TW202134239A - 用於預測靶向細胞凋亡途徑的化合物的抗癌功效的方法和組合物 - Google Patents

用於預測靶向細胞凋亡途徑的化合物的抗癌功效的方法和組合物 Download PDF

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Abstract

提供了用於預測MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-2抑制劑或Bcl-xL抑制劑在治療癌症患者中的功效的生物標記。還提供了用於評估生物標記的基因含量的組合物，例如試劑盒，以及使用此類基因含量預測癌症患者對MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-2抑制劑或Bcl-xL抑制劑的反應的方法。可以使用此類訊息來確定癌症患者的預後和治療選擇。

Description

用於預測靶向細胞凋亡途徑的化合物的抗癌功效的方法和組合物
本申請總體上關於癌症治療。
逃避細胞凋亡是人類癌症的標誌，並且是治療抗性的常見原因（Hanahan D等人, Cell [細胞](2000) 100:57-70；Delbridge AR等人, Cold Spring Harb Perspect Biol [冷泉港生物學展望](2012) 4）。因此，在人類癌症中靶向關鍵的細胞凋亡參與者是用於開發全新類型的抗癌療法的有吸引力的新策略。
對抗癌療法有臨床反應通常僅限於一部分患者。為了最大化抗癌療法的效率，已經提出了基於分子生物標記的個性化化學療法。然而，對能夠預測對抗癌療法的反應的預測性生物標記的鑒定仍然是一個挑戰。因此，存在對開發生物標記的持續需求，這些生物標記用於預測靶向細胞凋亡途徑的化合物的抗癌功效。
在一方面，本揭露提供了用於在有需要的受試者中治療癌症的方法。在一個實施例中，該方法包括：在來源於該受試者的測試樣品中測量至少一種包含Noxa的生物標記的含量；將該至少一種生物標記的含量與該至少一種生物標記的對應的參考含量進行比較，以確定與參考含量的差異；並且當該差異達到預定的閾值時，向該受試者施用有效量的MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-xL抑制劑或Bcl-2抑制劑。
在另一方面，本揭露提供了用於鑒定患有癌症的受試者可能對用MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-xL抑制劑或Bcl-2抑制劑的治療產生反應的方法。在一個實施例中，該方法包括：在來源於該受試者的測試樣品中測量至少一種包含Noxa的生物標記的含量；並將該至少一種生物標記的含量與該至少一種生物標記的對應的參考含量進行比較，以確定與參考含量的差異；並且當該差異達到預定的閾值時，鑒定該受試者可能對用MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-xL抑制劑或Bcl-2抑制劑的治療產生反應。
在一個實施例中，用於鑒定患有癌症的受試者可能對用MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-xL抑制劑或Bcl-2抑制劑的治療產生反應的方法進一步包括向被鑒定為可能對用MDM2抑制劑、Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-xL抑制劑或Bcl-2抑制劑的治療產生反應的受試者施用有效量的MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-xL抑制劑或Bcl-2抑制劑。
在另一方面，本揭露提供了用於在受試者中監測治療功效的方法，該受試者患有癌症，並在治療期內已經用MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-xL抑制劑或Bcl-2抑制劑進行了治療。在一個實施例中，該方法包括：治療期後從該受試者獲得測試樣品；在該測試樣品中測量至少一種包含Noxa的生物標記的含量，以獲得該至少一種生物標記的治療後含量；將該治療後含量與來源於該受試者的治療期之前的樣品中的該至少一種生物標記的基線含量進行比較，以確定該至少一種生物標記的含量的治療後變化；並且當該治療後變化達到預定的閾值，或當該治療後變化未達到預定的閾值時，向該受試者繼續施用MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-xL抑制劑或Bcl-2抑制劑，增加對該受試者的MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-xL抑制劑或Bcl-2抑制劑的劑量，或向該受試者施用有效量的與MDM2抑制劑、Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-xL抑制劑或Bcl-2抑制劑組合的第二抗癌治療劑，或向該受試者停止施用MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-xL抑制劑或Bcl-2抑制劑。
在某些實施例中，在治療期後樣品中Noxa含量的升高或維持表明了對用MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-xL抑制劑或Bcl-2抑制劑治療產生持續反應性的可能性。在某些實施例中，樣品中Noxa含量的降低表明了對用MDM2抑制劑、Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-xL抑制劑或Bcl-2抑制劑的治療產生降低的反應性的可能性。
在一些實施例中，第二抗治療劑可以選自抗腫瘤劑、抗血管生成劑、化學治療劑和肽類癌症治療劑。在又另一個實施例中，抗腫瘤劑選自抗生素型藥劑、烷化劑、抗代謝劑、激素藥劑、免疫學藥劑、干擾素型藥劑、激酶抑制劑、其他藥劑及其組合。
在一些實施例中，將免疫檢查點分子作為第二抗癌治療劑與MDM2抑制劑組合施用。在一些實施例中，將化學治療劑作為第二抗癌治療劑與Bcl-2/Bcl-xL抑制劑或Bcl-2抑制劑或Bcl-xL抑制劑組合施用。
在一些實施例中，可以將第二抗癌治療劑與MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL抑制劑或Bcl-2抑制劑或Bcl-xL抑制劑同時地、單獨地或順序地施用。
在某些實施例中，癌症是實體瘤或血液學癌症。在某些實施例中，癌症選自腎上腺皮質癌、肛門癌、星形細胞瘤、兒童小腦或大腦癌、基底細胞癌、膽道癌（bile duct cancer）、膀胱癌（例如，泌尿膀胱癌）、骨腫瘤、腦癌、小腦星形細胞瘤、大腦星形細胞瘤/惡性膠質瘤、室管膜瘤、髓母細胞瘤、幕上原始神經外胚層瘤、視覺通路和下丘腦膠質瘤、乳腺癌、伯基特淋巴瘤、子宮頸癌、結腸癌、肺氣腫、子宮內膜癌、食道癌、尤因氏肉瘤、視網膜母細胞瘤、胃/胃部癌（gastric/stomach cancer）、膠質瘤、頭頸癌、心臟癌症、霍奇金淋巴瘤、胰島細胞癌（內分泌胰腺癌）、卡波西肉瘤、腎癌（腎細胞癌）、喉癌（laryngeal cancer）、肝癌（例如，肝細胞癌）、肺癌（例如，小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺鱗狀細胞癌）、神經母細胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、胃腸道癌、咽癌、前列腺癌、直腸癌、視網膜母細胞瘤、尤因腫瘤家族、皮膚癌、睾丸癌、咽喉癌（throat cancer）、甲狀腺癌、膽管癌（cholangiocarcinoma）、陰道癌和小細胞癌（例如，小細胞肺癌（SCLC）、肺外小細胞癌（EPSCC）、前列腺小細胞癌、或膀胱小細胞癌）、黑色素瘤、皮膚鱗狀細胞癌、膠質母細胞瘤、子宮腫瘤（hysterocarcinoma）、骨肉瘤、子宮癌、子宮CS、結腸直腸癌、肉瘤、嫌色細胞癌、透明細胞RCC、乳突狀RCC、葡萄膜黑色素瘤、睾丸生殖細胞瘤、低分級膠質瘤（LGG）、間皮瘤、PCPG、或胸腺瘤。在某些實施例中，癌症選自慢性淋巴細胞性白血病（CLL）、急性髓性白血病（AML）、T細胞幼淋巴細胞白血病、多發性骨髓瘤（MM）、華氏（Waldenstrom）巨球蛋白血症（WM）、急性淋巴母細胞性白血病（ALL）和淋巴瘤（例如，被套細胞淋巴瘤、瀰漫性大B細胞淋巴瘤）。
在一方面，本揭露提供了用於在有需要的受試者中治療癌症的方法。在一個實施例中，該方法包括：在來源於該受試者的測試樣品中測量至少一種包含ASCL1的生物標記的含量；將該至少一種生物標記的含量與該至少一種生物標記的對應的參考含量進行比較，以確定與參考含量的差異；並且當該差異達到預定的閾值時，向該受試者施用有效量的MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-xL抑制劑或Bcl-2抑制劑。
在另一方面，本揭露提供了用於鑒定患有癌症的受試者可能對用MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-xL抑制劑或Bcl-2抑制劑的治療產生反應的方法。在一個實施例中，該方法包括：在來源於該受試者的測試樣品中測量至少一種包含ASCL1的生物標記的含量；並將該至少一種生物標記的含量與該至少一種生物標記的對應的參考含量進行比較，以確定與參考含量的差異；並且當該差異達到預定的閾值時，鑒定該受試者可能對用MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-xL抑制劑或Bcl-2抑制劑的治療產生反應。
在一個實施例中，用於鑒定患有癌症的受試者可能對用MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-xL抑制劑或Bcl-2抑制劑的治療產生反應的方法進一步包括向被鑒定為可能對用MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-xL抑制劑或Bcl-2抑制劑的治療產生反應的受試者施用有效量的MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-xL抑制劑或Bcl-2抑制劑。
在某些實施例中，癌症是神經內分泌癌。在某些實施例中，癌症選自肺大細胞神經內分泌癌（LCNEC）、甲狀腺瘤、中腸癌、膽囊癌、卵巢癌、子宮頸癌、嗜鉻細胞瘤、梅克爾細胞瘤、胃癌、食道癌、胰腺癌、胃腸道癌、乳腺癌、肝癌、頭頸癌、膽管癌、或小細胞癌（例如，小細胞肺癌、肺外小細胞癌（EPSCC）、前列腺小細胞癌、或膀胱小細胞癌）。
在一方面，本揭露提供了用於在有需要的受試者中治療癌症的方法。在一個實施例中，該方法包括：在來源於該受試者的測試樣品中測量至少一種包含Noxa和ASCL1兩者的生物標記的含量；將該至少一種生物標記的含量與該至少一種生物標記的對應的參考含量進行比較，以確定與參考含量的差異；並且當該差異達到預定的閾值時，向該受試者施用有效量的MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-xL抑制劑或Bcl-2抑制劑。
在另一方面，本揭露提供了用於鑒定患有癌症的受試者可能對用MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-xL抑制劑或Bcl-2抑制劑的治療產生反應的方法。在一個實施例中，該方法包括：在來源於該受試者的測試樣品中測量至少一種包含Noxa和ASCL1兩者的生物標記的含量；並將該至少一種生物標記的含量與該至少一種生物標記的對應的參考含量進行比較，以確定與參考含量的差異；並且當該差異達到預定的閾值時，鑒定該受試者可能對用MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-xL抑制劑或Bcl-2抑制劑的治療產生反應。
在一個實施例中，用於鑒定患有癌症的受試者可能對用MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-xL抑制劑或Bcl-2抑制劑的治療產生反應的方法進一步包括向被鑒定為可能對用MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-xL抑制劑或Bcl-2抑制劑的治療產生反應的受試者施用有效量的MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-xL抑制劑或Bcl-2抑制劑。
在另一方面，本揭露提供了用於在受試者中監測治療功效的方法，該受試者患有癌症，並在治療期內已經用MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-xL抑制劑或Bcl-2抑制劑進行了治療。在一個實施例中，該方法包括：治療期後從該受試者獲得測試樣品；在該測試樣品中測量至少一種包含Noxa和ASCL1兩者的生物標記的含量，以獲得該至少一種生物標記的治療後含量；將該治療後含量與來源於該受試者的治療期之前的樣品中的該至少一種生物標記的基線含量進行比較，以確定該至少一種生物標記的含量的治療後變化；並且當該治療後變化達到預定的閾值，或當該治療後變化未達到預定的閾值時，向該受試者繼續施用MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-xL抑制劑或Bcl-2抑制劑，增加對該受試者的MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-xL抑制劑或Bcl-2抑制劑的劑量，向該受試者施用有效量的與MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-xL抑制劑或Bcl-2抑制劑組合的第二抗癌治療劑，或向該受試者停止施用MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-xL抑制劑或Bcl-2抑制劑。
在某些實施例中，癌症是神經內分泌癌。
在某些實施例中，該至少一種生物標記包含Noxa和ASCL1，並且癌症是神經內分泌癌。在某些實施例中，神經內分泌癌是肺大細胞神經內分泌癌（LCNEC）、甲狀腺瘤、中腸癌、膽囊癌、卵巢癌、子宮頸癌、嗜鉻細胞瘤、梅克爾細胞瘤、胃癌、食道癌、胰腺癌、胃腸道癌、乳腺癌、肝癌、頭頸癌、膽管癌、或小細胞癌（例如，小細胞肺癌、肺外小細胞癌（EPSCC）、前列腺小細胞癌、或膀胱小細胞癌）。在某些實施例中，神經內分泌癌是小細胞癌。在某些實施例中，該至少一種生物標記包含Noxa和ASCL1，並且癌症是小細胞肺癌。
在本文所述的任何方面，通過mRNA含量、蛋白質含量或DNA含量來測量該至少一種生物標記的含量。在某些實施例中，通過擴增測定、雜交測定、定序測定或免疫測定來測量該至少一種生物標記的含量。
在某些實施例中，擴增測定是基於聚合酶鏈式反應（PCR）的方法。
在某些實施例中，通過統計學方法設置預定的閾值。
在某些實施例中，當測試樣品中Noxa含量比Noxa的相應的參考含量高至少15%（例如，至少25%、至少35%、至少45%、至少50%）時，達到Noxa的預定的閾值。
在某些實施例中，Noxa的參考含量代表患有癌症的受試者的一般群體中Noxa的平均含量。在某些實施例中，在對照樣品中測量Noxa的參考含量。在某些實施例中，對照樣品是具有如下Noxa含量的樣品，該Noxa的含量代表一般癌症群體中Noxa的平均含量。
在某些實施例中，當測試樣品中ASCL1含量比ASCL1的相應的參考含量高至少15%（例如，至少25%、至少50%、至少100%、至少150%）時，達到ASCL1的預定的閾值。
在某些實施例中，ASCL1的參考含量代表患有癌症的受試者的一般群體中ASCL1的平均含量。
在某些實施例中，在對照樣品中測量ASCL1的參考含量。在某些實施例中，對照樣品是具有如下ASCL1含量的樣品，該ASCL1含量代表一般癌症群體中ASCL1的平均含量。
在某些實施例中，樣品是體液樣品或組織樣品。
在某些實施例中，該至少一種生物標記進一步包含選自下組的一種或多種另外的生物標記，該組由以下組成：Bcl-xL、Bcl-2、Mcl-1、包含Bcl-xL蛋白的蛋白質複合物、包含Bcl-2的蛋白質複合物，或其任何組合。
在某些實施例中，比較的步驟是用演算法進行的。
在某些實施例中，該演算法包括分類演算法。
在某些實施例中，差異包括測試樣品中含量的測試得分和參考含量的參考得分之間的差異，並且其中測試得分和參考得分由演算法計算。
在某些實施例中，本文所述的Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑是具有式 (I)、(II) 或 (III) 的結構的化合物：
Figure 02_image001
Figure 02_image003
Figure 02_image005
或其藥學上可接受的鹽； 其中A環是
Figure 02_image007
或
Figure 02_image009
； 取代的或未取代的X選自下組，該組由以下組成：亞烷基、亞烯基、環亞烷基、環亞烯基和雜環亞烷基； Y選自下組，該組由以下組成：(CH2 )n -N(Ra )2 和
Figure 02_image011
； Q選自下組，該組由以下組成：O、O(CH2 )1-3 、NRc 、NRc (C1-3 亞烷基)、OC(=O)(C1-3 亞烷基)、C(=O)O、C(=O)O(C1-3 亞烷基)、NHC(=O)(C1-3 亞烷基)、C(=O)NH和C(=O)NH(C1-3 亞烷基)； Z是O或NRc ； R1 和R2 獨立地選自下組，該組由以下組成：H、CN、NO2 、鹵代、烷基、環烷基、烯基、環烯基、炔基、芳基、雜芳基、雜環烷基、OR'、SR'、NR'R''、COR'、CO2 R'、OCOR'、CONR'R''、CONR'SO2 R''、NR'COR''、NR'CONR''R'''、NR'C=SNR''R'''、NR'SO2 R''、SO2 R'和SO2 NR'R''； R3 選自下組，該組由以下組成：H、烷基、環烷基、烯基、環烯基、炔基、芳基、雜芳基、雜環烷基、OR'、NR'R''、OCOR'、CO2 R'、COR'、CONR'R''、CONR'SO2 R''、C1-3 亞烷基CH(OH)CH2 OH、SO2 R'和SO2 NR'R''； R'、R''和R'''獨立地是H、烷基、環烷基、烯基、環烯基、炔基、芳基、雜芳基、C1-3 亞烷基雜環烷基、或雜環烷基； R'和R''、或R''和R'''可以與它們所鍵合的原子一起形成3至7元環； R4 是氫、鹵代、C1-3 烷基、CF3 或CN； R5 是氫、鹵代、C1-3 烷基、取代的C1-3 烷基、羥基烷基、烷氧基或取代的烷氧基； R6 選自下組，該組由以下組成：H、CN、NO2 、鹵代、烷基、環烷基、烯基、環烯基、炔基、芳基、雜芳基、雜環烷基、OR'、SR'、NR'R''、CO2 R'、OCOR'、CONR'R''、CONR'SO2 R''、NR'COR''、NR'CONR''R'''、NR'C=SNR''R'''、NR'SO2 R''、SO2 R'和SO2 NR'R''； 取代的或未取代的R7 選自下組，該組由以下組成：氫、烷基、烯基、(CH2 )0-3 環烷基、(CH2 )0-3環烯基 、(CH2 )0-3 雜環烷基、(CH2 )0-3 芳基和(CH2 )0-3 雜芳基； R8 選自下組，該組由以下組成：氫、鹵代、NO2 、CN、CF3 SO2 和CF3 ； Ra 選自下組，該組由以下組成：氫、烷基、雜烷基、烯基、羥基烷基、烷氧基、取代的烷氧基、環烷基、環烯基和雜環烷基； Rb 是氫或烷基； Rc 選自下組，該組由以下組成：氫、烷基、取代的烷基、羥基烷基、烷氧基和取代的烷氧基；並且 n、r和s獨立地是1、2、3、4、5或6。
在某些實施例中，本文所述的Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑是具有式 (IV) 的結構的化合物： (IV)
Figure 02_image013
或其藥學上可接受的鹽； R21 是SO2 R2 '； R22 是烷基，較佳為C1 -C4 烷基，更佳為甲基、丙基或異丙基； R23 是烷基，較佳為C1 -C4 烷基，更佳為甲基、丙基或異丙基； R24 是鹵素，較佳為氟、氯； R25 是鹵素，較佳為氟、氯； R26 選自H、鹵素、烷基，較佳為氟、氯、C1 -C4 烷基，更佳為甲基、丙基、異丙基； R21b 是H或烷基，較佳為C1 -C4 烷基，更佳為甲基、丙基或異丙基； n2 、r2 和s2 獨立地是1、2、3、4、5或6，更佳地r2 和s2 都是2，並且n2 是3、4或5，更佳地，n2 、r2 和s2 都是2；並且 R2 '是烷基，較佳為C1 -C4 烷基，更佳為甲基、丙基或異丙基。
在某些實施例中，本文所述的Bcl-2抑制劑是具有式 (V) 的結構的化合物： (V)
Figure 02_image015
， 或其藥學上可接受的鹽；A3 選自下組，該組由以下組成：
Figure 02_image017
、
Figure 02_image019
、
Figure 02_image021
、
Figure 02_image023
、
Figure 02_image025
、
Figure 02_image027
、
Figure 02_image029
、
Figure 02_image031
、
Figure 02_image033
、以及
Figure 02_image035
； E3 是碳原子，並且
Figure 02_image037
是雙鍵；或 E3 是-C(H)-，並且
Figure 02_image037
是單鍵；或 E3 是氮原子，並且
Figure 02_image037
是單鍵； X31 、X32 和X33 各自獨立地選自下組，該組由以下組成：-CR38 =和-N=； R31a 和R31b 與它們所附接的碳原子一起形成3元、4元或5元任選取代的環烷基；或 R31a 和R31b 與它們所附接的碳原子一起形成4元或5元任選取代的雜環； R32 選自下組，該組由以下組成：-NO2 、-SO2 CH3 和-SO2 CF3 ； R32a 選自下組，該組由以下組成：氫和鹵素； R33 選自下組，該組由以下組成：氫、-CN、-C≡CH和-N(R34a )(R34b )； R34a 選自下組，該組由以下組成：任選取代的C1-6 烷基、任選取代的C3-6 環烷基、雜環、雜烷基、(環烷基)烷基和(雜環)烷基； R34b 選自下組，該組由以下組成：氫和C1-4 烷基； R35 選自下組，該組由以下組成：任選取代的C1-6 烷基、雜環、雜烷基、(環烷基)烷基和(雜環)烷基； R36a 、R36c 、R36e 、R36f 和R36g 各自獨立地選自下組，該組由以下組成：氫、任選取代的C1-6 烷基、任選取代的C3-6 環烷基、任選取代的芳基、任選取代的雜芳基、雜環、雜烷基、(環烷基)烷基和(雜環)烷基； R36b 和R36d 各自獨立地選自下組，該組由以下組成：氫、C1-4 烷基和鹵素； R37 選自下組，該組由以下組成：任選取代的C1-6 烷基、雜環、雜烷基、(環烷基)烷基和(雜環)烷基；並且 R38 選自下組，該組由以下組成：氫和鹵素。
在某些實施例中，Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-xL抑制劑或Bcl-2抑制劑是選自表1-A、表1-B和表1-C的化合物或其藥學上可接受的鹽。
在某些實施例中，Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑是具有以下結構的(R )-2-(1-(3-(4-(N-(4-(4-(3-(2-(4-氯苯基)-1-異丙基-5-甲基-4-(甲基磺醯基)-1H-吡咯-3-基)-5-氟苯基)呱嗪-1-基)苯基)氨磺醯基)-2-(三氟甲基磺醯基)苯基胺基)-4-(苯硫基)丁基)呱啶-4-羰基氧基)乙基膦酸（在本文中還被稱為“化合物A15”），或其藥學上可接受的鹽：
Figure 02_image039
。
在某些實施例中，Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑是具有以下結構的(R)-1-(3-(4-(N-(4-(4-(3-(2-(4-氯苯基)-1-異丙基-5-甲基-4-(甲基磺醯基)-1H-吡咯-3-基)-5-氟苯基)呱嗪-1-基)苯基)氨磺醯基)-2-(三氟甲基磺醯基)苯基胺基)-4-(苯硫基)丁基)呱啶-4-甲酸（在本文中還被稱為“化合物B4”），或其藥學上可接受的鹽：
Figure 02_image041
。
在某些實施例中，Bcl-2抑制劑選自具有以下結構的化合物
Figure 02_image043
， 或其藥學上可接受的鹽。
在某些實施例中，MDM2抑制劑包含具有以下式 (VI) 的化學結構：
Figure 02_image045
或其藥學上可接受的鹽，其中
Figure 02_image047
選自下組，該組由以下組成：
Figure 02_image049
； B是C4-7 碳環； R61 是H、取代的或未取代的C1-4 烷基、取代的或未取代的環烷基、取代的或未取代的雜環烷基、OR6a 、或NR6a R6b ； n3 是0、1或2； R62 、R63 、R64 、R65 、R67 、R68 、R69 和R70 獨立地選自下組，該組由以下組成：H、F、Cl、CH3 和CF3 ； R66 是
Figure 02_image051
或
Figure 02_image053
； R6a 是氫或取代的或未取代的C1-4 烷基； R6b 是氫或取代的或未取代的C1-4 烷基； R6c 和R6d 是環B的一個碳原子上的取代基，其中 R6c 是H、C1-3 烷基、C1-3 亞烷基-OR6a 、OR6a 或鹵代； R6d 是H、C1-3 烷基、C1-3 亞烷基-OR6a 、OR6a 或鹵代；或 R6c 和R6d 與它們所附接的碳一起形成4元至6元螺取代基，任選地包含氧原子；並且 R6e 是-C(=O)OR6a 、-C(=O)NR6a R6b 或-C(=O)NHSO2 CH3 。
在某些實施例中，
Figure 02_image047
是
Figure 02_image056
； B是
Figure 02_image058
；並且 R6c 和R6d 是F和F、H和H、OH和CH3 、OH和H、CH3 和CH3 、CH3 和OH、H和OH、CH2 CH3 和CH2 CH3 、或CH2 OH和CH2 OH。
在某些實施例中，
Figure 02_image060
是H、CH3 或CH2 CH3 。
在某些實施例中，R62 是H；R63 是鹵代；R64 和R65 是H。
在某些實施例中，R67 是氟；R68 、R69 和R70 中的每個是H；並且R6e 是-C(=O)OH、-C(=O)NH2 或-C(=O)NHSO2 CH3 。
在某些實施例中，MDM2抑制劑是選自以下的化合物：
Figure 02_image062
、
Figure 02_image064
、
Figure 02_image066
、
Figure 02_image068
、
Figure 02_image070
、
Figure 02_image072
、
Figure 02_image074
、
Figure 02_image076
、
Figure 02_image078
、
Figure 02_image080
、
Figure 02_image082
、
Figure 02_image084
、
Figure 02_image086
、
Figure 02_image088
和
Figure 02_image090
，或藥學上可接受的鹽。
在某些實施例中，MDM2抑制劑是
Figure 02_image092
和
Figure 02_image094
或其藥學上可接受的鹽。
在某些實施例中，MDM2抑制劑是化合物C，或藥學上可接受的鹽。
在又另一個方面，本揭露提供了用於在本文所述的方法中使用的試劑盒。在一個實施例中，試劑盒包含一種或多種用於測量至少一種包含Noxa的生物標記的含量的試劑。在一個實施例中，試劑盒包含一種或多種用於測量至少一種包含ASCL1的生物標記的含量的試劑。在一個實施例中，試劑盒包含一種或多種用於測量至少一種包含Noxa和ASCL1兩者的生物標記的含量的試劑。
在某些實施例中，用於測量Noxa含量的試劑包含可以與Noxa的多核苷酸雜交的引子或探針，或可以與Noxa的蛋白質特異性結合的抗體。在某些實施例中，用於測量ASCL1含量的試劑包含可以與ASCL1的多核苷酸雜交的引子或探針，或可以與ASCL1的蛋白質特異性結合的抗體。在某些實施例中，一種或多種試劑包含可以與Noxa的多核苷酸雜交的第一引子或第一探針、或可以與Noxa的蛋白質特異性結合的第一抗體，以及可以與ASCL1的多核苷酸雜交的第二引子或第二探針、或可以與ASCL1的蛋白質特異性結合的第二抗體。
在某些實施例中，一種或多種試劑被可檢測地標記。
在另一方面，本揭露提供了用於測量至少一種包含Noxa、ASCL1或兩者的生物標記的含量的一種或多種試劑在生產用於進行本文所述方法的診斷試劑盒中的用途。在一個實施例中，該至少一種生物標記包含Noxa。在一個實施例中，該至少一種生物標記包含ASCL1。在一個實施例中，該至少一種生物標記包含Noxa和ASCL1兩者。
在更詳細地描述本揭露之前，應理解的是本揭露不限於所描述的具體實施例，因此這些當然可以改變。還應當理解，本文使用的術語僅是為了描述具體實施例的目的，而並不意圖是限制性的，因為本揭露的範圍將僅由所附申請專利範圍限定。
除非另外定義，本文所用的全部技術術語和科學術語具有與本揭露所屬領域的通常知識者通常所理解的相同意義。雖然與本文所述的那些方法和材料相似或等同的任意方法和材料也可以用於實施或測試本揭露，但是現在描述較佳的方法和材料。
在本說明書中引用的所有公開物和專利通過引用結合於此，就像每個單獨公開物或專利被確切地並且單獨地指示為通過引用被結合並且通過引用結合於此，以結合所引用的這些公開物來揭露和描述這些方法和/或材料。任何公開物的引用內容是針對在提交日之前的揭露，並且不能理解為承認因為先前揭露而本揭露不能獲得比這些公開物更早的申請日。此外，所提供的公開日期可能與實際的公開日期不同，實際的公開日期可能需要單獨地確認。
如將對於本領域通常知識者清楚的是，在閱讀本揭露時，本文描述和展示的單獨實施例的每一個具有離散的組成和特徵，這些組成和特徵可以在不偏離本揭露的範圍或精神的情況下易於與任何其他若干個實施例的特徵分離或組合。可以按照所敘述的事件的順序或按照邏輯上可行的任何其他順序來進行任何敘述的方法。
定義
提供以下定義來幫助讀者。除非另有定義，否則本文使用的所有技術術語、符號和其他科學或醫學術語或用辭旨在具有由化學和醫學領域通常知識者通常理解的含義。在一些情況下，為了清楚和/或為了便於參考而在本文中定義了具有通常理解的含義的術語，並且在本文中包括這些定義不應必須被解釋為表示與本領域中通常理解的術語的定義之間的實質性差異。
如本文所使用的，單數形式「一個/種（a/an）」以及「該（the）」包括複數指示物，除非上下文清楚地另外指明。
如本文所使用的，術語「生物標記」是指作為一些生物學狀態或狀況的可測量的指示物的生物分子。本文使用的術語「生物標記」旨在涵蓋例如目的多核苷酸、由目的多核苷酸編碼的多肽。本文提供的生物標記的實例可以是基因（例如，基因組DNA、cDNA）、或基因產物（例如，從基因轉錄的mRNA、或由基因編碼的蛋白質）。本文提供的特定的生物標記的實例包括例如Noxa和ASCL1。
關於生物標記的術語「含量」是指樣品中存在的目的生物標記的量或數量。這樣的量或數量可以用絕對術語（即，樣品中生物標記的總數量）、或相對術語（即，樣品中生物標記的濃度或百分比）表示。可以在DNA含量（例如，如由染色體區域中基因的量或數量或拷貝數表示）、RNA含量（例如，如mRNA量或數量表示）、或蛋白質含量（例如，如蛋白質量或數量或蛋白質複合物量或數量表示）上測量生物標記的含量。
值得注意的是，在本揭露中，例如「包括/包含/含有（comprises/comprised/comprising/contains/containing）」等術語旨在是包括性的或開放式的，並且不排除另外的、未列舉的元素或方法步驟。
術語「測定」、「測量」和「檢測」可互換地使用，並且是指定量和半定量的測定。
術語「雜交」是指核酸分子的至少部分互補的鏈的結合、雙鏈化或配對。當存在避免與非靶核酸序列非特異性結合的足夠程度的互補性時，核酸鏈可以與靶核酸鏈特異性雜交。對核酸雜交的大量指導可見於，例如，TijssenLaboratory Techniquesin Biochemistry and Molecular Bio logy-Hybridization with Nucleic Acid Probes [生物化學和分子生物學實驗室技術：與核酸探針雜交]第I部分, 第2章, “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays [雜交原理和核酸探針測定策略的綜述], ”(1993) 愛思維爾公司（Elsevier）, 紐約州）。
術語「核酸」和“多核苷酸」可互換地使用，並且是指任何長度的核苷酸的聚合形式（去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其類似物）。多核苷酸可以具有任何三維結構並且可以執行任何已知或未知的功能。多核苷酸的非限制性實例包括基因、基因片段、外顯子、內含子、信使RNA（mRNA）、轉移RNA、核糖體RNA、核酶、cDNA、shRNA、單鏈短或長RNA、重組多核苷酸、分支多核苷酸、質體、載體、任何序列的分離的DNA、控制區、任何序列的分離的RNA、核酸探針和引子。核酸分子可以是線性或環狀的。
術語「互補性」是指通過傳統的華森-克里克類型或其他非傳統類型在核酸序列和另一種核酸序列之間進行鹼基配對的能力。互補性可以是部分的或全部的。當一個或多個核酸鹼基根據鹼基配對原則不匹配時，發生部分互補性。百分比互補性表示核酸分子中可與第二核酸序列形成鹼基對的（例如，華森-克里克鹼基配對）的核酸鹼基的百分比（例如，10個鹼基中的5、6、7、8、9、10個鹼基配對是50%、60%＞、70%＞、80%＞、90%和100%互補）。
通常，「蛋白質」是多肽（即，通過肽鍵彼此連接的至少兩個胺基酸的串）。蛋白質可以包括胺基酸以外的部分（例如，可以是醣蛋白）和/或還可以另外進行加工或修飾。本領域通常知識者將理解，「蛋白質」可以是由細胞產生的完整多肽鏈（具有或不具有訊息序列），或者可以是其功能部分。本領域普通通常知識者將進一步理解，蛋白質有時可包含多於一個的多肽鏈，例如通過一個或多個二硫鍵連接或通過其他方式締合。
如本文所使用的，關於受試者對治療產生反應的「可能性」和「可能」是對該受試者中發生治療反應的可能性的度量。它可以與「概率」互換地使用。可能性是指大於推測但小於確定性的概率。因此，如果理性人使用常識、訓練或經驗得出結論認為鑒於當前情形，治療反應是可能的，則治療反應是可能的。在一個實施例中，術語「可能性」和「可能」表示發生治療反應的可能性的百分比的機會。在一些實施例中，患有癌症的受試者被鑒定為「可能反應」是指如下患有癌症的受試者，該受試者對用Bcl-2/Bcl-xL抑制劑和Bcl-2抑制劑或Bcl-xL抑制劑的治療產生反應有著大於30%機會、大於40%機會、大於50%機會、大於60%機會、大於70%機會、大於80%機會、大於90%機會。
如在受試者對癌症療法的治療反應的上下文中使用的術語「反應的」或「反應性」可互換地使用，並且是指受試者對治療的有益反應，而不是不利反應（即不良事件）。在受試者中，有益反應可以根據許多臨床參數來表達，這些臨床參數包括可檢測到的腫瘤消失（完全反應），腫瘤大小和/或癌細胞數減小（部分反應），腫瘤生長停滯（穩定的疾病），腫瘤生長速度降低（其延長整體存活期），可能導致腫瘤消退或排斥的抗腫瘤免疫反應增強；與腫瘤有關的一種或多種症狀在某種程度上的減輕；治療後的存活期長度增加；和/或治療後給定時間點處的死亡率降低。腫瘤大小和/或癌細胞數的持續增加（沒有任何有利於整體存活期的生長速率的降低）、和/或腫瘤轉移表明缺乏對治療的有益反應，並因此降低了反應性。
如本文所述，術語「有效量」是指當通過本發明的方法施用時，足以將用於治療目的病症或疾病的一種或多種活性成分有效遞送至有需要的個體的該一種或多種活性成分的量。在癌症或其他增殖性障礙的情況下，該藥劑的有效量可以減少（即，在某種程度上延遲並且較佳地停止）不想要的細胞增殖；減少癌細胞的數量；減小腫瘤大小；抑制（即，在一定程度上延遲並且較佳地停止）癌細胞浸潤到周邊器官中；抑制（即，在一定程度上延遲並且較佳地停止）腫瘤轉移；在一定程度上抑制腫瘤生長；減少靶細胞中的Bcl-2/Bcl-xL訊息傳遞；和/或在一定程度上緩解一種或多種症狀。
如本文所使用的，「癌症」是範圍廣泛的細胞惡性腫瘤的通用名稱，其特徵在於生長不受控、缺乏分化以及侵襲局部組織和轉移的潛力或能力。這些贅生性惡性腫瘤以不同程度的患病率影響體內的每個組織和器官。癌症涉及具有致癌細胞典型特徵（例如不受控的增殖、永生、轉移潛力、快速生長和增殖速率以及某些特有形態特徵）的細胞的存在。癌細胞通常呈腫瘤形式，但是此類細胞可以單獨存在，或可以作為獨立細胞（例如白血病細胞）在血流中循環。術語癌症和腫瘤在本文中可互換地使用。該術語包括所有已知的癌症和贅生性病症（無論被描述為惡性、良性、血液學的還是實體性的），以及所有階段和等級的癌症（包括轉移前和轉移後的癌症）。
如本文所使用的，術語「實體瘤」是指不包含囊腫或液體區域的任何癌症。實體瘤通常不包括白血病（即，血癌）。實體瘤可以是良性或惡性的。如本文所使用的，實體瘤的類型包括但不限於，腎上腺皮質癌、肛門癌、星形細胞瘤、兒童小腦或大腦癌、基底細胞癌、膽道癌、膀胱癌（例如，泌尿膀胱癌）、骨腫瘤、腦癌、小腦星形細胞瘤、大腦星形細胞瘤/惡性膠質瘤、室管膜瘤、髓母細胞瘤、幕上原始神經外胚層瘤、視覺通路和下丘腦膠質瘤、乳腺癌、伯基特淋巴瘤、子宮頸癌、結腸癌、肺氣腫、子宮內膜癌、食道癌、尤因氏肉瘤、視網膜母細胞瘤、胃/胃部癌、膠質瘤、頭頸癌、心臟癌症、霍奇金淋巴瘤、胰島細胞癌（內分泌胰腺癌）、卡波西肉瘤、腎癌（腎細胞癌）、喉癌、肝癌（例如，肝細胞癌）、肺癌（例如，小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺鱗狀細胞癌）、神經母細胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、胃腸道癌、咽癌、前列腺癌、直腸癌、視網膜母細胞瘤、尤因腫瘤家族、皮膚癌、睾丸癌、咽喉癌、甲狀腺癌、膽管癌、陰道癌和小細胞癌（例如，小細胞肺癌（SCLC）、肺外小細胞癌（EPSCC）、前列腺小細胞癌、或膀胱小細胞癌）、黑色素瘤、皮膚鱗狀細胞癌、膠質母細胞瘤、子宮腫瘤、骨肉瘤、子宮癌、子宮CS、結腸直腸癌、肉瘤、嫌色細胞癌、透明細胞RCC、乳突狀RCC、葡萄膜黑色素瘤、睾丸生殖細胞瘤、低分級膠質瘤（LGG）、間皮瘤、PCPG、或胸腺瘤。
如本文所使用的，「神經內分泌癌」是起因於神經內分泌系統（神經系統和內分泌腺激素相互作用的彌散系統）的癌症；或起因於通過例如對生存必要的肽的選擇性腫瘤基因表達（STEPS）等致癌過程而獲得神經內分泌細胞的一些特性的非內分泌細胞的癌症（參見，North (2000)Exper. Physiol. [實驗生理學] 85S:27S-40S）。大多數詳細描述的成人神經內分泌腫瘤都具有獨特性，並源於已知的原發位點，包括類癌、嗜鉻細胞瘤和梅克爾細胞瘤。類癌包括胃癌、胰腺癌、結腸癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌、睾丸癌和子宮頸癌。嗜鉻細胞瘤是一種腎上腺髓質癌，通常會導致腎上腺產生過多的兒茶酚胺。梅克爾細胞瘤是在皮膚上或僅在皮膚下形成的癌症，但有時也被認為是由下面的軟組織引起的。它們也被稱為皮膚的神經內分泌癌。
神經內分泌癌的實例包括但不限於，小細胞癌、乳腺癌、小細胞肺癌（SCLC）、肺大細胞神經內分泌癌（LCNEC）、甲狀腺瘤、胃癌、胰腺癌、中腸癌、肝癌、膽囊癌、卵巢癌、子宮頸癌、食道癌、胃腸道癌、頭頸癌、膽管癌、嗜鉻細胞瘤和梅克爾細胞瘤。
如本文所使用的，「小細胞癌」是指以短的倍增時間、高的生長比率和轉移的早期發展為特徵的高度惡性癌症類型。小細胞癌最常見於肺，並且偶發於其他身體部位，例如子宮頸、前列腺和胃腸道。示例性小細胞癌包括小細胞肺癌、肺外小細胞癌（EPSCC）、前列腺小細胞癌、膀胱小細胞癌。
術語「血液學癌症」是指在血液形成組織（例如骨髓）中或在免疫系統的細胞中開始的任何癌症。在某些實施例中，血液學癌症是慢性淋巴細胞性白血病（CLL）、急性髓性白血病（AML）、T細胞幼淋巴細胞白血病、多發性骨髓瘤（MM）、華氏巨球蛋白血症（WM）、急性淋巴母細胞性白血病（ALL）或淋巴瘤（例如，被套細胞淋巴瘤、瀰漫性大B細胞淋巴瘤）。
如本文所使用的，術語「樣品」是指來源於受試者的生物樣品，並且包含一種或多種目的生物標記。樣品的實例包括但不限於體液，例如血液、血漿、血清、尿液、陰道液、子宮或陰道沖洗液、胸膜液、腹水液、腦脊髓液、唾液、汗液、眼淚、痰、細支氣管肺泡灌洗液等；以及組織，例如活檢組織（例如，活檢的骨組織、骨髓、乳腺組織、胃腸道組織、肺組織、肝組織、前列腺組織、腦組織、神經組織、腦膜組織、腎組織、子宮內膜組織、子宮頸組織、淋巴結組織、肌肉組織或皮膚組織）、石蠟包埋的組織。在某些實施例中，樣品可以是如下生物樣品，該生物樣品包含癌細胞（包括循環癌細胞）或來自腫瘤周圍或與腫瘤相鄰的組織的細胞。在一些實施例中，生物學樣品是例如通過腫瘤活檢或細針抽吸從腫瘤組織或從腫瘤周圍或與腫瘤相鄰的組織獲得的新鮮或存檔的樣品。在一些實施例中，樣品可以是任何含有癌細胞或懷疑含有癌細胞的生物流體（例如在周邊血單核細胞（PBMC）中）。通常在醫院或診所之後，例如在活檢期間，根據標準方案進行從受試者收集樣品。
如本文所使用的，術語「測試樣品」是指來源於需要癌症治療的受試者的樣品，並且代表該受試者的癌症病情。例如，測試樣品可以包含癌細胞。
如本文所使用的，術語「對照樣品」是指除了在參考含量上表達目的生物標記，還在其他方面與測試樣品相當的樣品。對照樣品的實例包括但不限於參考癌細胞或組織樣品，或健康、非癌組織樣品，或二倍體、非轉化的、非癌性、基因組穩定的健康人類細胞系（只要它們在參考含量上表達目的生物標記）。
如本文所使用的，術語「受試者」是指人類或任何非人類動物（例如，小鼠、大鼠、兔、狗、貓、牛、豬、綿羊、馬或靈長類動物）。在許多實施例中，受試者是人類。受試者可以是患者，是指呈現給醫療提供者以診斷或治療疾病的人。術語「受試者」在本文中與「個體」或「患者」互換地使用。受試者可以患有或易患疾病或障礙，但是可以顯示或可以不顯示該疾病或障礙的症狀。
除非另有說明，否則如本文所使用的術語癌症的「治療（treating/treatment）」是指部分地或完全地逆轉、減輕、抑制或阻止受試者中腫瘤生長、腫瘤轉移或其他引起癌症的細胞或贅生性細胞的進展。
如本文所使用的，術語「預後（prognose/prognosing）」是指疾病或病症的未來病程或結果的預測或預報。
如本文所使用的，「共同施用」或「組合療法」應被理解為使用單獨的配製品或單一藥物配製品施用兩種或更多種活性劑，或以任何順序連續施用，使得存在兩種（或所有）活性劑同時發揮其生物學活性的一段時間。本文預期一種活性劑（例如，Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-2抑制劑或Bcl-xL抑制劑）可以改善第二藥劑的活性，例如，可以使靶細胞（例如癌細胞）對第二藥劑的活性敏感。共同施用不需要同時、按相同的頻率或通過相同的施用途徑來施用這些藥劑。
如本文所使用的，術語「烷基」是指直鏈和支鏈的飽和C1-10 烴基團，包括但不限於甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、2,2-二甲基丙基、正己基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,2-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基和2-乙基丁基。
術語Cm-n 表示烷基基團具有「m」至「n」個碳原子。
術語「亞烷基」是指具有取代基的烷基基團。例如，烷基（例如甲基）或亞烷基（例如-CH2 -）基團可以被獨立地選擇的鹵代、三氟甲基、三氟甲氧基、羥基、烷氧基、硝基、氰基、烷基胺基或胺基基團中的一個或多個（並且典型地一個至三個）取代。
除了含有碳-碳雙鍵外，術語「烯基」被等同地定義為「烷基」，例如乙烯基、丙烯基和丁烯基。除了含有碳-碳雙鍵外，術語「亞烯基」與「亞烷基」被等同地定義。除了該基團含有碳-碳三鍵外，術語「炔基」和「亞炔基」被等同地定義為「烷基」和「亞烷基」。
如本文所使用的，術語“鹵代」或“鹵素」被定義為氟、氯、溴或碘。
術語「羥基」被定義為-OH。
術語「烷氧基」被定義為-O-烷基。
術語「胺基」被定義為-NH2 ，並且術語「烷基胺基」是其中氮與至少一個烷基基團鍵合的取代基基團。實例包括NH-烷基、N(烷基)2 、或與一個烷基基團和一個取代基基團鍵合的氮（例如苄基、苯乙基等）。
術語「胺基甲醯基”是指H2 NC(O)-、烷基-NHC(O)-、(烷基)2 NC(O)-、芳基-NHC(O)-、烷基(芳基)-NC(O)-、雜芳基-NHC(O)-、烷基(雜芳基)-NC(O)-、芳烷基-NHC(O)-、烷基(芳烷基)-NC(O)-等。
術語「羧基」被定義為-C(=O)OH或其鹽。
術語「硝基」被定義為-NO2 。
術語「氰基」被定義為-CN。
術語「三氟甲基」被定義為-CF3 。
術語「三氟甲氧基」被定義為-OCF3 。
如本文所使用的，術語「芳基」是指單環或多環芳香族基團，較佳為單環或二環芳香族基團。芳基基團的實例包括但不限於，苯基、萘基、芴基、薁基、蒽基、菲基、芘基、聯苯基和三聯苯基。芳基還指二環和三環碳環，其中一個環是芳香族的，並且其他環是飽和的、部分不飽和的或芳香族的，例如，二氫萘基、茚基、茚滿基或四氫萘基（四氫化萘基（tetralinyl））。除非另有說明，芳基基團可以是未取代的或被一個或多個並且特別是一個至四個基團取代的，該一個或多個基團獨立地選自例如，鹵代、烷基、烯基、-OCF3 、-NO2 、-CN、-NC、-OH、烷氧基、胺基、烷基胺基、-CO2 H、-CO2 烷基、-OCO烷基、芳基和雜芳基。
如本文所使用的，術語「雜環」是指雜芳基和雜環烷基環系統。
如本文所使用的，術語「雜芳基」是指包含一個或兩個芳香族環，並且在芳香族環中包含至少一個氮、氧或硫原子的單環或二環環系統。雜芳基基團的每個環可以包含一個或兩個O原子、一個或兩個S原子和/或一至四個N原子，條件是每個環中雜原子的總數為四個或更少，並且每個環包含至少一個碳原子。在某些實施例中，雜芳基基團具有從5至20、從5至15、或從5至10個環原子。單環雜芳基基團的實例包括但不限於，呋喃基、咪唑基、異噻唑基、異噁唑基、噁二唑基、噁唑基、吡嗪基、吡唑基、噠嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、噻二唑基、噻唑基、噻吩基、四唑基、三嗪基和三唑基。二環雜芳基基團的實例包括但不限於苯並呋喃基、苯並咪唑基、苯並異噁唑基、苯並吡喃基、苯並噻二唑基、苯並噻唑基、苯並噻吩基、苯並苯硫基、苯並三唑基、苯並噁唑基、呋喃並吡啶基、咪唑並吡啶基、咪唑並噻唑基、吲嗪基、吲哚基、吲唑基、異苯並呋喃基、異苯並噻吩基、異吲哚基、異喹啉基、異噻唑基、萘啶基、噁唑並吡啶基、酞嗪基、蝶啶基、嘌呤基、吡啶並吡啶基、吡咯並吡啶基、喹啉基、喹喔啉基、喹唑啉基、噻二唑並嘧啶基和噻吩並吡啶基。除非另有說明，雜芳基基團可以是未取代的或被一個或多個並且特別是一個至四個取代基取代的，該一個或多個取代基選自例如，鹵代、烷基、烯基、-OCF3 、-NO2 、-CN、-NC、-OH、烷氧基、胺基、烷基胺基、-CO2 H、-CO2 烷基、-OCO烷基、芳基和雜芳基。
如本文所使用的，術語「環烷基」表示含有三個至八個碳原子的單環或二環、飽和或部分不飽和的環系統，包括例如任選地被獨立選擇的鹵代、三氟甲基、三氟甲氧基、羥基、烷氧基、硝基、氰基、烷基胺基、或胺基基團中的一個或多個（並且典型地一個至三個）取代的環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環庚基和環辛基。
如本文所使用的，術語「雜環烷基」表示含有總計4個至12個原子的單環或二環、飽和或部分不飽和的環系統，其中這些原子中的一個至五個獨立地選自氮、氧和硫，並且剩餘原子是碳。雜環烷基基團的非限制性實例是氮雜環丁烷基、吡咯烷基、呱啶基、呱嗪基、二氫吡咯基、嗎啉基、硫代嗎啉基、二氫吡啶基、氧雜環庚基、二氧雜環庚基、硫代環庚基、二氮雜環庚基，各自任選地被環原子上的獨立選擇的鹵代、C1-6 烷基、C1-6 烷氧基、氰基、胺基、胺基甲醯基、硝基、羧基、C2-7 烯基、C2-7 炔基等中的一個或多個（並且典型地一個至三個）取代。
用於預測 MDM2 抑制劑或 Bcl-2/Bcl-xL 雙重抑制劑或 Bcl-2 抑制劑或 Bcl-xL 抑制劑的功效的生物標記
本文所述的方法和組合物部分地基於對生物標記的發現，這些生物標記的含量可預測患有癌症的受試者對靶向細胞凋亡途徑的化合物（包括MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-2抑制劑或Bcl-xL抑制劑）的治療產生反應的可能性。生物標記還可用於在患有癌症的受試者中預測靶向細胞凋亡途徑的化合物（包括MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-2抑制劑或Bcl-xL抑制劑）的治療功效。
i. 細胞凋亡途徑和靶向該途徑的化合物
細胞凋亡途徑包括複雜網路中的多個參與者，這些參與者結合在一起調節細胞的命運。Bcl-2（B細胞淋巴瘤蛋白2）家族蛋白在粒線體介導的（也稱為「內在」）途徑中是細胞凋亡的關鍵調節因子。它們的活性與淋巴樣癌症和若干種實體瘤癌症的發作有關，並且據信在許多癌症中是化學療法抗性的關鍵介質。Bcl-2家族蛋白的特徵在於結構性同源結構域BH1、BH2、BH3和BH4，並且可以根據每種蛋白質包含多少個同源結構域或根據其生物學活性（即，該蛋白質是否具有抗凋亡（促存活）或促凋亡（促死亡）功能）被進一步分類為三個亞族。
Bcl-2蛋白的第一亞組包含具有所有四個同源結構域（即，BH1、BH2、BH3和BH4）的蛋白質。它們的一般作用是抗-凋亡，即保護細胞免於啟動細胞死亡過程。例如Bcl-2、Bcl-w、Bcl-xL、Mcl-1和Bfl-1/A1等蛋白質是該第一亞組的成員。
屬於Bcl-2蛋白的第二亞組的蛋白質包含三個同源結構域BH1、BH2和BH3，並具有促凋亡作用。該第二亞組的兩種主要代表性蛋白質是Bax和Bak。
Bcl-2蛋白的第三亞組由僅包含BH3結構域的蛋白質組成，並且該亞組的成員通常被稱為「僅BH3蛋白」。它們對細胞的生物學作用是促凋亡。Bim、Bid、Bad、Bik、Noxa、Hrk、Bmf和Puma是該第三亞族蛋白質的實例。
Bcl-2家族蛋白調節細胞死亡的確切機制尚不完全清楚。在Bcl-2家族蛋白調節細胞死亡的一種假設中，這些僅BH3蛋白被進一步根據其調節功能分為「活化劑」（例如Bim和Bid）、或「敏化劑」（例如Bad、Bik、Noxa、Hrk、Bmf和Puma）。
活化劑僅BH3蛋白結合並直接活化促凋亡蛋白質。這些活化劑還可以結合並抑制抗凋亡Bcl-2家族蛋白。該結合隔離這些活化劑蛋白質並阻止它們發揮其細胞凋亡活性。
由敏化劑肽置換這些活化劑導致Bax/Bak介導的細胞凋亡。敏化劑僅BH3蛋白僅與抗凋亡Bcl-2家族蛋白結合，並阻斷其抗凋亡功能。每種敏化劑蛋白可以具有不同的特異性特徵。例如，Noxa以高親和力結合Mcl-1，BAD與Bcl-xL和Bcl-2結合但僅與Mcl-1弱結合，而PUMA與所有的這三個標靶都結合良好。這些相互作用可具有多種結果，包括體內平衡、細胞死亡、對細胞凋亡的敏化和細胞凋亡的阻滯。
抗凋亡（促存活）和促凋亡（促死亡）蛋白之間的平衡決定了細胞存活或死亡的命運。促存活蛋白質（例如Bcl-2和Bcl-xL）的過表達與腫瘤發生有關，並且是抗癌療法抗性的常見原因（Vaux DL等人, Nature [自然](1988) 335:440-42；Delbridge AR等人, Cell Death Differ[細胞死亡與分化](2015) 22:1071-80）。因此，被設計成靶向抗凋亡Bcl-2家族蛋白的藥劑（例如，小分子BH3模擬物）可以為癌症患者的治療提供新的策略。然而，抗凋亡Bcl-2家族蛋白或BH3模擬物的臨床可用抑制劑（包括進行臨床評估的抑制劑）在血液學癌症以及實體瘤中顯示出有限的功效，這可能是由於複雜的訊息傳遞途徑和腫瘤微環境所致。
先前已經將Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-2抑制劑或Bcl-xL抑制劑描述為抗癌治療劑（參見，例如PCT申請WO 2014113413 A1、PCT/CN 2019/098576、PCT/CN 2019/086673、PCT US 2014011571，將其各自的全部內容通過引用併入本文），並且在人類中作為單一療法或與用於治療疾病和病症的標準護理化學療法藥劑組合而被評估，其中對Bcl-2家族蛋白活性的抑制提供了益處。
由於細胞凋亡途徑中涉及過多的Bcl-2家族蛋白，並且這些蛋白質的天然含量可以按不同細胞類型而變化，所以很少存在通常可應用於預測特定的Bcl-2抑制劑、Bcl-xL抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑的抗癌功效的生物標記。
在由Bcl-2家族蛋白調節的細胞凋亡途徑的上游，腫瘤抑制因子p53結合導致細胞凋亡的細胞信號。p53明顯通過協同作用的轉錄依賴性和非依賴性機制促進細胞凋亡。例如，p53的活化誘導特異性細胞凋亡靶基因的表達，這使得Bcl-2家族的平衡向促凋亡成員轉移。p53的活化還允許其快速易位至粒線體，從而促進促凋亡成員從其隔離狀態釋放（McBride A.等人, Frontiers in Oncology [腫瘤學前沿], (2019) 9:192，Haupt S.等人, Journal of Cell Science [細胞科學雜誌], (2003) 116:4077）。除了調節細胞凋亡外，p53的活化還引發細胞週期停滯或細胞衰老（Green DR, Nature [自然], 2009; 458(7242):1127）。新興證據進一步表明，p53功能障礙促進了炎症並支持腫瘤免疫逃避，因此p53功能障礙可作為腫瘤發生的免疫學驅動因素（Guo G, Cancer Research [癌症研究], 2017；77(9):2292）。因此，操縱p53活性構成了癌症治療的有吸引力的目標。
MDM2（鼠雙微體2）被p53轉錄活化，並且MDM2反過來通過至少三種機制抑制p53活性（Wu等人, Genes Dev. [基因與發育]7:1126 (1993)）。首先，MDM2蛋白直接與p53反式活化結構域結合，從而抑制p53介導的反式活化。其次，MDM2蛋白包含核輸出信號序列，並且在與p53結合後，該核輸出信號序列誘導p53的核輸出，從而阻止p53與所靶向的DNA結合。第三，MDM2蛋白是E3泛素連接酶，並且在與p53結合後，能夠促進p53降解。MDM2和p53是自動調節反饋迴路的一部分（Wu等人, Genes Dev. [基因與發育]7:1126 (1993)）。如本文所使用的，“MDM2”旨在涵蓋MDM2基因、以及MDM2基因產物（例如，mRNA、蛋白質）。人類MDM2的示例性序列在NCBI登錄號ABT17086、ABT17084.1、ABT17085.1或ABT17083.1下是可用的。
MDM2抑制劑干擾MDM2癌蛋白與腫瘤抑制因子p53蛋白的結合，並且充當藥理學p53活化劑。先前已經將MDM2抑制劑描述為抗癌治療劑（參見，例如美國專利號9,745,314，將其全部內容通過引用併入本文），並且在人類中作為單一療法或與用於治療疾病和病症的標準護理化學療法藥劑組合而被評估，其中對MDM2和MDM2相關蛋白活性的抑制提供了益處。
本發明中揭露的MDM2抑制劑抑制p53或p53相關蛋白與MDM2或MDM2相關蛋白之間的相互作用。通過抑制MDM2或MDM2相關蛋白對p53或p53相關蛋白的負作用，本發明的MDM2抑制劑使細胞對細胞凋亡和/或細胞週期停滯的誘導劑敏感。在一個實施例中，本發明的MDM2抑制劑誘導細胞凋亡和/或細胞週期停滯。
ii. 生物標記
本文已經鑒定出，生物標記能夠預測靶向細胞凋亡途徑的化合物的反應或治療功效的可能性。本文提供的生物標記包括Noxa和ASCL1。
如本文所使用的，術語「Noxa」是指Noxa基因和Noxa基因產物（例如，Noxa基因的mRNA和由Noxa基因編碼的蛋白質）。Noxa基因（也被稱為佛波醇-12-豆蔻酸酯-13-乙酸酯誘導的蛋白1（PMA誘導的蛋白1，或PMAIP1）基因、立即早期反應蛋白APR基因、成人T細胞白血病衍生的PMA反應性基因或APR基因）編碼至少部分通過促進粒線體膜變化和促凋亡蛋白從粒線體外排來促進半胱天冬酶的活化和細胞凋亡的蛋白質。人類Noxa基因在NCBI數據庫中具有基因ID為5366。人類Noxa基因的mRNA轉錄物具有NCBI參考序列為NM_021127.2。由人類Noxa基因編碼的蛋白質具有NCBI參考序列為NP_066950.1。本文中將Noxa的示例性序列提供為SEQ ID NO: 8（DNA序列）和SEQ ID NO: 7（蛋白質序列）。
如本文所使用的，術語「ASCL1」是指ASCL1基因和ASCL1基因產物（例如，ASCL1基因的mRNA和由ASCL1基因編碼的蛋白質）。ASCL1基因（也被稱為Achaete-Scute同系物1基因、Achaete-Scute家族BHLH轉錄因子1基因、A類鹼性螺旋-環-螺旋蛋白46基因、HASH1基因、ASH1基因、MASH1基因）編碼在神經元分化中起關鍵作用的轉錄因子。ASCL1的直接轉錄標靶包括Bcl2。人類ASCL1基因在NCBI數據庫中具有基因ID為429。人類ASCL1基因的mRNA轉錄物具有NCBI參考序列為NM_004316.4。由人類ASCL1基因編碼的蛋白質具有NCBI參考序列為NP_004307.2。在本文中將ASCL1的示例性序列提供為SEQ ID NO: 22（DNA序列）和SEQ ID NO: 21（蛋白質序列）。
ASCL1對神經元分化（例如神經內分泌細胞的正常發育）至關重要。另外，ASCL1表達與神經內分泌肺癌的生長和存活有關（Augustyn, A.等人 PNAS [美國國家科學院院刊], 111: 14788-14793 (2014)）。關於小細胞肺癌（SCLC）的近期研究提出，通過四個關鍵轉錄調節因子（ASCL1、神經原性分化因子（NeuroD1）、yes相關蛋白1（YAP1）和POU 2類同源框（POU2F3））的不同表達將SCLC分為四種亞型，其中這四個轉錄調節因子的表達基本上是互斥的，而表達ASCL1的SCLC占SCLC的比例最大（即，約70%）（Rudin, CM等人, 19:289-297, (2019)）。
本揭露的發明人出人意料地發現，至少一種包含Noxa、或ASCL1或兩者的生物標記的含量與MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-2抑制劑或Bcl-xL抑制劑的治療功效相關。
在某些實施例中，該生物標記包含含有SEQ ID NO: 8的基因序列的Noxa基因、或由其編碼的mRNA。在某些實施例中，該生物標記包含含有SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的Noxa蛋白。
在某些實施例中，該生物標記包含含有SEQ ID NO: 22的基因序列的ASCL1基因、或由其編碼的mRNA。在某些實施例中，該生物標記包含含有SEQ ID NO: 21的胺基酸序列的ASCL1蛋白。
因此，基於至少一種包含Noxa、ASCL1或兩者的生物標記的測量含量，本揭露提供了用於測量至少一種包含Noxa、ASCL1或兩者的生物標記的含量的檢測試劑；和用於鑒定患有癌症的受試者可能對用MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-2抑制劑或Bcl-xL抑制劑的治療產生反應的方法；用於在有需要的受試者中治療癌症的方法；以及用於在受試者中監測治療功效的方法，該受試者患有癌症，並在治療期內已經用MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-2抑制劑或Bcl-xL抑制劑進行了治療。
在一些實施例中，該至少一種生物標記進一步包含選自下組的一種或多種另外的生物標記，該組由以下組成：Bcl-xL、Bcl-2、PUMA、Mcl-1、包含Bcl-xL的蛋白質複合物、包含Bcl-2的蛋白質複合物及其任何組合。
本文中將Bcl-xL的示例性序列提供為SEQ ID NO: 4（DNA序列）和SEQ ID NO: 3（蛋白質序列）。本文中將Bcl-2的示例性序列提供為SEQ ID NO: 2和14（DNA序列）以及SEQ ID NO: 1和13（蛋白質序列）。本文中將PUMA的示例性序列提供為SEQ ID NO: 10（DNA序列）和SEQ ID NO: 9（蛋白質序列）。本文中將Mcl-1的示例性序列提供為SEQ ID NO: 12、18和20（DNA序列）以及SEQ ID NO: 11、17和19（蛋白質序列）。
在一些實施例中，該蛋白質複合物包含與僅BH3蛋白或與包含BH3結構域的蛋白質複合的Bcl-xL蛋白。在一些實施例中，該蛋白質複合物進一步包含與僅BH3蛋白或與包含BH3結構域的蛋白質複合的Bcl-2蛋白。
在某些實施例中，該僅BH3蛋白選自下組，該組由以下組成：BIM、BID、BAD、BIK、HRK、BMF和PUMA。在某些實施例中，該僅BH3蛋白可以選自BIM和PUMA。
本文中將BIM的示例性序列提供為SEQ ID NO: 6和16（DNA序列）以及SEQ ID NO: 5和15（蛋白質序列）。
在一些實施例中，該蛋白質複合物包含選自下組的複合物，該組由以下組成：Bcl-xL : BIM、Bcl-xL : PUMA、Bcl-2 : BIM、Bcl-2 : PUMA及其任何組合。
iii. 生物標記的檢測試劑
在一方面，本揭露提供了用於檢測或測量該至少一種包含Noxa、ASCL1或兩者的生物標記的含量的檢測試劑。測量可以在RNA含量、DNA含量和/或蛋白質含量上。可以使用用於檢測靶RNA、靶DNA或靶蛋白質的合適的試劑。
在某些實施例中，檢測試劑包含可以與Noxa的多核苷酸雜交的一種或多種引子或探針，和/或可以與ASCL1的多核苷酸雜交的一種或多種引子或探針。如本文所使用的，術語「引子」是指由於靶多核苷酸序列的序列內的至少一部分引子的序列互補性，可以與靶多核苷酸序列特異性雜交的寡核苷酸。引子的長度可以是至少8個核苷酸，典型地為8至70個核苷酸，通常為18至26個核苷酸。為了與靶序列正確雜交，引子可以與靶多核苷酸序列的雜交部分具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、或至少95%序列互補性。可用作引子的寡核苷酸可以根據最初由Beaucage和Caruthers,Tetrahedron Letts. [四面體通訊](1981) 22: 1859-1862所述的固相亞磷醯胺三酯方法，使用自動合成儀，如Needham-Van Devanter等人, Nucleic Acids Res.[核酸研究] (1984) 12:6159-6168中所述進行化學合成。
引子可用於核酸擴增反應，其中引子被延伸以產生多核苷酸的新鏈。引子可以由通常知識者使用本領域已知的常識容易地設計，使得它們可以與本文提供的至少一種生物標記的靶核苷酸序列的核苷酸序列特異性退火。通常，將引子的3'核苷酸設計成與靶序列在相應的核苷酸位置處互補，以通過聚合酶提供最佳的引子延伸。
如本文所使用的，術語「探針」是指由於靶多核苷酸序列的序列內的至少一部分探針的序列互補性，可以與靶多核苷酸序列特異性雜交的寡核苷酸或其類似物。示例性探針可以是例如DNA探針、RNA探針或蛋白質核酸（PNA）探針。探針的長度可以是至少8個核苷酸，典型地為8至70個核苷酸，通常為18至26個核苷酸。為了與靶序列正確雜交，探針可以與靶多核苷酸序列的雜交部分具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%序列互補性。並且探針也可以根據如上所述的固相亞磷醯胺三酯方法化學合成。用於製備DNA和RNA探針的方法、以及用於將其與靶核苷酸序列雜交的條件描述於Molecular Cloning: A Laboratory Manual [分子克隆：實驗室手冊], J. Sambrook等人編輯, 第2版 Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港實驗室出版社], 1989, 第10和11章中。
在某些實施例中，本文提供的引子或探針包含可與SEQ ID NO: 8或22的序列內的一部分雜交的多核苷酸序列。在某些實施例中，本文提供的引子或探針包含可與SEQ ID NO: 2、4、6、10、12、14、16、18或20的序列內的一部分雜交的多核苷酸序列。在某些實施例中，本文提供的引子或探針包含與SEQ ID NO: 8或22的序列內的一部分具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%互補性的多核苷酸序列。在某些實施例中，本文提供的引子或探針包含與SEQ ID NO: 2、4、6、10、12、14、16、18或20的序列內的一部分具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%互補性的多核苷酸序列。
在某些實施例中，檢測試劑包含可以與Noxa的蛋白質特異性結合的一種或多種抗體，和/或可以與ASCL1的蛋白質特異性結合的一種或多種抗體。
如本文所使用的，術語「抗體」是指可以與靶蛋白抗原特異性結合的免疫球蛋白或其抗原結合片段。可以通過從噬菌體或類似載體中的重組抗體庫中選擇抗體來鑒定和製備抗體，以及通過對動物（例如兔或小鼠）進行免疫來製備多株和單株抗體（參見，例如，Huse等人,Science [科學](1989) 246: 1275-1281；Ward等人,Nature [自然](1989) 341: 544-546）。
在某些實施例中，本文提供的抗體包含能夠與具有SEQ ID NO: 7或21的序列的蛋白質或多肽內的表位特異性結合的抗原結合區。在某些實施例中，本文提供的抗體包含能夠與具有SEQ ID NO: 1、3、5、9、11、13、15、17或19的序列的蛋白質或多肽內的表位特異性結合的抗原結合區。
在某些實施例中，本文提供的引子、探針和抗體是被可檢測地標記的。適合用於標記引子、探針和抗體的可檢測標記的實例包括例如發色團、放射性同位素、螢光團、化學發光部分、顆粒（可見的或螢光的）、核酸、配體、或催化劑（例如酶）。
放射性同位素的實例包括但不限於，123 I、124 I、125 I、131 I、35 S、3 H、111 In、112 In、14 C、64 Cu、67 Cu、86 Y、88 Y、90 Y、177 Lu、211 At、186 Re、188 Re、153 Sm、212 Bi和32 P。
螢光團的實例包括但不限於，吖啶、7-胺基-4-甲基香豆素-3-乙酸（AMCA）、BODIPY、瀑布藍（Cascade Blue）、Cy2、Cy3、Cy5、Cy7、伊丹（Edans）、伊紅（Eosin）、赤蘚紅、螢光素、6-FAM、TET、JOC、HEX、俄勒岡綠（Oregon Green）、羅丹明、羅丹綠（Rhodol Green）、Tamra、Rox和Texas RedTM （分子探針公司（Molecular Probes, Inc.），尤金（Eugene），俄勒岡州（Oreg.））。
酶的實例包括但不限於，鹼性磷酸酶、酸性磷酸酶、辣根過氧化物酶、β-半乳糖苷酶和核糖核酸酶。
配體的實例包括但不限於，生物素、親和素、抗體或抗原。
應理解的是，可檢測標記不必產生可檢測信號，例如，在一些實施例中，它可以與可檢測配偶體反應或與一種或多種另外的化合物反應以產生可檢測信號。例如，可檢測標記可以是能夠用作標記的配體的特異性結合對成員的配體（例如，第二標記的抗體）。再例如，由於其催化導致可檢測信號產生的發色、發螢光或發光基質的催化活性，酶可用作可檢測標記。
在某些實施例中，本文提供的可檢測地標記的引子、探針或抗體可以進一步包含淬滅劑物質。淬滅劑物質是指如下物質，當與螢光物質足夠接近地存在時，由於例如螢光共振能量轉移（FRET），其可以淬滅由螢光物質發出的螢光。
淬滅劑物質的實例包括但不限於，Tamra、Dabcyl或黑洞淬滅劑（Black Hole Quencher）（BHQ，生物研究技術公司（Biosearch Technologies））、DDQ（優羅泰公司（Eurogentec））、Iowa Black FQ（集成DNA技術公司（Integrated DNA Technologies））、QSY-7（分子探針公司（Molecular Probes））和Eclipse淬滅劑（時代生物科學公司（Epoch Biosciences））。
通過切口平移方法或通過隨機引子方法，可以將引子和探針標記為具有高特異性活性。有用的探針標記技術描述在文獻中（Fan, Y-S, Molecular cytogenetics: protocols and applications [分子細胞遺傳學：方案與應用], Humana Press [胡瑪納出版社], 托托華（Totowa）, 新澤西州（N.J.）xiv, 411 (2002)）。
在某些實施例中，該一種或多種試劑包含可以與Noxa的多核苷酸雜交的引子或探針，或可以與Noxa的蛋白質特異性結合的抗體。在某些實施例中，本文提供的抗體包含能夠與具有SEQ ID NO: 7的序列的蛋白質或多肽內的表位特異性結合的抗原結合區。
在某些實施例中，該一種或多種試劑包含可以與ASCL1的多核苷酸雜交的引子或探針，或可以與ASCL1的蛋白質特異性結合的抗體。在某些實施例中，本文提供的抗體包含能夠與具有SEQ ID NO: 21的序列的蛋白質或多肽內的表位特異性結合的抗原結合區。
在某些實施例中，該一種或多種試劑包含可以與Noxa的多核苷酸雜交的第一引子或第一探針，或可以與Noxa的蛋白質特異性結合的抗體，以及可以與Noxa的多核苷酸雜交的第二引子或第二探針，或可以與Noxa的蛋白質特異性結合的第二抗體。在某些實施例中，本文提供的第一抗體包含能夠與具有SEQ ID NO: 7的序列的蛋白質或多肽內的表位特異性結合的抗原結合區，並且本文提供的第二抗體包含能夠與具有SEQ ID NO: 21的序列的蛋白質或多肽內的表位特異性結合的抗原結合區。
可以理解，在某些實施例中，將抗體進行修飾或標記以適當地在多種檢測測定中使用。在某些實施例中，抗體是被可檢測地標記的。在某些實施例中，抗體可以包含捕獲部分，或者可以被固定。
捕獲部分的實例可以包括例如結合配偶體或固體基質，例如多孔和無孔材料、乳膠顆粒、磁性顆粒、微粒、條帶、珠、膜、微量滴定孔和塑料管。固相材料的選擇和可檢測地標記抗原或抗體試劑的方法是根據所需的測定形式性能特徵確定的。在某些實施例中，抗體可以被固定在固體基質上。固定化可以通過共價連接或非共價附接（例如塗覆）進行。
用於患者鑒定、治療指導和預後的方法
在另一方面，本揭露提供了用於鑒定患有癌症的受試者可能對用MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-2抑制劑或Bcl-xL抑制劑的治療產生反應的方法。在某些實施例中，該方法包括：在來源於該受試者的測試樣品中測量至少一種包含Noxa或ASCL1或兩者的生物標記的含量；將該至少一種生物標記的含量與該至少一種生物標記的對應的參考含量進行比較，以確定與參考含量的差異；並且當該差異達到預定的閾值時，確定該受試者可能對用MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-2抑制劑或Bcl-xL抑制劑的治療產生反應。
在另一方面，本揭露提供了用於在有需要的受試者中治療癌症的方法。在某些實施例中，該方法包括：在來源於該受試者的樣品中測量至少一種包含Noxa或ASCL1或兩者的生物標記的含量；將該至少一種生物標記的含量與該至少一種生物標記的對應的參考含量進行比較，以確定與參考含量的差異；並且當該差異達到預定的閾值時，向該受試者施用有效量的MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-2抑制劑或Bcl-xL抑制劑。
在另一方面，本揭露提供了用於在受試者中監測治療功效或預後的方法，該受試者患有癌症，並在治療期內已經用MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-2抑制劑或Bcl-xL抑制劑進行了治療。在某些實施例中，該方法包括：治療期後從該受試者獲得測試樣品；在該測試樣品中測量至少一種包含Noxa的生物標記的含量，以獲得該至少一種生物標記的治療後含量；將該治療後含量與來源於該受試者的治療期之前的測試樣品中的該至少一種生物標記的基線含量進行比較，以確定該至少一種生物標記的含量的治療後變化。在某些實施例中，當該治療後變化達到預定的閾值時，該方法進一步包括向該受試者繼續施用MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-2抑制劑或Bcl-xL抑制劑。在某些實施例中，當該治療後變化未達到預定的閾值時，增加對該受試者的MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-2抑制劑或Bcl-xL抑制劑的劑量，向該受試者施用有效量的與MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-2抑制劑或Bcl-xL抑制劑組合的第二抗癌治療劑，或向該受試者停止施用MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-2抑制劑或Bcl-xL抑制劑。
i. 樣品製備
適用於實施本文提供的方法的任何生物樣品可以來源於受試者。在某些實施例中，可以通過可取的方法對樣品進一步處理，用於進行該至少一種生物標記的含量的測量。
在某些實施例中，該方法進一步包括從來源於受試者的生物流體樣品（例如，周邊血樣品）或組織樣品中分離或提取癌細胞（例如，循環腫瘤細胞）。癌細胞可以通過免疫磁分離技術來分離，例如可從易莫尼康公司（Immunicon）（亨廷頓穀（Huntingdon Valley），賓夕法尼亞州（Pa.））獲得的技術。
在某些實施例中，可以對組織樣品進行處理以進行原位雜交。例如，可以在將組織樣品固定在玻璃顯微鏡載玻片上之前進行石蠟包埋，然後用溶劑（典型地為二甲苯）脫蠟。
在某些實施例中，該方法進一步包括如果生物標記的RNA或DNA含量是待測量的，則從樣品中分離核酸。多種提取方法適用於從細胞或組織中分離DNA或RNA，例如苯酚和氯仿提取，並且多種其他方法描述於例如，Ausubel等人,Current Protocols of Molecular Biology [當代分子生物學實驗指南] (1997) John Wiley & Sons [約翰·威利父子出版社]，以及Sambrook和Russell,Molecular Cloning: A Laboratory Manual [ 分子克隆 : 實驗室手冊 ] 第3版 (2001)。
還可以使用可商購的試劑盒來分離RNA，包括例如，NucliSens提取試劑盒（生物梅裡埃公司（Biomerieux），瑪西埃圖瓦勒（Marcy l'Etoile），法國）、QIAampTM 微型血液試劑盒、Agencourt GenfindTM 、Rneasy®微型柱（凱傑公司（Qiagen））、PureLink® RNA微型試劑盒（賽默飛世爾科技公司（Thermo Fisher Scientific））和Eppendorf Phase Lock GelsTM 。通常知識者可以按照製造商的方案容易地提取或分離RNA或DNA。
ii. 測量生物標記的含量的方法
本揭露的方法包括在來源於患有癌症或懷疑患有癌症的受試者的樣品中測量本文所述的至少一種生物標記的含量。
本文提供的生物標記Noxa和/或ACSL1（和任選地另外的生物標記，包括Bcl-xL、Bcl-2、PUMA、Mcl-1、包含Bcl-xL的蛋白質複合物、包含Bcl-2的蛋白質複合物）旨在涵蓋包括mRNA、蛋白質以及DNA（例如，基因組DNA）的不同形式。因此，可以通過RNA含量（例如，mRNA含量）、蛋白質含量或DNA含量來測量該至少一種生物標記的含量。mRNA含量和/或蛋白質含量還可以被稱為該至少一種生物標記的表達含量。在某些實施例中，該蛋白質複合物在蛋白質含量上測量。
該至少一種包含Noxa、或ASCL1或兩者的生物標記的RNA（例如，mRNA）含量或DNA含量可以通過本領域已知的任何合適的核酸測定（例如，核酸擴增測定、核酸雜交測定、核酸定序測定）以及其他方法（例如，高效液相色譜法（HPLC）片段分析、毛細管電泳等）來測量。可以通過本領域已知的任何方法，例如但不限於免疫測定法來測量生物標記的蛋白質含量。這些方法在本領域中是熟知的，並且在下文作為示例性說明進行詳細描述。
a) 擴增測定
核酸擴增測定涉及複製靶核酸（例如，DNA或RNA），從而增加經擴增的核酸序列的拷貝數。擴增可以是指數的或線性的。示例性核酸擴增方法包括但不限於使用以下方法進行的擴增：聚合酶鏈式反應（“PCR”，參見美國專利4,683,195和4,683,202；PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications [PCR方案：方法和應用指南]（Innis等人編輯, 1990））、逆轉錄酶聚合酶鏈式反應（RT-PCR）、實時定量PCR（qRT-PCR）、定量PCR（例如，TaqMan®）、巢式PCR、連接酶鏈式反應（參見Abravaya, K.等人, Nucleic Acids Research [核酸研究], 23:675-682, (1995)）、分支DNA訊號擴增（參見，Urdea, M. S.等人, AIDS, 7（增刊2）: S11-S14, (1993)）、可擴增的RNA報告分子、Q-β複製（參見，Lizardi等人,Biotechnology [生物技術](1988) 6: 1197）、基於轉錄的擴增（參見，Kwoh等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊](1989) 86: 1173-1177）、回旋DNA擴增、鏈置換活化、循環探針技術、自動維持序列擴增（Guatelli等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊](1990) 87:1874-1878）、滾環複製（美國專利號5,854,033）、基於核酸序列的等溫擴增（NASBA）、以及基因表達的連續分析（SAGE）。
在一些實施例中，為測量生物標記的mRNA含量，在擴增之前將生物標記的靶RNA逆轉錄為cDNA。可以使用多種逆轉錄酶，包括但不限於MMLV RT、MMLV RT的RNase H突變體例如Superscript和Superscript II（生命技術公司（Life Technologies），GIBCO BRL，蓋瑟斯堡（Gaithersburg），馬裡蘭州（Md.））、AMV RT和來自嗜熱棲熱菌（Thermus thermophilus）的熱穩定逆轉錄酶。例如，可以用於將RNA轉化為cDNA的一種方法是改編自Superscript II預擴增系統（生命技術公司，GIBCO BRL，蓋瑟斯堡，馬裡蘭州；目錄號18089-011）的方案，如由Rashtchian, A., PCR Methods Applic.[PCR方法應用], 4:S83-S91, (1994)中所述。
在某些實施例中，在核酸擴增測定後，對本文提供的至少一種生物標記的含量進行定量。例如，可以在瓊脂糖凝膠上分離擴增的產物，並用溴化乙錠染色，然後使用標準凝膠電泳方法進行檢測和定量。可替代地，可以用合適的可檢測標記（例如，放射性核苷酸或螢光核苷酸）整體標記擴增的產物，然後使用X射線膠片或在合適的激發光譜下可視化。
在某些實施例中，在核酸擴增測定期間，對生物標記的RNA（例如，mRNA）的表達含量或DNA的拷貝數變化進行定量，這也被稱為實時擴增或定量擴增。定量擴增的方法揭露在以下文獻中：例如美國專利號6,180,349、6,033,854、和5,972,602，以及例如Gibson等人,Genome Research [基因組研究](1996) 6:995-1001；DeGraves等人,Biotechniques [生物技術](2003) 34(1): 106-10, 112-5；Deiman B等人,Mol Biotechnol . [分子生物技術](2002) 20(2): 163-79。定量通常基於對可檢測訊號的監測，該可檢測訊號代表擴增（例如，PCR）反應循環中模板的拷貝。可通過嵌入劑（例如SYBR GREEN™和SYBR GOLD™）或擴增過程中使用的標記引子或標記探針來產生可檢測訊號。
在某些實施例中，標記的引子或標記的探針包含含有螢光團的可檢測標記。在某些實施例中，標記的引子或標記的探針可以進一步包含淬滅劑物質。在一種引子或探針中螢光團和淬滅劑物質（「雙重標記的」）的存在可以有助於提供自淬滅探針例如TaqMan（美國專利號5,210,015和5,538,848）或分子信標探針（美國專利號5,118,801和5,312,728）、或其他無分支或線性信標探針（Livak等人, 1995, PCR Method Appl.[PCR方法應用], 4:357-362；Tyagi等人, 1996, Nature Biotechnology [自然生物技術], 14:303-308；Nazarenko等人, 1997, Nucl. Acids Res. [核酸研究], 25:2516-2521；美國專利號5,866,336和6,117,635）。在完整的引子或探針中，淬滅劑物質和螢光團非常接近，使得當螢光團被輻射激發時，螢光團會通過螢光共振能量轉移（FRET）將能量轉移至同一探針中的淬滅劑物質，從而不發出訊號。
在定量擴增測定（例如，實時PCR）中，可以使用本領域已知的方法對經檢測的生物標記的含量進行定量。例如，在擴增期間，可以在每個PCR循環期間監測和計算螢光訊號。可以進一步計算閾值循環或Ct值。Ct值是在螢光與預定的值相交處的循環。可以使用標準曲線將Ct與核酸的初始量或起始細胞數相關。建構標準曲線以關聯Ct值與所測量的生物標記的對數含量之間的差異。
作為品質控制參數，可以測量內部對照生物標記的含量。通常知識者將理解，內部對照生物標記可以固有地存在於樣品中，並且可以將其含量用於歸一化至少一種包含Noxa、ASCL1或兩者的生物標記的測量含量，以抵消樣品絕對數中的任何差異。
b) 雜交測定
核酸雜交測定使用探針與靶核酸雜交，從而允許檢測靶核酸。雜交測定的非限制性實例包括RNA印跡法、DNA印跡法、原位雜交、微陣列分析和基於多重雜交的測定。
在某些實施例中，用於雜交測定的探針是被可檢測地標記的。在某些實施例中，用於雜交測定的基於核酸的探針是未標記的。可以將此類未標記的探針固定在固體支持物（如微陣列）上，並且可以與可檢測地標記的靶核酸分子雜交。
在某些實施例中，可以通過分離核酸（例如，RNA或DNA），使核酸分開（例如，通過凝膠電泳），然後將分開的核酸轉移到合適的膜濾紙（例如，硝化纖維素濾紙）上來進行雜交測定，其中將探針與靶核酸雜交並允許檢測。參見，例如，Molecular Cloning: A Laboratory Manual [分子克隆：實驗室手冊], J. Sambrook等人編輯, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press [冷泉港實驗室出版社], 1989, 第7章。探針和靶核酸的雜交可以通過本領域已知的方法檢測或測量。例如，可以通過將雜交的濾器暴露於照相膠片來進行雜交的放射自顯影檢測。由雜交濾器曝光的照相膠片的光密度掃描提供了靶核酸含量的準確測量。電腦成像系統也可以用於量化生物標記的含量。
在一些實施例中，雜交測定可以在微陣列上進行。微陣列提供了用於同時測量大量靶核酸分子的含量的方法。靶核酸可以是RNA、DNA、從mRNA逆轉錄的cDNA或染色體DNA。可以允許靶核酸與包含基質的微陣列雜交，該微陣列具有以高達幾百萬個探針/平方釐米基質表面的密度排列的多個固定的核酸探針。樣品中的RNA或DNA與陣列上的互補探針雜交，然後通過激光掃描進行檢測。確定陣列上每個探針的雜交強度，並將其轉換為代表RNA或DNA相對含量的定量值。參見，美國專利號6,040,138、5,800,992和6,020,135、6,033,860以及6,344,316。
使用機械合成方法合成這些陣列的技術例如描述於美國專利號5,384,261中。儘管經常採用平面陣列表面，但是該陣列可以在實際上任何形狀的表面上或甚至多重表面上製造。陣列可以是在珠、凝膠、聚合物表面、纖維（例如光纖）、玻璃或任何其他合適的基質上的肽或核酸，參見美國專利號5,770,358、5,789,162、5,708,153、6,040,193和5,800,992。可以按允許對全包裝置進行診斷或其他操作的這樣的方式包裝陣列。有用的微陣列也是可商購的，例如，購自昂飛公司（Affymetrix）、納米線技術公司（Nano String Technologies）的微陣列，購自派諾克公司（Panomics）的QuantiGene 2.0多元測定。
在某些實施例中，雜交測定可以是原位雜交測定。原位雜交測定可用於檢測目的生物標記（例如，Noxa或ASCL1或兩者）的基因座上拷貝數變化（例如增加或擴增）的存在。可用於原位雜交測定的探針可以是基因座特異性探針，這些探針與染色體上的特異性基因座雜交以檢測特定目的基因座（例如，Noxa或ASCL1或兩者）的存在或缺失。其他類型的探針也可能是有用的，例如，染色體計數探針（例如，可與目的染色體中的重複序列區雜交，以指示整個染色體的存在或缺失）和染色體臂探針（例如，可與染色體區域雜交，並指示特定染色體的臂的存在或缺失）。使用用於原位雜交的獨特序列探針的方法在美國專利號5,447,841中進行了描述，將其通過引用併入本文。可以使用螢光顯微鏡和針對每個螢光團的合適的濾鏡，或通過使用雙重或三重帶通濾鏡組觀察多個螢光團來查看探針。參見，例如Bittner等人的美國專利號5,776,688，將其通過引用併入本文。任何合適的顯微成像方法（包括自動數位成像系統）都可用於使雜交的探針可視化。可替代地，可以使用例如流式細胞術等技術來檢查探針的雜交模式。
c) 定序方法
在測量目的生物標記的含量中有用的定序方法涉及對靶核酸的定序和對經定序的靶核酸的計數。定序方法的實例包括但不限於，RNA定序、焦磷酸定序和高通量定序。
高通量定序涉及合成法定序（sequencing-by-synthesis）、連接法定序（sequencing-by-ligation）和超深度定序（ultra-deep sequencing）（例如，描述於Marguiles等人, Nature [自然] 437(7057): 376-80 (2005)中）。合成法定序涉及通過在聚合酶擴增中摻入標記的核苷酸或核苷酸類似物來合成靶核酸的互補鏈。在成功摻入標記核苷酸之後或即刻開始，測量該標記的訊號並記錄核苷酸的身份。在摻入之前去除經摻入的核苷酸上的可檢測標記，重複檢測和鑒定步驟。合成法定序方法的實例是本領域已知的，並且描述於例如美國專利號7,056,676、美國專利號8,802,368和美國專利號7,169,560中，將其內容通過引用併入本文。以使用折返PCR和錨定引子在固體表面（或微陣列或晶片）上進行合成法定序。靶核酸片段可以通過與錨定引子雜交而附接至固體表面，並進行橋接擴增。該技術在例如Illumina® 定序平臺上使用。
焦磷酸定序涉及將靶核酸區域與引子雜交，並在聚合酶的存在下，通過順序地摻入對應於鹼基A、C、G和T（U）的去氧核苷酸三磷酸來延伸新鏈。每次鹼基的摻入都伴隨著焦磷酸鹽的釋放，焦磷酸鹽被硫酸化酶轉化為ATP，從而驅動了氧化螢光素的合成和可見光的釋放。由於焦磷酸鹽的釋放與摻入的鹼基數等莫耳，因此發出的光與在任一步驟中添加的核苷酸數成正比。重複該過程，直到確定整個序列。
在某些實施例中，本文所述的生物標記的含量通過全轉錄組定序或RNA定序（例如，RNA-Seq）來測量。已經描述了RNA定序的方法（參見Wang Z, Gerstein M和Snyder M,Nature Review Genetics [遺傳學自然評論](2009) 10:57-63；Maher CA等人,Nature [自然](2009) 458:97-101；Kukurba K和Montgomery SB, Cold Spring Harbor Protocols [冷泉港實驗方案](2015) 2015(11): 951-969）。簡而言之，將從樣品中提取的mRNA反轉錄為cDNA，然後剪切為片段。選擇在適當長度範圍內的片段，並與定序銜接子連接，然後進行擴增、定序並將讀數映射到參考基因組。
該至少一種包含Noxa或ASCL1或兩者的生物標記的蛋白質含量可以通過本領域已知的任何合適的蛋白質測定來測量，例如免疫測定、質譜法、2-D凝膠電泳、蛋白質陣列等。包含Bcl-xL的蛋白質複合物和/或包含Bcl-2的蛋白質複合物的含量可以通過本領域已知的用於測量蛋白質間相互作用的任何合適的測定來測量，一般參見，Protein-Protein Interactions: A Molecular Cloning Manual [蛋白質間相互作用：分子克隆手冊], 第2版, Golemis和Adams編輯, Cold Spring Harbor Laboratory Press [冷泉港實驗室出版社](2005)）。在某些實施例中，蛋白質間相互作用的測定基於免疫測定或鄰近測定。合適的方法通常例如Meso Scale Discovery（MSD）高級酶聯免疫吸附測定（MSD-ELISA）、標準複合物ELSIA、鄰近連接測定（PLA）、共免疫沉澱、免疫印跡測定或交聯測定等。
d) 免疫測定
免疫測定典型地涉及使用與靶多肽或蛋白質（例如，Noxa或ASCL1）特異性結合的抗體來檢測或測量靶多肽或蛋白質的存在或含量。此類抗體可以使用本領域已知的方法獲得（參見，例如，Huse等人,Science [科學](1989) 246: 1275-1281；Ward等人,Nature [自然](1989) 341: 544-546），或可以從商業來源獲得。免疫測定的實例包括但不限於，蛋白質印跡法、酶聯免疫吸附測定（ELISA）、酶免疫測定（EIA）、放射免疫測定（RIA）、夾心測定、競爭性測定、免疫螢光染色和成像、免疫組織化學（IHC）和螢光活化細胞分選術（FACS）。關於免疫學和免疫測定程序的綜述，參見Basic and Clinical Immunology [基礎和臨床免疫學]（Stites和Terr編輯, 第7版 1991）。此外，可以按多種構型中的任一種進行免疫測定，這些構型在酶免疫測定（Maggio編輯, 1980）以及Harlow和Lane（同上）中被廣泛綜述。關於一般免疫測定的綜述，還參見Methods in Cell Biology: Antibodies in Cell Biology [細胞生物學方法：細胞生物學中的抗體], 第37卷（Asai編輯 1993）；Basic and Clinical Immunology [基礎和臨床免疫學]（Stites和Terr編輯, 第7版 1991）。
免疫組織化學（IHC）通過檢測特異性抗體/適配子-抗原相互作用來證明原位細胞或組織組成，其中抗體/適配子已被可檢測標記加了標籤。可檢測標記可以是螢光染料、膠體金屬、半抗原、放射性標記，或更常見地是酶。實驗樣品包括福馬林固定的、石蠟包埋的（FFPE）樣品。理想地，需要最大的訊號強度以及最小的背景或非特異性染色，以給出最佳的抗原展示。IHC方案在本領域中是熟知的；參見，例如，Immunocytochemical Methods and Protocols [免疫細胞化學方法和方案]（第二版），由Lorette C. Javois編輯，來自Methods in Molecular Medicine [分子醫學方法], 第115卷, Humana Press [胡瑪納出版社], 1999（ISBN 0-89603-570-0）。
在某些實施例中，抗體是被可檢測地標記的，或是未標記的但可以與被可檢測地標記的第二分子（例如，可檢測地標記的第二抗體）反應。其他檢測系統也是可用的，例如時間分辨螢光、內部反射螢光、擴增（例如，聚合酶鏈式反應）和拉曼光譜學。
在某些實施例中，抗體可以被固定在固體基質上。固定化可以通過共價連接或非共價附接（例如塗覆）進行。固體基質的實例包括多孔和無孔材料、乳膠顆粒、磁性顆粒、微粒、條帶、珠、膜、微量滴定孔和塑料管。固相材料的選擇和可檢測地標記抗原或抗體試劑的方法是根據所需的測定形式性能特徵確定的。
靶多肽或蛋白質的含量可以例如通過標準化為內部對照值或標準曲線來確定。
可以將本文所述的每種生物標記的含量標準化為標準標記的標準含量。標準標記的標準含量可以是預先確定的，同時確定的，或樣品獲自受試者之後確定的。標準標記可以在同一測定中運行，或可以是來自先前測定的已知的標準標記。在通過定序測定（例如，RNA定序）確定生物標記的含量的情況下，可以將生物標記的含量標準化為定序的總讀數。
本文提供的用於測量生物標記的含量的任何測定和方法可以被改良或優化，以用於在自動化和半自動化系統或定點照護測定系統中使用。自動化和半自動化系統的實例描述於例如Hu等人, Lab On a Chip [芯片實驗室]2017, 17(13): 2225；Song等人, Anal Chem [分析化學], 2019, 91(1); 388；以及Rusling等人, Analyst [分析員]2010, 135(10):2496中。
iii. 與相應的參考含量進行比較
然後可以將生物標記的含量（例如，任選地歸一化）與相應生物標記的相應的參考含量進行比較，以確定與參考含量的差異。如本文所使用的，該至少一種生物標記（例如，Noxa、或ASCL1、或兩者）的術語「參考含量」是指如下生物標記的含量，該生物標記的含量代表正常受試者的對照含量，或代表患有癌症的受試者的一般群體中該生物標記的平均含量。在某些實施例中，該至少一種生物標記（例如，Noxa、或ASCL1、或兩者）的參考含量代表患有癌症的受試者的一般群體中該生物標記的平均含量。
在某些實施例中，參考含量可以是通常在一種或多種健康細胞或組織樣品中或在一種或多種對照（例如，癌症）細胞或組織樣品中觀察到的相應生物標記含量的典型含量、測量含量、或範圍。在某些實施例中，參考含量可以是在健康的受試者群體中或在患有癌症的受試者的一般群體中（例如，在一般的癌症患者群體中）相應生物標記的平均含量。如本文所使用的，「患有癌症的受試者的一般群體」或「一般癌症患者群體」是指癌症受試者或患有不同種類癌症的患者的群體。例如，一般癌症患者群體可以是一組至少三種（四種、五種、六種、七種、八種、九種、十種或更多種）類型的癌症患者，其中一些患者患有第一類型癌症、一些患有第二類型癌症、一些患有第三類型癌症，依此類推。例如，一般癌症患者群體可以是患有各種癌症或多種癌症類型的群體。在某些實施例中，參考含量也可以是被認為代表患有癌症的受試者的一般群體的經驗含量。在某些實施例中，本文所述的生物標記的參考含量是使用與在測量本文提供的生物標記的含量中使用的相同或相當的測量方法或測定而獲得的。
在某些實施例中，參考含量可以是預先確定的。例如，可以基於在正常組織或樣品的集合中的生物標記含量的測量值來計算或概括參考含量。又例如，參考含量可以 基於對來自正常群體的相當的樣品中通常觀察到的生物標記含量的統計。
在某些實施例中，參考含量可以與測試樣品中的生物標記的含量進行平行測試。在某些實施例中，在對照樣品中測量參考含量。在某些實施例中，對照樣品是來源於同一受試者或來源於健康受試者的正常的組織樣品。在某些實施例中，對照樣品來源於對照癌症患者。在某些實施例中，對照樣品是來自一個或多個健康受試者或來自一個或多個癌症患者的相當的樣品。
測試樣品中該至少一種生物標記的含量可以在升高或降低方面表現出與參考含量的差異。取決於特定的生物標記，為了根據本文提供的方法預測對MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL抑制劑雙重抑制劑或Bcl-2抑制劑或Bcl-xL抑制劑產生反應性的可能性，可以在一種生物標記中尋求增加，但在另一種生物標記中尋求降低。如本文所使用的，術語「升高」是指如在測試樣品中測量的生物標記的含量高於該生物標記的相應的參考含量。類似地，如本文所使用的「降低」是指如在樣品中測量的生物標記的含量低於該生物標記的相應的參考含量。如本文所使用的，術語「維持」是指沒有顯著變化。
在某些實施例中，Noxa含量的升高與對本文提供的MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-2抑制劑或Bcl-xL抑制劑產生反應性的可能性有關。在某些實施例中，ASCL1含量的升高與對本文提供的MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-2抑制劑或Bcl-xL抑制劑產生反應性的可能性有關。在某些實施例中，Noxa含量的升高和ASCL1含量的升高與對本文提供的MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-Xl雙重抑制劑或Bcl-2抑制劑或Bcl-xL抑制劑產生反應性的可能性有關。
在某些實施例中，該至少一種生物標記（例如，Bcl-xL、Bcl-2、Mcl-1、和/或包含Bcl-xL蛋白質的蛋白質複合物和/或包含Bcl-2的蛋白質複合物）的含量可以被進一步考慮，例如以增加診斷的敏感性和特異性。例如，Bcl-xL含量的升高、Bcl-2含量的升高、維持至Mcl-1含量的降低、和/或包含Bcl-xL蛋白質或Bcl-2蛋白質的蛋白質複合物含量的升高還與對本文提供的Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑產生反應性的可能性有關。在某些實施例中，Noxa含量的升高，和/或ASCL1含量的升高，伴隨著Bcl-xL含量的升高、Bcl-2含量的升高、維持至Mcl-1含量的降低、或包含Bcl-xL蛋白質或Bcl-2蛋白質的蛋白質複合物含量的升高，與對本文提供的MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-2抑制劑或Bcl-xL抑制劑產生反應性的可能性有關。
在某些實施例中，將與參考含量的差異與預定的閾值做進一步比較。在某些實施例中，可以通過統計方法設置預定的閾值，使得如果與參考含量的差異達到預定的閾值，則可以認為這種差異在統計學上是顯著的。有用的統計分析方法描述於L. D. Fisher和G. vanBelle, Biostatistics: A Methodology for the Health Sciences [生物統計學：健康科學方法論]（Wiley-Interscience[威利國際科學出版社], 紐約州, 1993）中。可以基於置信度（「p」）值確定統計學顯著性，p值可以使用未配對的2尾t檢驗來計算。通常可以使用例如小於或等於0.1、0.05、0.025或0.01的p值來指示統計學顯著性。可信區間和p值可以通過本領域熟知的方法來確定。參見，例如，Dowdy和Wearden, Statistics for Research [研究統計], John Wiley & Sons[約翰·威利父子出版社], 紐約, 1983。
在某些實施例中，Noxa含量的預定的閾值是至少15%、至少25%、至少35%、至少45%、或至少50%的升高。如本文所使用的，「升高百分比」或「更高百分比」是指增量的百分比。例如，100%升高表示從參考含量的100%增加，相當於參考含量的總共200%。換言之，當在測試樣品中測量的Noxa含量比Noxa的相應的參考含量高至少15%、至少25%、至少35%、至少45%、或至少50%時，測試樣品中Noxa的這種測量含量被認為與參考含量顯著不同。
在某些實施例中，ASCL1含量的預定的閾值是至少15%、至少25%、至少35%、至少45%、或至少50%、或至少100%的升高。換言之，當在測試樣品中測量的ASCL1含量比ASCL1的相應的參考含量高至少50%、至少75%、至少100%、至少125%、或至少150%時，測試樣品中ASCL1的這種測量含量被認為與參考含量顯著不同。
用於患者鑒定和治療指導的方法
在另一方面，本揭露提供了用於鑒定患有癌症的受試者可能對用MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-xL抑制劑或Bcl-2抑制劑的治療產生反應的方法。在一個實施例中，該方法包括：在來源於該受試者的測試樣品中測量至少一種包含Noxa、ASCL1或Noxa和ASCL1的生物標記的含量；並將該至少一種生物標記的含量與該至少一種生物標記的對應的參考含量進行比較，以確定與參考含量的差異；並且當該差異達到預定的閾值時，鑒定該受試者可能對用MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-xL抑制劑或Bcl-2抑制劑的治療產生反應。
在某些實施例中，如果該差異未達到預定的閾值，那麼該受試者被鑒定為不太可能對用MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-2抑制劑或Bcl-xL抑制劑的治療產生反應。可以建議這些經鑒定的受試者進行另外的測試以確認結論，或可替代地可以建議不用本文提供的MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-2抑制劑或Bcl-xL抑制劑進行治療。
在某些實施例中，本文提供的方法進一步包括向被鑒定為可能對用MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-2抑制劑或Bcl-xL抑制劑的治療產生反應的受試者施用有效量的MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-2抑制劑或Bcl-xL抑制劑。
在某些實施例中，本文提供的方法進一步包括向被鑒定為可能對用MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-2抑制劑或Bcl-xL抑制劑的治療產生反應的受試者施用有效量的與MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-2抑制劑或Bcl-xL抑制劑組合的第二抗癌治療劑。
在另一方面，本揭露提供了用於在有需要的受試者中治療癌症的方法。在某些實施例中，該方法包括：在來源於該受試者的測試樣品中測量至少一種包含Noxa或ASCL1或兩者的生物標記的含量；將該至少一種生物標記的含量與該至少一種生物標記的對應的參考含量進行比較，以確定與參考含量的差異；並且當差異達到預定的閾值時，向該受試者施用有效量的MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-2抑制劑或Bcl-xL抑制劑。
在另一方面，本揭露提供了用於在受試者中監測治療功效的方法，該受試者患有癌症，並在治療期內已經用MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-2抑制劑或Bcl-xL抑制劑進行了治療。在某些實施例中，該方法包括：治療期後從該受試者獲得測試樣品；在測試樣品中測量至少一種包含Noxa或ASCL1或兩者的生物標記的含量，以獲得該至少一種生物標記的治療後含量；將該治療後含量與來源於該受試者的治療期之前的測試樣品中的該至少一種生物標記的基線含量進行比較，以確定該至少一種生物標記的含量的治療後變化。如果該治療後差異仍達到預定的閾值，那麼該受試者被鑒定為仍對用MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-2抑制劑或Bcl-xL抑制劑的治療產生反應。可替代地，如果該治療後差異未達到預定的閾值，那麼該受試者被鑒定為對本文提供的MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-2抑制劑或Bcl-xL抑制劑具有降低的反應性或不再產生反應。
在某些實施例中，該方法進一步包括當該差異達到預定的閾值時，向該受試者繼續施用MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-2抑制劑或Bcl-xL抑制劑。在某些實施例中，當差異未達到預定的閾值時，該方法進一步包括：向該受試者施用有效量的與MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-2抑制劑或Bcl-xL抑制劑組合的第二抗癌治療劑，或向該受試者停止施用MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-2抑制劑或Bcl-xL抑制劑。
在某些實施例中，該至少一種生物標記進一步包含Bcl-xL、Bcl-2、PUMA、Mcl-1、包含Bcl-xL的蛋白質複合物，或其任何組合。樣品中Noxa（以及任選地Bcl-2、Bcl-xL）的治療後含量的降低表明對用MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-2抑制劑或Bcl-xL抑制劑的治療產生降低的反應性的可能性。在某些實施例中，樣品中Mcl1的治療後含量的升高表明對用MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-2抑制劑或Bcl-xL抑制劑的治療產生降低的反應性的可能性。
Bcl-2/Bcl-xL 雙重抑制劑或 Bcl-2 抑制劑或 Bcl-xL 抑制劑
在某些實施例中，本文所述的Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑是具有結構式 (I)、(II) 或 (III)的化合物：
Figure 02_image001
Figure 02_image003
Figure 02_image005
或式 (I)、(II) 或 (III) 的藥學上可接受的鹽； 其中A環是
Figure 02_image007
或
Figure 02_image009
； 取代的或未取代的X選自下組，該組由以下組成：亞烷基、亞烯基、環亞烷基、環亞烯基和雜環亞烷基； Y選自下組，該組由以下組成：(CH2 )n -N(Ra )2 和
Figure 02_image011
； Q選自下組，該組由以下組成：O、O(CH2 )1-3 、NRc 、NRc (C1-3 亞烷基)、OC(=O)(C1-3 亞烷基)、C(=O)O、C(=O)O(C1-3 亞烷基)、NHC(=O)(C1-3 亞烷基)、C(=O)NH和C(=O)NH(C1-3 亞烷基)； Z是O或NRc ； R1 和R2 獨立地選自下組，該組由以下組成：H、CN、NO2 、鹵代、烷基、環烷基、烯基、環烯基、炔基、芳基、雜芳基、雜環烷基、OR'、SR'、NR'R''、COR'、CO2 R'、OCOR'、CONR'R''、CONR'SO2 R''、NR'COR''、NR'CONR''R'''、NR'C=SNR''R'''、NR'SO2 R''、SO2 R'和SO2 NR'R''； R3 選自下組，該組由以下組成：H、烷基、環烷基、烯基、環烯基、炔基、芳基、雜芳基、雜環烷基、OR'、NR'R''、OCOR'、CO2 R'、COR'、CONR'R''、CONR'SO2 R''、C1-3 亞烷基CH(OH)CH2 OH、SO2 R'和SO2 NR'R''； R'、R''和R'''獨立地是H、烷基、環烷基、烯基、環烯基、炔基、芳基、雜芳基、C1-3 亞烷基雜環烷基、或雜環烷基； R'和R''、或R''和R'''可以與它們所鍵合的原子一起形成3至7元環； R4 是氫、鹵代、C1-3 烷基、CF3 或CN； R5 是氫、鹵代、C1-3 烷基、取代的C1-3 烷基、羥基烷基、烷氧基或取代的烷氧基； R6 選自下組，該組由以下組成：H、CN、NO2 、鹵代、烷基、環烷基、烯基、環烯基、炔基、芳基、雜芳基、雜環烷基、OR'、SR'、NR'R''、CO2 R'、OCOR'、CONR'R''、CONR'SO2 R''、NR'COR''、NR'CONR''R'''、NR'C=SNR''R'''、NR'SO2 R''、SO2 R'和SO2 NR'R''； 取代的或未取代的R7 選自下組，該組由以下組成：氫、烷基、烯基、(CH2 )0-3 環烷基、(CH2 )0-3環烯基 、(CH2 )0-3 雜環烷基、(CH2 )0-3 芳基和(CH2 )0-3 雜芳基； R8 選自下組，該組由以下組成：氫、鹵代、NO2 、CN、CF3 SO2 和CF3 ； Ra 選自下組，該組由以下組成：氫、烷基、雜烷基、烯基、羥基烷基、烷氧基、取代的烷氧基、環烷基、環烯基和雜環烷基； Rb 是氫或烷基； Rc 選自下組，該組由以下組成：氫、烷基、取代的烷基、羥基烷基、烷氧基和取代的烷氧基；並且 n、r和s獨立地是1、2、3、4、5或6。
在某些實施例中，本文所述的Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑是具有式 (IV) 的結構的化合物： (IV)
Figure 02_image013
或 (IV) 的藥學上可接受的鹽； R21 是SO2 R2 '； R22 是烷基，較佳為C1 -C4 烷基，更佳為甲基、丙基或異丙基； R23 是烷基，較佳為C1 -C4 烷基，更佳為甲基、丙基或異丙基； R24 是鹵素，較佳為氟、氯； R25 是鹵素，較佳為氟、氯； R26 選自H、鹵素、烷基，較佳氟、氯、C1 -C4 烷基，更佳為甲基、丙基、異丙基； R21b 是H或烷基，較佳為C1 -C4 烷基，更佳為甲基、丙基或異丙基； n2 、r2 和s2 獨立地是1、2、3、4、5或6，更佳地為r2 和s2 都是2，並且n2 是3、4或5，更佳地為，n2 、r2 和s2 都是2；並且 R2 '是烷基，較佳為C1 -C4 烷基，更佳為甲基、丙基或異丙基。
在某些實施例中，本文所述的Bcl-2抑制劑是具有式 (V) 的結構的化合物：
Figure 02_image015
(V)， 或 (V) 的藥學上可接受的鹽； A3 選自下組，該組由以下組成：
Figure 02_image017
、
Figure 02_image019
、
Figure 02_image021
、
Figure 02_image023
、
Figure 02_image025
、
Figure 02_image027
、
Figure 02_image029
、
Figure 02_image031
、
Figure 02_image033
、以及
Figure 02_image035
； E3 是碳原子，並且
Figure 02_image037
是雙鍵；或 E3 是-C(H)-，並且
Figure 02_image037
是單鍵；或 E3 是氮原子，並且
Figure 02_image037
是單鍵； X31 、X32 和X33 各自獨立地選自下組，該組由以下組成：-CR38 =和-N=； R31a 和R31b 與它們所附接的碳原子一起形成3元、4元或5元任選取代的環烷基；或 R31a 和R31b 與它們所附接的碳原子一起形成4元或5元任選取代的雜環； R32 選自下組，該組由以下組成：-NO2 、-SO2 CH3 和-SO2 CF3 ； R32a 選自下組，該組由以下組成：氫和鹵素； R33 選自下組，該組由以下組成：氫、-CN、-C≡CH和-N(R34a )(R34b )； R34a 選自下組，該組由以下組成：任選取代的C1-6 烷基、任選取代的C3-6 環烷基、雜環、雜烷基、(環烷基)烷基和(雜環)烷基； R34b 選自下組，該組由以下組成：氫和C1-4 烷基； R35 選自下組，該組由以下組成：任選取代的C1-6 烷基、雜環、雜烷基、(環烷基)烷基和(雜環)烷基； R36a 、R36c 、R36e 、R36f 和R36g 各自獨立地選自下組，該組由以下組成：氫、任選取代的C1-6 烷基、任選取代的C3-6 環烷基、任選取代的芳基、任選取代的雜芳基、雜環、雜烷基、(環烷基)烷基和(雜環)烷基； R36b 和R36d 各自獨立地選自下組，該組由以下組成：氫、C1-4 烷基和鹵素； R37 選自下組，該組由以下組成：任選取代的C1-6 烷基、雜環、雜烷基、(環烷基)烷基和(雜環)烷基；並且 R38 選自下組，該組由以下組成：氫和鹵素。
在某些實施例中，本文所述的具有結構式 (I-III) 的Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑是選自表1-A的化合物或該化合物的藥學上可接受的鹽。
表1-A
化合物 結構
A1
Figure 02_image115
A2
Figure 02_image117
A3
Figure 02_image119
A4
Figure 02_image121
A5
Figure 02_image123
A6
Figure 02_image125
A7
Figure 02_image127
A8
Figure 02_image129
A9
Figure 02_image131
A10
Figure 02_image133
A11
Figure 02_image135
A12
Figure 02_image137
A13
Figure 02_image139
A14
Figure 02_image141
A15
Figure 02_image143
A16
Figure 02_image145
A17
Figure 02_image147
A18
Figure 02_image149
A19
Figure 02_image151
在某些實施例中，本文所述的具有結構式 (IV) 的Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑是選自表1-B的化合物。
表1-B
化合物 結構
B1
Figure 02_image153
B2
Figure 02_image155
B3
Figure 02_image157
B4
Figure 02_image041
B5
Figure 02_image160
B6
Figure 02_image162
B7
Figure 02_image164
B8
Figure 02_image166
B9
Figure 02_image168
B10
Figure 02_image170
B11
Figure 02_image172
B12
Figure 02_image174
在某些實施例中，本文所述的具有結構式 (V) 的Bcl-2抑制劑是選自表1-C的化合物或該化合物的藥學上可接受的鹽。
表1C
化合物 結構
C1
Figure 02_image176
C2
Figure 02_image178
C3
Figure 02_image180
C4
Figure 02_image182
C5
Figure 02_image184
C6
Figure 02_image186
C7
Figure 02_image188
C8
Figure 02_image190
C9
Figure 02_image192
C10
Figure 02_image194
C11
Figure 02_image196
C12
Figure 02_image198
C13
Figure 02_image200
C14
Figure 02_image202
C15
Figure 02_image204
C16
Figure 02_image206
C17
Figure 02_image208
C18
Figure 02_image210
C19
Figure 02_image212
C20
Figure 02_image214
C21
Figure 02_image216
C22
Figure 02_image218
C23
Figure 02_image220
C24
Figure 02_image222
C25
Figure 02_image224
C26
Figure 02_image226
C27
Figure 02_image228
C28
Figure 02_image230
C29
Figure 02_image232
C30
Figure 02_image234
C31
Figure 02_image236
C32
Figure 02_image238
C33
Figure 02_image240
C34
Figure 02_image242
C35
Figure 02_image244
C36
Figure 02_image246
C37
Figure 02_image248
C38
Figure 02_image250
C39
Figure 02_image252
C40
Figure 02_image254
C41
Figure 02_image256
C42
Figure 02_image258
C43
Figure 02_image260
C44
Figure 02_image262
C45
Figure 02_image264
C46
Figure 02_image266
C47
Figure 02_image268
C48
Figure 02_image270
C49
Figure 02_image272
C50
Figure 02_image274
C51
Figure 02_image276
C52
Figure 02_image278
C53
Figure 02_image280
C54
Figure 02_image282
C55
Figure 02_image284
C56
Figure 02_image286
C57
Figure 02_image288
C58
Figure 02_image290
C59
Figure 02_image292
C60
Figure 02_image294
C61
Figure 02_image296
C62
Figure 02_image298
C63
Figure 02_image300
C64
Figure 02_image302
C65
Figure 02_image304
C66
Figure 02_image306
在某些實施例中，Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑是具有以下結構的(R )-2-(1-(3-(4-(N-(4-(4-(3-(2-(4-氯苯基)-1-異丙基-5-甲基-4-(甲基磺醯基)-1H-吡咯-3-基)-5-氟苯基)呱嗪-1-基)苯基)氨磺醯基)-2-(三氟甲基磺醯基)苯基胺基)-4-(苯硫基)丁基)呱啶-4-羰基氧基)乙基膦酸（“化合物A15”）
Figure 02_image039
，或其藥學上可接受的鹽。
在某些實施例中，Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑是具有以下結構的(R)-1-(3-(4-(N-(4-(4-(3-(2-(4-氯苯基)-1-異丙基-5-甲基-4-(甲基磺醯基)-1H-吡咯-3-基)-5-氟苯基)呱嗪-1-基)苯基)氨磺醯基)-2-(三氟甲基磺醯基)苯基胺基)-4-(苯硫基)丁基)呱啶-4-甲酸（“化合物B4”）
Figure 02_image041
或其藥學上可接受的鹽。
化合物A15是以非常高親和力、以分別為1.6 nM、4.4 nM和9.3 nM的IC50 值與Bcl-2、Bcl-xL和Bcl-w蛋白質結合的小分子化合物。化合物A15對Mcl-1蛋白質具有弱親和力。化合物A15在癌細胞系的一個亞組中顯示出具有奈莫耳效價的有效的體外細胞生長抑制活性。從原理上講，化合物A15有效誘導半胱天冬酶-3和PARP的切割，半胱天冬酶-3和PARP是癌細胞和異種移植腫瘤組織中人類癌症的細胞凋亡的生化標記。化合物B4是化合物A15的活性代謝物。
在一些實施例中，Bcl-2抑制劑選自具有以下結構的化合物
Figure 02_image310
， 或其藥學上可接受的鹽。
許多Bcl-xL抑制劑在本領域中是已知的，例如在以下文獻中描述的那些：Urbaniak A等人, Oncol Lett.[腫瘤學快報] 2019年11月; 18(5):5097-5106；Zhan Y等人, Cell Biosci. [細胞生物科學] 2019年7月23日; 9:60.；Hikita H等人, Hepatology. [肝臟學] 2010; 52:1310-21；Lee B等人, Biochem Biophys Res Commun. [生物化學和生物物理學研究通訊] 2019年6月25日; 514(2):518-523；Henz K等人, Biol Chem. [生物化學] 2019年1月28日; 400(2):181-185；Wang Q等人, Leuk Lymphoma. [白血病和淋巴瘤] 2019年9月; 60(9):2170-2180.；Rello-Varona S等人, Sci Rep. [科學報告] 2019年3月7日; 9(1):3816；Levesley J等人, Neuro Oncol. [神經腫瘤學] 2018年1月22日; 20(2):203-214以及Lucantoni F等人, Oncotarget. [腫瘤靶標] 2018年5月25日; 9(40):26046-26063。
在某些實施例中，本文所述的Bcl-xL抑制劑選自ABT-263、ABT-737、A-1331852、A-1155463和WEHI-539。
MDM2 抑制劑
在某些實施例中，MDM2抑制劑包含具有以下式 (VI) 的化學結構：
Figure 02_image045
或其藥學上可接受的鹽，其中
Figure 02_image047
選自下組，該組由以下組成：
Figure 02_image314
； B是C4-7 碳環； R61 是H、取代的或未取代的C1-4 烷基、取代的或未取代的環烷基、取代的或未取代的雜環烷基、OR6a 、或NR6a R6b ； n3 是0、1或2； R62 、R63 、R64 、R65 、R67 、R68 、R69 和R70 獨立地選自下組，該組由以下組成：H、F、Cl、CH3 和CF3 ； R66 是
Figure 02_image051
或
Figure 02_image053
； R6a 是氫或取代的或未取代的C1-4 烷基； R6b 是氫或取代的或未取代的C1-4 烷基； R6c 和R6d 是環B的一個碳原子上的取代基，其中 R6c 是H、C1-3 烷基、C1-3 亞烷基-OR6a 、OR6a 或鹵代； R6d 是H、C1-3 烷基、C1-3 亞烷基-OR6a 、OR6a 或鹵代；或 R6c 和R6d 與它們所附接的碳一起形成4元至6元螺取代基，任選地包含氧原子；並且 R6e 是-C(=O)OR6a 、-C(=O)NR6a R6b 或-C(=O)NHSO2 CH3 。
在某些實施例中，
Figure 02_image047
是
Figure 02_image319
； B是
Figure 02_image321
；並且 R6c 和R6d 是F和F、H和H、OH和CH3 、OH和H、CH3 和CH3 、CH3 和OH、H和OH、CH2 CH3 和CH2 CH3 、或CH2 OH和CH2 OH。
在某些實施例中，
Figure 02_image060
是H、CH3 或CH2 CH3 。
在某些實施例中，R62 是H；R63 是鹵代；R64 和R65 是H。
在某些實施例中，R67 是氟；R68 、R69 和R70 中的每個是H；並且R6e 是-C(=O)OH、-C(=O)NH2 或-C(=O)NHSO2 CH3 。
在某些實施例中，MDM2抑制劑是選自以下的化合物：
Figure 02_image324
、
Figure 02_image326
、
Figure 02_image328
、
Figure 02_image330
、
Figure 02_image332
、
Figure 02_image334
、
Figure 02_image336
、
Figure 02_image338
、
Figure 02_image340
、
Figure 02_image342
、
Figure 02_image344
、
Figure 02_image346
、
Figure 02_image348
、
Figure 02_image350
和
Figure 02_image352
，或藥學上可接受的鹽。
在一個實施例中，MDM2抑制劑是
Figure 02_image092
， 或其藥學上可接受的鹽。
在一個實施例中，MDM2抑制劑是
Figure 02_image094
， 或其藥學上可接受的鹽。
將可在本申請中使用的更多的MDM2抑制劑和MDM2抑制劑的合成進一步揭露於美國專利號9,745,314中，將其通過引用併入本文。
第二抗癌治療劑
在一些實施例中，向受試者施用有效量的與MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL抑制劑或Bcl-2抑制劑或Bcl-xL抑制劑組合的第二抗癌治療劑，該受試者通過如本文所提供的方法被鑒定為可能對用MDM2抑制劑、Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-xL抑制劑或Bcl-2抑制劑的治療產生反應。
在一些實施例中，向受試者施用有效量的與MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL抑制劑或Bcl-2抑制劑或Bcl-xL抑制劑組合的第二抗癌治療劑，該受試者通過如本文所提供的方法被鑒定為對用MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-xL抑制劑或Bcl-2抑制劑的治療具有降低的反應可能性。
在一些實施例中，向受試者施用與有效量的MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-2抑制劑或Bcl-xL抑制劑組合的有效量的第二抗癌治療劑，該受試者已經被確定為具有至少一種包含Noxa、ASCL1或兩者的生物標記的治療後變化，該變化未達到如本文所述的預定閾值。
在一些實施例中，按與治療具體癌症的護理標準下的標準劑量不同（例如，低於）的劑量施用MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-2抑制劑或Bcl-xL抑制劑。在某些實施例中，MDM2抑制劑、Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-2抑制劑或Bcl-xL抑制劑的施用劑量比治療具體癌症的護理標準下的標準劑量低5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。在某些實施例中，MDM2抑制劑、Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-2抑制劑或Bcl-xL抑制劑的施用劑量是治療具體癌症的護理標準下的標準劑量的95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%或5%。
在一個具體的實施例中，第二抗癌治療劑是可以用於治療癌症的藥劑。例如，第二抗癌治療劑可以選自抗腫瘤劑、抗血管生成劑、化學治療劑和肽類癌症治療劑。在又另一個實施例中，抗腫瘤劑選自抗生素型藥劑、烷化劑、抗代謝劑、激素藥劑、免疫學藥劑、干擾素型藥劑、激酶抑制劑、其他藥劑及其組合。值得注意的是，第二抗癌治療劑可以是傳統的小的有機化學分子，或可以是大分子（例如蛋白質、抗體、肽體、DNA、RNA）或此類大分子的片段。
在一些實施例中，另外的藥物活性劑是免疫檢查點分子的調節劑。
如本文所使用的，「免疫檢查點」或「免疫檢查點分子」是免疫系統中的調節訊號的分子。免疫檢查點分子可以是共刺激檢查點分子（即，調高訊號），或抑制性檢查點分子（即，調低訊號）。如本文所使用的，「共刺激檢查點分子」是免疫系統中調高訊號或具有共刺激性的分子。如本文所使用的，「抑制性檢查點分子」是免疫系統中調低訊號或具有共抑制性的分子。
如本文所使用的，「免疫檢查點分子的調節劑」是能夠改變受試者中免疫檢查點活性的藥劑。在某些實施例中，免疫檢查點分子的調節劑改變一種或多種免疫檢查點分子的功能，該一種或多種免疫檢查點分子包括PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、TIM-3、LAG3、CD160、2B4、TGF β、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、OX40、CD2、CD27、ICAM-1、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3、LFA-1、1COS、4-1BB、GITR、CD30、CD40、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT和CD83。免疫檢查點的調節劑可以是免疫檢查點的活化劑（例如，激動劑）或抑制劑（例如，拮抗劑）。在一些實施例中，免疫檢查點分子的調節劑是免疫檢查點結合蛋白（例如，抗體、抗體Fab片段、二價抗體、抗體藥物綴合物、scFv、融合蛋白、二價抗體或四價抗體）。在一些實施例中，免疫檢查點分子的調節劑是單株抗體或其抗原結合片段。在其他實施例中，免疫檢查點分子的調節劑是小分子。在一個具體的實施例中，免疫檢查點分子的調節劑是抗PD1抗體。在一個具體的實施例中，免疫檢查點分子的調節劑是抗PD-L1抗體。在一個具體的實施例中，免疫檢查點分子的調節劑是抗CTLA-4抗體。
在一些實施例中，免疫檢查點分子的調節劑恢復抗腫瘤T細胞活性或阻斷T細胞抑制性細胞活性。在一些實施例中，免疫檢查點分子的調節劑是共刺激檢查點分子的活化劑，並且共刺激檢查點分子的活化劑改變完全T細胞活化所需的共刺激訊號。
在一些實施例中，免疫檢查點分子的調節劑是派姆單抗、伊匹單抗、納武單抗、阿特珠單抗、阿維魯單抗（avelumab）、度伐魯單抗（durvalumab）、AGEN-1884、BMS-986016、CS-1002、LAG525、MBG453、MEDI-570、OREG-103/BY40、利瑞魯單抗（lirilumab）、曲美木單抗、納武單抗、AMP-224、AMP-514、BGB-A317、賽米單抗（cemiplimab）、JS001、PDR-001、CS-1001、PF-06801591、IBI-308、匹地利珠單抗（pidilizumab）、SHR-1210、或TSR-042、JS003、LY3300054、MDX-1105、SHR-1316、KN035、或CK-301。
在一些實施例中，第二抗癌治療劑是化療藥物，是可以用於治療癌症的生物（大分子）或化學（小分子）化合物。化療藥物的類型包括但不限於，組蛋白脫乙醯化酶抑制劑（HDACI）、烷化劑、抗代謝物、生物鹼、細胞毒性/抗癌症抗生素、拓撲異構酶抑制劑、微管蛋白抑制劑、蛋白質、抗體、激酶抑制劑等。化療藥物包括用於靶向療法的化合物和傳統化學療法的非靶向性化合物。
化療藥物的非限制性實例包括：埃羅替尼、阿法替尼、多西他賽、阿黴素、5-FU（5-氟尿嘧啶）、帕比司他、吉西他濱、順鉑、卡鉑、紫杉醇、貝伐單抗、曲妥珠單抗、帕妥珠單抗、二甲雙胍、替莫唑胺、他莫昔芬、多柔比星、雷帕黴素、拉帕替尼、羥基喜樹堿、曲美替尼（trimetinib）。化療藥物的另外的實例包括：奧沙利鉑、硼替佐米、舒尼替尼、來曲唑、伊馬替尼、PI3K抑制劑、氟維司群、亞葉酸、洛那法尼、索拉非尼、吉非替尼、克唑替尼、伊立替康、拓撲替康、伐柔比星、維莫非尼、泰比維尼（telbivinib）、卡培他濱、凡德他尼、苯丁酸氮芥、帕尼單抗、西妥昔單抗、利妥昔單抗、托西莫單抗、坦羅莫司、依維莫司、帕唑帕尼、坎磷醯胺、噻替派、環磷醯胺；烷基磺酸酯，例如白消安、英丙舒凡（improsulfan）和呱泊舒凡（piposulfan）；乙烯亞胺、苯佐替呱（benzodopa）、卡波醌、美妥替呱（meturedopa）、烏瑞替呱（uredopa）、甲基蜜胺（包括六甲蜜胺、三乙烯蜜胺、三乙基磷醯胺、三乙基硫代磷醯胺和三亞甲基蜜胺）；布拉他辛（bullatacin）、布拉他辛酮（bullatacinone）；苔蘚蟲素；海綿聚酮（callystatin）、CC-1065（包括它的阿多來新、卡折來新、比折來新合成類似物）、念珠藻素（特別地，念珠藻素1和念珠藻素8）；多拉司他汀、多卡米新（包括合成類似物KW-2189和CB1-TM1）；艾榴塞洛素（eleutherobin）；水鬼蕉堿、匍枝珊瑚醇、海綿素；氮芥，例如，苯丁酸氮芥、萘氮芥、環磷醯胺、雌氮芥、 異環磷醯胺、雙-氯乙基-甲胺、氧氮芥馬法蘭、新恩比興（novembichin）、苯芥膽甾醇、潑尼莫司汀、曲洛磷胺、烏拉莫司汀、亞硝基脲、例如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；抗生素（例如，烯二炔類抗生素（例如，加利車黴素、加利車黴素γ1I、加利車黴素ωI1、達內黴素、達內黴素A）；二磷酸鹽，例如，氯膦酸鹽、埃斯培拉黴素、和新制癌菌素髮色團和相關的色蛋白烯二炔類抗生素發色團）、阿克拉黴素、放線菌素、全反式維甲酸、氨茴黴素、重氮絲氨酸、博來黴素、放線菌素C、卡柔比星（carabicin）、洋紅黴素、噬癌菌素、色黴素、放線菌素D、柔紅黴素、去氧-氟尿苷、地托比星、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、嗎啉代-多柔比星、氰基-嗎啉代-多柔比星、2-吡咯啉-多柔比星、環氧多柔比星、表阿黴素、依索比星、伊達比星、麻西羅黴素、絲裂黴素、黴酚酸、諾加黴素、橄欖黴素、培洛黴素、泊非黴素、嘌呤黴素、三鐵阿黴素、羅多比星、鏈黑菌素、鏈脲黴素、殺結核菌素、烏苯美司、淨司他丁、佐柔比星；抗代謝藥，例如甲氨蝶呤；葉酸類似物，例如二甲基葉酸、甲氨蝶呤、蝶羅呤、三甲曲沙；嘌呤類似物，例如氟達拉濱、6-巰基嘌呤、甲氨蝶呤、硫咪嘌呤、硫鳥嘌呤；嘧啶類似物，例如安西他濱、阿紮胞苷、硫唑嘌呤、博來黴素、6-硝基尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、雙去氧尿苷、去氧氟尿苷、依諾他濱、氟尿苷；雄激素，卡魯睾酮、屈他雄酮丙酸酯、環硫雄醇、美雄烷、睾內酯；抗腎上腺素藥劑，例如氨魯米特、米托坦、曲洛司坦；葉酸補充劑，例如亞葉酸；醋葡醛內酯；醛磷醯胺糖苷；胺基乙醯丙酸；恩尿嘧啶、安吖啶、阿莫司汀（bestrabucil）、比生群、伊達曲沙、地磷醯胺（defofamine）、秋水仙胺、地吖醌、依氟鳥氨酸、依利醋銨、埃博黴素、依託格魯；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖、氯尼達明（lonidainine）、美登木素生物鹼、美登素、安絲菌素、米托胍腙、米托蒽醌、莫呱達醇、尼曲瑞林（nitraerine）、噴司他丁、蛋氨氮芥、吡柔比星、洛索蒽醌、鬼臼酸；2-乙基肼；丙卡巴肼、PSK®多糖複合物（JHS自然產品公司（JHS Natural Products），尤金，俄勒岡州）、雷佐生、根黴素、西佐喃、鍺螺胺、細交鏈孢菌酮酸、三亞胺醌；2,2’,2”-三氯-三乙胺；單端孢黴烯（特別是T-2毒素、疣孢菌素（verracurin）A、漆斑菌素A和蛇形菌素）；烏拉坦、長春地辛、達卡巴嗪、甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴衛矛醇；呱泊溴烷、蓋克托辛（gacytosine）、阿拉伯糖苷（“Ara-C”）；環磷醯胺；噻替派；硫鳥嘌呤；6-巰基嘌呤；甲氨蝶呤；長春堿；依託泊苷、異環磷醯胺、米托蒽醌、長春新堿、長春瑞濱、米托蒽醌（novantrone）；培美曲塞；替尼泊苷、依達曲沙、道諾黴素；胺基蝶呤；伊班膦酸鹽；CPT-11；拓撲異構酶抑制劑RFS 2000；DMFO，類視黃醇，例如視黃酸；及其藥學上可接受的鹽或衍生物。
本文使用的化療藥物較佳地為選自下組，該組由以下組成：帕比司他、放線菌素、全反式維甲酸、阿紮胞苷、硫唑嘌呤、博來黴素、硼替佐米、卡鉑、卡培他濱、順鉑、苯丁酸氮芥、環磷醯胺、胞嘧啶阿拉伯糖苷、柔紅黴素、多西他賽、5-氟尿嘧啶、去氧氟尿苷、多柔比星、表阿黴素、阿黴素、埃博黴素、依託泊苷、氟尿嘧啶、吉西他濱、羥基脲、伊達比星、伊馬替尼、伊立替康、氮芥、巰基嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、奧沙利鉑、紫杉醇、培美曲塞、替尼泊苷、硫鳥嘌呤、拓撲替康、伐柔比星、維莫非尼、長春鹼、長春新鹼、長春地辛、長春瑞濱和羥基喜樹堿。
在一些實施例中，將免疫檢查點分子作為第二抗癌治療劑與MDM2抑制劑組合施用。在一些實施例中，將化學治療劑作為第二抗癌治療劑與Bcl-2/Bcl-xL抑制劑或Bcl-2抑制劑或Bcl-xL抑制劑組合施用。可以將第二抗癌症治療劑與MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL抑制劑或Bcl-2抑制劑或Bcl-xL抑制劑同時地、單獨地或順序地施用。
試劑盒
在另一方面，本揭露進一步提供了在如本文所述的任何測定中可用的一種或多種試劑，用於測量本文提供的該至少一種生物標記的含量。這些試劑可以是引子、探針和抗體。
在一些實施例中，本揭露提供了附接到固體支持物（例如陣列載玻片或晶片）上的寡核苷酸探針，例如，如描述於Bowtell和Sambrook編輯的DNA Microarrays: A Molecular Cloning Manual [DNA微陣列：分子克隆手冊](2003) Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港實驗室出版社]中。此類裝置的建構在本領域中是熟知的，例如如在以下美國專利和專利公開中所述：美國專利號5,837,832；PCT申請W0 95/11995；美國專利號5,807,522；美國專利號7,157,229、7,083,975、6,444,175、6,375,903、6,315,958、6,295,153和5,143,854、2007/0037274、2007/0140906、2004/0126757、2004/0110212、2004/0110211、2003/0143550、2003/0003032和2002/0041420。還在以下參考文獻中綜述了核酸陣列：Biotechnol Annu Rev [生物技術年鑒](2002) 8:85-101；Sosnowski等人Psychiatr Genet [精神病遺傳學](2002)12(4): 181-92；Heller,Annu Rev Biomed Eng [生物醫學工程年鑒](2002) 4: 129-53；Kolchinsky等人,Hum. Mutat [人類突變](2002) 19(4):343-60；和McGail等人,Adv Biochem Eng Biotechnol [生物化學工程/生物技術進展](2002) 77:21-42。
在另一方面，本揭露通過了用於在以上所述的方法中使用的試劑盒。典型地，試劑盒在載體或分隔容器中包含可用於本文提供的任何方法中的試劑。載體可以是呈例如袋、盒、管、架子形式的容器或支持物，並且任選地是分隔的。
試劑盒包含本文提供的引子、探針和/或抗體或微陣列中的一種或多種。引子、探針和/或抗體可以被或不可以被可檢測地標記。在某些實施例中，試劑盒可以進一步包含進行本文所述的方法的其他試劑。在此類應用中，試劑盒可以包含以下的任一者或全部：合適的緩衝液、用於分離核酸的試劑、用於擴增核酸的試劑（例如，聚合酶、dNTP混合物）、用於雜交核酸的試劑、用於對核酸進行定序的試劑、用於定量核酸的試劑（例如，嵌入劑、檢測探針）、用於分離蛋白質的試劑、以及用於檢測蛋白質的試劑（例如，抗體）。
在某些實施例中，試劑盒可以進一步包含標準陰性對照和/或標準陽性對照。
另外，試劑盒可包括指導材料，這些指導材料包含用於實施本文提供的方法的指導（即方案）。雖然指導材料典型地包含書面材料或印刷材料，但它們不限於此。
在某些實施例中，試劑盒可進一步包含儲存在電腦可讀介質上的電腦程式產品。當電腦程式產品由電腦執行時，它進行以下步驟：將該至少一種生物標記的含量與該至少一種生物標記的對應的參考含量進行比較，以確定與參考含量的差異。任何能夠儲存此類電腦可執行指令並將其傳送給最終使用者的介質都被本說明所考慮。這樣的介質包括但不限於電子儲存介質（例如，磁碟、磁帶、磁帶盒（cartridge）、晶片）、光學介質（例如，CD ROM）等。此類介質可以包括提供此類指導材料的網際網路網站的網址。
也可以使用載波訊號對電腦程式進行編碼和傳輸，這些載波訊號被改適用於經由符合包括網際網路的各種協議的有線網路、光學網路和/或無線網路進行傳輸。因此，可以使用此類程式編碼的數據訊號來創建根據本發明的實施例的電腦可讀介質。可以將程式代碼編碼的電腦可讀介質與兼容設備打包在一起，或者與其他設備分開提供（例如，通過網際網路下載）。任何這樣的電腦可讀介質可以駐留在單個電腦產品（例如，硬碟驅動器、CD或整個電腦系統）上或內部，並且可以存在於系統或網路內的不同電腦產品上或內部。
提供以下實例以更好地說明所要求保護的發明，並且不應將其解釋為限制本發明的範圍。下文描述的所有特定的組合物、材料和方法（全部或部分）均落入本發明的範圍內。這些特定的組合物、材料和方法不旨在限制本發明，而僅僅是為了說明落入本發明的範圍內的特定實施例。本領域通常知識者可以開發等同的組合物、材料和方法，而無需使用創新能力，並且不脫離本發明的範圍。應理解的是，可以在本文描述的程序中做出許多變化，同時仍然保持在本發明的範圍內。發明人的意圖是，此類變化包括在本發明的範圍內。
實例
實例 1
該實例示出在胃癌PDX模型和食道癌PDX模型中，Noxa表達與化合物A15的化合物功效之間的相關性。
材料與方法
選擇12個胃癌PDX模型和4個食道癌PDX模型進行功效研究。將攜帶患者來源的異種移植物（PDX）的小鼠根據其腫瘤體積隨機分配到2個不同的研究組。隨機化下的平均腫瘤體積是100-200 mm3 。在第1天，基於「匹配分佈（Matched distribution）」隨機化方法（StudyDirectorTM軟體）進行隨機化。向小鼠施用媒介物或化合物A15，持續21天（靜脈內，每週兩次）。
使用卡尺每週兩次在二維上測量腫瘤體積，並且使用以下公式以mm3 表示體積：腫瘤體積（mm3 ）= 0.5 a x b2 （其中a和b分別是腫瘤的長徑和短徑）。使用以下公式計算相對腫瘤體積（RTV）：RTV = Vt /V1 ，其中V1 和Vt 是在治療的第一天（第1天）的平均腫瘤體積和在某個時間點上的平均腫瘤體積。腫瘤生長抑制百分比（%T/C）被計算為經治療的腫瘤（T）的平均RTV除以對照腫瘤（C）的平均RTV × 100%。T/C值百分比是抗腫瘤效果的指標：T/C值 ＜ 42%被NCI認為是具有顯著抗腫瘤活性。T/C值 ＜ 10%被認為指示高度顯著的抗腫瘤活性，並且如果滿足毒性和某些其他要求，該值是被NCI用於證明臨床試驗合理性的含量（稱為DN-2含量活性）。大於20%的體重減輕（組均值）或大於20%的藥物致死被認為是指示劇毒劑量。所有數據在SPSS（統計產品和服務解決方案）18.0版（IBM公司，阿蒙克，紐約州，美國）中進行分析。將Prism 6版（GraphPad軟體公司，聖地亞哥，加利福尼亞州）用於圖像顯示。R2 （決定相關性）顯示y的百分比變化，這由範圍從0到1的所有x變量解釋。1表示最強的可能一致性，即完全相關。
結果
在胃癌PDX模型的功效試驗中，採用12個PDX模型（Bcl-xLhi 、Bcl2hi 、Mcl1低 - 正常 ），並用100 mg/kg化合物A15（靜脈內，每週兩次）治療21天（總共7個劑量）。這些模型的T/C值在17-117之間變化（圖 1A 和 1B ）（T/C值，處理組相比媒介物對照組中的平均腫瘤體積）。已經針對這些模型進行了RNA定序，並且將RNA定序數據表示為Log2（FPKM），其中FPKM是指轉錄物的每千鹼基的片段/百萬個映射讀數。基於RNA定序數據，在這些模型中，Noxa的表達含量在1.0354至7.5223（由Log2（FPKM）表示）的範圍內。通過線性回歸分析T/C值和相應的RNA表達，並且將R平方計算為0.8661，這表明T/C的86.61%的變化可以用Noxa的RNA表達來解釋（p ＜ 0.0001）。
從一組獨立的實驗中，雖然採用了食道癌PDX模型（n = 4），但觀察到T/C與Noxa的表達之間的相似相關性（圖 2A 和2B ）。R2 值被記錄為0.7732（其中P ＜ 0.05）。
還分別測試了T/C與Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1、BIM和PUMA的RNA表達的相關性，並且R平方分別顯示在圖3中：0.2574（Bcl-2，圖 3E ）；0.0207（Bcl-xL，圖 3C ）；0.1737（Mcl-1，圖 3D ）；0.3382（BIM，圖 3B ）和0.0517（PUMA，圖 3A ） 。
總之，Noxa的RNA表達含量與Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑化合物A15治療的胃癌和食道癌PDX模型中腫瘤消退的程度高度相關。這種相關性遠高於任何其他所測試的生物標記：BIM、Mcl-2、Bcl-2、PUMA和Bcl-xL。
實例2
該研究示出化合物B4在作為Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑發揮作用方面，對Bcl-xL的依賴性比對Bcl-2的依賴性更大。
ABT-737（IUPAC名稱：4-{4-[(4’-氯-2-聯苯基)甲基]-1-呱嗪基}-N-[(4-{[(2R)-4-(二甲基胺基)-1-(苯基硫烷基)-2-丁基]胺基}-3-硝基苯基)磺醯基]苯甲醯胺）是由亞培公司（Abbott Laboratories）（現為艾伯維公司（Abbvie））開發的最早的BH3模擬物之一。它充當雙重BCl-2/Bcl-xL抑制劑，並促進腫瘤細胞凋亡。該研究比較了Bcl-2和BCl-xL在化合物B4或ABT-737之間的結合。
選擇瀰漫性大B細胞淋巴瘤系Toledo和急性淋巴細胞性白血病系RS4;11進行該研究。將細胞用指定濃度（分別為0.025 uM、0.04 uM和0.06 uM）的化合物B4或ABT-737治療24小時，並收穫以進行複雜分析。使用MSD高級ELISA方法分析Bcl-2 : BIM和Bcl-xL : BIM複合物兩者。
結果顯示，在Toledo（圖4A）和RS4;11（圖4B）細胞系中，相比Bcl-2 : BIM複合物，化合物B4更有效地破壞Bcl-xL : BIM。特別地，相比ABT-737，化合物B4更強烈地破壞Bcl-xL : BIM複合物。
這些細胞系結果與使用化合物A15的相關胃癌/食道癌PDX試驗一致（數據未顯示），這證實化合物A15（在PDX中）和化合物B4（在細胞系中）兩者相比Bcl-2複合物更能靶向Bcl-xL，並且是與參考化合物ABT-737不同的。
實例 3.
該研究顯示化合物A15在ASCL-1-高和Noxa-高SCLC PDX模型中的抗腫瘤活性。
SCLC是具有極高突變率，但缺乏用於分子靶向療法的經鑒定的驅動癌基因的異質性疾病。當前在診所中將其作為單個疾病實體來治療。最近的研究提高了我們對SCLC的理解，並且基於ASCL1、NEUROD1、POU2F3或YAP1的互斥表達表徵了不同的亞型（Rudin等人，2019）。表達ASCL1的SCLC是最常見的亞型，占病例的70%。
從58個可商購的SCLC的PDX模型（可從中美冠科生物公司（Crownbio）獲得PDX模型）中獲得Noxa表達含量。這58個PDX模型的Noxa表達含量已經通過RNA定序進行了確定，並且將其繪製在圖5A中，其中每個點代表一個PDX模型。基於RNA定序數據，在這些模型中，Noxa的表達含量在低於2至高於6（由Log2（FPKM）表示）的範圍內。在圖5A中，PMAIP1（編碼的蛋白Noxa）的平均含量在圖上顯示為帶有誤差條的直線。
針對化合物A15的抗腫瘤活性，測試了這58個PDX模型中的13個模型。將化合物A15單一療法按50 mg/kg每週兩次靜脈內給予，並且腫瘤抑制率60%被設置為腫瘤消退的截止值。
結果表明，化合物A15在總共測試的13個模型中的3個模型中實現了腫瘤消退（圖5A，表示為空心圓），但在其他10個測試模型中沒有實現。出乎意料地，這三個反應性模型全部具有高於平均值的Noxa表達（例如，圖5A中，log2 FPKM高於6），並且還具有ASCL1表達。相比之下，儘管分別表達NEUROD1、POU2F3或YAP1，其他10個非反應性模型（圖5A，表示為半實心圓）不顯示ASCL1表達，或顯示ASCL1表達但具有低於平均值的Noxa表達。本研究中未測試化合物A15的抗腫瘤活性的45個模型被表示為灰點。
結果表明，具有高Noxa表達的ASCL1亞型的SCLC對化合物A15單一療法具有高度敏感性。
使用線性回歸進行的進一步統計表明，在所有測試模型（n = 13）中，化合物A15的抗腫瘤活性與Noxa表達之間的決定係數（R2）為0.138（圖5B）。當考慮ASCL-1表達（測試模型5/13）時，化合物A15的抗腫瘤活性與Noxa表達之間的決定係數（R2）可以增加至0.5067（圖5C）。我們的結果表明，使用ASCL1和Noxa作為共同生物標記將選出最有可能對化合物A15的治療產生反應的SCLC患者。
實例 4
該研究的目的是評估在胃癌PDX模型中MDM2抑制劑化合物C的抗腫瘤活性和Noxa含量。
實驗方法和程序與實例1中描述的類似。向小鼠施用媒介物或化合物C。
在該功效試驗中，採用胃癌PDX模型，並將其用100 mg/kg化合物C口服治療14天（總共7個劑量）或用10-50 mg/kg化合物C口服治療QOD。通過RNA定序來確定Noxa的表達含量。預期在化合物C治療的胃PDX模型中，相對於參考含量的Noxa的高表達含量與腫瘤消退程度相關。
儘管已經參考特定的實施例（其中的一些是較佳的實施例）具體示出並描述了本揭露，但是本領域通常知識者應當理解，在不脫離如本文揭露的本揭露的精神和範圍的情況下，可以在形式和細節上進行各種改變。
無
以下圖式構成本說明書的一部分，並且被包括在內以進一步說明本揭露的某些方面。通過參考這些圖式中的一個或多個圖式，結合本文中呈現的具體實施例的詳細描述，可以更好地理解本揭露。
圖 1A 和 1B 說明在用Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑化合物A15處理的胃癌PDX（患者來源的異種移植物）模型中，Noxa表達含量與腫瘤消退相關聯。
圖 2A 和2B 說明在用Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑化合物A15處理的食道癌PDX（患者來源的異種移植物）模型中，Noxa表達含量與腫瘤消退相關聯。
圖 3A 至 3E 說明在胃癌PDX模型中另外的生物標記（包括PUMA（圖3A）、BIM（圖3B）、Bcl-xL（圖3C）和Mcl-1（圖3D）、Bcl-2（圖3E））與腫瘤消退的關聯性。
圖 4A 和 4B 說明在Toledo細胞系（圖 4A ）和在RS4;11細胞系（圖 4B ）中，化合物B4和參考化合物ABT-737在降低Bcl-xL: BIM或Bcl2: BIM的蛋白質複合物的含量方面的比較。
圖 5A 、 5B 和 5C 說明在ASCL-1-高和Noxa-高小細胞肺癌（SCLC）PDX中化合物A15的抗腫瘤活性（圖 5A ），在所有SCLC PDX模型中化合物A15的抗腫瘤活性與Noxa表達之間的關聯性（圖 5B ），以及在ASCL-1-高SCLC PDX中化合物A15的抗腫瘤活性與Noxa表達之間的關聯性（和圖 5C ）。
圖 6 顯示如本文提供的生物標記的示例性序列。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
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Figure 12_A0101_SEQ_0021

Claims (51)

  1. 一種用於在有需要的受試者中治療癌症的方法，該方法包括： a)   在來源於該受試者的測試樣品中測量至少一種包含Noxa的生物標記的含量； b)   將該至少一種生物標記的含量與該至少一種生物標記的對應的參考含量進行比較，以確定與參考含量的差異；以及 c)   當該差異達到預定的閾值時，向該受試者施用有效量的MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-xL抑制劑或Bcl-2抑制劑。
  2. 一種用於鑒定患有癌症的受試者可能對用MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-xL抑制劑或Bcl-2抑制劑的治療產生反應的方法，該方法包括： a)   在來源於該受試者的測試樣品中測量至少一種包含Noxa的生物標記的含量； b)   將該至少一種生物標記的含量與該至少一種生物標記的對應的參考含量進行比較，以確定與參考含量的差異；以及 c)   當該差異達到預定的閾值時，鑒定該受試者可能對用MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-xL抑制劑或Bcl-2抑制劑的治療產生反應。
  3. 如請求項2所述的方法，其中該方法進一步包括： d)   向被鑒定為可能對用MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-xL抑制劑或Bcl-2抑制劑的治療產生反應的受試者施用有效量的MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-xL抑制劑或Bcl-2抑制劑。
  4. 一種用於在受試者中監測治療功效的方法，該受試者患有癌症並在治療期內已經用MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-xL抑制劑或Bcl-2抑制劑進行了治療，該方法包括： a)   治療期後從該受試者獲得測試樣品； b)   在該測試樣品中測量至少一種包含Noxa的生物標記的含量，以獲得該至少一種生物標記的治療後含量； c)   將該治療後含量與來源於該受試者的治療期之前的測試樣品中的該至少一種生物標記的基線含量進行比較，以確定該至少一種生物標記的含量的治療後變化；以及 d)   當該治療後變化達到預定的閾值時，向該受試者繼續施用MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-xL抑制劑或Bcl-2抑制劑，或 當該治療後變化未達到預定的閾值時，增加對該受試者的MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-xL抑制劑或Bcl-2抑制劑的劑量，向該受試者施用有效量的與MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-xL抑制劑或Bcl-2抑制劑組合的第二抗癌治療劑，或向該受試者停止施用MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-xL抑制劑或Bcl-2抑制劑。
  5. 如請求項1-4中任一項所述的方法，其中該癌症是實體瘤或血液學癌症。
  6. 如請求項5所述的方法，其中該實體瘤選自腎上腺皮質癌、肛門癌、星形細胞瘤、兒童小腦或大腦癌、基底細胞癌、膽道癌、膀胱癌或泌尿膀胱癌、骨腫瘤、腦癌、小腦星形細胞瘤、大腦星形細胞瘤/惡性膠質瘤、室管膜瘤、髓母細胞瘤、幕上原始神經外胚層瘤、視覺通路和下丘腦膠質瘤、乳腺癌、伯基特淋巴瘤、子宮頸癌、結腸癌、肺氣腫、子宮內膜癌、食道癌、尤因氏肉瘤、視網膜母細胞瘤、胃/胃部癌、膠質瘤、頭頸癌、心臟癌症、霍奇金淋巴瘤、胰島細胞癌、內分泌胰腺癌卡波西肉瘤、腎癌、腎細胞癌、喉癌、肝癌、肝細胞癌、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺鱗狀細胞癌、神經母細胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、胃腸道癌、咽癌、前列腺癌、直腸癌、視網膜母細胞瘤、尤因腫瘤家族、皮膚癌、睾丸癌、咽喉癌、甲狀腺癌、膽管癌、陰道癌和小細胞癌、小細胞肺癌、肺外小細胞癌、前列腺小細胞癌、膀胱小細胞癌、黑色素瘤、皮膚鱗狀細胞癌、膠質母細胞瘤、子宮腫瘤、骨肉瘤、子宮癌、子宮CS、結腸直腸癌、肉瘤、嫌色細胞癌、透明細胞RCC、乳突狀RCC、葡萄膜黑色素瘤、睾丸生殖細胞瘤、低分級膠質瘤（LGG）、間皮瘤、PCPG、或胸腺瘤。
  7. 如請求項5所述的方法，其中該血液學癌症選自慢性淋巴細胞性白血病（CLL）、急性髓性白血病（AML）、T細胞幼淋巴細胞白血病、多發性骨髓瘤（MM）、華氏巨球蛋白血症（WM）、急性淋巴母細胞性白血病（ALL）和淋巴瘤、被套細胞淋巴瘤、瀰漫性大B細胞淋巴瘤。
  8. 一種用於在有需要的受試者中治療癌症的方法，該方法包括： a)   在來源於該受試者的測試樣品中測量至少一種包含ASCL1的生物標記的含量； b)   將該至少一種生物標記的含量與該至少一種生物標記的對應的參考含量進行比較，以確定與參考含量的差異；以及 c)   當該差異達到預定的閾值時，向該受試者施用有效量的MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-xL抑制劑或Bcl-2抑制劑。
  9. 一種用於鑒定患有癌症的受試者可能對用MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-xL抑制劑或Bcl-2抑制劑的治療產生反應的方法，該方法包括： a)   在來源於該受試者的測試樣品中測量至少一種包含ASCL1的生物標記的含量； b)   將該至少一種生物標記的含量與該至少一種生物標記的對應的參考含量進行比較，以確定與參考含量的差異；以及 c)   當該差異達到預定的閾值時，鑒定該受試者可能對用MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-xL抑制劑或Bcl-2抑制劑的治療產生反應。
  10. 如請求項9所述的方法，其中該方法進一步包括： d)   向被鑒定為可能對用MDM2抑制劑、Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-xL抑制劑或Bcl-2抑制劑的治療產生反應的受試者施用有效量的MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-xL抑制劑或Bcl-2抑制劑。
  11. 如請求項8-10中任一項所述的方法，其中該癌症是神經內分泌癌。
  12. 如請求項11所述的方法，其中該癌症選自肺大細胞神經內分泌癌（LCNEC）、甲狀腺瘤、中腸癌、膽囊癌、卵巢癌、子宮頸癌、嗜鉻細胞瘤、梅克爾細胞瘤、胃癌、食道癌、胰腺癌、胃腸道癌、乳腺癌、肝癌、頭頸癌、膽管癌和小細胞癌、小細胞肺癌、肺外小細胞癌、前列腺小細胞癌、或膀胱小細胞癌。
  13. 如請求項1-4和7-9中任一項所述的方法，其中該至少一種生物標記包含Noxa和ASCL1兩者。
  14. 如請求項13所述的方法，其中該癌症是神經內分泌癌。
  15. 如前述請求項中任一項所述的方法，其中通過mRNA含量、蛋白質含量或DNA含量測量該至少一種生物標記的含量。
  16. 如請求項15所述的方法，其中通過擴增測定、雜交測定、定序測定或免疫測定來測量該至少一種生物標記的含量。
  17. 如請求項16所述的方法，其中該擴增測定是基於聚合酶鏈式反應（PCR）的方法。
  18. 如前述請求項中任一項所述的方法，其中該預定的閾值通過統計學方法設置，或使用分類演算法確定。
  19. 如請求項18所述的方法，其中當測試樣品中Noxa含量比Noxa的相應的參考含量高至少15%、至少25%、至少35%、至少45%、或至少50%時，達到Noxa的預定的閾值。
  20. 如請求項19所述的方法，其中該Noxa的參考含量代表患有癌症的受試者的一般群體中Noxa的平均含量。
  21. 如請求項19所述的方法，其中在對照樣品中測量Noxa的參考含量。
  22. 如請求項18所述的方法，其中當測試樣品中ASCL1含量比ASCL1的相應的參考含量高至少15%、至少25%、至少50%、至少100%、或至少150%時，達到ASCL1的預定的閾值。
  23. 如請求項22所述的方法，其中該ASCL1的參考含量代表患有癌症的受試者的一般群體中ASCL1的平均含量。
  24. 如請求項22所述的方法，其中在對照樣品中測量ASCL1的參考含量。
  25. 如請求項21或24所述的方法，其中該對照樣品是具有如下ASCL1含量的樣品，該ASCL1含量代表一般癌症群體中ASCL1的平均含量；或是具有如下Noxa含量的樣品，該Noxa含量代表一般癌症群體中Noxa的平均含量。
  26. 如前述請求項中任一項所述的方法，其中該樣品是體液樣品或組織樣品。
  27. 如請求項4所述的方法，其中在治療期後樣品中Noxa含量的升高或維持表明對用MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-xL抑制劑或Bcl-2抑制劑治療產生持續反應性的可能性。
  28. 如請求項4所述的方法，其中樣品中Noxa含量的降低表明對用MDM2抑制劑或Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-xL抑制劑或Bcl-2抑制劑的治療產生降低的反應性的可能性。
  29. 如前述請求項中任一項所述的方法，其中該至少一種生物標記進一步包含選自下組的一種或多種另外的生物標記，該組由以下組成：Bcl-xL、Bcl-2、PUMA、Mcl-1、包含Bcl-xL的蛋白質複合物、包含Bcl-2的蛋白質複合物及其任何組合。
  30. 如前述請求項中任一項所述的方法，其中該Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-xL抑制劑或Bcl-2抑制劑是具有式 (I)、(II)、(III)、(IV) 或 (V) 的結構的化合物：
    Figure 03_image001
    、
    Figure 03_image003
    、
    Figure 03_image005
    、 (IV)
    Figure 03_image013
    、或 (V)
    Figure 03_image015
    ， 或 (I)、(II)、(III)、(IV) 或 (V) 的藥學上可接受的鹽， 其中A環是
    Figure 03_image007
    或
    Figure 03_image009
    ； 取代的或未取代的X選自下組，該組由以下組成：亞烷基、亞烯基、環亞烷基、環亞烯基和雜環亞烷基； Y選自下組，該組由以下組成：(CH2 )n -N(Ra )2 和
    Figure 03_image011
    ； Q選自下組，該組由以下組成：O、O(CH2 )1-3 、NRc 、NRc (C1-3 亞烷基)、OC(=O)(C1-3 亞烷基)、C(=O)O、C(=O)O(C1-3 亞烷基)、NHC(=O)(C1-3 亞烷基)、C(=O)NH和C(=O)NH(C1-3 亞烷基)； Z是O或NRc ； R1 和R2 獨立地選自下組，該組由以下組成：H、CN、NO2 、鹵代、烷基、環烷基、烯基、環烯基、炔基、芳基、雜芳基、雜環烷基、OR'、SR'、NR'R''、COR'、CO2 R'、OCOR'、CONR'R''、CONR'SO2 R''、NR'COR''、NR'CONR''R'''、NR'C=SNR''R'''、NR'SO2 R''、SO2 R'和SO2 NR'R''； R3 選自下組，該組由以下組成：H、烷基、環烷基、烯基、環烯基、炔基、芳基、雜芳基、雜環烷基、OR'、NR'R''、OCOR'、CO2 R'、COR'、CONR'R''、CONR'SO2 R''、C1-3 亞烷基CH(OH)CH2 OH、SO2 R'和SO2 NR'R''； R'、R''和R'''獨立地是H、烷基、環烷基、烯基、環烯基、炔基、芳基、雜芳基、C1-3 亞烷基雜環烷基、或雜環烷基； R'和R''、或R''和R'''可以與它們所鍵合的原子一起形成3至7元環； R4 是氫、鹵代、C1-3 烷基、CF3 或CN； R5 是氫、鹵代、C1-3 烷基、取代的C1-3 烷基、羥基烷基、烷氧基或取代的烷氧基； R6 選自下組，該組由以下組成：H、CN、NO2 、鹵代、烷基、環烷基、烯基、環烯基、炔基、芳基、雜芳基、雜環烷基、OR'、SR'、NR'R''、CO2 R'、OCOR'、CONR'R''、CONR'SO2 R''、NR'COR''、NR'CONR''R'''、NR'C=SNR''R'''、NR'SO2 R''、SO2 R'和SO2 NR'R''； 取代的或未取代的R7 選自下組，該組由以下組成：氫、烷基、烯基、(CH2 )0-3 環烷基、(CH2 )0-3環烯基 、(CH2 )0-3 雜環烷基、(CH2 )0-3 芳基和(CH2 )0-3 雜芳基； R8 選自下組，該組由以下組成：氫、鹵代、NO2 、CN、CF3 SO2 和CF3 ； Ra 選自下組，該組由以下組成：氫、烷基、雜烷基、烯基、羥基烷基、烷氧基、取代的烷氧基、環烷基、環烯基和雜環烷基； Rb 是氫或烷基； Rc 選自下組，該組由以下組成：氫、烷基、取代的烷基、羥基烷基、烷氧基和取代的烷氧基； n、r和s獨立地是1、2、3、4、5或6； R21 是SO2 R2 ’； R22 是烷基，較佳為C1 -C4 烷基，更佳為甲基、丙基或異丙基；為 R23 是烷基，較佳為C1 -C4 烷基，更佳為甲基、丙基或異丙基； R24 是鹵素，較佳為氟、氯； R25 是鹵素，較佳為氟、氯； R26 選自H、鹵素、烷基，較佳為氟、氯、C1 -C4 烷基，更佳為甲基、丙基、異丙基； R21b 是H或烷基，較佳為C1 -C4 烷基，更佳為甲基、丙基或異丙基； n2 、r2 和s2 獨立地是1、2、3、4、5或6，更佳地r2 和s2 都是2，並且n2 是3、4或5，更佳地，n2 、r2 和s2 都是2； R2 '是烷基，較佳為C1 -C4 烷基，更佳為甲基、丙基或異丙基； A3 選自下組，該組由以下組成：
    Figure 03_image017
    、
    Figure 03_image019
    、
    Figure 03_image021
    、
    Figure 03_image023
    、
    Figure 03_image025
    、
    Figure 03_image027
    、
    Figure 03_image029
    、
    Figure 03_image031
    、
    Figure 03_image033
    、以及
    Figure 03_image035
    ； E3 是碳原子，並且
    Figure 03_image037
    是雙鍵；或 E3 是-C(H)-，並且
    Figure 03_image037
    是單鍵；或 E3 是氮原子，並且
    Figure 03_image037
    是單鍵； X31 、X32 和X33 各自獨立地選自下組，該組由以下組成：-CR38 =和-N=； R31a 和R31b 與它們所附接的碳原子一起形成3元、4元或5元任選取代的環烷基；或 R31a 和R31b 與它們所附接的碳原子一起形成4元或5元任選取代的雜環； R32 選自下組，該組由以下組成：-NO2 、-SO2 CH3 和-SO2 CF3 ； R32a 選自下組，該組由以下組成：氫和鹵素； R33 選自下組，該組由以下組成：氫、-CN、-C≡CH和-N(R34a )(R34b )； R34a 選自下組，該組由以下組成：任選取代的C1-6 烷基、任選取代的C3-6 環烷基、雜環、雜烷基、(環烷基)烷基和(雜環)烷基； R34b 選自下組，該組由以下組成：氫和C1-4 烷基； R35 選自下組，該組由以下組成：任選取代的C1-6 烷基、雜環、雜烷基、(環烷基)烷基和(雜環)烷基； R36a 、R36c 、R36e 、R36f 和R36g 各自獨立地選自下組，該組由以下組成：氫、任選取代的C1-6 烷基、任選取代的C3-6 環烷基、任選取代的芳基、任選取代的雜芳基、雜環、雜烷基、(環烷基)烷基和(雜環)烷基； R36b 和R36d 各自獨立地選自下組，該組由以下組成：氫、C1-4 烷基和鹵素； R37 選自下組，該組由以下組成：任選取代的C1-6 烷基、雜環、雜烷基、(環烷基)烷基和(雜環)烷基；並且 R38 選自下組，該組由以下組成：氫和鹵素。
  31. 如請求項30所述的方法，其中該Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-xL抑制劑或Bcl-2抑制劑是選自表1-A、表1-B和表1-C的化合物或其藥學上可接受的鹽。
  32. 如請求項31所述的方法，其中該Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑是具有以下結構的(R )-2-(1-(3-(4-(N-(4-(4-(3-(2-(4-氯苯基)-1-異丙基-5-甲基-4-(甲基磺醯基)-1H-吡咯-3-基)-5-氟苯基)呱嗪-1-基)苯基)氨磺醯基)-2-(三氟甲基磺醯基)苯基胺基)-4-(苯硫基)丁基)呱啶-4-羰基氧基)乙基膦酸，或其藥學上可接受的鹽：
    Figure 03_image039
    ，或 具有以下結構的(R )-1-(3-(4-(N-(4-(4-(3-(2-(4-氯苯基)-1-異丙基-5-甲基-4-(甲基磺醯基)-1H-吡咯-3-基)-5-氟苯基)呱嗪-1-基)苯基)氨磺醯基)-2-(三氟甲基磺醯基)苯基胺基)-4-(苯硫基)丁基)呱啶-4-甲酸，或其藥學上可接受的鹽：
    Figure 03_image041
    。
  33. 如請求項31所述的方法，其中該Bcl-2/Bcl-xL雙重抑制劑或Bcl-xL抑制劑或Bcl-2抑制劑選自具有以下結構的化合物
    Figure 03_image377
    ， 或其藥學上可接受的鹽。
  34. 如請求項1-29中任一項所述的方法，其中該MDM2抑制劑包含具有以下式 (VI) 的化學結構： (VI)
    Figure 03_image379
    或其藥學上可接受的鹽，其中
    Figure 03_image047
    選自下組，該組由以下組成
    Figure 03_image382
    ； B是C4-7 碳環； R61 是H、取代的或未取代的C1-4 烷基、取代的或未取代的環烷基、取代的或未取代的雜環烷基、OR6a 、或NR6a R6b ； n3 是0、1或2； R62 、R63 、R64 、R65 、R67 、R68 、R69 和R70 獨立地選自下組，該組由以下組成：H、F、Cl、CH3 和CF3 ； R66 是
    Figure 03_image051
    或
    Figure 03_image053
    ； R6a 是氫或取代的或未取代的C1-4 烷基； R6b 是氫或取代的或未取代的C1-4 烷基； R6c 和R6d 是環B的一個碳原子上的取代基，其中 R6c 是H、C1-3 烷基、C1-3 亞烷基-OR6a 、OR6a 或鹵代； R6d 是H、C1-3 烷基、C1-3 亞烷基-OR6a 、OR6a 或鹵代；或 R6c 和R6d 與它們所附接的碳一起形成4元至6元螺取代基，任選地包含氧原子；並且 R6e 是-C(=O)OR6a 、-C(=O)NR6a R6b 或-C(=O)NHSO2 CH3 。
  35. 如請求項34所述的方法，其中
    Figure 03_image047
    是
    Figure 03_image387
    ； B是
    Figure 03_image389
    ；並且 R6c 和R6d 是F和F、H和H、OH和CH3 、OH和H、CH3 和CH3 、CH3 和OH、H和OH、CH2 CH3 和CH2 CH3 、或CH2 OH和CH2 OH。
  36. 如請求項34或35所述的方法，其中
    Figure 03_image391
    是H、CH3 或CH2 CH3 。
  37. 如請求項34-36中任一項所述的方法，其中R62 是H；R63 是鹵代；R64 和R65 是H。
  38. 如請求項34-37中任一項所述的方法，其中R67 是氟；R68 、R69 和R70 中的每個是H；並且R6e 是-C(=O)OH、-C(=O)NH2 或-C(=O)NHSO2 CH3 。
  39. 如請求項34所述的方法，其中該MDM2抑制劑是選自以下的化合物：
    Figure 03_image062
    、
    Figure 03_image064
    、
    Figure 03_image066
    、
    Figure 03_image068
    、
    Figure 03_image070
    、
    Figure 03_image072
    、
    Figure 03_image074
    、
    Figure 03_image076
    、
    Figure 03_image078
    、
    Figure 03_image080
    、
    Figure 03_image082
    、
    Figure 03_image084
    、
    Figure 03_image086
    、
    Figure 03_image088
    和
    Figure 03_image090
    ，或該化合物的藥學上可接受的鹽。
  40. 如請求項34所述的方法，其中該MDM2抑制劑是
    Figure 03_image092
    或
    Figure 03_image094
    或其藥學上可接受的鹽。
  41. 如請求項1-29中任一項所述的方法，其中該MDM2抑制劑是化合物C或其藥學上可接受的鹽。
  42. 一種用於在如請求項1-7和13-41中任一項所述的方法中使用的試劑盒，該試劑盒包含一種或多種用於測量至少一種包含Noxa的生物標記的含量的試劑。
  43. 如請求項42所述的試劑盒，其中該一種或多種用於測量Noxa含量的試劑包含可以與Noxa的多核苷酸雜交的引子或探針，或可以與Noxa的蛋白質特異性結合的抗體。
  44. 一種用於在如請求項8-26和29-41中任一項所述的方法中使用的試劑盒，該試劑盒包含一種或多種用於測量至少一種包含ASCL1的生物標記的含量的試劑。
  45. 如請求項44所述的試劑盒，其中該一種或多種用於測量ASCL1含量的試劑包含可以與ASCL1的多核苷酸雜交的引子或探針，或可以與ASCL1的蛋白質特異性結合的抗體。
  46. 一種用於在如請求項13-26和29-41中任一項所述的方法中使用的試劑盒，該試劑盒包含一種或多種用於測量至少一種包含Noxa和ASCL1的生物標記的含量的試劑。
  47. 如請求項46所述的試劑盒，其中該一種或多種試劑包含可以與Noxa的多核苷酸雜交的第一引子或第一探針，或可以與Noxa的蛋白質特異性結合的第一抗體，以及可以與ASCL1的多核苷酸雜交的第二引子或第二探針，或可以與ASCL1的蛋白質特異性結合的第二抗體。
  48. 如請求項42-47中任一項所述的試劑盒，其中該一種或多種試劑被可檢測地標記。
  49. 一種用於測量至少一種包含Noxa的生物標記的含量的一種或多種試劑在生產用於進行如請求項1-7和13-41中任一項所述的方法的試劑盒中的用途。
  50. 一種用於測量至少一種包含ASCL1的生物標記的含量的一種或多種試劑在生產用於進行如請求項8-26和29-41中任一項所述的方法的試劑盒中的用途。
  51. 一種用於測量至少一種包含Noxa和ASCL1的生物標記的含量的一種或多種試劑在生產用於進行如請求項13-26和29-41中任一項所述的方法的試劑盒中的用途。
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