NO328075B1 - Fremgangsmate for fremstilling av en gjaercelle, en ikke-human pattedyrembryonisk ES celle, et kimaert ikke-humant pattedyr og et transgent ikke-humant pattedyr samt gjaercelle og isolert ikke-humant pattedyr ES celle. - Google Patents
Fremgangsmate for fremstilling av en gjaercelle, en ikke-human pattedyrembryonisk ES celle, et kimaert ikke-humant pattedyr og et transgent ikke-humant pattedyr samt gjaercelle og isolert ikke-humant pattedyr ES celle. Download PDFInfo
- Publication number
- NO328075B1 NO328075B1 NO19950244A NO950244A NO328075B1 NO 328075 B1 NO328075 B1 NO 328075B1 NO 19950244 A NO19950244 A NO 19950244A NO 950244 A NO950244 A NO 950244A NO 328075 B1 NO328075 B1 NO 328075B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- fragment
- human
- locus
- cell
- heavy chain
- Prior art date
Links
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 title claims abstract description 21
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 title claims description 185
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 49
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 title claims description 28
- 230000008569 process Effects 0.000 title description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 4
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 claims abstract description 181
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims abstract description 88
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims abstract description 42
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims abstract description 26
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 238000009395 breeding Methods 0.000 claims abstract description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 257
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 148
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 60
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 60
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 claims description 45
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 claims description 42
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 claims description 42
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 40
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 40
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 35
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 claims description 32
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 claims description 32
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 26
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 14
- 230000013011 mating Effects 0.000 claims description 12
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 11
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 claims description 11
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 claims description 4
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 claims description 2
- 101150076615 ck gene Proteins 0.000 claims 2
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 abstract description 163
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 abstract description 65
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 abstract description 23
- 102000018251 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 abstract description 19
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 abstract description 9
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 abstract description 8
- 230000004044 response Effects 0.000 abstract description 7
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 abstract description 5
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 abstract description 5
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 abstract description 5
- 230000006798 recombination Effects 0.000 abstract description 5
- 238000005215 recombination Methods 0.000 abstract description 5
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 140
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 95
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 83
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 64
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 58
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 55
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 45
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 40
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 38
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 36
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 36
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 36
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 33
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 32
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 25
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 23
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 23
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 23
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 22
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 22
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 22
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 22
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 21
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 20
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 19
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 19
- 101100231743 Homo sapiens HPRT1 gene Proteins 0.000 description 18
- 238000011161 development Methods 0.000 description 17
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 16
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 15
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 15
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 15
- 239000000047 product Substances 0.000 description 15
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 15
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 14
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 13
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 13
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 13
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 12
- 102000006822 Agouti Signaling Protein Human genes 0.000 description 11
- 108010072151 Agouti Signaling Protein Proteins 0.000 description 11
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 11
- 241000484025 Cuniculus Species 0.000 description 11
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 11
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 11
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 11
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 11
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 11
- 108091035539 telomere Proteins 0.000 description 11
- 102000055501 telomere Human genes 0.000 description 11
- 210000003411 telomere Anatomy 0.000 description 11
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 10
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 9
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 9
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 9
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 9
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 9
- 241000894007 species Species 0.000 description 9
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 8
- 241001323321 Pluto Species 0.000 description 8
- 210000002230 centromere Anatomy 0.000 description 8
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 8
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 8
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 8
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 8
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 8
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 8
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 8
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 8
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 8
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 8
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 8
- 101150097493 D gene Proteins 0.000 description 7
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 7
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 7
- IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N ganciclovir Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2COC(CO)CO IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229960002963 ganciclovir Drugs 0.000 description 7
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 7
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000011746 C57BL/6J (JAX™ mouse strain) Methods 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 241001045988 Neogene Species 0.000 description 6
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 6
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 6
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 6
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 6
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 6
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 6
- 101150091879 neo gene Proteins 0.000 description 6
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 6
- 238000003906 pulsed field gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 101150009006 HIS3 gene Proteins 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- 101000773364 Homo sapiens Beta-alanine-activating enzyme Proteins 0.000 description 5
- 229930192392 Mitomycin Natural products 0.000 description 5
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 5
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 5
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 5
- 101100394989 Rhodopseudomonas palustris (strain ATCC BAA-98 / CGA009) hisI gene Proteins 0.000 description 5
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 5
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 5
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 5
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 5
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 5
- 230000031864 metaphase Effects 0.000 description 5
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 5
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 5
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 5
- 101150116497 sacm1l gene Proteins 0.000 description 5
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 5
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 4
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 4
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 4
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 101150003725 TK gene Proteins 0.000 description 4
- 101001099217 Thermotoga maritima (strain ATCC 43589 / DSM 3109 / JCM 10099 / NBRC 100826 / MSB8) Triosephosphate isomerase Proteins 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 4
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 210000002242 embryoid body Anatomy 0.000 description 4
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 4
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 4
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 4
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 4
- 102100036409 Activated CDC42 kinase 1 Human genes 0.000 description 3
- 108091023043 Alu Element Proteins 0.000 description 3
- 102100030981 Beta-alanine-activating enzyme Human genes 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 206010068051 Chimerism Diseases 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 3
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000000853 LDL receptors Human genes 0.000 description 3
- 108010001831 LDL receptors Proteins 0.000 description 3
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 3
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 3
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 3
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 3
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 3
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 3
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 3
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 3
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 3
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 3
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 3
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 3
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 3
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 3
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 2
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 2
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 2
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 2
- 108010069091 Dystrophin Proteins 0.000 description 2
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 2
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 2
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 2
- 101000608935 Homo sapiens Leukosialin Proteins 0.000 description 2
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 2
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- 102000012745 Immunoglobulin Subunits Human genes 0.000 description 2
- 108010079585 Immunoglobulin Subunits Proteins 0.000 description 2
- 102000012960 Immunoglobulin kappa-Chains Human genes 0.000 description 2
- 108010090227 Immunoglobulin kappa-Chains Proteins 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100039564 Leukosialin Human genes 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 241000021375 Xenogenes Species 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- MKUXAQIIEYXACX-UHFFFAOYSA-N aciclovir Chemical compound N1C(N)=NC(=O)C2=C1N(COCCO)C=N2 MKUXAQIIEYXACX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960004150 aciclovir Drugs 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 210000004952 blastocoel Anatomy 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 2
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 2
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 229940127073 nucleoside analogue Drugs 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000037439 somatic mutation Effects 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 2
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 2
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- AGNGYMCLFWQVGX-AGFFZDDWSA-N (e)-1-[(2s)-2-amino-2-carboxyethoxy]-2-diazonioethenolate Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CO\C([O-])=C\[N+]#N AGNGYMCLFWQVGX-AGFFZDDWSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 238000011714 129 mouse Methods 0.000 description 1
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 108010066676 Abrin Proteins 0.000 description 1
- 241001244729 Apalis Species 0.000 description 1
- 102000007592 Apolipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010071619 Apolipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108010027006 Apolipoproteins B Proteins 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 101150040566 B3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150008604 CAN1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100000858 Caenorhabditis elegans act-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 1
- 206010010741 Conjunctivitis Diseases 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 102000012605 Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Human genes 0.000 description 1
- 108010079245 Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 238000011765 DBA/2 mouse Methods 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 230000007023 DNA restriction-modification system Effects 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 101150014361 Delta gene Proteins 0.000 description 1
- 101800000585 Diphtheria toxin fragment A Proteins 0.000 description 1
- 101100347633 Drosophila melanogaster Mhc gene Proteins 0.000 description 1
- 102000001039 Dystrophin Human genes 0.000 description 1
- 201000009051 Embryonal Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 108010033128 Glucan Endo-1,3-beta-D-Glucosidase Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102100028967 HLA class I histocompatibility antigen, alpha chain G Human genes 0.000 description 1
- 101710197836 HLA class I histocompatibility antigen, alpha chain G Proteins 0.000 description 1
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 description 1
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 description 1
- 101100440311 Homo sapiens C5 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 208000035150 Hypercholesterolemia Diseases 0.000 description 1
- 208000031226 Hyperlipidaemia Diseases 0.000 description 1
- 101150031639 IV gene Proteins 0.000 description 1
- HEFNNWSXXWATRW-UHFFFAOYSA-N Ibuprofen Chemical compound CC(C)CC1=CC=C(C(C)C(O)=O)C=C1 HEFNNWSXXWATRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700029228 Immunoglobulin Heavy Chain Genes Proteins 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 101150008942 J gene Proteins 0.000 description 1
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 102000004058 Leukemia inhibitory factor Human genes 0.000 description 1
- 108090000581 Leukemia inhibitory factor Proteins 0.000 description 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 101000777315 Mus musculus Choline kinase alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000777310 Mus musculus Choline/ethanolamine kinase Proteins 0.000 description 1
- 101100339600 Mus musculus Hprt1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000974705 Mus musculus UMP-CMP kinase Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 1
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 1
- 240000002834 Paulownia tomentosa Species 0.000 description 1
- 235000010678 Paulownia tomentosa Nutrition 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 241000577979 Peromyscus spicilegus Species 0.000 description 1
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 1
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 description 1
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 description 1
- 229920002535 Polyethylene Glycol 1500 Polymers 0.000 description 1
- 229920001030 Polyethylene Glycol 4000 Polymers 0.000 description 1
- 241001505332 Polyomavirus sp. Species 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 108010039491 Ricin Proteins 0.000 description 1
- 241000288726 Soricidae Species 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 1
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 208000037280 Trisomy Diseases 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 101150067366 adh gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 108010045649 agarase Proteins 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 229950011321 azaserine Drugs 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 239000004020 conductor Substances 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 description 1
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002509 fluorescent in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 230000000799 fusogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004209 hair Anatomy 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 101150051897 his5 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 208000020346 hyperlipoproteinemia Diseases 0.000 description 1
- 230000000937 inactivator Effects 0.000 description 1
- 238000009655 industrial fermentation Methods 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000007852 inverse PCR Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- BWHLPLXXIDYSNW-UHFFFAOYSA-N ketorolac tromethamine Chemical compound OCC(N)(CO)CO.OC(=O)C1CCN2C1=CC=C2C(=O)C1=CC=CC=C1 BWHLPLXXIDYSNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 101150109301 lys2 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 210000003519 mature b lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000021121 meiosis Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 201000006938 muscular dystrophy Diseases 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 210000004303 peritoneum Anatomy 0.000 description 1
- RLZZZVKAURTHCP-UHFFFAOYSA-N phenanthrene-3,4-diol Chemical compound C1=CC=C2C3=C(O)C(O)=CC=C3C=CC2=C1 RLZZZVKAURTHCP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 1
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 1
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000014493 regulation of gene expression Effects 0.000 description 1
- 102000053632 repetitive DNA sequence Human genes 0.000 description 1
- 108091035233 repetitive DNA sequence Proteins 0.000 description 1
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000028070 sporulation Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- YNDXUCZADRHECN-JNQJZLCISA-N triamcinolone acetonide Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@H]3OC(C)(C)O[C@@]3(C(=O)CO)[C@@]1(C)C[C@@H]2O YNDXUCZADRHECN-JNQJZLCISA-N 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 210000005239 tubule Anatomy 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
- A01K67/0276—Knock-out vertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
- A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
- C07K16/1267—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria
- C07K16/1282—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria from Clostridium (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
- C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
- C07K16/244—Interleukins [IL]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
- C07K16/244—Interleukins [IL]
- C07K16/248—IL-6
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/2812—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD4
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2851—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the lectin superfamily, e.g. CD23, CD72
- C07K16/2854—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the lectin superfamily, e.g. CD23, CD72 against selectins, e.g. CD62
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2875—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2207/00—Modified animals
- A01K2207/15—Humanized animals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåte for fremstilling av en gjærcelle, en ikke-human pattedyrembryonisk ES celle, et kimært ikke-humant pattedyr og et transgent ikke-humant pattedyr samt gjærcelle og isolert ikke-humant pattedyr ES celle.
INNLEDNING
Teknisk område
Området for denne oppfinnelse er fremstillingen av xenogene spesifikke bindingsproteiner i et levedyktig verts-pattedyr.
Bakgrunn
Muligheten for å frembringe transgene dyr er blitt revolusjonert ved at det er blitt mulig å dyrke murine embryo-stamceller og foreta genetiske modifikasjoner i disse cellene for senere overføring til mus-kimlinjen. Det er således mulig å endre endogene gener ved å introdusere fremmede gener i verten, særlig humane gener for dannelse av xenogene bindingsproteiner slik at det kan dannes dyrestammer som er i stand til å frembringe nye produkter. Ekspresjonen av slike gener in vivo i en dyremodell, kan gi mulighet for studier av funksjonen av genet, reguleringen av genekspresjon, dets bearbeidning, respons på forskjellige agens og lignende. Dyr med nye fenotyper inklusivt slike som etterligner en rekke sykdommer, kan dessuten frembringes. For eksempel er det interesse for innføring av en dominant mutasjon eller komplementering av en recessiv mutasjon. Avhengig av hvilket gen det er tale om, vil problemet med å oppnå den ønskede mutasjon variere betydelig. Mens noen utvalgte gener har vist seg å være relativt egnet for modifisering, har andre vist seg å være ekstremt resistente overfor modifisering.
På grunn av anledningen til å utvikle transgene dyr, er det betydelig interesse for å komme frem til nye fremgangsmåter som bedre sikrer fremstillingen av transgene dyr. Særlig når det er ønske om å innføre store DNA-fragmenter som omfatter hundrevis av kilobaser, er man meget opptatt av muligheten for å få ført de store fragmentene i intakt form inn i pattedyrceller, av effektiviteten av integrasjonen, funksjonsevnen til gener som forekommer på fragmentet og overførselen til avkommets kimlinje. Dessuten bidrar slike fremgangsmåter for innføring av store DNA-fragmenter til å bestemme funksjonen av store DNA-fragmenter som er identifisert gjennom det pågående humangenom-prosjekt.
Særlig er det interesse for å fremstille xenogene spesifikke bindingsproteiner, for eksempel humane monoklonale antistoff, i små forsøksdyr som f.eks. mus. Monoklonale antistoff anvendes både diagnostisk og terapeutisk. På grunn av evnen til å binde seg til spesifikke epitoper, gir de en enestående mulighet til å identifisere molekyler som er bærere av denne epitop, eller til, som sådanne eller sammen med en annen del, å rettes mot et spesifikt sete for diagnose eller terapi.
Monoklonale antistoff omfatter tunge og lette kjeder som går sammen om å danne et bindingsområde for epitopen. Hver av kjedene omfatter en variabel region og en konstant region. Aminosyresekvensen for den konstante region er spesifikk for en bestemt isotype av antistoffet, så vel som for verten som produserer antistoffet.
På grunn av slektsskapet mellom sekvensen for den konstante region og arten som antistoffet stammer fra, kan innføringen av et xenogent antistoff i vertens vaskulære system, frembringe en immunrespons. Når det xenogene antistoff innføres gang på gang, som ved kroniske sykdommer, blir det uhensiktsmessig å administrere antistoffet i og med at det hurtig vil bli nedbrutt og kan ha en uheldig virkning. Det har derfor vært gjort mange forsøk på å komme frem til en kilde av genetisk identiske eller allogenetiske antistoff. En teknikk har involvert bruk av rekombinant DNA-teknologi, hvor vertsdyrets gener for tunge og lette kjeder ble identifisert og de regioner som koder for den konstante region, isolert. Disse regionene ble deretter forenet med den delen av en annen arts immunglobulingener som koder for den variable region rettet mot en spesifikk epitop.
Selv om det resulterende kimære, delvis xenogene, antistoff er vesentlig mer anvendelig enn et helt xenogent antistoff, har det fremdeles flere ulemper. Identifikasjonen, isoleringen og sammenkoblingen av de variable og konstante regioner er meget arbeidskrevende. Dessuten kan sammenkoblingen av en konstant region fra én art med en variabel region fra en annen art, forandre de variable regionenes spesifisitet og affinitet, slik at de ønskede egenskaper til den variable region går tapt. I den variable region finnes dessuten struktur- og hypervariable sekvenser som er spesifikke for en art. Disse struktur- og hypervariable sekvensene kan resultere i uønskede antigene responser.
Det ville derfor være mer fordelaktig å fremstille allogenetiske antistoff for administrering til et vertsdyr ved å immunisere dyret med et immunogen av interesse. For primater, og særlig for mennesker, er dette ingen praktisk fremgangsmåte. De humane antistoff som er blitt fremstillet, har vært basert på tilfeldig forekomst av en tilgjengelig milt fra en vert som tidligere var blitt immunisert mot den interessante epitop. Selv om humane lymfocytter i perifert blod kan benyttes til produksjon av monoklonale antistoff, har dette ikke vært særlig vellykket ved fusjoner og har vanligvis kun ført til IgM. Det er dessuten spesielt vanskelig å frembringe en human antistoff-respons mot et humant protein, et ønskelig mål for mange terapeutiske og diagnostiske anvendelser. Det eksisterer derfor betydelig interesse for å finne alternative måter for fremstilling av allogenetiske antistoff for mennesker.
Relevant litteratur
WO 91/10741 beskriver ikke-humane pattedyn/erter kjennetegnet ved inaktiverte endogene lg loci og funksjonelle humane lg loci for respons overfor et immunogen for å produsere antistoffer eller analoger derav.
Thomas & Capecchi (1987), CeN, 51:503-512 og Koller & Smithies
(1989), Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 86:8932-8935 beskriver inaktivering av (32-mikroglobulin-locuset ved homolog rekombinasjon i embryoniske stamceller. Berman et al. (1988), EMBO J. 7:727-738 beskriver det humane Ig-VH-locus. Burke, et al. (1987), Science. 236:806-812 beskriver kunstige gjærkromosomvektorer. Se også Garza et al. (1989). Science 246:641-646 og Brownstein et al. (1989), Science. 244:1348-1351. Sakano et al., beskriver et diversitets-segment av genene for immunglobulin tung kjede i Sakano et al. (1981), Nature. 290:562-565. Tucker et al. (1981), Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 78:7684-7688 beskriver gensekvensen for den tunge kjede i muse-lgA. Blankenstein & Kruwinkel (1987), Eur. J. Immunol.. 17:1351-1357 beskriver den variable region av tunge kjeder hos mus. Se også Joyner et al., (1989), Nature. 338:153-155, Traver et al. (1989) Proe. Nat. Acad. Sei. USA, 86:5898-5902, Pachnis et al., (1990), Proe. Nat. Acad. Sei. USA. 87:5109-5113 og PCT-søknad PCT/US91/00245. Bruggemann et al., Proe. Nat. Acad. Sei. USA. 86:6709-6713 (1989): Behring Inst. Mitt. 87:21-24
(1990); Eur. J. Immunol. 21:1323-1326 (1991), beskriver monoklonale antistoff med humane tunge kjeder. Albertsen et al., Proe. Nat. Acad. Sei. USA. 87:4256-4260 (1990), beskriver konstruksjonen av et bibliotek av kunstige gjærkromosomer som inneholder humane DNA-fragmenter. Kunstige gjærkromosomvektorer er beskrevet av Burke et al., Science. 236:806-812 (1987). Pavan et al., Mol and Cell. Biol. 10(8):4163-4169 (1990) beskriver innføringen av en neomycinresistens-kasett i det human-avledede innskudd i kunstige gjærkromosomer ved å benytte homolog rekombinasjon, og overføring til en embryonal karsinom-cellelinje ved å benytte polyetylenglykol-mediert sfæroplast-fusjon. Pachnis et al., Proe. Nat. Acad. Sei. USA, 87:5109-5113 (1990), og Gnirke et al., EMBO Journal. 10(7):1629-1634 (1991), beskriver overføring til pattedyrceller av et kunstig gjærkromosom som bærer humant DNA. Eliceiri et al., Proe. Nat. Acad. USA. 88:2179-2183 (1991), beskriver ekspresjonen i museceller av kunstige gjærkromosomer som inneholder humane gener. Huxley et al., Genomics. 9:742-750 (1991), beskriver ekspresjonen i museceller av kunstige gjærkromosomer inneholdende det humane HPRT-gen. Mortensen et al., Mol and Cell Biol. !2(5):2391-2395 (1992), beskriver bruken av høye konsentrasjoner av G418 for å dyrke heterozygote embryoniske stamceller for seleksjon av homozygote, mutasjonelt endrede celler. Gjærprotoplastfusjon med musefibroblaster er beskrevet av Traver et al., Proe. Nat. Acad. Sei. USA. 86:5898-5902 (1989) og Pachnis et al., Proe. Nat. Acad. Sei. USA. 87:5109-5113 (1990). Davies et al., Nucl. Acids Res. 20:2693-2698 (1992), beskriver målrettede forandringer i YAC. Zachau, Biol. Chem. 371:1-6 (1990) beskriver det humane immunglobulin lette (kappa)
(IgK) locus; Matsuda et al., Nature Genetics. 3:88-94 (1993) og Shin et al., EMBO. 10:3641-3645 (1991), beskriver kloningen av det humane immunglobulin tunge (IgH) locus i YAC.
SAMMENFATNING AV OPPFINNELSEN
Xenogene spesifikke bindingsproteiner fremstilles i et ikke-humant levedyktig vertsdyr ved immunisering av vertsdyret med et passende immunogen.
Et foretrukket ikke-humant vertsdyr karakteriseres ved at: (1) det ikke er i stand til å produsere endogent immunglobulin tung kjede; (2) det i det vesentlige er ute av stand til å produsere endogene immunglobulin lette kjeder, og (3) det er i stand til å produsere xenogene immunglobulin lette og tunge kjeder for å danne et xenogent immunglobulin eller en immunglobulin-analog. Verten kan således ha et helt endogent immunglobulin-locus erstattet med en del av, eller et helt, xenogent immunglobulin-locus eller ha et xenogent immunglobulin-locus innskutt i et kromosom i vertscellen og en inaktivert endogen immunglobulinregion. Disse forskjellige alternativene vil i det minste delvis, oppnås ved å benytte homolog rekombinasjon for inaktivering eller erstatning ved immunglobulin-loci for de tunge og lette kjeder.
Det tilveiebringes dessuten nye fremgangsmåter for innføring av store segmenter, på minst 100 kb, av xenogent DNA, særlig humant DNA, inn i vertsdyr, særlig mus, ved å innføre et kunstig gjærkromosom (YAC) inneholdende et xenogent DNA-segment på minst 100 kb, inn i en embryonisk stamcelle for integrering i stamcellens genom, seleksjon av stamceller som omfatter det integrerte YAC ved hjelp av en markør som forekommer i dette YAC, innføring av den YAC-holdige ES-celle i embryoer og utvikling av kimære mus fra embryoene. De kimære dyrene kan parres for å gi dyr som er heterozygote for dette YAC. De heterozygote dyrene kan parres for å frembringe avkom som er homozygote for det integrerte YAC.
BESKRIVELSE AV TEGNINGENE
Figur 1 er et diagram av inaktiveringsvektoren for den tunge kjedes J-region hos mus, som beskrevet i Eksempel I, infra. Figur 2 er et diagram av DNA-restriksjonskartet for plasmidet pmHSJ og målmusens tung kjede J-gener, som beskrevet i Eksempel II, infra. Figur 3 er et flow-cytometrisk plottdiagram av antistoff som farver for IgM-allotyper i musestammer, som beskrevet i Eksempel II, infra. Figur 4 er et flow-cytometrisk histogram av antistoff som farver for IgM-allotyper i musestammer, som beskrevet i Eksempel II, infra. Figur 5 er et diagram av inaktiveringsvektoren for gener for kappa konstant-regionen i muse-immunglobulin, som beskrevet i Eksempel III, infra. Figur 6 er et diagram som viser utledningen av plasmidet pK.TK/Neo, som beskrevet i Eksempel III, infra. Figur 7 er et diagram av restriksjonskartet av mål-locusets lette kjede, som beskrevet i Eksempel III, infra. Figur 8 er et diagram av målvektoren for inaktivering av kappa lett kjede J- og konstante regioner og utformingen av målrettingsforsøket, som beskrevet i Eksempel IV, infra. Figur 9 er et diagram som viser konstruksjonen av vektorer for inaktivering av kappa lett kjede J- og konstante regioner, som beskrevet i Eksempel IV, infra. Figur 10 er et diagram av den endelige delesjonsvektor for inaktivering av kappa lett kjede J og konstante regioner
som beskrevet i Eksempel IV, infra.
Figur 11 er en illustrasjon av Southern blotting-analysen av celler med delesjon av lett kjede J og konstant region, som beskrevet i Eksempel IV, infra. Figur 12 A-E er fotografier av resultatene av Southern blotting-analyse for karakterisering av yHPRT- og genomisk gjær-DNA integrert i ES-kloner,
som beskrevet i Eksempel VI, infra (A = human repeterende Alu-sekvens; B, C = pBR322-spesifikke sekvenser for den høyre (B) og venstre (C) YAC-arm; D = gjær-Ty-repeterende sekvens; E = gjær-"single copy"-gen LYS2. Kortere eksponeringstider (12 timer for II sammenlignet med 48 timer for I) av yHPRT hvor Alu- og Ty-sekvenser ble benyttet som prober, er også vist. Posisjonene av molekylvekt-markørene er avmerket. Skjemaer for høyre (a) og venstre (b) vektorarm og lokaliseringen av pBR322-avledede YAC-vektor-fragmenter er vist ( = telomer; = gjær-avledede sekvenser,
0 = gjærcentromer; = pBR322-avledede sekvenser; = humant innskudd;
= EcoRI kloningssete; H = Hindlll-seter).
Figur 13 A-D er fotomikrogram av resultatet av in situ hybridisering for å påvise integreringen av yHPRT- og genomiske gjær-sekvenser i ES-cellens kromosomer, som beskrevet i Eksempel VI, infra (A, B = metafase-spredninger fra ESY-8-7-celler hybridisert til biotinylerte humane genomiske sekvenser og C = metafase-spredninger og D = interfase-kjerner fra ESY-8-6-celler hybridisert til biotinylerte repeterte gjær-DNA-sekvenser). Figur 14 A, B, C viser det stabile bibehold av yHPRT under in vitro ES-celledifferensiering og overføring via kimlinjen hos mus, som beskrevet i Eksempel VI, infra (A: a, b = embryoide legemer; og differensierte celletypene = "blood islands"; d = kontraherende muskel; e = nerveceller;
f = neurale tubuli dannet av ESY-kloner; B: Southern blotting-analyse av DNA ekstrahert fra differensierte ESY 5-2, 3-6, 8-5 og 8-6 (20 ug) og yHPRT 1 AB1380 (40 ng) ved å benytte a = human Alu-probe; b = gjær-Ty-sekvenser; C: Southern blotting-analyse av "tail DNA" (20 ug) fra 2 stykk aguti-farvet avkom (4-2 og 4-3) som skriver seg fra ESY-kimære hanner 394/95-2 ved å benytte a = humane Alu- og b = Ty-sekvenser; kortere eksponeringer (12 timer) av 8-6 og yHPRT med Ty som probe, er vist (II). Figur 15 A og B er fotografier av en elektroforese-gel som viser ekspresjonen av det humane HPRT-gen i forskjellig musevev, som beskrevet i Eksempel VI, infra (15A = påvisning av human HPRT-mRNA ved bruk av revers transkripsjon-PCR i ES-, ESY 3-1- og Hut-78-celler, milt og lever fra kontrollmus eller ESY 4-3 aguti-farvet avkom; 15B = påvisning av mus-y-interferon-reseptor-mRNA ved RT-PCR i prøver fra 15A; M = størrelses-markør). Figur 16 er et diagram av locus for det humane immunglobulins tunge kjede og en YAC-substitusjonsvektor for human tung kjede, som beskrevet i Eksempel VII, infra. Figur 17 er et diagram av et museformerings-skjema, som beskrevet i Eksempel VIII, infra. Figur 18 gjengir genotypene for enkelte av de vertsdyr som er fremstillet ved hjelp av fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen.
BESKRIVELSE AV BESTEMTE UTFØRELSESFORMER
Foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåte for fremstilling av en gjærcelle som har minst et kunstig gjærkromosom (YAC) omfattende et fragment av et urearrangert humant immunoglobulin tung kjede lokus tilstrekkelig for å kode for en human immunoglobulin tung kjede, og minst et YAC omfattende et fragement av et urearrangert humant immunoglobulin lett kjede lokus tilstrekkelig for å kode for en human immunoglobulin lett kjede, idet fremgangsmåten omfatter følgende trinn: a) introdusering inn i en første gjærcelle et YAC som omfatter fragmentet av et urearrangert tung kjede lokus eller fragmentet av et urearrangert lett kjede lokus, og en selekterbar markør; b) introdusering av et kromosomalt DNA fra første gjærcelle inn i en andre gjærcelle som omfatter et YAC omfattende fragmentet av et
urearrangert lett kjede lokus eller fragmentet av et urearrangert tung kjede lokus, og en selekterbar markør;
c) selektering av gjærceller som omfatter YAC omfattende fragmentet av et urearrangert tung kjede lokus og YAC omfattende
fragmentet av et urearrangert lett kjede lokus.
Det er videre beskrevet gjærcelle som har minst et kunstig gjærkromosom (YAC), omfattende et fragment av et urearrangert humant immunoglobulin tung kjede lokus tilstrekkelig for å kode for en human immunoglobulin tung kjede, og minst et YAC som omfatter et fragment av et urearrangert humant immunoglobulin lett kjede lokus tilstrekkelig for å kode for en human immunoglobulin lett kjede, hvori gjærcellen blir produsert ved fremgangsmåten ifølge krav 1.
Oppfinnelsen vedrører også fremgangsmåte for fremstilling av en ikke-human pattedyrembryonisk ES celle som har minst et fragment av et urearrangert humant immunoglobulin tung kjede lokus tilstrekkelig for å kode for en human immunoglobulin tung kjede og minst et fragment av et urearrangert humant immunoglobulin lett kjede lokus tilstrekkelig for å kode for en human immunoglobulin lett kjede, hvori fragmentet av et urearrangert tung kjede lokus og fragmentet av et urearrangert lett kjede lokus er stabilt integrert inn i det samme kromosomet til en ikke-human pattedyr ES celle, idet fremgangsmåten omfatter følgende trinn: a) kombinering under fusjonsbetingelser en ikke-human pattedyr ES celle og en gjærsfæroplast dannet fra en gjærcelle ifølge krav 3, hvori nevnte sfæroplast inneholder to eller flere YAC, hvori minst en YAC omfatter fragmentet av et urearrangert tung kjede lokus og minst et YAC som omfatter fragmentet av et urearrangert lett kjede lokus, og hvori hver YAC omfatter et gen kodende for en selekterbar markør, hvor ved fragmentene blir stabilt integrerte inn i genomet til ES cellene; og b) selektering for ES celler som bærer humant immunoglobulin loki ved hjelp av en eller flere av markørene.
Det er også beskrevet isolert ikke-humant pattedyr ES celle som har minst et fragment av et urearrangert humant immunoglobulin tung kjede lokus tilstrekkelig for å kode for en human immunoglobulin tung kjede og minst et fragment av et urearrangert humant immunoglobulin lett kjede lokus tilstrekkelig for å kode for en human immunoglobulin lett kjede, hvori fragmentet av et urearrangert tung kjede lokus og fragmentet av et urearrangert lett kjede lokus er stabilt integrert inn i det samme kromosomet av ES cellen, og hvor ES cellen blir produsert ved fremgangsmåten ifølge krav 4.
Foreliggende oppfinnelse vedrører videre ES celle ifølge krav 5, hvori fragmentet av et urearrangert tung kjede lokus har sekvensen til et fragment av humant kromosom 14 fra D segment genene til human immunoglobulin tung kjede lokuset, videre fortsettelse gjennom J segment genene og konstant region genene til og med Cp av det lokuset, hvori nevnte DNA sekvens ikke innbefatter en gamma konstant region, og hvori nevnte sekvens er operabelt koblet til minst et humant V segment gen.
Det er også beskrevet fremgangsmåte for fremstilling av et kimært ikke-humant pattedyr som har minst et fragment av et urearrangert humant immunoglobulin tung kjede lokus tilstrekkelig for å kode for en human immunoglobulin tung kjede og minst et fragment av et urearrangert humant immunglobulin lett kjede lokus tilstrekkelig for å kode for en human immunoglobulin tung kjede, hvori fragmentet av et urearrangert tung kjede lokus og fragmentet av et urearrangert lett kjede lokus er stabilt integrert inn i det samme kromosomet i minst noen av dets celler, idet fremgangmåten omfatter følgende trinn:
a) produsering av en ES celle ifølge krav 5; og
b) produsering av det kimære ikke-humane pattedyret fra ES
cellen.
Oppfinnelsen vedrører videre fremgangsmåte for fremstilling av et transgent ikke-humant pattedyr og dets avkom som har i dets somatiske og kim-celler minst et fragment av et urearrangert humant immunoglobulin tung kjede lokus tilstrekkelig for å kode for en human immunoglobulin tung kjede og minst et fragment av et urearrangert humant immunoglobulin lett kjede lokus tilstrekkelig for å kode for en human immunoglobulin lett kjede, hvori fragmentet av en urearrangert tung kjede og fragmentet av en urearrangert lett kjede er stabilt integrert inn i det samme kromosomet, idet fremgangsmåten omfatter trinnet å avle det kimeriske ikke-humane pattedyret ifølge krav 11 og dets avkom for å fremstille det transgene ikke-humane pattedyret.
Det tilveiebringes nye transgene ikke-humane vertsdyr, særlig pattedyr, vanligvis murine vertsdyr, hvor vertsdyret er i stand til å gi en immunrespons på et immunogen, hvor denne respons danner antistoff som har xenogene, særlig primate og helst humane, konstante og/eller variable regioner eller tilsvarende andre effektorpeptid-sekvenser av interesse. Med "transgene" menes et dyr som inneholder en genetisk manipulert modifikasjon, særlig i sammenheng med foreliggende oppfinnelse, innføringen av et humant immunglobulin-gen i alle dets celler. Vertene kjennetegnes ved å være i stand til å produsere xenogene immunglobuliner, eller analoger derav, som resultat av inaktivering av de loci som koder for endogene immunglobulin-subenheter, og å innføre xenogent DNA, for eksempel DNA som koder for humant immunglobulin. Modifikasjonene kan bibeholde i det minste en del av de xenogene konstante regioner som sørger for sammenføyning av bindingssetet for den variable region, bundet ved C-enden til et funksjonelt peptid. Det funksjonelle peptid kan ha mange former eller konformasjoner og kan tjene som enzym, vekstfaktor, bindingsprotein, ligand, cytokin, effektor-protein, chelaterende proteiner, etc. Antistoffene kan være av en hvilken som helst isotype, f.eks. IgA, D, E, G eller M eller subtyper innen isotypen.
Som individuelle trinn innføres som en første strategi, de xenogene, f.eks. humane, gener for tunge og lette immunglobulin-kjeder i vertsdyrets kimlinje (f.eks. sperma eller oocytter), og i separate trinn gjøres de tilsvarende vertsgener ikke-funksjonelle ved inaktivering under bruk av homolog rekombinasjon. Gener for humane tunge og lette immunglobulin-kjeder rekonstitueres i en passende eukaryotisk eller prokaryotisk mikroorganisme, og de resulterende DNA-fragmenter kan føres inn i det passende vertsdyr, for eksempel inn i pronuclei til befruktede muse-oocytter eller embryoniske stamceller. Inaktivering av de endogene verts-immunglobulin-loci oppnås ved målrettet ødeleggelse av passende loci ved homolog rekombinasjon i vertscellene, særlig embryoniske stamceller eller pronuclei av befruktede muse-oocytter. Den målrettede ødeleggelse kan skyldes innføring av en lesjon eller delesjon i mållocuset, eller delesjon inne i mållocus ledsaget av at det i dette locus innføres for eksempel en selekterbar markør. Når det er tale om embryoniske stamceller, utvikles kimære dyr som til dels skriver seg fra de modifiserte embryoniske stamcellene og som er i stand til å overføre de genetiske modifikasjonene gjennom kimlinjen. Parring av vertsdyr som har fått innført humane immunglobulin-loci, med stammer med ianktiverte endogene loci, vil føre til dyr som har rent xenogen, f.eks. human antistoffproduksjon.
I henhold til en annen alternativ strategi benyttes i det minste deler av de humane loci for tunge og lette immunglobulin-kjeder til direkte å erstatte de tilsvarende endogene immunglobulin-loci ved homolog rekombinasjon i embryoniske stamceller. Dette resulterer i samtidig inaktivering og erstatning av det endogene immunglobulin. Dette etterfølges av utvikling av kimære dyr, hvor de embryoniske stamcelle-avledede celler kan bidra til kimlinjen.
Disse former for strategi er basert på den kjente organisering av immunglobulin-kjeders loci i en rekke dyr, siden organiseringen, den relative lokalisering av exoner som koder for individuelle domener og lokaliseringen av spleiseseter og transkripsjonselementer er klarlagt i varierende grad. Hos mennesket er locus for immunglobulin tung kjede (lgHhu) lokalisert på kromosom 14.1 transkripsjonsretningen 5'-3' omfatter dette locus en stor ansamling (duster) av gener for den variable region (VH), genene for diversitets-regionen (D), fulgt av genene for J-regionen (Jh) og den konstante (Ch) gen-ansamling. Størrelsen av dette locus anslås å være fra ca. 1500 til ca. 2500 kilobaser (kb). Under B-celleutviklingen bringes diskontinuerlige gensegmenter fra kimlinjens IgH-locus inntil hverandre ved hjelp av en fysisk rearrangering av DNA. For at det skal dannes et tung kjede funksjonelt lg-polypeptid, må tre diskontinuerlige DNA-segmenter fra VH-, D- og Jh-regionene forenes på en helt bestemt sekvensiell måte; først D til JH, deretter VH til DJh, hvorved den funksjonelle enhet VhDJh frembringes. Når VhDJh er dannet, produseres spesifikke tunge kjeder etter transkripsjon av lg-locuset, ved at det som templat benyttes den spesifikke VHDJHCH-enhet som omfatter exoner og introner.
For immunglobulinets lette kjeder (IgL) finnes to loci, kappa-locuset på humant kromosom 2 og lambda-locuset på humant kromosom 22. Organiseringen av disse IgL-loci tilsvarer den for IgH-locuset bortsett fra at D-regionen ikke forekommer. Etter IgH-reaarangering skjer en lignende rearrangering av et lett kjede locus ved VL til JL-sammenføyning av kappa-eller lambda-kjeden. Størrelsene av lambda- og kappa-lociene er hver omtrent 1000 kb til 2000 kb. Ekspresjon av rearrangert IgH og en IgK eller IgÅ lett kjede i en bestemt B-celle bevirker dannelsen av antistoff-molekyler.
For å isolere, klone og overføre lgHhu-locuset kan det benyttes et kunstig gjær-kromosom eller "YAC". Et YAC som bærer det xenogene DNA kan innføres i ES-celler eller oocytter ved hjelp av flere metoder, inklusivt gjær-sfæroplast: ES-celle-fusjon, mikroinjeksjon og lipofeksjon. YAC vil integreres tilfeldig (dvs. ikke-homologt) i verts-genomet. Dersom gjær-sfæroplast: ES-celle-fusjon benyttes for å føre et YAC som bærer xenogent DNA, inn i ES-vertsceller, kan to eller flere YAC i en enkelt verts-gjærcelle innføres samtidig i den samme ES-vertscelle. Fordelen ved dette er at flere YAC som hvert inneholder xenogent DNA, for eksempel loci for tung og lett kjede av humant immunglobulin, kan innføres i et enkelt kromosom i en vertscelle. Dette eliminerer behovet for oppformering av dyr som inneholder individuelle humane lg-gener, for å kunne frembringe et vertsdyr som er i stand til å produsere fullstendig humane immunglobuliner. For eksempel kan en gjærstamme som inneholder et enkelt YAC søkes med en vektor som f.eks. pLUTO (beskrevet infra) for å føre en selekterbar pattedyrs-markør som HPRT, og en selekterbar gjær-markør som LYS2 inn i en arm av dette YAC. Kromosomalt DNA fra målstammen benyttes deretter til å omdanne en andre, vanligvis haploid, Ivs2 mutant gjærstamme inneholdende et andre, forskjellig YAC. Lys<+->kolonier analyseres deretter ved PFGE (pulsed-field gel electrophoresis) for å identifisere kloner som har de to YAC og bekrefte at deres størrelse er uforandret. Ytterligere YAC med forskjellige selekterbare markører, for eksempel ADE2 (dersom verten er en ade2 mutant), kan senere adderes ved transformasjon. Alternativt søkes en YAC-holdig gjærstamme med en vektor som f.eks. pLUTO for å innføre en selekterbar pattedyrs-markør (f.eks. HPRT), som ovenfor, hvorpå den "parres" med annen YAC-holdig stamme av motsatt "kjønn". Forekomsten av de to YAC bekreftes deretter i de diploide gjærcellene, som beskrevet ovenfor. De diploide gjærstammene benyttes direkte for fusjon eller sendes gjennom meiose og ascosporogenese (sporulering) ved å benytte standardmetoder. De meiotiske produktene underkastes deretter screening for å identifisere en haploid klon inneholdende de to YAC. Enten den ene eller den annen av de ovenfor beskrevne måter benyttes, kan det andre YAC søkes med HPRT eller en annen selekterbar markør før innføring av det første YAC. Dersom hvert YAC inneholder forskjellige selekterbare gjærmarkører, kan bibehold av begge YAC under formeringen av stammen dessuten selekteres genetisk. Fusjon med ES-celler foretas deretter på samme måte som med gjærceller som inneholder et enkelt YAC. Siden mange gjærkromosomer kan integreres sammen med YAC, vil man forvente at en betydelig andel ES-kloner som uttrykker den pattedyrs-selekterbare markør som forekommer i ett YAC (f.eks. HAT<R->kloner dersom YAC-markøren er HPRT og ES-cellen er HPRT-), vil ha integrert begge YAC. Metoder som Southern blotting-analyse og/eller PCR kan benyttes for å identifisere slike kloner, og Southern blotting-analyse med pulsfelt-gelelektroforese kan benyttes til å karakterisere graden av YAC-integrasjon.
Hele IgHhu-locuset kan inngå i én eller noen få YAC-kloner sammen med en pattedyrs-markør som f.eks. Neo, HPRT, GPT, B-gal, etc. Det samme gjelder lociene for lg lett kjede. Rekonstituering av intakte kimlinje Ig-loci ved homolog rekombinasjon mellom forskjellige YAC med overlappende homologiregioner kan oppnås i gjær. På denne måte oppnås isoleringen av DNA-fragmenter som koder for den humane lg-kjede. Alternativt kan man klone et intakt kimlinje-locus direkte i et enkelt YAC.
For å oppnå et bredt spektrum av antistoff med høy affinitet er det nødvendig å inkludere hele V-regionen. Forskjellige V-region-genfamilier er spredt innen den humane V-region-ansamling. Ved å oppnå et subsett av de kjente V-region-gener av de humane tunge og lette lg-kjeders loci (Berman et al., EMBO J. (1988) 7:727-738) i stedet for hele komplementet av V-regioner, kan den transgene vert immuniseres og være i stand til å oppvise en sterk immunrespons og gi antistoff med høy affinitet. På denne måte kan relativt små DNA-fragmenter av kromosomet benyttes. For eksempel inngår et rapportert 670 kb fragment av Igmrlocuset i et Notl-Notl-restriksjonsfragment, som ville tjene til å gi et utvalg av V-regioner (Berman et al., su<p>ra). Øket diversitet gis også gjennom rekombinasjon med de forskjellige D- og J-regioner og somatisk mutasjon.
For å sette vertsimmunglobulin-lociene ut av funksjon, kan det benyttes homolog rekombinasjon, hvor DNA innføres ved lociene for vertens endogene immunglobulin tunge og lette kjeder, hvilket inhiberer dannelsen av endogent immunglobulin. Siden der er to alleler for tung kjede og to lett kjede loci, kappa og lambda, hvert med to alleler, selv om man kan velge å ignorere lambda-lociet, vil det måtte være gjentatte transformasjoner som resulterer i inaktivering av hvert allel. Homolog rekombinasjon kan benyttes for funksjonelt å inaktivere hvert av lociene ved innføring av det homologe DNA via en konstruksjon som kan ødelegge eller delere mållocuset i embryoniske stamceller med påfølgende innføring av de modifiserte cellene i recipient-blastocyster. Etterfølgende formering muliggjør kimlinjeoverføring av det inaktiverte locus. Man kan derfor velge å formere heterozygot avkom og selektere for homozygot avkom fra de heterozygote foreldrene.
I henhold til den andre av de alternative strategier som er beskrevet ovenfor, kan antallet trinn reduseres ved å sørge for minst et fragment av det humane immunglobulin-locus i den konstruksjon som benyttes for homolog rekombinasjon med det analoge endogene immunglobulin, slik at det humane locus erstatter i det minste en del av vertens immunglobulin-locus, hvilket resulterer i inaktivering av locuset for vertens immunglobulin-subenhet. Av særlig interesse er bruken av transformasjon for en enkelt inaktivering, med påfølgende formering av det heterozygote avkom for å frembringe et homozygot avkom. Når det humane locus benyttes for substitusjon eller innføring i verts-locuset for inaktivering, kan antall transformasjoner begrenses til tre transformasjoner, og som allerede antydet, kan man velge å ignorere det mindre anvendte locus og begrense transformasjonene til to transformasjoner. Som et alternativ kan man velge å foreta inaktiveringen som et eget trinn for hvert locus ved å benytte embryoniske stamceller fra avkom som tidligere har hatt ett eller flere loci inaktivert. I det tilfellet hvor det bare benyttes transformasjon, og det humane locus er integrert på en tilfeldig måte i verts-genomet, kan det være nødvendig med i alt åtte eller flere transformasjoner.
For inaktivering kan det benyttes en hvilken som helst lesjon i mållocuset som resulterer i ekspresjonshindring av en immunglobulin-subenhet for dette locus. Lesjonen kan således være i en region som omfatter enhancere, f.eks. en 5'- eller 3'-enhancer, eller et intron, i V-, J- eller C-regionene, og for den tunge kjede foreligger muligheten i D-regionen, eller kombinasjoner derav. Den viktige faktor er at rearrangering av gener i lg-kimlinjen inhiberes, idet en funksjonell beskjed som koder for det endogene immunglobulin ikke kan iverksettes, enten som følge av transkripsjonssvikt eller svikt i behandling av beskjeden eller lignende. En slik lesjon kan ha form av en delesjon i målgenet, et innskudd av et fremmed gen, en kombinasjon av et innskudd og en delesjon eller en erstatning hvor en xenogen sekvens benyttes med eller uten innføring av en delesjon i det endogene gen.
Når man er interessert i inaktivering av immunglobulin-subenhetens locus, vil lesjonen fortrinnsvis bli foretatt i ett eller flere av de exoner som inngår i locus for immunglobulin-subenheten, for eksempel i locusets konstante region eller J-region. Man danner således en målrettet konstruksjon som mangler funksjonelle exoner i denne region og som kan omfatte de tilstøtende sekvenser oppstrøms og/eller nedstrøms fra J- og/eller C-regionen, eller omfatter hele, eller en del av, regionen med et inaktiverende innskudd i J- eller C-exonene. Innskuddet kan være 50 bp eller mer, hvor et slikt innskudd resulterer i at dannelsen av et funksjonelt mRNA ødelegges. Det er ønskelig at minst ca. 75% av exon-sekvensen, fortrinnsvis minst ca. 90% av exon-sekvensen, deleres.
Det er ønskelig at et markør-gen benyttes i den målrettede konstruksjon for å erstatte de delerte sekvenser. Forskjellige markører, særlig slike som gjør positiv seleksjon mulig, kan benyttes. Av særlig interesse er bruken av G418-resistens som er resultat av ekspresjon av genet for neomycin-fosfotransferase ("neo").
I den målrettede konstruksjon kan det, oppstrøms og/eller nedstrøms fra målgenet, være et gen som sørger for å fastslå hvorvidt det har forekommet en homolog dobbel overkryssing (negativ seleksjon). For dette formål kan thymidinkinase-genet i Herpes simplex viruset benyttes, siden celler som uttrykker thymidinkinase kan drepes ved bruk av nukleosid-analoger som acyclovir eller gancyclovir, som har cytotoksiske virkninger på celler som inneholder et funksjonelt HSV-tk (Mansour et al., Nature. 336:348-352 (1988)). Manglende følsomhet overfor disse nukleosidanalogene indikerer at HSV-thymidinkinase-genet mangler og at det derfor når det har skjedd homolog rekombinasjon, også har skjedd en dobbelt overkryssing.
Selv om nærværet av markørgenet i genomet vil indikere at integrasjon har funnet sted, vil det fortsatt være nødvendig å bestemme hvorvidt det har skjedd en homolog integrasjon. Dette kan oppnås på flere måter. I de fleste tilfeller vil det bli benyttet DNA-analyse ved hjelp av Southern blott-hybridisering for å fastslå lokaliseringen av integrasjonen. Ved å benytte prober for innskuddet og de sekvenser i 5'- og 3'-regionene som flankerer den region hvor homolog integrasjon ville inntre, kan man vise at homolog målretting har funnet sted.
PCR kan også med fordel benyttes for å påvise nærvær av homolog rekombinasjon. Det kan benyttes PCR-primere som er komplementære med en sekvens i den målrettede konstruksjon og komplementære med en sekvens utenfor konstruksjonen og ved mållocuset. På denne måte kan det bare oppnås DNA-molekyler som har begge primerne foreliggende i de komplementære kjeder dersom det har inntrådt homolog rekombinasjon. Påvisning av fragmenter med den forventede størrelse, f.eks. ved bruk av Southern blotting-analyse, støtter antagelsen om homolog rekombinasjon.
Den målrettede konstruksjon kan videre innbefatte et replikasjonssystem som er funksjonelt i vertscellen. Disse replikasjonssystemene vil oftest involvere virale replikasjonssystemer, som f.eks. SV40 (Simian virus 40), Epstein-Barr-virus, polyomavirus, papillomavirus og lignende. Det kan benyttes forskjellige systemer for transkripsjonsinitiering, enten fra virus eller fra pattedyr-gener, så som SV40, metallathionein-l- og ll-gener, B-actin-gen, adenovirus tidlige og sene gener, fosfoglycerat-kinase-gen, RNA-polymerase ll-gen eller lignende. I tillegg til promotere kan villtype-enhancere benyttes for ytterligere å forsterke ekspresjonen av markør-genet.
Ved fremstilling av de målrettede konstruksjoner for homolog rekombinasjon, kan det inkluderes et replikasjonssystem for prokaryoter, særlig E. coli. for fremstilling av den målrettede konstruksjon, subkloning etter hver manipulering, analyse f.eks. restriksjons-kartlegging eller sekvensering, mangfoldiggjøring og isolering av den ønskede sekvens. Når det gjelder substitusjonsstrategien når det xenogene DNA-innskudd er stort, generelt mer enn ca. 50 kbp, vanligvis mer enn 100 kbp, og i alminnelighet ikke mer enn ca. 1000 kbp, kan et kunstig gjærkromosom (YAC) benyttes for kloning av den målrettede konstruksjon.
Når en målrettet konstruksjon er fremstillet og eventuelle uønskede sekvenser, f.eks. prokaryote sekvenser fjernet, kan konstruksjonen innføres i målcellen, for eksempel en ES-celle. En hvilken som helst hensiktsmessig teknikk for innføring av DNA i målcellene kan benyttes. Slike teknikker innbefatter protoplast-fusjon, f.eks. gjær-sfæroplast:cellefusjon, lipofeksjon, elektroporering, kalsiumfosfat-mediert DNA-overføring eller direkte mikroinjeksjon.
Etter transformasjon eller transfeksjon av målcellene kan målceller selekteres ved hjelp av positive og/eller negative markører, som angitt tidligere, neomycin-resistens og acyclovir- eller gancyclovir-resistens. De celler som oppviser den ønskede fenotype, kan deretter analyseres videre ved restriksjonsanalyse, elektroforese, Southern blotting-analyse, PCR eller lignende. Ved å identifisere fragmenter som viser forekomsten av lesjonene ved mållocuset, kan man identifisere celler hvor det for å inaktivere en kopi av mållocuset, har inntrådt homolog rekombinasjon.
Den ovenfor beskrevne prosess kan foretas for først å inaktivere et locus for tung kjede i en embryonisk stamcelle, hvorpå cellene mikroinjiseres i verts-blastocyster som utvikler seg til et kimært dyr. De kimære dyrene parres for å oppnå heterozygote verter. Ved formering av de heterozygote vertene kan det oppnås en homozygot vert eller isoleres embryoniske stamceller, som transformeres for å inaktivere det andre IgH-locus, hvorpå prosessen gjentas inntil alle ønskede loci er inaktivert. Alternativt kan locus for den lette kjede være det første som inaktiveres. For fullstendig å eliminere evnen til å danne lett kjede immunglobulin, er det ønskelig å inaktivere locus for både lambda og kappa lett kjede immunglobulin. På et hvilket som helst trinn kan de xenogene loci innføres.
Som allerede nevnt kan mållocuset byttes ut med det analoge xenogene locus. På denne måte vil det xenogene locus bli anbragt i det vesentlige i samme region som det analoge vertslocus, slik at enhver regulering som er assosiert med locusets posisjonen i det vesentlige vil være den samme for det xenogene immunglobulin-locus. Ved for eksempel å isolere den variable region av det humane IgH-locus (inklusivt V-, D-, og J-sekvenser), eller en del av disse, og flankere det humane locus med sekvenser fra det murine locus, fortrinnsvis sekvenser som er adskilt med minst ca. 5 kbp i verts-locuset, fortrinnsvis minst ca. 10 kbp i verts-locuset, kan det humane fragment settes inn i denne region ved rekombinasjon, hvor-under det humane immunglobulin-locus erstatter den endogene variable region av verts-immunglobulin-locuset. På denne måte kan vertens evne til å danne en endogen immunglobulin-subenhet avbrytes, mens promoteren for det humane immunglobulin-locus kan aktiveres av verts-enhanceren og reguleres av vertens regulerende system.
For å oppnå dannelse av xenogene bindingsproteiner i en vert, er det nødvendig at verten er i stand til å frembringe de nødvendige enzymer og andre faktorer som er involvert i produksjonen av antistoff, men mangler kompetente endogene gener for ekspresjon av tunge og lette subenheter av immunglobuliner. De enzymer og andre faktorer som er assosiert med kimlinje-rearrangering, spleising, somatisk mutasjon og lignende, vil således være funksjonelle i verten. Hva som vil mangle er en funksjonell naturlig region som omfatter de forskjellige exoner som er assosiert med dannelsen av endogent immunglobulin.
Integreringen av innført xenogent DNA kan være tilfeldig eller homolog, avhengig av den bestemte strategi som benyttes. Ved å benytte gjentatte transformasjonstrinn, eventuelt i kombinasjon med parring, kan det således oppnås transgene dyr som er i stand til å produsere xenogene bindingsproteiner i det vesentlige uten lett eller tungt endogent immunglobulin. Ved transformasjon menes enhver teknikk for innføring av DNA i en levedyktig celle, så som konjugasjon, PEG-mediert cellefusjon, transformasjon, transfeksjon, transduksjon, elektroporering, lipofeksjon, "biolistics" eller lignende.
Når de xenogene loci er innført i vertsgenomet, enten ved homolog rekombinasjon eller ved tilfeldig integrering, og vertsdyr med de endogene immunglobulin-loci inaktivert, er produsert ved passende formering av de forskjellige transgene dyr, eller dyr oppnådd fra kimære dyr, kan man fremstille et vertsdyr som mangler den naturlige evne til å produsere endogent immunglobulin, men har evnen til å produsere xenogene immunglobuliner med i det minste en betydelig del av den xenogene kildes repertoar.
Den funksjonelle inaktivering av de to kopiene av hver av de tre verts-lg-loci (tung, kappa og lambda), hvor verten da inneholder det humane IgH og de humane lg-kappa- og/eller lambda-loci vil gjøre produksjon av rent humane antistoff-molekyler mulig uten produksjon av verts-antistoff eller verts/humane kimære antistoff. En slik vertsstamme vil ved immunisering med spesifikke antigener, svare med produksjon av murine B-celler som produserer spesifikke human-antistoff, hvor B-cellene kunne fusjoneres med murine myelomceller eller immortaliseres på annen måte for vedvarende stabil produksjon av humane monoklonale antistoff. Metoder for å oppnå vedvarende stabil produksjon av monoklonale antistoff er vel kjent på området.
Metodikk og strategier behøver ikke være begrenset til fremstilling av fullstendige immunglobuliner, men gir mulighet for å frembringe regioner
forbundet med en del av den konstante region, f.eks. Cm. CH2, Ch3 eller CH4 eller kombinasjoner av disse. Alternativt kan ett eller flere av exonene av Ch-og CK- eller CA-regionene erstattes med, eller forbindes med en sekvens som koder for et annet protein, så som et enzym, f.eks. plasminogenaktivator, superoksyd-dismutase, etc; toksiner, f.eks. ricin, abrin, difteritoksin, etc; vekstfaktor; cytotoksisk middel, f.eks. TNF; reseptorligand eller lignende. Se for eksempel WO 89/07142; WO 89/09344; og WO 88/03559. Ved å sette inn det interessante protein i et konstant region-exson og sørge for spleising av den variable region til det modifiserte konstantregion-exon, kan det resulterende bindingsprotein ha en annen C-terminal region enn immunglobulinet. Ved å forsyne det innskutte gen med en stoppsekvens vil proteinproduktet ha det innskutte protein som den C-terminale region. Om ønskes, kan den konstante region være helt erstattet med det andre proteinet ved å sørge for en konstruksjon med de riktige spleiseseter for sammenføyning av den variable region med det andre proteinet.
B-cellene fra den transgene vert, som produserer immunglobulin eller immunglobulin-analog, kan benyttes for fusjon til en murin myeloid celle for fremstilling av hybridomer, eller immortaliseres ved hjelp av andre konvensjonelle fremgangsmåter, f.eks. transfeksjon med onkogener. Disse immortaliserte cellene kan deretter dyrkes i kontinuerlig kultur eller innføres i peritoneum til en forlikelig vert for fremstilling av ascites.
Fremstilling av polyklonalt humant antiserum eller humane monoklonale antistoff eller antistoff-analoger er mulig. Når verts-pattedyret er blitt immunisert med et immunogen, kan de resulterende humane antistoff isoleres fra andre proteiner ved bruk av en affinitetskolonne som har en Fc-bindende del, så som protein A eller lignende.
Oppfinnelsen inkluderer følgende utførelsesformer av ikke-humane vertsdyr (se også Figur 18): I. Dyr som er heterozygote for et inaktivt endogent lett kjede immunglobulin-gen (homozygote dyr oppnås ved krysning); II. Dyr som er heterozygote for et inaktivt endogent tung kjede immunglobulin-gen (homozygote dyr oppnås ved krysning); III. Dyr som er homozygote for funksjonelle endogene lett og tung kjede immunglobulin-gener og hemizygote for (dvs. inneholdende en kopi av) fremmede, fortrinnsvis humane, tung kjede immunglobulin-gener (homozygote dyr oppnås ved krysning); IV. Dyr som er homozygote for funksjonelle endogene lett og tung kjede immunglobulin-gener og hemizygote for fremmede, fortrinnsvis humane, lett kjede immunglobulin-gener (homozygote dyr oppnås ved krysning); V. Dyr som er heterozygote for inaktive endogene tung og lett kjede immunglobulin-gener oppnådd ved kryssing av dyr av kategori I med dyr av kategori II (homozygote dyr oppnås ved krysning); VI. Dyr som er heterozygote for inaktive endogene tung og lett kjede immunglobulin-gener og hemizygote for fremmede, fortrinnsvis humane, tung kjede immunglobulin-gener oppnådd ved kryssing av dyr av kategori III med dyr av kategori V (dyr som er homozygote for de inaktive endogene loci og homo- eller hemizygote for det fremmede gen, oppnås ved krysning); VII. Dyr som er heterozygote for inaktive endogene tung og lett kjede immunglobulin-gener og hemizygote for fremmede, fortrinnsvis humane, lett kjede immunglobulin-gener oppnådd ved kryssing av dyr av kategori IV med dyr av kategori V (dyr som er homozygote for de inaktive endogene loci og homo- eller hemizygote for det fremmede gen, oppnås ved krysning); VIII. Dyr som er homozygote eller heterozygote for inaktive
endogene tung og lett kjede immunglobulin-gener og hemizygote for fremmede, fortrinnsvis humane, lett kjede immunglobulin-gener oppnådd ved kryssing av dyr av kategori VI og VII (dyr som er homozygote for de inaktive endogene loci og homo- eller hemizygote for det fremmede gen, oppnås ved krysning);
I henhold til en foretrukket utførelsesform benyttes de homozygote dyrene av kategori VIII til fremstilling av humane antistoff.
IX. Dyr som er homozygote for funksjonelle endogene tung og lett kjede immunglobulin-gener og hemizygote for fremmede, fortrinnsvis humane, tung og lett kjede immunglobulin-gener, oppnådd ved kryssing av dyr av kategori III og IV (homozygote dyr oppnås ved krysning);
X. Dyr som er heterozygote for et inaktivt endogent tung kjede immunglobulin-gen og hemizygot for fremmede, fortrinnsvis humane, tung og lett kjede immunglobulin-gener, oppnådd ved kryssing av dyr av kategori II og IX (dyr som er homozygote for de inaktive endogene loci og homo- eller hemizygote for det fremmede gen, oppnås ved krysning);
XI. Dyr som er heterozygote for et inaktivt endogent lett kjede immunglobulin-gen og hemizygote for fremmede, fortrinnsvis humane, tung og lett kjede immunglobulin-gener, oppnådd ved kryssing av dyr av kategori I og IX (dyr som er homozygote for de inaktive endogene loci og homo- eller hemizygote for det fremmede gen, oppnås ved krysning).
Fremgangsmåtene angitt ovenfor muliggjør innføring av store sammenhengende, xenogene DNA-sekvenser i en ikke-human vert, f.eks. et pattedyr. Vanligvis vil sekvensen være minst 100 kb, oftere minst ca. 200 kb og i alminnelighet utgjøre fra ca. 200 til 1000 kb. Det kan således være ønske om å overføre et locus av interesse, så som immunglobulin-locus, T-celle-reseptor-locus, det viktigste vevsforlikelighets-locus; regioner av et xenogent kromosom som kan inkludere ett eller flere gener av interesse, som kan, men ikke behøver, være karakterisert, så som LDL-reseptoren (Low Density Lipoprotein receptor), Apolipoprotein (Apo) B, Apo E, transmembranlednings-regulatoren (transmembrane conductor regulator) for cystisk fibrose, dystrofin eller regioner av xenogene kromosomer som kan være involvert i partiell kromosom-trisomi (f.eks. kromosom 21, 7 og 10); og virus. Slikt DNA kan omfatte villtypegener eller defekte gener for studium av en rekke sykdommer, ved å frembringe dominante mutasjoner eller komplementere recessive mutasjoner. For eksempel kan LDL-reseptoren og Apo-B-gener innføres for studium av hyperkolesterolemi, hyperlipoproteinemi og aterosklerose. Faktor VIII eller IX kan innføres for hemofili, cystisk fibrose transmembranlednings-regulator kan innføres for cystisk fibrose og dystrofin-genet for muskeldystrofi. Det xenogene DNA beregnet for innføring ved bruk av YAC, skriver seg fra pattedyr, særlig primater og spesielt mennesket, andre vertebrater eller invertebrater og lignende. Man kan således gi verten en rekke nye muligheter, frembringe genetiske responser relatert til den xenogene DNA-kilde, sørge for produksjon av antistoff, sørge for spesifikke kombinasjoner av transkripsjonsfaktorer, sørge for metabolske systemer, innføre dominante mutasjoner eller komplementere recessive mutasjoner. Det xenogene DNA kan modifiseres når det er tilstede i et YAC. Siden homolog rekombinasjon er virksom i gjær og gir høy andel av sete-spesifikk integrasjon av homologt DNA når det homologe DNA flankerer annet DNA av interesse, er man i stand til å modifisere det xenogene DNA før innføring i en ES-celle. På denne måte kan man i verten innføre avvikende gener som uttrykker avvikende proteiner for å etterligne sykdomstilstander i den xenogene vert, for å studere forskjellige mekanismer for interaksjonen mellom avvikende proteiner og andre xenogene proteiner eller endogene proteiner, eller for å studere gener eller gensystemer.
For å overføre store DNA-segmenter som her utførlig beskrevet, benyttes generelt YAC som omfatter en gjær-centromer, et replikasjons-origo og telomerer som avgrenser det interessante DNA. Det kan benyttes forskjellige centromerer eller telomerer, særlig centromerene fra gjær-kromosomene 4 og 5. YAC har en markør som tillater seleksjon eller screening av celler som YAC integreres i. Ikke alle markører muliggjør effektiv seleksjon. Særlig har HPRT-genet, nærmere bestemt humant HPRT, vist seg å gi effektiv seleksjon av HPRT-manglende ES-celler som bærer YAC. Andre kjente markører som kan selekteres eller underkastes screening, inkluderer hygromycin, neomycin, B-gal og GPT. ES-cellen kan oppnås fra et hvilket som helst ikke-humant vertsdyr, som ES-celler er tilgjengelige fra og som kan formeres i kultur som forblir levedyktig og funksjonell og som det eksisterer en seleksjonsmarkør for, og hvor ES-cellen kan føres inn i et embryo og kan repopulere verten, inklusivt kimlinjen. Denne evne er hovedsakelig etablert hos gnagere, f.eks. mus og rotter, og i mindre grad hos marsvin. Mus har vært benyttet for produksjon av antistoff eller B-lymfocytter for immortalisering for produksjon av antistoff. Siden mus lett lar seg håndtere, kan produseres i store mengder og er kjent for å ha et omfattende immunrepertoar, vil mus vanligvis være det dyr som foretrekkes. Etter hvert som andre arters ES-celler blir tilgjengelige, kan disse også benyttes i henhold til foreliggende oppfinnelse. Små forsøksdyr, særlig gnagere, eller husdyr, inklusivt mus, rotter, kaniner, kyr, griser, hamstere, hester, hunder, sauer og marsvin, eller fugl, som f.eks. høns, kalkun, etc, vil være av særlig interesse. ES-cellene kan ha én eller flere mutasjoner, for eksempel mangle en bestemt aktivitet. Av særlig interesse i henhold til foreliggende oppfinnelse er ES-celler som mangler HPRT. Dessuten kan befruktede egg av visse arter finne anvendelse i henhold til oppfinnelsen.
Aktuelt YAC kan oppnås ved screening av eksisterende humane YAC-bibliotek, som f.eks. de som er tilgjengelige fra Centre d'Etude du Polymorphisme Human (C.E.P.H.), Paris, Frankrike og Washington University, St. Louis, MO, ved å benytte standardmetoder. Alternativt kan YAC lett fremstilles, som her utførlig beskrevet, ved å forene de gjær-flankerende segmenter som omfatter én arm med en centromer og telomer og en annen med en telomer sammen med det interessante DNA. Vanligvis vil det også forekomme én eller flere markører i gjærvertens celler som muliggjør seleksjon. Av særlig interesse for gjærseleksjon er markører som komplementerer mutasjoner av gjærverten så som gener som inngår i produksjonen av aminosyrer, puriner eller pyrimidiner, URA3, TRP1, LYS2, ADE2 på YAC for å komplementere ura3-, trp1-, Iys2- og Ade2-mutasjoner i verten. Ved å sørge for komplementering vil hovedsakelig bare gjærceller som bærer hele YAC være i stand til å overleve i et selektivt medium. I tillegg til gentisk å bekrefte at begge YAC-armene er bibeholdt, er det ønskelig å bekrefte integriteten av YAC ved å benytte en slik fremgangsmåte som pulsfelt-gelelektroforese.
De gjærverter som bærer YAC kan deretter benyttes som kilde for det YAC som skal innføres i ES-cellen. Overføring av YAC oppnås effektivt ved å fremstille gjær-sfæroplaster i henhold til konvensjonell teknikk. Ved å bryte ned den ytre vegg under milde betingelser i et isotonisk medium, fremstilles sfæroplaster i høyt utbytte. Eksponensielt voksende ES-celler protease-behandles, f.eks. trypsiniseres, og kombineres med sfæroplastene. En pellet av gjær-sfæroplaster kan lett fremstilles, og ES-cellene sentrifugeres sammen med denne pellet og eksponeres overfor et fusogent middel, som f.eks. PEG i 1-2 minutter. Cellene resuspenderes og inkuberes deretter i passende serumfritt medium. Cellene utplates deretter på "feeder" celler, hvoretter de selekteres i overensstemmelse med den selektive markør. For HPRT-genet kan HAT-medium benyttes til seleksjon. Overlevende fusjonskolonier blir deretter plukket, mangfoldiggjort og analysert. Analysen kan foretas ved restriksjonsenzym-analyse i kombinasjon med Southern blotting eller pulsfelt-gelelektroforese eller ved polymerase-kjedereaksjonen (PCR), under bruk av passende primere, hvorav minst én er komplementær med DNA-innskuddet, og med en probe med repeterende sekvenser som forekommer i det xenogen DNA, så som Alu, for deteksjon av humane DNA-sekvenser. Ty, Y', rDNA og delta-sekvenser benyttes i proben for å fastslå gjærsekvenser. Prober for YAC-ender benyttes til bekreftelse av integriteten av YAC. De celler som oppviser det intakte eller tilnærmet intakte YAC-DNA integrert i verts-genomet benyttes deretter i de neste trinn. I enkelte kloner integreres bare en del, eller lite eller intet av gjær-DNA i muse-genomet. Det integrerte gjær-DNA varierer fra mer enn ca. 90% av det opprinnelige gjær-genom til mindre enn ca. 10%.
I henhold til en foretrukket utførelsesform oppnås effektiv produksjon av transgene ikke-humane vertsdyr ved å benytte en fremgangsmåte som integrerer store, minst 100 kb, xenogene DNA-fragmenter i tilnærmet intakt form, i en vert i form av en embryonisk stamcelle (ES) eller et befruktet egg (zygote). Innføringen av det xenogene DNA oppnås på en effektiv måte ved fusjon av ES-cellen med gjær-sfæroplaster som inneholder de YAC som er bærere av de 100 kb DNA, og en selekterbar markør, under betingelser som muliggjør integrering av det YAC-DNA som inneholder markøren, i ES-celle-genomet, eller ved transfeksjon av et renset YAC, inn i ES-celler. ES-celler som omfatter det YAC som er integrert i genomet, selekteres deretter ved hjelp av markøren, som er funksjonell i ES-cellen. For eksempel kan hypoxantin-fosforibosyl-transferase-genet (HPRT-genet) benyttes som en markør i HPRT-manglende (HPRT-) ES-celler. For å produsere dyr fra embryoniske stamceller, kan cellene etter transformasjon, plates ut på lag av feeder-celler i et passende medium, f.eks. føtalt bovint serum-forsterket DM EM. ES-cellen kan ha et enkelt mållocus (heterozygot) eller kan manipuleres ved hjelp av homogenotiseringsprosessen slik at begge loci målrettes (homozygot). Homogenotiseringsprosessen (dannelse av homozygoter) benytter seleksjonstrykk for å utvikle de celler som har den gensøkende forekomst på begge kromosomer. Celler som inneholder de to målrettede alleler kan påvises ved å benytte et selektivt medium, og etter tilstrekkelig tid til at koloniene kan vokse, kan kolonier plukkes og analyseres med henblikk på inntrådt integrasjon eller homolog rekombinasjon. Som beskrevet tidligere kan PCR benyttes med primere innenfor eller utenfor konstruksjonssekvensen, men ved mållocuset.
De kolonier som oppviser homolog rekombinasjon, kan deretter benyttes for embryo-manipulering og blastocyst-injeksjon. De selekterte ES-cellene føres deretter inn i embryoer i passende vertsdyr ved mikroinjeksjon eller på annen måte. For eksempel kan murine blastocyster oppnås fra hunndyr, ved spyling av uterus 3,5 dager etter ovulasjon. De modifiserte ES-cellene blir deretter trypsinisert, hvoretter minst 1 og opptil 15 celler, kan injiseres inn i blastocystens blastocøl. Etter injeksjon returneres minst 1, og ikke mer enn ca. 10, av blastocystene til hvert uterushorn i pseudogravide hunner. Hunnene går videre til termin, og de resulterende kimære dyr kan så analyseres på forekomst av YAC i deres somatiske celler. Med "kimær" menes et dyr som er bærer av celler oppnådd fra mer enn én kilde, f.eks. fra vertsdyret og en annen dyreart. I sammenheng med foreliggende oppfinnelse inneholder eksempelvis et kimært murint dyr en genetisk modellert modifikasjon, særlig et humant gen, i enkelte av dets celler, f.eks. i celler som utvikles fra de modifiserte embryoniske stamcellene. Forekomsten av det integrerte YAC i frembragte kimære vertsdyr, blir deretter analysert. De kimære vertsdyr undersøkes med henblikk på kimlinje-overføring av ES-celle-genomet ved parring, for eksempel ved å parre kimære mus med C57BL/6J-mus. Kimære vertsdyr kan parres med ikke-kimære verter, enten de er genetisk identiske eller allogenetiske, for screening av kimærer som i kimcellene bærer dette YAC. Avkom som er heterozygot for den genetiske modifikasjon krysses deretter for å produsere avkom som er homozygot for modifikasjonen og som konsekvent overfører den virksomme YAC-konstruksjon til sitt avkom.
Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen for innføring av store xenogene DNA-segmenter i et ikke-humant vertsdyr, særlig en gnager, og vanligvis et murint dyr, sørger for stabil integrasjon av dette DNA. Gener i det innskutte DNA viser seg å være funksjonelle, og de resulterende kimære vertsdyr er i stand til å sørge for kimlinje-overføring av det integrerte DNA. Etter parring av det kimære vertsdyr, frembringes transgene heterozygote vertsdyr som parres for å frembringe et homozygot dyr som kan benyttes for en lang rekke formål, inklusivt fremstilling av produkter som f.eks. bindingsproteiner, for eksempel immunglobuliner, til screening av forskjellige medikamenter, til genterapi, for eksempel for å komplementere for recessive genetiske forstyrrelser, til studium av ulike sykdommer, til studium av funksjonen og reguleringen av dårlig kartlagte store DNA-fragmenter.
De etterfølgende eksempler er gitt som illustrasjon.
EKSPERIMENTELT
EKSEMPEL 1
L Inaktivering av genene for tung kjede J ( Jh) hos mus
A. Konstruksjon av den målrettede inaktiverinosvektor
Et 6,4 kb EcoRI fragment som inneholder genene fra mus for tung kjede J- og flankerende sekvenser, klones fra et genomisk bibliotek fra et Balb/C muse-embryo ved å benytte de prober som er beskrevet i Sakano et al., (1981), Nature. 290:562-565. Dette fragmentet (mDJ) settes inn i EcoRI-kuttet pUC19-plasmid (pmDJ). Et 2,9 kb-fragment som inneholder 4J-genene deleres ved Xhol-Scal-kutting (pmDQJNeo, se Figur 1). Et 1150 bp Xhol-BamHI fragment som inneholder et neomycin-resistensgen regulert av thymidinkinase-genpromoteren i Herpes simplex virus (HSV-tk) og en polyoma-enhancer isoleres fra pMCINeo (Thomas & Capecchi (1987), Cell. 51, 503-512). En syntetisk adapter adderes til dette fragment for å omdanne BamHI-enden til en Scal-ende, og det resulterende fragment forbindes med Xhol-Scal-pmD6J for å danne inaktiveringsvektoren (pmDSJ.Neo) hvor 5'- til 3'-orienteringen av neomycinet og de tunge kjede-promotorene er identisk. Dette plasmid lineariseres ved Ndel-oppslutning før transfeksjon til ES-celler. Sekvensene som regulerer den homologe rekombinasjon, er 3 kb og 0,5 kb-fragmenter som er lokalisert henholdsvis 5' og 3' til neomycin-genet.
B. Dyrkning, eletroporerina oa seleksjon av ES- celler ES-cellelinjen E14TG2a (Hooper et al (1987), Nature. 326:292-295) dyrkes på mitomycin-behandlede primære embryoniske fibroblast-feeder-lag i det vesentlige som beskrevet (Doetschman et et. (1985), J. Embrvol. Exp. Morphol. 87:27-45). De embryoniske fibroblastene fremstilles fra embryoer fra C57BL/6 hunner som 14 til 16 dager tidligere er parret med en hann som er homozygot for et neomycin-transgen (Gossleret al., (1986), PNAS 83:9065-9069). Disse cellene kan vokse i medier inneholdende G418. Elektroporerings-betingelsene er beskrevet av (Boggs et al., (1986), Ex. Hematol. ( NY). 149:988-994). ES-cellene trypsiniseres, resuspenderes i dyrkningsmediet i en konsentrasjon på 4 x 10<7>/mL og elektroporeres i nærvær av den målrettede DNA-konstruksjon i en konsentrasjon på 12 nM i det første forsøk og 5 nM DNA i det andre. En spenning på 300 V med en kapasitans på 150-250 uF har vist seg optimal med en elektroporeringscelle av 5 mm lengde og et tverrsnitt på 100 mm<2>. Deretter utplates 5 x 10<6> elektroporerte celler på mitomycin-behandlede fibroblaster i 100 mm skåler i nærvær av Dulbecco's modifiserte Eagle's medium (DMEM) supplert med 15% føtalt bovint serum (FBS) og 0,1 mM 2-merkaptoetanol. Mediene erstattes 24 timer etter elektroporering med medier som inneholder 200 ug/ml_ G418.
ES-kolonier som resulterer 10-14 dager etter elektroporering plukkes med uttrukne kapillær-pipetter for analyse ved bruk av PCR. Halvparten av hver utplukkede koloni oppbevares i 24-brønns plater hvor det allerede er utsådd mitomycin-behandlede feeder-celler. De andre halvdelene, hvor 3-4 slås sammen, overføres til Eppendorf-rør inneholdende ca. 0,5 ml_ PBS og analyseres for homolog rekombinasjon ved PCR. Betingelsene for PCR-reaksjonene er i det vesentlige som beskrevet (Kim & Smithies (1988), Nucleic Acids Res. 16:8887-8893). Etter sentrifugering resuspenderes den oppnådde ES-cellepellet i 5 ul_ PBS og lyseres ved tilsetning av 55 ul_ H20 til hvert rør. DNAser inaktiveres ved oppvarming av hvert rør til 95°C i 10 minutter. Etter behandling med proteinase K ved 55°C i 30 minutter, overføres 30 ul_ av hvert lysat til et rør inneholdende 20 ul_ av en reaksjonsblanding som innbefatter PCR-buffer:1,5 ug av hver primer, 3U Taq polymerase, 10% DMSO og 0,2 mM av hver dNTP. Ved PCR-mangfoldiggjøringen benyttes 55 runder under bruk av en "thermocycler" med 65 sekunders smelting ved 92°C og 10 minutters renaturering og polymerisasjon ved 65°C. De to oligonukleotid-primerne er
TGGCGGACCGCTATCCCCCAGGAC og TAGCCTGGGTCCCTCCTTAC,
som tilsvarer henholdsvis en region 650 baser 3' fra startkodonet til neomycin-genet og sekvenser lokalisert i genet for tung kjede hos mus, 1100 baser 3' fra innskuddssetet. 20 uL av reaksjonsblandingen underkastes eletroforese på agarosegel og overføres til nylonmembraner (Zeta Bind). Filterne behandles med prober som utgjøres av et <32>P-merket fragment av 991 bp Xbal-fragmentet av J-C-regionen.
EKSEMPEL II
IL Delesion av genene for lg tung kiede J ( Jh) i ES- celler
fra mus
A. Konstruksjon av den målrettede substitusionsvektor
Et 6,1 kb EcoRI fragment som inneholder genene for immunglobulin tung kjede J-regionen og flankerende sekvenser, klonet fra et genomisk bibliotek fra et Balb/C muse-embryo og innskutt i pUC18 (pJH), ble kuttet med Xhol og Nael for å delere et ca. 2,3 kb fragment inneholdende de fire J-genene (se Figur 2A). Et ca. 1,1 kb Xhol-BamHI fragment med butte ender ved BamHI-setet, inneholdende et neomycin-resistensgen regulert av Herpes simplex virus thymidinkinase-gen- (HSV-tk) promoteren og polyoma-enhancer ble isolert fra pMC1 Neo (Thomas & Capecchi (1987), Cell. 51, 503-512). Dette fragmentet ble innskutt i det Xhol-Nael-delerte pJH for å danne delesjonsvektoren (pmH5J, se Figur 2B), hvor den transkripsjonene orientering av neomycin- og tung kjede-genene er den samme. Dette plasmidet ble linearisert ved Ndel-kutting før transfeksjon til ES-celler. Sekvensene som regulerer den homologe rekombinasjon, er ca. 2,8 kb og ca. 1,1 kb-fragmenter som er lokalisert henholdsvis 5' og 3' til neomycin-genet.
B. Dyrkning, eletrooorering og seleksjon av ES- celler
ES-cellelinjen E14TG2a (Koller & Smithies (1989), PNAS USA, 86:8932-8935) ble dyrket på mitomycin-C-behandlede embryoniske fibroblast-feeder-lag som beskrevet (Koller & Smithies (1989), PNAS USA, 86:8932-8935). ES-celler ble trypsinisert, resuspendert i HPS-buffer (pH 7,05; 137 mM NaCI, 5 mM KCI, 2 mM CaCI2, 0,7 mM Na2HP04> 21 mM HEPES pH 7,1) i en konsentrasjon på 2 x 10<7>/mL og elektroporert i nærvær av 50 ug/ml av den lineariserte inaktiveringsvektor. Elektroporering ble foretatt med en BioRad Gene Pulser ved bruk av 240 volt og en kapasitans på 500 uF. 5x10<6> elektroporerte celler ble utplatet på mitomycin-C-behandlede fibroblaster i 100 mm skåler i nærvær av Dulbecco's modifiserte Eagle's medium (DMEM) supplert med 15% føtalt bovint serum og 0,1 mM 2-merkaptoetanol. Mediene ble erstattes 24 timer etter elektroporering med medier som inneholdt 200 ug/ml_ G418. G418-resistente ES-kolonier som var resultat av vekst i 12-14 dager etter elektroporering, ble plukket med uttrukne kapillær-pipetter for analyse ved bruk av polymerase-kjedereaksjon (PCR). Halvparten av hver utplukkede koloni ble overført til individuelle brønner i en 24-brønns plate hvor det allerede var utsådd mitomycin-C-behandlede feeder-celler. De andre halvdelene, hvor 4 og 4 av disse er slått sammen, ble overført til Eppendorf-rør inneholdende 0,3 ml_ PBS, og det ble fremstillet celle-lysater for PCR-analyse som beskrevet av Joyner et al.
(1989) Nature. 338: 153-155. PCR-reaksjonen inkluderte 5-20 ul_ av celle-lysatet, 1 uM av hver primer, 1,5 U Taq polymerase og 200 uM dNTP. PCR-amplifikasjonen benyttet 45 runder under bruk av en "thermocycler" (Perkin-Elmer Cetus) med 1 minutts smelting ved 94°C, 2 minutters renaturering ved 55°C og 3 minutter polymerisasjon ved 72°C. De to oligonukleotid-primerne
er ACGGTATCGCCGCTCCCGAT og AGTCACTGTAAAGACTTCGGGTA,
som tilsvarer henholdsvis ca. 120 baser 5' fra BamHI-setet til neomycin-genet og sekvenser lokalisert i genet for tung kjede hos mus, ca. 160 baser 3' fra innskuddssetet. Vellykket homolog rekombinasjon fører til et ca. 1,4 kb fragment. 20 uL av reaksjonsblandingen underkastes eletroforese på 1% agarose-gel, farves med etidiumbromid og overføres til nylonmembraner (Gene Screen). Filterne behandles med probe bestående av et <32>P-merket ca. 1,4 kb EcoRI-Pstl-fragment lokalisert i tung kjede hos mus, 3' av
innskudds-setet (se Figur 2). For videre analyse ble det fremstillet genomisk DNA fra ES-celler, kuttet med restriksjonsenzymer i henhold til produsentens anbefaling, og fragmenter separert på 1% agarose-gel. DNA ble overført til nylonmembraner (Gene Screen) og behandlet med det ovenfor beskrevne <32>P-merkede fragment som probe.
C Analyse av G418- resistente ES- kolonier
I det første forsøk fastslo PCR-analyse av de sammenslåtte kolonier et positivt PCR-signal av forventet størrelse (ca. 1,4 kb) fra 34 sammenslåtte forråd som representerte 136 G418-resistente kolonier. De fire enkeltkolonier som hadde bidratt til dette positive forråd ble analysert individuelt ved PCR, og en positiv klon, ES33D5, ble idintifisert. Lignende analyse av 540 G418-resistente kolonier oppnådd i det andre forsøk, førte til fire ytterligere positive kloner (ES41-1, ES61-1, ES65-1, ES110-1).
For å bekrefte den målrettede ødeleggelse av én kopi av J-genene (genet er autosomalt og foreligger således i to kopier), ble de PCR-positive klonene mangfoldiggjort og genomisk DNA fremstillet, kuttet med Hindi 11 eller med Sacl og analysert ved Southern blotting-analyse som beskrevet ved bruk av EcoRI-Pstl-proben.
Erstatningen av J-genene ved innskudd av neomycin-genet ved en homolog rekombinasjon, resulterer i et Hindi 11 fragment som kan påvises med EcoRI-Pstl-proben, som er ca. 1,9 kb lenger enn det tilsvarende
fragment i det native locus, hvilket skyldes tapet av to Hindlll-seter lokalisert i den delerte J-gen-region (se Figur 2C). Southern blotting-analyse av hver av de fem positive klonene ved Hindlll-kutting ga et mønster som tydet på at én av de to kopiene av tung kjede J-genene var ødelagt. Tre merkede fragmenter ble påvist: ett fragment (760 bp) med samme størrelse som det forekommende i ubehandlede celler med samme intensitet, ett fragment (ca. 2,3 kb) med samme størrelse som det forekommende i ubehandlede celler, men med nedsatt intensitet i den PCR-positive klon, og et ytterligere fragment ca. 4,2 kb, den størrelse som forventes ved en homolog rekombinasjon, kun forekommende i de PCR-positive klonene. På tilsvarende måte resulterer erstatning av J-genene med neomycin-genet ved
homolog rekombinasjon i et tap på ett Sacl-sete og forekomst av et fragment som kan påvises med EcoRI-Pstl-proben og som er ca. 570 bp kortere enn det tilsvarende fragment i det native locus (se Figur 2C). Southern blotting-analyse av klonene etter Sacl-kutting ga det forventede mønster til ett nativt og ett målrettet allel: ca. 4,0 kb fragment, med samme størrelse som det påvist i ubehandlede celler, men med nedsatt intensitet i de 5 positive klonene, og ett ytterligere fragment på ca. 3,4 kb med forventet størrelse for en målrettet homolog rekombinasjon, kun forekommende i de identifiserte klonene. Rehybridisering av de resulterende Southern blott med en probe for neomycin-genet viste at kun 4,2 kb- og 3,4 kb-fragmentene, som skrev seg fra henholdsvis Hindlll- og Sacl-kuttingen, hybridiserte til proben som forventet ved målrettingen.
D. Utvikling av kimære mus med JH- delesioner
Tre og en halv dag gamle C57BL/6J (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) blastocyster ble tatt fra 4-5 uker gamle super-ovulerte hunner som beskrevet av Koller et al. 1989 (supra). ES-cellene ble trypsinisert, vasket én gang med friskt DMEM-medium og fortynnet til ca. 1 x 10<6>/mL i DMEM-medium inneholdende 10% føtalt bovint serum og 20 mM HEPES, pH 7,5.10 til 15 celler ble injisert inn i blastocølet til hver blastocyst. ES-celleholdige blastocyster ble deretter overført kirurgisk til et børhorn i C57BL/6J X DBA/2 eller C57BL/6J X CBA F1-pseudogravide hunner.
ES-cellenes bidrag til avkommet ble vurdert visuelt ved undersøkelse av ungenes pelsfarve. Farven til C57BL/6J-mus er helsort. ES-celle-foreldrelinjen E14TG2a ble isolert fra 129/Ola-embryoer som er bærer av tre pelsfarve-gener, det dominante Aw<->allel i aguti-locuset, det recessive "pink-eyes-dilute"-allel i p-locuset og det recessive C<ch> i c-locuset. Kimært avkom hvor ES-cellene har deltatt i dannelsen av dyret, har pels som inneholder aguti-grå og kremgule hår.
De kimære musenes evne til kimlinje-overføring ble undersøkt ved parring med C57BL/6J-mus, og F1-avkommet gitt poeng for aguti-farve. 50% av disse aguti-musene skulle forventes å arve det muterte allel for tung kjede som kan identifiseres ved Southern blotting-analyse av DNA isolert fra hale (tail).
Den JH-målrettede ES-cellelinje ES65-1, som bærer et målrettet allel for tung kjede, ble injisert i C57BL/6J-muse-blastocyster. Ca. 45% av det overlevende avkom var kimærer. To kimære hunner, 238-2 og 244-3, førte etter parring med C57BL/6J-hanner, til kimlinje-overføring med en frekvens på 100% og 15%, fastslått ut fra prosentandelen aguti-farvet avkom. Southern blotting-analyse av DNA fra heterozygot avkom tydet på forekomst av den målrettede tunge kjede i tillegg til et nativt allel i 2 av 5 undersøkte aguti-farvede unger.
Mus som var homozygote for mutasjonen ble oppnådd ved å krysse hann- og hunn-mus som var identifisert som Jn-delerte (5Jh) heterozygoter. Avkom etter disse parringene ble analysert ved Southern blotting-analyse på nærvær av de to målrettede alleler for tung kjede.
E Analyse av B- celler fra kimære mus
Dersom delesjon av JH-regionen er tilstrekkelig til å inaktivere locuset for tung kjede, burde det resultere i fullstendig blokkering av utviklingen av IgM-uttrykkende B-celler og av antistoff-dannelse. Mus som er heterozygote ved Jh-locuset, bærer et intakt og funksjonelt allel for tung kjede, som skriver seg fra C57BL/6J-opphavet, og et allel for JH-delert tung kjede som skriver seg fra ES-cellene (129/Ola-stamme). Stammene 129 og B6 adskiller seg med hensyn til allotyper for lg tung kjede. ES-avledede B-celler (lgM<a >allotype) kan skjelnes fra B6-avledede B-celler (lgM<b> allotype) med allotype-spesifikke monoklonale antistoff, ved å benytte flow-cytometrisk analyse av antistoff som uttrykker B.
Spesifisiteten av disse antistoffene er vist i Figur 3 (A-C). Lymfocytter fra perifert blod ble farvet med antistoff mot den B-celle-spesifikke markør, B220, og med antistoff mot IgM-allotypen. B-celler fra C57BL/6J-mus ga farve med antistoff rettet mot lgM<b->allotypen, men ikke mot lgM<a->allotypen (Figur 3B). B-celler som skriver seg fra 129/Ola-mus ga farve med antistoff mot lgM<a->allotypen, men ikke mot lgM<b->allotypen (Figur 3A). I heterozygote (a/b F1) mus som er bærere av et intakt ES-avledet allel for tung kjede, og et intakt C57BL/6J-avledet allel for tung kjede, var begge allotypene tilstede i like mengder (Figur 3C).
Når B-celler fra mus som var heterozygote for JH-delesjonen ble analysert, hvor det Jn-delerte allel for tung kjede var fra 129/Ola-opphavet, forekom ingen positive celler for Igfvf-allotypen. Alle B-celler var lgM<b->positive, fra det intakte allel for C57BL/6J tung kjede (Figur 3D). Disse resultatene tyder på at locuset for JH-delert tung kjede inaktiveres og ikke kan kode for et funksjonelt IgM-antistoff.
Mus som var homozygote for JH-delesjonen ble også analysert med henblikk på evnen til å produsere funksjonelle antistoff. Lymfocytter i perifert blod fra homozygote mutante mus ble analysert ved flow-cytometri ved å benytte antistoff mot den B-celle-spesifikke markør B220 og med de allotype-spesifikke markørene (se Figur 4). I motsetning til kontrollmusene (Figur 4D-F) kunne ingen B220<+->celler eller IgM-produserende celler påvises i de mutante musene (Figur 4A-C). Dessuten hadde mutante mus intet påvisbart IgM i serumet. Disse resultatene tyder på at delesjonen av JH-regionene fra begge allene for tung kjede fører til fullstendig inhibering av B-celleutvikling til modne B-celler og produksjon av antistoff.
F. Utvikling av homozygote mutante ES- celler
Virkningen JH-delesjon på B-celler kan også analyseres ved å utvikle ES-celler hvor begge allelene for tung kjede er målrettet, som så benyttes for å produsere kimære mus som inneholder en populasjon av lymfoide celler som er homozygote for mutasjonen.
Homozygote 5JH-mutante ES-celler ble frembragt ved å underkaste en av de heterozygote mutante ES-klonene, ES110-1, forhøyede nivåer av G418 (1,4 mg/mL) og deretter selektere for homogenotisering av det målrettede allel. Syv av de overlevende koloniene ble ved hjelp av Southern blotting-analyse under bruk av Sacl-kutting, underkastet screening med henblikk på tap av villtype-allelet for tung kjede og ervervelse av et andre målrettet allel. For en av disse klonene, ESDK207, ble det vist at den hadde mistet det native allel for tung kjede, hvilket fremgikk av at probene ikke var i stand til å påvise villtypens 4,0 kb fragment og ved den forhøyede intensitet av det 3,4 kb målrettede fragment. Karyotypisk analyse av ESDK207 tydet på at ca. 80% av cellene, i likhet med foreldrelinjen ES110-1, hadde 40 kromosomer, noe som tydet på at det forelå to målrettede alleler. De homozygote mutante ES-cellene ble mikroinjisert inn i C57BL/6J-blastocyster, og det ble utviklet kimære mus.
G. Analyse av B- celler fra homozygote kimærer
B-celler fra kimære mus ble analysert for å bestemme virkningen av JH-delesjon på B-celleutvikling og antistoffproduksjon. Lymfocytter fra ES-cellelinjen (129/Ola) kan skjelnes fra blastocyst-avledede (C57BL/6J)
lymfocytter med et monoklonalt antistoff mot Ly-9.1 -markøren som finnes på lymfocytter av 129-opprinnelse, men ikke på de av B6-opprinnelse. Dessuten adskiller de to stammene seg, som tidligere beskrevet, med hensyn til deres IgM-allotype.
De analyserte kimærene var blitt oppnådd fra villtype E14TG2a-ES-celler (WT) eller fra ES-celler som var heterozygote (ES110-1, ES65-1) eller homozygote (ESDK207) ved den målrettede JH-region. Mononukleære celler fra perifert blod ble farvet med antistoff mot den B-celle-spesifikke markør B220 og med antistoff enten mot Ly-9.1- eller IgM-allotyper, og deretter analysert ved to-farve-flowcytometri. For å vurdere kimærisme i T-cellelinjen, ble cellene farvet med antistoff for T-celle-markøren Thy 1.2 og med anti-Ly-9.1-antistoff. Farving av celler fra mus av foreldrestammen ga kontroller for spesifisitet og følsomhet av bestemmelsen.
Mus som ut fra vurdering av pelsfarven hadde samme grad av kimærisme, ble sammenlignet. ES-avledede B- og T-celler ble påvist i det perifere blod hos kimære mus utviklet fra villtype E14TG2a-ES-celler, hvilket bekrefter denne cellelinjes evne til å danne lymfoide celler in vivo. Analyse av kimærer utviklet fra individuelle JH-målrettede ES65-1- og ES110-1-celler, viste nærvær av B220<+>/lgM<a+>/Ly-9.1<+> B-celler som inneholdt et enkelt, intakt, ES-celle-avledet locus for lg tung kjede.
I kontrast til villtypen og kimærer med en enkelt delesjon, manglet mus utviklet fra den homozygote mutant ESDK207-cellelinje, Ly-9.1<+>/B220<+ >eller lgMa+/B220+1-B-celler i perifert blod. Den observerte mangel på ESDK207-avledede B-celler skyldtes ikke mangel ved lymfopoiesen i og med at ES-avledede Ly-9.1 +/B220"-celler representerte 12% av totalforrådet av mononukleære celler fra perifert blod. Av disse var ca. halvparten Thy-1.2<+->T-celler. Delesjon av JH-regionen fra begge alleler blokkerer således utviklingen av modne lgM<a->produserende B-celler. Lignende observasjoner ble gjort for kimære miltceller.
Kimærer ble også testet på nærvær av serum IgM som skrev seg fra ES-cellene. lgM<a->nivåene var høye i kimærer fra villtype ES-celler og celler med en enkelt målrettet mutasjon, men kunne ikke påvises i mus avledet fra ESDK207-cellelinjen.
Videre analyse viste at benmarg fra ESDK207-mus inneholdt normale lgM<b+->B-celler avledet fra blastocyst-verten, men manglet ES-avledede lgM<a+->B-celler. DK207-avledet benmarg inneholdt imidlertid en cellepopulasjon som var B220<dull>/Ly-9.1<+> avledet fra ES-cellene. Det er derfor sannsynlig at benmargen inneholder en subpopulasjon av ES-celle-avledede B-celle-prekursorer som blokkeres i sin modning av den homozygote delesjon av JH-regionen.
Benmargcellene ble også analysert med tre-farve-flowcytometri ved å benytte antistoff mot Ly-9.1, B220 og enten CD43 eller Thy-1.2. Resultatene viser at storparten av ES-avledede celler var CD43-positive, hvilket stemmer overens med en tidlig blokkering av modningen. Mange av cellene var også positive for Thy-1.2, hvilket var å forvente av meget tidlige B-celle-prekursorer. Disse data viser at delesjon av JH-regionen resulterer i at locuset for den tunge kjede ikke kan rearrangere og produsere funksjonelt IgM. Mangel på IgH- rearrangering resulterer i en blokkering av B-celle-modning, hvorved B-celle-progenitorer begrenses til et tidlig utviklingstrinn.
EKSEMPEL III
Delesion av den konstante region ( C*) av
lg kappa lett kiede hos mus
A. Konstruksjon av den målrettede substitusionsvektor
Kappa-regionen ble inaktivert med en vektor av substitusjonstype som ble konstruert for å delere den konstante region av kappa-locuset og erstatte den med G418-markøren for medikamentresistens gjennom homolog rekombinasjon. Homolog rekombinasjon ble regulert av homologiregioner som flankerer den konstante region (se Figur 5).
Et genomisk bibliotek fra 129/Ola-lever-DNA fra musefostere (Stratagene) klonet inn i lambda-fag ble underkastet screening på forekomst av mus-CK-genet med et 1,6 kb Hpal/BamHI fragment (Steinmetz & Zachau
(1980) Nucleic Acids Research 8:1693-1706) som spenner over den mus-kappa-konstante region. En lambda-fag-klon som hybridiserte til denne prøve, ble identifisert og deretter renset og benyttet som en kilde for CK-DNA. Analyse av fag-DNA viste at kappa-konstant-region-proben hybridiserte til et 5,6 kb Sphl/BamHI fragment. Dette fragment inneholdt kappa-J-region-genene, et intronisk enhancer-element og kappa konstant-regionen. Det ble deretter isolert og subklonet inn i Sphl- og BamHI-setene i plasmidet pUC218 for å gi plasmidet pUC218/5.6kappa.
For å konstruere delesjonsvektoren ble fragmenter inneholdende 5'-regionen av kappa konstant-regionen, et thymidinkinase-gen for negativ seleksjon, et neomycin-resistens-gen og en 3'-homologi-region til kappa konstant-regionen, ligert sammen (se Figur 6).
Et 4,0 kb Sphl/Bsu361 fragment fra plasmidet pUC218/5.6kappa ble subklonet inn i Sphl- og Bsu361 -setene til vektoren pSK.A for å gi plasmidet pSK.A/5'K. Vektoren pSK.A er en modifikasjon av pBluescript SK- som har en syntetisk polylinker:
innskutt mellom pBluescript Kpnl- og Sacl-setene.
Et 2,7 kb EcoRI/Hindlll fragment som inneholdt herpes-thymidinkinase-(TK)-genet, regulert av mus-fosfoglyceratkinase-genpromoteren (PGK-promoter) fra plasmidet pKJtk (Tybulewicz, et al., (1991) Cell 65:1153-1163) ble innskutt i EcoRI- og Notl-setene til pSK.A/5'K ved å benytte en Hindlll/Notl-adapter med sekvensen:
I det resulterende plasmid, pSK.A/5'K/TK, befinner 5'-enden av TK-genet og genet for kappa konstant region seg i nabostilling til hverandre i motsatte transkripsjonene orienteringer.
Et 1,1 kb Xhol/BamHI fragment fra pMC1 Neo, som inneholder den pattedyr-medikament-selekterbare markør for resistens mot neomycin, ble klonet inn i Xhol- og BamHI-setene til plasmidet pSK.B for å gi plasmidet pSK.B/Neo. Vektoren pSK.B er en modifikasjon av pBluescript SK- som har en syntetisk polylinker:
innskutt mellom pBluescript Kpnl- og Sacl-setene.
Et 1,1 kb Bglll/BamHI fragment fra pUC218/5.6kappa, som inneholder homologi til 3'-enden av kappa-regionen, ble klonet inn i en BamHI-kuttet, alkalisk fosfatase-behandlet, pSK.C-vektor. Vektoren pSK.C er en modifikajson av pBluescript SK- som har en syntetisk polylinker:
innskutt mellom pBluescript Kpnl- og Sacl-setene. Det resulterende plasmid, pSK.C/3'K er orientert slik at transkripsjonen skjer fra Sacl-setet i plasmid-polylinkeren i retning mot Kpnl-setet.
Det endelige målrettede plasmid ble konstruert ved en ligering av tre deler ved å benytte (A) et 6,1 kb Notl/Ndel fragment fra pSK.A/5'K/TK, (B) et 1,2 kb Ndel/Sacl fragment fra pSK.B/Neo og (C) et 4,0 kb Sacl/Notl fragment fra pSK.C/3'K ligert for å oppnå plasmidet pK.TK/neo.
B. Elektroporering av kappa- delesionsvektor inn i ES- celler
Renset plasmid-DNA fra pK.TK/Neo ble kuttet med Pvul, ekstrahert med fenol/kloroform og utfelt med etanol. DNA ble etter utfellingen resuspendert i en konsentrasjon på 1 mg/mL i 10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA.
Den embryoniske stamcellelinje E14-1, en subklon av E14 (Hooper et al. (1987) Nature 326:292-295) ble dyrket i DMEM 4,5 g/L glukose (J.R.H. Biosciences) supplert med 15% varme-inaktivert føtalt kalveserum, rekombinant murin leukemi-inhibitor-faktor (ESGRO fra Gibco BRL,
1000 U/mL), 0,1 mM B-merkaptoetanol, 2 mM glutamin og 100 U/mL penicillin ved 37°C i 5% C02.
Cellene ble dyrket på lag av mitomycin-behandlede primære embryoniske fibroblast feeder-celler i det vesentlige som beskrevet (Koller & Smithies (1989) supra). De embryoniske fibroblastene ble fremstillet fra dag 14-embryoer som var bærere av den homozygote målrettede mutasjon av B2-mikroglobulin (Koller & Smithies (1990) Science 248:1227-1230). Disse feeder-cellene kan vokse i medier som inneholder G418.
Ved 80% konfluens ble ES-cellene preparert for elektroporering ved
trypsinisering, konsentrering ved kortvarig sentrifugering og resuspendering i HEPES-bufret saltoppløsning til 2 x 10<7> celler/mL. Cellene ble ekvilibrert ved romtemperatur og tilsatt linearisert målrettet vektor-DNA (20 ug). Blandingen ble elektroporert ved 960 uF og 250 V med en BioRad Gene Pulser. Cellene fikk stå ved romtemperatur i 10 minutter før utplating på 4 x 10 cm skåler av mitomycin-behandlede fibroblast-"feeders" (3 x 10<6> feeder-celler/plate). Etter inkubering ved 37°C i 48 timer, ble cellene tilført media som inneholdt
150 ug/mL G418 for å selektere for neomycin-resistens. Etter ytterligere 48 timer ble cellene tilført media inneholdende 150 ug/mL G418 og 2 uM gancyclovir (Syntex) for å selektere for tap av thymidinkinase-genet.
C. Analyse av målrettede ES- celler
Etter 10 dagers medikament-selektering med både G418 og gancyclovir, ble de enkelte overlevende kolonier plukket og dissosiert med en dråpe trypsin i en 96-brønns plate og deretter inkubert ved 37° i 2 minutter. Cellene fra hver koloni ble overført til en brønn i en 24-brønns plate inneholdende mitomycin C-behandlede feeder-celler og selektive media med G418, men uten gancyclovir. Etter ytterligere 5-8 dager ble 20% av cellene i hver brønn nedfrosset og resten benyttet til fremstilling av genomisk DNA. Cellene ble lysert med 0,4 mL 10 mM Tris-HCI (pH 7,5), 100 mM NaCI,
10 mM EDTA, 1% SDS og proteinase K (1 mg/mL) ved inkubering over natten ved 50°C. DNA ble renset ved fenolekstraksjon og etanolutfelling, deretter vasket med 70% etanol og resuspendert i 20 ul_ 10 mM Tris-HCI, 1 mM
EDTA.
Southern-blotting-analyse ble foretatt under bruk av Bglll-kuttet genomisk DNA fra hver prøve. Et ca. 1,2 kb BamHI/Bglll fragment som inneholder regionen sammenhengende med 3'-homologifragmentet i den målrettede vektor, ble benyttet som probe. Det native ES-celle-locus ga et ca. 2,3 kb fragment, mens det målrettede ES-celle-locus ga et ca. 5,7 kb fragment. Den økte størrelse skyldes tapet av Bglll-setet under konstruksjonen av delesjonsvektoren.
En Southern blotting-analyse av 166 kloner viste to cellelinjer som hadde den tiltenkte mutasjon. Disse klonene ble analysert videre ved at filterne ble behandlet med en probe bestående av et ca. 1,1 kb fragment som spenner over neo-genet. Som forventet, hybridiserte proben bare til det målrettede allel.
Videre analyse av det genomiske DNA fra de to positive klonene, 1L2-850 og 1L2-972, etter opptining og mangfoldiggjøring, bekreftet på nytt de første observasjonene. En tredje probe, et ca. 1,7 kb Hindlll/Bglll fragment som spenner over kappa-J-region-locuset, ble benyttet til kontroll av korrekt integreringsmønster fra 5'-enden til den målrettede vektor. Ved å benytte denne probe med EcoRI-kuttet genomisk DNA, ble et ca. 15 kb fragment påvist i det native allel og et ca. 5 kb fragment fra det målrettede locus. Det ytterligere EcoRI-setet føres inn av neo-genet under målrettet homolog rekombinasjon (se Figur 7).
P^ Utvikling av kimlinie- kimærer
De umodifiserte E14-1 -cellene har vist seg å bidra med høy frekvens til kimlinjen etter injeksjon i C57BL/6J-blastocyster. For å utvikle kimlinje-kimærer som inneholder den målrettede kappa-region, ble de målrettede cellelinjene 1L2-850 og 1L2-972 dyrket på primære feeder-celler, deretter trypsinisert og resuspendert i injeksjonsmedium som besto av DM EM supplert med 15% føtalt kalveserum, 20 mM HEPES (pH 7,3), antibiotika og B-merkaptoetanol. ES-cellene ble injisert inn i hver enkelt blastocyst og de injiserte blastocystene deretter overført til et uterushorn i en pseudogravid hunnmus. Kimære unger ble identifisert via den kimære pelsfarve. Kimære hanner ble krysset med C57BL/6J-hunner, og kimlinje-overføringen av 129/Ola-avledede ES-celler ble påvist gjennom avkommets aguti-farvede pels.
En kimær hann fra cellelinje 1L2-972 (ut fra dens pelsfarve, ca. 40% ES-celle-avledet) førte etter parring med C57B1/6J-hunnertil kimlinje-overføring med en frekvens på 25%, bestemt ved prosentandelen aguti-farvet avkom. Kimære hanner, ca. 40%, 70% og 90% kimære, fra cellelinje 1L2-850, førte til kimlinje-overføring med en frekvens på henholdsvis 90%, 63% og 33%. Blant det aguti-farvede avkom utviklet fra den 70% kimære hann fra 1L2-850, ble åtte F1-dyr av 12 dyr undersøkt ved Southern blotting-analyse (en Bglll-kutting ved å benytte det ovenfor beskrevne 1,2 kb BamHI/Bglll fragment som probe), under bruk av genomisk DNA oppnådd fra hale-DNA, funnet å være heterozygote ved kappa-locuset for den målrettede Cc-mutasjon. Parring av en hann og en hunn fra denne gruppe av åtte F1-dyr som begge var heterozygote for CK-mutasjonen, ga én hann som ble funnet å være homozygot for denne mutasjon, hvilket ble bekreftet ved Southern blotting-analyse.
E Analyse av B- celler oppnådd fra mus, målrettet ved kappa- locuset
Dersom locus for kappa (k) lett kjede er inaktivert som følge av delesjonen av den lette kjedes konstante region (Ck) den sammenkoblende region (Jk) eller både Ck og Jk, burde det resultere i fullstendig blokkering i utviklingen av K-uttrykkende B-celler. Muse-embryo-stamceller inneholdende en enkelt kopi av den fullstendige Cx-delesjon (ACk) ble innført i de ovenfor beskrevne museblastocyster for å frembringe kimære mus. Disse kimære musene ble deretter parret med villtype C57BL/6 (B6) mus, og F1-avkommet ble undersøkt på nærvær av ACK-mutasjonen ved hjelp av Southern blotting av hale-DNA. F1-mus som var bærere av ACK-mutasjonen ble parret, og F2-avkommet ble undersøkt på tilsvarende måte for ACk. Ett av fem F2-avkom viste seg å være bærer av en homozygot CK-delesjon, mens en annen var heterozygot bærer av både ACk- og et villtype CK-allel. De tre øvrige av avkommet var av villtype. Forekomst eller mangel på K-positive B-celler ble påvist ved flowcytometrisk analyse av perifere blod-B-celler farvet med fluorescerende antistoff som reagerer med en pan-B-celle-markør (B220) eller med den k lette kjede. For den homozygote ACk-F2-itius ble det ikke påvist K-positive B-celler, og i den heterozygote var det en reduksjon i frekvensen av K-positive B-celler, overensstemmende med nærværet av et villtype-allel og et ikke-funksjonelt ACK-allel. Disse resultatene viser at delesjon av Ck fra kromosomet forhindrer K-ekspresjon av muse-B-celler.
EKSEMPEL IV
Inaktivering av den kappa lett kiede J- oa konstante region i immunglobulin hos mus
A. Oppsett av målrettinasforsøket
Den målrettede vektor ble innledningsvis konstruert som en vektor av substitusjonstype for å delere den konstante region så vel som J-regionen av kappa-locuset, og erstatte det med tre elementer gjennom homolog rekombinasjon ved bruk av homologi-regioner som flankerer den konstante region (Figur 8). Et difteritoksin-gen (A-kjede) som flankerer den ene eller begge homologi-regionene, ble i enkelte tilfeller inkludert som en negativt selekterbar markør. De tre elementene besto av G418-medikamentresistens-markøren, en addert DNA-homologi (ADH)-sekvens av muse-DNA homologt til en region av kappa-locuset lokalisert oppstrøms for J-regionen, samt et thymidinkinase-gen. Som resultat av inkluderingen av ADH-sekvensen i vektoren, satte denne første målretting en andre kopi av ADH inn i locuset. Denne duplikasjon ble deretter benyttet for å gjennomføre en avgrenset delesjon av sekvensene mellom segmentene under pålegg av et seleksjonstrykk. I dette tilfelle delerte cellen thymidinkinase-genet som ligger mellom de to segmentene, for å overleve gancyclovir-seleksjon.
B. Konstruksjon av målrettings- vektoren
Homologi-regionene ble avledet fra et genomisk bibliotek av leveren fra et 129-musefoster (Stratagene) som ble underkastet screening under bruk av to prober som beskrevet ovenfor i Eksempel III. Denne subklon inneholdt J-regionen, et intronisk enhancer-element og den konstante region av locuset for kappa lett kjede. Den andre proben var et 0,8 kb EcoRI fragment (Van Ness et al., (1981), CeN, 27:593-602) som ligger 2,8 kb opp-strøms for J-regionen. Fag-DNA fra en lambda-klon som var positiv for denne probe, viste at proben hybridiserte til et 5,5 kb Sacl fragment som ble subklonet inn i Sacl-setet til pBluescript SK (Stratagene) for å gi plasmidet pSK.5'-kappa (Figur 8).
Inaktiveringsvektorene som inneholdt en 5'-homologiregion, et thymidinkinase-gen, en ADH, et neomycinresistens-gen og en 3'-homologiregion (Figur 9), i enkelte tilfeller flankert av difteritoksin-gener, ble konstruert fra tre plasmider (Figur 8) inneholdende: (a) 5'-homologifragmentet med eller uten difteritoksin-genet (DT) regulert av muse-fosfoglycerat-kinase-gen- (PGK) promoteren som en negativ selekterbar markør, (b) herpes thymidinkinase-genet (tk) regulert av muse-fosfoglyceratkinase-gen- (PGK) promoteren som en negativ selekterbar markør sammen med DSH og det G418-selekterbare neomycin (neo)-gen fra pMC1 Neo (Thomas & Capecchi (1987), CeJI, 5J.:503-12) og (c) 3'-homologifragmentet med eller uten det PGK-regulerte DT-gen. Disse tre plasmidene (Figur 8) ble konstruert fra henholdsvis pSK.A, pSK.B og pSK.C, alle avledet fra plasmidet pBluescript SK ved modifikasjon av polylinkeren.
Polylinkeren av plasmid pBluescript SK' ble modifisert ved mellom Kpnl- og Sacl-setene å klone en syntetisk polylinker definert ved oligonukleotidene
TAC-3' for å frembringe plasmidet pSK.C.
En diferitoksin-gen-kasett hvor genet var flankert av PGK-promoteren og det bovine veksthormon-polyadenyleringssignal (Woychik et al., (1984), Proe. Nati. Acad. Sei. U. S. A.. 8J.:3944-3948; Pfarr et al., (1986), DNA. 5:115-122). Et 2,3 kb Xbal/EcoRI fragment fra pTH-1 (Maxwell et al, (1986), Cancer Res. 46: 4660-4664) inneholdende difteritoksin A-kjeden regulert av den humane metallothionein- (hMTII) promoter, ble klonet inn i pBluescript SK", kuttet med Xbal og EcoRI, for å gi plasmidet pSK.DT. hMTII-promoteren av pSK.DT ble erstattet med PGK-promoteren fra pKJ1 (Tybulewicz et al.,
(1991), Cell, 65:1153-1163). Et 0,5 kb Xbal/Pstl fragment fra pKJ1 ble koblet til et 3,1 kb Xbal/Ncol fragment fra pSK.DT ved å benytte en Pstl/Ncol-adapter dannet fra oligonukleotidene 5'-GGGAAGCCGCCGC-3' og 5'-CATGGCGGCGGCTTCCCTGCA-3' for å gi plasmidet pSK.pgkDT. Et 248 bp fragment inneholdende det bovine veksthormons polyadenyleringssignal, oppnådd ved PCR-amplifikasjon av bovint genomisk DNA under bruk av oligonukleotidprimerne
5'-CAGGATCCAGCTGTGCCTTCTAGTTG-3' og
5'-CTGAGCTCTAGACCCATAGAGCCCACCGCA-3\ ble klonet inn i pCR1000 (Invitron Corp., San Diego, CA). Polyadenyleringssekvensen ble deretter klonet bak DT-genet som et Hindlll/Pvull fragment inn i pSK.pgkDT, kuttet med Hindlll og Hpal, for å gi plasmidet pSK.pgkDTbovGH. DT-genkasetten fra pSK.pgkDTbovGH ble flyttet som et 2,1 kb EcoRI/Hindlll fragment inn i pSK.A, kuttet med EcoRI og Noti, under bruk av en Hindlll/Notl-adapter dannet fra oligonukleotidene
5'-AGCTGGAACCCCTTGC-3' og 5'-GGCCGCAAGGGGTTCC-3' for å gi plasmidet pSK.A/DT. Mellom Sphl- og Bsu361-setene av både pSK.A og pSK.A/DT ble 5'-homologiregionen for kappa-locuset klonet. For dette formål ble et 4,0 kb Sphl/Bsu361 fragment resulterende fra en partiell Bsu361-kutting, etterfulgt av en fullstendig Sphl-kutting av plasmid-subklon pUC218/5.6kappa, ligert til pSK.A eller pSK.A/DT for å gi plasmidene henholdsvis pSK.A/5'K og pSK.A/DT/5'K. I plasmidet pSK.A/DT/5'K var 5'-enden av DT-genet og kappa-fragmentet nabostillet til hverandre, løpende i motsatt transkripsjonen orientering.
PGKtk-genet fra plasmidet pKJtk (Tybulewicz et al., (1991), Celj, 65:1153-1163) ble klonet som et 2,7 kb EcoRI/Hindlll mellom de unike EcoRI- og Hindlll-setene av pSK.B for å gi pSK.B/TK. Et 0,8 kb EcoRI fragment benyttet for ADH, ble klonet fra pSK.5'kappa og ligert inn i EcoRI-setet av pSK.B/TK for å gi pSK.B/(TK/0,8K) slik at 5'-enden av tk-genet og kappa-fragmentet var nabostillet og løp i motsatte transkripsjonene orienteringer. Det 1,1 kb neo-gen fra pMCINeo ble klonet som et Xhol/BamHI fragment mellom de samme seter av pSK.B/(TK/0,8K) for å gi pSK.B/(TK/0,8K/Neo). Plasmidet pSK.C/3'K som inneholdt 3'-homologifragmentet, ble konstruert ved å ligere pSK.C, kuttet med Barn Hl og behandlet med alkalisk fosfatase, til det 1,1 kb Bglll/BamHI fragment som var isolert fra pUC218/5.6kappa. I pSK.C/3'K var kappa-fragmentet orientert slik at transkripsjonen utviklet seg fra Sacl i plasmid-polylinkeren i retning av Kpnl-setet. 2,1 kb DT-kassetten fra pSK.pgkDTbovGH ble klonet som et EcoRI/Hindlll fragment inn i de samme seter av pSK.C for å gi pSK.C/3'K/DT.
Ligeringer av tre deler ble foretatt for å konstruere de endelige målrettede plasmider (Figur 9). 4,0 kb Notl/Ndel fragmentet fra pSK.A/5'K og 4,8 kb Ndel/Sacl fragmentet fra pSK.B/(TK/0,8K/Neo) (oppnådd ved en Sacl-kutting partielt fulgt av en Ndel-kutting av plasmidet), samt 4,0 kb Sacl/Notl fragmentet fra pSK.C/3'K ble isolert og ligert sammen for å frembringe pK.(TK/0,8K/Neo). Det 6,1 kb Notl/Ndel fragmentet fra pSK.A/DT/5'K, det 4,8 kb Ndel/Sacl fragmentet fra pSK.B/(TK/0,8K/Neo) og 4,0 kb Sacl/Notl fragmentet fra pSK.C/3'K ble isolert og ligert sammen for å danne pK.DT/(TK/0,8K/Neo). Det 6,1 kb Notl/Ndel fragment fra pSK.A/DT/5'K, det 4,8 kb Ndel/Sacl fragment fra pSK.B/(TK/0,8K/Neo) og 6,1 kb Sacl/Notl fragment fra pSK.C/3'K/DT (oppnådd ved en Sacl-kutting partielt fulgt av en Notl-kutting av plasmidet) ble isolert og ligert sammen for å danne pK.DT/(TK/0,8K/Neo)/DT. For elektroporering ble det rensede plasmid-DNA først kuttet med Pvul eller ApaLI, deretter ekstrahert med fenol/kloroform og utfelt ved tilsetning av etanol før sentrifugering. De resulterende DNA-pellets ble resuspendert i en konsentrasjon på 1 mg/mL i 10 mM Tris-HCI, 1 mM
EDTA (TE).
C. Innføring av DNA i celler
Den embryoniske stamcellelinjen E14-1 ble dyrket som beskrevet ovenfor i Eksempel III. Cellene ble ekvilibrert ved romtemperatur og DNA (20 pg) linearisert med Pvul (som beskrevet ovenfor), ble tilsatt. Blandingen ble elektroporert som beskrevet ovenfor i Eksempel III.
D. Analyse av konstant reoion- målrettede ES- celler
Etter 7-10 dager under medikamentseleksjon med G418, ble de enkelte overlevende koloniene plukket og dissosiert i en dråpe trypsin som beskrevet ovenfor i Eksempel III.
Southern blotting-analyse ble foretatt ved å benytte Bglll-kuttet genomisk DNA fra hver prøve. Et 2,3 kb fragment fra det native ES-celle-locuset ble påvist, mens et større 4,9 kb fragment ble påvist fra et målrettet ES-celle-locus (Figur 11) ved bruk av 1,2 kb BamHI/Bglll fragmentet isolert fra den opprinnelige fag-DNA, sammenhengende med fragmentet benyttet for 3'-homologien i den målrettede vektor, som probe. Størrelsen av fragmentet økte fordi Bglll-setet i Bglll/BamHI fragmentet gikk tapt i det målrettede plasmid som følge av sammenkoblingen av et Bglll-sete med et BamHI-sete ved ligeringen og at et nytt Bglll-sete lokalisert i thymidinkinase-genet, innføres i det målrettede locus.
Fra en screening foretatt ved den ovenfor beskrevne Southern-blotting-analyse av totalt 103 kloner oppnådd fra forsøk hvor tre ulike målrettede plasmider ble benyttet, ble det identifisert fem cellelinjer som var bærere av den tiltenkte mutasjon (Tabell 1).
Ytterligere analyse av genomisk DNA produsert fra fire av de positive klonene (klon 625, 604, 611 og 653) bekreftet etter tining og mangfoldig-gjøring, de innledende observasjoner. Ved å benytte en andre probe, et 1.7 kb Hindi I l/Bgll I fragment som spente over J-regionen av kappa-locuset, ble det korrekte integrasjonsmønster kontrollert for homolog målretting ved 5'-enden av den målrettede vektor. Ved å benytte denne probe ved en EcoRI-kutting av det genomiske DNA, ble det således påvist et 15 kb fragment fra det umodifiserte allel. I motsetning til dette ble det observert et 7.8 kb fragment fra det målrettede allel som resultat av innføringen av et nytt EcoRI-sete i thymidinkinase-genet under den homologe integreringen (Figur 11).
E. In vitro eksision av J- reaion- DNA fra målrettede kloner
For å foreta den ønskede delesjon fra det homologt målrettede kappa-locus, ble celler fra klon 653 utplatet på feeder-celler i en tetthet på 0,5-1 x 10<6> celler/10 cm skål i nærvær av både gancyclovir (2 uM) og G418 (150 ug/mL). Etter vekst i 5 dager i nærvær av begge medikamenter, ble det plukket kloner, som beskrevet ovenfor, og disse ble overført til 24-brønns plater og dyrket under seleksjon med G418 alene. Etter ytterligere 5-8 dager ble 20% av cellene i hver brønn nedfrosset og resten benyttet til å fremstille genomisk DNA som tidligere beskrevet.
F. Analyse av J/ konstant- reaion- delerte ES- celler
Southern blotting-analyse ble foretatt under bruk av Barn Hl-kuttet genomisk DNA fra hver prøve. Ved å benytte 0,8 kb EcoRI fragmentet benyttet som ADH i de målrettede vektorene som probe, ble det påvist et 12,7 kb fragment fra det native ES-celle-locus, mens et større, 15,8 kb, fragment ble påvist fra locuset for konstant region-målrettet ES-celle (Figur 11) ved å benytte DNA fra klon 653. Fragmentet økte i størrelse på grunn av innføringen av tk-genet, ADH- og neo-genet i det 12,7 kb lange BamHI fragment. Det ble også innført et nytt BamHI-sete ved 3'-enden av neo-genet. Ved å benytte DNA fra de J/konstant region-delerte cellene, ble det som forventet ut fra analysen av restriksjonskartet, påvist et 5,5 kb fragment fra det modifiserte locus i tillegg til 12,7 kb fragmentet fra det ikke-målrettede allel. Fra denne screening ved Southern-blotting-analyse av to kloner produsert fra 1,5 x 10<6> utplatede ES-celler (klon 653), ble det identifisert én cellelinje (klon 653B) som var bærer av den tiltenkte delering av J- og konstant-regionene.
Videre analyse av genomisk DNA fremstillet fra klon 653B etter opptining og mangfoldiggjøring, bekreftet de innledende observasjoner. Ved å benytte 0,8 kb EcoRI fragmentet ble deleringen kontrollert gjennom to ytterligere restriksjonskuttinger som skulle kutte utenfor den kuttede region av den målrettede vektors 5'- og 3'-ender. Ved å benytte denne probe ved en Bglll-kutting av det genomiske DNA fra den ikke-kuttede klon 653, ble det således påvist et 2,6 kb fragment både fra de umodifiserte og modifiserte allelene, mens et ytterligere 4,9 kb fragment bare ble registrert fra det målrettede allel (Figur 11). Dette 4,9 kb fragment var det samme som det som ble påvist med det tidligere benyttede 1,2 kb BamHI/Bglll-fragment. Ved å benytte DNA fra klon 653B, førte en Bglll-kutting til et 5,8 kb fragment i tillegg til 2,6 kb fragmentet fra det umodifiserte allel. En Sacl-kutting av klon 653-DNA oppviste, med 0,8 kb EcoRI fragmentet som probe, et 5,5 kb fragment både fra det umodifiserte og fra det modifiserte allel og et 3,1 kb fragment fra kun det målrettede allel (Figur 11). 5,5 kb fragmentet ble også påvist i DNA fra klon 653B og et ytterligere 2,0 kb fragment. Det 5,8 kb Bglll fragment og 2,0 kb Seal fragmentet stemte overens med en analyse av det forventede restriksjonskart for et presist eksisjons-trinn, hvor 10,3 kb av DNA, inklusivt J-regionen tk-genet og én kopi av ADH, ble delert.
G. Utvikling av kimlinie- kimærer
De umodifiserte E14-1 -cellene bidro med høyfrekvens til kimlinjen etter injeksjon i C57BL/6J-blastocyster. Cellene fra den målrettede ES-cellelinje 691, hvor kun kappa konstant regionen var delert ved homolog rekombinasjon uten noen negativ seleksjon, ble mikroinjisert og kimære dyr fremstillet som beskrevet ovenfor i Eksempel III. Celler fra den målrettede ES-cellelinje 653B hvor både kappa konstant regionen og J-regionen var delert, ble også mikroinjisert og kimære dyr fremstillet som beskrevet ovenfor. Kimært avkom identifiseres ved "kimær pelsfarve". Kimlinje-overføring av den modifiserte ES-celle påvises gjennom F1-avkommets aguti-farvede pels.
EKSEMPEL V
Kloning av humant tung kjede locus ved bruk av kunstige gjærkromosomer A. Fremstilling av kunstige gjærkromosomer ( YAC) inneholdende human tuna kiede
Et Spel fragment som strekker seg over den humane tunge kjede VH6-D-J-Cu-C5-region (Berman et al. (1988), EMBO J. 7:727-738; se Figur 15) isoleres fra et humant YAC-bibliotek (Burke et al. Science. 236:806-812) ved å benytte DNA-prober beskrevet av Berman et al., (1988) EMBO J. 7:727-738. Det oppnås en klon som anslås å være ca. 100 kb. Den isolerte YAC-klon karakteriseres ved pulsfelt-gelelektroforese (Burke et al. supra; Brownstein et al., Science. 244:1348-1351) under bruk av radioaktivt merkede prober for den humane tunge kjede (Berman et al., supra).
B. Innføring av YAC- kloner i embryoer eller ES- celler
Høymolekylært DNA fremstilles i agaroseplugger fra gjærceller inneholdende det interessante YAC (dvs. et YAC som inneholder det ovenfor nevnte Spel fragment fra IgH-locuset). DNA størrelses-fraksjoneres på et CHEF-gel-apparat og YAC-båndet kuttes ut fra den lavtsmeltende agarosegel. Gelfragmentet ekvilibreres med polyaminer og smeltes og behandles deretter med agarase for å oppslutte agarosen. Det polyamin-dekkede DNA injiseres deretter i den hannlige pronukleus i befruktede muse-embryoer som så kirurgisk overføres til uterus i pseudogravide hunnmus, som ovenfor beskrevet. Avkommets transgene natur analyseres ved "slot-blot" av DNA isolert fra haler (tails), og produksjonen av human tung kjede analyseres ved å undersøke en liten mengde serum for nærvær av lg-kjeder med kanin-anti-humane antistoff.
Som et alternativ til mikroinjeksjon overføres YAC-DNA til murine ES-celler ved ES-celle:gjær-protoplast-fusjon (Traver et al. (1989) Proe. Nati. Acad. Sei.. USA, 86:5898-5902; Pachnis et al., (1990), ibjd. 8_Z:5109-5113). Først settes neomycin-resistens-genet fra pMC1 Neo eller HPRT eller en annen selekterbar markør fra pattedyr og en selekterbar markør fra gjær, inn i ikke-essensielle YAC-vektorsekvenser i et plasmid. Denne konstruksjon benyttes for å omdanne en gjærstamme inneholdende IgH-YAC, og pMC1 Neo (eller en annen selekterbar markør) integreres i vektorsekvensen til IgH-YAC ved homolog rekombinasjon. Det modifiserte YAC overføres deretter til en ES-celle ved protoplast-fusjon (Traver et al., (1989); Pachnis et al., 1990), og resulterende G418-resistente ES-celler (eller oppvisende en annen selekterbar fenotype) som inneholder den intakte humane IgH-sekvens, benyttes til å utvikle kimære mus. Alternativt transfekteres et renset YAC, for eksempel ved lipofeksjon eller ved kalsiumfosfat-mediert DNA-overføring, inn i ES-celler.
EKSEMPEL VI
Innføring av humane la- aener i mus
A. Kloning av humane la- aener i gjær
1_. Identifikasjon oa karakterisering av en human IgH- YAC- klon inneholdende VH-. D-. JH-. mu- og delta- sekvenser:
PCR-primere for det humane VH6-gen
(V6A=5' GCA GAG CCT GCT GAA TTC TGG CTG 3' og V6B=5' GTA ATA CAC AGC CGT GTC CTG G 3') ble benyttet til screening av DNA-forråd fra Washington University Human YAC library (Washington University, St. Louis, MO). Positive forråd ble deretter underkastet screening ved hybridisering av koloniene og en positiv mikrotiterplate-brønn, A287-C10, ble identifisert. To VH6-holdige YAC av ulik størrelse (205 kb og 215 kb) ble isolert fra mikrotiter-brønnen. I tillegg til VH6, hybridiserte den mindre av de to IgH-YAC, A287-C10 (205 kb), til prober for følgende sekvenser: delta, mu, JH, D, VH1, VH2 og VH4. Den største av de to IgH-YAC, A287-C10
(215 kb), hybridiserte til følgende prober: delta, JH, D, VH1, VH2 og VH4, men ikke til mu. YAC inneholdt sekvenser fra minst 5 VH-gener inklusivt to VH1 -gener, ett VH2-, ett VH4- og ett VH6-gen. Analyse av restriksjonskuttinger tydet på at det 205 kb YAC inneholder en delesjon (størrelse ca. 20 kb) som fjerner noe av, men ikke hele D-gen-ansamlingen, mens resten av YAC synes å være intakt og ha kimlinje-konfigurasjon. PCR og detaljert analyse av restriksjonskuttingen av det 205 kb YAC viste nærvær av flere forskjelllige D-genfamiliemedlemmer. Det 215 kb YAC syntes å inneholde den fullstendige hoved-D-genansamling, men hadde en delesjon (ca. 10 kb) som fjernet mu-genet. Denne delesjon synes ikke å påvirke JH-ansamlingen eller den enhancer som er lokalisert mellom JH- og mu-gener.
Den antatte progenitor av de ovennevnte to beslektede IgH-YAC, et YAC på ca. 225-230 kb som inneholdt hele den genomiske region mellom VH2-genet og delta-genet (Shin et al., 1991, su<p>ra) (se Figur 15), var ikke blitt identifisert i A287-C10-mikrotiterbrønnen. En tidligere alikvot av A287-C10-mikrotiterplate-brønnen ble derfor undersøkt for å finne progenitor-YAC under den forutsetning at den var tapt under passasjen av biblioteket. A287-C10-mikrotiterbrønnen ble strøket ut (Washington University, St. Louis, MO) og 2 av 10 analyserte kloner inneholdt et 230 kb IgH YAC sammen med et annet tilsynelatende ubeslektet YAC. Klon 1 inneholdt dessuten IgH YAC, et tilnærmet 220 kb YAC, og klon 3 inneholdt dessuten et ca. 400 kb YAC. IgH YAC inneholdt mu, den fullstendige D-profil (på basis av en BamHI-oppslutning, se nedenfor) og JH. IgH YAC fra klon 1 ble skilt fysisk fra det ubeslektede YAC ved meiotisk segregasjon ved en krysning mellom A287-C10/AB1380 og YPH857 (genotype=MATa ade2 Ivs2 ura3 trp1 HIS5 CAN1 his3 Ieu2 cvh2. for å gi A287-C10 (230 kb/MP 313 (verts-aenotvpe=MATa ade2 Ieu2 Ivs2 his3 ura3 trp1 can1 cvh2). 2. Målretting av det A287- C10 kb YAC med en selekterbar markør fra pattedyr. HPRT: En YAC høyrearms målrettings-vektor betegnet pLUTO (15,6 kb) ble frembragt ved subkloning av et humant HPRT-minigen som inngikk i et 6,1 kb BamHI fragment (Reid et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 87:4299-4303 (1990)) inn i BamHI-setet i polylinkeren til pLUS (Hermanson et al., Nucleic Acids Research. 19:4943-4938 (1991)). En kultur av A287-C10/AB1380 inneholdende både det 230 kb IgH YAC og et ubeslektet YAC, ble transformert med linearisert pLUTO og selektert for Lys<+->transformanter. Lys<+->klonene ble underkastet screening ved hybridisering av kloner for nærvær av mu. Det ble identifisert én klon som inneholdt et enkelt YAC på ca. 240 kb som hybridiserte til prober for mu, HPRT og LYS2.
Southern blotting-analyse av det 230 kb A287-C10 YAC målrettet med pLUTO, ble foretatt under bruk av en rekke prober for å demonstrere den intakte, ikke-rearrangerte natur av de klonede humane IgH-sekvenser. I de fleste tilfeller ble resultatene av BamHI-, Hindi- og EcoRI-kuttingene sammenlignet med restriksjonsdata for WI38 (en human embryonisk foster-lunge-avledet cellelinje), 205 kb og 215 kb delesjons-derivatene av A287-C10 og publiserte verdier. Diversitet- (D) genprofilen bestemt ved hybridisering med en D-region-probe (0,45 Ncol/Pstl fragment; Berman et al., 1988) viste de forventede fire D-gensegmentene (D1-D4 (Siebenlist et al., 1981: Nature. 294:631-635). Med BamHI ble det for eksempel observert fire restriksjonsfragmenter, 3,8 kb, 4,5 kb, 6,9 kb og 7,8 kb, i A287-C10 og WI38. WI38 hadde et ytterligere, større bånd som antas å skrive seg fra D5-regionen på kromosom 16 (Matsuda et al., 1988, EMBO. 7:1047-1051). PCR- og Southern blotting-analyse med D-familie-spesifikke primere og prober demonstrerte i det 215 kb delesjons-derivatet YAC (som viste seg å ha en intakt D-region med samme restriksjonsmønster som 230 kb YAC) forekomsten av 2 til 4 medlemmer av hver av følgende D-gen-familier: DM, DN, DK, DA, DXP og DLR. Den J-mu-introniske enhancer, som ble sekvensert fra klonede PCR-produkter fra A287-C10 230 kb YAC (primere EnA=5' TTC CGG CCC CGA TGC GGG ACT GC 3' og EnB1=5' CCT
CTC CCT AAG ACT 3') og bestemt å være intakt, frembragte også individuelle restriksjonsfragmenter av tilnærmet forventede størrelser med BamHI, EcoRI og Hindlll når 480 bp PCR-produktet ble benyttet som probe. JH-regionen ble vurdert med en ca. 6 kb BamHI/Hindlll fragment-probe som strakte seg over DHQ52 og hele JH-regionen (Ravetch et al., 1981, Cell. 27:583-591). A287-C10 førte til restriksjonsfragmenter av tilnærmet forventede størrelser. Restriksjonsfragmentene av lik størrelse ble dessuten påvist med enhanceren og JH-probene (Ravetch et al., su<p>ra: Shin et al., 1991, supia). Det ca. 18 kb BamHI JH-fragment som ble påvist i A287-C10 og WI38 hybridiserte også til en 0,9 kb mu-probesekvens (Ravetch et al., su<p>ra). Hybridisering med 0,9 kb EcoRI fragment-mu-proben (Ravetch et al., su<p>ra) viste restriksjonsfragmenter av tilnærmet forventede størrelser (Ravetch et al., supra: Shin et al., supra):>12 kb BamHI (ca. 17 kb forventet); 0,9 kb EcoRI (0,9 kb forventet) og ca. 12 kb Hindlll (ca. 11 kb forventet). WI38 ga BamHI fragment med samme størrelse som A287-C10. JH- og DHQ52-regionene fra begge YAC-delesjons-derivatene ble sekvensert og begge var i kimlinje-konfigurasjon. Delta ble analysert med et exon 1 PCR-produkt (som inneholdt regionen på tilnærmet 160 bp mellom primerne D1 B= 5' CAA AGG ATA ACA GCC CTG 3' og
D1 D= 5' AGC TGG CTG CTT GTC ATG 3'); restriksjonsfragmenter for A287-C10 lå nær de forventet fra litteraturen (Shin et al., supra) og til de bestemt for WI38. 3'-kloningssetet av YAC kan være det første EcoRI-sete 3' av delta (Shin et al., supra) eller et annet EcoRI-sete lenger mot 3'. VH-genprober for VH1, VH4 og VH6 (Berman et al., su<p>ra) og for VH2 (Takahashi et al., 1984, Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 81:5194-5198) ble benyttet for å vurdere det variable geninnhold i YAC. A287-C10 inneholder to VH1 -gener som har tilnærmet den forventede størrelse (Shin et al., supra: Matsuda et al., 1993, su<p>ra): restriksjons-analyse med de tre enzymene ga størrelser nær de forventede fragmenter, f.eks. med EcoRI var observerte bånd 3,4 og 7,8 kb (forventet 3,4 og 7,2 kb). De forventede størrelser av EcoRI fragmenter for VH4 (5,3 kb observert, 5,1 kb forventet) og for VH6 (0,8 kb observert, 0,9 kb forventet) (Shin et al. supra: Matsuda et al., supra) forekom i A287-C10. EcoRI fragmentet med forventet størrelse ble iakttatt for VH2 (5,5 kb observert, 5,4 kb forventet), men BamHI og Hindlll fragmentene var forskjellige fra de forventede. Samtidig hybridisering av BamHI- og Hindlll-fragmentene med en pBR322-probe tydet på at EcoRI-setet som er i 5'-enden av VH2-genet (Shin et al., supra). er 5'-kloningssetet, hvorved det naturlige 5'Hindlll-setet og BamHI-setene elimineres. Den totale lengde av YAC-innskuddet (anslått til ca. 220 kb) stemmer godt med den forventede størrelse for et intakt, ikke-rearrangert segment som starter i 5'-enden av det VH2-gen som er nærmest 3', og strekker seg til et EcoRI-sete 3' av delta-locuset (Shin et al., supra).
3i Identikasion oa karakterisering av laK YAC som inneholder CK- oa VK- sekvenser: To YAC ble identifisert ved en screening av PFG-forråd (pulsed field gel pools) fra det humane YAC-bibliotek fra Washington University (St. Louis, MO) med en probe fra genet for konstant human kappa region (CK)
(2,5 kb EcoRI fragment ATCC Nr. 59173, Parklawn Dr., Rockville, MD). Disse YAC, betegnet A80-C7 (170 kb) og A276-F2 (320 kb), inneholder det kappa-delerende element kde. CK, JK og den CJ-introniske enhancer og strekker seg 3' forbi kde. Uragende 5' fra JK, inneholder YAC også B1-, B2-og B3-VK-genene bestemt ved hybridisering og/eller PCR, og muligens andre VK-sekvenser. A80-C7/AB1380-stammen inneholdt i tillegg til IgK YAC, et ubeslektet YAC av tilsvarende størrelse. Meiotisk segregasjon ble derfor benyttet for å separere disse YAC; A80-C7 ble krysset med YPH857, og det ble oppnådd et meiotisk produkt som inneholdt kun IgK YAC (MP8-2; verts-genotype=a ade2 Ieu2 his3 his5 Ivs2 ura3 trp1 can1 cvh2). A80-C7 og A276-F2 YAC er blitt målrettet med pLUTO for å inkorporere det humane HPRT-minigen i høyre vektorarm av YAC.
Restriksjonsanalyse av IgK YAC A80-C7 og A276-F2 under bruk av en rekke enzymer, støtter den konklusjon at begge YAC er ikke-rearrangert (dvs. har kimlinje-konfigurasjon). For eksempel viser BamHI-kutting etterfulgt av hybridisering med CK-proben, det forventede 13 kb restriksjonsfragment (Klobeck et al., Biol. Chem. Hoppe- Sevler. 370:1007-1012 (1989)). Båndet av samme størrelse hybridiserer til en JK-probe (et 1,2 kb PCR-produkt, hvor det benyttes primer innrettet på å amplifisere JK1-5-regionen), som forventet ut fra genkartet (Klobeck et al., su<p>ra). B3-klasse IV-genet (proben er et 123 bp PCR-produkt fra B3-genet) gir et 4,9 kb BamHI og et 2,2 kb Bglll fragment, nær de publiserte verdiene på henholdsvis 4,6 kb og 2,3 kb, (Lorenz et al.. Molec. Immunol. 25:479-484 (1988)). PCR-analyse av begge IgK YAC så vel som humant genomisk DNA for følgende kappa-locus-sekvenser, oppviste de forventede båndstørrelsene: Kde (120 bp), CK
(304 bp), C-J intronisk enhancer (455 bp), JK1-5 (1204 bp), B3 VK (123 bp) og B1 VK-pseudogen (214 bp). Sekvenser benyttet for utviklingen av PCR-primere for CK-, JK- og C-J-enhancer-regionene er fra Whitehurst et al.,
Nucl. Acids. Res. 20:4929-4930 (1992); Kde er fra Klobeck et Zachau Nucl. Acids. Res. 14. 4591-4603 (1986); B3 er fra Klobeck et al., Nucl. Acids. Res. 13:6515-6529 (1985) og B1 er fra Lorenz et al., supra).
B. Innføring av 680 kb vHPRT YAC i ES- celler
i. Dyrkning av vHPRT- aiærstamme oa fremstilling av aiær- sfæroplaster
Det 680 kb yHPRT er et YAC som inneholder en funksjonell kopi av det humane gen for hypoksantin-fosforibosyltransferase (HPRT) klonet fra et YAC-bibliotek som beskrevet i Huxley et al., (1991) Genomics. 9:742-750. Gjærstammen som inneholder yHPRT ble dyrket i uracil- og tryptofan-manglende flytende media, som beskrevet i Huxley, et al., (1991) su<p>ra).
For å fremstille gjær-sfæroplaster, ble en 400 ml_ gjærkultur inneholdende yHPRT, sentrifugert og den oppnådde gjær-pellet vasket én gang med vann og én gang med 1M sorbitol. Denne gjær-pellet ble resuspendert i SPEM (1M sorbitol, 10 mM natriumfosfat, pH 7,5,10 mM EDTA, pH 8,0, 30 mM B-merkaptoetanol) i en konsentrasjon på 5 x 10<8 >gjærceller/mL. Zymolase 20T ble tilsatt i en konsentrasjon på 150 ug/ml_ gjærceller og kulturen inkubert ved 30°C inntil 90% av cellene var sfæroplaster (vanligvis 15-20 minutter). Cellene ble vasket to ganger i STC (1M sorbitol, 10 mM Tris, pH 7,5,10 mM CaCI2) og resuspendert i STC i en konsentrasjon på 2,5 x 10<8>/mL.
2. Dyrkning av E14TG2a ES- celler
Den HPRT-negative ES-cellelinjen E14TG2a ble dyrket som tidligere beskrevet.
3^ Fusion av ES- celler og gjær- sfæroplaster
Eksponensielt voksende E14TG2a-ES-celler dyrket på gelatin-belagte skåler, ble trypsinisert og vasket tre ganger med se ru mf ritt DM EM. En pellet av 2,5 x 10<8> gjær-sfæroplaster ble forsiktig dekket med 5 x 10<6> ES-celler som ble sentrifugert ned på den nevnte gjærpellet. Den oppnådde kombinasjonspellet ble resuspendert i 0,5 ml_ av enten 50% polyetylenglykol (PEG) 1500 eller 50% PEG 4000 (Boehringer, Mannheim) inneholdende 10 mM CaCI2. Etter inkubering i 1,5 minutter ved romtemperatur eller ved 37°C, ble 5 ml_ serumfritt DMEM langsomt tilsatt, hvoretter cellene ble hensatt ved romtemperatur i 30 minutter. Cellene ble deretter pelletert og resuspendert i 10 ml_ ES-celle-komplettmedium (som tidligere beskrevet) og anbragt på en 100 mm plate dekket med feeder-celler. Etter 24 timer ble mediet erstattet med friskt medium. 48 timer etter fusjonen ble skålene utsatt for HAT (ES-medium som inneholder 1 x 10"<4>M hypoksantin, 4 x 10"7M aminopterin, 1,6 x 10'<5> thymidin) seleksjon. HAT-resistente ES-kolonier ble observert 7-10 dager etter fusjonen i skålene under begge de anvendte ulike fusjonsbetingelsene. yHPRT-ES ("ESY") fusjonskolonier ble plukket og utplatet på brønner dekket med feeder-celler og mangfoldiggjort for videre analyse.
4. Analyse av YAC DNA integrert i vHPRT- ES fusionskloner
DNA ekstrahert fra 23 yHPRT-ES fusjonskolonier ble kuttet med Hindlll og underkastet Southern blotting-analyse (Figur 12) ved å benytte probene: en human repeterende Alu-sekvens (A); pBR322-spesifikke sekvenser for den høyre (B) og venstre (C) YAC-vektorarm; gjær-Ty repeterende sekvens (D); gjær-enkeltkopi-gen LYS2 (E). Den humane HPRT-probe, et 1,6 kb cDNA i full lengde (Jolly et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 80:477-481 (1983)) ble benyttet til å bekrefte forekomsten av det humane HPRT-gen i ESY-kloner. Alu-proben var et 300 bp BamHI fragment fra BLUR8-Alu-elementet i pBP63A (Pavan et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 78:1300-1304 (1990)). Høyre- og venstre-vektorarm-probene var pBR322-avledet BamHI-Pvull, henholdsvis 1,7 og 2,7 kb fragmenter, som tilsvarte vektorsekvensen i pYAC4 (skjema a, b (Burke et al., i: Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Guthrie & Fink, red. Academic Press, 194:251-270 (1991)). Det 4,5 kb fragment som ble påvist ved høyrearms-proben, strakk seg over regionen mellom HindiII-setet på telomer 5'-enden og det første Hindlll-setet inne i det humane innskudd (skjema a). De 3 kb og 4,1 kb fragmentene som ble påvist med proben for venstre enden tilsvarer henholdsvis regionen mellom Hindlll-setet i telomer-enden og Hindlll-setet 5' av gjærsekvensen og den region som strekker seg fra Hindlll-setet 3' av centromeren inn i human-innskuddet (skjema b). Forskjellen i hybridiserings-intensitet av disse to bånd er relatert til forskjellen i graden av homologi mellom disse fragmentene og proben. Den repeterende gjær-Ty-probe (Philippsen et al., i Gene Expression in Yeast, Proceedings of the Alko Yeast Symposium, Helsinki, Korhola & Vaisanen, red. Foundation for Biotechnical and Industrial Fermentation Research, 1:189-200 (1983)) var et 5,6 kb Xhol fragment isolert fra Ty1-holdig pJEF742 som også kunne påvise 3' Hindlll fragmentet av Ty2, som følge av homologien mellom de to elementene. LYS2-genproben var et 1,7 BamHI fragment fra pLUS (Hermanson et al., Nuc. Acids. Res. 19:4943-4948(1991)).
Hybridisering med en human HPRT-probe (cDNA-probe med 1,6 kb full lengde) viste at alle analyserte kloner inneholdt de samme 15, 7 og 5 kb exon-holdige fragmentene i det humane HPRT-gen som yHPRT YAC. Gjentatt undersøkelse av de samme blottene med en 300 bp human repeterende Alu-sekvens-probe, tydet på at alle de analyserte klonene inneholdt de fleste, om ikke alle, de Alu-inneholdende fragmenter som forekommer i yHPRT (Figur 12A). Dataene tyder på at det 680 kb humane innskudd i de fleste av de analyserte kloner ikke var blitt påviselig rearrangert eller delert etter integrasjon i ES-celle-genomet. Integreringen av YAC-vektorsekvenser ble undersøkt ved å benytte spesifikke prober for vektorarmene. Rehybridisering av de samme blott med en probe for den høyre YAC-vektorarm, hvor et 4,5 kb Hindlll fragment ble påvist, tydet på at den høyre YAC-arm opptil telomeren, fremdeles var intakt og ikke-rearrangert og knyttet til det humane innskudd (Figur 12B) i 10 av de 23 analyserte kloner, hvilket gir et ytterligere bevis på integreringen av YAC i disse klonene. Venstrearms-proben påviste 3 kb og 4,1 kb Hindlll yHPRT-fragmentene i 18 av de 20 analyserte klonene (Figur 12C) som tyder på hyppig venstrearm-retensjon.
Den strukturelle integritet av yHPRT i ESY-kloner, ble ytterligere vurdert for to kloner (ESY-5-2 og 8-7) ved å benytte pulsfelt-gel-restriksjonsanalyse. I gjær som var bærer av yHPRT, ble det ved forskjellige prober definert fem Sfi-fragmenter av følgende tilnærmede størrelser: 315 kb (Alu, venstrearm), 145 kb (Alu, HPRT); 95 kb (Alu, høyrearm), 70 og 50 kb (kun Alu). I begge ES-klonene hadde de interne HPRT- og Alu-spesifikke fragmentene tilsvarende størrelser som yHPRT-fragmentene. Endefragmentene påvist for begge kloner var som forventet for YAC-integrert i et musekromosom, større enn de i yHPRT: henholdsvis 185 og 200 kb for høyre endes fragment, og mer enn 800 kb for venstre endes fragment i begge kloner. Disse data gir sammen med Alu-profilen, ytterligere bevis for bibehold av den strukturelle integritet av YAC i disse klonene. Undersøkelsene ble supplert med fluorescens in situ hybridisering foretatt på ESY 8-7 (Figur 13A, B) og ESY 8-6 metafase-kromosom-utspredninger, hvor det for de humane sekvenser ble påvist et enkelt integrasjonssete. Fotomikrogrammer av representative metafase-utspredninger (Figur 13A, B, C) eller interfase-nuclei (Figur 13D) fra ESY 8-7-celler (Figur 13A, B) hybridisert med biotinylerte humane genomiske sekvenser og ESY 8-6-celler (Figur 13C, D) hybridisert med biotinylerte repeterte gjær-DNA-sekvenser. Human-proben ble frembragt fra humant genomisk placenta-DNA (Clontech, Palo Alto, CA). Gjærproben besto av en blanding av DNAfragmenter som koder for de repeterte gjærelementene: delta (et 1,08 kb Sau3A fragment av pdelta6 (Gafner et al., EMBO J. 2:583-591 (1983)) og Ty (et 1,35 kb EcoRI-Sall fragment av p29 (Hermanson et al.. Nuc. Acids. Res. 19:4943-4948 (1991)), rDNA (et 4,6 kb Bglllk-A L90 og et 4,4 kb Bglll-B L92 fragment (Keil & Roeder, CeJI, 39:377-386 (1984)) og V-telomer-elementene (2,0 og 1,5 kb Bglll-Hindlll fragmentene av p198 (Chan & Tye, Cell. 33:563-573
(1983)). Hybridisering av sekvenser på kromosom-metafase-utspredninger med biotinylerte prober og påvisning med avidin-FITC, fulgt av biotin-anti-avidin og avidin-FITC-amplifikasjon ble foretatt som beskrevet av Trask & Pinkel. Methods Cell Biol. 30:383-400 (1990) ved å benytte et Zeiss Axiophot mikroskop. Kromosomer ble "counterstained" med propidiumjodid. De viste fotomikrogrammer er representative for 95% av metafase-utspredningene eller interfase-nuclei sveip-fotografert i tre uavhengige forsøk foretatt med human- eller gjær-probene. Et enkelt integrasjonssete for de humane sekvensene ble påvist.
De samme blottene ble også undersøkt med en probe av den repeterte elementsekvens i gjær-Ty for å påvise forekomst av genomiske gjær-DNA-sekvenser i ESY-klonene (Figur 12D). Mens enkelte av klonene viste seg å inneholde det meste av de Ty-holdige fragmentene forekommende i opphavets gjærstamme, ble noen av klonene funnet å ha en meget liten fraksjon, om i det hele tatt noen, av de Ty-holdige fragmentene. Disse resultatene tyder på at det i enkelte ES-kloner ble integrert lite eller intet genomisk gjær-DNA selv om YAC-DNA integreres intakt. For å bestemme om det kromosomale gjær-DNA ble integrert i et enkelt eller i flere seter i ES-cellegenomet, ble det foretatt fluorescerende in situ hybridisering på ESY-klon 8-6 som hadde en fullstendig Ty-profil. Et enkelt integreringssete ble påvist ved å benytte en kombinert repeterende gjær-probe (Figur 13C, D), som innenfor oppløsningsgrensene, tydet på at alle gjær-DNA-fragmenter ble integrert som en blokk.
Ved å benytte ES-cellenes evne til å gjennomgå ordnet differensiering in vitra, ble YAC-stabilitet og virkningen av integrert DNA på pluripotensiteten av ES-celler undersøkt. Fire ES-kloner, inneholdende forskjellige mengder gjær-DNA (ESY 5-2, 3-6, 8-6 og 8-7) oppviste et differensieringsmønster som ikke lot seg skjelne fra mønsteret til ikke-fusjonerte ES-celler, nemlig at dannelse av embryoide legemer førte til en rekke differensierte celletyper (Figur 14A). Southern blotting-analyse ble foretatt på DNA ekstrahert fra differensierte ESY 5-2, 3-6, 8-5 og 8-6 (20 ug) og yHPRT i AB1380 (40 ng) ved å benytte (a) en human Alu-probe og (b) gjær-Ty-sekvenser. Es-kloner ble indusert for å danne embryoide legemer ved å dyrke dem som aggregater i suspensjon i 10-14 dager som beskrevet av Martin & Evans, Cell. 6:467-474 (1975). Etter at de igjen er festet til substratum i vevskultur, fører ESY-avledede embryoide legemer til differensierte celletyper. YAC- og gjær-DNA-sekvenser ble stabilt opprettholdt av de differensierte ES-klonene under dyrkning i ikke-selektivt medium i 40 dager, hvilket viser at det stabilt integrerte fremmede DNA ikke svekket ES-cellenes pluripotensitet (Figur 14B). De differensierte kulturene opprettholdt et funksjonelt humant HPRT-gen, noe som fremgår av deres normale vekst og differensiering når de ble overført til HAT-selektivt medium.
5. Utvikling av kimære mus fra vHPRT- ES- cellelinien
ESY-cellenes evne til å repopulere mus, inklusivt kimlinjen, ble demonstrert gjennom mikroinjeksjon av ES-celler i museblastocyster og utviklingen av kimære mus. ESY-celler ble mikroinjisert i C57BL/6J-museblastocyster, og kimære mus ble utviklet som tidligere beskrevet. Kimære hanner ble parret med C57BL/6J-hunner og kimlinje-overføring bestemt gjennom forekomsten av aguti-farvet avkom. Genomisk DNA fra kimære mus, fremstillet fra hale-DNA, ble ved PCR-analyse undersøkt på forekomst av yHPRT-DNA i musegenomet. Nærværet av YAC-venstrearmen ble analysert ved å benytte de to primer-oligonukleotidene,
5' CTTGCGCCTTAAACCAACTTGGTACCG, som ble oppnådd henholdsvis fra pBR322-sekvensene og SUP4-genet i den venstre YAC-vektorarm. Et 259 bp PCR-produkt ble oppnådd fra analysen av den gjær som inneholdt yHPRT og ESY-cellelinjene. PCR-analyse av hale-DNA fremstillet fra 18 kimære mus utviklet fra ESY-cellelinjene ESY 3-1, ESY 3-6 og ESY 5-2, førte til det forventede PCR-produkt som således tyder på nærvær av den venstre YAC-vektorarm i genomet til den kimære mus.
ÉL Kimlinie- overføring av <y>HPRT
Kimære hanner med pelsfarve-kimærisme på 30-60%, avledet fra ESY-cellelinjene ESY 3-1 og ESY 5-2, ble uttatt for parring for vurdering av kimlinje-overføring, dvs. for å bestemme hvorvidt den gentiske modifikasjon var overført via kimcellene (sperma eller oocytter) til dyrenes avkom. Tre av de kimære ESY 3-1 avledede hanner, 394/95-1, 394/95-2 og 411 -1 overførte ES-celle-genomet til avkommet med en frekvens på henholdsvis 20%, 30% og 30%. Southern blotting-analyse av hale-DNA fra det aguti-farvede avkommet tydet på nærvær av yHPRT i genomet til tre mus, 4-2, 4-3 og 5-1, avledet fra 394/395-2 kimærene. Alu-profilen oppnådd fra slike analyser kunne ikke skjelnes fra tilsvarende fra den parentale ES3-1 cellelinje (Figur 14C), hvilket viser at det 680 kb humane innskudd omhyggelig og sikkert ble overført gjennom muse-kimlinjen.
Ved å benytte en human HPRT-spesifikk PCR-bestemmelse på
mRNA-avledede cDNA fra et yHPRT-holdig avkom, ble ekspresjonen av det humane HPRT-gen påvist i alle de undersøkte vev (Figur 15A og B), og dette viser at det overførte YAC beholdt pålitelig funksjonsdyktighet. I dette forsøk ble humant HPRT-mRNA påvist gjennom revers transkripsjon (RT)-PCR i
ES-, ESY 3-1- og Hut 78 (humane) celler, milt og lever fra en kontrollmus (C) eller fra 4-3 aguti-avkommet (avledet fra 394/95-2 kimærer) og en prøve som ikke inneholdt templat-DNA (angitt som "-" i Figur 15A). Revers transkripsjon av poly(A+)-RNA og PCR-amplifikasjon av spesifikke cDNA-sekvenser ble foretatt ved å benytte cDNA-cykliseringssettet (Invitrogen). Spesifikk amplifisering av et 626 bp fragment fra humant HPRT cDNA i nærvær av murint HPRT cDNA ble foretatt som skissert av Huxley et al., supra. Integriteten av alle RNA-prøvene ble demonstrert gjennom PCR-amplifikasjon av cDNA fra mus-y-interferon-reseptoren. Primerne benyttet for amplifisering av et 359 bp fragment var: GTATGTGGAGCATAACCGGAG og CAGGTTTTGTCTCTAACGTGG. De humane HPRT og y-interferon-reseptor-primerne ble utviklet for å eliminere muligheten for å oppnå PCR-produkter fra genomisk DNA-forurensning. PCR-produkter ble analysert ved elektroforese og visualisert med ethidiumbromid. Størrelsesmarkørene er 1 kb stige (BRL). Resultatene av påvisning av mus-y-interferon-reseptor mRNA ved RT-PCR i de ovenfor beskrevne prøver, er vist i Figur 15B. Det spesifikke humane HPRT mRNA ble også påvist i de øvrige undersøkte vev (hjerne, nyre og hjerte) tatt fra 4-3 musen. Sammenlignbare steady state-nivåer av mus- og humant HPRT mRNA ble påvist i leveren til yHPRT-holdig avkom. Disse resultatene tyder på at opptaket av hele 13 megabaser genomisk gjær-DNA ikke virket skadelig på korrekt utvikling, kimlinje-overføring eller gen-ekspresjon.
Resultatene ovenfor demonstrerer at gjær-sfæroplaster er effektive bærere for avgivelse av en enkelt kopi høymolekylære DNA-fragmenter til ES-celler og at slike molekyler overføres stabilt og funksjonelt gjennom muse-kimlinjen. Alu-profilene, supplert med PFGE-analyse og in situ hybridisering av enkelte av ES-klonene underbygger sterkt at majoriteten av klonene praktisk talt inneholdt hele det humane innskudd i ikke-rearrangert form (dvs. i "kimlinje-konfigurasjon") med høy frekvens av kloner (40%) som også beholdt begge YAC-armene. Det betydelige opptak av genomisk gjær-DNA var ikke skadelig for korrekt differensiering av ES-celler in vitro og in vivo og forhindret ikke kimlinje-overføring eller gen-ekspresjon. Gjennom disse metodene kan man overføre store fragmenter genomisk DNA som innskudd i ikke-humane dyregenomer, hvor innskuddene kan overføres intakt gjennom kimlinje-overføring. Et stort utvalg xenogent DNA kan derfor overføres til ikke-humane vertsdyr, så som pattedyr, særlig små forsøksdyr, som kan gi nye fenotyper eller nye genotyper. For eksempel kan man gi små forsøksdyr gener til et pattedyr, f.eks. et menneske, for å studere etiologien for en sykdom, eller humane geners respons på et stort utvalg av forskjellige agens. Alternativt kan man innføre store loci i en pattedyrs-vert for å produsere andre arters produkter, for eksempel skaffe tilveie humane proteinsekvenser av slike proteiner som immunglobuliner, T-celle-reseptorer, MHC-antigener (Major Histocompatibility Complex), etc.
Innføring av tung kiede YAC A287- C10 oa kappa kiede YAC A80- Ci ES-celler oa embryoer
Gjær som inneholder det humane tung kjede YAC A287-C10 målrettet med pLUTO (yA287-C10) ble "spheroplasted" og fusjonert med den HPRT-manglende ES-cellelinje E14.1TG3B1 som beskrevet ovenfor. Ti HAT-resistente ES (ESY)-kloner (2B, 2C, 2D, 3A, 3B, 5C, 1125A, 1125E, 100/1500 og 100/4000) ble plukket og mangfoldiggjort for DNA-analyse. Vurderingen av det integrerte YAC ble foretatt ved Southern blotting-analyse av Hindlll-kuttet DNA fra disse klonene under bruk av humane tung kjede prober for de ovenfor beskrevne D-, JH-, u- og VH2-regionene. Samtlige ESY-kloner ble funnet å inneholde de forventede >10 kb Jh- og u-fragmentene. Samtlige ESY-kloner unntatt 2D- og 5C-kloner ble funnet å inneholde 4,8 kb VH2 kb fragmentet. Samtlige ESY-kloner, unntatt 2D og 3B, ble funnet å inneholde de forventede 10 og 7,6 kb D-genfragmentene. Genomiske gjær-sekvenser ble påvist ved hybridisering til det repeterende gjær-Ty-element i alle ESY-klonene unntatt 2B, 2D, 100/1500 og 5C. ESY-klonene 2B, 3A og 5C ble mikroinjisert i C57B/6 blastocyster som beskrevet ovenfor, og kimære mus (10 fra 2B-klonen, 1 fra 3A-klonen og 1 fra 5C-klonen) ble frembragt. Southern blotting-analyse av hale-DNA fra 10 av disse kimære dyrene tydet på nærvær av de fleste, om ikke alle, de tilsynelatende 10 Alu-fragmentene påvist i yA287-C10 i gjær, så vel som nærvær av VH2-og D-genfragmenter. De frembragte kimære musene ble parret med C57BL16J-mus for vurdering av kimlinje-overføring. En kimær hann, 78K-3, avledet fra 2B-klonen, overførte ES-cellegenomet til sitt avkom med en frekvens på 100%. Southern blotting-analyse av hale-DNA fra fire av i alt 6 aguti-farvede musunger tydet på nærvær av sekvenser av human tung kjede.
Fusjonsforsøk med gjær som inneholdt det humane kappa kjede YAC A80-C7 målrettet med pLUTO (yA80 C7) med E14.1TG3B1 ES-celler frembragte 2 HAT-resistente ESY-kloner: M4.4.1 og M5.2.1. Southern blotting-analyse av Hindlll-kuttede DNA fra disse kloner oppviste nærvær av samtlige av de tilsynelatende 10 Alu-fragmenter som ble påvist i yA80-C7 i gjær. I begge klonene var de genomiske gjær-sekvensene integrert. ESY-kloner ble mikroinjisert i C57B1/6J-blastocyster, og det ble utviklet kimære mus.
EKSEMPEL VII
Fremstilling av humant lg ved i kimære mus å innføre humant lg ved bruk av homolo<g> rekombinasjon
Som alternativ til måten beskrevet i Eksempel l-VI, innføres humane lg-gener i muse-lg-locuset ved å erstatte loci for muse-immunglobuliners tunge og lette kjede direkte med fragmenter av loci for de humane tunge og lette kjeder under bruk av homolog rekombinasjon. Dette etterfølges av utvikling av kimære transgene dyr, hvor celler avledet fra embryoniske stamceller bidrar til kimlinjen.
A. Konstruksjon av human tung kiede substitusionsvektor
De humane sekvenser som ønskes innført, inkluderer Spel 100 kb fragmentet av genomisk DNA som omfatter den humane VH6-D-J-Cu-C5 tunge kjederegion isolert fra et humant-YAC-bibliotek som beskrevet tidligere. Sekvensen for den flankerende tunge kjede hos mus, som regulerer den homologe
rekombinasjons-substitusjon, inneholder et 10 kb BamHI fragment av mus-Ce-Ca-tung kjede og et 5'J558-fragment som omfatter 5'-halvdelen av J558-fragmentet av den variable region i den tunge kjede hos mus, i henholdvis 3'-og 5'-enden til de humane sekvenser (Figur 16). Disse mus-sekvensene isoleres fra et genomisk museembryo-bibliotek ved å benytte probene beskrevet i henholdsvis Tucker et al., (1981). PNAS USA. 78:7684-7688 og Blankenstein & Krawinkel (1987, supra). Det 1150 bp Xhol til BamHI fragment som inneholder et neomycin-resistens-gen regulert av promoteren for Herpes simplex virusets thymidinkinase-gen (HSV-tk) og en polyoma-enhancer isoleres fra pMC1 Neo (Koller & Smithies, 1989, su<p>ra). En syntetisk adapter adderes til dette fragmentet for å omdanne Xhol-enden til en BamHI-ende, og det resulterende fragment forbindes med BamHI-mus-C£-Ca i et plasmid.
Fra YAC-klonen som inneholder locuset for den humane tunge kjede isoleres DNA-sekvenser fra hver ende av innskuddet ved invers PCR (Silverman et al., (1989) PNAS. 86:7485-7489) eller ved plasmid "rescue" i E. coN, (Burke et al., (1987); Garza et al., (1989), Science. 246:641-646: Traver et al., 1989) (se Figur 8). Den isolerte humane sekvens fra 5V6-enden av YAC ligeres til mus-J-558-sekvensen i et plasmid, og likeledes ligeres den humane sekvens som skriver seg fra 3'Cd-enden av YAC til Neo-genet i det ovenfor beskrevne plasmid som inneholder Neo og mus-Ce-Ca. Det humane V6-mus J558-segment subklones nå inn i en halv-YAC-kloningsvektor som inkluderer en selekterbar gjær-markør (HIS3) som ikke forekommer i det opprinnelige IgH YAC, en centromer (CEN) og en enkelt telomer (TEL). Det humane CS-Neo-mus-Ce-Ca subklones likeledes inn i en separat halv-YAC-vektor med en annen selektiv gjær-markør ( LEU2) og en enkelt TEL. Den halve-YAC-vektor som inneholder det humane V6 DNA lineariseres og benyttes til å transformere en gjærstamme som er delert med hensyn til de kromosomale HIS3- og LEU2-loci og som bærer IgH-YAC. Seleksjon for histidin-prototrofi fører til gjærkolonier som har undergått homolog rekombinasjon mellom de humane V6-DNA-sekvenser og inneholder et rekombinant YAC. Den halv-YAC-vektor som inneholder det humane C5-DNA lineariseres deretter og benyttes til å transformere gjærstammen utviklet i det foregående trinn. Seleksjon for leucin-prototrofi resulterer i en gjærstamme som inneholder det fullstendige IgH-substitusjons YAC (se Figur 16). Fortrinnsvis foretas begge målrettingsprosesser i et enkelt transformasjonstrinn, hvor det samtidig selekteres for leucin- og histidin-prototrofi. Dette er særlig anvendelig når de opprinnelige centriske og acentriske YAC-armene er i motsatt orientering i forhold til den som er vist i Figur 16. Dette YAC isoleres og innføres i ES-celler ved mikroinjeksjon som tidligere beskrevet for embryoer.
EKSEMPEL VIII
Kryssing av transgene mus
Æ Utvikling av mus som produserer humane monoklonale antistoff
Mus som inneholder locuset for humant immunglobulin parres med
mus med inaktiverte murine immunglobulin-gener for å frembringe mus som kun produserer humane antistoff. Ved å gå ut fra fire heterozygote stammer, fordres avl i tre generasjoner for å frembringe en mus som er homozygot for inaktive murine kappa og tung kjede immunglobuliner og heterozygot for lociet for humant immunglobulins tunge kjede og kappa-kjede. Avls-programmet er vist i Figur 17.
EKSEMPEL IX
Fremstilling av humane monoklonale antistoff
A. Immunisering av mus
Kimlinje-kimære mus inneholdende integrert humant DNA fra immunglobulin-loci immuniseres ved injeksjon av et antigen i adjuvans. Musene gis en tilleggsinjeksjon av antigen 14 dager etter den primære immunisering, hvilket gjentas etter 35 og 56 dager. Fra de immuniserte dyrene tas en blodprøve for å bestemme titeret av serum-antistoff mot immuniserings-antigenet. Den mus som har høyest titer avlives, hvorpå milten tas ut.
B. Fusion av splenocvtter
Myelomceller benyttet som fusjonspartner for miltcellene, opptines 6 dager før fusjonen og dyrkes i vevskultur. Et døgn før fusjonen fordeles cellene på friskt medium som inneholder 10% føtalt kalveserum i en konsentrasjon på 5 x 10<5> celler/mL. Om morgenen dagen for fusjon fortynnes cellene med et tilsvarende volum medium supplert med 20% føtalt kalveserum og 2X OPI- (3 mg/mL), 0,1 mg/mL natriumpyruvat og 0,4 IE/mL insulin) oppløsning.
Etter avlivning av musen uttas milten aseptisk og anbringes i en skål med dyrkningsmedium. Cellene rives fra hverandre inntil milten er revet i små biter og de fleste celler er tatt ut. Cellene vaskes i friskt, sterilt medium, og klumpene får mulighet til å skille seg ut.
Splenocyttene vaskes to ganger til ved sentrifugering i medium uten serum. Under den andre vaskingen, vaskes myeolomcellene også inn i et separat rør. Etter den avsluttende vasking, kombineres de to cellepellets som så sentrifugeres en gang sammen.
En oppløsning av 50% polyetylenglykol (PEG) tilsettes langsomt til den oppnådde cellepellet mens cellene resuspenderes i totalt 2 minutter. 10 mL oppvarmet medium tilsettes til celleoppløsningen under langsom omrøring i 3 minutter. Cellene sentrifugeres og supernatanten fjernes. Cellene resuspenderes i 10 mL medium supplert med 20% føtalt kalveserum, 1X OPI-oppløsning og 1X AH-oppløsning (58 uM azaserin, 0,1 mM hypoksantin). De fusjonerte cellene anbringes som alikvoter i 96-brønns plater og dyrkes ved 37° i 1 uke.
Supernatant uttas aseptisk fra hver brønn og forenes til forrådspuljer. Disse forrådene undersøkes med hensyn til reaktivitet mot det immuniserende antigen. Positive forråd undersøkes ytterligere for å finne frem til individuelle brønner. Når en positiv brønn er identifisert, overføres cellene fra 96-brønns platen til 0,5 mL medium supplert med 20% føtalt kalveserum, 1X OPI, og 1X AH i en 24-brønns plate. Når denne kulturen blir tett begrodd, mangfoldiggjøres cellene i 5 mL og deretter i 10 mL. På dette trinn subklones cellene slik at en enkelt antistoff-produserende celle befinner seg i kulturen.
I overensstemmelse med de ovenfor beskrevne fremgangsmåter kan det fremstilles et kimært ikke-humant vertsdyr, særlig et murint vertsdyr, som kan immuniseres for å produsere humane antistoff eller analoger som er spesifikke for et immunogen. På denne måte unngås problemene med å oppnå humane monoklonale antistoff, siden det transgene vertsdyr kan immuniseres med immunogener som ikke kunne vært benyttet med et menneske som vert. Det kan dessuten sørges for tilleggsinjeksjoner og adjuvanser som ikke ville tillates brukt på mennesker. De resulterende B-cellene kan deretter benyttes for immortalisering for den kontinuerlige produksjon av det ønskede antistoff. De immortaliserte cellene kan benyttes til isolering av gener som koder for immunglobulinet eller analoger, og kan underkastes ytterligere molekylær modifikasjon etter metoder, som f.eks. in vitro mutagenese eller annen teknikk for å endre antistoffenes egenskaper. Disse modifiserte genene kan deretter returneres til de immortaliserte cellene ved transfeksjon for å tilveiebringe en varig cellulær kilde av de ønskede antistoff i et pattedyr. Foreliggende oppfinnelse sørger således for en lettvint kilde til humane antistoff, hvor de humane antistoff produseres på analog måte som ved produksjon av antistoff i et menneske. Vertsdyrets celler gjør det på en forholdsvis lettvint måte mulig å oppnå aktivering og rearrangering av humant DNA for produksjon av humane antistoff i vertscellene.
Det kan følgelig fremstilles humane antistoff mot humane immunogener, f.eks. proteiner, ved immunisering av angjeldende verts-pattedyr med humane immunogener. De resulterende antisera vil være spesifikke for det humane immunogen og kan høstes fra vertens serum. De immuniserte B-celler fra verten kan benyttes for immortalisering, f.eks. myelomcellefusjon, transfeksjon, etc, for å gi immortaliserte celler, f.eks. hybridomer, til fremstilling av monoklonale antistoff. Antistoffene, antiserum og monoklonale antistoff, vil bli glykosylert i overensstemmelse med hvilken art cellen som produserer antistoffene tilhører. Sjeldne variable regioner i lg-locuset kan rekrutteres ved fremstilling av antistoffene slik at antistoff med sjeldne variable regioner kan oppnås.
Claims (17)
1. Fremgangsmåte for fremstilling av en gjærcelle som har minst et kunstig gjærkromosom (YAC) omfattende et fragment av et urearrangert humant immunoglobulin tung kjede lokus tilstrekkelig for å kode for en human immunoglobulin tung kjede, og minst et YAC omfattende et fragement av et urearrangert humant immunoglobulin lett kjede lokus tilstrekkelig for å kode for en human immunoglobulin lett kjede, idet fremgangsmåten omfatter følgende trinn: a) introdusering inn i en første gjærcelle et YAC som omfatter fragmentet av et urearrangert tung kjede lokus eller fragmentet av et urearrangert lett kjede lokus, og en selekterbar markør; b) introdusering av et kromosomalt DNA fra første gjærcelle inn i en andre gjærcelle som omfatter et YAC omfattende fragmentet av et urearrangert lett kjede lokus eller fragmentet av et urearrangert tung kjede lokus, og en selekterbar markør; c) selektering av gjærceller som omfatter YAC omfattende fragmentet av et urearrangert tung kjede lokus og YAC omfattende fragmentet av et urearrangert lett kjede lokus.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvori trinn (b) blir oppnådd ved parring av første og andre gjærcelle.
3. Gjærcelle som har minst et kunstig gjærkromosom (YAC), omfattende et fragment av et urearrangert humant immunoglobulin tung kjede lokus tilstrekkelig for å kode for en human immunoglobulin tung kjede, og minst et YAC som omfatter et fragment av et urearrangert humant immunoglobulin lett kjede lokus tilstrekkelig for å kode for en human immunoglobulin lett kjede, hvori gjærcellen blir produsert ved fremgangsmåten ifølge krav 1.
4. Fremgangsmåte for fremstilling av en ikke-human pattedyrembryonisk ES celle som har minst et fragment av et urearrangert humant immunoglobulin tung kjede lokus tilstrekkelig for å kode for en human immunoglobulin tung kjede og minst et fragment av et urearrangert humant immunoglobulin lett kjede lokus tilstrekkelig for å kode for en human immunoglobulin lett kjede, hvori fragmentet av et urearrangert tung kjede lokus og fragmentet av et urearrangert lett kjede lokus er stabilt integrert inn i det samme kromosomet til en ikke-human pattedyr ES celle, idet fremgangsmåten omfatter følgende trinn: a) kombinering under fusjonsbetingelser en ikke-human pattedyr ES celle og en gjærsfæroplast dannet fra en gjærcelle ifølge krav 3, hvori nevnte sfæroplast inneholder to eller flere YAC, hvori minst en YAC omfatter fragmentet av et urearrangert tung kjede lokus og minst et YAC som omfatter fragmentet av et urearrangert lett kjede lokus, og hvori hver YAC omfatter et gen kodende for en selekterbar markør, hvor ved fragmentene blir stabilt integrerte inn i genomet til ES cellene; og b) selektering for ES celler som bærer humant immunoglobulin loki ved hjelp av en eller flere av markørene.
5. Isolert ikke-humant pattedyr ES celle som har minst et fragment av et urearrangert humant immunoglobulin tung kjede lokus tilstrekkelig for å kode for en human immunoglobulin tung kjede og minst et fragment av et urearrangert humant immunoglobulin lett kjede lokus tilstrekkelig for å kode for en human immunoglobulin lett kjede, hvori fragmentet av et urearrangert tung kjede lokus og fragmentet av et urearrangert lett kjede lokus er stabilt integrert inn i det samme kromosomet av ES cellen, og hvor ES cellen blir produsert ved fremgangsmåten ifølge krav 4.
6. ES celle ifølge krav 5, hvori fragmentet av et urearrangert tung kjede lokus har sekvensen til et fragment av humant kromosom 14 fra D segment genene til human immunoglobulin tung kjede lokuset, videre fortsettelse gjennom J segment genene og konstant region genene til og med Cp av det lokuset, hvori nevnte DNA sekvens ikke innbefatter en gamma konstant region, og hvori nevnte sekvens er operabelt koblet til minst et humant V segment gen.
7. ES celle ifølge krav 5, hvori genomet til ES cellen omfatter minst et inaktivert endogent immunoglobulin tung kjede lokus, hvori lokuset blir inaktivert for å unngå rearrangement av lokuset og å forebygge dannelse av et transkript av et rearrangert immunoglobulin tung kjede lokus.
8. ES celle ifølge krav 7, hvori det minst ene endogene immunoglobulin tung kjede lokuset blir inaktivert ved delesjon av alle J segment genene.
9. ES celle ifølge krav 7, hvori genomet av ES cellen videre omfatter minst et inaktivert endogent immunoglobulin lett kjede lokus, hvori lokuset blir inaktivert for å unngå rearrangement av lokuset og å unngå dannelse av et transkript av et rearrangert immunoglobulin lett kjede lokus.
10. ES celle ifølge krav 9, hvori minst det ene endogene immunoglobulin lett kjede lokuset blir inaktivert ved delesjon av Ck genet.
11. Fremgangsmåte for fremstilling av et kimært ikke-humant pattedyr som har minst et fragment av et urearrangert humant immunoglobulin tung kjede lokus tilstrekkelig for å kode for en human immunoglobulin tung kjede og minst et fragment av et urearrangert humant immunglobulin lett kjede lokus tilstrekkelig for å kode for en human immunoglobulin tung kjede, hvori fragmentet av et urearrangert tung kjede lokus og fragmentet av et urearrangert lett kjede lokus er stabilt integrert inn i det samme kromosomet i minst noen av dets celler, idet fremgangmåten omfatter følgende trinn: a) produsering av en ES celle ifølge krav 5; og b) produsering av det kimære ikke-humane pattedyret fra ES cellen.
12. Fremgangsmåte for fremstilling av et transgent ikke-humant pattedyr og dets avkom som har i dets somatiske og kim-celler minst et fragment av et urearrangert humant immunoglobulin tung kjede lokus tilstrekkelig for å kode for en human immunoglobulin tung kjede og minst et fragment av et urearrangert humant immunoglobulin lett kjede lokus tilstrekkelig for å kode for en human immunoglobulin lett kjede, hvori fragmentet av en urearrangert tung kjede og fragmentet av en urearrangert lett kjede er stabilt integrert inn i det samme kromosomet, idet fremgangsmåten omfatter trinnet å avle det kimeriske ikke-humane pattedyret ifølge krav 11 og dets avkom for å fremstille det transgene ikke-humane pattedyret.
13. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 4,11 eller 12, hvori fragmentet av et urearrangert tung kjede lokus har sekvensen til et fragment av humant kromosom 14 fra D segment genene til human immunoglobulin tung kjede lokuset, gjennom J segment genene og konstant region genene til og med Cp av det lokuset, hvori nevnte DNA sekvens ikke innbefatter en gamma konstant region, og hvori nevnte DNA sekvens er operabelt koblet til minst et humant V segment gen.
14. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 4,11 eller 12, hvori genomet til ES cellen omfatter minst et inaktivert endogent immunoglobulin tung kjede lokus, hvori lokuset blir inaktivert for å unngå rearrangement av lokuset og for å unngå dannelsen av et transkript av et rearrangert immunoglobulin tung kjede lokus.
15. Fremgangsmåte ifølge krav 14, hvori det i det minste ene endogene immunoglobulin tung kjede lokuset blir inaktivert ved delesjon av alle J segment genene.
16. Fremgangsmåte ifølge krav 14, hvori genomet til ES cellen omfatter minst et inaktivert endogent immunoglobulin lett kjede lokus, hvori lokuset blir inaktivert for å unngå rearrangement av lokuset og for å unngå dannelsen av et transkript av et rearrangert immunoglobulin lett kjede lokus.
17. Fremgangsmåte ifølge krav 16, hvori minst et endogent immunoglobulin lett kjede lokus blir inaktivert ved delesjon av Ck genet.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US91929792A | 1992-07-24 | 1992-07-24 | |
US08/031,801 US6673986B1 (en) | 1990-01-12 | 1993-03-15 | Generation of xenogeneic antibodies |
PCT/US1993/006926 WO1994002602A1 (en) | 1992-07-24 | 1993-07-23 | Generation of xenogeneic antibodies |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO950244D0 NO950244D0 (no) | 1995-01-23 |
NO950244L NO950244L (no) | 1995-03-23 |
NO328075B1 true NO328075B1 (no) | 2009-11-23 |
Family
ID=26707625
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO19950244A NO328075B1 (no) | 1992-07-24 | 1995-01-23 | Fremgangsmate for fremstilling av en gjaercelle, en ikke-human pattedyrembryonisk ES celle, et kimaert ikke-humant pattedyr og et transgent ikke-humant pattedyr samt gjaercelle og isolert ikke-humant pattedyr ES celle. |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0652950B1 (no) |
JP (2) | JPH07509137A (no) |
AT (1) | ATE381614T1 (no) |
AU (1) | AU675661B2 (no) |
CA (1) | CA2140638C (no) |
ES (1) | ES2301158T3 (no) |
FI (1) | FI121339B (no) |
NO (1) | NO328075B1 (no) |
NZ (1) | NZ255101A (no) |
SG (1) | SG48760A1 (no) |
WO (1) | WO1994002602A1 (no) |
Families Citing this family (801)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE69133566T2 (de) * | 1990-01-12 | 2007-12-06 | Amgen Fremont Inc. | Bildung von xenogenen Antikörpern |
US6657103B1 (en) | 1990-01-12 | 2003-12-02 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
US6673986B1 (en) | 1990-01-12 | 2004-01-06 | Abgenix, Inc. | Generation of xenogeneic antibodies |
US6075181A (en) * | 1990-01-12 | 2000-06-13 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
US6713610B1 (en) | 1990-01-12 | 2004-03-30 | Raju Kucherlapati | Human antibodies derived from immunized xenomice |
US6150584A (en) * | 1990-01-12 | 2000-11-21 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
US5770429A (en) * | 1990-08-29 | 1998-06-23 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
US7084260B1 (en) | 1996-10-10 | 2006-08-01 | Genpharm International, Inc. | High affinity human antibodies and human antibodies against human antigens |
KR19980701536A (ko) * | 1995-01-20 | 1998-05-15 | 케더린 세레다 글라우브 | 융합된 세포에서 스크린 효과를 개선시키는 방법 |
US6130364A (en) * | 1995-03-29 | 2000-10-10 | Abgenix, Inc. | Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination |
US6091001A (en) * | 1995-03-29 | 2000-07-18 | Abgenix, Inc. | Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination |
US6884622B1 (en) | 1995-04-21 | 2005-04-26 | Abgenix, Inc | Method for preparing a mammalian cell deficient in HPRT |
AU2008202860B9 (en) * | 1995-04-27 | 2012-03-29 | Amgen Fremont Inc. | Human Antibodies Derived From Immunized Xenomice |
AU4376400A (en) * | 1995-04-27 | 2000-11-30 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
ATE390933T1 (de) * | 1995-04-27 | 2008-04-15 | Amgen Fremont Inc | Aus immunisierten xenomäusen stammende menschliche antikörper gegen il-8 |
AU2466895A (en) * | 1995-04-28 | 1996-11-18 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
CN1165344C (zh) * | 1995-07-21 | 2004-09-08 | 内布拉斯卡大学评议会 | 用于催化水解HIVgp120的组合物及其制备方法和用途 |
US6632976B1 (en) | 1995-08-29 | 2003-10-14 | Kirin Beer Kabushiki Kaisha | Chimeric mice that are produced by microcell mediated chromosome transfer and that retain a human antibody gene |
US7888466B2 (en) | 1996-01-11 | 2011-02-15 | Human Genome Sciences, Inc. | Human G-protein chemokine receptor HSATU68 |
EP1854481B1 (en) | 1996-04-23 | 2014-07-16 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Cerebral stroke/cerebral edema preventive or remedy containing IL-8 binding inhibitor as active ingredient |
US6420140B1 (en) | 1996-10-11 | 2002-07-16 | Abgenix, Inc. | Production of multimeric protein by cell fusion method |
US5916771A (en) | 1996-10-11 | 1999-06-29 | Abgenix, Inc. | Production of a multimeric protein by cell fusion method |
AU5702298A (en) | 1996-12-03 | 1998-06-29 | Abgenix, Inc. | Transgenic mammals having human Ig loci including plural VH and VK regions nd antibodies produced therefrom |
EP2322216A1 (en) | 1997-03-21 | 2011-05-18 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | A preventive or therapeutic agent for sensitized T cell-mediated diseases comprising IL-6 antagonist as an active ingredient |
US6235883B1 (en) | 1997-05-05 | 2001-05-22 | Abgenix, Inc. | Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor |
US20020173629A1 (en) | 1997-05-05 | 2002-11-21 | Aya Jakobovits | Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor |
ATE395933T1 (de) | 1997-08-15 | 2008-06-15 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Präventiva oder arzneien enthaltend neutralisierende anti-il6-rezeptor antikörper zur reduktion urinären proteins bei systemischen lupus erythematosus |
TWI255853B (en) | 1998-08-21 | 2006-06-01 | Kirin Brewery | Method for modifying chromosomes |
EP1136548A4 (en) | 1998-11-04 | 2002-09-25 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | NEW SERINE PROTEASES FROM THE TRYPSIN FAMILY |
EE05627B1 (et) | 1998-12-23 | 2013-02-15 | Pfizer Inc. | CTLA-4 vastased inimese monoklonaalsed antikehad |
US7109003B2 (en) | 1998-12-23 | 2006-09-19 | Abgenix, Inc. | Methods for expressing and recovering human monoclonal antibodies to CTLA-4 |
PT2112166T (pt) | 1998-12-23 | 2019-01-30 | Pfizer | Anticorpos monoclonais humanos contra ctla-4 |
US6914128B1 (en) | 1999-03-25 | 2005-07-05 | Abbott Gmbh & Co. Kg | Human antibodies that bind human IL-12 and methods for producing |
EP1961818A3 (en) | 1999-04-09 | 2008-09-10 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Novel fetal genes |
WO2000075314A1 (fr) | 1999-06-02 | 2000-12-14 | Chugai Research Institute For Molecular Medicine, Inc. | Proteine receptrice d'hemopoietine |
US6833268B1 (en) * | 1999-06-10 | 2004-12-21 | Abgenix, Inc. | Transgenic animals for producing specific isotypes of human antibodies via non-cognate switch regions |
CN1370076A (zh) | 1999-08-23 | 2002-09-18 | 中外制药株式会社 | Hm1.24抗原的表达增强剂 |
KR100942863B1 (ko) | 1999-08-24 | 2010-02-17 | 메다렉스, 인코포레이티드 | 인간 씨티엘에이-4 항체 및 그의 용도 |
US7605238B2 (en) | 1999-08-24 | 2009-10-20 | Medarex, Inc. | Human CTLA-4 antibodies and their uses |
WO2001018200A1 (fr) | 1999-09-06 | 2001-03-15 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Gene de type tsg |
US7459540B1 (en) | 1999-09-07 | 2008-12-02 | Amgen Inc. | Fibroblast growth factor-like polypeptides |
EP1223217A4 (en) | 1999-09-21 | 2003-06-25 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | TRANSPORTER GENES OATP-B, C, D AND E |
IL148980A0 (en) | 1999-10-01 | 2002-11-10 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | An antibody to human tissue factor and experimental animals having inserted cells with the gene encoding human tissue factor |
ATE409747T1 (de) | 2000-01-24 | 2008-10-15 | Haruo Sugiyama | Mit wt1 interagierendes protein, wtip |
TWI335336B (no) | 2000-02-10 | 2011-01-01 | Abbott Gmbh & Co Kg | |
US6653448B1 (en) | 2000-03-29 | 2003-11-25 | Curagen Corporation | Wnt-7B-like polypeptides and nucleic acids encoding same |
AU2001253339A1 (en) * | 2000-04-10 | 2001-10-23 | American Biogenetic Sciences Inc. | Human immunoglobulin-producing gnotobiotics |
AU2001252618A1 (en) | 2000-04-28 | 2001-11-12 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Cell proliferation inhibitors |
JP3597140B2 (ja) | 2000-05-18 | 2004-12-02 | 日本たばこ産業株式会社 | 副刺激伝達分子ailimに対するヒトモノクローナル抗体及びその医薬用途 |
PT2077279E (pt) | 2000-06-28 | 2012-09-14 | Amgen Inc | Moléculas do receptor de linfopoietina estromal tímica e suas utilizações |
US7105348B2 (en) | 2000-10-31 | 2006-09-12 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of modifying eukaryotic cells |
US6586251B2 (en) * | 2000-10-31 | 2003-07-01 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of modifying eukaryotic cells |
US20050144655A1 (en) * | 2000-10-31 | 2005-06-30 | Economides Aris N. | Methods of modifying eukaryotic cells |
US6596541B2 (en) | 2000-10-31 | 2003-07-22 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of modifying eukaryotic cells |
EP1343880B1 (en) * | 2000-11-17 | 2009-05-27 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Expression of xenogenous (human) immunoglobulins in cloned, transgenic bovine |
JP3523245B1 (ja) | 2000-11-30 | 2004-04-26 | メダレックス,インコーポレーテッド | ヒト抗体作製用トランスジェニック染色体導入齧歯動物 |
EP1415005B1 (en) | 2000-12-07 | 2012-11-21 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Endogenous retroviruses up-regulated in prostate cancer |
PE20020801A1 (es) | 2001-01-05 | 2002-09-06 | Pfizer | Anticuerpos contra el receptor del factor de crecimiento similar a insulina |
JP3986439B2 (ja) | 2001-02-07 | 2007-10-03 | 中外製薬株式会社 | 造血器腫瘍の治療剤 |
CA2441071C (en) | 2001-03-14 | 2010-06-22 | Myriad Genetics, Inc. | Tsg101-gag interaction and use thereof |
UA80091C2 (en) | 2001-04-02 | 2007-08-27 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Remedies for infant chronic arthritis-relating diseases and still's disease which contain an interleukin-6 (il-6) antagonist |
WO2002081639A2 (en) | 2001-04-06 | 2002-10-17 | Georgetown University | Gene brcc2 and diagnostic and therapeutic uses thereof |
AU2002305151A1 (en) | 2001-04-06 | 2002-10-21 | Georgetown University | Gene scc-112 and diagnostic and therapeutic uses thereof |
AU2002258728A1 (en) | 2001-04-06 | 2002-10-21 | Georgetown University | Gene brcc-3 and diagnostic and therapeutic uses thereof |
JP2004536579A (ja) | 2001-04-13 | 2004-12-09 | ヒューマン ジノーム サイエンシーズ, インコーポレイテッド | 血管内皮増殖因子2 |
JP4115281B2 (ja) | 2001-05-11 | 2008-07-09 | キリンファーマ株式会社 | ヒト抗体λ軽鎖遺伝子を含むヒト人工染色体、および子孫伝達可能な該ヒト人工染色体を含む非ヒト動物 |
EP1463522A4 (en) | 2001-05-16 | 2005-04-13 | Einstein Coll Med | HUMAN ANTI-PNEUMOCOCCAL ANTIBODIES FROM NON-HUMAN ANIMALS |
MXPA03010747A (es) | 2001-05-25 | 2004-03-02 | Human Genome Sciences Inc | Anticuerpos que se unen inmunoespecificamente a receptores de ligando inductor de apoptosis relacionado con factor de necrosis tumoral. |
GB0115256D0 (en) * | 2001-06-21 | 2001-08-15 | Babraham Inst | Mouse light chain locus |
EP1283053A1 (en) | 2001-08-09 | 2003-02-12 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Inhibitors of HER3 activity |
US7981863B2 (en) | 2001-09-19 | 2011-07-19 | Neuronova Ab | Treatment of Parkinson's disease with PDGF |
AR039067A1 (es) | 2001-11-09 | 2005-02-09 | Pfizer Prod Inc | Anticuerpos para cd40 |
CA2847885C (en) | 2001-11-30 | 2022-03-22 | Amgen Fremont Inc. | Transgenic animals bearing human ig.lambda. light chain genes |
US20050171339A1 (en) | 2001-12-28 | 2005-08-04 | Izumi Sugo | Method of stabilizing protein |
EP1475101B1 (en) | 2002-02-14 | 2010-10-27 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antibody-containing solution pharmaceuticals |
US7662924B2 (en) | 2002-02-22 | 2010-02-16 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Beta chain-associated regulator of apoptosis |
US20040023267A1 (en) | 2002-03-21 | 2004-02-05 | Morris David W. | Novel compositions and methods in cancer |
SI1527100T1 (sl) | 2002-03-29 | 2009-12-31 | Schering Corp | Humana monoklonska protitelesa proti interlevkinu-5 in postopki in sestavki, ki jih obsegajo |
US7666610B2 (en) | 2002-03-29 | 2010-02-23 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Expressing transporters on viral envelopes |
WO2004022597A1 (ja) | 2002-09-04 | 2004-03-18 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Gpc3の血中可溶化n端ペプチドに対する抗体 |
US7244565B2 (en) | 2002-04-10 | 2007-07-17 | Georgetown University | Gene shinc-3 and diagnostic and therapeutic uses thereof |
AU2003234736B2 (en) | 2002-04-12 | 2008-09-25 | E. R. Squibb & Sons, L.L.C. | Methods of treatment using CTLA-4 antibodies |
EP2275544A3 (en) | 2002-06-06 | 2011-03-30 | Oncotherapy Science, Inc. | Genes and polypeptides relating to human colon cancers |
SI1513934T1 (sl) | 2002-06-06 | 2011-06-30 | Oncotherapy Science Inc | Geni in polipeptidi, povezani s humanimi raki kolona |
US8518694B2 (en) | 2002-06-13 | 2013-08-27 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Nucleic acid vector comprising a promoter and a sequence encoding a polypeptide from the endogenous retrovirus PCAV |
ZA200500480B (en) | 2002-07-15 | 2006-10-25 | Wyeth Corp | Methods and compositions for modulating T helper (TH) cell development and function |
USRE47770E1 (en) | 2002-07-18 | 2019-12-17 | Merus N.V. | Recombinant production of mixtures of antibodies |
PT1523496E (pt) | 2002-07-18 | 2011-09-29 | Merus B V | Produção de misturas de anticorpos de forma recombinante |
US20060058511A1 (en) | 2002-08-27 | 2006-03-16 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method for stabilizing protein solution preparation |
BRPI0314038B8 (pt) | 2002-09-06 | 2021-05-25 | Amgen Inc | anticorpo humano isolado, molécula de ácido nucleico isolada, vetor, uso de um anticorpo, e, composição farmacêutica |
CA2496400A1 (en) | 2002-09-09 | 2004-03-18 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Bh3 peptides and method of use thereof |
JP5525118B2 (ja) | 2002-09-11 | 2014-06-18 | 中外製薬株式会社 | タンパク質精製方法 |
TW200413725A (en) | 2002-09-30 | 2004-08-01 | Oncotherapy Science Inc | Method for diagnosing non-small cell lung cancers |
TW200413539A (en) | 2002-09-30 | 2004-08-01 | Oncotherapy Science Inc | Genes and polypeptides relating to prostate cancers |
WO2004038018A1 (ja) | 2002-10-22 | 2004-05-06 | Eisai Co., Ltd. | 分裂停止後のドーパミン産生ニューロン前駆細胞に特異的に発現している遺伝子 |
AU2003280643A1 (en) | 2002-10-30 | 2004-05-25 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Membrane protein originating in mast cells |
EP1563084A4 (en) | 2002-11-08 | 2006-03-01 | Hematech Llc | TRANSGENE UNGULATES WITH REDUCED PRION PROTEIN ACTIVITY AND USES THEREOF |
EP2287192B1 (en) | 2002-11-15 | 2015-08-26 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Methods for preventing and treating cancer metastasis and bone loss associated with cancer metastasis |
EP2363410B1 (en) | 2002-11-27 | 2017-10-11 | Minerva Biotechnologies Corporation | Isoforms of MUC1 |
DE60333228D1 (de) | 2002-12-02 | 2010-08-12 | Amgen Fremont Inc | Gegen den tumor nekrose faktor gerichtete antikörper und deren verwendungen |
US7282568B2 (en) | 2002-12-16 | 2007-10-16 | Medarex, Inc. | Human monoclonal antibodies against interleukin 8 (IL-8) |
EP1589106B1 (en) | 2002-12-29 | 2010-12-01 | Toudai Tlo, Ltd. | Adiponectin receptor and gene coding for the same |
DE10303974A1 (de) | 2003-01-31 | 2004-08-05 | Abbott Gmbh & Co. Kg | Amyloid-β(1-42)-Oligomere, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung |
US7767387B2 (en) | 2003-06-13 | 2010-08-03 | Sagres Discovery, Inc. | Therapeutic targets in cancer |
WO2004074321A2 (en) | 2003-02-14 | 2004-09-02 | Sagres Discovery, Inc. | Therapeutic gpcr targets in cancer |
US20040170982A1 (en) | 2003-02-14 | 2004-09-02 | Morris David W. | Novel therapeutic targets in cancer |
AU2004224390A1 (en) | 2003-03-19 | 2004-10-07 | Abgenix, Inc. | Antibodies against T cell immunoglobulin domain and mucin domain 1 (TIM-1) antigen and uses thereof |
GB2401040A (en) | 2003-04-28 | 2004-11-03 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Method for treating interleukin-6 related diseases |
EP1627916B1 (en) | 2003-05-28 | 2009-11-25 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Anti-BAMBI antibodies or RNA for diagnosis and therapy of colon or liver cancer |
US20100069614A1 (en) | 2008-06-27 | 2010-03-18 | Merus B.V. | Antibody producing non-human mammals |
WO2004106375A1 (en) | 2003-05-30 | 2004-12-09 | Merus Biopharmaceuticals B.V. I.O. | Fab library for the preparation of anti vegf and anti rabies virus fabs |
JPWO2005017155A1 (ja) | 2003-06-18 | 2006-10-12 | 中外製薬株式会社 | フコーストランスポーター |
AU2004260936B2 (en) | 2003-06-27 | 2010-06-10 | Amgen Fremont Inc. | Antibodies directed to the deletion mutants of epidermal growth factor receptor and uses thereof |
HN2004000285A (es) | 2003-08-04 | 2006-04-27 | Pfizer Prod Inc | ANTICUERPOS DIRIGIDOS A c-MET |
CN1838968A (zh) | 2003-08-08 | 2006-09-27 | 艾伯吉尼斯公司 | 针对甲状旁腺激素(pth)之抗体和其用途 |
EP1654383A1 (en) | 2003-08-08 | 2006-05-10 | Licentia, Ltd. | Materials and methods for colorectal cancer screening, diagnosis, and therapy |
WO2005014818A1 (ja) | 2003-08-08 | 2005-02-17 | Perseus Proteomics Inc. | 癌高発現遺伝子 |
AR045563A1 (es) | 2003-09-10 | 2005-11-02 | Warner Lambert Co | Anticuerpos dirigidos a m-csf |
WO2005035753A1 (ja) | 2003-10-10 | 2005-04-21 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | 機能蛋白質を代替する二重特異性抗体 |
EP1693448A4 (en) | 2003-10-14 | 2008-03-05 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | DOUBLE SPECIFICITY ANTIBODY FOR FUNCTIONAL PROTEIN SUBSTITUTION |
US20050100965A1 (en) | 2003-11-12 | 2005-05-12 | Tariq Ghayur | IL-18 binding proteins |
US7750123B2 (en) | 2003-11-25 | 2010-07-06 | Dana Farber Cancer Institute, Inc. | Antibodies against SARS-CoV and methods of use thereof |
DE10355904A1 (de) | 2003-11-29 | 2005-06-30 | Merck Patent Gmbh | Feste Formen von anti-EGFR-Antikörpern |
CN1914320A (zh) | 2003-12-03 | 2007-02-14 | 中外制药株式会社 | 利用哺乳类β肌动蛋白启动子的表达体系 |
US7700737B2 (en) | 2003-12-05 | 2010-04-20 | Multimmune Gmbh | Therapeutic and diagnostic anti-Hsp70 antibodies |
US7312320B2 (en) | 2003-12-10 | 2007-12-25 | Novimmune Sa | Neutralizing antibodies and methods of use thereof |
EP1710255A4 (en) | 2003-12-12 | 2008-09-24 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | MODIFIED ANTIBODIES RECOGNIZING A TRIMER OR LARGER RECEPTOR |
CA2552750C (en) | 2004-01-07 | 2021-11-09 | Chiron Corporation | M-csf-specific monoclonal antibody and uses thereof |
MX370489B (es) | 2004-01-09 | 2019-12-16 | Pfizer | Anticuerpos contra madcam. |
US7625549B2 (en) | 2004-03-19 | 2009-12-01 | Amgen Fremont Inc. | Determining the risk of human anti-human antibodies in transgenic mice |
CA2564989C (en) | 2004-03-19 | 2014-05-27 | Amgen, Inc. | Reducing the risk of human and anti-human antibodies through v gene manipulation |
JP4938451B2 (ja) | 2004-03-23 | 2012-05-23 | オンコセラピー・サイエンス株式会社 | 非小細胞肺癌の診断のための方法 |
EP1786463A4 (en) | 2004-03-26 | 2009-05-20 | Human Genome Sciences Inc | ANTIBODY AGAINST NOGO RECEPTOR |
CN101014715A (zh) | 2004-04-22 | 2007-08-08 | 麒麟麦酒株式会社 | 转基因动物及其用途 |
EP1761784B1 (en) | 2004-05-24 | 2016-10-26 | Universität Zu Köln | Identification of ergothioneine transporter and therapeutic uses thereof |
EP1602926A1 (en) | 2004-06-04 | 2005-12-07 | University of Geneva | Novel means and methods for the treatment of hearing loss and phantom hearing |
AU2005259221B2 (en) | 2004-07-01 | 2011-02-10 | Innate Pharma | Antibodies binding to receptors KIR2DL1, -2, 3 but not KIR2DS4 and their therapeutic use |
EP2314317A3 (en) | 2004-07-09 | 2011-06-29 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Anti-glypican 3 antibody |
KR20080019733A (ko) | 2004-07-16 | 2008-03-04 | 화이자 프로덕츠 인코포레이티드 | 항-아이지에프-1알 항체를 사용하는 비-혈액학적악성종양에 대한 조합 치료 |
US20060024677A1 (en) | 2004-07-20 | 2006-02-02 | Morris David W | Novel therapeutic targets in cancer |
JP3996627B2 (ja) | 2004-07-22 | 2007-10-24 | エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 | Lrp4/Corinドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー |
CA2574881C (en) | 2004-08-04 | 2013-01-08 | Amgen Inc. | Antibodies to dkk-1 |
CA2582683A1 (en) | 2004-10-01 | 2006-04-13 | Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. | Novel antibodies directed to the mammalian eag1 ion channel protein |
ES2679282T3 (es) | 2004-10-22 | 2018-08-23 | Revivicor Inc. | Porcinos transgénicos que carecen de cadena ligera de inmunoglobulina endógena |
AU2012200570A1 (en) * | 2004-10-22 | 2012-02-23 | Revivicor, Inc. | Ungulates with genetically modified immune systems |
US20080026457A1 (en) | 2004-10-22 | 2008-01-31 | Kevin Wells | Ungulates with genetically modified immune systems |
MX2007005866A (es) | 2004-11-17 | 2007-11-12 | Amgen Inc | Anticuerpos monoclonales totalmente humanos para il-13. |
ATE504602T1 (de) | 2004-12-20 | 2011-04-15 | Amgen Fremont Inc | Für humane matriptase spezifische bindungsproteine |
EP2284194A1 (en) | 2004-12-21 | 2011-02-16 | AstraZeneca AB | Antibodies directed to angiopoietin-2 and uses thereof |
US20090061485A1 (en) | 2004-12-22 | 2009-03-05 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method of Producing an Antibody Using a Cell in Which the Function of Fucose Transporter Is Inhibited |
WO2006081139A2 (en) | 2005-01-26 | 2006-08-03 | Abgenix, Inc. | Antibodies against interleukin-1 beta |
PA8660701A1 (es) | 2005-02-04 | 2006-09-22 | Pfizer Prod Inc | Agonistas de pyy y sus usos |
EP2311983A1 (en) | 2005-02-10 | 2011-04-20 | Oncotherapy Science, Inc. | Method of treating bladder cancer using siRNA |
CN101160528A (zh) | 2005-02-14 | 2008-04-09 | 惠氏公司 | Il17-f在诊断和治疗气道炎症中的用途 |
WO2006088833A2 (en) | 2005-02-14 | 2006-08-24 | Wyeth | Interleukin-17f antibodies and other il-17f signaling antagonists and uses therefor |
EP1871807B1 (en) | 2005-02-18 | 2012-11-28 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Antibodies against cxcr4 and methods of use thereof |
TWI406870B (zh) | 2005-02-21 | 2013-09-01 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | A method of making a protein using hamster IGF-1 |
NZ560844A (en) | 2005-03-08 | 2008-08-29 | Pharmacia & Upjohn Co Llc | Anti-MAdCAM antibody compositions |
WO2007059082A1 (en) | 2005-11-10 | 2007-05-24 | Curagen Corporation | Method of treating ovarian and renal cancer using antibodies against t cell immunoglobulin domain and mucin domain 1 (tim-1) antigen |
EP2526957A3 (en) | 2005-03-30 | 2013-02-20 | Minerva Biotechnologies Corporation | Proliferation of MUC1 expressing cells |
ES2720288T3 (es) | 2005-03-30 | 2019-07-19 | Minerva Biotechnologies Corp | Proliferación de células que expresan MUC1 |
WO2006106905A1 (ja) | 2005-03-31 | 2006-10-12 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | 会合制御によるポリペプチド製造方法 |
US20090214536A1 (en) | 2005-04-07 | 2009-08-27 | Guoying Yu | CACNA1E in Cancer Diagnosis, Detection and Treatment |
US20090220495A1 (en) | 2005-04-07 | 2009-09-03 | Abdallah Fanidi | Cancer Related Genes (PRLR) |
EP1876236B9 (en) | 2005-04-08 | 2015-02-25 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antibody substituting for function of blood coagulation factor viii |
GT200600148A (es) | 2005-04-14 | 2006-11-22 | Metodos para el tratamiento y la prevencion de fibrosis | |
WO2006113643A2 (en) | 2005-04-20 | 2006-10-26 | Amgen Fremont Inc. | High affinity fully human monoclonal antibodies to interleukin-8 and epitopes for such antibodies |
EA201100642A1 (ru) | 2005-04-25 | 2011-12-30 | Пфайзер Инк. | Антитела к миостатину |
MX2007013304A (es) | 2005-04-26 | 2007-12-13 | Pfizer | Anticuerpos de p-caderina. |
CA2608474C (en) | 2005-05-17 | 2019-11-12 | University Of Connecticut | Compositions and methods for immunomodulation in an organism |
CA2610987C (en) | 2005-06-10 | 2013-09-10 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Stabilizer for protein preparation comprising meglumine and use thereof |
CN103172738A (zh) | 2005-06-30 | 2013-06-26 | Abbvie公司 | Il-12/p40结合蛋白 |
US8067153B2 (en) | 2005-07-27 | 2011-11-29 | Oncotheraphy Science, Inc. | Genes and polypeptides relating to prostate cancers |
EP2311876A3 (en) | 2005-07-28 | 2011-04-27 | Novartis AG | M-CSF-specific monoclonal antibody and uses thereof |
CN101287493A (zh) | 2005-08-18 | 2008-10-15 | 根马布股份公司 | 采用cd4结合肽和辐射的疗法 |
US7612181B2 (en) | 2005-08-19 | 2009-11-03 | Abbott Laboratories | Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof |
JP5415071B2 (ja) | 2005-08-19 | 2014-02-12 | ワイス・エルエルシー | Gdf−8に対するアンタゴニスト抗体ならびにalsおよびその他のgdf−8関連障害の処置における使用 |
WO2007024715A2 (en) | 2005-08-19 | 2007-03-01 | Abbott Laboratories | Dual variable domain immunoglobin and uses thereof |
EP2500354A3 (en) | 2005-08-19 | 2012-10-24 | Abbott Laboratories | Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof |
PL2447283T3 (pl) | 2005-09-07 | 2015-12-31 | Amgen Fremont Inc | Ludzkie przeciwciała monoklonalne przeciwko kinazie podobnej do receptora aktywiny-1 (ALK-1) |
RU2396275C2 (ru) | 2005-09-29 | 2010-08-10 | Эйсай Ар Энд Ди Менеджмент Ко., Лтд. | Молекула адгезии т-клеток и антитело, направленное против молекулы |
CA2624562A1 (en) | 2005-09-30 | 2007-04-12 | Abbott Gmbh & Co. Kg | Binding domains of proteins of the repulsive guidance molecule (rgm) protein family and functional fragments thereof, and their use |
JP5014143B2 (ja) | 2005-10-14 | 2012-08-29 | 学校法人福岡大学 | 膵島移植における移植膵島障害抑制剤 |
AR058135A1 (es) | 2005-10-21 | 2008-01-23 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Agentes para el tratamiento de cardiopatias |
US8128934B2 (en) | 2005-11-14 | 2012-03-06 | Ribomic, Inc. | Method for treatment or prevention of disease associated with functional disorder of regulatory T cell |
AR057582A1 (es) | 2005-11-15 | 2007-12-05 | Nat Hospital Organization | Agentes para suprimir la induccion de linfocitos t citotoxicos |
EP1967209B1 (en) | 2005-11-25 | 2012-06-06 | Keio University | Therapeutic agent for prostate cancer |
CN101432302A (zh) | 2005-11-30 | 2009-05-13 | 艾博特公司 | 抗-Aβ球聚体抗体,其抗原结合部分,相应的杂交瘤、核酸、载体、宿主细胞,生产所述抗体的方法,包含所述抗体的组合物,所述抗体的应用以及使用所述抗体的方法 |
CA2631195C (en) | 2005-11-30 | 2016-04-05 | Abbott Laboratories | Monoclonal antibodies against amyloid beta protein and uses thereof |
WO2007065027A2 (en) | 2005-12-02 | 2007-06-07 | Dana Farber Cancer Institute | Carbonic anhydrase ix (g250) antibodies and methods of use thereof |
WO2007067959A2 (en) | 2005-12-07 | 2007-06-14 | Medarex, Inc. | Ctla-4 antibody dosage escalation regimens |
ES2385054T3 (es) | 2005-12-13 | 2012-07-17 | Medimmune Limited | Proteínas de unión específicas para factores de crecimiento de tipo insulina y usos de las mismas |
WO2007074880A1 (ja) | 2005-12-28 | 2007-07-05 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | 抗体含有安定化製剤 |
AR056857A1 (es) | 2005-12-30 | 2007-10-24 | U3 Pharma Ag | Anticuerpos dirigidos hacia her-3 (receptor del factor de crecimiento epidérmico humano-3) y sus usos |
SG10201400426XA (en) | 2006-01-12 | 2014-07-30 | Alexion Pharma Inc | Antibodies to ox-2/cd200 and uses thereof |
KR101481843B1 (ko) | 2006-01-25 | 2015-01-12 | 에라스무스 유니버시티 메디컬 센터 로테르담 | 형질전환 동물 내에서의 중쇄만의 항체의 생성 |
US8771686B2 (en) | 2006-01-27 | 2014-07-08 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Methods for treating a disease involving choroidal neovascularization by administering an IL-6 receptor antibody |
US7803561B2 (en) | 2006-02-06 | 2010-09-28 | Rhode Island Hospital | GPR30 estrogen receptor in breast cancers |
EP2010569A4 (en) | 2006-03-20 | 2009-09-09 | Xoma Technology Ltd | FOR GASTRIN SPECIFIC HUMAN ANTIBODIES, MATERIALS AND METHODS |
WO2007123791A2 (en) | 2006-03-31 | 2007-11-01 | Dana-Farber Cancer Institute | Methods of determining cellular chemosensitivity |
US11046784B2 (en) | 2006-03-31 | 2021-06-29 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Methods for controlling blood pharmacokinetics of antibodies |
EP4218801A3 (en) | 2006-03-31 | 2023-08-23 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antibody modification method for purifying bispecific antibody |
KR20090029184A (ko) | 2006-04-07 | 2009-03-20 | 더 가브먼트 오브 더 유나이티드 스테이츠 오브 아메리카, 리프리젠티드 바이 더 세크러테리, 디파트먼트 오브 헬쓰 앤드 휴먼 서비씨즈 | 항체 조성물 및 신생물성 질병의 치료 방법 |
JP5754875B2 (ja) | 2006-04-07 | 2015-07-29 | 国立大学法人大阪大学 | 筋再生促進剤 |
TW200813091A (en) | 2006-04-10 | 2008-03-16 | Amgen Fremont Inc | Targeted binding agents directed to uPAR and uses thereof |
TW200813231A (en) | 2006-04-13 | 2008-03-16 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Methods of treating, diagnosing or detecting cancer |
US20100080794A1 (en) | 2006-04-14 | 2010-04-01 | Takashi Tsuji | Mutant polypeptide having effector function |
US8293245B2 (en) | 2006-04-20 | 2012-10-23 | The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. | Methods and compositions based on Shiga toxin type 1 protein |
WO2007129457A1 (ja) | 2006-04-25 | 2007-11-15 | The University Of Tokyo | アルツハイマー病および癌の治療薬 |
CN103272232B (zh) | 2006-06-08 | 2018-07-24 | 中外制药株式会社 | 炎性疾病的预防或治疗药 |
US20100040600A1 (en) | 2006-06-14 | 2010-02-18 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Agents for Promoting the Growth of Hematopoietic Stem Cells |
WO2007150069A2 (en) | 2006-06-23 | 2007-12-27 | Myriad Genetics, Inc. | Dpyd gene variants and use thereof |
JPWO2008007755A1 (ja) | 2006-07-13 | 2009-12-10 | 中外製薬株式会社 | 細胞死誘導剤 |
EP2574625B1 (en) | 2006-07-21 | 2015-02-25 | HuBit genomix, Inc. | Remedy for renal disease |
CL2007002225A1 (es) | 2006-08-03 | 2008-04-18 | Astrazeneca Ab | Agente de union especifico para un receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (pdgfr-alfa); molecula de acido nucleico que lo codifica; vector y celula huesped que la comprenden; conjugado que comprende al agente; y uso del agente de un |
MX2009001293A (es) | 2006-08-03 | 2009-02-11 | Astrazeneca Ab | Anticuerpos dirigidos a (v(6 y usos de los mismos. |
EP2054444B1 (en) | 2006-08-04 | 2016-11-02 | MedImmune Limited | Antibodies to erbb2 |
JP5406027B2 (ja) | 2006-08-04 | 2014-02-05 | ノバルティス アーゲー | EphB3特異的抗体およびその使用 |
EP3111955B1 (en) | 2006-08-14 | 2019-01-23 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Diagnosis and treatment of cancer using anti-desmoglein-3 antibody |
KR101433544B1 (ko) | 2006-08-18 | 2014-08-27 | 노바르티스 아게 | Prlr 특이적 항체 및 그 용도 |
US20090053210A1 (en) | 2006-09-01 | 2009-02-26 | Roland Buelow | Enhanced expression of human or humanized immunoglobulin in non-human transgenic animals |
CN102719444B (zh) | 2006-09-01 | 2016-12-14 | 人类多细胞株治疗学公司 | 人或人源化免疫球蛋白在非人转基因动物中增强的表达 |
KR101544108B1 (ko) | 2006-09-08 | 2015-08-13 | 애브비 바하마스 리미티드 | 인터루킨-13 결합 단백질 |
EP2083017A4 (en) | 2006-09-14 | 2011-01-12 | Med & Biological Lab Co Ltd | ANTIBODIES HAVING INCREASED ADCC ACTIVITY AND METHOD FOR PRODUCING THE SAME |
MX2009003393A (es) | 2006-10-02 | 2009-05-11 | Regeneron Pharma | Anticuerpos humanos de alta afinidad para el receptor de il-4 humano. |
US7608693B2 (en) | 2006-10-02 | 2009-10-27 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | High affinity human antibodies to human IL-4 receptor |
CA2664567C (en) | 2006-10-04 | 2016-04-26 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Tumor immunity |
CA2665528C (en) | 2006-10-12 | 2018-01-23 | The University Of Tokyo | Diagnosis and treatment of cancer using anti-ereg antibody |
EP2093237B1 (en) | 2006-10-20 | 2015-12-30 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Anti-cancer agent comprising anti-hb-egf antibody as active ingredient |
JP5378795B2 (ja) | 2006-10-20 | 2013-12-25 | 中外製薬株式会社 | 抗hb−egf抗体を有効成分として含む医薬組成物 |
JP5570218B2 (ja) | 2006-11-03 | 2014-08-13 | ユースリー ファーマ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | Fgfr4抗体 |
US8455626B2 (en) | 2006-11-30 | 2013-06-04 | Abbott Laboratories | Aβ conformer selective anti-aβ globulomer monoclonal antibodies |
AU2007329307B2 (en) | 2006-12-07 | 2012-08-02 | Novartis Ag | Antagonist antibodies against EphB3 |
RU2448979C2 (ru) | 2006-12-14 | 2012-04-27 | Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. | Антитела человека к дельта-подобному лиганду-4 человека |
CA2672581A1 (en) | 2006-12-14 | 2008-06-19 | Forerunner Pharma Research Co., Ltd. | Anti-claudin 3 monoclonal antibody and treatment and diagnosis of cancer using the same |
EP2094306A2 (en) | 2006-12-20 | 2009-09-02 | XOMA Technology Ltd. | Treatment of il-1-beta related diseases |
US20100111851A1 (en) | 2007-01-05 | 2010-05-06 | The University Of Tokyo | Diagnosis and treatment of cancer by using anti-prg-3 antibody |
PT2099826E (pt) | 2007-01-05 | 2014-01-09 | Univ Zuerich | Anticorpo anti-beta-amilóide e suas utilizações |
US7776331B1 (en) | 2007-01-16 | 2010-08-17 | Abbott Laboratories | Methods of treating plaque psoriasis |
TWI438208B (zh) | 2007-01-23 | 2014-05-21 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | 抑制慢性排斥反應之藥劑 |
EP2119777A4 (en) | 2007-02-09 | 2011-05-25 | Eisai R&D Man Co Ltd | GABA NEURONS TEMPLATE MARKER 65B13 |
US20100216977A1 (en) | 2007-02-15 | 2010-08-26 | Kyushu University, National University Corporation | Therapeutic agent for interstitial pulmonary disease comprising anti-hmgb-1 antibody |
CN101951953A (zh) | 2007-02-27 | 2011-01-19 | 株式会社未来创药研究所 | 含抗grp78抗体作为有效成分的药物组合物 |
EP2124952A2 (en) | 2007-02-27 | 2009-12-02 | Abbott GmbH & Co. KG | Method for the treatment of amyloidoses |
CL2008000719A1 (es) | 2007-03-12 | 2008-09-05 | Univ Tokushima Chugai Seiyaku | Agente terapeutico para cancer resistente a agentes quimioterapeuticos que comprende un anticuerpo que reconoce hla de clase i como ingrediente activo; composicion farmaceutica que comprende dicho anticuerpo; y metodo para tratar cancer resistente a |
CA2680914C (en) | 2007-03-13 | 2019-06-18 | University Of Zurich | Monoclonal human tumor-specific antibody |
EP2125898B1 (en) | 2007-03-14 | 2013-05-15 | Novartis AG | Apcdd1 inhibitors for treating, diagnosing or detecting cancer |
BRPI0809042B1 (pt) | 2007-03-22 | 2021-08-31 | Biogen Ma Inc. | Proteína de ligação a cd154 isolada, seu uso, e composição |
CA2682927A1 (en) | 2007-04-02 | 2008-10-16 | Amgen Fremont Inc. | Anti-ige antibodies |
JP5117765B2 (ja) | 2007-05-28 | 2013-01-16 | 国立大学法人 東京大学 | 抗robo1抗体を含むpet用腫瘍診断剤 |
LT2602323T (lt) | 2007-06-01 | 2018-04-10 | Open Monoclonal Technology, Inc. | Kompozicijos ir būdai endogeninių imunoglobulinų genams slopinti ir transgeniniams žmogaus idiotipo antikūnams gaminti |
WO2009001840A1 (ja) | 2007-06-25 | 2008-12-31 | Forerunner Pharma Research Co., Ltd. | ADCC活性又はCDC活性を有する抗Prominin-1抗体 |
JP5354680B2 (ja) | 2007-07-10 | 2013-11-27 | 塩野義製薬株式会社 | Mmp13に対する中和活性を有するモノクローナル抗体 |
WO2009014263A1 (ja) | 2007-07-26 | 2009-01-29 | Osaka University | インターロイキン6受容体阻害剤を有効成分とする眼炎症疾患治療剤 |
MX2010001307A (es) | 2007-08-02 | 2010-07-30 | Novimmune Sa | Anticuerpos anti-proteína regulada con la activación, expresada y secretada por los linfocitos t normales y metodos de uso de los mismos. |
SG183698A1 (en) | 2007-08-20 | 2012-09-27 | Oncotherapy Science Inc | Cdca1 peptide and pharmaceutical agent comprising the same |
JP5555952B2 (ja) | 2007-08-20 | 2014-07-23 | オンコセラピー・サイエンス株式会社 | Foxm1ペプチドおよびこれを含む薬剤 |
ES2632123T3 (es) | 2007-08-20 | 2017-09-11 | Oncotherapy Science, Inc. | Péptido CDH3 y agente medicinal que comprende el mismo |
SI2188313T1 (en) | 2007-08-21 | 2018-04-30 | Amgen, Inc. | HUMAN C-FMS ANTIGEN TRANSFER PROTEIN |
JOP20080381B1 (ar) | 2007-08-23 | 2023-03-28 | Amgen Inc | بروتينات مرتبطة بمولدات مضادات تتفاعل مع بروبروتين كونفيرتاز سيتيليزين ككسين من النوع 9 (pcsk9) |
EP2615114B1 (en) | 2007-08-23 | 2022-04-06 | Amgen Inc. | Antigen binding proteins to proprotein convertase subtilisin kexin type 9 (PCSK9) |
EP2527369A3 (en) | 2007-09-13 | 2012-12-19 | University Of Zurich Prorektorat Forschung | Monoclonal amyloid beta (abeta)-specific antibody and uses thereof |
TW200918553A (en) | 2007-09-18 | 2009-05-01 | Amgen Inc | Human GM-CSF antigen binding proteins |
EP2497783A3 (en) | 2007-09-26 | 2013-04-17 | U3 Pharma GmbH | Heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor antigen binding proteins |
SI2202245T1 (sl) | 2007-09-26 | 2016-10-28 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Postopek modificiranja izoelektrične točke protitelesa preko aminokislinske substitucije v CDR |
AR066172A1 (es) | 2007-09-28 | 2009-07-29 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Metodo para la preparacion de un anticuerpo antiglipicano 3 con modulada cinetica plasmatica mediante variacion de la semivida plasmatica. |
CN101815532B (zh) | 2007-10-02 | 2012-08-15 | 中外制药株式会社 | 以白细胞介素6受体抑制剂为有效成分的移植物抗宿主病治疗剂 |
KR101558009B1 (ko) | 2007-10-15 | 2015-10-19 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | 항체의 제조 방법 |
KR20100115340A (ko) | 2007-10-19 | 2010-10-27 | 이무나스 파마 가부시키가이샤 | Aβ 올리고머에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 이용 |
EP2230300A4 (en) | 2007-10-24 | 2012-08-08 | Otsuka Chemical Holdings Co Ltd | POLYPEPTIDE WITH IMPROVED EFFECTOR FUNCTION |
PE20091163A1 (es) | 2007-11-01 | 2009-08-09 | Wyeth Corp | Anticuerpos para gdf8 |
DK2220121T3 (en) | 2007-11-12 | 2015-12-07 | U3 Pharma Gmbh | AXL antibodies |
WO2009063970A1 (ja) | 2007-11-14 | 2009-05-22 | Forerunner Pharma Research Co., Ltd. | 抗gpr49抗体を用いる癌の診断および治療 |
SG188134A1 (en) | 2007-11-15 | 2013-03-28 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Monoclonal antibody capable of binding to anexelekto, and use thereof |
CA2705923A1 (en) | 2007-11-16 | 2009-05-22 | Nuvelo, Inc. | Antibodies to lrp6 |
KR101643005B1 (ko) | 2007-12-05 | 2016-07-28 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | 항nr10 항체 및 그의 이용 |
EP2241332A4 (en) | 2007-12-05 | 2011-01-26 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | THERAPEUTIC AGENT AGAINST PRITURE |
EP3524619A1 (en) | 2007-12-06 | 2019-08-14 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Antibodies against influenza virus and methods of use thereof |
US20110262425A1 (en) | 2007-12-12 | 2011-10-27 | National Cancer Center | Therapeutic agent for mll leukemia and moz leukemia of which molecular target is m-csf receptor, and use thereof |
CN101945891A (zh) | 2007-12-20 | 2011-01-12 | 爱克索马技术有限公司 | 治疗痛风的方法 |
EP2261254A3 (en) | 2007-12-21 | 2011-04-13 | Amgen, Inc | Anti-amyloid antibodies and uses thereof |
PE20091174A1 (es) | 2007-12-27 | 2009-08-03 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Formulacion liquida con contenido de alta concentracion de anticuerpo |
WO2009086514A1 (en) | 2007-12-28 | 2009-07-09 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Humanized monoclonal antibodies and methods of use |
SG187457A1 (en) | 2008-01-11 | 2013-02-28 | Univ Tokyo | Anti-cldn6 antibody |
WO2009094551A1 (en) | 2008-01-25 | 2009-07-30 | Amgen Inc. | Ferroportin antibodies and methods of use |
PL2246427T3 (pl) | 2008-02-08 | 2017-06-30 | Immunas Pharma, Inc. | Przeciwciała zdolne do wiązania się swoiście do oligomerów amyloidu beta i ich stosowanie |
JO2913B1 (en) | 2008-02-20 | 2015-09-15 | امجين إنك, | Antibodies directed towards angiopoietin-1 and angiopoietin-2 proteins and their uses |
US8962803B2 (en) | 2008-02-29 | 2015-02-24 | AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG | Antibodies against the RGM A protein and uses thereof |
RU2497545C2 (ru) | 2008-03-18 | 2013-11-10 | Эбботт Лэборетриз | Способ лечения псориаза (варианты) |
CL2009000647A1 (es) | 2008-04-04 | 2010-06-04 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Composicion farmaceutica para tratar o prevenir cancer hepatico que comprende una combinacion de un agente quimioterapeutico y un anticuerpo anti-glipicano 3; agente para atenuar un efecto secundario que comprende dicho anticuerpo; metodo para tratar o prevenir un cancer hepatico de un sujeto. |
PL2275443T3 (pl) | 2008-04-11 | 2016-05-31 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Cząsteczka wiążąca antygen zdolna do wiązania dwóch lub więcej cząsteczek antygenu w sposób powtarzalny |
KR20110014607A (ko) | 2008-04-29 | 2011-02-11 | 아보트 러보러터리즈 | 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도 |
JP2011519279A (ja) | 2008-05-01 | 2011-07-07 | アムジエン・インコーポレーテツド | 抗ヘプシジン抗体及び使用の方法 |
WO2009136382A2 (en) | 2008-05-09 | 2009-11-12 | Abbott Gmbh & Co. Kg | Antibodies to receptor of advanced glycation end products (rage) and uses thereof |
WO2009147781A1 (ja) | 2008-06-02 | 2009-12-10 | 国立大学法人東京大学 | 抗がん剤 |
MX2010013239A (es) | 2008-06-03 | 2011-02-24 | Abbott Lab | Inmunoglobulinas de dominio variable doble y usos de las mismas. |
UY31861A (es) | 2008-06-03 | 2010-01-05 | Abbott Lab | Inmunoglobulina con dominio variable dual y usos de la misma |
JOP20190083A1 (ar) | 2008-06-04 | 2017-06-16 | Amgen Inc | بولي ببتيدات اندماجية طافرة لـfgf21 واستخداماتها |
CN104906581A (zh) | 2008-06-05 | 2015-09-16 | 国立研究开发法人国立癌症研究中心 | 神经浸润抑制剂 |
WO2009154025A1 (ja) | 2008-06-20 | 2009-12-23 | 国立大学法人岡山大学 | 酸化LDL/β2GPI複合体に対する抗体及びその用途 |
RU2559525C2 (ru) | 2008-07-08 | 2015-08-10 | Эббви Инк | Белки, связывающие простагландин е2, и их применение |
MX2010014574A (es) | 2008-07-08 | 2011-04-27 | Abbott Lab | Inmunoglobulinas de dominio variable dual para prostaglandina e2 y usos de las mismas. |
SG10201701323TA (en) | 2008-08-18 | 2017-04-27 | Amgen Fremont Inc | Antibodies to ccr2 |
CA2736799A1 (en) | 2008-08-25 | 2010-03-11 | Burnham Institute For Medical Research | Conserved hemagglutinin epitope, antibodies to the epitope, and methods of use |
CN102264763B (zh) | 2008-09-19 | 2016-04-27 | 米迪缪尼有限公司 | 定向于dll4的抗体及其用途 |
PL2346994T3 (pl) | 2008-09-30 | 2022-04-19 | Ablexis, Llc | Myszy knock-in do wytwarzania chimerycznych przeciwciał |
KR20140101876A (ko) | 2008-10-09 | 2014-08-20 | 미네르바 바이오테크놀로지 코포레이션 | 세포내에서 다능성을 유도하기 위한 방법 |
PE20120021A1 (es) | 2008-10-10 | 2012-02-10 | Amgen Inc | Mutantes fgf21 |
ES2548377T3 (es) | 2008-10-27 | 2015-10-16 | Revivicor, Inc. | Ungulados inmunodeprimidos |
DK2894165T3 (da) | 2008-11-10 | 2023-03-20 | Alexion Pharma Inc | Fremgangsmåder og sammensætninger til behandling af komplementforbundne forstyrrelser |
AU2009328505B2 (en) | 2008-12-19 | 2014-11-27 | Panima Pharmaceuticals Ag | Human anti-alpha-synuclein autoantibodies |
JP5756292B2 (ja) | 2008-12-22 | 2015-07-29 | 中外製薬株式会社 | 抗hs6st2抗体及びその用途 |
WO2010073972A1 (ja) | 2008-12-22 | 2010-07-01 | エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 | Neph3を用いた膵臓前駆細胞の取得方法 |
JP2012513194A (ja) | 2008-12-23 | 2012-06-14 | アストラゼネカ アクチボラグ | α5β1に向けられた標的結合剤およびその使用 |
JO3382B1 (ar) | 2008-12-23 | 2019-03-13 | Amgen Inc | أجسام مضادة ترتبط مع مستقبل cgrp بشري |
EP2385114A4 (en) | 2008-12-25 | 2012-08-08 | Univ Tokyo | CANCER TREATMENT DIAGNOSIS WITH ANTI-TM4SF20 ANTIBODY |
KR20110099762A (ko) | 2008-12-26 | 2011-09-08 | 고쿠리츠다이가쿠호우진 도쿄다이가쿠 | 항lgr7항체를 사용하는 암의 진단 및 치료 |
US8309530B2 (en) | 2009-02-04 | 2012-11-13 | Washington State University | Compositions and methods for modulating ghrelin-mediated conditions |
NZ611324A (en) | 2009-03-05 | 2015-02-27 | Abbvie Inc | Il-17 binding proteins |
JP2010210772A (ja) | 2009-03-13 | 2010-09-24 | Dainippon Screen Mfg Co Ltd | 液晶表示装置の製造方法 |
CA2889453C (en) | 2009-03-20 | 2018-11-06 | Amgen Inc. | Carrier immunoglobulins and uses thereof |
US9079957B2 (en) | 2009-04-16 | 2015-07-14 | The University Of Tokyo | Diagnosis and treatment of cancer using anti-TMPRSS11E antibody |
DK2419447T3 (en) | 2009-04-17 | 2017-09-25 | Immunas Pharma Inc | ANTIBODIES THAT SPECIFICALLY BIND TO A BETA OLIGOMER AND USE THEREOF |
AU2010242338B2 (en) | 2009-05-01 | 2013-12-19 | Perseus Proteomics Inc. | Anti-cadherin antibody |
MX2011011815A (es) | 2009-05-05 | 2012-01-27 | Amgen Inc | Mutantes fgf21 y usos de los mismos. |
CN107188950B (zh) | 2009-05-05 | 2021-09-28 | 安姆根有限公司 | Fgf21突变体及其用途 |
MX2011011729A (es) | 2009-05-05 | 2012-04-10 | Novimmune Sa | Anticuerpo anti il-17f y metodos de uso de los mismos. |
EP2436397B1 (en) | 2009-05-29 | 2017-05-10 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Pharmaceutical composition containing antagonist of egf family ligand as component |
US9445581B2 (en) | 2012-03-28 | 2016-09-20 | Kymab Limited | Animal models and therapeutic molecules |
HUE055817T2 (hu) | 2009-07-08 | 2021-12-28 | Kymab Ltd | Állatmodellek és terápiás molekulák |
EP2287336A1 (fr) | 2009-07-31 | 2011-02-23 | Exhonit Therapeutics SA | Procédés et méthodes de diagnostic de la maladie d'Alzheimer |
WO2011013786A1 (ja) | 2009-07-31 | 2011-02-03 | Maeda Shin | 癌の転移抑制剤 |
EP2462451B1 (en) | 2009-08-05 | 2016-02-17 | Nexigen GmbH | Human hcv-interacting proteins and methods of use |
ES2614949T3 (es) | 2009-08-06 | 2017-06-02 | Immunas Pharma, Inc. | Anticuerpos que se unen específicamente a oligómeros beta A y uso de los mismos |
DK2462161T3 (en) | 2009-08-06 | 2017-06-06 | Immunas Pharma Inc | Antibodies specifically binding to A-beta oligomers and their use |
CA2771436A1 (en) | 2009-08-17 | 2011-02-24 | Forerunner Pharma Research Co., Ltd. | Pharmaceutical composition comprising anti-hb-egf antibody as active ingredient |
WO2011024114A1 (en) | 2009-08-25 | 2011-03-03 | Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) | Targeting extracellular matrix molecules for the treatment of cancer |
US8313747B2 (en) * | 2009-08-28 | 2012-11-20 | Vlst Corporation | Antikine antibodies that bind to multiple CC chemokines |
PE20121647A1 (es) | 2009-08-29 | 2012-12-31 | Abbvie Inc | Proteinas terapeuticas de union a dll4 |
UY32870A (es) | 2009-09-01 | 2011-02-28 | Abbott Lab | Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas |
MX2012003138A (es) | 2009-09-14 | 2012-07-04 | Abbott Lab Y Abbott Gmbh & Co Kg | Metodos para tratar la psoriasis. |
TW201118166A (en) | 2009-09-24 | 2011-06-01 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | HLA class I-recognizing antibodies |
US8926976B2 (en) | 2009-09-25 | 2015-01-06 | Xoma Technology Ltd. | Modulators |
AU2010298036B2 (en) | 2009-09-25 | 2015-05-21 | Xoma Technology Ltd. | Screening methods |
EP2305285A1 (en) | 2009-09-29 | 2011-04-06 | Julius-Maximilians-Universität Würzburg | Means and methods for treating ischemic conditions |
RU2012119756A (ru) | 2009-10-15 | 2013-11-20 | Эбботт Лэборетриз | Иммуноглобулины с двумя вариабельными доменами и их применение |
JO3244B1 (ar) | 2009-10-26 | 2018-03-08 | Amgen Inc | بروتينات ربط مستضادات il – 23 البشرية |
UY32979A (es) | 2009-10-28 | 2011-02-28 | Abbott Lab | Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas |
TW201121568A (en) | 2009-10-31 | 2011-07-01 | Abbott Lab | Antibodies to receptor for advanced glycation end products (RAGE) and uses thereof |
EP2496604B1 (en) | 2009-11-06 | 2017-08-23 | IDEXX Laboratories, Inc. | Canine anti-cd20 antibodies |
GB0919751D0 (en) | 2009-11-11 | 2009-12-30 | King S College Hospital Nhs Fo | Conjugate molecule |
JP5931736B2 (ja) | 2009-11-13 | 2016-06-08 | ウー3・フアルマ・ゲー・エム・ベー・ハーU3 Pharma | Her−3関連疾患を治療または予防するための物質および方法 |
AU2010321832B2 (en) | 2009-11-20 | 2014-08-14 | Amgen Inc. | Anti-Orai1 antigen binding proteins and uses thereof |
CA2992770A1 (en) | 2009-11-24 | 2011-06-03 | Medimmune Limited | Targeted binding agents against b7-h1 |
US9420770B2 (en) | 2009-12-01 | 2016-08-23 | Indiana University Research & Technology Corporation | Methods of modulating thrombocytopenia and modified transgenic pigs |
UA109888C2 (uk) | 2009-12-07 | 2015-10-26 | ІЗОЛЬОВАНЕ АНТИТІЛО АБО ЙОГО ФРАГМЕНТ, ЩО ЗВ'ЯЗУЄТЬСЯ З β-КЛОТО, РЕЦЕПТОРАМИ FGF І ЇХНІМИ КОМПЛЕКСАМИ | |
WO2011070045A1 (en) | 2009-12-08 | 2011-06-16 | Abbott Gmbh & Co. Kg | Monoclonal antibodies against the rgm a protein for use in the treatment of retinal nerve fiber layer degeneration |
CA2786692A1 (en) | 2010-01-11 | 2011-07-14 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Biomarkers of immunomodulatory effects in humans treated with anti-cd200 antibodies |
AR080428A1 (es) | 2010-01-20 | 2012-04-11 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Formulaciones liquidas estabilizadas contentivas de anticuerpos |
JP5104996B2 (ja) | 2010-01-29 | 2012-12-19 | 東レ株式会社 | ポリ乳酸系樹脂シート |
JP5918540B2 (ja) | 2010-01-29 | 2016-05-18 | 中外製薬株式会社 | 抗dll3抗体 |
US9796788B2 (en) | 2010-02-08 | 2017-10-24 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Mice expressing a limited immunoglobulin light chain repertoire |
US20130045492A1 (en) | 2010-02-08 | 2013-02-21 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods For Making Fully Human Bispecific Antibodies Using A Common Light Chain |
NZ719253A (en) | 2010-02-08 | 2022-08-26 | Regeneron Pharma | Common light chain mouse |
CA2789310C (en) | 2010-02-10 | 2018-01-09 | Fujifilm Ri Pharma Co., Ltd. | Radioactive metal-labeled anti-cadherin antibody |
WO2011103426A2 (en) | 2010-02-19 | 2011-08-25 | The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma | Monoclonal antibodies that inhibit the wnt signaling pathway and methods of production and use thereof |
US20120321557A1 (en) | 2010-02-26 | 2012-12-20 | Forerunner Pharma Research Co., Ltd. | Anti-icam3 antibody and use thereof |
WO2011109298A2 (en) | 2010-03-02 | 2011-09-09 | Abbott Laboratories | Therapeutic dll4 binding proteins |
WO2011108714A1 (ja) | 2010-03-04 | 2011-09-09 | 中外製薬株式会社 | 抗体定常領域改変体 |
TWI667257B (zh) | 2010-03-30 | 2019-08-01 | 中外製藥股份有限公司 | 促進抗原消失之具有經修飾的FcRn親和力之抗體 |
CA3006800C (en) | 2010-03-31 | 2022-10-04 | Ablexis, Llc | Genetic engineering of non-human animals for the production of chimeric antibodies |
CA2796055A1 (en) | 2010-04-15 | 2011-10-20 | Amgen Inc. | Human fgf receptor and .beta.-klotho binding proteins |
US8987419B2 (en) | 2010-04-15 | 2015-03-24 | AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG | Amyloid-beta binding proteins |
SI2563813T1 (sl) | 2010-04-30 | 2015-12-31 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Protitelesa anti-C5A in postopki uporabe protiteles |
UY33386A (es) | 2010-05-14 | 2011-12-30 | Abbott Laboratoires | Proteínas de unión a il-1 |
JP6051049B2 (ja) | 2010-05-28 | 2016-12-21 | 中外製薬株式会社 | 抗腫瘍t細胞応答増強剤 |
JP5904552B2 (ja) | 2010-05-28 | 2016-04-13 | 国立研究開発法人国立がん研究センター | 膵癌治療剤 |
CA2800531C (en) | 2010-06-02 | 2021-05-25 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Humanized monoclonal antibodies and methods of use |
CA2803588A1 (en) | 2010-06-22 | 2011-12-29 | The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate | Antibodies to the c3d fragment of complement component 3 |
WO2012006500A2 (en) | 2010-07-08 | 2012-01-12 | Abbott Laboratories | Monoclonal antibodies against hepatitis c virus core protein |
UY33492A (es) | 2010-07-09 | 2012-01-31 | Abbott Lab | Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas |
TW201206473A (en) | 2010-08-03 | 2012-02-16 | Abbott Lab | Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof |
US20120156130A1 (en) | 2010-08-06 | 2012-06-21 | Thore Hettmann | Use of her3 binding agents in prostate treatment |
MX2013001632A (es) | 2010-08-10 | 2013-06-05 | Amgen Inc | Ensayo de enlace objetivo in vitro de funcion doble para la deteccion de anticuerpos neutralizantes contra anticuerpos objetivo. |
MX358739B (es) | 2010-08-14 | 2018-09-03 | Abbvie Inc Star | Proteinas de union a amiloide beta. |
SI3333188T1 (sl) | 2010-08-19 | 2022-04-29 | Zoetis Belgium S.A. | Protitelesa proti NGF in njihova uporaba |
JP2013539364A (ja) | 2010-08-26 | 2013-10-24 | アッヴィ・インコーポレイテッド | 二重可変ドメイン免疫グロブリンおよびその使用 |
EP2609431B1 (en) | 2010-08-27 | 2017-05-10 | University of Zurich | Method for target and drug validation in inflammatory and/or cardiovascular diseases |
WO2012028697A1 (en) | 2010-09-01 | 2012-03-08 | Eth Zürich, Institute Of Molecular Biology And Biophysics | Affinity purification system based on donor strand complementation |
MY188828A (en) | 2010-09-17 | 2022-01-06 | Takeda Pharmaceuticals Co | Stabilization of immunoglobulins through aqueous formulation with histidine at weak acidic to neutral ph |
CA2814780C (en) | 2010-09-22 | 2017-05-16 | Amgen Inc. | Carrier immunoglobulins and uses thereof |
EP2627672B1 (en) | 2010-10-11 | 2018-08-01 | Biogen Idec International Neuroscience GmbH | Human anti-tau antibodies |
EP2632481A1 (en) | 2010-10-25 | 2013-09-04 | Regents Of The University Of Minnesota | Therapeutic composition for treatment of glioblastoma |
MX354481B (es) | 2010-10-27 | 2018-03-07 | Amgen Inc | Anticuerpos dkk1 y métodos de uso. |
EP3404043B1 (en) | 2010-10-29 | 2022-10-26 | Perseus Proteomics Inc. | Anti-cdh3 antibody having high internalization capacity |
KR101398363B1 (ko) | 2010-11-17 | 2014-05-22 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | 혈액응고 제viii 인자의 기능을 대체하는 기능을 갖는 다중특이성 항원 결합 분자 |
PL2647707T3 (pl) | 2010-11-30 | 2019-02-28 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Środek terapeutyczny wywołujący cytotoksyczność |
MX365235B (es) | 2010-11-30 | 2019-05-28 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Molécula de unión a antígeno capaz de unir repetidamente a la pluralidad de moléculas de antígeno. |
CN103380145B (zh) | 2010-12-17 | 2016-10-12 | 生物控股有限公司 | 人类抗-sod1抗体 |
CN103874503A (zh) | 2010-12-21 | 2014-06-18 | 瑟莱克斯制药公司 | 抗p-选择素抗体及其使用和鉴定方法 |
JP6009455B2 (ja) | 2010-12-21 | 2016-10-19 | アッヴィ・インコーポレイテッド | Il−1アルファおよびベータ二重特異的二重可変ドメイン免疫グロブリンおよびその使用 |
WO2012088094A2 (en) | 2010-12-21 | 2012-06-28 | Abbott Laboratories | Il-1 binding proteins |
WO2012092376A2 (en) | 2010-12-31 | 2012-07-05 | Short Jay M | Comprehensive monoclonal antibody generation |
US20120185956A1 (en) | 2011-01-18 | 2012-07-19 | Gingras Jacinthe | Global nav1.7 knockout mice and uses |
WO2012102679A1 (en) | 2011-01-24 | 2012-08-02 | National University Of Singapore | Pathogenic mycobacteria-derived mannose-capped lipoarabinomannan antigen binding proteins |
US9447187B2 (en) | 2011-02-03 | 2016-09-20 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Use of an anti-CD200 antibody for prolonging the survival of allografts |
WO2012104824A1 (en) | 2011-02-04 | 2012-08-09 | Ecole polytechnique fédérale de Lausanne (EPFL) | Therapeutic antibodies targeting app-c99 |
US20140044644A1 (en) | 2011-02-21 | 2014-02-13 | University Of Zurich | Ankyrin g and modulators thereof for the treatment of neurodegenerative disorders |
EP2679681B2 (en) | 2011-02-25 | 2023-11-15 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | FcgammaRIIB-specific FC antibody |
CN103649118A (zh) | 2011-03-01 | 2014-03-19 | 安进公司 | 双特异性结合剂 |
EP4086338A1 (en) | 2011-03-17 | 2022-11-09 | Minerva Biotechnologies Corporation | Method for making pluripotent stem cells |
EP2500073A1 (en) | 2011-03-17 | 2012-09-19 | ChromaCon AG | Method for identification and purification of multi-specific polypeptides |
WO2012129520A1 (en) | 2011-03-24 | 2012-09-27 | Texas Tech University System | Tcr mimic antibodies as vascular targeting tools |
DK2698431T3 (da) | 2011-03-30 | 2020-11-30 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Opretholdelse af antigen-bindende molekyler i blodplasma og fremgangsmåde til modifikation af immunogenicitet |
KR20140027211A (ko) | 2011-04-04 | 2014-03-06 | 유니버시티 오브 아이오와 리써치 파운데이션 | 백신 면역원성의 개선 방법 |
CA2831957A1 (en) | 2011-04-07 | 2012-10-11 | Amgen Inc. | Novel egfr binding proteins |
WO2012142164A1 (en) | 2011-04-12 | 2012-10-18 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services | Human monoclonal antibodies that bind insulin-like growth factor (igf) i and ii |
US20140193420A1 (en) | 2011-04-18 | 2014-07-10 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Diagnosis and treatment of cancer using anti-itm2a antibody |
EP2702077A2 (en) | 2011-04-27 | 2014-03-05 | AbbVie Inc. | Methods for controlling the galactosylation profile of recombinantly-expressed proteins |
JOP20200043A1 (ar) | 2011-05-10 | 2017-06-16 | Amgen Inc | طرق معالجة أو منع الاضطرابات المختصة بالكوليسترول |
WO2012158818A2 (en) | 2011-05-16 | 2012-11-22 | Fabion Pharmaceuticals, Inc. | Multi-specific fab fusion proteins and methods of use |
EP2710037B1 (en) | 2011-05-19 | 2019-07-31 | The Regents of The University of Michigan | Integrin alpha-2 binding agents and use thereof to inhibit cancer cell proliferation |
EP2530088A1 (en) | 2011-05-30 | 2012-12-05 | Klinikum rechts der Isar der Technischen Universität München | Means and methods for diagnosing and treating multiple sclerosis |
MX351600B (es) | 2011-06-03 | 2017-10-20 | Xoma Technology Ltd | Anticuerpo especificos para tgf-beta. |
US9574002B2 (en) | 2011-06-06 | 2017-02-21 | Amgen Inc. | Human antigen binding proteins that bind to a complex comprising β-Klotho and an FGF receptor |
US20140227265A1 (en) | 2011-06-17 | 2014-08-14 | Amgen Inc. | Method of treating or ameliorating metabolic disorders using clec-2 |
TR201815563T4 (tr) | 2011-06-23 | 2018-11-21 | Biogen Int Neuroscience Gmbh | Anti-alfa sinüklein bağlayıcı moleküller. |
BR112013032630B1 (pt) | 2011-06-30 | 2022-06-14 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Polipeptídeo heterodimerizado compreendendo região fc de igg |
DE202011103324U1 (de) | 2011-07-12 | 2012-01-02 | Nekonal S.A.R.L. | Therapeutische anti-TIRC7 Antikörper für die Verwendung in Immun und anderen Krankheiten |
JP2014520847A (ja) | 2011-07-13 | 2014-08-25 | アッヴィ・インコーポレイテッド | 抗il−13抗体を使用して喘息を治療するための方法および組成物 |
JP6176849B2 (ja) | 2011-07-19 | 2017-08-09 | 中外製薬株式会社 | アルギニンアミドまたはその類似化合物を含む安定なタンパク質含有製剤 |
WO2013017656A1 (en) | 2011-08-02 | 2013-02-07 | Medizinische Universität Wien | Antagonists of ribonucleases for treating obesity |
EP2739652B1 (en) | 2011-08-04 | 2017-04-05 | Medizinische Universität Innsbruck | Cahgt1p inhibitors for use in the treatment of candidiasis |
SG2014007686A (en) | 2011-08-05 | 2014-03-28 | Regeneron Pharma | Humanized universal light chain mice |
EP2749572A4 (en) | 2011-08-23 | 2015-04-01 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | NEW ANTI-DDR1 ANTIBODY WITH ANTITUMORACTIVITY |
WO2013035824A1 (ja) | 2011-09-07 | 2013-03-14 | ファーマロジカルズ・リサーチ プライベート リミテッド | 癌幹細胞の分離 |
CN103945689B (zh) | 2011-09-19 | 2016-10-19 | 科马布有限公司 | 免疫球蛋白基因多样性的操纵及多抗体治疗剂 |
CA2791109C (en) | 2011-09-26 | 2021-02-16 | Merus B.V. | Generation of binding molecules |
WO2013045916A1 (en) | 2011-09-26 | 2013-04-04 | Kymab Limited | Chimaeric surrogate light chains (slc) comprising human vpreb |
KR102239138B1 (ko) | 2011-09-30 | 2021-04-12 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | 표적 항원에 대한 면역응답을 유도하는 항원 결합 분자 |
WO2013046722A1 (ja) | 2011-09-30 | 2013-04-04 | 中外製薬株式会社 | イオン濃度依存性結合分子ライブラリ |
SI2760471T1 (sl) | 2011-09-30 | 2017-04-26 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Terapevtski peptidi |
US20150050269A1 (en) | 2011-09-30 | 2015-02-19 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antigen-binding molecule promoting disappearance of antigens having plurality of biological activities |
KR102143331B1 (ko) | 2011-09-30 | 2020-08-11 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | 항원의 소실을 촉진시키는 항원 결합 분자 |
TW201817745A (zh) | 2011-09-30 | 2018-05-16 | 日商中外製藥股份有限公司 | 具有促進抗原清除之FcRn結合域的治療性抗原結合分子 |
EP2764118A1 (en) | 2011-10-05 | 2014-08-13 | University of Bremen | Wnt4 and med12 for use in the diagnosis and treatment of tumor diseases |
JP6271251B2 (ja) | 2011-10-05 | 2018-01-31 | 中外製薬株式会社 | 糖鎖受容体結合ドメインを含む抗原の血漿中からの消失を促進する抗原結合分子 |
AU2012326137B2 (en) | 2011-10-17 | 2018-11-29 | Minerva Biotechnologies Corporation | Media for stem cell proliferation and induction |
BR112014009536A2 (pt) | 2011-10-21 | 2017-04-18 | Augurex Life Sciences Corp | antígenos derivados de 14-3-3 xitrulinada e usos dos mesmos no diagnóstico de artrite reumatoide |
AU2012328921B2 (en) | 2011-10-24 | 2017-05-11 | Abbvie Inc. | Immunobinders directed against TNF |
EP2771360A1 (en) | 2011-10-24 | 2014-09-03 | AbbVie Inc. | Immunobinders directed against sclerostin |
EP3603671A3 (en) | 2011-10-28 | 2020-07-29 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Cancer stem cell-specific molecule |
RU2681885C2 (ru) | 2011-10-31 | 2019-03-13 | Чугаи Сейяку Кабусики Кайся | Антигенсвязывающая молекула с регулируемой конъюгацией между тяжелой цепью и легкой цепью |
CA2856149A1 (en) | 2011-11-08 | 2013-05-16 | Pfizer Inc. | Methods of treating inflammatory disorders using anti-m-csf antibodies |
PE20141937A1 (es) | 2011-11-16 | 2014-12-18 | Amgen Inc | Metodos para tratar trastornos relacionados con mutante viii de eliminacion de factor de crecimiento epidermico |
CN104080909A (zh) | 2011-11-30 | 2014-10-01 | 中外制药株式会社 | 包含进入细胞内以形成免疫复合体的搬运体(载体)的药物 |
US9253965B2 (en) | 2012-03-28 | 2016-02-09 | Kymab Limited | Animal models and therapeutic molecules |
CN104220460A (zh) | 2011-12-08 | 2014-12-17 | 安姆根有限公司 | 激动人lcat抗原结合蛋白和它们在疗法中的用途 |
EP2602621A1 (en) | 2011-12-08 | 2013-06-12 | Julius-Maximilians-Universität Würzburg | LASP-1, a novel urinary marker for transitional cell carcinoma detection |
CA2855840C (en) | 2011-12-14 | 2023-08-29 | AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG | Composition and method for the diagnosis and treatment of iron-related disorders |
MX356933B (es) | 2011-12-14 | 2018-06-20 | Abbvie Deutschland | Composicion y metodo para el diagnostico y tratamiento de trastornos relacionados con hierro. |
WO2013096516A1 (en) | 2011-12-19 | 2013-06-27 | Xoma Technology Ltd. | Methods for treating acne |
US20150030602A1 (en) | 2011-12-23 | 2015-01-29 | Phenoquest Ag | Antibodies for the treatment and diagnosis of affective and anxiety disorders |
TWI593705B (zh) | 2011-12-28 | 2017-08-01 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Humanized anti-epiregulin antibody and cancer therapeutic agent containing the antibody as an active ingredient |
SI2797952T1 (sl) | 2011-12-28 | 2019-07-31 | Immunoqure Ag | Postopek za pripravo monoklonskih avto-protiteles z želeno specifičnostjo |
MX2014008101A (es) | 2011-12-30 | 2014-09-25 | Abbvie Inc | Proteinas de union especificas duales dirigidas contra il-13 y/o il-17. |
NZ714482A (en) | 2012-01-27 | 2017-08-25 | Abbvie Inc | Composition and method for diagnosis and treatment of diseases associated with neurite degeneration |
EP2812443B1 (en) | 2012-02-06 | 2019-05-29 | Inhibrx, Inc. | Cd47 antibodies and methods of use thereof |
SG10201704849PA (en) | 2012-02-09 | 2017-07-28 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Modified fc region of antibody |
CA2864702A1 (en) | 2012-02-22 | 2013-08-29 | Amgen Inc. | Autologous mammalian models derived from induced pluripotent stem cells and related methods |
ES2795419T3 (es) | 2012-02-24 | 2020-11-23 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Molécula de unión al antígeno que promueve la desaparición del antígeno vía Fc RIIB |
NZ712508A (en) | 2012-03-16 | 2018-06-29 | Regeneron Pharma | Non-human animals expressing ph-sensitive immunoglobulin sequences |
RS57414B1 (sr) | 2012-03-16 | 2018-09-28 | Regeneron Pharma | Antitela sa lakim lancem konstruisanim sa histidinom i genetički modifikovani glodari za generisanje istih |
US20140013456A1 (en) | 2012-03-16 | 2014-01-09 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Histidine Engineered Light Chain Antibodies and Genetically Modified Non-Human Animals for Generating the Same |
CA2865644A1 (en) | 2012-03-16 | 2013-09-19 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Mice that produce antigen-binding proteins with ph-dependent binding characteristics |
US10251377B2 (en) | 2012-03-28 | 2019-04-09 | Kymab Limited | Transgenic non-human vertebrate for the expression of class-switched, fully human, antibodies |
GB2502127A (en) | 2012-05-17 | 2013-11-20 | Kymab Ltd | Multivalent antibodies and in vivo methods for their production |
US9751942B2 (en) | 2012-03-29 | 2017-09-05 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Anti-LAMP5 antibody and utilization thereof |
HUE037613T2 (hu) | 2012-03-29 | 2018-09-28 | Novimmune Sa | Anti-TLR4 antitestek és azok felhasználása |
CN103382223B (zh) | 2012-04-01 | 2015-06-10 | 上海益杰生物技术有限公司 | 针对表皮生长因子受体隐蔽表位和t细胞抗原的多功能抗体多肽 |
WO2013150623A1 (ja) | 2012-04-04 | 2013-10-10 | 株式会社ペルセウスプロテオミクス | 抗cdh3(p-カドヘリン)抗体の薬剤コンジュゲート |
EP2836514A4 (en) | 2012-04-13 | 2015-12-30 | Childrens Medical Center | TIKI INHIBITORS |
US9067990B2 (en) | 2013-03-14 | 2015-06-30 | Abbvie, Inc. | Protein purification using displacement chromatography |
US9150645B2 (en) | 2012-04-20 | 2015-10-06 | Abbvie, Inc. | Cell culture methods to reduce acidic species |
WO2013158273A1 (en) | 2012-04-20 | 2013-10-24 | Abbvie Inc. | Methods to modulate c-terminal lysine variant distribution |
SI2838918T1 (sl) | 2012-04-20 | 2019-11-29 | Merus Nv | Postopki in sredstva za proizvodnjo heterodimernih IG-podobnih molekul |
SI3431492T1 (sl) | 2012-04-27 | 2021-07-30 | Novo Nordisk A/S | Antigen-vezavni proteini liganda človeškega CD30 |
EA039663B1 (ru) | 2012-05-03 | 2022-02-24 | Амген Инк. | Применение антитела против pcsk9 для снижения сывороточного холестерина лпнп и лечения связанных с холестерином расстройств |
EP3511343A1 (en) | 2012-05-04 | 2019-07-17 | Dana Farber Cancer Institute, Inc. | Affinity matured anti-ccr4 humanized monoclonal antibodies and methods of use |
US9249182B2 (en) | 2012-05-24 | 2016-02-02 | Abbvie, Inc. | Purification of antibodies using hydrophobic interaction chromatography |
ES2856272T3 (es) | 2012-05-30 | 2021-09-27 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Molécula de unión a antígenos para eliminar antígenos agregados |
JPWO2013180200A1 (ja) | 2012-05-30 | 2016-01-21 | 中外製薬株式会社 | 標的組織特異的抗原結合分子 |
AR092325A1 (es) | 2012-05-31 | 2015-04-15 | Regeneron Pharma | Formulaciones estabilizadas que contienen anticuerpos anti-dll4 y kit |
CA2875783C (en) | 2012-06-06 | 2018-12-11 | Zoetis Llc | Caninized anti-ngf antibodies and methods thereof |
EP4310191A3 (en) | 2012-06-14 | 2024-05-15 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antigen-binding molecule containing modified fc region |
US9127053B2 (en) | 2012-06-22 | 2015-09-08 | Cytomx Therapeutics, Inc. | Anti-jagged 1/jagged 2 cross-reactive antibodies, activatable anti-jagged antibodies and methods of use thereof |
WO2014007402A1 (ja) | 2012-07-06 | 2014-01-09 | 京都府公立大学法人 | 眼細胞の分化マーカーおよび分化制御 |
AR091755A1 (es) | 2012-07-12 | 2015-02-25 | Abbvie Inc | Proteinas de union a il-1 |
JP6774164B2 (ja) | 2012-08-24 | 2020-10-21 | 中外製薬株式会社 | マウスFcγRII特異的Fc抗体 |
US10919953B2 (en) | 2012-08-24 | 2021-02-16 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | FcgammaRIIB-specific Fc region variant |
WO2014036562A2 (en) | 2012-08-31 | 2014-03-06 | University Of Virginia Patent Foundation | Target peptides for immunotherapy and diagnostics |
US9206390B2 (en) | 2012-09-02 | 2015-12-08 | Abbvie, Inc. | Methods to control protein heterogeneity |
US9512214B2 (en) | 2012-09-02 | 2016-12-06 | Abbvie, Inc. | Methods to control protein heterogeneity |
AU2013312529A1 (en) | 2012-09-05 | 2015-04-16 | The University Of Birmingham | Target peptides for colorectal cancer therapy and diagnostics |
US10393733B2 (en) | 2012-09-19 | 2019-08-27 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Dynamic BH3 profiling |
EP2711016A1 (en) | 2012-09-21 | 2014-03-26 | Covagen AG | Novel IL-17A binding molecules and medical uses thereof |
AU2013320972B2 (en) | 2012-09-27 | 2018-08-30 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | FGFR3 fusion gene and pharmaceutical drug targeting same |
TWI609083B (zh) | 2012-09-28 | 2017-12-21 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Blood coagulation reaction assessment method |
MX370848B (es) | 2012-10-04 | 2020-01-08 | Dana Farber Cancer Inst Inc | Anticuerpos monoclonales humanos anti-pd-l1 y métodos de uso. |
TW201811825A (zh) | 2012-11-01 | 2018-04-01 | 美商艾伯維有限公司 | 抗-vegf/dll4雙重可變區域免疫球蛋白及其用途 |
JP6212497B2 (ja) | 2012-11-08 | 2017-10-11 | 国立大学法人 宮崎大学 | トランスフェリン受容体を特異的に認識できる抗体 |
ES2784631T3 (es) | 2012-12-03 | 2020-09-29 | Novimmune Sa | Anticuerpos anti-CD47 y métodos de uso de los mismos |
WO2014093855A1 (en) | 2012-12-13 | 2014-06-19 | University Of Virginia Patent Foundation | Target peptides for ovarian cancer therapy and diagnostics |
LT2935326T (lt) | 2012-12-21 | 2020-12-10 | Biogen Ma Inc. | Žmogaus antikūnai prieš tau baltymą |
EP2940135B9 (en) | 2012-12-27 | 2021-09-08 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Heterodimerized polypeptide |
CA2896824A1 (en) | 2012-12-31 | 2014-07-03 | Neurimmune Holding Ag | Recombinant human antibodies for therapy and prevention of polyomavirus-related diseases |
EP2948478B1 (en) | 2013-01-25 | 2019-04-03 | Amgen Inc. | Antibodies targeting cdh19 for melanoma |
JO3519B1 (ar) | 2013-01-25 | 2020-07-05 | Amgen Inc | تركيبات أجسام مضادة لأجل cdh19 و cd3 |
SG11201506132PA (en) | 2013-02-06 | 2015-09-29 | Inhibrx Llc | Non-platelet depleting and non-red blood cell depleting cd47 antibodies and methods of use thereof |
CA2905010A1 (en) | 2013-03-12 | 2014-09-18 | Abbvie Inc. | Human antibodies that bind human tnf-alpha and methods of preparing the same |
MX362075B (es) | 2013-03-14 | 2019-01-07 | Abbott Lab | Ensayo de combinación de antígeno-anticuerpo del virus de la hepatitis c (vhc) y métodos y composiciones para usarlo. |
US9017687B1 (en) | 2013-10-18 | 2015-04-28 | Abbvie, Inc. | Low acidic species compositions and methods for producing and using the same using displacement chromatography |
CA2906407A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-09-18 | Abbott Laboratories | Hcv ns3 recombinant antigens and mutants thereof for improved antibody detection |
WO2014159579A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-10-02 | Abbvie Inc. | MUTATED ANTI-TNFα ANTIBODIES AND METHODS OF THEIR USE |
EP2970451A1 (en) | 2013-03-14 | 2016-01-20 | Amgen Inc. | Chrdl-1 antigen binding proteins and methods of treatment |
WO2014159242A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-10-02 | Novartis Ag | Notch 3 mutants and uses thereof |
WO2014151878A2 (en) | 2013-03-14 | 2014-09-25 | Abbvie Inc. | Methods for modulating protein glycosylation profiles of recombinant protein therapeutics using monosaccharides and oligosacharides |
CN105452292A (zh) | 2013-03-14 | 2016-03-30 | 帕卡什·吉尔 | 使用结合细胞表面grp78的抗体进行癌症治疗 |
JP6739329B2 (ja) | 2013-03-14 | 2020-08-12 | アボット・ラボラトリーズAbbott Laboratories | Hcvコア脂質結合ドメインモノクローナル抗体 |
US9505849B2 (en) | 2013-03-15 | 2016-11-29 | Amgen Research (Munich) Gmbh | Antibody constructs for influenza M2 and CD3 |
CN105142668B (zh) | 2013-03-15 | 2018-04-27 | 达纳-法伯癌症研究院公司 | 治疗性肽 |
US9469686B2 (en) | 2013-03-15 | 2016-10-18 | Abbott Laboratories | Anti-GP73 monoclonal antibodies and methods of obtaining the same |
TW201512219A (zh) | 2013-03-15 | 2015-04-01 | Abbvie Inc | 針對IL-1β及/或IL-17之雙特異性結合蛋白 |
AU2014233198B2 (en) | 2013-03-15 | 2019-06-27 | Sutter West Bay Hospitals | Falz for use as a target for therapies to treat cancer |
TW201525001A (zh) | 2013-03-15 | 2015-07-01 | Amgen Res Munich Gmbh | 包含n-端abp之單鏈結合分子 |
JP6427552B2 (ja) | 2013-03-15 | 2018-11-21 | デイナ ファーバー キャンサー インスティチュート,インコーポレイテッド | フラビウイルス中和抗体およびその使用方法 |
WO2014144632A2 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Amgen Inc. | Human pac1 antibodies |
US9850297B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-12-26 | Amgen Inc. | Secreted frizzle-related protein 5 (SFRP5) binding proteins |
US9788534B2 (en) | 2013-03-18 | 2017-10-17 | Kymab Limited | Animal models and therapeutic molecules |
CN113621057A (zh) | 2013-04-02 | 2021-11-09 | 中外制药株式会社 | Fc区变体 |
US9783618B2 (en) | 2013-05-01 | 2017-10-10 | Kymab Limited | Manipulation of immunoglobulin gene diversity and multi-antibody therapeutics |
US9783593B2 (en) | 2013-05-02 | 2017-10-10 | Kymab Limited | Antibodies, variable domains and chains tailored for human use |
US11707056B2 (en) | 2013-05-02 | 2023-07-25 | Kymab Limited | Animals, repertoires and methods |
CN104140974B (zh) | 2013-05-08 | 2017-09-29 | 科济生物医药(上海)有限公司 | 编码gpc‑3嵌合抗原受体蛋白的核酸及表达gpc‑3嵌合抗原受体蛋白的t淋巴细胞 |
JP6537143B2 (ja) | 2013-05-16 | 2019-07-03 | 国立大学法人京都大学 | 癌の予後を診断する方法 |
EP3003372B1 (en) | 2013-06-07 | 2019-10-09 | Duke University | Inhibitors of complement factor h |
JP6442404B2 (ja) | 2013-06-11 | 2018-12-19 | 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター | 再発寛解型多発性硬化症(rrms)患者の治療予後予測方法、及び新規治療適応判断方法 |
AU2014299916A1 (en) | 2013-06-24 | 2015-12-24 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Therapeutic agent comprising humanized anti-Epiregulin antibody as active ingredient for non-small-cell lung carcinoma excluding adenocarcinoma |
CA2916259C (en) | 2013-06-28 | 2024-02-20 | Amgen Inc. | Methods for treating homozygous familial hypercholesterolemia |
WO2015001013A2 (en) | 2013-07-03 | 2015-01-08 | Immunoqure Ag | Human anti-ifn-alpha antibodies |
EP2820947A1 (en) | 2013-07-05 | 2015-01-07 | B Cell Design | Transgenic non-human mammal for producing chimeric human immunoglobulin E antibodies |
EP3033356B1 (en) | 2013-08-14 | 2020-01-15 | Sachdev Sidhu | Antibodies against frizzled proteins and methods of use thereof |
TW201605896A (zh) | 2013-08-30 | 2016-02-16 | 安美基股份有限公司 | Gitr抗原結合蛋白 |
EP3047276B1 (en) | 2013-09-19 | 2023-06-14 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Methods of bh3 profiling |
WO2015041310A1 (ja) | 2013-09-20 | 2015-03-26 | 中外製薬株式会社 | 抗プロテインc抗体による出血性疾患の治療 |
EP3050896B1 (en) | 2013-09-27 | 2021-07-07 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method for producing polypeptide heteromultimer |
SG10201802295XA (en) | 2013-10-01 | 2018-04-27 | Kymab Ltd | Animal Models and Therapeutic Molecules |
EP3052640A2 (en) | 2013-10-04 | 2016-08-10 | AbbVie Inc. | Use of metal ions for modulation of protein glycosylation profiles of recombinant proteins |
US9085618B2 (en) | 2013-10-18 | 2015-07-21 | Abbvie, Inc. | Low acidic species compositions and methods for producing and using the same |
US9181337B2 (en) | 2013-10-18 | 2015-11-10 | Abbvie, Inc. | Modulated lysine variant species compositions and methods for producing and using the same |
US8946395B1 (en) | 2013-10-18 | 2015-02-03 | Abbvie Inc. | Purification of proteins using hydrophobic interaction chromatography |
CN113307873A (zh) | 2013-11-11 | 2021-08-27 | 中外制药株式会社 | 含有改变了抗体可变区的抗原结合分子 |
WO2015073884A2 (en) | 2013-11-15 | 2015-05-21 | Abbvie, Inc. | Glycoengineered binding protein compositions |
AU2014358191B2 (en) | 2013-12-04 | 2020-12-24 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antigen-binding molecules, the antigen-binding activity of which varies according to the concentration of compounds, and libraries of said molecules |
KR20160090904A (ko) | 2013-12-06 | 2016-08-01 | 다나-파버 캔서 인스티튜트 인크. | 치료 펩티드 |
TW201609093A (zh) | 2013-12-27 | 2016-03-16 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Fgfr門控蛋白變異基因及以其爲標的之醫藥 |
JP6722455B2 (ja) | 2013-12-27 | 2020-07-15 | 中外製薬株式会社 | 等電点の低い抗体の精製方法 |
CN103865920B (zh) * | 2013-12-31 | 2016-06-01 | 广州达恩基因科技有限公司 | 胚胎干细胞特有小分子多肽es61编码基因的克隆方法 |
TW201532513A (zh) * | 2014-01-10 | 2015-09-01 | Alfur Fu-Hsin Hung | 能產生比小鼠IgE量高出許多的人源化IgE之基因轉殖動物 |
CN104774264B (zh) | 2014-01-15 | 2018-09-14 | 上海易乐生物技术有限公司 | 抗人proBDNF单克隆抗体及其在疼痛中的作用 |
EP3105252B1 (en) | 2014-02-12 | 2019-07-24 | Michael Uhlin | Bispecific antibodies for use in stem cell transplantation |
CA2939006A1 (en) | 2014-03-14 | 2015-09-17 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Vaccine compositions and methods for restoring nkg2d pathway function against cancers |
US20170174751A1 (en) | 2014-03-19 | 2017-06-22 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Immunogenetic restriction on elicitation of antibodies |
WO2015143414A2 (en) | 2014-03-21 | 2015-09-24 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals that make single domain binding proteins |
CA2943405A1 (en) | 2014-03-31 | 2015-10-08 | Debiopharm International Sa | Fgfr fusions |
CA2940585C (en) | 2014-04-15 | 2023-08-08 | Helmholtz Zentrum Munchen - Deutsches Forschungszentrum Fur Gesundheit Und Umwelt (Gmbh) | Differential diagnosis of eczema and psoriasis |
EP4112070A1 (en) | 2014-04-25 | 2023-01-04 | Dana Farber Cancer Institute, Inc. | Middle east respiratory syndrome coronavirus neutralizing antibodies and methods of use thereof |
EP3137910B1 (en) | 2014-04-30 | 2019-09-25 | Klinikum rechts der Isar der Technischen Universität München | Diagnosis of multiple sclerosis |
CA2949237C (en) | 2014-05-16 | 2022-08-23 | Amgen Inc. | Assay for detecting th1 and th2 cell populations |
US20170198054A1 (en) | 2014-05-21 | 2017-07-13 | Dana-Farber Cancer Institute | Methods for treating cancer with anti bip or anti mica antibodies |
TWI695011B (zh) | 2014-06-18 | 2020-06-01 | 美商梅爾莎納醫療公司 | 抗her2表位之單株抗體及其使用之方法 |
TWI831106B (zh) | 2014-06-20 | 2024-02-01 | 日商中外製藥股份有限公司 | 用於因第viii凝血因子及/或活化的第viii凝血因子的活性降低或欠缺而發病及/或進展的疾病之預防及/或治療之醫藥組成物 |
CN112979828A (zh) | 2014-07-17 | 2021-06-18 | 恺兴生命科技(上海)有限公司 | 靶向cld18a2的t淋巴细胞及其制备方法和应用 |
WO2016016278A2 (en) | 2014-07-29 | 2016-02-04 | Neurimmune Holding Ag | Human-derived anti-huntingtin (htt) antibodies and uses thereof |
CA2952540C (en) | 2014-07-31 | 2022-06-21 | Amgen Research (Munich) Gmbh | Bispecific single chain antibody construct with enhanced tissue distribution |
AR101669A1 (es) | 2014-07-31 | 2017-01-04 | Amgen Res (Munich) Gmbh | Constructos de anticuerpos para cdh19 y cd3 |
JP6749312B2 (ja) | 2014-07-31 | 2020-09-02 | アムゲン リサーチ (ミュンヘン) ゲーエムベーハーAMGEN Research(Munich)GmbH | 最適化された種間特異的二重特異性単鎖抗体コンストラクト |
WO2016027859A1 (ja) | 2014-08-20 | 2016-02-25 | 中外製薬株式会社 | 蛋白質溶液の粘度測定方法 |
WO2016040767A2 (en) | 2014-09-12 | 2016-03-17 | Amgen Inc. | Chrdl-1 epitopes and antibodies |
MX2017003247A (es) | 2014-09-15 | 2017-11-30 | Amgen Inc | Proteina de union a antigenos, bi-especificos del receptor anti-cgrp/receptor pac1 y usos de las mismas. |
WO2016044588A1 (en) | 2014-09-19 | 2016-03-24 | The Regents Of The University Of Michigan | Staphylococcus aureus materials and methods |
MA40764A (fr) | 2014-09-26 | 2017-08-01 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité |
SG11201701925XA (en) | 2014-09-30 | 2017-04-27 | Neurimmune Holding Ag | Human-derived anti-dipeptide repeats (dprs) antibody |
EP3201232A1 (en) | 2014-10-03 | 2017-08-09 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor (gitr) antibodies and methods of use thereof |
JP6795505B2 (ja) | 2014-10-06 | 2020-12-02 | デイナ ファーバー キャンサー インスティチュート,インコーポレイテッド | ヒト化ccケモカイン受容体4(ccr4)抗体およびその使用法 |
MX2017004769A (es) | 2014-10-15 | 2017-10-16 | Amgen Inc | Elementos promotores y reguladores para mejorar la expresion de genes heterologos en celulas hospederas. |
CA2967379A1 (en) | 2014-11-18 | 2016-05-26 | Janssen Pharmaceutica Nv | Cd47 antibodies, methods, and uses |
WO2016094881A2 (en) | 2014-12-11 | 2016-06-16 | Abbvie Inc. | Lrp-8 binding proteins |
EP3034620A1 (en) | 2014-12-17 | 2016-06-22 | Diaxonhit | Compositions and methods for diagnosing thyroid cancer |
FR3030758A1 (fr) | 2014-12-19 | 2016-06-24 | Inst Nat De La Rech Agronomique (Inra) | Marqueurs diagnostiques de la maladie de crohn |
US9969800B2 (en) | 2015-02-05 | 2018-05-15 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | IL-8 antibodies |
CA2972393A1 (en) | 2015-02-27 | 2016-09-01 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Composition for treating il-6-related diseases |
EP3265491A1 (en) | 2015-03-03 | 2018-01-10 | Xoma (Us) Llc | Treatment of post-prandial hyperinsulinemia and hypoglycemia after bariatric surgery |
CN107223135B (zh) | 2015-03-16 | 2021-11-02 | 亥姆霍兹慕尼黑中心-德国环境健康研究中心(Gmbh) | 用于治疗hbv感染和相关病症的三特异性结合分子 |
AU2016232749B2 (en) | 2015-03-18 | 2021-09-23 | The Johns Hopkins University | Novel monoclonal antibody inhibitors targeting potassium channel KCNK9 |
CN107438622A (zh) | 2015-03-19 | 2017-12-05 | 瑞泽恩制药公司 | 选择结合抗原的轻链可变区的非人动物 |
CN116327915A (zh) | 2015-04-03 | 2023-06-27 | 佐马技术有限公司 | 使用TGF-β抑制剂和PD-1抑制剂治疗癌症 |
WO2016164835A1 (en) | 2015-04-08 | 2016-10-13 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Humanized influenza monoclonal antibodies and methods of use thereof |
KR102057767B1 (ko) | 2015-04-17 | 2019-12-19 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | 응고 인자 및 다중특이적 항체의 조합 요법 |
KR20180023892A (ko) | 2015-04-17 | 2018-03-07 | 암젠 리서치 (뮌헨) 게엠베하 | Cdh3 및 cd3에 대한 이중 특이성 항체 작제물 |
MX2017013383A (es) | 2015-04-20 | 2017-12-07 | Tolero Pharmaceuticals Inc | Prediccion de respuesta a alvocidib mediante perfilado mitocondrial. |
JOP20200116A1 (ar) | 2015-04-24 | 2017-06-16 | Amgen Inc | طرق لعلاج أو الوقاية من الصداع النصفي |
CA2983022C (en) | 2015-04-27 | 2023-03-07 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | High throughput bh3 profiling: a rapid and scalable technology to bh3 profile on low numbers of cells |
RS59847B1 (sr) | 2015-04-28 | 2020-02-28 | Mitsubishi Tanabe Pharma Corp | Protein koji vezuje rgma i njegova upotreba |
AU2016258742B9 (en) | 2015-05-01 | 2023-07-13 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Methods of mediating cytokine expression with anti CCR4 antibodies |
TR201911032T4 (tr) | 2015-05-18 | 2019-08-21 | Tolero Pharmaceuticals Inc | Artırılmış biyoyararlanıma sahip alvocıdıb ön ilaçları. |
FR3036287A1 (fr) | 2015-05-19 | 2016-11-25 | Univ Bordeaux | Traitement et detection des trypanosomes |
SI3303395T1 (sl) | 2015-05-29 | 2020-03-31 | Abbvie Inc. | Protitelesa proti CD40 in njihove uporabe |
TW201710286A (zh) | 2015-06-15 | 2017-03-16 | 艾伯維有限公司 | 抗vegf、pdgf及/或其受體之結合蛋白 |
TWI717375B (zh) | 2015-07-31 | 2021-02-01 | 德商安美基研究(慕尼黑)公司 | Cd70及cd3抗體構築體 |
TWI793062B (zh) | 2015-07-31 | 2023-02-21 | 德商安美基研究(慕尼黑)公司 | Dll3及cd3抗體構築體 |
TWI796283B (zh) | 2015-07-31 | 2023-03-21 | 德商安美基研究(慕尼黑)公司 | Msln及cd3抗體構築體 |
TWI744242B (zh) | 2015-07-31 | 2021-11-01 | 德商安美基研究(慕尼黑)公司 | Egfrviii及cd3抗體構築體 |
TWI829617B (zh) | 2015-07-31 | 2024-01-21 | 德商安美基研究(慕尼黑)公司 | Flt3及cd3抗體構築體 |
AU2016301315C1 (en) | 2015-08-03 | 2022-07-07 | Sumitomo Pharma Oncology, Inc. | Combination therapies for treatment of cancer |
US10253101B2 (en) | 2015-08-06 | 2019-04-09 | Xoma (Us) Llc | Antibody fragments against the insulin receptor and uses thereof to treat hypoglycemia |
MA45352A (fr) | 2015-08-07 | 2018-06-13 | Univ Birmingham | Identification de glycopeptides associés à mhc de catégorie i comme cibles d'immunothérapie de cancer |
WO2017049004A1 (en) | 2015-09-15 | 2017-03-23 | Amgen Inc. | Tetravalent bispecific and tetraspecific antigen binding proteins and uses thereof |
TWI814162B (zh) | 2015-09-18 | 2023-09-01 | 日商中外製藥股份有限公司 | Il-8結合抗體及其用途 |
JP2018529729A (ja) | 2015-10-01 | 2018-10-11 | アムジエン・インコーポレーテツド | 胆汁酸障害の処置 |
US11660340B2 (en) | 2015-11-18 | 2023-05-30 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Combination therapy using T cell redirection antigen binding molecule against cell having immunosuppressing function |
US11649293B2 (en) | 2015-11-18 | 2023-05-16 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method for enhancing humoral immune response |
JP6975720B2 (ja) | 2015-11-30 | 2021-12-01 | シェ、ヤンホイXie Yanhui | 腫瘍の診断および治療におけるAkt2の使用 |
WO2017106578A1 (en) | 2015-12-15 | 2017-06-22 | Amgen Inc. | Pacap antibodies and uses thereof |
WO2017112824A2 (en) | 2015-12-23 | 2017-06-29 | Amgen Inc. | Method of treating or ameliorating metabolic disorders using binding proteins for gastric inhibitory peptide receptor (gipr) in combination with glp-1 agonists |
WO2017110980A1 (ja) | 2015-12-25 | 2017-06-29 | 中外製薬株式会社 | 増強された活性を有する抗体及びその改変方法 |
US10781264B2 (en) | 2016-02-03 | 2020-09-22 | Amgen Research (Munich) Gmbh | PSMA and CD3 bispecific T cell engaging antibody constructs |
EA039859B1 (ru) | 2016-02-03 | 2022-03-21 | Эмджен Рисерч (Мюник) Гмбх | Биспецифические конструкты антител, связывающие egfrviii и cd3 |
CR20180420A (es) | 2016-02-03 | 2018-12-05 | Amgen Inc | Constructos de anticuerpo biespecíficos para bcma y cd3 que se ligan a células t |
WO2017136676A1 (en) | 2016-02-05 | 2017-08-10 | Nanoview Diagnostics Inc. | Detection of exosomes having surface markers |
KR20180116215A (ko) | 2016-03-14 | 2018-10-24 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | 암의 치료에 이용하기 위한 세포상해 유도 치료제 |
EP3430058A4 (en) | 2016-03-15 | 2019-10-23 | Generon (Shanghai) Corporation Ltd. | MULTISPECIFIC FAB FUSION PROTEINS AND USES THEREOF |
JP7137474B2 (ja) | 2016-03-15 | 2022-09-14 | メルサナ セラピューティクス,インコーポレイティド | NaPi2b標的化抗体-薬物コンジュゲート及びその使用方法 |
JOP20170091B1 (ar) | 2016-04-19 | 2021-08-17 | Amgen Res Munich Gmbh | إعطاء تركيبة ثنائية النوعية ترتبط بـ cd33 وcd3 للاستخدام في طريقة لعلاج اللوكيميا النخاعية |
JP2018035137A (ja) | 2016-07-13 | 2018-03-08 | マブイミューン ダイアグノスティックス エイジーMabimmune Diagnostics Ag | 新規な抗線維芽細胞活性化タンパク質(fap)結合薬剤およびその使用 |
JP7082967B2 (ja) | 2016-07-22 | 2022-06-09 | デイナ ファーバー キャンサー インスティチュート,インコーポレイテッド | グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体(gitr)抗体及びその使用方法 |
EP3487867A2 (en) | 2016-07-22 | 2019-05-29 | Amgen Inc. | Methods of purifying fc-containing proteins |
JP7148493B2 (ja) | 2016-08-01 | 2022-10-05 | ゾーマ (ユーエス) リミテッド ライアビリティ カンパニー | 副甲状腺ホルモン受容体1(pth1r)抗体およびその使用 |
CA3035081A1 (en) | 2016-09-02 | 2018-03-08 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Composition and methods of treating b cell disorders |
EP3509633A1 (en) | 2016-09-06 | 2019-07-17 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Methods of treating or preventing zika virus infection |
MX2019002510A (es) | 2016-09-06 | 2019-06-24 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Metodos para usar un anticuerpo biespecifico que reconoce el factor de coagulacion ix y/o el factor de coagulacion ix activado y el factor de coagulacion x y/o factor de coagulacion x activado. |
WO2018049261A1 (en) | 2016-09-09 | 2018-03-15 | Icellhealth Consulting Llc | Oncolytic virus expressing immune checkpoint modulators |
JP2019534710A (ja) | 2016-09-28 | 2019-12-05 | ゾーマ (ユーエス) リミテッド ライアビリティ カンパニー | インターロイキン2に結合する抗体およびその使用 |
MX2019003473A (es) | 2016-10-03 | 2019-10-15 | Abbott Lab | Metodos mejorados para evaluar el estado de ubiquitin carboxi-terminal hidrolasa l1 (uch-l1) en muestras de pacientes. |
EP3535299A1 (en) | 2016-11-04 | 2019-09-11 | Novimmune S.A. | Anti-cd19 antibodies and methods of use thereof |
EP3538555A1 (en) | 2016-11-14 | 2019-09-18 | Amgen Inc. | Bispecific or biparatopic antigen binding proteins and uses thereof |
WO2018094275A1 (en) | 2016-11-18 | 2018-05-24 | Tolero Pharmaceuticals, Inc. | Alvocidib prodrugs and their use as protein kinase inhibitors |
BR112019008265A2 (pt) | 2016-11-28 | 2019-07-09 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | molécula de ligação ao ligante cuja atividade de li-gação ao ligante é ajustável |
KR20190099260A (ko) | 2016-12-19 | 2019-08-26 | 톨레로 파마수티컬스, 인크. | 프로파일링 펩티드 및 감도 프로파일링을 위한 방법 |
WO2018129284A1 (en) | 2017-01-05 | 2018-07-12 | The Johns Hopkins University | Development of new monoclonal antibodies recognizing human prostate-specific membrane antigen (psma) |
MX2019008029A (es) | 2017-01-06 | 2019-12-11 | Abl Bio Inc | Anticuerpo anti-alfa-sinucleina y su uso. |
WO2018128454A1 (ko) | 2017-01-06 | 2018-07-12 | 에이비엘바이오 주식회사 | 항 α-SYN 항체 및 그 용도 |
JOP20190177A1 (ar) | 2017-01-17 | 2019-07-16 | Amgen Inc | طريقة لعلاج أو تحسين اضطرابات أيضية باستخدام مساعدات مستقبل glp-1 مقترنة بمناهضات لمستقبل ببتيد مثبط معوي (gipr) |
EP3570668A1 (en) | 2017-01-19 | 2019-11-27 | Open Monoclonal Technology, Inc. | Human antibodies from transgenic rodents with multiple heavy chain immunoglobulin loci |
JOP20190189A1 (ar) | 2017-02-02 | 2019-08-01 | Amgen Res Munich Gmbh | تركيبة صيدلانية ذات درجة حموضة منخفضة تتضمن بنيات جسم مضاد يستهدف الخلية t |
WO2018175942A1 (en) | 2017-03-23 | 2018-09-27 | Abbott Laboratories | Methods for aiding in the diagnosis and determination of the extent of traumatic brain injury in a human subject using the early biomarker ubiquitin carboxy-terminal hydrolase l1 |
KR20190133005A (ko) | 2017-03-24 | 2019-11-29 | 젠야쿠코교가부시키가이샤 | 항 IgM/B 세포 표면 항원 이중 특이성 항체 |
CN110461358A (zh) | 2017-03-31 | 2019-11-15 | 公立大学法人奈良县立医科大学 | 可用于预防和/或治疗凝血因子ⅸ异常、包含代替凝血因子ⅷ的功能的多特异性抗原结合分子的药物组合物 |
US10722589B2 (en) | 2017-04-03 | 2020-07-28 | Covagen Ag | FGFR3 binding molecules |
JOP20190243A1 (ar) | 2017-04-12 | 2019-10-13 | Medimmune Llc | علاج الربو بجسم مضاد لـ tslp |
CA3053409A1 (en) | 2017-04-15 | 2018-10-18 | Abbott Laboratories | Methods for aiding in the hyperacute diagnosis and determination of traumatic brain injury in a human subject using early biomarkers |
JOP20190248A1 (ar) | 2017-04-21 | 2019-10-20 | Amgen Inc | بروتينات ربط مولد ضد trem2 واستخداماته |
WO2018199214A1 (ja) | 2017-04-27 | 2018-11-01 | 中外製薬株式会社 | 薬物動態が改善された血液凝固第ix因子 |
BR112019022476A2 (pt) | 2017-04-28 | 2020-05-12 | Abbott Laboratories | Métodos para o auxílio no diagnóstico e determinação hiperagudos de lesão cerebral traumática usando biomarcadores iniciais em pelo menos duas amostras a partir do mesmo ser humano |
US11851486B2 (en) | 2017-05-02 | 2023-12-26 | National Center Of Neurology And Psychiatry | Method for predicting and evaluating therapeutic effect in diseases related to IL-6 and neutrophils |
US10865238B1 (en) | 2017-05-05 | 2020-12-15 | Duke University | Complement factor H antibodies |
US11918650B2 (en) | 2017-05-05 | 2024-03-05 | Amgen Inc. | Pharmaceutical composition comprising bispecific antibody constructs for improved storage and administration |
US10866251B2 (en) | 2017-05-25 | 2020-12-15 | Abbott Laboratories | Methods for aiding in the determination of whether to perform imaging on a human subject who has sustained or may have sustained an injury to the head using early biomarkers |
WO2018215835A1 (en) | 2017-05-26 | 2018-11-29 | Novimmune Sa | Anti-cd47 x anti-mesothelin antibodies and methods of use thereof |
BR112019025387A2 (pt) | 2017-05-30 | 2020-07-07 | Abbott Laboratories | métodos para auxiliar no diagnóstico e avaliação de uma lesão traumática cerebral branda em um indivíduo humano com o uso de troponina cardíaca i e biomarcadores precoces |
JOP20190259A1 (ar) | 2017-05-31 | 2019-10-31 | Amgen Inc | بروتينات ربط مولد ضد مضادة لـ jagged1 |
CN110831969B (zh) | 2017-06-20 | 2024-06-21 | 安进公司 | 使用抑胃肽受体(gipr)结合蛋白与glp-1激动剂的组合治疗或改善代谢障碍的方法 |
CR20200076A (es) | 2017-07-14 | 2020-06-10 | Pfizer | ANTICUERPOS CONTRA MAdCAM |
JP7504025B2 (ja) | 2017-08-04 | 2024-06-21 | アムジエン・インコーポレーテツド | Cys-mabのコンジュゲーション方法 |
WO2019055579A1 (en) | 2017-09-12 | 2019-03-21 | Tolero Pharmaceuticals, Inc. | TREATMENT REGIME FOR CANCERS THAT ARE INSENSITIVE TO BCL-2 INHIBITORS USING THE MCL-1 ALVOCIDIB INHIBITOR |
JP7235249B2 (ja) | 2017-10-20 | 2023-03-08 | 学校法人兵庫医科大学 | 抗il-6受容体抗体を含有する術後の癒着を抑制するための医薬組成物 |
JP7266532B2 (ja) | 2017-11-28 | 2023-04-28 | 中外製薬株式会社 | リガンド結合活性が調整可能なリガンド結合分子 |
KR20200106495A (ko) | 2017-11-29 | 2020-09-14 | 보오드 오브 리젠츠, 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 | 암 치료요법을 위한 조성물 및 방법 |
US11022617B2 (en) | 2017-12-09 | 2021-06-01 | Abbott Laboratories | Methods for aiding in the diagnosis and evaluation of a subject who has sustained an orthopedic injury and that has or may have sustained an injury to the head, such as mild traumatic brain injury (TBI), using glial fibrillary acidic protein (GFAP) and/or ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1 (UCH-L1) |
CN110892266A (zh) | 2017-12-09 | 2020-03-17 | 雅培实验室 | 使用gfap和uch-l1的组合辅助诊断和评价人类受试者中创伤性脑损伤的方法 |
SG11202004273YA (en) | 2017-12-11 | 2020-06-29 | Amgen Inc | Continuous manufacturing process for bispecific antibody products |
WO2019117684A1 (ko) | 2017-12-14 | 2019-06-20 | 에이비엘바이오 주식회사 | a-syn/IGF1R에 대한 이중 특이 항체 및 그 용도 |
TWI817974B (zh) | 2017-12-28 | 2023-10-11 | 日商中外製藥股份有限公司 | 細胞毒性誘導治療劑 |
UY38041A (es) | 2017-12-29 | 2019-06-28 | Amgen Inc | Construcción de anticuerpo biespecífico dirigida a muc17 y cd3 |
AU2019207812A1 (en) | 2018-01-12 | 2020-07-23 | Bristol-Myers Squibb Company | Combination therapy with anti-IL-8 antibodies and anti-PD-1 antibodies for treating cancer |
CA3087951A1 (en) | 2018-01-12 | 2019-07-18 | Amgen Inc. | Pac1 antibodies and uses thereof |
JP7458790B2 (ja) | 2018-01-31 | 2024-04-01 | 元一 加藤 | Il-6阻害剤を含有する喘息の治療剤 |
RU2020129265A (ru) | 2018-03-12 | 2022-04-12 | ЗОИТИС СЕРВИСЕЗ ЭлЭлСи | Антитела против ngf и связанные с ними способы |
AU2019235523A1 (en) | 2018-03-14 | 2020-10-29 | Novimmune Sa | Anti-CD3 epsilon antibodies and methods of use thereof |
US20210196568A1 (en) | 2018-05-21 | 2021-07-01 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Lyophilized formulation sealed in glass container |
WO2019225787A1 (ko) | 2018-05-24 | 2019-11-28 | 에이비엘바이오 주식회사 | 항-b7-h3 항체 및 그 용도 |
CN108707599A (zh) * | 2018-05-31 | 2018-10-26 | 东北农业大学 | 一种小鼠胚胎干细胞单细胞融合方法 |
US20210364412A1 (en) | 2018-06-01 | 2021-11-25 | NanoView Biosciences, Inc. | Compositions, systems, and methods for enhanced label-free and fluorescence - based detection of nanoparticles |
WO2020013238A1 (ja) | 2018-07-10 | 2020-01-16 | 田辺三菱製薬株式会社 | 末梢神経障害又は末梢神経障害若しくはアストロサイト障害が認められる疾患に伴う疼痛の予防又は治療方法 |
US20210301017A1 (en) | 2018-07-30 | 2021-09-30 | Amgen Research (Munich) Gmbh | Prolonged administration of a bispecific antibody construct binding to cd33 and cd3 |
CA3107192A1 (en) | 2018-08-03 | 2020-02-06 | Amgen Research (Munich) Gmbh | Antibody constructs for cldn18.2 and cd3 |
JP2021534779A (ja) | 2018-08-27 | 2021-12-16 | アフィメッド ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツンク | 抗体構築物がプレロードされた凍結保存nk細胞 |
SG11202103275YA (en) | 2018-10-11 | 2021-04-29 | Amgen Inc | Downstream processing of bispecific antibody constructs |
WO2020117988A1 (en) | 2018-12-04 | 2020-06-11 | Tolero Pharmaceuticals, Inc. | Cdk9 inhibitors and polymorphs thereof for use as agents for treatment of cancer |
JPWO2020153467A1 (ja) | 2019-01-24 | 2021-12-02 | 中外製薬株式会社 | 新規がん抗原及びそれらの抗原に対する抗体 |
US20220125754A1 (en) | 2019-01-29 | 2022-04-28 | Helmholtz Zentrum München - Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) | Treating the causative agent in adhesiogenesis |
WO2020160402A1 (en) | 2019-02-01 | 2020-08-06 | NanoView Biosciences, Inc. | Systems and methods for vesicle cargo labeling and detection |
EP3912992A4 (en) | 2019-02-04 | 2022-11-23 | National University Corporation Ehime University | CAR LIBRARY AND MANUFACTURING PROCESSES FOR SCFV |
WO2020167912A1 (en) | 2019-02-13 | 2020-08-20 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Anti-peripheral lymph node addressin antibodies and uses thereof |
CN113508140A (zh) | 2019-02-28 | 2021-10-15 | 学校法人顺天堂 | 与切断型的突变型Calreticulin结合的抗体以及骨髄增殖性肿瘤的诊断、预防或治疗药 |
EP3943108A4 (en) | 2019-03-19 | 2023-01-04 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | ANTIGEN-BINDING MOLECULE CONTAINING AN ANTIGEN-BINDING DOMAIN WHOSE ANTIGEN-BINDING ACTIVITY IS ALTERED DEPENDING ON THE MTA, AND BANK FOR OBTAINING SUCH ANTIGEN-BINDING DOMAIN |
US11793802B2 (en) | 2019-03-20 | 2023-10-24 | Sumitomo Pharma Oncology, Inc. | Treatment of acute myeloid leukemia (AML) with venetoclax failure |
SG11202110986YA (en) | 2019-04-10 | 2021-11-29 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Method for purifying fc region-modified antibody |
KR20220019670A (ko) | 2019-04-17 | 2022-02-17 | 고쿠리츠다이가쿠호진 히로시마다이가쿠 | Il-6 저해제 및 ccr2 저해제를 조합하여 투여하는 것을 특징으로 하는 비뇨기암의 치료제 |
CN114174344A (zh) | 2019-05-30 | 2022-03-11 | 美国安进公司 | 工程改造铰链区以驱动抗体二聚化 |
BR112021023735A2 (pt) | 2019-06-05 | 2022-01-04 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Molécula de ligação de sítio de clivagem de anti-corpo |
MX2021014644A (es) | 2019-06-13 | 2022-04-06 | Amgen Inc | Control de perfusion basado en biomasa automatizado en la fabricacion de productos biologicos. |
MX2021015791A (es) | 2019-06-28 | 2022-04-01 | Amgen Inc | Proteínas de unión al antígeno biespecificas anti-receptor de cgrp/anti-receptor pac1. |
WO2021021676A1 (en) | 2019-07-26 | 2021-02-04 | Amgen Inc. | Anti-il13 antigen binding proteins |
MX2022002981A (es) | 2019-09-10 | 2022-04-06 | Amgen Inc | Metodo de purificacion para polipeptidos de union a antigeno biespecificos con capacidad de union dinamica de captura de proteina l mejorada. |
CN115175680A (zh) | 2019-10-18 | 2022-10-11 | 加利福尼亚大学董事会 | Plxdc激活剂及其用于治疗血管病症的用途 |
US20220389119A1 (en) | 2019-11-08 | 2022-12-08 | Amgen Inc. | ENGINEERING CHARGE PAIR MUTATIONS FOR PAIRING OF HETERO-IgG MOLECULES |
WO2021097344A1 (en) | 2019-11-13 | 2021-05-20 | Amgen Inc. | Method for reduced aggregate formation in downstream processing of bispecific antigen-binding molecules |
JP2023501717A (ja) | 2019-11-19 | 2023-01-18 | アムジエン・インコーポレーテツド | 新規の多重特異性抗体フォーマット |
CA3164129A1 (en) | 2019-12-20 | 2021-06-24 | Amgen Inc. | Mesothelin-targeted cd40 agonistic multispecific antibody constructs for the treatment of solid tumors |
AR120898A1 (es) | 2019-12-26 | 2022-03-30 | Univ Osaka | Agente para tratar o prevenir neuromielitis óptica en fase aguda |
WO2021130383A1 (en) | 2019-12-27 | 2021-07-01 | Affimed Gmbh | Method for the production of bispecific fcyriii x cd30 antibody construct |
WO2021145432A1 (ja) | 2020-01-15 | 2021-07-22 | 国立大学法人大阪大学 | 糖尿病性自律神経障害の予防又は治療剤 |
AU2021207010A1 (en) | 2020-01-15 | 2022-08-25 | Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation | Prophylactic or therapeutic agent for dementia |
WO2021150824A1 (en) | 2020-01-22 | 2021-07-29 | Amgen Research (Munich) Gmbh | Combinations of antibody constructs and inhibitors of cytokine release syndrome and uses thereof |
US11896619B2 (en) | 2020-03-10 | 2024-02-13 | Massachusetts Institute Of Technology | Compositions and methods for immunotherapy of NPM1c-positive cancer |
US20230146593A1 (en) | 2020-03-12 | 2023-05-11 | Amgen Inc. | Method for treatment and prophylaxis of crs in patients comprising a combination of bispecific antibodies binding to cds x cancer cell and tnf alpha or il-6 inhibitor |
CN115427454A (zh) | 2020-03-19 | 2022-12-02 | 安进公司 | 针对粘蛋白17的抗体及其用途 |
JP7329288B2 (ja) | 2020-03-27 | 2023-08-18 | 株式会社PhotoQ3 | 腫瘍細胞を死滅させるための医薬 |
JPWO2021206078A1 (no) | 2020-04-06 | 2021-10-14 | ||
CA3175523A1 (en) | 2020-04-13 | 2021-10-21 | Antti Virtanen | Methods, complexes and kits for detecting or determining an amount of a .beta.-coronavirus antibody in a sample |
JP2023106635A (ja) | 2020-04-17 | 2023-08-02 | 中外製薬株式会社 | 二重特異性抗原結合分子ならびに、それに関連する組成物、組成物の製造のための使用、キット、および方法 |
AU2021275049A1 (en) | 2020-05-19 | 2022-12-22 | Amgen Inc. | MAGEB2 binding constructs |
CN115667515A (zh) | 2020-05-22 | 2023-01-31 | 中外制药株式会社 | 中和具有凝血因子viii(f.viii)功能替代活性的物质的抗体 |
WO2021243320A2 (en) | 2020-05-29 | 2021-12-02 | Amgen Inc. | Adverse effects-mitigating administration of a bispecific antibody construct binding to cd33 and cd3 |
CN115803062A (zh) | 2020-06-03 | 2023-03-14 | 博泰康医药公司 | 滋养层细胞表面抗原2(trop-2)抗体 |
KR20230026407A (ko) | 2020-06-18 | 2023-02-24 | 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. | 액티빈 a 항체 제형 및 이의 사용 방법 |
EP4174071A4 (en) | 2020-06-24 | 2024-09-11 | Univ Tokyo | PHOTOSENSITIZING DYE |
WO2022006562A1 (en) | 2020-07-03 | 2022-01-06 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Multispecific coronavirus antibodies |
JP2023534987A (ja) | 2020-07-24 | 2023-08-15 | アムジエン・インコーポレーテツド | Sars-cov2スパイクタンパク質に由来する免疫原 |
KR20230047397A (ko) | 2020-07-28 | 2023-04-07 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | 신규 개변형 항체를 포함하는, 바늘 실드를 구비한 바늘 부가 프리필드 시린지 제제 |
MX2023001120A (es) | 2020-07-31 | 2023-02-22 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Composicion farmaceutica que comprende una celula que expresa un receptor quimerico. |
WO2022031804A1 (en) | 2020-08-04 | 2022-02-10 | Abbott Laboratories | Improved methods and kits for detecting sars-cov-2 protein in a sample |
WO2022040466A1 (en) | 2020-08-20 | 2022-02-24 | Amgen Inc. | Antigen binding proteins with non-canonical disulfide in fab region |
AU2021331170A1 (en) | 2020-08-27 | 2023-03-23 | Juntendo Educational Foundation | Anti-cleaved mutant calr-cd3 bispecific antibody and pharmaceutical composition |
AU2021358033A1 (en) | 2020-10-07 | 2023-05-04 | Amgen Inc. | Rational selection of building blocks for the assembly of multispecific antibodies |
AU2021357841A1 (en) | 2020-10-08 | 2023-06-15 | Affimed Gmbh | Trispecific binders |
US12006550B2 (en) | 2020-10-12 | 2024-06-11 | University Of South Carolina | Targeting treatment for ADAM30 in pathological cells |
TW202225188A (zh) | 2020-11-06 | 2022-07-01 | 德商安美基研究(慕尼黑)公司 | 與cd3結合的多肽構建體 |
KR20230098334A (ko) | 2020-11-06 | 2023-07-03 | 암젠 리서치 (뮌헨) 게엠베하 | Cldn6 및 cd3에 선택적으로 결합하는 폴리펩디드 작제물 |
UY39508A (es) | 2020-11-06 | 2022-05-31 | Amgen Res Munich Gmbh | Moléculas de unión a antígeno biespecíficas con múltiples dianas de selectividad aumentada |
IL301926A (en) | 2020-11-06 | 2023-06-01 | Amgen Inc | Antigen binding domain with reduced cleavage rate |
MX2023005379A (es) | 2020-11-10 | 2023-05-23 | Amgen Inc | Enlazadores novedosos de dominios de union a antigenos multiespecificos. |
WO2023102384A1 (en) | 2021-11-30 | 2023-06-08 | Abbott Laboratories | Use of one or more biomarkers to determine traumatic brain injury (tbi) in a subject having received a head computerized tomography scan that is negative for a tbi |
WO2022119841A1 (en) | 2020-12-01 | 2022-06-09 | Abbott Laboratories | Use of one or more biomarkers to determine traumatic brain injury (tbi) in a subject having received a head computerized tomography scan that is negative for a tbi |
WO2022147147A1 (en) | 2020-12-30 | 2022-07-07 | Abbott Laboratories | Methods for determining sars-cov-2 antigen and anti-sars-cov-2 antibody in a sample |
KR20230156368A (ko) | 2021-03-12 | 2023-11-14 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | 중증 근무력증의 치료 또는 예방용의 의약 조성물 |
CA3212599A1 (en) | 2021-03-22 | 2022-09-29 | Novimmune S.A. | Bispecific antibodies targeting cd47 and pd-l1 and methods of use thereof |
US20220315655A1 (en) | 2021-03-22 | 2022-10-06 | Novimmune Sa | Bispecific antibodies targeting cd47 and pd-l1 and methods of use thereof |
MX2023011690A (es) | 2021-04-02 | 2023-12-15 | Amgen Inc | Construcciones de unión a mageb2. |
WO2022225921A1 (en) | 2021-04-20 | 2022-10-27 | Amgen Inc. | Balanced charge distribution in electrostatic steering of chain pairing in multi-specific and monovalent igg molecule assembly |
WO2022232376A1 (en) | 2021-04-29 | 2022-11-03 | Amgen Inc. | Methods for reducing low molecular weight species of recombinantly-produced proteins |
EP4334358A1 (en) | 2021-05-06 | 2024-03-13 | Amgen Research (Munich) GmbH | Cd20 and cd22 targeting antigen-binding molecules for use in proliferative diseases |
US20240262917A1 (en) | 2021-05-06 | 2024-08-08 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Antibodies against alk and methods of use thereof |
EP4341699A1 (en) | 2021-05-18 | 2024-03-27 | Abbott Laboratories | Methods of evaluating brain injury in a pediatric subject |
US20240118279A1 (en) | 2021-06-14 | 2024-04-11 | Abbott Laboratories | Methods of diagnosing or aiding in diagnosis of brain injury caused by acoustic energy, electromagnetic energy, an over pressurization wave, and/or blast wind |
IL308154A (en) | 2021-07-30 | 2023-12-01 | Affimed Gmbh | Double structure antibodies |
CA3230038A1 (en) | 2021-08-31 | 2023-03-09 | Hongwei Zhang | Methods and systems of diagnosing brain injury |
EP4406556A1 (en) | 2021-09-24 | 2024-07-31 | PhotoQ3 Inc. | Medicine for killing tumor cells |
AU2022354059A1 (en) | 2021-09-30 | 2024-03-28 | Abbott Laboratories | Methods and systems of diagnosing brain injury |
WO2023057871A1 (en) | 2021-10-04 | 2023-04-13 | Novartis Ag | Surfactant stabilizers |
WO2023058705A1 (ja) | 2021-10-08 | 2023-04-13 | 中外製薬株式会社 | 抗hla-dq2.5抗体の製剤 |
KR20240099407A (ko) | 2021-11-03 | 2024-06-28 | 아피메트 게엠베하 | 이중특이적 cd16a 결합제 |
MX2024005106A (es) | 2021-11-03 | 2024-07-02 | Affimed Gmbh | Ligandos biespecificos de cd16a. |
IL312538A (en) | 2021-11-05 | 2024-07-01 | Abviro Llc | Broadly reactive human monoclonal influenza antibodies and methods for their use |
AU2022396272A1 (en) | 2021-11-24 | 2024-06-06 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Antibodies against ctla-4 and methods of use thereof |
CA3239389A1 (en) | 2021-12-01 | 2023-06-08 | Kohei SOEDA | Method for preparing antibody-containing formulation |
CA3240822A1 (en) | 2021-12-17 | 2023-06-22 | Tony Lee | Systems and methods for determining uch-l1, gfap, and other biomarkers in blood samples |
CA3241407A1 (en) | 2021-12-17 | 2023-06-22 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Platform for antibody discovery |
CA3241395A1 (en) | 2021-12-17 | 2023-06-22 | Barbel SCHROFELBAUER | Antibodies and uses thereof |
US20230213536A1 (en) | 2021-12-28 | 2023-07-06 | Abbott Laboratories | Use of biomarkers to determine sub-acute traumatic brain injury (tbi) in a subject having received a head computerized tomography (ct) scan that is negative for a tbi or no head ct scan |
WO2023150652A1 (en) | 2022-02-04 | 2023-08-10 | Abbott Laboratories | Lateral flow methods, assays, and devices for detecting the presence or measuring the amount of ubiquitin carboxy-terminal hydrolase l1 and/or glial fibrillary acidic protein in a sample |
WO2023178357A1 (en) | 2022-03-18 | 2023-09-21 | Evolveimmune Therapeutics, Inc. | Bispecific antibody fusion molecules and methods of use thereof |
WO2023218027A1 (en) | 2022-05-12 | 2023-11-16 | Amgen Research (Munich) Gmbh | Multichain multitargeting bispecific antigen-binding molecules of increased selectivity |
WO2024006876A1 (en) | 2022-06-29 | 2024-01-04 | Abbott Laboratories | Magnetic point-of-care systems and assays for determining gfap in biological samples |
WO2024039670A1 (en) | 2022-08-15 | 2024-02-22 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Antibodies against cldn4 and methods of use thereof |
WO2024039672A2 (en) | 2022-08-15 | 2024-02-22 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Antibodies against msln and methods of use thereof |
TW202421650A (zh) | 2022-09-14 | 2024-06-01 | 美商安進公司 | 雙特異性分子穩定組成物 |
WO2024059708A1 (en) | 2022-09-15 | 2024-03-21 | Abbott Laboratories | Biomarkers and methods for differentiating between mild and supermild traumatic brain injury |
US20240254234A1 (en) | 2022-10-21 | 2024-08-01 | Novimmune Sa | PD-L1xCD28 BISPECIFIC ANTIBODIES FOR IMMUNE CHECKPOINT-DEPENDENT T CELL ACTIVATION |
WO2024173607A2 (en) | 2023-02-14 | 2024-08-22 | Evolveimmune Therapeutics, Inc. | Combination of bispecific antibodies and chimeric antigen receptor t cells for treatment |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE69133566T2 (de) * | 1990-01-12 | 2007-12-06 | Amgen Fremont Inc. | Bildung von xenogenen Antikörpern |
EP0814159B1 (en) * | 1990-08-29 | 2005-07-27 | GenPharm International, Inc. | Transgenic mice capable of producing heterologous antibodies |
GB9119338D0 (en) * | 1991-09-10 | 1991-10-23 | Inst Of Animal Physiology And | Control of gene expression |
JPH07508410A (ja) * | 1992-06-18 | 1995-09-21 | ジェンファーム インターナショナル インコーポレイテッド | 酵母人工染色体を有するトランスジェニック非ヒト動物の製造方法 |
-
1993
- 1993-07-23 EP EP93918332A patent/EP0652950B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-07-23 AT AT93918332T patent/ATE381614T1/de not_active IP Right Cessation
- 1993-07-23 WO PCT/US1993/006926 patent/WO1994002602A1/en active IP Right Grant
- 1993-07-23 ES ES93918332T patent/ES2301158T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1993-07-23 NZ NZ255101A patent/NZ255101A/xx not_active IP Right Cessation
- 1993-07-23 SG SG9601354A patent/SG48760A1/en unknown
- 1993-07-23 CA CA2140638A patent/CA2140638C/en not_active Expired - Fee Related
- 1993-07-23 AU AU47819/93A patent/AU675661B2/en not_active Ceased
- 1993-07-23 JP JP6504704A patent/JPH07509137A/ja active Pending
-
1995
- 1995-01-23 FI FI950277A patent/FI121339B/fi active IP Right Grant
- 1995-01-23 NO NO19950244A patent/NO328075B1/no not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-11-09 JP JP2006303644A patent/JP2007125020A/ja not_active Withdrawn
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
ES2301158T3 (es) | 2008-06-16 |
NO950244L (no) | 1995-03-23 |
EP0652950A4 (en) | 1997-05-07 |
JP2007125020A (ja) | 2007-05-24 |
FI121339B (fi) | 2010-10-15 |
FI950277A (fi) | 1995-03-21 |
AU4781993A (en) | 1994-02-14 |
ATE381614T1 (de) | 2008-01-15 |
NZ255101A (en) | 1997-08-22 |
JPH07509137A (ja) | 1995-10-12 |
EP0652950A1 (en) | 1995-05-17 |
SG48760A1 (en) | 2003-03-18 |
CA2140638A1 (en) | 1994-02-03 |
FI950277A0 (fi) | 1995-01-23 |
EP0652950B1 (en) | 2007-12-19 |
AU675661B2 (en) | 1997-02-13 |
WO1994002602A1 (en) | 1994-02-03 |
CA2140638C (en) | 2010-05-04 |
NO950244D0 (no) | 1995-01-23 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
NO328075B1 (no) | Fremgangsmate for fremstilling av en gjaercelle, en ikke-human pattedyrembryonisk ES celle, et kimaert ikke-humant pattedyr og et transgent ikke-humant pattedyr samt gjaercelle og isolert ikke-humant pattedyr ES celle. | |
US6114598A (en) | Generation of xenogeneic antibodies | |
US6162963A (en) | Generation of Xenogenetic antibodies | |
JP2009034106A (ja) | ヒト化免疫系を含むトランスジェニック動物 | |
WO1992022645A1 (en) | Transgenic immunodeficient non-human animals | |
US20040010810A1 (en) | Generation of xenogeneic antibodies | |
WO2021003152A1 (en) | Transgenic mammals and methods of use thereof | |
JP2008136494A (ja) | 異種抗体の生産 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |