JPH0618524A - 免疫反応の妨害反応抑制剤およびそれを用いた方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 抗ＣＡ１９−９モノクロ−ナル抗体（ｂ）と
体液中のＣＡ１９−９（ｃ）を反応させる工程を有する
免疫測定法において、免疫反応をＣＡ１９−９中のシア
ル酸残基またはフコ−ス残基を水素に置き換えた糖質な
どの妨害反応抑制剤（ａ）の存在下で行う。 【効果】 この方法により体液中の妨害抗体の影響を受
けない。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、抗ＣＡ１９−９モノク
ロ−ナル抗体と、体液中のＣＡ１９−９免疫反応の妨害
反応抑制剤及びこれを用いた免疫反応の方法に関するも
のである。

【０００２】

【従来の技術】抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体と、
体液中のＣＡ１９−９との免疫反応を利用した免疫測定
法は、測定手段の違いにより放射線免疫測定法、酵素免
疫測定法、蛍光免疫測定法などに類別される。これらの
方法において、抗ＣＡ１９−９モノクロ−ナル抗体と体
液中のＣＡ１９−９との免疫反応を妨害する反応を抑制
するための妨害反応抑制剤は知られていない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、体液中
にはルイスａ抗原などのＣＡ１９−９類似糖質に対する
抗体が含まれていることがあり、妨害反応抑制剤を用い
ない従来の免疫測定法では、これらの抗体の影響を受け
て抗ＣＡ１９−９モノクロ−ナル抗体とＣＡ１９−９の
反応が妨害され、測定試薬の添加回収試験で正確な添加
回収率が得られないなどの問題があった。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記問題
を解決すべく鋭意検討した結果、本発明に到達した。す
なわち本発明は、下記（ａ１）〜（ａ３）からなる群よ
り選ばれる糖質（ａ）１種以上からなることを特徴とす
る抗ＣＡ１９−９モノクロ−ナル抗体（ｂ）と体液中の
ＣＡ１９−９（ｃ）との免疫反応の妨害反応抑制剤； （ａ１）：ＣＡ１９−９中のシアル酸残基及び／又はフ
コ−ス残基を水素に置き換えた糖質、 （ａ２）：β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→３）−
［α−Ｌ−フコピラノシル−（１→４）］β−Ｄ−Ｎ−
アセチルグルコサミン類 及び （ａ３）：シアリル−（２→３）−β−Ｄ−ガラクトピ
ラノシル−（１→３）−β−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサ
ミン類 ；（ｂ）と体液中の（ｃ）とを上記の抑制剤の存在下で
免疫反応させる方法；並びに、（ｂ）と体液中の（ｃ）
を反応させる工程を有する免疫測定法において、該反応
を上記の抑制剤の存在下で行うことを特徴とする免疫測
定法である。

【０００５】本発明において、（ａ１）としては、ＣＡ
１９−９中のシアル酸をノイラミニダ−ゼを用いて加水
分解した糖質やフコ−スをα−Ｌ−フコシダ−ゼを用い
て加水分解した糖質などがあげられる［たとえば、マグ
ナニ・ジェイ、ニルソン・ビ−、ブロックハウス・エ
ム、エト−ル；ザ ジャ−ナル オブ バイオロジカル
ケミストリ−（Magnani J,Nilsson B,Brockhaus M,et a
l）;The Journal of Biological Chemistry, Vol.257 P
P.14365-14369(1982)］。なお、本発明において、糖質
とはオリゴ糖、多糖類、糖タンパク質、糖脂質を総称し
た用語として用いる。

【０００６】（ａ２）は、下記化１に示すオリゴ糖が結
合した糖質であり、たとえば、糖タンパク質ではルイス
ａ型ヒト血液型活性物質、糖脂質ではラクトＮ−フコペ
ンタオ−スIIセラミド、オリゴ糖ではラクトＮ−フコペ
ンタオ−スIIが各々あげられる。

【０００７】

【化１】

【０００８】（式中、GalはＤ−ガラクトピラノ−ス残
基、GluNAcはＤ−Ｎ−アセチルグルコサミン残基、Fuc
はＬ−フコピラノ−ス残基、Rは糖タンパク質、糖脂質
又はオリゴ糖を表す。）

【０００９】（ａ３）は、下記化２に示すオリゴ糖が結
合した糖質であり、たとえば、糖脂質ではシアリルラク
トＮ−テトラオ−スａセラミド、オリゴ糖ではシアリル
ラクトＮ−テトラオ−スａが各々あげられる。

【００１０】

【化２】

【００１１】（式中、Neu5Acはシアル酸残基、Rは糖タ
ンパク質、糖脂質又はオリゴ糖を表し、Gal、GluNAcは
化１中の略号と同様の残基を表す。）

【００１２】本発明において、抗ＣＡ１９−９モノクロ
−ナル抗体（ｂ）としては、例えば１９７９年にコプロ
スキ−らにより見出された抗ＣＡ１９−９モノクロ−ナ
ル抗体があげられる。このものは細胞融合法により作製
することができる［たとえば、ヒラリー・コプロスキ
ー、ゼノン・ステプルスキー、ケネット・ミッチェル、
ミーンハード・ヘリン；ソマチック セル ジェネッティ
ックス（Hilary Koprowski,Zenon Steplewski,Kenneth
Mitchell,Meenhard Helyn ;Somatic Cell Genetics）Vo
l.5,pp.957-972(1979)］。（ｂ）は下記化３に示すシア
リルラクトＮ−フコペンタオ−スIIと結合する性質を有
し［たとえば、マグナニ・ジェイ、ニルソン・ビ−、ブ
ロックハウス・エム、エト−ル；フェデ プロス（Magn
ani J,Nilsson B,Brockhaus M,et al; Fed Proc）, Vo
l.41,PP.898(1982)］、シアリルラクトＮ−フコペンタ
オ−スIIのシアル酸残基及び／又はフコ−ス残基を水素
で置換したものとは結合しない性質を示すものである
［たとえば、マグナニ・ジェイ、ニルソン・ビ−、ブロ
ックハウス・エム、エト−ル；ザ ジャ−ナル オブ
バイオロジカル ケミストリ−（Magnani J,Nilsson B,
Brockhaus M,et al;The Journal of Biological Chemis
try）, Vol.257 PP.14365-14369(1982)］。

【００１３】

【化３】

【００１４】（式中、Neu5Acはシアル酸残基、GalはＤ
−ガラクトピラノ−ス残基、GluNAcはＤ−Ｎ−アセチル
グルコサミン残基、FucはＬ−フコピラノ−ス残基、Glu
はＤ−グルコピラノ−ス残基を表す。）

【００１５】（ｂ）は、免疫測定法に用いる場合、後記
の適用可能な免疫測定法の測定手段の類別に応じて、不
溶性固体［たとえば、ケイ酸質無機担体（ガラス、シリ
カゲル、ベントナイトなど）、磁性体、有機担体（プラ
スチック、デキストラン、ロ紙、赤血球、ラテックス粒
子など）］又は標識物質［酵素（ペルオキシダーゼ、ア
ルカリフォスファターゼ、およびβーガラクトシダーゼ
など）、放射線同位元素（³Ｈ、¹²⁵Ｉなど）、蛍光物質
（フルオレセインイソチオシアネート、ローダミンな
ど）、化学発光物質（イソルミノール誘導体、N-メチル
アクリジウム誘導体など）など］などと結合したもので
もよい。

【００１６】本発明において、ＣＡ１９−９（ｃ）は、
オリゴ糖であるシアリルラクトＮ−フコペンタオ−スII
の状態のものだけでなく、糖タンパク質や糖脂質となっ
たものを含む。たとえば、文献［マグナニ・ジェイ、ニ
ルソン・ビ−、ブロックハウス・エム、エト−ル；ザ
ジャ−ナル オブ バイオロジカル ケミストリ−（Ma
gnani J,Nilsson B,Brockhaus M,et al;The Journal of
Biological Chemistry）,Vol.257 PP.14365-14369(198
2)］に記載されているＣＡ１９−９は、シアリルラクト
Ｎ−フコペンタオ−スIIとセラミドが結合した下記化４
に示す糖脂質である。

【００１７】

【化４】

【００１８】（式中、Cerはセラミド残基、Neu5Ac、Ga
l、GluNAc、Fuc、Gluは化３中の略号と同様の残基を表
す。）

【００１９】又、文献［マグナニ・ジェイ・エル、ステ
ップルスキ−・ゼット、コプロスキ−・エッチ、ギンス
バ−グ・ブイ；キャンサ− リサ−チ（Magnani J L,St
eplewski Z,Koprowski H,Ginsburg V；CANCER RESERC
H）, Vol.43,PP.5489-5492 (1983)］に記載されている
ＣＡ１９−９は、シアリルラクトＮ−フコペンタオ−ス
IIのグルコ−ス残基が糖タンパク質で置換した下記化５
に示す糖タンパク質である。

【００２０】

【化５】

【００２１】（式中、Rは糖タンパク質、Neu5Ac、Gal、
GluNAc、Fucは化３中の略号と同様の残基を表す。）

【００２２】本発明において、該体液とは血清、血漿、
血液、リンパ液、膵液、胆汁、胃液尿、唾液、脊髄液、
関節液、汗、乳汁、腸液、涙液、精液、糞便のことを言
い、免疫測定法の場合は、通常血清又は血漿が用いられ
る。

【００２３】本発明の方法において、（ｂ）と体液中の
（ｃ）を反応させる際［たとえば、酵素免疫測定法では
不溶性固体に結合した状態の（ｂ）と体液中の（ｃ）を
反応させる際又は標識物質と結合した状態の（ｂ）と体
液中の（ｃ）を反応させる際］、本発明の抑制剤を体液
１００μｌに対し通常１ｎｇ以上好ましくは１０ｎｇ〜
１００ｍｇの範囲で添加するとよい。

【００２４】本発明の免疫測定法の適用可能範囲を測定
手段の類別で示すと、従来知られている放射線免疫測定
法［たとえば、ビルラノ・ビ−・シ−・デ−、ベレナン
・エス、ブロック・ピ−、エト−ル；クリン ケム（Vi
llano B.C.D.,Brennan S.,Paul B.,et al;CLIN.CHE
M.）,Vol.29,PP.549-552(1983)］、酵素免疫測定法［た
とえば、大倉久直、坂脇多津；胆と膵、VoL.6、PP.1807
-1816(1985)］、蛍光免疫測定法、赤血球凝集法、ラテ
ックス凝集法、免疫比濁法のいずれにも適用できる。
（ｂ）と体液中の（ｃ）との免疫反応は、これらの免疫
測定法に応じた温度、時間で行うことができる。［たと
えば、（ｂ）と体液中の（ｃ）を緩衝液中でインキュベ
−ション（たとえば、５〜５０℃、５分〜２日）す
る。］

【００２５】

【実施例】以下、実施例および比較例により本発明を更
に説明するが、本発明はこれに限定されるものではな
い。 実施例１ ＣＡ１９−９中のシアル残基を水素で置換した糖質を含
有するＣＡ１９−９酵素免疫測定試薬の添加回収試験を
おこなった。 （１）ＣＡ１９−９酵素免疫測定試薬の製造 ａ）抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体の製造 抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体は、文献［ヒラリー
・コプロスキー、ゼノン・ステプルスキー、ケネット・
ミッチェル、ミーンハード・ヘリン；ソマチック セル
ジェネッティックス（Hilary Koprowski,Zenon Stepl
ewski,KennethMitchell,Meenhard Helyn ;Somatic Cell
Genetics）Vol.5,pp.957-972(1979)］に記載の方法に
準じ次の通り製造した。ＳＷ１１１６細胞（大日本製薬
社から入手可能）1x10⁶個をＢＡＬＢ／ｃマウスの静脈
内に投与し免疫した。１ヶ月後に再びＳＷ１１１６細胞
1x10⁶ 個を投与し３日後に脾臓を摘出して脾細胞を採
取した。ＲＰＭＩ１６４０培地にて洗浄した後、脾細胞
全量を2x10⁷個のマウスミエローマ細胞（Ｐ３−ＮＳ１
／１−Ａｇ４．１）と混ぜ、３７℃の４２．５％ポリエ
チレングリコール１５４０および７．５％ジメチルスル
フォキシドを含むＲＰＭＩ１６４０培地１ｍｌ中で１分
間融合させた。１分後にその細胞懸濁物をＲＰＭＩ１６
４０培地５ｍｌで徐々に希釈した。それらの細胞を遠心
分離し、洗浄した後、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、ア
ミノプテリン、チミジン、１０％牛胎児血清を含むＲＰ
ＭＩ１６４０培地）を２０ｍｌになるように加えて、９
６ウェル マイクロプレートに０．２ｍｌずつ分注して
２週間培養した後、増殖したウェル中の培養上清の抗体
活性を測定した。次に、活性の認められたウェルの細胞
を限界希釈法を使用して繰り返してクローン化し、Ｉｇ
Ｇクラスの抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体を産生す
る細胞を得た。この細胞を無血清培養液中で培養し、培
養上清液を採取した。この培養液中のモノクローナル抗
体をアフィ・ゲル・プロテインＡ ＭＡＰＳキット（バ
イオラッド社）を用いて精製単離し、以下の検討に用い
た。

【００２６】ｂ）抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体結
合ガラスビーズの作製 米国特許第652761号明細書の方法に従い、ガラスビーズ
の表面に抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体をコーティ
ングした。 ｃ）ペルオキシダーゼ標識抗ＣＡ１９−９モノクローナ
ル抗体の作製 抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体を文献［エス・ヨシ
タケ、エム・イマガワ、イー・イシカワ、エトール；ジ
ェイ．バイオケム(S.YOSHITAKE,M.IMAGAWA,E.ISHIKAWA,
et.al.;J.Biochem.),Vol.92(1982) 1413-1424］に記載
の方法にてペルオキシダーゼと結合し、ペルオキシダー
ゼ標識抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体を得た。この
試薬は通常１％牛血清アルブミン含有緩衝液で１０〜５
０００倍に希釈して使用した。 ｄ）ＣＡ１９−９標準溶液の調整 ＳＷ１１１６細胞を１０％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ１６
４０培地で培養し、培養上清液を採取した。培養上清液
中のＣＡ１９−９濃度をイムノクロンＣＡ１９−９（富
士レビオ社）を用いて測定し、濃度が３０、６０、１２
０、２４０Ｕ／ｍｌなるように１％牛血清アルブミン含
有緩衝液で希釈し標準溶液とした。

【００２７】（２）ＣＡ１９−９中のシアル酸残基を水
素に置換した糖質溶液の作製 ＣＡ１９−９濃度が５μｇ／ｍｌのＣＡ１９−９溶液１
０ｍｌにノイラミニダ−ゼ（生化学工業）を５ｕｎｉｔ
／ｍｌ添加し３７℃で６０分間反応させた。次に８０℃
で１５分間加熱した後、３０００ｒｐｍで遠心分離を行
い上清液を採取し糖質溶液１を得た。 （３）添加回収試験 ａ）添加試料 ２５μｌの妨害血清（抑制剤無添加で添加回収率が異常
になる血清）又は正常血清（抑制剤無添加でも添加回収
率が正常な血清）と２５μｌのＣＡ１９−９標準１２０
Ｕ／ｍｌを混合し添加試料とした。 ｂ）標準溶液または被検試料の測定と添加回収率の算出 ５０μｌの標準溶液または被検試料、１０μｌの糖質溶
液１および４００μｌの１％牛血清アルブミン含有０．
０２Ｍリン酸緩衝液を入れた試験管に抗ＣＡ１９−９モ
ノクローナル抗体結合ガラスビーズを１個入れインキュ
ベーション（３７℃、１５分間）したのち、生理食塩水
にてビーズを洗浄した。次に、ペルオキシダーゼ標識抗
ＣＡ１９−９モノクローナル抗体含有０．０２Ｍリン酸
緩衝液５００μｌ中にビーズを移し、インキュベーショ
ン（３７℃、１５分間）した。再度、生理食塩水にてビ
ーズを洗浄したのち、ビーズを基質溶液（過酸化水素含
有オルトーフェニレンジアミン溶液）５００μｌ中に移
し、インキュベーション （３７℃、１５分間）したの
ち、１．５規定硫酸水溶液３ｍｌを加えて反応を停止し
た。この液の４９２ｎｍの吸光度を測定し、ビーズに結
合した酵素の酵素活性を測定した。ＣＡ１９−９標準溶
液０、３０、６０、１２０、２４０Ｕ／ｍｌの吸光度か
ら検量線を得た。血清および添加試料を測定し検量線か
ら濃度を読み取り、下記の数式から理論値および添加回
収率を算出した。結果を表１に示す。 理論値（unit/ml）＝（血清測定値＋１２０）／２ 添加回収率（％）＝（添加血清測定値／理論値）x １０
０

【００２８】実施例２ ＣＡ１９−９中のフコ−ス残基を水素で置換した糖質を
含有するＣＡ１９−９酵素免疫測定試薬の添加回収試験
をおこなった。 （１）ＣＡ１９−９酵素免疫測定試薬の製造 実施例１（１）に準じた。 （２）ＣＡ１９−９中のシアル酸残基を水素に置換した
糖質溶液の作製 ＣＡ１９−９濃度が５μｇ／ｍｌのＣＡ１９−９溶液１
０ｍｌにα−Ｌ−フコシダ−ゼ（ベ−リンガ−マンハイ
ム社）を０．５ｕｎｉｔ／ｍｌ添加し、３７℃で６０分
間反応させた。次に８０℃で１５分間加熱した後、３０
００ｒｐｍで遠心分離を行い上清液を採取し糖質溶液２
を得た。 （３）添加回収試験 実施例１（３）の糖質溶液１を糖質溶液２に換え、実施
例１に準じて試験を行った。結果を表１に示す。

【００２９】実施例３ 本発明の抑制剤である（ａ２）を含有するＣＡ１９−９
酵素免疫測定試薬の添加回収試験をおこなった。 （１）ＣＡ１９−９酵素免疫測定試薬の製造 実施例１（１）に準じた。 （２）抑制剤（ａ２）を含有する糖質溶液の作製 ラクトＮ−フコペンタオ−スII結合人血清アルブミン
（バイオカ−ブ社）を１％牛血清アルブミン含有０．０
２Ｍリン酸緩衝液で５μｇ／ｍｌの濃度に溶解し糖質溶
液３を得た。 （３）添加回収試験 実施例１（３）の糖質溶液１を糖質溶液３に換え、実施
例１に準じて試験を行った。結果を表１に示す。

【００３０】実施例４ 本発明の抑制剤である（ａ３）を含有するＣＡ１９−９
酵素免疫測定試薬の添加回収試験をおこなった。 （１）ＣＡ１９−９酵素免疫測定試薬の製造 実施例１（１）に準じた。 （２）抑制剤（ａ３）含有糖質溶液の作製 シアリルラクトＮ−テトラオ−スａ結合人血清アルブミ
ン（バイオカ−ブ社）を１％牛血清アルブミン含有０．
０２Ｍリン酸緩衝液で５μｇ／ｍｌの濃度に溶解し糖質
溶液４を得た。 （３）添加回収試験 実施例１（３）の糖質溶液１を糖質溶液４に換え、実施
例１に準じて試験を行った。結果を表１に示す。

【００３１】比較例 糖質溶液を含有しないＣＡ１９−９酵素免疫測定試薬の
添加回収試験をおこなった。 （１）ＣＡ１９−９酵素免疫測定試薬の製造 実施例１（１）に準じた。 （２）添加回収試験 実施例１（３）の糖質溶液１溶液を１％牛血清アルブミ
ン含有０．０２Ｍリン酸緩衝液に換え、実施例１に準じ
て試験を行った。結果を表１に示す。

【００３２】

【表１】

【００３３】

【発明の効果】本発明の妨害反応抑制剤は、抗ＣＡ１９
−９モノクロ−ナル抗体とＣＡ１９−９の免疫反応を妨
害する体液中の抗体の影響を抑制する優れたものであ
る。すなわち、妨害反応抑制剤を用いない従来の免疫測
定法では、体液中に含まれるルイスａ抗原などのＣＡ１
９−９類似糖質に対する抗体の影響を受けて抗ＣＡ１９
−９モノクロ−ナル抗体とＣＡ１９−９の反応が妨害さ
れ、測定試薬の添加回収試験で正確な添加回収率が得ら
れないなどの問題があったが、本発明のＣＡ１９−９の
免疫測定法によれば、正確な添加回収率を得ることがで
きる。以上の点から、本発明は、すべてのＣＡ１９−９
の免疫測定法に応用でき、特に、高感度の測定法である
放射線免疫測定法、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法に
有用である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記（ａ１）〜（ａ３）からなる群より
   選ばれる糖質（ａ）１種以上からなることを特徴とする
   抗ＣＡ１９−９モノクロ−ナル抗体（ｂ）と体液中のＣ
   Ａ１９−９（ｃ）との免疫反応の妨害反応抑制剤。 （ａ１）：ＣＡ１９−９中のシアル酸残基及び／又はフ
   コ−ス残基を水素に置き換えた糖質、 （ａ２）：β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→３）−
   ［α−Ｌ−フコピラノシル−（１→４）］β−Ｄ−Ｎ−
   アセチルグルコサミン類 及び （ａ３）：シアリル−（２→３）−β−Ｄ−ガラクトピ
   ラノシル−（１→３）−β−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサ
   ミン類。
2. 【請求項２】 抗ＣＡ１９−９モノクロ−ナル抗体
   （ｂ）と体液中のＣＡ１９−９（ｃ）とを請求項１記載
   の抑制剤の存在下で免疫反応させる方法。
3. 【請求項３】 抗ＣＡ１９−９モノクロ−ナル抗体
   （ｂ）と体液中のＣＡ１９−９（ｃ）を反応させる工程
   を有する免疫測定法において、該反応を請求項１記載の
   抑制剤の存在下で行うことを特徴とする免疫測定法。