KR20180018507A - 미토콘드리아 프로파일링에 의한 알보시딥에 대한 반응 예측 - Google Patents

미토콘드리아 프로파일링에 의한 알보시딥에 대한 반응 예측 Download PDF

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KR20180018507A
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cancer
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treatment
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스티븐 엘. 워너
데이비드 제이. 베알스
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톨레로 파마수티컬스, 인크.
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Abstract

본 개시내용은 알보시딥에 대한 환자의 반응을 예측하고 알보시딥을 환자에게 투여하는 의사의 결정을 가이드하는 데 유용한 진단 방법을 제공한다.

Description

미토콘드리아 프로파일링에 의한 알보시딥에 대한 반응 예측
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2015년 4월 20일에 출원된 미국 가출원 번호 62/150,138을 35 U.S.C. 119(e) 하에 우선권 주장하며, 이 가출원은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
기술 분야
본 개시내용은 일반적으로, 알보시딥-함유 요법(alvocidib-containing regimen)에 대한 반응의 가능도(likelihood)가 높은 환자에게 알보시딥-함유 요법을 수행(administration)하여 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 알보시딥-함유 치료 요법에 대한 환자의 반응을 예측하는 것을 포함한다.
표적 암 요법과 쌍을 이루는 예측 및 예후 바이오마커의 사용은 약물 개발 시간 단축, 약물 효능 개선 및 임상 결정을 가이드하는 열쇠를 쥐고 있을 수 있다. 암 치료에서의 발전이 있지만, 화학요법은 대체로 여전히 비효율적이며 효과가 없다. 화학요법의 일반적으로 열악한 성과에 대한 한 가지 이유는 선택한 치료가 종종 개개의 환자의 질환과 밀접하게 일치하지 않는다는 점이다. 정밀한 진단과 치료법을 결합시킨 개인맞춤형 의약(personalized medicine) 접근법은 이 문제를 완화시킬 수 있다.
지금까지 임상 종양학 실습에 가치를 더한 바이오마커는 소수에 불과하다. 부분적으로는 이 이유는 인식된 마커가 종종 약물 메커니즘에 상관관계가 있으나 인과 관계가 없기 때문이다. 비록 "바이오마커" 생물학이 동반 요법(companion therapy)의 약리학을 지지(line up)하더라도, 약물이 환자에서 어떻게 작용할 것인지를 예측하는 것은 여전히 중대한 도전 과제이다. 이 외에도, 임상 개발에 이르는 길은 시험의 가치를 보고 환자에게 이익을 가져다줄 수 있다고 여기는 의사-과학자들의 참여를 필요로 한다.
항-아폽토시스(anti-apoptotic) Bcl-2 패밀리 단백질은 화학요법에 대한 암세포 반응에 대한 중추적 원인 인자이다. 미토콘드리아 아폽토시스를 조정하는 데 있어서 이들 단백질의 기능성의 측정은 치료에 대한 암 환자 반응을 위한 예측 바이오마커를 제공하는 것으로 입증되었다. 많은 화학요법은 아폽토시스에 의존하여 효과적이며 일부 경우에 특이적 항-아폽토시스 단백질에 의한 아폽토시스의 조정은 특정한 요법에 대한 반응성과 상관관계가 있다. 그 다음에 특정한 단백질의 측정은 약물 반응을 위한 바이오마커를 제공한다. 따라서, 치료제에 대한 예상되는 반응을 결정하는 바이오마커는 계속 추구되고 있다.
따라서, 한 실시양태에서 본 개시내용은
a) 암 치료를 필요로 하는 환자의 골수로부터 얻은 암세포 표본에 대한 BH3 프로파일링(profiling) 데이터를 요청하는 것; 및
b) 상기 암세포 표본에서의 NOXA 프라이밍이 적어도 15%인 경우 알보시딥을 포함하는 치료 요법을 상기 환자에게 수행하는 것
을 포함하는, 암 치료를 필요로 하는 환자에서 암 치료 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은
a) 암 치료를 필요로 하는 환자의 골수로부터 얻은 암세포 표본에 대한 MCL-1 발현 데이터를 요청하는 것; 및
b) 상기 암세포 표본에서의 MCL-1 발현이 정상 세포에서의 MCL-1 발현의 적어도 1.1배인 경우 알보시딥을 포함하는 치료 요법을 상기 환자에게 수행하는 것
을 포함하는, 암 치료를 필요로 하는 환자에서 암 치료 방법에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은
환자의 골수로부터의 투과화된(permeabilized) 암세포 표본을 1종 이상의 BH3 도메인 펩티드와 접촉시키는 것;
상기 표본에서 NOXA 프라이밍을 결정하는 것; 및
상기 표본에서의 NOXA 프라이밍이 적어도 15%인 경우 환자를 알보시딥을 포함하는 치료 요법에 대한 가능성 반응자(likely responder)로 분류하는 것
을 포함하는, 알보시딥을 포함하는 치료 요법에 대한 환자의 반응 가능도를 결정하는 방법에 관한 것이다.
다른 관련 실시양태에서, 본 개시내용은
환자의 골수로부터의 암세포 표본에서 MCL-1 발현을 결정하는 것; 및
상기 표본에서의 MCL-1 발현이 정상 세포에서의 MCL-1 발현의 적어도 1.1배인 경우 환자를 알보시딥을 포함하는 치료 요법에 대한 가능성 반응자로서 분류하는 것을 포함하는, 알보시딥을 포함하는 치료 요법에 대한 환자의 반응 가능도를 결정하는 방법을 제공한다,
또 다른 측면에서, 본 발명은 환자 암세포의 BH3 프로파일링을 사용하여 아폽토시스 유발 단백질(pro-apoptotic protein)을 격리시키기 위해 MCL1 및 BFL1 단백질을 그의 기능 면에서 교란시키는 작용제에 대한 반응을 결정하는 것 및 환자의 하나 이상의 임상적 인자를 결정하는 것, 및 MCL1의 기능을 교란시키는 하나 이상의 암 치료법(cancer treatment)에 대한 임상 반응의 가능도에 대해 환자를 분류하는 것을 포함하는, 환자를 위한 암 치료법을 선택하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 및 본원에 나타낸 바와 같이, 환자 암 표본은 골수 흡인물로부터 정제된 암세포로 구성되어 있다. MCL1 또는 MCL1 및 BFL1에 대해 선택적인 BH3의 유일한 단백질 NOXA 또는 BH3 모방체를 포함하는 펩티드를 사용하여 결정된 바와 같이, 암세포는 아폽토시스 유발 단백질 Bim, Bid, Bax 또는 Bak에 결합하는 MCL1 또는 MCL1 및 BFL1을 선택적으로 교란시키는 작용제에 노출된다.
일부 실시양태에서, 및 본원에 나타낸 바와 같이, 골수 흡인물로부터 정제된 암세포로 구성된 환자 암 표본으로부터의 BH3 검정의 판독 정보(readout)와 말초 혈액으로부터의 BH3 프로파일링의 판독 정보를 비교한다. 상이한 판독 정보는 구별되는 치료 옵션에 대한 반응을 예측한다. 추가로, 환자 골수로부터 채취한 AML 세포에 대해 수행된 BH3 프로파일링은 FLAM 치료를 예측한 것으로 나타났으며 한편 말초 혈액으로부터의 AML 세포에 대한 BH3 프로파일링은 FLAM 치료가 아니라 7+3 치료를 예측한다.
일부 실시양태에서, 및 본원에 나타낸 바와 같이, 다양한 임상적 인자, 심지어 아폽토시스와 관련이 없는 것들 또는 관련이 있는 것으로 공지되지 않은 것들을, BH3 프로파일링의 예측력을 증가시키기 위해, 사용할 수 있어, 시험을 단순히 예후가 아닌 예측 시험으로 변환시킨다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 CDK-9 억제 화합물에 대한 백혈병 환자의 반응을 예측하는 진단 시험을 제공한다. 일부 측면에서, CDK-9 억제제는 플라보피리돌 (알보시딥)이다. 추가 측면에서, CDK-9 억제제는 치료 요법의 일부로서 1종 이상의 추가 화합물과 함께 공동 투여될 수 있다. 예를 들어, 요법은 ara-C 및 미톡산트론과 조합된 알보시딥 (FLAM)일 수 있다. 추가 변수는 검정 변수의 민감도를 증가시키는 것으로 간주될 수 있다. 예를 들어, 환자의 세포유전학적 프로파일 또는 상태 및/또는 연령을 예측 알고리즘의 인자로 포함시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 진단 시험은 BH3 펩티드 Noxa 또는 MCL1/Bfl-1 선택적 BH3 모방체 화합물 EU5346 (문헌 [D. Richard et al. Molecular Cancer Therapeutics, 2013]에 기재된 화합물 9)에 반응하여 미토콘드리아 막 전위의 변화를 측정하는 것을 포함하여, MCL1의 기능을 측정하는 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 환자의 투과화된 암세포를 1종 이상의 BH3 도메인 펩티드와 접촉시켜 프라이밍의 정도를 결정하는 것; 면역조직화학 및/또는 형광 제자리 부합법(fluorescent in situ hybridization) (FISH)에 의해 환자의 암세포의 하나 이상의 임상적 인자의 존재 또는 부재를 결정하는 것; 및 하나 이상의 암 치료법에 대한 임상 반응의 가능도에 대해 환자를 분류하는 것을 포함하는, 환자를 위한 암 치료법을 결정하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 골수로부터 수집된 환자의 AML 암세포 견본에 대한 BH3 프로파일을 결정하는 것; 환자의 하나 이상의 임상적 인자를 결정하는 것으로서, 여기서 하나 이상의 임상적 인자가 연령 프로파일 및/또는 세포유전학적 상태로부터 선택되는 것; 및 하나 이상의 암 치료법에 대한 임상 반응의 가능도에 대해 환자를 분류하는 것을 포함하는, 알보시딥 또는 FLAM 치료에 대한 AML 환자의 반응을 결정하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 골수로부터 수집된 환자의 AML 암세포 견본에 대한 BH3 프로파일을 결정하는 것; 환자의 하나 이상의 임상적 인자를 결정하는 것으로서, 여기서 하나 이상의 임상적 인자가 연령 프로파일 및/또는 세포유전학적 상태로부터 선택되는 것; 및 하나 이상의 암 치료법에 대한 임상 반응의 가능도에 대해 환자를 분류하는 것을 포함하는, 알보시딥 또는 FLAM 치료, 또는 시타라빈 기반 치료 단독에 대한 AML 환자의 반응을 결정하는 방법을 제공한다. 그 다음에 이 판독 정보를 말초 혈액 표본으로부터의 BH3 프로파일 판독 정도와 비교한다. 구체적으로 0.1 PM에서의 Bim BH3 펩티드의 BH3 프로파일 판독 정보는 알보시딥 없이 ara-C 기반 치료를 예측하는 것으로 나타났다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 골수로부터 수집된 환자의 AML 암세포 견본에 대한 BH3 프로파일을 결정하는 것; 환자의 하나 이상의 임상적 인자를 결정하는 것으로서, 여기서 하나 이상의 임상적 인자가 연령 프로파일 및/또는 세포유전학적 상태로부터 선택되는 것; 및 하나 이상의 암 치료법에 대한 임상 반응의 가능도에 대해 환자를 분류하는 것을 포함하는, (인터루킨-6) IL-6 길항 치료제, 및 또는 MCL1 선택적 BH3 모방체에 대한 AML 환자의 반응을 결정하는 방법을 제공한다. 그 다음에 이 판독 정보를 말초 혈액 표본으로부터의 BH3 프로파일 판독 정보와 비교한다.
본 발명의 실시양태의 세부 사항은 이하에 수반되는 설명에서 제시된다. 비록 본원에 기재된 것들과 유사한 또는 동등한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있지만, 예시적인 방법 및 물질이 이제 기재된다. 본 발명의 다른 특징, 목적 및 이점은 상세한 설명 및 청구범위로부터 명백해질 것이다. 명세서 및 첨부된 청구범위에서, 단수 형태는 또한 문맥이 달리 지시하지 않는 한 복수를 포함한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 과학 기술 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
추가로, 암세포의 생체내 상황은 MCL1 단백질이 암의 발병 및 유지에 관여하는 정도 및 MCL1 표적 요법의 효능에 영향을 미친다. 구체적으로, 골수의 간질에 있는 골수성 백혈병(myeloid leukemia) 및 골수종 세포는 말초 혈액에서 순환하는 것들보다 생존을 위해 MCL1에 더 의존한다. 추가로, 말초 혈액 샘플로부터의 BIM BH3 펩티드가 ara-c와 안트라시클린, 7+3에 대한 AML 환자의 반응과 상관관계가 있다는 것이 확립되어 있다. 그러나, 이 판독 정보도, 또는 말초 혈액 중 백혈병 세포로부터의 어떠한 BH3 프로파일링 판독 정보도 FLAM 또는 다른 MCL1 억제 요법에 대한 AML 환자의 반응을 예측하지 않는다.
BH3 프로파일링은 자체적으로 요법에 대한 화학민감성 또는 화학반응성의 일반적인 의미(general sense)를 제공하는 것으로 공지되어 있다. 그러나, 여기서, MCL1 단백질에 중점을 둔 메커니즘에 대한 구체적인 상관관계를 인식하면 치료에 영향을 주는 MCL1에 대한 환자의 반응을 예측하는 특유의 민감한 방법이 제공된다. 그러나 이것은 암세포가 골수의 간질로부터 단리될 때 특정 MCL1 표적 요법에서만 사실이다.
도 1A 내지 도 1E는 FLAM 요법으로 치료된 환자로부터 얻은 골수 샘플로부터의 대표적인 BH3 프로파일링 데이터를 나타낸다. 이 도면은 AML 환자로부터의 높게 프라이밍된(primed) 모세포(blast cell)와 낮게 프라이밍된 모세포의 패턴 차이를 나타낸다. 확인된 컷오프(cutoff)는 골수에서 NOXA 프라이밍에 대한 ROC 분석에 의해 이상적이었으며 약 10.7%였다. 패널 A-C는 보다 높은 NOXA 프라이밍을 나타내며 CR을 겪은 각각의 세포유전학적 위험 범주 (Fav-적합(favorable), adv-유해(adverse) 및 int-중간(intermediate))의 예를 나타낸다. 패널 D-E는 치료에 실패한 낮은 NOXA 프라이밍을 가진 중간 위험과 유해한 위험을 나타낸다.
도 2A 내지 도 2F는 모든 FLAM-처리 환자 표본에서 반응과의 수신자 작동자 채널(receiver operator channel) (ROC) 곡선 분석에 의한 BH3 펩티드 연관성(Association)을 나타낸다. 패널 A, C 및 E는 BAD, BIM 100 및 PUMA의 수신자 작동자 채널 (ROC) 곡선 분석을 세포유전학적 위험 인자 및 MDS 병력 임상 변수와 조합하여 나타낸다. 패널 B, D 및 F는 그렇지 않은 환자와 비교하여 CR에 도달한 환자에서 조합된 측정 지표(metric)로부터 각각의 환자 데이터 포인트를 도시하는 상응하는 도트 플롯(dot plot)을 나타낸다.
도 3A 내지 도 3C는 골수 유래 FLAM 치료 환자 표본에서의 반응과의 도트 블롯(Dot blot) 상관관계 분석에 의한 Noxa BH3 펩티드 연관성을 나타낸다. NOXA 프라이밍 단독은 골수 샘플에서 예측 값을 나타낸다. 패널 A 내지 패널 C는 모든 샘플 (A), 및 골수 (B) 또는 말초 혈액 (C)으로부터 채취한 것들에서 측정한 NOXA 프라이밍을 나타내는 도트 플롯을 나타낸다. 골수로부터 얻은 샘플은 말초 혈액에서 채취한 샘플에서는 보이지 않는, CR과 유의한 연관성을 나타낸다.
도 4A 내지 도 4D는 골수-유래 FLAM 치료 환자 표본에서 반응과의 수신자 작동자 채널 (ROC) 곡선 분석에 의한 Noxa BH3 펩티드 연관성을 나타낸다. 패널 A 및 B는 NOXA 펩티드 프라이밍의 수신자 작동자 채널 (ROC) 곡선 분석을 모든 샘플에서 세포유전학적 위험 인자 및 MDS 병력 임상 변수와 조합하여 나타낸다. 패널 C 및 D는 말초 혈액으로부터의 샘플이 아니라 골수로부터 채취한 샘플에서 동일한 것을 나타낸다. 세포유전학적 위험 인자와 MDS 병력의 추가는 시험의 예측력을 개선시키며, 여기서 세포유전학적 위험 인자와 MDS 병력과 함께 BM NOXA 프라이밍에서 AUC 값은 0.92이다.
도 5A 및 도 5B는 BIM 0.1 및 NOXA 프로파일링의 예를 나타낸다.
도 6은 치료를 받은 적이 없는 AML 환자에서 암 요법을 선택하기 위한 알고리즘을 확인하는 방법을 나타낸다. 상대적 IM 0.1 및 NOXA 프로파일링을 비교함으로써, 환자는 FLAM 요법, 7+3 요법에 배정될 수 있거나 둘 중 어느 요법에도 적합하지 않은 것으로 확인될 수 있다.
도 7A 및 도 7B는 알보시딥이 MV-4-11 세포에 대해 용량 및 시간 의존적 방식으로 발암(oncogenic) mRNA를 억제함을 나타내는 데이터를 제공한다.
도 8은 알보시딥이 A549 세포에 대해 용량 의존적 방식으로 발암 mRNA를 억제함을 나타내는 데이터이다.
도 9A 및 도 9B는 알보시딥이 세척 단계와 함께 (도 9A), 및 세척 단계 없이 (도 9B) 시간 의존적 방식으로 MCL-1의 발현을 억제함을 나타내는 겔이다.
도 10A 및 도 10B는 알보시딥이 MV-4-11 세포에 대해 용량 및 시간 의존적 방식으로 주요 발암 단백질을 억제함을 나타내는 추가 겔이다.
도 11은 알보시딥이 SK-N-AS 세포 (고형 종양, 신경모세포종)에 대해 시간 의존적 방식으로 N-Myc의 발현을 억제함을 도시한다.
도 12는 A549 세포에 대한 반복 투여 요법을 사용할 때 알보시딥이 시간 의존적 방식으로 발암 단백질의 발현을 억제함을 나타낸다.
도 13A-B는 알보시딥이 Panc-1 세포에 대해, 세척 단계와 함께 (도 13A), 및 세척 단계 없이 (도 13B) 시간 의존적 방식으로 발암 단백질의 발현을 억제함을 나타낸다.
도 14는 Panc-1 세포에 대한 반복 투여 요법을 사용할 때 알보시딥이 시간 의존적 방식으로 발암 단백질의 발현을 억제함을 나타낸다.
도 15A 및 도 15B는 알보시딥이 유겐(Yugen)8 세포에 대해, 세척 단계와 함께 (도 15A), 및 세척 단계 없이 (도 15B) 시간 의존적 방식으로 발암 단백질의 발현을 억제함을 나타낸다.
도 16은 유겐8 세포에 대한 반복 투여 요법을 사용할 때 알보시딥이 시간 의존적 방식으로 발암 단백질의 발현을 억제함을 나타낸다.
도 17A 및 도 17B는 ACM (또는 FLAM) 조합에서 사용될 때 알보시딥이 MCL-1을 억압함을 나타낸다. 처리 일정 (도 17A)뿐만 아니라 면역블롯팅으로부터의 결과 (도 17B)가 제공된다.
표 1은 FLAM 환자 연구이다. 전체 환자 요약을 표에 나타냈으며, 각각의 측정 지표에 대해 양성인 환자의 수가 각각의 값에 대해 이용 가능한 데이터를 가진 총수보다 많다.
표 2는 FLAM 치료 환자 요약 분석을 나타낸다. 표는 얻은 모든 샘플을 열거한다. 환자들은 3종의 상이한 다른 프로토콜 (J0669, J0856 및 J01101)에 등록되었고 주로 새로 진단된 AML 환자였다. 말초 혈액 또는 골수 흡인물로부터 샘플을 얻었다. 진단 당시 연령을 계산하였다. CALGB 지침을 사용하여 세포유전학적 위험 인자를 결정하였다. 세포유전학, FLT-3 및 NPM1 돌연변이 상태, MDS 병력, 화학요법 이력, 퍼센트 골수 모세포(percent bone marrow blast), 백혈구 (WBC) 수, 치료 및 반응을 모두 얻었다. 음영 처리된 회색 샘플은 BH3 프라이밍에 대해 성공적으로 검정되지 않았으며 모든 후속 분석 (MRD-최소 잔존 질환, TF-치료 실패, PR-부분 반응, CR-완전 관해)에서 제외되었다.
표 3은 FLAM 반응과의 임상 특성 연관성을 나타낸다. 임상 변수의 통계 분석은 반응에 대해 수행하였다. 명시된 측정 지표 각각은 순위-합(rank-sum) 만-위트니 검정(Mann-Whitney test) 및 로지스틱 회귀(Logistic Regression) 분석에 의해 유의성에 대해 시험하였다. AUC (곡선하 면적)는 ROC 곡선 분석으로부터 얻었다.
표 4는 FLAM 환자 연구로부터의 BH3 프로파일링 데이터를 나타낸다. BH3 프로파일링은 표 2에 열거된 모든 환자 샘플에서 수행하였다. 음영 처리된 회색인 줄(row)은 프로세싱 동안에 BH3 프로파일링의 허용 기준을 충족하지 못한 샘플이다. 대시 (-)를 함유하는 임의의 세포는 명시된 샘플에 대한 각각의 BH3 펩티드 검정을 수행하기에 충분한 세포를 갖지 않았다. 신호 대 잡음은 CCCP JC-1 판독 MFI에 대한 DMSO JC-1 적색 평균 형광 강도(mean fluorescence intensity) (MFI)의 척도이다. 세포 수(cell count)와 퍼센트 생존율(percent viability)은 트립판 블루 배제에 의해 수동 세포 계수(manual cell counting)하여 결정하였다. 퍼센트 모세포(percent blast)는 CD45-dim, CD3/CD20 음성, 및 투과화된 생존 세포의 SSC-low의 백분율이다. 게이팅된(gated) 모세포에서 모든 BH3 프로파일링을 수행하였다.
표 5는 CR과의 개개의 BH3 펩티드 프로파일의 연관성을 나타낸다. BH 펩티드의 통계 분석은 반응에 대해 수행하였는데, CR 샘플이 모든 부분 반응, 최소 잔존 질환 및 치료 실패 (NR-무반응자(non-responder))와 비교되었다. 명시된 측정 지표 각각은 순위-합 만-위트니 순위 검정 및 로지스틱 회귀 분석에 의해 유의성에 대해 시험하였다. AUC (곡선하 면적)는 ROC 곡선 분석으로부터 얻었다.
표 6은 FLAM 연구에서 다른 임상 변수와 BH3 펩티드 프로파일링의 다변량 분석을 나타낸다. BH3 펩티드의 통계 분석은 반응에 대해 수행하였는데, NR 샘플이 CR 샘플과 비교되었다. 변수의 조합은 로지스틱 회귀 모델 하에 계수 및 상수를 결정하기 위해 로지스틱 회귀를 사용하여 시험한 다음에, 이들 계수 및 상수를 순위-합 만-위트니 시험 및 ROC 곡선 분석에 의해 시험하였다.
표 7은 골수 샘플에서 CR과의 개개의 BH3 펩티드 프로파일의 연관성을 나타낸다. BH3 펩티드의 통계 분석은 표 5에서 행해진 바와 같이 골수로부터 얻은 그러한 샘플에서만 수행하였다. 명시된 측정 지표 각각을 순위-합 만-위트니 검정 및 로지스틱 회귀 분석에 의해 유의성에 대해 시험하였다. AUC (곡선하면적)는 ROC 곡선 분석으로부터 얻었다. 이 분석은 무반응자와 비교하여 치료에 반응한 환자에서 NOXA 프라이밍이 유의하게 높다는 것을 밝힌다.
표 8은 BH3 펩티드의 통계 분석을 골수로부터 얻은 모든 샘플에서만 수행하였음을 나타낸다. BH3 펩티드의 통계 분석은 표 6에서 행해진 바와 같이 골수로부터 얻은 그러한 샘플에서만 수행하였다. 변수의 조합은 로지스틱 회귀 모델 하에 계수 및 상수를 결정하기 위해 로지스틱 회귀를 사용하여 시험한 다음에, 이들 계수 및 상수를 순위-합 만-위트니 시험 및 ROC 곡선 분석에 의해 시험하였다. 이 분석은 BAD, BIM 100 및 PUMA의 조합이 골수 샘플 단독에서만의 반응과 연관이 있음을 나타낸다. NOXA 둘 다 및 3종의 펩티드 판독 정보는 세포유전학적 위험 범주 및 MDS 병력에 부가적이며 더 높은 유의성 및 AUC 값을 결과한다.
본 개시내용은 BH3 프로파일링 검정의 의학적 유용성이 환자 골수 흡인물로부터 독점적으로 수집된 암세포에서의 반응을 측정함으로써 CDK-9 억제제 (예를 들어 알보시딥) 단독에 대한 또는 공동 치료 요법에서 반응을 예측하기 위해 실현될 수 있다는 발견에, 부분적으로, 기반하고 있다. BH3 프로파일링 측정의 민감도 및/또는 특이성은 말초 혈액 또는 말초 혈액 샘플과 골수 샘플의 조합으로부터 수집된 혈액에 비해 유의하게 개선된다. 동일한 환자의 말초 혈액 샘플과 비교하여 골수로부터 독점적으로 샘플을 채취하였을 때 Noxa 생성 신호의 상관관계의 극적인 개선이 일어나서 0.445 p-값이 0.0007로 개선되었음이 보여졌다. (표 6 및 표 7). 검정의 민감도는 임상 변수, 세포유전학 및 연령을 분석의 인자로 포함시켰을 때 0.805 (AUC)에서 0.91 (AUC)로 개선되었다.
본원에 기재된 진단 접근법은 MCL1 교란 요법(perturbing therapy)에 대한 반응을 예측하는 새로운 방법을 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 골수로부터 독점적으로 수집된 환자의 종양 또는 암 세포 견본에서 MCL1 의존성의 정도를 결정하는 것; 환자의 하나 이상의 임상적 인자를 결정하는 것, 및 하나 이상의 암 치료법에 대한 임상 반응의 가능도에 대해 환자를 분류하는 것을 포함하는 것으로서; 여기서 하나 이상의 임상적 인자가 임상 반응과의 연관을 위해 MCL1 특이적 BH3 프로파일 판독 정보의 특이성 및/또는 민감도를 증가시키도록 선택되는 것인, 환자를 위한 암 치료법을 결정하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 환자의 투과화된 암세포를 Noxa BH3 도메인 펩티드와 접촉시켜 프라이밍의 정도를 결정하는 것; 면역조직화학 및/또는 형광 제자리 부합법 (FISH)에 의해 환자의 암세포의 하나 이상의 임상적 인자의 존재 또는 부재를 결정하는 것; 및 하나 이상의 암 치료법에 대한 임상 반응의 가능도에 대해 환자를 분류하는 것을 포함하는, 환자를 위한 암 치료법을 결정하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 골수 또는 말초 혈액으로부터 채취한 환자의 AML 암세포 견본에 대한 BH3 프로파일을 결정하는 것; 그러한 두 가지 암세포 공급원으로부터의 판독 정보를 비교하고 그 정보를 사용하여 FLAM 또는 시타라빈 기반 치료를 가이드하는 것을 포함하는, 시타라빈 및/또는 FLAM에 대한 AML 환자의 반응을 결정하는 방법을 제공한다,
다양한 실시양태에서, 임상적 인자는 연령, 세포유전학적 상태, 수행(performance), 조직학적 서브클래스(subclass), 성별, 및 질환 단계 중 하나 이상이다. 또 다른 실시양태에서, 방법은 돌연변이 상태, 단일 뉴클레오티드 다형태, 정상 상태 단백질 수준 및 동적 특이성 단백질 수준으로부터 선택된 추가 바이오마커의 측정을 추가로 포함하며, 이는 시험에 추가 특이성 및/또는 민감도를 부가할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 방법은 환자에서 임상 반응을 예측하는 것을 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 임상 반응은 적어도 약 1, 약 2, 약 3, 또는 약 5년 진행/무사건 생존율(event-free survival)이다.
특정 실시양태에서, 프라이밍은 하기 수학식에 의해 정의되며: 여기서 AUC는 곡선하 면적 또는 신호 강도를 포함하며; DMSO는 기준선 음성 대조군을 포함하며; CCCP (카르보닐 시아나이드 m-클로로페닐 히드라존)는 미토콘드리아에서의 전자전달계(electron transport chain)에서 전자 운반체의 정상적인 활성 동안에 확립된 양성자 구배의 짝풀기제(uncoupling agent)로서 작용함으로써 단백질 합성의 이펙터를 포함하며 기준선 양성 대조군을 포함한다. 일부 실시양태에서, 곡선하 면적은 균질 시간 분해 형광(homogenous time-resolved fluorescence) (HTRF)에 의해 확립된다. 일부 실시양태에서, 시간은 약 0 내지 약 300분에서 약 0 내지 약 30분 사이의 시간대(window)에 걸쳐 발생한다. 일부 실시양태에서, 곡선하 면적은 형광 활성화 세포 분류(fluorescence activated cell sorting) (FACS)에 의해 확립된다. 일부 실시양태에서, 신호 강도는 약 5분 내지 약 300분 사이에 발생하는 단일 시점 측정이다.
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예시적 임상 결정
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은, 예를 들어, 진단, 예후, 및 치료에 대한 반응을 평가하기 위해 환자 평가에 유용하다. 다양한 측면에서, 본 발명은 종양 또는 혈액암(hematological cancer)을 평가하는 것을 포함한다. 다양한 실시양태에서, 평가는 진단, 예후, 및 치료에 대한 반응으로부터 선택할 수 있다.
진단은 예를 들어 암과 같은 가능한 질환 또는 장애를 결정하거나 확인하려고 시도하는 과정을 지칭한다. 예후는 예를 들어 암과 같은 질환 또는 장애의 가능한 결과를 예측하는 것을 지칭한다. 완전한 예후는 종종 예상되는 지속 기간, 기능, 및 질환 경과에 대한 설명, 예컨대 점진적 쇠퇴, 간헐적 위기, 또는 갑작스런 예측할 수 없는 위기를 포함한다. 치료에 대한 반응은 치료를 받을 때 환자의 의학적 결과의 예측이다. 치료에 대한 반응은 비제한적인 예로서 병리학적 완전 반응, 생존, 및 무진행 생존, 진행 시간, 재발 확률일 수 있다.
다양한 실시양태에서, 본 방법은 환자가 특정 치료를 받을 지 여부에 관한 임상 결정을 지시한다. 한 실시양태에서, 본 방법은 네오아주반트(neoadjuvant) 및/또는 아주반트 화학요법에 대한 긍정적 반응 또는 네오아주반트 및/또는 아주반트 화학요법에 대한 무반응성(non-responsiveness)을 예측한다. 한 실시양태에서, 본 방법은 아폽토시스 유발제(pro-apoptotic agent) 또는 아폽토시스를 통해 작동하는 작용제 및/또는 아폽토시스를 통해 작동하지 않는 작용제에 대한 긍정적인 반응 또는 아폽토시스 이펙터 작용제 및/또는 아폽토시스를 통해 작동하지 않는 작용제에 대한 무반응성을 예측한다. 다양한 실시양태에서, 본 발명은 예를 들어, 어떤 유형의 치료가 수행되거나 보류되어야 하는지를 포함하여, 암 환자의 치료를 지시한다.
한 실시양태에서, 본 방법은 환자가 단일 단독 아주반트 요법을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 일차, 주요 또는 초기 치료 후에 아주반트 요법을 받을 지 여부에 관한 임상 결정을 지시한다. 아주반트 케어(adjuvant care)라고도 칭해지는 아주반트 요법은 일차, 주요 또는 초기 치료에 더하여 주어지는 치료이다. 비제한적인 예로서, 아주반트 요법은 모든 검출 가능한 질환이 제거되었지만 잠재 질환으로 인해 재발의 통계적 위험이 남아있는 수술 후 통상 주어지는 부가적인 치료일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 방법은 아주반트 요법을 포함하는 환자의 치료를 지시한다. 예를 들어, 특정 치료에 반응하도록 점수가 매겨지는 환자는 아주반트 요법과 같은 치료를 받을 수 있다. 추가로, 본 방법은 비제한적인 예로, 아폽토시스 유발 방식으로 유도 및/또는 작동하는 치료로서 또는 그렇지 않은 치료로서의 아주반트 요법의 정체성(identity)을 지시한다. 한 실시양태에서, 본 방법은 환자가 특정 치료에 반응이 없거나 덜 반응할 것이며 따라서 이러한 환자는 아주반트 요법으로서 이러한 치료를 받을 수 없다는 것을 명시할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 방법은 환자의 가능한 반응에 따라 아주반트 요법을 제공하거나 보류하도록 제공한다. 이러한 방식으로, 환자의 삶의 질과 치료 비용이 개선될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 방법은 환자가 특정 유형의 치료를 받아야 하는 지에 관한 임상 결정을 지시한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 방법은 환자 치료를 위한 안내 시험이다.
일부 실시양태에서, 본 방법은 환자가 특정한 치료를 받아야 할 가능한 반응에 대한 정보를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 반응의 높은 가능도를 제공하며 적극적인 치료를 포함한 치료를 지시할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 반응의 낮은 가능도를 제공하며 더 나은 삶의 질을 위한 효과 없는 화학요법으로부터의 불필요한 독성을 피하기 위해, 완화 치료(palliative care)의 사용, 및 적극적인 치료를 포함한 치료의 중단을 지시할 수 있다.
예시적 실시양태에서, 본 방법은 특정 치료에 대한 반응의 가능도를 명시할 것이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 방법은 아폽토시스 유발제 및/또는 아폽토시스를 통해 작동하는 작용제 및/또는 직접적인 단백질 조정에 의해 유도되는 아폽토시스를 통해 작동하는 작용제에 대한 반응의 높거나 낮은 가능도를 명시한다. 다양한 실시양태에서, 예시적 아폽토시스 유발제 및/또는 아폽토시스를 통해 작동하는 작용제 및/또는 직접적인 단백질 조정에 의해 유도되는 아폽토시스를 통해 작동하는 작용제는 ABT-263 (나비토클락스(Navitoclax)), 및 오바토클락스, WEP, 보르테조밉, 및 카르필조밉을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 아폽토시스를 통해 작동하지 않는 작용제 및/또는 직접적인 단백질 조정에 의해 유도되는 아폽토시스를 통해 작동하지 않는 작용제에 반응의 높거나 낮은 가능도를 명시한다. 다양한 실시양태에서, 아폽토시스를 통해 작동하지 않는 예시적 작용제는 키네신 스핀들 단백질 억제제, 시클린-의존적 키나제 억제제, 삼산화비소 (트리세녹스(TRISENOX), MEK 억제제, 포몰리도미드, 아자시티딘, 데시티빈, 보리노스타트, 엔티노스타트, 디나시클립, 겜투주맙, BTK 억제제, PI3 키나제 델타 억제제, 레놀리디미드, 안트라시클린, 시타라빈, 멜팔람, Akt 억제제, mTOR 억제제를 포함한다.
예시적 실시양태에서, 본 방법은 환자가 암 치료를 위해 아폽토시스 유발제 또한 아폽토시스를 통해 작동하는 작용제를 받을 지 여부를 명시할 것이다. 또 다른 예시적 실시양태에서, 본 방법은 환자가 아폽토시스를 통해 작동하지 않는 작용제를 받을 지 여부를 명시할 것이다.
구체적 실시양태에서, 본 방법은 본원에 기재된 치료법 (작용제 포함) 중 임의의 것에 대한 암 환자의 반응을 예측하는 데 유용하다. 예시적 실시양태에서, 본 발명은 시타라빈 및 아자시티딘에 대한 AML 환자의 반응 가능도를 예측하고, 환자의 BH3 프로파일, 연령 프로파일 및 세포유전학적 인자의 평가를 포함한다.
다양한 실시양태에서, 암 치료법은 본원에 기재된 방법에 기반으로 수행되거나 보류된다. 예시적 치료는 외과적 절제술, 방사선 요법 (방사선증감제로서, 또는 방사선증감제와 조합하여, 본원에 기재된 바와 같은 화합물의 사용을 포함), 화학요법, 약역학적 요법, 표적 요법, 면역 요법, 및 지지 요법 (예를 들어, 진통제, 이뇨제, 항이뇨제, 항바이러스제, 항생제, 영양 보충제, 빈혈 치료제, 혈액 응고 치료제, 뼈 치료제, 및 정신의학적 및 및 심리 치료제)을 포함한다.
다양한 다른 실시양태에서, 본 발명은
a) 암 치료를 필요로 하는 환자의 골수로부터 얻은 암세포 표본에 대한 BH3 프로파일링 데이터를 요청하는 것; 및
b) 상기 암세포 표본에서의 NOXA 프라이밍이 적어도 15%인 경우 알보시딥을 포함하는 치료 요법을 상기 환자에게 수행하는 것
를 포함하는, 암 치료를 필요로 하는 환자에서 암 치료 방법에 관한 것이다.
전술한 내용의 일부 실시양태에서, 치료 요법은 암세포 표본에서의 NOXA 프라이밍이 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35% 또는 적어도 40%인 경우에만 환자에게 수행된다.
또 다른 실시양태에서, 알보시딥-함유 요법을 사용한 치료에 대한 환자의 적합성을 결정하는 데 암세포 표본에서의 MCL-1 발현을 또한 사용하며, 상기 방법은 암세포 표본으로부터 얻은 MCL-1 발현 데이터를 요청하는 것, 및 상기 암세포 표본에서의 MCL-1 발현이 정상 세포에서의 MCL-1 발현의 적어도 1.1배인 경우에만 치료 요법을 환자에게 수행하는 것을 추가로 포함한다. 추가 실시양태에서, 치료 요법은 암세포 표본에서의 MCL-1 발현이 정상 세포에서의 MCL-1 발현의 적어도 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배 또는 심지어 10배인 경우에만 환자에게 수행된다.
또 다른 실시양태에서, 치료 요법은 환자의 세포유전학이 위험이 높은 경우에만 환자에게 수행된다.
전술한 내용의 또 다른 실시양태에서, 치료 요법은 환자가 골수형성이상 증후군 (MDS)의 이전 병력을 가진 경우에만 환자에게 수행된다.
전술한 내용의 또 다른 실시양태에서, BH3 프로파일링 데이터는 암세포 표본을 투과화하는 것, 상기 투과화된 세포를 1종 이상의 BH3 도메인 펩티드와 접촉시 미토콘드리아 막 전위의 변화를 결정하는 것; 및 아폽토시스를 유도하는 화학요법제에 대한 세포의 화학민감성과 미토콘드리아 막 전위의 손실 사이의 상관관계를 입증하는 것을 포함하는 방법으로부터 얻는다.
더 예시적 실시양태에서, BH3 도메인 펩티드는 BIM, BIM2A, BAD, BID, HRK, PUMA, NOXA, BMF, BIK 또는 PUMA2A, 또는 그의 조합물이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서 BH3 도메인 펩티드는 0.1 μM 내지 200 μM 범위의 농도로 사용된다.
또 다른 실시양태에서, MCL-1 발현은 알보시딥-함유 요법을 사용한 치료에 대한 환자의 적합성을 결정하기 위한 주요한 가이드이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서 본 발명은
a) 암 치료를 필요로 하는 환자의 골수로부터 얻은 암세포 표본에 대한 MCL-1 발현 데이터를 요청하는 것; 및
b) 상기 암세포 표본에서의 MCL-1 발현이 정상 세포에서의 MCL-1 발현의 적어도 1.1배인 경우 알보시딥을 포함하는 치료 요법을 상기 환자에게 수행하는 것
를 포함하는, 암 치료를 필요로 하는 환자에서 암 치료 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 암세포는 종양 세포이다.
전술한 내용의 다른 실시양태에서, 치료 요법은 암세포 표본에서의 MCL-1 발현이 정상 세포에서의 MCL-1 발현의 적어도 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배 또는 심지어 10배인 경우에만 환자에게 수행된다.
또 다른 실시양태에서, NOXA 프라이밍은 MCL-1 발현과 함께 고려되며, 상기 방법은 암세포 표본에 대한 BH3 프로파일링을 요청하는 것 및 종양 또는 암 세포 표본에서의 NOXA 프라이밍이 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35% 또는 적어도 40%인 경우에만 치료 요법을 수행하는 것을 추가로 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 치료 요법은 환자의 세포유전학이 위험이 높은 경우에만 환자에게 수행된다. 다른 실시양태에서, 치료 요법은 환자가 골수형성이상 증후군 (MDS)의 이전 병력을 가진 경우에만 환자에게 수행된다.
전술한 치료 방법 중 어느 한 방법에서, 암은 혈액암(hematologic cancer)이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서 혈액암은 급성 골수성 백혈병(acute myelogenous leukemia) (AML), 다발성 골수종, 여포성 림프종, 급성 림프모구성 백혈병(acute lymphoblastic leukemia) (ALL), 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia), 및 비호지킨 림프종으로부터 선택된다. 일부 구체적 실시양태에서, 혈액암은 급성 골수성 백혈병 (AML)이다.
전술한 내용의 일부 다른 실시양태에서, 혈액암은 골수형성이상 증후군 (MDS)이다. 전술한 내용의 상이한 실시양태에서, 혈액암은 만성 림프구성 백혈병 (CLL)이다.
전술한 실시양태 중 어느 한 다른 실시양태에서, 알보시딥을 포함하는 치료 요법은 알보시딥, 시타라빈, 및 미톡산트론 (FLAM)을 포함한다.
전술한 내용의 또 다른 실시양태에서, 암세포 표본은 비고형 종양의 생검으로부터 유래된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서 암세포 표본은 다발성 골수종, 급성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프형성 백혈병(chronic lymphogenous leukemia), 외투 세포 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종 또는 비호지킨 림프종을 가진 환자의 생검으로부터 유래된다.
또 다른 실시양태에서, 암세포 표본은 고체 매트릭스 또는 비드에 결합된 항-CD138 항체를 가진 생검 샘플로부터의 선택에 의해 보강되는(enriched) 다발성 골수종 세포이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서 암세포 표본은 CD45-지시된 항체에 결합함으로써 보강되는 급성 골수성 백혈병 세포이다. 다른 실시양태에서, 암세포 표본은 비(non)-B 세포 고갈에 의해 보강되는 만성 림프형성 백혈병 또는 미만성 거대 B 세포 림프종이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은
환자의 골수로부터의 투과화된 암세포 표본을 1종 이상의 BH3 도메인 펩티드와 접촉시키는 것;
상기 표본에서 NOXA 프라이밍을 결정하는 것; 및
상기 표본에서의 NOXA 프라이밍이 적어도 15%인 경우 환자를 알보시딥을 포함하는 치료 요법에 대한 가능성 반응자로서 분류하는 것
을 포함하는, 알보시딥을 포함하는 치료 요법에 대한 환자의 반응 가능도를 결정하는 방법에 관한 것이다.
"가능성 반응자"는 치료에 적합하게 반응할 확률이 50% 초과인 (예를 들어, 부분 또는 완전 관해) 환자이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은
환자의 골수로부터의 암세포 표본에서 MCL-1 발현을 결정하는 것; 및
상기 표본에서의 MCL-1 발현이 정상 세포에서의 MCL-1 발현의 적어도 1.1배인 경우 환자를 알보시딥을 포함하는 치료 요법에 대한 가능성 반응자로서 분류하는 것
을 포함하는, 알보시딥을 포함하는 치료 요법에 대한 환자의 반응 가능도를 결정하는 방법을 제공한다.
전술한 내용의 추가 실시양태에서, 방법은 치료 요법을 가능성 반응자로서 분류된 환자에게 수행하는 것을 추가로 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 치료전(pre-treatment) AML 환자에서 암 치료 전략을 선택하는 방법으로서, 상기 방법이
(a) 환자의 골수 (BM) 샘플에서 NOXA 프라이밍을 결정하는 검사의 결과를 요청하는 것;
(b) 환자의 말초 혈액 (PB) 샘플에서 BIM 0.1 프라이밍을 결정하는 검사의 결과를 요청하는 것;
(c) NOXA 프라이밍을 BIM 0.1 프라이밍과 비교하는 것; 및
(i) 알보시딥-함유 요법 (예를 들어, FLAM)을 BM NOXA > 10.8%이고 BM/PB BIM 0.1 <35%인 환자에게 수행하는 것;
(ii) 7+3 요법을 BM NOXA >10.8%이고 BM/PB BIM 0.1 > 15%인 환자에게 수행하는 것;
(ii) 7+3 요법을 BM NOXA <10.8%이고 BM / PB BIM 0.1> 35%인 환자에게 수행하는 것; 또는
(iv) BM NOXA < 10.8%이고 BM/PB BIM 0.1 < 15%인 환자에게 또 다른 요법을 수행하는 것
을 포함하는 방법에 관한 것이다.
예시적 치료
예시적 실시양태에서, 본 발명은 치료 작용제를 선택한다. 이러한 작용제의 예는 항암 약물, 화학요법, 수술, 아주반트 요법, 및 네오아주반트 요법 중 하나 이상을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 한 실시양태에서, 암 치료법은 BH3 모방체, 후성적 변형제(epigenetic modifying agent), 국소이성화효소(topoisomerase) 억제제, 시클린-의존적 키나제 억제제, 및 키네신-스핀들 단백질 안정화제 중 하나 이상이다. 또 다른 실시양태에서, 암 치료법은 프로테아좀 억제제; 및/또는 세포 주기 조절의 조정제 (비제한적인 예로, 시클린 의존적 키나제 억제제); 및/또는 세포 후성적 메커니즘의 조정제 (비제한적인 예로, 히스톤 데아세틸라제 (HDAC) (예를 들어 보리노스타트 또는 엔티노스타트 중 하나 이상), 아자시티딘, 데시타빈 중 하나 이상); 및/또는 안트라시클린 또는 안트라센디온 (비제한적인 예로, 에피루비신, 독소루비신, 미톡산트론, 다우노루비신, 이다루비신 중 하나 이상); 및/또는 백금-기반 치료제 (비제한적인 예로, 카르보플라틴, 시스플라틴, 및 옥살리플라틴 중 하나 이상); 시타라빈 또는 시타라빈-기반 화학요법; BH3 모방체 (비제한적인 예로, BCL2, BCLXL, 또는 MCL1 중 하나 이상); 및 MCL1의 억제제이다.
다양한 실시양태에서, 본 발명은 미국 특허 공개 번호 US2002-0225851 및 국제 특허 공개 번호 WO 2012/122370에 기재된 것들을 포함하나 이에 제한되지는 않은, 암 치료법에 관한 것으로, 이들 특허 공개의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
다양한 실시양태에서, 본 발명은 하나 이상의 알킬화제 예컨대 티오테파 및 시톡산(CYTOXAN) 시클로포스파미드; 알킬 술포네이트 예컨대 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘 예컨대 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파, 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸아멜라민, 예를 들어 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸롤로멜라민; 아세토게닌 (예를 들어, 불라탁신 및 불라탁시논); 캄포테신 (합성 유사체 토포테칸 포함); 브리오스타틴; 콜리 스타틴(cally statin); CC-1065 (그의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 크립토피신 (예를 들어, 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 두오카르마이신 (합성 유사체, KW-2189 및 CB 1-TM1 포함); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕틴; 스폰기스타틴; 질소 머스터드 예컨대 클로르암부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로르에타민, 메클로르에타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰시친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스터드; 니트로스우레아 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 및 라니무스틴; 항생제 예컨대 에네딘 항생제 (예를 들어, 칼리키아미신, 특별히 칼리키아미신 감말(gammall) 및 칼리키아마이신 오메갈(omegall) (예를 들어 문헌 [Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)] 참조); 디네미신, 예를 들어 디네미신 A; 비스포스포네이트, 예컨대 클로드로네이트; 에스페라미신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 색소단백질 에네딘 항생제 발색단), 아클라시노미신, 액티노마이신, 오트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카미노마이신, 카르지필린, 크로모마이시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 아드리아마이신(ADRIAMYCIN) 독소루비신 (모르폴리노-독소루비신, 시아노모를폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시 독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신 예컨대 미토마이신 C, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항대사산물 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 푸린 유사체 예컨대 플루다라빈, 6-메르캅토푸린, 티아미프린, 티오구아닌; 피림딘 유사체 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플로스우리딘; 안드로겐 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-아드레날 예컨대 미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충제 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드 예컨대 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 록소산트론; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK 폴리사카라이드 복합체 (JHS 내추럴 프로덕츠(Natural Products), 오레곤주 유진); 라족산; 리족신; 시조푸란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (예를 들어, T-2 톡신, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 마노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 시클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들어, 탁솔(TAXOL) 파클리탁셀 (브리스톨-마이어스 스퀴브 온콜로지(Bristol-Myers Squibb Oncology), 뉴저지주 프린스턴), 파클리탁셀의 아브락산(ABRAXANE) 무-크레모포르(Cremophor-free), 알부민-조작된(engineered) 나노입자 제제 (아메리칸 파마슈티컬 파트너즈(American Pharmaceutical Partners), 샤움베르크, 111.), 및 탁소테레(TAXOTERE) 독세탁셀 (롱-프랑 로라(Rhone-Poulenc Rorer), 프랑스 앙또니); 클로르안부실; 겜자르(GEMZAR) 겜시타빈; 6-티오구아닌; 메르캅토푸린; 메토트렉세이트; 백금 유사체 예컨대 시스플라틴, 옥살리플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴; 나벨빈(NAVELBINE). 비노르엘빈; 노반트론; 테니폽시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 크셀로다; 이반드로네이트; 이리노테칸 (캄프토사르(Camptosar), CPT-11) (5-FU 및 류코보린과의 이리노테칸의 치료 요법 포함); 국소이성화효소 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드 예컨대 레티노산; 카페시타빈; 콤브레타스타틴; 류코보린 (LV); 옥살리플라틴, 예를 들어 옥살리플라틴 치료 요법 (FOLFOX); 라파티닙 (티케르브(Tykerb)); PKC-I, Raf, H-Ras, EGFR (예를 들어, 에를로티닙 (타르세바(Tarceva)) 및 VEGF-A의 억제제 (세포 증식을 감소시킴), 다코겐, 벨케이트, 및 상기 내용 중 어느 하나의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체을 포함하나 이에 제한되지는 않는 암 치료법에 관한 것이다.
예시적 검출 방법
다양한 실시양태에서, 본 방법은 단백질 및/또는 핵산의 존재, 부재 또는 수준을 평가하는 것을 포함한다. 다양한 실시양태에서, 본 방법은 BH3 프로파일링의 특이성 및/또는 민감도를 향상시킬 수 있는 단백질 및/또는 핵산의 존재, 부재 또는 수준을 평가하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 평가는 환자의 반응에 대한 마커이다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 면역조직화학적 염색, 웨스턴 블롯팅, 인 셀 웨스턴 (in cell western), 면역형광 염색, ELISA, 및 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 중 하나 이상, 또는 본원에 기재되거나 관련 기술분야에 공지된 임의의 다른 방법을 사용하여 측정하는 것을 포함한다. 본 방법은 조직 또는 체액에 특이적이고 암의 상태를 나타내는 에피토프를 확인하기 위해 항체를 종양 표본 (생검 또는 조직 또는 체액)과 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다.
일반적으로 체액 또는 조직의 항원에서 에피토프의 검출에 사용되는 두 가지 전략인, 직접 방법 및 간접 방법이 있다. 직접 방법은 원-스텝 염색을 포함하며, 체액 또는 조직 샘플에서 항원과 직접 반응하는 표지된 항체 (예를 들어 FITC 접합 항혈청)를 포함할 수 있다. 간접 방법은 체액 또는 조직 항원과 반응하는 표지되지 않은 1차 항체, 및 1차 항체와 반응하는 표지된 2차 항체를 포함한다. 표지는 방사능 표지, 형광 표지, 합텐 표지 예컨대, 바이오틴, 또는 효소 예컨대 호스 래디시 퍼옥시다제 또는 알칼리 포스파타제를 포함할 수 있다. 이들 검정을 수행하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어 문헌 [Harlow et al. (Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1988)], [Harlow et al. (Using Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1999)], [Virella (Medical Immunology, 6th edition, Informa HealthCare, New York, 2007)], 및 [Diamandis et al. (Immunoassays, Academic Press, Inc., New York, 1996)]을 참조한다. 이들 검정을 수행하기 위한 키트는, 예를 들어, 클론테크 레보러토리즈, 엘엘씨.(Clontech Laboratories, LLC.) (캘리포니아주 마운틴뷰)로부터 시판되고 있다.
다양한 실시양태에서, 항체는 전체 항체 및/또는 임의의 항원 결합 단편 (예를 들어, 항원 결합 부분 및/또는 이들의 단일 쇄를 포함한다 (예를 들어, 항체는 디설파이드 브릿지에 의해 서로 연결되는 2개의 중질 (H) 쇄 및 2개의 경질 (L) 쇄 포함하며, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; 힌지 영역에서 디설파이드 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab)2 단편; VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편 등을 포함한다). 다양한 실시양태에서, 폴리클로날 및 모노클로날 항체가 유용하며, 단리된 인간 또는 인간화 항체, 또는 그의 기능적 단편도 유용하다.
다양한 종의 표적에 대한 항체의 결합능을 평가하기 위한 표준 검정은, 예를 들어, ELISA, 웨스턴 블롯 및 RIA를 포함하여 관련 기술분야에 공지되어 있다. 항체의 결합 동역학 (예를 들어, 결합 친화도)은 예컨대 비아코어(Biacore) 분석에 의해 관련 기술분야에 공지된 표준 검정에 의해 또한 평가될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 측정은 핵산의 존재, 부재 또는 수준을 평가하는 것을 포함한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 적절한 마커의 DNA/RNA 수준을 검출하거나 정량화하기 위해 다수의 방법을 사용할 수 있음을 인식할 것이다.
유전자 발현은 리포터 유전자 검정, 노던 블롯, 형광 제자리 부합법 (FISH), 및 역전사 PCR (RT-PCR)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 저-내지-중-플렉스(low-to-mid-plex) 기술을 사용하여 측정할 수 있다. 유전자 발현은, 예를 들어, 유전자 발현의 연속 분석 (SAGE), DNA 마이크로어레이, 타일링 어레이(Tiling array), RNA-Seq/전 전사체 숏건 서열결정(whole transcriptome shotgun sequencing) (WTSS), 고속원료처리 서열결정(high-throughput sequencing), 멀티플렉스 PCR, 다중 결찰-의존적 탐침 증폭(multiplex ligation-dependent probe amplification) (MLPA), 결찰에 의한 DNA 서열결정, 루미넥스(Luminex)/XMAP를 포함하나 이에 제한되지는 않는 보다 높은 플렉스(higher-plex) 기술을 사용하여 또한 측정할 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 샘플 내에 바이오마커의 RNA 생성물의 수준을 검출하거나 정량화하기 위해 어레이, 예컨대 마이크로어레이, RT-PCR (정량적 PCR 포함), 뉴클레아제 보호 검정 및 노던 블롯 분석을 포함하는, 다수의 방법을 사용할 수 있음을 인식할 것이다.
예시적 암 및 환자
일부 실시양태에서 본 발명은 암 치료법을 결정하는 방법을 제공하고/거나 환자의 종양 또는 암 세포 견본을 포함한다. 암 또는 종양은 세포의 제어되지 않는 성장 및/또는 비정상적인 증가된 세포 생존 및/또는 신체 기관 및 체계의 정상 기능을 방해하는 아폽토시스의 억제를 지칭한다. 암 또는 종양을 가진 대상체는 대상체의 신체에 존재하는 객관적으로 측정 가능한 암세포를 가진 대상체이다. 본 발명에는 양성 및 악성 암, 뿐만 아니라 휴면 종양 또는 미세 전이(micrometastasis)가 포함된다. 원래 위치 및 종자 생명유지 기관(seed vital organ)으로부터 이동하는 암은 영향을 받는 장기의 기능 저하를 통해 결국 대상체를 죽음에 이르게할 수 있다.
다양한 실시양태에서, 본 발명은 전-전이성(pre-metastatic) 암 또는 전이성 암에 적용 가능하다. 전이는 암이 신체에서 그의 원발 부위로부터 다른 곳으로 퍼져나가는 것을 지칭한다. 암세포는 원발성 종양으로부터 빠져 나와 림프관과 혈관에 침투하고, 혈류를 따라 순환하며, 신체의 다른 곳의 정상 조직에서 먼 병소(focus)에서 성장 (전이)할 수 있다. 전이는 국소적이거나 원거리일 수 있다. 전이는 순차적 과정으로, 원발성 종양에서 떨어져 나가고, 혈류를 따라 이동하고, 원거리 부위에서 멈추는 종양 세포 여하에 달려 있다. 새로운 부위에서, 세포는 혈액 공급을 확립하고 성장하여 생명을 위협하는 덩어리를 형성할 수 있다. 종양 세포 내의 자극성 및 억제성 분자 경로는 이러한 거동, 및 원거리 부위에서의 숙주 세포와 종양 세포 사이의 상호 작용을 조절한다. 전이는 특정 증상의 모니터링 외에도 자기 공명 영상 (MRI) 스캔, 컴퓨터 단층 촬영 (CT) 스캔, 혈액 및 혈소판 수, 간 기능 연구, 흉부 엑-선 및 골 스캔의 단독 또는 조합 사용을 통해 종종 검출된다.
본원에 기재된 방법은 암의 예후, 암의 진단, 암의 치료, 및/또는 아폽토시스의 억제, 또는 증가된 세포 생존과 연관된 증식성 장애 및 악성 종양의 성장, 진행, 및/또는 전이의 진단, 예후, 치료, 예방 또는 개선에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 암은 급성 골수성 백혈병 (AML), 다발성 골수종, 여포성 림프종, 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), 만성 림프구성 백혈병을 포함하나 이에 제한되지는 않는 혈액암, 및 외투 세포 림프종 및 미만성 거대 B 세포 림프종을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 비호지킨 림프종이다. 일부 실시양태에서, 암은 비소세포성 폐암종, 난소암 및 흑색종을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 고형 종양이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 하기 암 중 하나 이상에 관한 것이다: 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), 급성 골수성 백혈병 (AML), 부신피질 암종, AIDS-관련 암, 항문암, 맹장암, 성상 세포종 (예를 들어 소아기 소뇌 또는 대뇌), 기저 세포 암종, 담관암, 방광암, 골 종양 (예를 들어 골육종, 악성 섬유성 조직구종), 뇌간 신경교종, 뇌암, 뇌종양 (예를 들어 소뇌 성상세포종, 대뇌 성상세포종/악성 신경교종, 상의세포종, 수모세포종, 천막상 원시신경 외배엽 종양, 시각 경로 및 시상 하부 신경 교종), 유방암, 기관지 선종/카르시노이드(carcinoid), 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma), 유암종(carcinoid tumor), 중추 신경계 림프종, 소뇌 성상세포종, 자궁 경부암, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 만성 골수성 백혈병 (CML), 만성 골수 증식성 질환, 결장암, 피부 T 세포 림프종(cutaneous T 세포 림프종), 섬유조직형성 작은 원형 세포 종양(desmoplastic small round cell tumor), 자궁내막암, 상의세포종, 식도암, 유잉 육종(Ewing's sarcoma), 두개외 배세포종 (extracranial germ cell tumor), 고환외 배세포종(extrangonadal germ cell tumor), 간외 담관암, 눈암, 담낭암, 위암(gastric (stomach) cancer), 위장 간질 종양 (GIST), 배세포종 (예를 들어 두개외, 고환외, 난소), 임신성 융모 종양(gestational trophoblastic tumor), 신경교종 (예를 들어 뇌 줄기, 대뇌 성상세포종, 시각 경로 및 시상하부), 위 카르시노이드(gastric carcinoid), 두경부암, 심장암, 간세포 (간) 암, 하인두암, 시상하부 및 시각 경로 신경교종, 안구내 흑색 종, 도세포 암종 (내분비 췌장), 신장암 (신장 세포 암), 후두암, 백혈병 (예를 들어 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 모발 세포), 입술 및 구강암, 지방 육종, 간암, 폐암 (예를 들어 비소세포, 소세포), 림프종 (예를 들어 AIDS-관련, 버킷, 피부 T 세포 호지킨, 비호지킨, 일차 중추 신경계), 수모세포종, 흑색종, 메르켈 세포(Merkel cell) 암종, 중피종, 전이성 편평 경부암(metastatic squamous neck cancer), 구강암(mouth cancer), 다발 내분비 신생물 증후군, 다발성 골수종, 균상 식육종, 골수이형성 증후군, 골수이형성/골수증식성 질환, 골수성 백혈병, 골수성 백혈병, 골수성 백혈병, 골수증식성 장애, 만성, 비강 및 부비강 암, 비인두 암종, 신경모세포종, 비호지킨 림프종, 비소세포 폐암, 구강암(oral cancer), 구강인두암, 골육종, 난소암, 췌장암, 췌장암, 부비강 및 비강 암, 부갑상선암, 음경암, 인두암, 갈색세포종, 송과체 성상세포종 및/또는 배아세포종, 송과체모세포종 및 천막상 원시 신경외배엽 종양, 뇌하수체 선종, 혈장 세포 신생물/다발성 골수종, 흉막폐 모세포종, 원발성 중추 신경계 림프종, 전립선암, 직장암, 신장 세포 암종 (신장암), 신장 골반 및 요관, 망막모세포종, 횡문근 육종, 타액선암, 육종 (예를 들어 유잉 패밀리, 카포시(Kaposi), 연조직, 자궁), 세자리 증후군(Sezary syndrome), 피부암 (예를 들어 비흑색종, 흑색종, 메르켈 세포), 소세포 폐암, 소장암, 연조직 육종, 편평 세포 암종, 편평 경부암, 위암, 천막상 원시 신경외배엽 종양, T 세포 림프종, 고환암, 인후암, 흉선종 및 흉선 암종, 갑상선암, 융모 종양, 요관 및 신장 골반 암, 자궁암, 자궁 육종, 질암, 시각 경로 및 시상하부 신경교종, 외음부암, 발덴스트롬 거대글로불린혈증(Waldenstroem Macroglobulinemia), 및 빌름스 종양.
한 실시양태에서, 암은 AML이다. AML은 두 번째로 가장 흔한 백혈병으로, 미국에서 연간 대략 13,000 건이 새로 진단되며 9,000 건의 사망 사례가 있다. 비록 승인된 치료법이 있긴 하지만, 많은 백혈병 환자의 예후는 좋지 않으며 성공적인 치료의 가능도가 낮다. AML을 위한 치료의 현재 표준은 안트라시클린 작용제 (예를 들어, 다우노루비신, 이다루비신 또는 미톡산트론 등)와 조합된 유도(induction) 시토신 아라비노시드 (ara-C)이다. 이 치료 요법에 전형적으로 고용량 시타라빈의 투여 및/또는 줄기 세포 이식이 뒤따른다. 이러한 치료법은 젊은 환자에서 결과를 개선시켰다. 급성 전골수구 백혈병이 치료에서도 진전이 있었으며, 여기서 모든-트랜스 레티노산 (ATRA) 또는 삼산화비소를 사용한 표적 요법은 탁월한 생존율을 결과하였다. 그러나, 대다수의 AML 사례를 나타내는 집단인 60세가 넘는 환자는, 계속 치료 수수께끼로 남아 있다. 비록 65-85%의 환자가 기존 치료에 반응하긴 하지만, 이러한 반응자의 65%는 재발을 겪고, 많은 환자가 이 질환으로 쓰러진다. 적어도 이러한 이유로 그리고 앞에서 언급한 치료법이 심각한 부작용을 가질 수 있기 때문에, 본 발명의 예측 검사는 이들 논쟁을 완화시키는 치료법의 사용을 가이드할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 적절한 환자를 적절한 치료와 일치시킴으로써 성공적인 치료의 가능도를 개선시킨다. 추가로, 현재 치료에 대한 AML 환자의 반응을 예측하는 어떠한 검사도 없다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 대상체는 달리 정의되지 않는 한, 포유동물, 예를 들어, 인간, 마우스, 래트, 햄스터, 기니아 피그, 개, 고양이, 말, 소, 염소, 양, 돼지, 또는 비인간 영장류, 예컨대 원숭이, 침팬지 또는 개코 원숭이이다. 용어 "대상체" 및 "환자"는 서로 교체하여 사용된다.
예시적 표본
특정 실시양태에서, 표본은 인간 종양-유래 세포주이다. 특정 실시양태에서, 표본은 암 줄기 세포이다. 다른 실시양태에서, 표본은 고형 종양의 생검, 예를 들어, 결장직장, 유방, 전립선, 폐, 췌장, 신장, 또는 난소 원발성 종양 등의 생검으로부터 유래된다.
특정 실시양태에서, 표본은 비-고형 종양, 예를 들어, 본원에 기재된 암 중 어느 한 암의 생검 등으로부터 유래된다. 구체적 실시양태에서, 표본은 다발성 골수종, 급성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프형성 백혈병, 외투 세포 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 및 비호지킨 림프종을 가진 환자의 생검으로부터 유래된다. 구체적 실시양태에서, 표본은 고체 매트릭스 또는 비드에 결합된 항-CD138 항체를 가진 생검 샘플로부터의 선택에 의해 보강되는 다발성 골수종 세포이다. 구체적 실시양태에서, 표본은 CD45-지시된 항체에 결합함으로써 보강되는 급성 골수성 백혈병 세포이다. 구체적 실시양태에서, 표본은 비-B 세포 고갈에 의해 보강되는 만성 림프형성 백혈병 또는 미만성 거대 B 세포 림프종이다.
일부 실시양태에서, 표본은 순환 종양 세포로부터 유래된다.
BH3 프로파일링
다양한 실시양태에서, 본 발명은 BH3 프로파일링을 포함한다. 다양한 실시양태에서, 본 발명은 적어도 2, 또는 3, 또는 4, 또는 5, 또는 6, 또는 7, 또는 8, 또는 9 또는 10개의 BH3 펩티드를 한꺼번에 평가하는 BH3 프로파일링을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 단일 BH3 펩티드의 평가와는 대조적으로 다중펩티드 분석을 포함한다. 일부 실시양태에서, BH3 펩티드의 패널은 단일 환자 표본 상에서 스크리닝한다.
BH3 프로파일링 및 이러한 방법에 유용한 시약은 미국 특허 번호 7,868,133; 8,221,966; 및 8,168,755 및 미국 특허 공개 번호 2011/0130309에 기재되어 있으며, 이 특허 및 특허 공개의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
간단히, 이론에 얽매이지 않기를 바라면서, 비정상적인 표현형의 결과로서, 암세포는 아폽토시스 경로에서 블록(block)을 발생시킨다. 이들 블록은 암세포가 일부 요법에 내성을 갖도록 할뿐만 아니라, 놀랍게도 일부 암세포를 다른 요법에 민감하게 만든다. "종양 유전자 중독(oncogene addiction)"의 개념은 생존을 위한 특정 단백질에 대한 암세포의 획득 의존성 또는 중독에 대한 현상을 기술한다. BH3 프로파일링은 특정 아폽토시스 조절 단백질에 대한 이러한 의존성이 주어진 암세포에서 발생하는 지 여부를 결정하고, 의존성 단백질을 확인한다. 암세포는 아폽토시스를 겪도록 사전에 설정되어 있을 수 있지만 항상 그렇지는 않으며 이것은 달리 의도하지 않은 생존을 위해 암세포가 임의의 또는 모든 항-아폽토시스 Bcl-2 패밀리 단백질에 의존하는 기능이다. 이것은 치료에 반응하는 암세포의 가능도에 대한 통찰력을 제공한다.
암세포는, 이론에 얽매이지 않기를 바라면서, 비정상, 예컨대 DNA 손상, 유전적 불안정, 비정상적 성장 인자 신호 전달, 및 비정상적 또는 결핍된 매트릭스 상호 작용을 나타내며, 이들 중 임의의 것은 (미토콘드리아) 아폽토시스 경로를 통해 아폽토시스를 전형적으로 유도하여야 한다. 그러나, 이들 아폽토시스 신호에 반응하기보다는 암세포가 생존한다. 종종, 그렇게 함으로써, 이들 세포는 만성 아폽토시스 신호에 대한 선택된 블록에 크게 의존하게 된다. 이 적응은 암세포에게 생존 메커니즘을 제공하나; 이들 적응은 또한 암세포를 특정한 아폽토시스 유도 요법에 감수성이 되도록 한다. 내인성 아폽토시스에 의해 세포를 사멸하게 하는 중대한 사건은 미토콘드리아 외막 (MOMP)의 투과화 및 이펙터 카스파제를 활성화시키는 분자의 방출이다. 많은 경우에, MOMP는 내인성 아폽토시스 경로에서 이미 뒤로 물러설 수 없는 단계이다. Bcl-2 패밀리 단백질은 MOMP의 핵심 조절 인자이며, 그의 활성은 림프성 및 여러 고형 종양 암의 발병과 관련이 있으며 많은 암에서 화학요법에 대한 내성의 핵심 중재자로 여겨진다.
Bcl-2 단백질은 생존 유발(pro-survival) (항-아폽토시스) 및 아폽토시스 유발 구성원 간의 구별되는 단백질-단백질 상호 작용에 의해 조절된다. 이들 상호 작용은 BH3 (Bcl-2 상동성 도메인-3) 매개 결합을 통해 주로 발생한다. 아폽토시스-개시 신호 전달은 미토콘드리아의 대부분의 상류에서 발생하며 짧은 BH3-유일, Bcl-2 패밀리 구성원을 MOMP를 활성화시키거나 민감화하는 미토콘드리아로의 전위(translocation)를 유발한다. 활성화 인자(activator) BH3 유일 단백질, Bim 및 Bid는 이펙터, 아폽토시스 유발 단백질 Bax 및 Bak에 결합하여 직접 활성화시키고, 또한 항-아폽토시스 Bcl-2 패밀리 단백질, Bcl-2, MCL1., Bfl-1, Bcl-w 및 Bcl-xL에 결합하여 억제한다. 민감제 BH3 단백질, Bad, Bik, Noxa, Hrk, Bmf 및 Puma는, 단지 항-아폽토시스 Bcl-2 패밀리 단백질, Bcl-2, MCL1., Bfl-1, Bcl-w 및 Bcl-xL에 결합하여, 그의 항-아폽토시스 기능을 차단한다. 이론에 얽매이지 않기를 바라면서, 각각의 민감제 단백질은 특유의 특이성 프로파일을 갖는다. 예를 들어, Noxa (A 및 B)는 MCL1.에 높은 친화도로 결합하며, Bad는 Bcl-xL 및 Bcl-2에 결합하지만 MCL1.에는 약하게 결합하며, Puma는 세 표적 모두에 잘 결합한다. 이들 단백질의 항-아폽토시스 기능은 활성화 인자 BH3 단백질 Bim 및 Bid의 격리이다. 민감제 펩티드에 의한 이들 활성화 인자의 치환(displacement)은 Bax/Bak-매개 아폽토시스 이행(commitment)을 결과한다. 이들 상호 작용은 항상성, 세포 사멸, 아폽토시스에 대한 민감화, 및 아폽토시스의 봉쇄를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 결과를 가질 수 있다.
아폽토시스 신호 전달이 차단되는 암세포의 결정적인 특징은 미토콘드리아 표면에서 BH3 유일 활성화 인자 단백질의 축적이며, 이들 단백질의 결과는 항-아폽토시스 단백질에 의해 격리된다. 그의 이펙터 표적 단백질에 대한 축적과 근접성은 "BH3 프라이밍된" 상태에서 Bcl-2 패밀리 단백질의 길항 작용에 대한 증가된 민감도를 설명한다
일부 실시양태에서, Noxa (A 또는 B)에 높은 아폽토시스 반응을 초래하는 세포는 프라이밍된 MCL1이며, 한편 펩티드 Bad에 대한 높은 반응은 Bcl-xL 또는 Bcl-2가 아폽토시스 블록을 제공한다는 것을 나타낸다. 일부 실시양태에서, Puma는 pan-Bcl-2 패밀리 프라이밍을 반영한다. 이러한 방식으로, MCL1. 또는 Bcl-xL, 두 단백질 모두, 또는 여러 Bcl-2 패밀리 구성원에 의존하는 세포는 쉽게 구별되어 그에 따라 적절한 치료가 맞춰질 수 있도록 한다. 이들 펩티드에 대한 미토콘드리아 반응의 구별은 MCL1. 또는 Bcl-xL 영향 내인성 신호전달 내로 유입되는 경로를 통해 작용하는 것으로 공지된 요법의 사용을 가이드한다. Bcl-2 억제 또는 MCL1. 억제 화합물의 사용은 이러한 경우에서 지시될 수 있다. 일부 실시양태에서, 또한, 본 방법은 MCL1. 또는 Bcl-xL의 상류 실재(entity)를 표적으로 하는 요법을 지시하거나 금기한다.
BH3 프로파일링 검정은 암세포가 프라이밍된 상태뿐만 아니라 프라이밍이 발생한 구성을 확인하며, 이는 예측 값을 갖는다.
예시적 임상적 인자 및 추가 바이오마커
일부 실시양태에서, 본 발명은 임상적 인자의 평가를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 환자 반응을 평가하기 위한 프로파일링 및/또는 임상적 인자의 평가를 포함한다. 일부 실시양태에서, BH3 프로파일링 연구와 함께 환자 반응 정보를 제공하는 임상적 인자는 아폽토시스와 관련되지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, 임상적 인자는 아폽토시스에 영향을 미치지 않는다.
한 실시양태에서, 임상적 인자는 표 3에 나타냈다.
한 실시양태에서, 임상적 인자는 연령, 세포유전학적 상태, 수행, 조직학적 서브클래스, 성별, 및 질환 단계 중 하나 이상이다.
한 실시양태에서, 임상적 인자는 연령이다. 한 실시양태에서, 환자 연령 프로파일은 약 10세 초과, 약 20세 초과, 약 30세 초과, 약 40세 초과, 약 50세 초과, 약 60세 초과, 약 70세 초과, 또는 약 80세 초과로 분류된다.
한 실시양태에서, 임상적 인자는 세포유전학적 상태이다. 일부 암, 예컨대 빌름스 종양 및 망막모세포종에서, 예를 들어, 종양 억제 인자와 연관된 염색체 영역이 일반적으로 결실되거나 돌연변이되기 때문에, 유전자 결실 또는 불활성화가 암 진행을 시작하는 원인이 된다. 예를 들어, 결실, 역위(inversion) 및 전위는 신경교종, 비소세포 폐암, 백혈병 및 흑색종에서 염색체 영역 9p21에서 일반적으로 검출된다. 이론에 얽매이지 않기를 바라면서, 이들 염색체 변화는 종양 억제 인자(suppressor) 시클린-의존적 키나제 억제제 2A를 불활성화할 수 있다. 유전자의 이들 결실과 함께, 염색체의 많은 부분이 또한 손실될 수 있다. 예를 들어, 염색체 1p 및 16q는 고형 종양 세포에서 일반적으로 손실된다. 유전자 중복 및 유전자 카피(copy) 수의 증가가 또한 암의 한 원인이 될 수 있으며 전사 분석 또는 카피 수 변이 어레이로 검출될 수 있다. 예를 들어, 염색체 영역 12q13-q14는 많은 육종에서 증폭된다. 이 염색체 영역은 p53으로 칭해지는 종양 억제 인자에 결합하는 것으로 알려진 MDM2로 칭해지는 결합 단백질을 코딩한다. MDM2가 증폭되는 경우, 이는 p53이 세포 성장을 조절하지 못하게 하여, 종양 형성을 결과할 수 있다. 추가로, 특정 유방암은 과발현 및 ERBB2 유전자의 카피 수의 증가와 연관이 있으며, 이는 인간 표피 성장 인자 수용체 2를 코딩한다. 또한, 염색체 수, 예컨대 염색체 1q 및 3q의 증가가 또한 증가된 암 위험과 연관이 있다.
세포유전학적 상태는 관련 기술분야에 공지된 여러 가지의 방식으로 측정될 수 있다. 예를 들어, FISH, 전통적인 핵형 분석 및 가상 핵형 분석 (예를 들어 비교 게놈 하이브리드화 어레이(genomic hybridization array), CGH 및 단일 뉴클레오티드 다형태 어레이)이 사용될 수 있다. 예를 들어, FISH는 특이적 유전자 자리에서 염색체 재배열을 평가하는 데 사용될 수 있으며 이들 현상은 질환 위험 상태와 연관된다. 일부 실시양태에서, 세포유전학적 상태는 적합, 중간, 또는 적합하지 않음(unfavorable)이다.
한 실시양태에서, 임상적 인자는 수행이다. 활동도(performance status)는 임의의 시스템을 사용하여 정량화될 수 있으며, 환자의 활동도를 채점하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 이 척도는 환자가 화학요법, 용량 조정의 조정을 받을 수 있는 지의 여부를 결정하고, 완화 치료의 강도를 결정하는 데 종종 사용된다. 카르노프스키 점수(Karnofsky score) 및 주브로드 점수(Zubrod score)를 포함한, 다양한 채점 시스템이 있다. 평행 채점 시스템(Parallel scoring system)은 정신의학의 진단 및 통계 매뉴얼 (DSM)의 다섯 번째 축으로서 통합된 전반적 기능 평가(Global Assessment of Functioning) (GAF) 점수를 포함한다. 더 높은 활동도 (예를 들어, 카르노프스키 채점 시스템을 사용하여 적어도 80%, 또는 적어도 70%)는 환자의 화학요법 및/또는 방사선 치료를 받아들이는 능력을 향상시킬 수 있고, 질환 상태의 진행을 예방하는 치료를 나타낼 수 있다. 예를 들어, 이들 실시양태에서, 환자는 보행이 가능하고 자기 돌봄이 가능하다. 다른 실시양태에서, 평가는 낮은 활동도 (예를 들어, 카르노프스키 채점 시스템을 사용하여 예를 들어 50% 미만, 30% 미만 또는 20% 미만)를 가진 환자를 나타내어, 통상적인 방사선요법 및/또는 화학요법이 용인되도록 한다. 이들 실시양태에서, 환자는 주로 침대 또는 의자에 국한되며 심지어 자기 돌봄에 장애가 있다.
카르노프스키 점수는 100에서 0으로 진행되며, 여기서 100은 "완벽한" 건강이며 0은 사망이다. 점수는 10의 간격으로 사용할 수 있으며, 여기서 100%는 정상이며, 불만이 없고, 질환의 징후가 없으며; 90%는 정상적인 활동이 가능하고, 질환의 증상 또는 징후가 거의 없으며, 80%는 정상적인 활동에 약간의 어려움, 일부 증상 또는 징후가 있으며; 70%는 스스로 돌보며, 정상적인 활동 또는 일을할 수 없고; 60%는 약간의 도움을 필요로 하고, 대부분의 개인적인 요구 사항을 처리할 수 있으며; 50%는 종종 도움을 필요로 하고, 빈번히 의료를 필요로 하며; 40%는 장애가 있으며 특별한 돌봄 및 도움을 필요로 하며; 30%는 심하게 장애가 있으며, 병원 입원이 지시되지만 사망 위험은 없으며; 20%가 매우 아프거나, 급히 입원을 필요로 하거나, 보조적인 조치 또는 치료를 필요하며; 10%는 죽어가는, 빠르게 진행하는 치명적인 질환 과정이다.
활동도에 대한 주브로드 채점 시스템은 다음을 포함한다: 0, 완전 활동성, 제한 없이 모든 사전 질환(pre-disease) 수행을 계속 가능; 1, 육체적으로 격렬한 활동은 제한되나 보행이 가능하고 가벼운 또는 앉아서 하는 일, 예를 들어, 가벼운 집안일, 사무실 일을 수행 가능; 2, 보행이 가능하고 모든 자기 돌봄이 가능하나 깨어있는 시간의 50% 이상 어떤 작업 활동도 할 수 없다; 3, 깨어있는 시간의 50% 초과 침대 또는 의자에 국한된, 단지 제한된 자기 돌봄 가능; 4, 침대 또는 의자로 완전히 국한된, 완전히 장애, 자기 돌봄 계속할 수 없다; 5, 사망.
한 실시양태에서, 임상적 인자는 조직학적 서브클래스이다. 일부 실시양태에서, 종양의 조직학적 샘플을 문헌 [Elston & Ellis, Histopathology, 1991, 19:403-10]에 따라 등급화하고, 이 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
한 실시양태에서, 임상적 인자는 성별이다. 한 실시양태에서, 성별은 남성이다. 또 다른 실시양태에서 성별은 여성이다.
한 실시양태에서, 임상적 인자는 질환 단계이다. 비제한적인 예로, 전체 단계 그룹화를 사용하여, I기 암은 신체의 한 부분에 국부적이 되며; II기 암은 III기 암과 마찬가지로 국부적으로 진행된다. 암이 II기 또는 III기로 지정되는 지 여부는 암의 특정 유형에 따라 달라질 수 있다. 한 비제한적인 예에서, 호지킨병, II기는 횡격막의 한쪽에만 영향을 받는 림프절을 나타내며, 한편 III기는 횡격막 위와 아래에 영향을 받는 림프절을 나타낸다. 따라서 II기와 III기에 대한 구체적 기준은 진단에 따라 다르다. IV기 암은 다른 장기 또는 신체 전체에 걸쳐 전이되거나 확산된다.
일부 실시양태에서, 임상적 인자는 혈액 질환에 대한 프랑스-미국-영국(French-American-British) (FAB) 분류 체계 (예를 들어, 골수조혈이상(dysmyelopoiesis)의 존재 및 골수모세포 및 적혈구모세포의 정량화를 나타내는)이다. 한 실시양태에서, 급성 림프모구성 백혈병에 대한 FAB는 L1-L3이고, 급성 골수성 백혈병에 대한 FAB는 M0-M7이다. 또 다른 실시양태에서, 방법은 돌연변이 상태, 단일 뉴클레오티드 다형태, 정상 상태 단백질 수준 및 동적 단백질 수준으로부터 선택된 추가 바이오마커의 측정을 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 방법은 환자에서 임상 반응을 예측하는 것을 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 임상 반응은 약 1, 약 2, 약 3, 또는 약 5년 진행/무사건 생존율이다.
여러 가지의 임상적 인자, 예컨대 연령 프로파일 및 활동도가 확인되었다. 세포 신호전달 단백질 단백질에서의 변화, 뿐만 아니라 유전자 MLL, AML/ETO, Flt3-ITD, NPM1 (NPMc+), CEBPI, IDH1, IDH2, RUNX1, ras, 및 WT1에서 및 후성적 변형 유전자 TET2 및 ASXL에서의 돌연변이를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 분자 사건 및 세포유전학과 같은, 진단의 다수의 정적 측정이 또한 이용되었다.
일부 실시양태에서, 예방 방법은 본원에 기재된 방법에 의해 가이드된 바와 같이 암에 걸릴 가능성이 있는 환자에게 치료법을 수행하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체가 암에 대한 높은 위험, 암에 대한 유전적 소인 (예를 들어 유전적 위험 인자), 암의 이전의 에피소드(episode) (예를 들어 새로운 암 및/또는 재발), 암의 가족력, 암-유발제 (예를 들어 환경 작용제)로의 노출, 및 약리유전학적 정보 (약물동태학, 약역학적 또는 치료제의 효능 프로파일에 대한 유전형의 영향) 중 하나 이상을 특징으로 하는 경우, 대상체는 암에 걸릴 가능성이 있다.
일부 실시양태에서, 대상체가 암에 대한 높은 위험을 특징으로 하는 경우 대상체는 암에 걸릴 가능성이 있다. 일부 실시양태에서, 대상체가 암에 대한 유전적 소인을 특징으로 하는 경우 대상체는 암에 걸릴 가능성이 있다. 일부 실시양태에서, 암에 대한 유전적 소인은 관련 기술분야에 공지된 바와 같이 유전적 임상 인자이다. 이러한 임상적 인자는 예로서, 결장, 자궁, 소장, 위, 요로 암에 대한 HNPCC, MLH1, MSH2, MSH6, PMS1, PMS2를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체가 암의 이전의 에피소드를 특징으로 하는 경우 대상체는 암에 걸릴 가능성이 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 1, 또는 2, 또는 3, 또는 4, 또는 5, 또는 6의, 암의 이전의 에피소드에 걸려 있다. 일부 실시양태에서, 대상체가 암의 가족력을 특징으로 하는 경우 대상체는 암에 걸릴 가능성이 있다. 일부 실시양태에서, 부모 및/또는 조부모 및/또는 형제자매 및/또는 앤트(aunt)/엉클(uncle) 및/또는 조앤트(great aunt)/조앵클(great uncle), 및/또는 사촌은 암에 걸린 적이 있거나 또는 암에 걸려 있다. 일부 실시양태에서, 대상체가 암-유발제 (예를 들어 환경 작용제)로에 노출을 특징으로 하는 경우 대상체는 암에 걸릴 가능성이 있다. 예를 들어, 강한 일광에 피부를 노출시키는 것은 피부암에 대한 임상적 인자이다. 예로서, 흡연은 폐, 구강, 후두, 방광, 신장, 및 여러 다른 장기의 암에 대한 임상적 인자이다.
추가로, 일부 실시양태에서, 다음의 임상적 인자 중 어느 한 인자가 본원에 기재된 방법에 유용할 수 있다: 성별; 유전적 위험 인자; 가족력; 개인력; 인종 및 민족성; 특정 조직의 특징; 다양한 양성 병태 (예를 들어 비증식성 병변); 이전의 흉부 방사선; 발암 물질 노출 등.
더 나아가, 일부 실시양태에서, 다음의 임상적 인자 중 어느 한 인자가 본원에 기재된 방법에 유용할 수 있다: 세포 표면 마커 CD33, 세포 표면 마커 CD34, FLT3 돌연변이 상태, p53 돌연변이 상태, MEK-1 키나제의 인산화 상태, 및 Bcl-2의 70번 위치에서의 세린의 인산화 중 하나 이상.
일부 실시양태에서, 임상적 인자는 인터루킨-6을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 시토카인의 발현 수준이다. 일부 실시양태에서, 인터루킨-6 수준은 불량한 환자의 예후 또는 양호한 환자의 예후를 포함하여, MM 환자에서 반응의 가능도와 상관관계가 있을 것이다.
특정 실시양태에서, 반응의 가능도는 퍼센트 프라이밍을 평가함으로써 결정된다. 특정 실시양태에서, 프라이밍은 하기 수학식에 의해 정의된다:
Figure pct00002
여기서 AUC는 곡선하 면적 또는 신호 강도를 포함하며; DMSO는 기준선 음성 대조군을 포함하며; CCCP (카르보닐 시아나이드 m-클로로페닐 히드라존)는 미토콘드리아에서의 전자전달계에서 전자 운반체의 정상적인 활성 동안에 확립된 양성자 구배의 짝풀기제로서 작용함으로써 단백질 합성의 이펙터를 포함하며 기준선 양성 대조군을 포함한다. 일부 실시양태에서, 곡선하 면적은 균질 시간 분해 형광 (HTRF)에 의해 확립된다. 일부 실시양태에서, 시간은 약 0 내지 약 300분에서 약 0 내지 약 30분 사이의 시간대에 걸쳐 발생한다. 일부 실시양태에서, 곡선하 면적은 형광 활성화 세포 분류 (FACS)에 의해 확립된다. 일부 실시양태에서, 신호 강도는 약 5분 내지 약 300분 사이에 발생하는 단일 시점 측정이다.
또 다른 실시양태에서, 방법은 BH3 프로파일링 분석, 및 세포 표면 마커 CD33, 세포 표면 마커 CD34, FLT3 돌연변이 상태, p53 돌연변이 상태, MEK-1 키나제의 인산화 상태, 및 Bcl-2의 70번 위치에서의 세린의 인산화 중 하나 이상을 측정하는 것; 및 시타라빈 또는 시타라빈-기반 화학요법 및/또는 아자시티딘로 AML 환자를 치료하는 데 있어서 효능과의 상관관계를 입증하는 것을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 방법은 BH3 프로파일링 검정, 및 세포 표면 마커 CD33, 세포 표면 마커 CD34, FLT3 돌연변이 상태, p53 돌연변이 상태, MEK-1 키나제의 인산화 상태, 및 Bcl-2의 70번 위치에서의 세린의 인산화 중 하나 이상을 측정하는 것; 및 화학요법으로 MM 환자를 치료하는 데 있어서 효능과의 상관관계를 입증하는 것을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 암은 AML 및/또는 MM이고 임상적 인자는 연령 프로파일 및/또는 세포유전학적 상태이거나; 암은 AML 및/또는 MM이고 암 치료법은 시타라빈 또는 시타라빈-기반 화학요법 및/또는 아자시티딘이거나, 암 치료법은 시타라빈 또는 시타라빈-기반 화학요법 및/또는 아자시티딘이고 임상적 인자는 연령 프로파일 및/또는 세포유전학적 상태이거나, 암 치료법은 시타라빈 또는 시타라빈-기반 화학요법 및/또는 아자시티딘이며; 암은 AML 및/또는 MM이고; 임상적 인자는 연령 프로파일 및/또는 세포유전학적 상태이다.
본 발명은 종양 또는 암 세포 견본의 평가를 단순화할 수 있는 키트를 또한 제공한다. 본 발명의 전형적인 키트는, 예를 들어, BH3 펩티드를 검출하는 1종 이상의 작용제를 포함하는 다양한 시약을 포함한다. 키트는 다양한 검출 방법에서 유용한 것들, 예를 들어, 항체 등을 또한 포함하여, 검출을 위한 1종 이상의 시약을 또한 포함할 수 있다. 키트는 웰 플레이트(welled plate), 주사기 등을 포함하여 평가에 필요한 물질을 추가로 포함한다. 키트는 기재된 시약의 사용을 지시하는 표지 또는 인쇄된 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 키트는 시험될 치료법을 추가로 포함할 수 있다.
언급된 숫자 표시와 관련하여 사용될 때 용어 "약"은 언급된 숫자 표시의 10%까지 플러스 또는 마이너스를 의미한다. 예를 들어, 표현 "약 50"은 45 내지 55의 범위를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 단어 "포함한다" 및 그의 변형체는 비제한적인 것으로 의도되어, 목록 내의 항목의 열거가 이 기술의 물질, 조성, 장치 및 방법에도 유용할 수 있는 다른 유사한 항목을 제외하지 않도록 한다. 유사하게, 용어 "할 수 있다(can)" 및 "일 지도 모른다(may)" 및 그의 변형체는 비제한적인 것으로 의도되어, 한 실시양태가 특정 실시양태 또는 특징을 포함할 수 있거나 포함할 지도 모르는 열거가 그러한 요소 또는 특징을 함유하지 않는 본 기술의 다른 실시양태를 제외하지 않도록 한다. 비록 포함하는, 함유하는, 또는 갖는과 같은 용어의 동의어로서 개방형 용어 "포함하는"이 본 발명을 설명하고 청구하기 위해 본원에서 사용되긴 하지만, 본 기술 또는 그의 실시양태는 열거된 성분의 보다 제한적인 용어 예컨대 "로 이루어진" 또는 "로 본질적으로 이루어진"을 사용하여 대안적으로 기재될 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서의 모든 과학 기술 용어는 본 발명이 속하는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 비록 본원에 기술된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있긴 하지만, 바람직한 방법 및 물질이 본원에 기재되어 있다. 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 공보는 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 실시양태는 다음의 비제한적인 실시예에 의해 추가로 예시된다.
실시예
실시예 1
AML 환자-기반 코호트를 사용한 연구
존슨 홉킨스 대학교 병원 및 클리닉(Johns Hopkins University Hospitals and Clinics)은 그의 조직 저장소에 이전에 수행된 2건의 임상 시험으로부터 실행가능하게 동결된 AML 환자 표본을 갖는다. 존스 홉킨스 대학교로부터의 프로토콜 NCT00795002 (J0856), NCT00407966 (J0669), 또는 NCT01349972 (J1101)에 등록된 새로 진단받은 AML 또는 MDS를 가진 환자로부터의 63종의 말초 혈액 및 골수 샘플을 얻고 분석하였다. 환자를 FLAM: 알보시딥 (플라보피리돌), Ara-C 및 미톡산트론 (n=54) 또는 7+3 (Ara C 및 다우노루비신, n=9)으로 치료하였다. 모든 세포주의 정상적인 성숙으로 5% 미만의 골수모세포, ANC . 1000/μL 및 혈소판 수. 100,000/μL, 말초 혈액에서의 모세포의 부재, 골수에서의 백혈병 세포의 부재, 질환과 연관된 세포유전학의 클리어런스, 및 이전의 골수외 질환의 클리어런스를 특징으로 하는 완전 반응. 전체 환자 특성은 BH3 프로파일링이 완료된 후 존슨 홉킨스 대학교에 의해 제공되었으며 환자 연령, 세포유전학적 위험, FLT -3 돌연변이, NPM1 돌연변이, MDS/골수 장애 병력, 이전의 화학요법 이력, BM 모세포 %, 진단시 WBC 수, 및 요법에 대한 반응을 포함하여, 표 1에 요약하였다. 개개의 환자 특성을 표 2에 열거하였다.
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
간단히, 동결, 추출된 백혈구 샘플을 급속 해동시키고, 세포 생존력을 트립판 블루 배제에 의해 결정하였다. 세포를 FACS 완충제 (2% FBS 함유 1x PBS)에서 세척하고 형광 표지된 CD45, CD3 및 CD20 모노클로날 항체를 사용하여 면역표현형 검사를 하였다. 그 다음에 세포를 교란 단계(perturbation step)를 위해 뉴마이어(Newmeyer) 완충제 (10 mM 트레할로스, 10 mM HEPES, 80 mM KCl, 20 μM EGTA, 20 μM EDTA, 5 mM 숙시네이트, pH 7.4)에 재현탁시켰다. BH3 펩티드를 뉴마이어 완충액에 희석하여 최종 농도가 다음과 같은 작업 용액을 제조하였다: BIM (100 μM), BIM (0.1 μM), NOXA (100 μM), Puma (10 μM), HRK (100 μM), BAD (100 μM), 및 BID (1.0 μM). DMSO 및 CCCP를 음성 및 양성 펩티드 대조군으로 사용하였다. 디기코닌 및 올리고마이신을 개개의 FACS 튜브에 첨가한 후에, BH3 펩티드를 첨가하였다. 그 다음에 세포를 FACS 튜브에 첨가하고 실온에서 2시간 15분 동안 인큐베이션하여, 세포 투과화, 펩티드 또는 화합물의 전달 및 미토콘드리아의 탈분극이 발생하도록 하였다. 인큐베이션 후, JC-1 염료를 뉴마이어 완충제에서 제조하고 처리된 세포에 직접 첨가하였다. 펩티드 또는 화합물로 처리되지 않은 세포의 추가 튜브를 세포가 디기코닌에 의해 효과적으로 반드시 투과화되도록 프로피듐 요오다이드 (PI)로 염색하였다. JC-1과 함께 45분의 인큐베이션 후, 세 가지 레이저 BD FACSCanto II로 세포를 분석하였다. AML 모세포를 네 가지 매개 변수를 기반으로 게이팅하였다: 1) 투과화 (PI 염색에 의해 결정된 바와 같음), 2) SSC를 기반으로 하여 단일선 식별(singlet discrimination), 3) CD45 dim 및 CD3/CD20 음성, 및 4) SSC low. 그 다음에, 게이팅된 모세포 집단의 중앙값 JC-1 적색 형광은 DMSO (음성) 및 CCCP (양성) 대조군과 비교하여 % 탈분극을 계산하는데 사용되었다. 세포유전학적 위험 상태 결정 세포유전학적 분석은 존슨 홉킨스 대학교에 의해 제공되었다. 개개의 환자의 세포유전학적 위험 분류 (적합, 중간, 유해)는 암 및 백혈병 그룹 B (CALGB) 지침으로부터 결정하였다: 적합 = inv16, t(8:21), T(15;17) 중간 = 이배체, 적합하지 않음(Unfavorable) = -5, -7, +8, t(6;9), 11q, PH1+, . 3 관련되지 않은 세포유전학적 이상 등.
통계 분석: 각각의 펩티드에 대해, 완전히 프라이밍되지 않은 것으로서 DMSO 음성 대조군 및 100% 프라이밍된 기준으로서 CCCP를 기반으로 하여 프라이밍 백분율을 결정하는 다음 공식을 사용하여 프라이밍 백분율을 계산하였다.
Figure pct00008
분석을 위해, CR로서 분류되지 않은 모든 환자를 무반응자 [최소 잔존 질환 (MRD), 부분 관해 (PR), 및 TF (치료 실패)]로서 취급하였다. 스튜던트 t 검정(Student's t-test), 만-위트니 순위-합 비모수적 검정(non-parametric test), 다변량 로지스틱 회귀, 및 ROC 곡선 분석 (BH3 펩티드 (및 다른 종양 특징, 예컨대 세포유전학 등)와 반응 사이에)을 GraphPad 프리즘(Prism) 버전 5.04 및 MedCalc 버전 14.8.1을 사용하여 계산하였다.
FLAM 프로토콜 상에 등록된 AML 환자 샘플의 미토콘드리아 프로파일링
총 63종의 환자 샘플을 수령하고 프로세싱하여, 그러한 샘플을 표 1 및 표 2에 요약하였다. 전체 프로파일은 샘플 중 43개로부터 얻었고, 추가 아홉(9)개는 프로파일의 서브세트로 프로세싱하였다 (전체 검정을 수행하기에 불충분한 세포 수로 인해). 나머지 열한(11)개 샘플은 낮은 신호 대 잡음 비율로 인해 (세포가 검정 전에 이미 아폽토시스였음) 또는 부적당한 세포 수로 인해, 임의의 BH3 프로파일링을 결정하기에 불충분한 품질이었다. 모든 후속 분석은 임의의 BH3 프로파일링에 대해 성공적으로 프로세싱된 샘플 (총 n=52)에 대해서만 수행하였다.
환자로부터 얻은 임상 변수는 환자가 요법에 반응할 것인 지 여부에 이들 인자 중 어느 것 (만약에 있다면)이 영향을 미치는 지를 결정하기 위해 반응과 비교되었다 (표 3). CR과 유의한 연관성이 있는 것으로 밝혀진 유일한 변수는 세포유전학적 위험 인자였으며, 여기서 유해한 분류를 갖는 이들은 요법에 덜 반응할 가능성이 있다. WBC, MDS의 병력, 그리고 어떤 프로토콜을 따랐는지는 모두 유의성에 가까웠으며, 더 높은 WBC 값 및 MDS의 병력은 요법에 대한 반응과 연관이 있었다. 프로토콜 J0856은 J1101 (25명 중 8명)보다 더 높은 CR 비율 (25명 환자 중 13명 CR)을 가졌으며, 프로토콜 J0669는 BH3 프로파일링에 성공한 2명의 환자에 의해서만 나타났다. 연령, BM 모세포 백분율, NPM/FLT-3 돌연변이 상태는 이 데이터세트에서의 반응과 유의하게 연관되어 있지 않았다.
Figure pct00009
모든 BH3 개개의 환자 데이터를 표 4 및 5에 요약하였으며, 이는 각각의 BH3 펩티드가 모세포에서 미토콘드리아 탈분극을 유도하는 능력을 상술한다. 모든 반응을 살펴보면, BIM 100 μM 펩티드가 최고의 중앙 탈분극 (99.2%)을 결과하였으며, NOXA는 최저의 전체 프라이밍 (16.0%)을 가졌다. 그 다음에 단일 펩티드 BH3 프로파일은 표 6에서 행하지 않은 (NR) 환자들에 대해 치료에 반응한 (CR) 환자에서 비교되었다. 어떠한 단일 펩티드도 반응과 유의하게 연관되어 있지 않았지만; BAD 펩티드는 0.09의 p-값으로 유의성에 접근했으나, 단지 0.65의 AUC 값을 가졌다. 이것은 전체 환자 세트를 사용하여, 어떠한 개개의 BH3 펩티드도 알보시딥 함유 요법, 예컨대 FLAM 치료에 반응하는 환자를 확인하기에 충분하지 않음을 나타낸다.
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Figure pct00011
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Figure pct00013
다음으로, BH3 펩티드를 다른 BH3 펩티드 프로파일 및 임상 변수와 함께 다변량 분석에서 시험하였다 (표 7). 이 분석은 반응과 관련하여 BIM 100 μM + BAD + PUMA 사이의 매우 유의한 연관성이 존재함을 밝혔는데, p-값은 0.009이고 ROC AUC는 0.732이다 (도 1). 이들 3종의 펩티드가 세포유전학적 위험 범주와 조합되는 경우 p-값은 0.0001이 되고 AUC는 0.84가 된다. 분석에 MDS 병력을 추가하면 p-값이 0.0001이고 AUC가 0.85인 추가의 유의성을 야기한다. 세포유전학적 위험 범주 단독은 단지 0.60의 AUC 값을 초래한다 (세포유전학적 위험에 더하여 MDS 병력은 0.72의 AUC를 제공한다). 이것은 분석에 BH3 펩티드 프라이밍을 추가하면 알보시딥 (예를 들어, FLAM)에 반응하는 그러한 환자를 확인하는 능력을 크게 증가시킨다는 것을 나타낸다. BH3 펩티드 데이터를 세포유전학적 위험 범주 및 MDS 병력과 함께 사용하는 이상적인 컷오프 (유덴 지수(Youden index))에서, 이 검정은 이 연구에서 치료에 반응한 환자를 확인하는 데 89.5%의 민감성과 76%의 특이성이다. 이것은 이들 3종의 펩티드로부터의 BH3 펩티드 프라이밍 데이터를 임상 정보와 함께 사용하는 것이 알보시딥을 사용한 치료에 대한 예측 값에 가치가 있을 수 있음을 나타낸다.
Figure pct00014
본 연구의 과정에서, 우리는 또한 BH3 프라이밍에서 역할을 할 수 있는 다른 인자들을 조사하였다. 백혈병 세포 (즉, 말초 혈액 또는 골수)의 공급원이 상이한 세포 집단을 잠재적으로 단리할 수 있으므로, 우리는 환자의 골수로부터 얻은 그러한 샘플에서만 수행하였다. 표 8은 단지 골수 샘플에서 반응과의 각각의 BH3 펩티드의 연관성을 나타낸다. 이 샘플 서브세트에서, NOXA 프라이밍은 행하지 않은 환자들 (4.5% 및 5.2% 각각)과 비교하여 치료에 반응하는 환자에서 유의하게 (p=0.006) 더 높았고 0.805의 AUC 값을 갖는다 (도 2 및 도 3). 다른 단일 펩티드 중 어떠한 것도 골수 샘플 단독에서의 반응과 유의한 연관성을 보이지 않았다. 10.78% NOXA 프라이밍보다 더 높은 컷오프 값으로, 시험은 92% 민감성이고 67% 특이성이다. 15% 이상의 NOXA 프라이밍은 알보시딥 치료 (예를 들어, FLAM)에 대한 반응의 높은 가능도와 연관이 있는 것으로 보이며, 한편 약 30% 이상의 NOXA 프라이밍은 알보시딥-함유 요법에 대해 거의 100% 반응을 예측한다. 세포유전학적 위험 인자와 MDS 병력을 알고리즘에 추가하면 NOXA 프라이밍이 치료에 대한 반응을 예측하는 데 있어서 이들 변수에 더해져서, 이상적인 컷오프 값에서 92%의 민감도 및 80%의 특이성으로 0.92의 AUC 값을 초래하는 것으로 나타난다 (표 8 및 도 3).
Figure pct00015
이 연구의 결과는 BH3 프로파일링이 알보시딥 치료, 예컨대 FLAM 치료에 반응할 가능성이 있는 환자를 확인하는 데 있어서 유용한 것으로 입증될 수 있음을 나타낸다. 전체 데이터세트를 살펴보면, 개개의 BH3 펩티드가 반응과 상관관계가 없지만, 여러 펩티드 (BIM, BAD 및 PUMA)의 조합은 알보시딥 반응과 강한 상관관계를 나타냈다. 이들 여러 펩티드는 연구 기간 내에 골수 및 말초 혈액 샘플 둘 다에서 반응과 상관관계를 나타냈다. 환자의 MDS 병력과 함께 세포유전학적 상태를 환자 반응을 예측하는 단일 측정 지표로 통합하는 알고리즘을 확인하기 위해 이들 데이터가 공지된 환자 위험 인자에 부가적이었다는 것은 고무적인 일이다.
이 연구의 또 다른 흥미로운 발견은 NOXA 신호 전달이 전체 데이터세트에서 FLAM 반응과 유의하게 연관이 있는 것으로 밝혀지지 않았지만, 골수 샘플 단독의 검사는 반응과 매우 강한 연관성을 나타냈다는 점이다. AML 종양 세포의 니셰(niche)가 골수일 것이므로, 골수와 비교하여 말초 혈액에서 모세포의 표현형 마커가 상이할 수 있기 때문에, 골수와 비교하여 말초 혈액에서 상이한 BH3 프로파일이 존재할 것이라는 것은 놀랄 일이 아니다 (1,2). 게다가, 골수 간질은 직접 세포 접촉를 통해 그리고 골수에 존재하는 가용성(soluble) 인자를 통해 AML 세포에 대한 내성을 부여하는 것으로 이전에 확인되어 있다 (3). 골수 채취는 AML 모세포, 가용성 인자 인자 및 잠재적으로는 실질 간질 세포를 잠재적으로 수집할 것이기 때문에, 골수에서의 BH3 프라이밍 검정은 그의 정상적인 환경적 맥락에서 백혈병 세포의 더 직접적인 검사를 대표할 수 있다. 기능적 차이는 FLT3 키나제 억제제 단일 요법으로 AML에서 이전에 관찰되었으며, 여기서 순환 모세포(circulating blast)가 말초 혈액으로부터 제거되며 한편 골수 모세포가 최소한 영향을 받는다 (4). NOXA 판독 정보는 유사한 기능적 차이를 검출할 수 있으며, 여기서 NOXA를 사용한 프라이밍은 Mcl-1 치환을 결과하고 아폽토시스를 야기하여 FLAM에 반응할 가능성이 있는 그러한 암을 확인한다.
이번 연구에서 확인된 알고리즘 중 둘인, NOXA 및 [BAD + BIM 100 + PUMA] 프라이밍은 프라이밍된 Mcl-1인 암 세포를 확인하는 것일 수 있다. NOXA에 높은 아폽토시스 반응을 초래하는 세포는 프라이밍된 MCL1인 것으로 언급되며, 한편 펩티드 Bad에 대한 높은 반응은 Bcl-xL 또는 Bcl-2가 아폽토시스 차단을 제공함을 나타내는 것이다. PUMA는 pan-Bcl-2 패밀리 프라이밍을 반영할 수 있으므로, [BAD + BIM 100 + PUMA]를 지지하는 알고리즘은 실제로 PUMA - BAD - BIM100이므로, 효과적이며; 이들 판독 둘 다 효과적으로 Mcl-1의 프라이밍 상태를 측정할 수 있으며, 궁극적으로는 알보시딥 치료, 예컨대 FLAM 요법에 반응하는 그러한 환자는 Mcl-1 의존성이 있다. 따라서, 환자 암세포에서 MCL-1 과발현은 알보시딥에 대한 반응의 높은 반응 가능도와 연관이 있는 것으로 여겨진다.
실시예 2
FLAM 요법과 전통적인 7+3 치료 전략을 구별하는 알고리즘
AML 환자 골수 또는 말초 혈액에서의 BIM 0.1 프라이밍은 7+3 요법 (시타라빈 + 안트라시클린)에 대한 반응과 상관관계가 있었다; 문헌 [Pierceall, et al. "BH3 Profiling Discriminates Response to Cytarabine-based Treatment of Acute Myelogenous Leukemia" Molecular Cancer Therapeutics] 참조. 위에서 논의한 바와 같이, NOXA 골수 프라이밍은 FLAM (알보시딥, ara-C, 미톡산트론) 요법에 대한 반응과 상관관계가 있었다. 우리는 어떤 알고리즘이 FLAM 또는 7+3이 치료를 받은 적이인 없는 AML 환자를 치료하는데 사용되어야 하는지를 구별할 것인 지를 조사하였다.
BIM 0.1은 BM 샘플 서브세트에서 7+3에 대한 반응을 예측하는데 AUC 값은 0.80이고 민감도 및 특이성은 각각 64.3% 및 100%이다-왼쪽 아래. 그러나, 그러한 동일 샘플에서 NOXA는 본질적으로 예측력이 없는데 AUC 값은 0.54이고 민감도 및 특이성은 각각 42.9% 및 100%이다. 도 5 참조 (FLAM으로 치료했을 때의 0.81의 AUC 및 92%/67% 민감도/특이성과 비교됨). 이것은 치료전 AML 환자로부터 채취한 골수 세포에서 검출된 경우 NOXA 프라이밍이 7+3이 아니라 FLAM에 대한 반응과 상관관계가 있으며, 치료 전에 시험한 AML 환자의 말초 혈액으로부터의 BIM 0.1 판독이 FLAM이 아니라 7+3에 대한 반응과 상관관계가 있음을 나타내는 것이다.
BIM 0.1 프라이밍과 비교했을 때 NOXA 프라이밍의 추가 조사는 프라이밍 값을 가진 환자의 서브클래스가 존재하며 이는 이들이 한 작용제에 대해서는 반응할 가능성이 없으나 또 다른 작용제에 대해서는 반응할 가능성이 있음을 나타내는 것이라는 것을 밝힌다. 도 6은 원래 7+3 연구 (n=23)로부터의 골수 샘플로부터의 NOXA 프라이밍 대 BIM 0.1 프라이밍을 도시한다. 도 6의 데이터는 환자의 골수 샘플에서의 NOXA 프라이밍을 말초 혈액 (PB) 샘플에서의 BIM 0.1 프라이밍과 비교함으로써 치료전 AML 환자에서 암 치료 전략을 선택하는 방법을 제공한다. BM NOXA > 10.8%이고 BM/PB BIM 0.1 <35%인 경우라면 환자는 FLAM의 후보이다. BM NOXA가 < 10.8%이고 BM/PB BIM 0.1 >15%인 경우라면 환자는 7+3 요법의 후보이다. BM NOXA < 10.8%이고 BM/PB BIM 0.1 > 35%인 경우 환자는 또한 7+3 요법의 후보이다. 마지막으로, BM NOXA < 10.8%이고 BM/PB BIM 0.1 < 15%인 경우 환자는 FLAM 또는 7+3 요법의 어느 쪽의 후보도 아니다.
실시예 3
알보시딥은 MV-411 세포에서 MCL-1 mRNA 발현을 시간 및 용량 의존적 방식으로 저하시킨다
AML 세포주, MV-4-11은 MCL-1을 발현단다. MCL-1은 MV-4-11 세포에서 핵심 항-아폽토시스 단백질이다. 알보시딥, CDK9 억제제는 MCL-1 mRNA의 발현을 저하시키며, 이는 이미 문헌에서 충분히 입증되어 있다. 알보시딥은 MV-4-11 세포에서 MCL-1 mRNA를 용량 의존적 방식으로 하향 조절한다 (도 7A). 용량 의존성은 세포에 0 - 8 μM의 농도에서 알보시딥을 투여했을 때 대조군과 비교하여 MCL-1 mRNA의 상대적 발현을 모니터링함으로써 관찰된다. MV-4-11 세포를 시험관내에서 2시간 동안 알보시딥으로 처리하였다. 처리 후, 대조군에 대한 변화를 탐침하기 위해 MCL-1 mRNA의 검출을 위한 표준 실시간 PCR (RT-PCR) 검정을 사용하여 세포를 수확하고 준비하였다.
게다가, 알보시딥은 MV-4-11에서 MCL-1 mRNA를 시간-의존적 방식으로 또한 하향 조절한다 (도 7B). 시간 의존성은 시간이 지남에 따라 대조군과 비교된 MCL-1 mRNA의 상대적 발현을 모니터링함으로써 관찰된다. MCL-1 mRNA의 상대적 발현은 100 nM의 알보시딥을 투여한 후 0.5 - 16 시간 시점에서 측정되었다.
MV-4-11 세포를 도 7B에 명시된 시간 동안 시험관내에서 100 nM 알보시딥으로 처리하였다. 처리 후, MCL-1 mRNA 발현의 검출을 위한 표준 RT-PCR 검정을 사용하여 세포를 수확하고 제조하였다. 알보시딥은 치료 후 30분 만큼 일찍 MCL-1 mRNA 발현을 감소시켰다. MCL-1 mRNA의 상대적 발현은 알보시딥이 MV-4-11 세포에서 MCL-1 mRNA의 발현을 저하시킴을 보여준다.
실시예 4
알보시딥은 A549 세포에서 MCL-1 mRNA 발현을 용량 의존적 방식으로 그리고 발암 단백질 발현을 시간 의존적 방식으로 저하시킨다
A549 세포주는 MCL-1을 발현하는, 인간 선암종 세포 주이다. 알보시딥은 A549 세포에서 MCL-1 mRNA를 용량 의존적으로 하향 조절한다 (도 8). 용량 의존성은 세포에 0 - 8 μM의 농도에서 알보시딥을 투여했을 때 대조군과 비교하여 MCL-1 mRNA의 상대적 발현을 모니터링함으로써 관찰된다. A549 세포를 시험관내에서 2시간 동안 알보시딥으로 처리하였다. 처리 후, 대조군에 대한 변화를 탐침하기 위해 MCL-1 mRNA의 검출을 위한 표준 RT-PCR 검정을 사용하여 세포를 수확하고 준비하였다.
게다가, 알보시딥은 A549에서 MCL-1을 시간-의존적 방식으로 또한 하향 조절한다 (도 9A 및 도 9B). 시간 의존성은 시간이 지남에 따라 β-액틴과 비교된 MCL-1, Bcl-xL 및 Bcl-2의 상대적 발현을 모니터링함으로써 관찰된다. MCL-1, Bcl-xL 및 Bcl-2의 상대적 발현은 350 nM의 알보시딥을 투여한 후 0 - 96 시간 시점에서 측정되었다. 한 그룹에서는, 치료 24시간 후, 배지를 제거하고 350 nM의 알보시딥을 함유하는 새로운 배지로 교체하였다 (즉, 세척 단계, 도 9A 참조).
A549 세포를 도 9A 및 도 9B에 명시된 시간 동안 시험관내에서 350 nM 알보시딥으로 처리하였다. 처리 (및 적용가능한 경우 세척 단계) 후, MCL-1, Bcl-xL 및 Bcl-2 발현의 검출을 위한 표준 면역블롯팅 기술을 사용하여 세포를 수확하고 제조하였다. β-액틴과 비교된 CL-1, Bcl-xL 및 Bcl-2의 상대적 발현은 알보시딥이 A549 세포에서 발암 단백질의 발현을 저하시킴을 보여준다.
실시예 5
알보시딥은 MV-4-11 세포에서 발암 단백질 발현을 시간 및 용량 의존적 방식으로 저하시킨다
알보시딥은 MV-4-11 세포에서 MCL-1을 용량 의존적 방식으로 하향 조절한다 (도 10A). 용량 의존성은 세포에 0 - 8 μM의 농도에서 알보시딥을 투여했을 때 β-액틴과 비교하여 MCL-1의 상대적 발현을 모니터링함으로써 관찰된다. MV4-11 세포를 시험관내에서 2시간 동안 알보시딥으로 처리하였다. 처리 후, β-액틴에 대한 변화를 탐침하기 위해 MCL-1의 검출을 위한 표준 면역블롯팅 기술을 사용하여 세포를 수확하고 준비하였다.
게다가, 알보시딥은 MV-4-11에서 MCL-1을 시간-의존적 방식으로 또한 하향 조절한다 (도 10B). 시간 의존성은 시간이 지남에 따라 β-액틴과 비교된 MCL-1, Bcl-xL 및 Bcl-2의 상대적 발현을 모니터링함으로써 관찰된다. MCL-1, Bcl-xL 및 Bcl-2의 상대적 발현은 80 nM의 알보시딥을 투여한 후 1 - 96 시간 시점에서 측정되었다.
MV4-11 세포를 도 10B에 명시된 시간 동안 시험관내에서 80 nM 알보시딥으로 처리하였다. 처리 후, MCL-1, Bcl-xL 및 Bcl-2 발현의 검출을 위한 표준 면역블롯팅 기술을 사용하여 세포를 수확하고 제조하였다. β-액틴과 비교된 MCL-1, Bcl-xL 및 Bcl-2의 상대적 발현은 알보시딥이 MV-4-11 세포에서 발암 단백질의 발현을 저하시킴을 보여준다.
실시예 6
알보시딥은 SK-N-AS 세포에서 N-Myc 발현을 시간 의존적 방식으로 저하시킨다
SK-N-AS 세포주는 핵심 발암 단백질인 N-Myc를 발현하는 인간 신경모세포종 세포주이다. 알보시딥은 SK-N-AS 세포에서 N-Myc를 시간 의존적 방식으로 하향 조절한다 (도 11). 시간 의존성은 시간이 지남에 따라 β-액틴과 비교된 N-Myc의 상대적 발현을 모니터링함으로써 관찰된다. N-Myc의 상대적 발현은 300 nM의 알보시딥을 투여한 후 1 - 24 시간 시점에서 측정되었다.
SK-N-AS 세포를 도 11에 명시된 시간 동안 시험관내에서 300 nM 알보시딥으로 처리하였다. 처리 후, N-Myc의 검출을 위한 표준 면역블롯팅 기술을 사용하여 세포를 수확하고 제조하였다. N-Myc의 상대적 발현은 알보시딥이 SK-N-AS 세포에서 N-Myc의 발현을 저하시킴을 보여준다.
실시예 7
알보시딥은 반복 투여 요법을 사용하여 시간 의존적 방식으로 A549 세포에서 MCL-1 발현을 저하시킨다
알보시딥은 A549 세포에서 MCL-1을 시간에 따라 하향 조절한다 (도 12). 시간 의존성은 시간이 지남에 따라 β-액틴과 비교된 MCL-1, Bcl-xL 및 Bcl-2의 상대적 발현을 모니터링함으로써 관찰된다. MCL-1, Bcl-xL 및 Bcl-2의 상대적 발현은 350 nM의 알보시딥을 투여한 후 0 - 96 시간 시점에서 측정되었다.
세포를 시험관내에서 350 nM 알보시딥으로 3회 (3회의 24시간 기간, 2회의 24시간 휴식) 처리하였다. 처리 후, MCL-1, Bcl-xL 및 Bcl-2 발현의 검출을 위한 표준 면역블롯팅 기술을 사용하여 세포를 수확하고 제조하였다. β-액틴과 비교된 MCL-1, Bcl-xL 및 Bcl-2의 상대적 발현은 알보시딥이 MV-4-11 세포에서 발암 단백질의 발현을 저하시킴을 보여준다.
실시예 8
알보시딥은 Panc-1 세포에서 발암 단백질 발현을 시간 의존적 방식으로 저하시킨다
Panc-1 세포주는 MCL-1을 발현하는 인간 췌장 암종 세포주이다. 알보시딥은 Panc-1 세포에서 MCL-1을 시간 의존적 방식으로 하향 조절한다. 시간 의존성은 시간이 지남에 따라 β-액틴과 비교된 MCL-1, Bcl-xL 및 Bcl-2의 상대적 발현을 모니터링함으로써 관찰된다. MCL-1, Bcl-xL 및 Bcl-2의 상대적 발현은 730 nM의 알보시딥을 투여한 후 0 - 96 시간 시점에서 측정되었다. 한 그룹에서는, 치료 24시간 후, 배지를 제거하고 730 nM의 알보시딥을 함유하는 새로운 배지로 교체하였다 (즉, 세척 단계, 도 13A 참조).
Panc-1 세포를 도 13A 및 도 13B에 명시된 시간 동안 시험관내에서 730 nM 알보시딥으로 처리하였다. 처리 (및 적용가능한 경우 세척 단계) 후, MCL-1, Bcl-xL 및 Bcl-2 발현의 검출을 위한 표준 면역블롯팅 기술을 사용하여 세포를 수확하고 제조하였다. β-액틴과 비교된 CL-1, Bcl-xL 및 Bcl-2의 상대적 발현은 알보시딥이 Panc-1 세포에서 발암 단백질의 발현을 저하시킴을 보여준다.
실시예 9
알보시딥은 반복 투여 요법을 사용하여 시간 의존적 방식으로 Panc-1 세포에서 발암 유전자 단백질 발현을 저하시킨다
알보시딥은 반복 투여 요법을 사용하는 경우 Panc-1 세포에서 MCL-1을 시간 의존적으로 하향 조절한다 (도 14). 시간 의존성은 시간이 지남에 따라 β-액틴과 비교된 MCL-1, Bcl-xL 및 Bcl-2의 상대적 발현을 모니터링함으로써 관찰된다. MCL-1, Bcl-xL 및 Bcl-2의 상대적 발현은 730 nM의 알보시딥을 투여한 후 0 - 96 시간 시점에서 측정되었다.
세포를 시험관내에서 730 nM 알보시딥으로 3회 (3회의 24시간 기간, 2회의 24시간 휴식) 처리하였다. 처리 후, MCL-1, Bcl-xL 및 Bcl-2 발현의 검출을 위한 표준 면역블롯팅 기술을 사용하여 세포를 수확하고 제조하였다. β-액틴과 비교된 MCL-1, Bcl-xL 및 Bcl-2의 상대적 발현은 알보시딥이 Panc-1 세포에서 발암 단백질의 발현을 저하시킴을 보여준다.
실시예 10
알보시딥은 유겐8 세포에서 발암 단백질 발현을 시간 의존적 방식으로 저하시킨다
유겐8 세포주는 MCL-1을 발현하는 피부 암종 세포주이다. 알보시딥은 유겐8 세포에서 MCL-1을 시간 의존적 방식으로 하향 조절한다. 시간 의존성은 시간이 지남에 따라 β-액틴과 비교된 MCL-1, Bcl-xL 및 Bcl-2의 상대적 발현을 모니터링함으로써 관찰된다. MCL-1, Bcl-xL 및 Bcl-2의 상대적 발현은 280 nM의 알보시딥을 투여한 후 0 - 96 시간 시점에서 측정되었다. 한 그룹에서는, 치료 24시간 후, 배지를 제거하고 280 nM의 알보시딥을 함유하는 새로운 배지로 교체하였다 (즉, 세척 단계, 도 15A 참조).
유겐8 세포를 도 15A 및 도 15B에 명시된 시간 동안 시험관내에서 280 nM 알보시딥으로 처리하였다. 처리 (및 적용가능한 경우 세척 단계) 후, MCL-1, Bcl-xL 및 Bcl-2 발현의 검출을 위한 표준 면역블롯팅 기술을 사용하여 세포를 수확하고 제조하였다. β-액틴과 비교된 CL-1, Bcl-xL 및 Bcl-2의 상대적 발현은 알보시딥이 유겐8 세포에서 발암 단백질의 발현을 저하시킴을 보여준다.
실시예 11
알보시딥은 반복 투여 요법을 사용하여 시간 의존적 방식으로 유겐8 세포에서 발암 단백질 발현을 저하시킨다
알보시딥은 반복 투여 요법을 사용하는 경우 유겐8에서 MCL-1을 시간 의존적으로 하향 조절한다 (도 16). 시간 의존성은 시간이 지남에 따라 β-액틴과 비교된 MCL-1, Bcl-xL 및 Bcl-2의 상대적 발현을 모니터링함으로써 관찰된다. MCL-1, Bcl-xL 및 Bcl-2의 상대적 발현은 280 nM의 알보시딥을 투여한 후 0 - 96 시간 시점에서 측정되었다.
세포를 시험관내에서 280 nM 알보시딥으로 3회 (3회의 24시간 기간, 2회의 24시간 휴식) 처리하였다. 처리 후, MCL-1, Bcl-xL 및 Bcl-2 발현의 검출을 위한 표준 면역블롯팅 기술을 사용하여 세포를 수확하고 제조하였다. β-액틴과 비교된 MCL-1, Bcl-xL 및 Bcl-2의 상대적 발현은 알보시딥이 유겐8 세포에서 발암 단백질의 발현을 저하시킴을 보여준다.
실시예 12
알보시딥은 ACM (또는 Flam) 조합에서 MCL-1 발현을 억압한다
알보시딥은 시험관내에서 모델링된 바와 같이, ACM (또는 FLAM) 요법의 과정에 걸쳐, MCL-1의 발현을 포함하여, 슈퍼 인핸서 복합 조절 유전자(super enhancer complex regulated gene)를 억압한다 (도 17A).
MV-4-11 세포를 시험관내에서 80 nM 알보시딥, 1 μM 팔보시클립 또는 50 nM 디나시클립으로 처리하였다. 각각의 처리는 도 17A에 나타낸 바와 같이 각각의 24 시간 EC 50에서 투여되었다. 처리 후, MCL-1의 검출을 위한 표준 면역블롯팅 기술을 사용하여 세포를 수확하고 제조하였다. β-액틴과 비교된 MCL-1의 상대적 발현은 상이한 처리가 어떻게 MV-4-11 세포에서 MCL-1의 발현을 저하시키는 지를 보여준다 (도 17B).
관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에서 구체적으로 기재된 구체적 실시양태에 대한 다수의 균등물을 불과 통상적인 실험을 사용하여 인식할 것이거나, 알아낼 수 있을 것이다. 이러한 균등물은 특정 실시양태의 범위에 포함되도록 의도된다.
참조 문헌
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4 Yang, X. "Bone Marrow Stroma-mediated Resistance to FLT3 Inhibitors in FLT3-ITD AML Is Mediated by Persistent Activation of Extracellular Regulated Kinase." Br J Haematol 164.1 (2014): 61-72.
본 명세서 또는 첨부된 출원 데이터 시트(Application Data Sheet)에 언급된 미국 특허, 미국 특허 출원 공보, 미국 특허 출원, 외국 특허, 외국 특허 출원 및 비특허 간행물 모두는 본 기재와 모순되지 않는 정도로 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
전술한 내용으로부터, 비록 본 발명의 구체적 실시양태가 실례의 목적으로 본원에 기재되었지만, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 다양한 수정이 이루어질 수 있다는 것이 인식될 것이다. 따라서, 본 발명은 첨부된 청구범위에 의한 것을 제외하고는 제한되지 않는다.

Claims (31)

  1. a) 암 치료를 필요로 하는 환자의 골수로부터 얻은 암세포 표본에 대한 BH3 프로파일링 데이터를 요청하는 단계; 및
    b) 상기 암세포 표본에서의 NOXA 프라이밍이 적어도 15%인 경우 알보시딥을 포함하는 치료 요법을 상기 환자에게 수행하는 단계
    를 포함하는, 암 치료를 필요로 하는 환자에서 암 치료 방법.
  2. 제1항에 있어서, 치료 요법이 암세포 표본에서의 NOXA 프라이밍이 적어도 20%인 경우에만 환자에게 수행되는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 치료 요법이 암세포 표본에서의 NOXA 프라이밍이 적어도 25%인 경우에만 환자에게 수행되는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 치료 요법이 암세포 표본에서의 NOXA 프라이밍이 적어도 30%인 경우에만 환자에게 수행되는 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 암세포 표본으로부터 얻은 MCL-1 발현 데이터를 요청하는 단계, 및 상기 암세포 표본에서의 MCL-1 발현이 정상 세포에서의 MCL-1 발현의 적어도 1.1배인 경우에만 치료 요법을 환자에게 수행하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 요법이 환자의 세포유전학이 위험이 높은 경우에만 환자에게 수행되는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 요법이 환자가 골수형성이상 증후군 (MDS)의 이전 병력을 가진 경우에만 환자에게 수행되는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, BH3 프로파일링 데이터가 암세포 표본을 투과화하는 단계, 상기 투과화된 세포를 1종 이상의 BH3 도메인 펩티드와 접촉시 미토콘드리아 막 전위의 변화를 측정하는 단계; 및 미토콘드리아 막 전위의 손실과 아폽토시스를 유도하는 화학요법제에 대한 세포의 화학민감성 사이의 상관관계를 입증하는 단계를 포함하는 방법으로부터 얻어지는 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, BH3 도메인 펩티드가 BIM, BIM2A, BAD, BID, HRK, PUMA, NOXA, BMF, BIK 또는 PUMA2A, 또는 그의 조합물인 것이 방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, BH3 도메인 펩티드가 0.1 μM 내지 200 μM 범위의 농도로 사용되는 것인 방법.
  11. a) 암 치료를 필요로 하는 환자의 골수로부터 얻은 암세포 표본에 대한 MCL-1 발현 데이터를 요청하는 단계; 및
    b) 상기 암세포 표본에서의 MCL-1 발현이 정상 세포에서의 MCL-1 발현의 적어도 1.1배인 경우 알보시딥을 포함하는 치료 요법을 상기 환자에게 수행하는 단계
    를 포함하는, 암 치료를 필요로 하는 환자에서 암 치료 방법.
  12. 제11항에 있어서, 치료 요법이 암세포 표본에서의 MCL-1 발현이 정상 세포에서의 MCL-1 발현의 적어도 1.5배인 경우에만 환자에게 수행되는 것인 방법.
  13. 제11항에 있어서, 치료 요법이 암세포 표본에서의 MCL-1 발현이 정상 세포에서의 MCL-1 발현의 적어도 2배인 경우에만 환자에게 수행되는 것인 방법.
  14. 제11항에 있어서, 치료 요법이 암세포 표본에서의 MCL-1 발현이 정상 세포에서의 MCL-1 발현의 적어도 5배인 경우에만 환자에게 수행되는 것인 방법.
  15. 제11항 내지 제14항에 있어서, 암세포 표본에 대한 BH3 프로파일링을 요청하는 단계 및 종양 또는 암 세포 표본에서의 NOXA 프라이밍이 적어도 15%인 경우에만 치료 요법을 수행하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  16. 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 요법이 환자의 세포유전학이 위험이 높은 경우에만 환자에게 수행되는 것인 방법.
  17. 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 요법이 환자가 골수형성이상 증후군 (MDS)의 이전 병력을 가진 경우에만 환자에게 수행되는 것인 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 혈액암인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 혈액암이 급성 골수성 백혈병 (AML), 다발성 골수종, 여포성 림프종, 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), 만성 림프구성 백혈병, 및 비호지킨 림프종으로부터 선택되는 것인 방법.
  20. 제18항에 있어서, 혈액암이 급성 골수성 백혈병 (AML)인 방법.
  21. 제18항에 있어서, 혈액암이 골수형성이상 증후군 (MDS)인 방법.
  22. 제18항에 있어서, 혈액암이 만성 림프구성 백혈병 (CLL)인 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 요법이 알보시딥, 시타라빈, 및 미톡산트론 (FLAM)을 포함하는 것인 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 암세포 표본이 비고형 종양의 생검으로부터 유래되는 것인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 암세포 표본이 다발성 골수종, 급성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프형성 백혈병, 외투 세포 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종 또는 비호지킨 림프종을 가진 환자의 생검으로부터 유래되는 것인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 암세포 표본이 고체 매트릭스 또는 비드에 결합된 항-CD138 항체를 가진 생검 샘플로부터의 선택에 의해 보강되는 다발성 골수종 세포인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 암세포 표본이 CD45-지시된 항체에 결합함으로써 보강되는 급성 골수성 백혈병 세포인 방법.
  28. 제26항에 있어서, 암세포 표본이 비-B 세포 고갈에 의해 보강되는 만성 림프형성 백혈병 또는 미만성 거대 B 세포 림프종인 방법.
  29. 환자의 골수로부터의 투과화된 암세포 표본을 1종 이상의 BH3 도메인 펩티드와 접촉시키는 단계;
    상기 표본에서 NOXA 프라이밍을 측정하는 단계; 및
    상기 표본에서의 NOXA 프라이밍이 적어도 15%인 경우 환자를 알보시딥을 포함하는 치료 요법에 대한 가능성 반응자로서 분류하는 단계
    를 포함하는, 알보시딥을 포함하는 치료 요법에 대한 환자의 반응 가능도를 결정하는 방법.
  30. 환자의 골수로부터의 암세포 표본에서 MCL-1 발현을 측정하는 단계; 및
    상기 표본에서의 MCL-1 발현이 정상 세포에서의 MCL-1 발현의 적어도 1.1배인 경우 환자를 알보시딥을 포함하는 치료 요법에 대한 가능성 반응자로서 분류하는 단계
    를 포함하는, 알보시딥을 포함하는 치료 요법에 대한 환자의 반응 가능도를 결정하는 방법.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 치료 요법을 가능성 반응자로서 분류된 환자에게 수행하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
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