KR20100117588A - 스트렙토코커스 뉴모니애의 진단을 위한 분석법 - Google Patents

스트렙토코커스 뉴모니애의 진단을 위한 분석법 Download PDF

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Abstract

하나 이상의 연쇄상구균 항원을 이용하여 생물학적 샘플 중의 항-연쇄상구균 항체를 검출하는 분석법이 개시된다. 이 분석법에는 다양한 항원의 조합물이 사용될 수 있다. 예를 들어, Ply, PhtD, PhtE, LytB 및 PcpA 중 하나 이상이 사용될 수 있다. 또한, 추가 연쇄상구균 항원이 사용될 수도 있다. 이 분석법은 또한 연쇄상구균 핵산을 검출하는 분석법과 함께 사용될 수 있다.

Description

스트렙토코커스 뉴모니애의 진단을 위한 분석법{Assay for diagnosing Streptococcus pneumoniae}
관련 출원
본 출원은 2008년 2월 1일에 출원된 미국 특허출원 일련번호 61/063,376을 우선권으로 주장한다.
기술분야
본 출원은 세균 감염을 진단하는 시약 및 방법에 관한 것이다.
지역사회-획득 폐렴(community-acquired pneumonia: CAP)은 가장 일반적인 소아 감염 중 하나이고, 산업선진국의 질병률의 주요 원인이며, 5세 이하 아동들의 세계적인 사망율의 주요 원인이다(Mulholland K, Lancet 2007; 470(9583): 285-9); Pio A, BWHO; 2003; 81(4): 298-300). CAP는 다수의 인자들이 단독으로 또는 조합해서 유발할 수 있고, 그 예로는 호흡기 바이러스, 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae), 헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 클라미디아(Chlamydia) 및 마이코플라스마 뉴모니애(Mycoplasma pneumoniae)가 있다(Yin CC Respirology, 2003; 8(1):83-9; Chiang WC Respirology 2007; 12(2):254-61; Juven T PIDJ 2000; 19(4): 293-8). 병인 진단은 특히 혈액 배양물이 일반적으로 계속 음성이고, 기관지 분비물은 입수하기 어렵고, 빈번한 비인두 운반이 미생물 검출의 유용성을 제한하는 소아의 경우에 문제가 되고 있다. 그럼에도 불구하고 병원체 검출 분석법의 증가 수는 원인 인자의 동정 가능성을 증진시키고(Wang Pediatr Pulmonol 2008 feb 43(2)150-9; Nakayama E J Infect Chemother 2007, 13(5):305-13), 현대 진단 기구를 이용한 최근 연구들은 일차보건의료 및 병원내 환경 모두에서 CAP의 주요 원인으로 반복해서 동정했다(Juven T PIDJ 2000; 19(4): 293-8; Michelow IC; Pediatrics 2004; 113(4):701-7).
폐렴 감염에 대한 예방은 본질적으로 옵소닌포식작용(opsonophagocytosis)을 촉진하는 항체에 의해 매개된다. 이러한 항체는 폐렴 다당류(PPS) 또는 폐렴 표면 단백질(PSP)에 대항해 유발될 수 있다. 폐렴 면역화의 부재 시, 이러한 항체는 폐렴 노출, 집락화 및/또는 감염에 의해 유발된다. 이에 따라, 폐렴 항원에 대한 방어 항체의 부족은 폐렴 질환에 대한 유아 및 소아의 취약성에 근거를 두고 있다. 폐렴 감염의 혈청 진단에서는 우수한 특이성과 양성 예측치의 특정 PSP가 사용되고 있지만, 이러한 연구들은 종종 아동의 낮은 민감도로 인해 제한적이었다. 이것은 주로 혈청 분석을 방해하는 높은 집락 유병율이 원인이었다(Scott, et al. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2005).
폐렴구균 폐렴의 병인 진단은 특히 소아에 대해 과제로 남아 있다. 혈액 배양 또는 DNA 증폭을 기반으로 한 미생물 진단은 드물게 균혈증인 아동 중에서 특이성은 높지만 낮은 민감도를 나타낸다. 이에 반해, 높은 비인두 집락율은 비인두 또는 소변 샘플에서 세균 및/또는 이의 단편을 검출하는 분석법의 민감도를 제한한다(Dowell, S.F., Clin. Infect. Dis. 2000 32: 824-825). 폐렴구균 폐렴의 혈청 진단법은 확실한 방법론에 대한 탐색이 많은 어려움에 봉착해 있다(Kanclerski, J Clin Microbial 1988; Korppi M, Eur J Clin Microbial Infect Dis 2007).
지역사회-획득 폐렴(CAP)의 진단은 특히 소아의 경우 통상의 실험실 방법을 통한 방법을 과제로 하고 있다. 이 분야에는 특히 소아의 CAP를 정확하게 신속하게 진단하는데 유용한 시약과 방법이 필요한 실정이다. 이러한 필요는 무익한 항생제 투여를 피하기 위해 높은 민감도와 음성 예측치로 빠른 결과를 제공하는 분석법을 필요로 하는 개별 진단법, 및 질병 부하를 정확하게 추정하기에 적당한 민감도와 최적 증례의 정의를 위해 양성 예측치와 높은 특이성을 나타내는 분석법을 필요로 하는 역학조사에 관한 것이다. 이에 CAP를 정확하고 신속하게 진단하는 시약 및 방법에 대해 기술한다.
도 1. 입원 시의 항-PSP 혈청 IgG 항체.
도 2. 폐렴구균성 또는 비-폐렴구균성 CAP를 이용한 아동 중의 항-PhtD IgG 항체의 분포.
도 3. 폐렴구균성 또는 비-폐렴구균성 CAP를 이용한 아동 중의 항-PhtE IgG 항체의 분포.
도 4. 폐렴구균성 또는 비-폐렴구균성 CAP를 이용한 아동 중의 항-Ply IgG 항체의 분포.
도 5. 폐렴구균성 또는 비-폐렴구균성 CAP를 이용한 아동 중의 항-PcPA IgG 항체의 분포.
발명의 개요
이하, 생물학적 샘플에서 하나 이상의 연쇄상구균(streptococcal) 항원을 이용하여 항-연쇄상구균 항체를 검출하는 분석법을 기술한다. 이 분석법에는 다양한 항원이 단독으로 또는 항원 조합물이 사용될 수 있다. 예를 들어, 이 분석법은 PhtD, PhtE, LytB 및 PcpA 중 하나 이상과 Ply에 면역반응성인 항체; Ply, PhtE, LytB 및 PcpA 중 하나 이상과 PhtD에 면역반응성인 항체; Ply, PhtD, LytB 및 PcpA 중 하나 이상과 PhtE에 면역반응성인 항체; Ply, PhtD, PhtE 및 PcpA 중 하나 이상과 LytB에 면역반응성인 항체; 및/또는 Ply, PhtD, PhtE 및 LytB 중 하나 이상과 PcpA에 면역반응성인 항체를 검출하기 위해 수행할 수 있다. 또한, 여기에 기술된 분석법은 다른 연쇄상구균 항원을 서로 및/또는 Ply, PhtD, PhtE, LytB 및/또는 PcpA 중 하나 이상과 조합해서 사용할 수도 있다. 이러한 방식에 따르면, 이 분석법의 민감도가 증가하고 음성 예측치가 향상된다.
상세한 설명
본 발명에서 제공하는 지역사회-획득 폐렴(CAP)을 정확하고 신속하게 진단하는 시약과 방법에 대해 기술한다. 여기에 기술된 분석법은 단지 하나 또는 몇 가지 면역원성 폐렴구균 항원의 통상적인 사용으로 인한 아동 중의 폐렴구균 표면 단백질(PSP)계 면역분석법의 낮은 민감도를 극복한다. 환자의 혈청 또는 다른 생물학적 유체에 존재하는 세균 항원의 조합물에 대한 항체를 검출함으로써, CAP 진단이 이루어질 수 있다. 여기에 제시된 바와 같이, 과거 노출로 인해 유도된 체액 면역의 패턴 및 CAP로 입원한 소아의 급성 폐렴구균 감염을 평가하기 위해 면역학적 프로브로서 다수의 PSP를 이용했다. 한 양태에 따르면, 항원은 뉴모리신(pneumolysin)(Ply), PhtD, PhtE, LytB 및/또는 PcpA 중에서 선택할 수 있다. 이 5가지 폐렴구균 표면 단백질의 서열은 폐렴구균 균주 중에서 매우 보존적인 것이어서(>95-98%), 백신 후보뿐만 아니라 에스.뉴모니애에 대한 노출의 마커(marker)로 사용가능하다.
뉴모리신(Ply)은 폐렴구균 발병기전의 여러 단계, 예컨대 섬모 운동 저해 및 상피 세포 사이 치밀한 연접부의 붕괴 등에 관련된 세포용해-활성화 독소이다(Hirst et al. Clinical and Experimental Immunology(2004)). 몇 가지 뉴모리신이 알려져 있고 특히 진뱅크(GeneBank) 등록번호 Q04IN8, P0C2J9, Q7ZAK5 및 ABO21381 등은 본 명세서에 기술된 분석법을 실시하는데 적합할 것이다. 한 양태에서, Ply의 아미노산 서열은 서열번호 1에 제시한 바와 같다.
당해의 분석법을 수행하는데 적합한 PhtD 폴리펩타이드는 예컨대 무엇보다도 진뱅크 등록번호 AAK06760, YP816370 및 NP358501의 폴리펩타이드를 포함한다. 한 양태에서, PhtD의 아미노산 서열은 서열번호 2에 제시한 바와 같다.
당해의 분석법을 수행하는데 적합한 PhtE 폴리펩타이드는 예컨대 특히 진뱅크 등록번호 AAK06761, YP816371 및 NP358502의 폴리펩타이드를 포함한다. 한 양태에서, PhtE의 아미노산 서열은 서열번호 3에 제시한 바와 같다.
당해의 분석법을 수행하는데 적합한 LytB 폴리펩타이드는 예컨대 특히 진뱅크 등록번호 CAA09078, YP816335, ABJ55408, AAK19156, NP358461 및 AAK75086의 폴리펩타이드를 포함한다. 한 양태에서, LytB의 아미노산 서열은 서열번호 4, 5 또는 8에 제시한 바와 같다.
PcpA는 부착 역할이 추정되는 콜린-결합 단백질로서 1998년에 최초로 클로닝 및 특성 규명되었다(Sanchez-Beato A FEMS Microbiology Letters 164(1998) 207-214). 당해의 분석법을 수행하는데 적합한 PcpA 폴리펩타이드는 특히 진뱅크 등록번호 CAB04758, YP817353, AAK76194, NP359536, ZP01835022 및 ZP01833419의 폴리펩타이드를 포함한다. 한 양태에서, PcpA의 아미노산 서열은 서열번호 6 또는 7에 제시된 바와 같다.
이러한 항원들은 단독으로 또는 서로 조합해서 당해의 분석법에 사용될 수 있다. 단독 항원 또는 임의의 항원 조합물의 사용은 당해의 분석법에 사용하기에 적합할 수 있는데, 단 이 분석법이 바람직한 민감도 및 음성 예측치를 입증해야 한다. 특정 양태에 따르면, 조합 항원의 사용은 약 0.80, 0.85, 0.90, 0.91, 0.92, 0.93, 0.94, 0.95, 0.96, 0.97, 0.98, 0.99 또는 1.0의 민감도와 약 0.80, 0.85, 0.90, 0.91, 0.92, 0.93, 0.94, 0.95, 0.96, 0.97, 0.98, 0.99 또는 1.0의 음성 예측치를 초래할 수 있다. 일부 양태에 따르면, 이 값들은 유의적이다. 비교 실험을 수행할 수 있고, 유의성은 이용가능한 임의의 통계 분석 기구를 단독으로 또는 서로 조합해서 사용하여 측정했으며, 그 예로는 스튜던트 T 검정, 카이제곱 검정, 피셔 정확 검정법, 분산분석(ANOVA), 단변량 통계분석, 조정된 교차비(OR) 및 95% 신뢰구간(CI)을 계산하기 위한 로지스틱 회귀 분석이 있다. 또한, 교란요인(성별 등)으로 작용할 수 있는 임의의 통계적으로 유의한 인구학적 변수의 대조군도 이용할 수 있다. 수치 사이의 차이는 전형적으로 예컨대 p<0.05 또는 p<0.01일 때 유의적인 것으로 간주한다. 다른 통계적 분석 기구도 사용할 수 있다.
예를 들어, 상기 분석법들은 임의의 다른 항원에 반응성인 항체들에 대한 분석없이 Ply, PhtD, PhtE, LytB 또는 PcpA 중 하나에만 면역반응성인 항체를 검출하기 위해 수행될 수 있다. 대안적으로, 상기 분석법은 Ply, PhtD, PhtE, LytB 및/또는 PcpA 중 하나 이상에 면역반응성인 항체를 검출하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 분석법은 PhtD, PhtE, LytB 및 PcpA 중 하나 이상과 Ply에 면역반응성인 항체; Ply, PhtE, LytB 및 PcpA 중 하나 이상과 PhtD에 면역반응성인 항체; Ply, PhtD, LytB 및 PcpA 중 하나 이상과 PhtE에 면역반응성인 항체; Ply, PhtD, PhtE 및 PcpA 중 하나 이상과 LytB에 면역반응성인 항체; 및/또는 Ply, PhtD, PhtE 및 LytB 중 하나 이상과 PcpA에 면역반응성인 항체를 검출하기 위해 수행할 수 있다. 또한, 상기 분석법은 PcpA 및 Ply; PcpA 및 PhtD; PcpA 및 PhtE; PcpA 및 LytB; PcpA, Ply 및 PhtD; PcpA, Ply, PhtD 및 PhtE; Ply, PhtD, PhtE 및 LytB; PcpA, PhtD 및 PhtE; PcpA, PhtD, PhtE 및 LytB; PcpA, PhtE 및 LytB; PcpA, Ply, PhtE 및 LytB; PcpA, PhtD 및 LytB; PcpA, Ply 및 LytB; PcpA, Ply, PhtD 및 LytB; PcpA, Ply 및 PhtE; 및/또는 PcpA, PhtD 및 PhtE와 같은 항원 조합물에 면역반응성인 항체를 동정하기 위해 수행할 수 있다. 이러한 개시내용이 주어지면, 다른 조합물도 당업자에게 자명할 것이다. 또한, 당해의 분석법은 다른 연쇄상구균 항원을 서로 및/또는 Ply, PhtD, PhtE, LytB 및/또는 PcpA 중 하나 이상과 조합해서 사용할 수도 있다.
특정 양태에 따르면, 분리 및 정제된 PcpA 단백질 또는 이의 면역학적 반응성 단편은 피검체로부터 수득한 샘플에서 상기 분리 및 정제된 PcpA 항원(예컨대, 단백질 또는 이의 면역학적 반응성 단편)에 대한 항체의 결합을 검출하여 피검체의 스트렙토코커스 뉴모니애에 의한 과거 감염 또는 활동성 감염을 검출하는데 사용할 수 있다. 다른 양태에 따르면, 분리 및 정제된 PcpA 항원은 적어도 하나의 다른 항원(예, PhtD, PhtE, LytB 및/또는 Ply 단백질 또는 이의 면역학적 반응성 단편)과 함께 사용될 수 있다. 따라서, 피검체 유래의 생물학적 샘플에서 하나 이상의 PcpA, PhtD, PhtE, LytB 및/또는 Ply 항원에 대한 항체를 검출하는 단계를 포함하고, 상기 항원(들)에 결합하는 항체의 존재가 감염을 나타내는, 상기 피검체 중에 에스.뉴모니애에 의한 감염 또는 폐렴의 존재를 검출하고/하거나 진단하는 방법이 제공된다. 특정 양태에서, 이 방법은 피검체 유래의 생물학적 샘플을 에스. 뉴모니애의 분리 또는 정제된 PcpA, PhtD, PhtE, LytB 및/또는 Ply 항원과 항원-항체 복합체를 형성하기에 충분한 조건과 시간 동안 접촉시키는 단계 및 그 다음 항원-항체 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함한다. 항원-항체 복합체의 검출은 이 복합체에서 사람 면역글로불린을 검출하여 달성할 수 있다. 특정 양태에서, 항체의 검출은 항원-항체 복합체를 사람 면역글로불린과 면역학적 반응성인 "제2" 항체(예, 항-사람 면역글로불린 항체)와 이 제2 항체를 복합체 중의 사람 면역글로불린에 결합시키기에 충분한 조건과 시간 동안 접촉시킨 다음, 결합된 항-사람 면역글로불린을 검출하여 달성할 수 있다. 제2 항체는 검출가능 마커 또는 리포터 분자로 표지화된 것이 바람직하다.
또한, 치료요법적 화합물로 치료하기 위해 폐렴에 걸렸거나 또는 스트렙토코커스 뉴모니애에 감염된 피검체의 반응을 측정하는 방법도 제공한다. 이 방법은 치료 후에 피검체의 생물학적 샘플에서 PcpA 항원에 대한 항체를 검출하여, 검출된 항체의 양이 치료 전에 수득한 피검체의 생물학적 샘플 또는 정상이거나 건강한 피검체의 생물학적 샘플에서 검출할 수 있는 항체의 양과 비교했을 때 증가했거나, 변화가 없거나 또는 감소했는지를 분석하는 것을 수반한다. 한 양태에서, 치료 후에 항체의 무변화 또는 감소량은 피검체가 치료에 무반응임을 나타낼 수 있다. 다른 양태에서, 치료 후에 항체의 무변화 또는 감소량은 피검체가 치료에 반응성임을 나타낼 수 있다. 다른 양태에서, 치료 후에 항체의 증가량은 피검체가 치료에 무반응임을 나타낼 수 있다. 다른 양태에서, 치료 후에 항체의 증가량은 피검체가 치료에 반응성임을 나타낼 수 있다. 이에 따라, 치료 요법이 조정될 수 있다.
항원은 전체 길이의 폴리펩타이드로서 상기 분석법에 사용될 수 있다. 하지만, 항원은 관련 항원, 예컨대 생물학적 샘플에서 발견된 항체에 대해 반응성을 유지하는 단편, 변형체(예, 대립유전자, 스플라이스 변형체), 오르토로그(ortholog), 동족체 및 유도체(예, 펩타이드, 융합체)일 수 있다. 단편, 변형체 또는 유도체는 대상 서열과 비교했을 때 하나 이상의 서열 치환, 결실 및/또는 부가를 보유할 수 있다. 단편 또는 변형체는 자연발생 또는 인공 작제될 수 있다. 한 양태에서, 이러한 관련 항원은 대응하는 핵산 분자로부터 제조될 수 있다. 바람직한 양태에서, 관련 항원은 1 내지 3개, 1 내지 5개, 1 내지 10개, 1 내지 15개, 1 내지 20개, 1 내지 25개, 1 내지 30개, 1 내지 40개, 1 내지 50개 또는 50개 이상의 아미노산 치환, 삽입, 부가 및/또는 결실을 보유할 수 있다. 관련 항원은 일반적으로 이것이 유래되는 폴리펩타이드의 적어도 일부에 대응하는 서열을 가진 연속 인접 아미노산 잔기인 펩타이드를 포함할 수 있다. 바람직한 양태에서, 펩타이드는 약 5 내지 10개, 10 내지 15개, 15 내지 20개, 30 내지 20개 또는 30 내지 50개 아미노산을 포함할 수 있다.
치환은 보존적 또는 비보존적 치환 또는 이의 임의의 조합일 수 있다. 항원 서열에 대한 보존적 아미노산 변형(및/또는 암호화 뉴클레오타이드에 대한 상응하는 변형)은 기능적 및 화학적 특징이 모 항원과 유사한 관련 항원을 생산할 수 있다. 예를 들어, "보존적 아미노산 치환"은 천연 아미노산 잔기가 그 위치의 아미노산 잔기의 크기, 극성, 하전, 소수성 또는 친수성에 영향을 거의 또는 전혀 미치지 않고 특히 항원의 기능을 변경시키지 않는(예컨대 생물학적 샘플에서 항체와 면역원성 또는 반응성의 감소를 유발하지 않는), 비천연 잔기로 치환되는 것을 수반할 수 있다. 적당한 보존적 아미노산 치환의 예는 다음과 같다:
Figure pct00001
단편은 특정 영역 또는 도메인이 결실된 항원을 포함할 수 있다. 이러한 영역 또는 도메인의 존재가 당해의 분석법에서 단편의 사용을 방해하는 것이라면 그러한 영역 또는 도메인은 결실되는 것이 유익할 수 있다. 예를 들어, PcpA, Ply, PhtD, PhtE 또는 LytB를 사용할 때에는 콜린성 결합 영역이 결실될 수 있다. PcpA 단백질 단편의 한 예는 서열번호 7에 제시한 것이다.
다른 양태에서, 항원은 항원의 정제 및/또는 검출에 도움을 주는 하나 이상의 융합 폴리펩타이드 분절을 포함할 수 있다. 융합은 항원의 아미노 말단 또는 카르복시 말단에서 이루어질 수 있다. 융합은 링커(linker) 또는 어댑터(adapter) 분자 없이 직접 이루어지거나 링커 또는 어댑터 분자를 통해 이루어질 수 있다. 링커 또는 어댑터 분자는 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기, 일반적으로 약 20 내지 약 50개의 아미노산 잔기일 수 있다. 링커 또는 어댑터 분자에는 융합된 잔기의 분리를 허용하기 위해 DNA 제한효소 또는 프로테아제의 절단 부위가 설계될 수 있다. 융합된 잔기는 작제된 후 당업계에 공지된 바와 같이 또는 본 명세서에 기술된 방법에 따라 유도체화되거나 또는 다른 방식으로 조작될 수 있다. 적당한 융합 분절은 특히 금속 결합 도메인(예, 폴리히스티딘 분절), 면역글로불린 결합 도메인(예, 단백질 A, 단백질 G, T 세포, B 세포, Fc 수용체 또는 보체 단백질 항체-결합 도메인), 당 결합 도메인(예, 말토스 결합 도메인) 및/또는 "태그" 도메인(α-갈락토시다제, 스트렙 태그 펩타이드, T7 태그 펩타이드, FLAG 펩타이드의 적어도 일부 또는 모노클로날 항체와 같이 도메인에 결합하는 화합물을 이용하여 정제할 수 있는 다른 도메인)을 포함한다. 이러한 태그는 폴리펩타이드의 발현 후에 폴리펩타이드에 융합되는 것이 일반적이고, 숙주 세포로부터 당해 폴리펩타이드 서열의 친화도 정제를 위한 수단으로 작용할 수 있다. 친화도 정제는 친화도 매트릭스로서 태그에 대한 항체를 이용하는 컬럼 크로마토그래피 등에 의해 달성할 수 있다. 경우에 따라, 태그는 특정 펩타이드에 의한 절단 등과 같은 다양한 수단에 의해 당해 폴리펩타이드의 정제된 서열로부터 후속적으로 제거될 수 있다.
특정 양태에서, 항원은 검출될 수 있게 하는 방식으로 직접 또는 간접적으로(예컨대 항체를 이용하여) 표지화 또는 태그화될 수 있다. 항원은 항원 자체에 표지를 부착하여 직접 표지화할 수 있다. 항원은 이 항원에 결합하는 시약, 예컨대 항체 또는 다른 잔기에 표지를 부착하여 간접적으로 표지화할 수 있다. 적당한 표지에는, 예컨대 플루오레세인, 로다민, 피코에리트린, 유로퓸 및 텍사스 레드와 같은 플루오로크롬; 디아미노벤지딘, 방사선동위원소와 같은 발색원성 염료; 유색성, 자성 또는 반자성인 라텍스 비드와 같은 거대분자 콜로이드성 입자 또는 미립자 물질; 비오틴 및 디곡시제닌과 같은 결합제; 및 예컨대 FACS, ELISA, 웨스턴 블롯, TRFIA, 면역조직화학, 소실(evanescence), 루미넥스 비드 어레이, 딥스틱(dipstick) 또는 다른 측면 유동 분석 포맷 등에서 검출성 시그널이 육안 관찰, 전자적 검출 또는 여타 다른 방식으로 기록될 수 있도록 직접 또는 간접적으로 유발할 수 있는 생물학적 또는 화학적 활성제가 있다. 이러한 방법에 사용하기에 적당한 항체-결합 분자는 면역글로불린-결합 항체, 예컨대 항-사람 항체(예, Ig 이소타입 또는 서브클래스(예, IgG의 서브클래스)에 특이적이거나 또는 스타필로코커스 단백질 A 또는 G에 특이적인 항-사람 항체)를 포함할 수 있다.
바람직한 형광 태그 단백질은 녹색 형광 단백질(GFP)로 알려진 해파리 단백질 유래의 단백질을 포함한다. GFP 및 다른 형광단에 대한 추가 정보는 다음과 같은 간행물에 제공되어 있다: Tsien R Y, "The Green Fluorescent Protein" Annual Reviews of Biochemistry 1998; 67:509-544 Verkhusha, V and Lukyanov, K. "The Molecular Properties and Applications of Anthoza Fluorescent Proteins and Chromophores" Nature Biotechnology 2004; 22:289-296. 매우 다양한 형광 태그 단백질을 암호화하는 플라스미드 벡터는 클론테크 레보러토리즈, 인크.에서 시판하는 "Living Colours 8482; Fluorescent Proteins" 어레이를 비롯한 다양한 공급업체에서 구입할 수 있다. 또한, 이와 유사한 벡터도 인비트로겐 및 아머샴 바이오사이언시스를 비롯한 여타 공급업체에서 수득할 수 있다. GFP 유래의 적당한 형광 단백질은 적색-이동 변형체(red-shifted variant) EGFP, 청록색 이동 변형체 ECFP 및 황색 이동 변형체 EYFP이다. EGFP는 표적 항원의 항원성에 최소 영향을 미치며 밝은 형광을 제공하기 때문에 형광 마커로서 바람직하다. 대안적인 형광 마커 단백질도 구입할 수 있다. 생물학적 또는 화학적 활성제에는, 색을 발생 또는 변화시키거나 또는 전기적 성질 등에 변화를 유발하는 반응을 촉진하고, 또한 유용하게 사용될 수 있는 효소가 있다. 이것은 에너지 상태 사이의 전자 전이로 인해 특징적인 분광 흡수 또는 방출을 초래하도록 분자적으로 여기성일 수 있다. 또한, 바이오센서와 함께 사용되는 화학적 물질도 포함될 수 있다. 비오틴/아비딘 또는 비오틴/스트렙타비딘 및 알칼리성 포스파타제 검출 시스템이 이용되어도 좋다. 또 다른 예로는 양고추냉이 퍼옥시다제 및 화학발광 시약이 있다. 일부 양태에서, 비-고정화된 항체-결합 분자 또는 폴리펩타이드는 이 비-고정화된 항체-결합 분자 또는 폴리펩타이드에 결합하는 항체를 이용하여 검출할 수 있다. 적당한 검출 항체는 형광으로 표지화될 수 있다. 일부 양태에서, 표지는 표적 항원을 직접 표지화하는데 사용되는 형광 마커(태그)로, 항원과 형광 마커는 융합 단백질을 형성할 수 있다.
표적 항원에 대한 항체가 생물학적 샘플에 존재한다면, 항원 또는 항체는 태그로 표지화될 수 있고, 형성된 항원-항체 복합체는 면역침전 등에 의해 검출될 수 있다. 태그와 결합된 형광은 그 다음 단백질의 침전 여부(정성적 측정) 또는 침전된 단백질 함량(정량적 측정)을 측정하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 형광-태그화된 항원의 용해성 추출물은 환자 혈청과 적당한 시간 기간 동안, 예컨대 4℃에서 밤새 항온처리하여(보통 혈청 10 내지 15㎕ 대 추출물 300 내지 500㎕ 또는 그 이하) 항체를 항원에 결합시킬 수 있다. 그 다음, 비특이적 결합을 차단하기 위해 소량의 IgG 소 태아 혈청(Sigma)과 예비항온처리된 단백질 A 또는 단백질 G 세파로스 비드는 태그화된 항원/항체 복합체를 함유하는 추출물/혈청 혼합물에 첨가한 뒤, 실온에서 1 내지 2시간 동안 저속 회전 혼합한다. 태그화된 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 비롯한, 혈청 내의 항체는 단백질 A/G 비드에 결합한다. 단백질 A/G 세파로스 비드는 그 다음 적당한 완충액(일반적으로 10mM Tris-HCl pH 7.4, 100mM NaCl/1mM EDTA/1% Triton X-100)으로 세척하여 결합되지 않은 모든 태그화된 항원을 제거한다. 이는 다수 회(예, 2, 3, 4 또는 5회)의 원심분리, 상청액의 제거 및 완충액에 재현탁을 통해 달성될 수 있다. 일부에 태그화된 항원이 부착되어 있는 비드는 그 다음 수집해서 형광 판독기, 예컨대 Spectra Max Gemini XS 플레이트 판독기(Molecular Devices, Inc.)에 놓는다. 그 다음, 샘플 중의 항체의 존재를 정량분석할 수 있다. GFP의 경우에, 검출은 472nm에서의 여기와 512nm에서의 방출을 이용해 달성할 수 있다. 형광 여기는 사용된 형광단/태그에 의존적이지만, 동시에 다른 여러 태그화된 단백질을 병용할 수도 있다. 예를 들어, Ply, PhtD, PhtE, LytB 및/또는 PcpA 중 하나 이상은 별도로 태그화되어 별도로 또는 동시에 분석될 수 있다. 이 방법의 민감도는 검출 장치에 따라 달라지고, 더욱 민감한 검출 장치를 이용하면 상당히 증강될 수 있다. 이 방법의 다양한 변법도 이용될 수 있다. 당업계에서 이용가능하고 당해의 분석법을 사용하는데 적합할 수 있는 다른 표지들도 있다.
연쇄상구균 항원과 면역반응성인 항체를 검출하기 위한 당해의 분석법은 또한 연쇄상구균 감염을 검출하는데 유용한 다른 분석법과 조합될 수 있다. 예를 들어, 이 분석법(즉, ELISA)은 생물학적 샘플에 존재하는 연쇄상구균의 핵산을 검출하기 위한 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 분석법과 조합될 수 있다. 대안적으로, ELISA 분석법은 면역침전 분석법과 조합될 수 있다. 또는, PCR계 분석법은 면역침전 분석법과 조합될 수 있다. 본 명세서에 기술된 다양한 분석법들의 조합은 검출 민감도를 더욱 증가시키고 데이터의 음성 예측치를 더욱 감소시키는 작용을 할 수 있다.
또한, 환자의 생물학적 샘플에서 항체 또는 핵산을 검출하여 환자의 연쇄상구균 감염의 존재를 검출하는 키트도 제공된다. 한 양태에서, 하나 이상의 폐렴구균 항원(즉, Ply, PhtD, PhtE, LytB 및/또는 PcpA)은 생물학적 샘플에서 항-연쇄상구균 항체를 검출 또는 진단하기 위한 키트의 일부를 구성할 수 있다. 항원은 외부 환경으로부터 내용물을 보호하는 바이알과 같은 적당한 용기에 구비될 수 있다. 즉, 샘플 중의 항-연쇄상구균 항체를 검출하기 위한 키트는 항원(즉, Ply, PhtD, PhtE, LytB 및/또는 PcpA)과 함께, 이 샘플 중의 하나 이상의 항체의 결합을 측정하는 하나 이상의 검출 시약을 포함할 수 있다. 이 키트는 (i) 에스. 뉴모니애의 하나 이상의 분리 및 정제된 PcpA, PhtD, PhtE, LytB 및/또는 PcpA 단백질 또는 이의 면역학적 반응성 단편; 및 (ii) 항원-항체 복합체의 형성을 검출하기 위한 수단을 포함하고, 경우에 따라 사용 지침서가 동봉된 것이 바람직하다.
항원(들)은 용액에서 유리 상태이거나 또는 고체 지지체, 예컨대 자성 비드, 튜브, 마이크로플레이트 웰 또는 칩 위에 고정화될 수 있다. 특정 양태에서, 분리 및 정제된 PcpA, PhtD, PhtE, LytB 및/또는 PcpA 단백질 또는 이의 면역학적 반응성 단편 또는 융합 단백질이나 단백질 응집체가 흡착되어 있는 고체 매트릭스가 제공된다. 일부 양태에서, 키트는 추가로 검출 시약으로서 항체-결합 분자를 포함할 수 있다. 항체-결합 분자는 포획(capture) 또는 검출 시약일 수 있고, 용액에 유리 상태이거나 자성 비드, 튜브, 마이크로플레이트 웰 또는 칩과 같은 고체 지지체 위에 고정될 수 있다. 항체-결합 분자 또는 폴리펩타이드는 검출성 표지, 예컨대 형광 또는 발색성 표지 또는 결합 잔기, 예컨대 비오틴으로 표지화될 수 있다. 적당한 표지에 대해서는 앞에 더 상세하게 설명되어 있다. 키트는 추가로 표지와 반응하는 발색성, 형광성 또는 화학발광성 기질과 같은 기질, 또는 표지에 결합하여 시그널을 생산하는 효소 접합체와 같은 분자 등의 검출 시약 및/또는 면역침전용 시약(즉, 단백질 A 또는 단백질 G 시약)을 포함할 수 있다. 검출 시약은 추가로 완충제 용액, 세척 용액 및 다른 유용한 시약을 포함할 수 있다. 키트는 또한 개체에서 수득한 샘플을 취급 및/또는 보관하기 위한 장치 및 개체로부터 샘플을 수득하기 위한 장치(즉, 바늘, 랜싯 및 수집 튜브 또는 용기) 중 하나 또는 둘 모두를 포함할 수 있다. 또한, 키트는 항원을, 예컨대 검사 샘플 중의 항-연쇄상구균 항체를 본 명세서에 기술된 바와 같이 검출하는 방법 등에 사용하기 위한 지침서를 포함할 수도 있다. 분석법이 PCR과 같은 다른 종류의 분석법과 조합되어야 하는 경우, 이러한 분석법에 필요한 시약(즉, 프라이머, 완충제 등)도, 경우에 따라 이의 사용 지침서와 함께 포함될 수 있다.
본 발명 및 이의 많은 장점들에 대한 더 상세한 이해를 위해, 이하 예시적인 실시예를 제공한다.
실시예
실시예 1
재료 및 방법
2003년 3월부터 2005년 12월 사이에 로잔느 앤드 제네바 대학 병원(스위스)의 소아 병동에 CAP로 입원한 2개월 내지 6살인 99명의 아동을 전향적 코호트(prospective cohort) 연구에 입회시켰다. 아동은 WHO 분류(ref)에 따른 폐렴의 임상 징후를 나타내면 적합하고, 천식, 만성 병 또는 기본 질환, 면역억제에 대해 적극적인 치료를 받거나 쌔근거림(세기관지염 의심 환자)을 나타내는 아동은 제외시켰다. 이 아동들은 2003-2005년에 스위스 권장에 따라 에스. 뉴모니애에 대한 예방접종을 받지 않았다. 아동들은 두 협회의 윤리 위원회가 승인한, 부모 동의를 받은 후에 입회시켰다.
입원 8시간 내에 혈액, 소변 및 비인두측 샘플을 배양하고, 바이러스 또는 세균의 존재에 대해 평가했다. 비인두측 샘플에 대한 PCR 분석은 13종 바이러스, 마이코플라즈마 뉴모니애 및 클라디미아 뉴모니애를 포함하는 반면, 혈액 샘플은 Ply-특이적 PCR로 평가했다. 입원 시에 촬영한 모든 흉부 방사선사진은 임상 및 실험실 소견을 모르는 수석 방사선의사가 검토했다. 에스. 뉴모니애에 대한 사전 예방접종을 받지 않은 99명의 아동 중 75명에서는 3주 후에 회복기 혈청 샘플이 수득되었다. 이러한 75명의 아동을 CAP 관련 항-폐렴구균 반응에 대한 본 연구에 포함시켰다.
본 연구에 사용한 PhtD, PhtE, PcpA 및 LytB 단백질은 이.콜라이에서 발현된 재조합 단백질이다. 사용된 PhtD 및 PhtE는 전체 길이의 단백질이고 사용된 PcpA 및 LytB는 콜린 결합 도메인이 제거된 절두형이다. 4가지 단백질은 모두 용해성 단백질로서 이.콜라이에서 발현되고 이온교환크로마토그래피를 조합하여 정제한다. 단백질은 모두 정제 후에 순도가 SDS-PAGE 및 RP-HPLC로 분석 시에 ≥90%이다.
짝을 이룬 급성 및 회복기 혈청 샘플은 분석 시까지 -20℃에서 보관했다. 샘플은 실험실로 보내기 전에 암호화하고, Ply, PhtD, PhtE, PcpA 및 LytB에 대한 IgG 항체는 임상 데이터를 모르는 실험 요원이 무작정 측정했다. 짝을 이룬 혈청 샘플은 정제된 단백질을 Immunlon(Thermo Labsystem) 플레이트를 코팅하는데 사용하여 간접 ELISA로 동일 실험으로 시험했다. 각 혈청 샘플은 8개의 연속 희석물을 이용하여 항체 역가의 정량분석을 수행했다. 37℃에서 60분 후에, 양고추냉이 퍼옥시다제(Cappel)에 접합된 항-IgG 항체를 첨가했고, 그 다음 기질로서 ABTS를 첨가했다. 각 혈청의 ELISA 역가는 각 분석에 사용된 참조 사람 AB 혈청과 비교하여 정의했고, 여기에 ELISA 단위는 OD=1.0일 때의 희석율의 역수를 취해 임의로 지정했다. 결과는 EU/ml로 나타냈다. 역가가 분석 컷오프 5 EU/ml 이하인 혈청은 2.5 EU/ml의 역가를 제공했다. 항체 역가는 평균 기하 농도(GMC)를 비교할 수 있도록 log 변환했다. 항체 역가의 유의적 상승은 급성 및 회복기 단계 샘플 간에 최소 2배(100%) 증가로서 미리 정의했다.
참가자들의 사회-인구학적 특징은 표준 기술통계학(빈도, 평균, 기하 평균 및 표준 편차)을 이용하여 기술한다. 다른 혈청학의 비교는 스튜던트 T-검정을 이용해 수행했지만, 범주별 데이터는 카이제곱 검정법 또는 피셔 정확검정법을 적당한 때 사용하여 비교했다. 그룹 간의 혈청학은 분산분석(ANOVA)을 이용하여 비교했다. 단변량 통계 분석은 증례 환자인지 아닌지 의존적 변수에 대한 각 변수의 관계를 측정하기 위해 각 변수마다 수행했다. 로지스틱 회귀 분석은 혼란요인(성별 등)으로 작용할 수 있는 임의의 통계적으로 유의적인 인구학 변수들에 대해 조절하는 조정된 교차비(OR) 및 95% 신뢰구간(CI)을 계산하는데 사용했다. 모든 통계 검정법들에서, 차이는 p<.05일 때 또는 95% CI가 1.0을 포함하지 않을 때 유의적인 것으로 간주했다. 분석에는 SPSS(버전 15.0) 통계-소프트웨어 프로그램을 사용했다.
실시예 2
실험 결과
A. CAP 에 걸린 아동의 급성 폐렴구균 감염의 증거
과거 건강한 75명의 아동(평균 33.7개월, 중간 35.4개월, 2.6개월에서 66개월 범위, 50% 여아)을 입원 등록하고, CAP-관련 항-폐렴구균 면역성의 전향적 연구를 위해 급성 및 회복기 혈청을 준비했다. 한 아동만 양성 혈액 배양을 나타냈고, 이에 반해 15명/75명(20%)의 환자는 혈액 중에 뉴모리신 DNA(Ply+-PCR)를 보유했다. Ply에 대한 혈청 IgG 혈청반응의 사용(급성 혈청과 회복기 혈청 사이에 ≥2배 증가)으로 급성 폐렴구균 감염의 증거가 있는 16명/75명(21%)의 아동을 확인했다(표 1). 이 비율은 최근 보고에 따라(Korppi M, Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2007), Ply+-PCR 및/또는 항-Ply 혈청반응을 조합했을 때 31%(23명/75명)로 증가했다.
급성 폐렴구균 감염의 증거가 있는 아동을 추가로 확인하기 위해, 75명의 짝을 이룬 급성 및 회복기 혈청 샘플에서 항체 역가를 정량분석하기 위해 면역학적 프로브로서 4가지 추가 PSP(PhtD, PhtE, LytB 및 PcpA)를 사용했다. LytB에 대한 반응은 빈도가 낮았다(표 1). 이에 반해, 유의적인(≥2배) IgG 반응은 CAP로 입원한 아동의 21 내지 32%에서 관찰되었다(표 1). 이와 함께, 34명/75명(45%)의 아동은 에스. 뉴모니애에 대해 급성 반응의 증거를 나타냈다. 혈청 IgG 항체의 평균 배수 변화는 항-PhtD(4.22), 항-PhtE(6.88) 및 항-PcpA(5.62)에 대해서는 현저했고, 항-Ply(2.15)에 대해서는 보통이었고, 항-LytB(1.51)에 대해서는 약하게 나타났다. 나이는 혈청 항-PSP 항체의 변화 배수에 영향을 미치지 않았고(각 PSP마다 R2 < 0.162), 이것은 어린 유아조차도 급성 폐렴구균 감염에 대해 항-PSP 반응을 유발할 수 있음을 나타낸다. 이것은 PhtD, PhtE 및 PcpA에 대한 혈청반응이 현저한(중간 변화 2.88 내지 6.82배) 8 내지 10개월 된 3명의 유아를 관찰하여 확인했다. 마지막으로, 혈청반응은 여러 PSP에 대하여 빈번하게 유발되어(≥2 PSP: 30%, ≥3 PSP: 25%, ≥4 PSP: 14%, ≥5 PSP: 1%), 최근 폐렴구균 노출의 강한 증거를 제공했다.
≥1 PSP으로 급성 혈청반응을 나타내는 34/75명(45%) 아동은 86% (13/15) Ply+-PCR 환자를 포함했다. Ply+-PCR 아동 2명만이 항-PSP 반응을 나타내지 않았다: 감염 유도성 B 세포 반응을 빠르게 유발하기에는 너무 어린 것으로 추정되는 2.6개월 된 남아 및 사실상 대엽성 폐렴으로 입원했을 때 5가지 PSP에 대하여 높은 급성 혈청 역가를 보유했었던, 17일의 기침 이력과 7일간의 열로 입원한 43개월 된 여아. 따라서, Ply+-PCR과 5가지 PSP 패널에 대한 혈청 반응의 조합 결과, CAP로 입원한 아동 36명/75명(48%)이 급성 폐렴구균 감염(P-CAP)의 강한 증거를 나타내는 것으로 동정되었다.
B. 소아의 폐렴구균 CAP 를 진단하기 위한 면역프로브
최근 폐렴구균 노출의 증거가 없는 31명의 아동(Ply PCR 음성 및 임의의 PSP(NP-CAP)에 대한 IgG 역가의 ≥2배 상승의 결여)에 대하여 급성 폐렴구균 반응(≥2배 상승) 및/또는 감염(Ply+-PCR)(P-CAP)의 증거가 있는 36명의 CAP 아동을 조사했다. ≥3 PSP에 대해 매우 높은(>300 EU/ml) 입원 혈청 역가를 보유하는 8명의 아동은, 높은 항-PSP가 최근 노출 또는 감염을 반영하면서 ≥2배 반응의 가능성을 제한할 수 있는 바, 귀인 오류를 피하기 위해 본 분석에서 제외했다. 이러한 시도는 반응자가 정의상으로는 대조군에 포함되지 않기 때문에, 분석의 특이성 및 양성 예측치를 1.00으로 설정한다. 하지만, 잘 조절된 연구 그룹에서 분석의 민감도와 음성 예측치를 비교할 수 있도록 한다. 폐렴구균 CAP를 진단하는데 있어서 Ply+-PCR에만 의존하는 것은 폐렴구균성 폐렴이 드물게 세균성이라는 사실에 따르면 19/36명(53%)의 환자를 누락시켰을 것이다. 항-Ply IgG 반응만의 사용은 17/36명(47%)의 아동을 누락시켰을 것이어서, 종래 보고와 마찬가지로 0.44의 민감도와 0.61의 음성 예측치를 산출할 것이다(표 1). 항-PhtE 또는 항-PcpA 만의 사용 시에는 더 높은 값이 수득되었다(표 1). 주장한 바와 같이, 여러 PSP의 조합은 분석의 민감도를 더욱 증가시켰다(표 2). 항-PcpA와 항-PhtE 반응의 조합은 0.92의 민감도와 0.91의 음성 예측값을 산출했다. 이 값들은 항-Ply 반응을 추가함으로써 더욱 증가했고, 항-PcpA, PhtE 및 Ply 반응의 조합은 민감도와 음성 예측치 모두에 0.94의 최적 결과를 산출했다. 중요한 것은, PcpA를 포함하지 않는 임의의 PSP 조합물의 최대 민감도가 0.68 이하를 유지한다는 점이다. 이것은 항원 수의 증가가 CAP의 원인 인자를 동정할 수 있는 가능성을 증진시키고, 특정 면역프로브가 다른 것보다 더욱 크게 소아 폐렴구균 CAP의 진단에 기여한다는 것을 확인시켜준다.
C. 폐렴구균성 또는 비- 폐렴구균성 CAP 를 보유한 아동의 임상 특징
다음으로, 급성 폐렴구균성 감염의 강한 증거를 나타내는 아동(P-CAP, n=36)이 최근 폐렴구균의 노출 증거가 없는 아동(n=31, NP-CAP)과 다른 인구학적 또는 임상적 특징을 나타내는지를 측정하는 것도 흥미로웠다. 단변량 분석은, P-CAP 또는 NP-CAP로 병원에 입원한 아동들이 연령(33.5 대 32.7개월), 성별(50% 대 48% 여성), 폐렴의 임상 병도(WHO 스코어 I: 5 대 1, II: 23 대 21, III: 7 대 9), 기침 지속기간(7 대 4일), 열 지속기간(4.2 대 3.2일) 또는 입원 30일 내에 항생제 사용(아동 9명 대 8명) 모두에 있어서 차이가 없는 것으로 나타났다. 이것은 임상 패턴만으로는 폐렴구균 기원의 CAP를 보유한 아동을 믿을만하게 동정할 수는 없다는 것을 확인시켜준다.
D. 폐렴구균성 또는 비- 폐렴구균성 CAP 로 입원한 아동의 상이한 폐렴구균 면역성
에스. 뉴모니애 감염에 대한 방어에서 기존의 항-폐렴구균성 항체의 중요성이 제공되면, 공통의 참조 혈청을 이용하여 입원 시에 PSP-특이적 면역성을 비교하고, 가능하다면 P-CAP 및 NP-CAP 아동 간에 차이를 동정하고자 했다. 75명의 환자는 모두 적어도 하나의 단백질 및 대부분 여러 PSP에 대하여 검출가능한 혈청 항체를 보유했다(≥2 PSP: 96%, ≥3 PSP: 92%, ≥4 PSP: 89%, ≥5 PSP: 86%). 최고의 GMT는 PcpA, Ply 및 PhtE에 대하여 유발되었지만, 항-LytB 항체는 유의적으로 낮았다(표 3). 입원 시의 항체 역가는 매우 불균일했다. 폐렴구균 노출 및 B 세포 반응 용량이 나이가 들수록 증가하는 바, 나이(개월)와 PSP 특이적 GMT(log10 EU/ml) 간에 상관관계에 대해 조사했다. 이러한 상관관계는 Ply(R2=0.63434), PhtD(R2=0.63297) 및 PhtE(R2=0.59359)의 경우에 강했고, LytB(R2=0.45824) 및 PcpA(R2=0.31625)의 경우에는 약하지만 유의적이었다. 4개의 평균 연령 그룹 (≤17개월, 18 내지 35개월, 36 내지 49개월 및 ≥50개월)에 분포된 아동의 노출 유도성 항-PSP 항체의 평가는, 항-PcpA 항체가 이미 <18개월의 아동에서 고 역가로 존재했고(도 1), 이들의 나이에 따른 추가 증가는 유의적이지만(p=0.022), 다른 PSP들(p<0.001)보다는 현저하지 않았다. 항-PcpA 및 항-PhtE 항체는 2.6개월 된 가장 어린 유아에 이미 존재해 있었고, 이것은 모체 항체의 수동 전달을 반영하는 것으로 추정된다.
본 연구에 사용된 5가지 PSP는 폐렴구균 균주 중에서 잘 보존되어 있다(>95-98%). 항-PSP IgG 항체가 폐렴구균성 폐렴에 대항 방어에 한 역할을 한다면, 폐렴구균성 CAP 또는 비-폐렴구균성 CAP를 보유한 아동 간에 폐렴구균성 면역성의 차이를 발견할 수 있을 것으로 생각했다. 입원 시에, PhtD, PhtE 및 LytB에 대한 항체는 P-CAP 및 NP-CAP 아동 간에 유사했고(표 4 및 도 2), 이것은 에스. 뉴모니애에 대한 과거 노출 및 B 세포 반응력의 유사성을 시사한다. 입원 시에 항-Ply는 NP-CAP(169 EU/ml, p=0.03) 아동에서보다 P-CAP(446 EU/ml) 아동에서 훨씬 높았다. 이러한 차이는 본질적으로 입원 시에 P-CAP 아동의 상당 비율이 높은 항-Ply 항체(>200 EU/ml; 도 2)를 보유하고 있음을 반영했다. 놀랍게도 이와 반대로, 입원 시에 항-PcpA 항체는 NP-CAP로 입원한 아동보다 P-CAP로 입원한 아동에서 3배 낮았고(233 대 716 EU/ml, p=0.001), 이것은 NP-CAP 아동의 상당 비율이 임의의 값에서 항-PcpA 역가가 >10 EU/ml이라는 것을 반영한다(도 2). 즉, 기존의 항폐렴구균성 면역성은 폐렴구균성 및 비-폐렴구균성 기원의 CAP로 입원한 아동 간에 큰 차이가 있었다.
다음으로, 회복기 항체 역가를 비교하고, P-CAP 또는 NP-CAP로 입원한 후 3주째에 수거했다. Ply, PhtD, PhtE 및 Lyt-B에 대한 회복기 항체 역가는 나이가 들수록 상당한(p<0.01) 영향을 받았고, 이에 반해 항-PcpA 회복기 역가는 영향을 받지 않았다. 항-LytB 항체는 회복기 혈청에서 전혀 증가하지 않았는데, 이는 이 항원의 낮은 감염-유도 면역원성을 나타낸다(표 4; 도 2). 다른 4가지 PSP에 대한 회복기 항체 역가는 NP-CAP 환자보다 P-CAP 환자에서 더 높았다. 이러한 차이는 항-Ply 항체의 경우에만 통계적 유의성에 이르렀다(표 2). 이것은 역분포성 누적 곡선이 P-CAP 아동에서 중간 또는 높은 항-PhtD 및 항-PhtE 역가의 더 높은 비율을 분명하게 나타내는 바, 비교적 작은 연구 그룹에서 혈청반응의 현저한 불균일성을 본질적으로 반영하는 것 같다(도 2). 흥미로운 것은, 입원 시에 P-CAP 아동에서 3배 낮았던 항-PcpA 항체가 폐렴의 1회 발병 후에 3주만에 NP-CAP 아동과 유사한 역가에 이르렀다는 점이다.
다변량 분석은 입원 시에 높은 Ply 항체(p=0.014) 및 낮은 PcpA 항체(p=0.004)가 연령 및 임상 스코어에 관계없이 입원한 아동의 폐렴구균성 대 비-폐렴구균성 폐렴의 유의적인 유일한 예측인자라는 것을 확인시켜 주었다.
E. 데이터 분석
데이터는 면역원성 PSP 패널의 사용이 세계보건기구(WHO)에서 정한 폐렴의 임상 징후가 있는 소아의 폐렴구균성 감염의 진단을 크게 향상시킨다는 것을 입증한다. WHO는 항-PcpA 항체를 폐렴구균성 CAP의 주요 진단 마커로서 동정했다. 이 항체는 비-폐렴구균성 폐렴보다 폐렴구균성 폐렴을 보유한 아동에서 급성기 동안 매우 낮은 수준에서도 검출될 수 있다.
본 연구에서, 본 발명자들은 PSP계 분석법의 민감도가 가장 면역원성인 단백질의 사용 및/또는 이들의 조합에 의해 향상될 수 있다는 것을 주장했다. PSP 면역원성의 중요성은 LytB의 경우 0.14 내지 Ply의 경우 0.44까지, PhtD의 경우 0.56까지, PhtE 또는 PcpA 단백질의 경우 0.64까지의 민감도의 증명을 통해 주로 확인되었다. 이러한 순위는 PSP의 상대적 면역원성을 직접적으로 반영하며, 이는 연령과 크게 관계없는 항체 반응의 평균 증가 배수의 유사한 구배를 통해서도 입증되었다(LytB(1.51), Ply(2.15), PhtD(4.22), PcpA(5.62) 및 PhtE(6.88)). 더욱 인상적인 것은, 여러 PSP의 조합이 분석 민감도를 현저하게 증가시킨 점으로, 항-PcpA와 항-PhtE 반응의 조합은 CAP로 입원한 아동의 최근 폐렴구균 노출/감염의 진단에 대한 민감도가 0.92에 이르게 했고, 이는 항-Ply 반응의 추가 시에 0.94로 증가했다. 이러한 향상된 민감도 및 이와 관련된 음성 예측치에 대한 1가지 이유는 과거 집락화 또는 감염이 보통 모든 PSP에 대한 항체를 유발하지 않아서 1가지 PSP에 대한 높은 기존의 항체 역가가 다른 항원에 대한 반응을 방해하지 않기 때문이다. 다른 이유는 폐렴구균 CAP의 주요 진단 마커로서 PcpA 단백질의 동정에 있는데, 검사된 PSP 조합물에 관계없이 0.92이기 보다는 PcpA 부재 시에 분석의 민감도는 0.67이 되었다(표 2).
면역프로브로서 5가지 PSP 패널의 사용은 급성 폐렴구균성 반응의 증거가 있는 34명/75명(45%)의 CAP 아동을 동정했다. 4일간 열과 기침의 이력이 있은 후 입원한 3개월 이하의 유아 중에서 항-PSP 반응이 음성을 유지한 2명을 제외한 모든 환자들은 혈액에 폐렴구균 DNA를 보유했다(Ply+-PCR). 이는 면역 미숙 시기에 에스. 뉴모니애에 최초로 노출을 경험한 영아에서는 혈청진단이 어려울 수 있다는 것을 시사한다. 본 연구에 등록한 영아는 몇 명 되지 않아, 이 문제는 차후 연구에서 해결되어야 할 것이다. 항-PSP 반응이 부족한 다른 Ply+-PCR 아동은 CAP로 입원하기 전에 기침(17일)과 열(7일)에 대한 장기간의 병력이 있는 미취학 아동이었다. 이들의 항체 역가는 입원 시에 이미 매우 높았고(항-Ply: 952 EU/ml, 항-PhtD: 192 EU/ml, 항-PhtE: 277 EU/ml, 항-PcpA: 462 EU/ml), 이는 입원 전에 항체의 활성화를 나타낸다. 주목할 것은, 이 환자의 혈청진단이 항체 역가의 배수 증가의 독점적 사용 시보다 덜 엄중한 연구 기준에 의해 양성으로 간주되었을 수 있다는 것이다. 8명의 다른 아동(평균 연령 44.5개월, 22-66개월 범위)은 입원 시에 ≥3 PSP에 대해 높은 기존 면역성을 보유했고(항-Ply > 380 EU/ml, 항-PhtD > 111 EU/ml, 항-PhtE > 393 EU/ml 및 항-PcpA > 266 EU/ml), 귀인 오류를 피하기 위해 P-CAP 환자 또는 NP-CAP 환자로도 간주하지 않았다. 호흡기 바이러스(RSV, hMPV, 파라인플루엔자, 리노바이러스, 아데노바이러스, 엔테로바이러스)는 엠. 뉴모니애 감염의 증거를 나타낸 1명을 제외한 8명 모두에서 동정되었고, 모든 Ply-PCR은 음성을 유지했다. 이러한 8명의 환자를 NP-CAP 그룹에 포함시키는 것은 각 항-PSP 분석의 음성 예측치를 더욱 증가시킬 것이다.
일부 항-PSP 반응은 비인두 운반으로부터 초래된 것으로 결론지을 수 없었다. 입원 시에, 에스. 뉴모니애는 비인두 획득물이 폐렴구균 질환을 선행한다는 사실에 따라 NP-CAP 환자보다 P-CAP 환자의 비인두(44% 대 22%, p = 0.06)에서 더욱 빈번하게 동정되었다. 예를 들어, 신규 폐렴구균 균주의 획득은 Ply, PhtB 및 PhtE와 같은 특정 PSP에 대한 항체의 발생을 유도하는 것으로 알려져 있다(Holmlund E, PIDJ 2007). 이에 반해, 폐렴구균 운반은 단독으로 급성 혈청반응에 관여하지 않는다. CAP로 입원하기 전에 비인두 샘플채취는 운반의 최근 획득을 동정하는데 쓸모가 없었고, 항-PcpA 항체가 비인두 운반 획득을 통해 쉽게 유인되지 않는 것으로 여겨지는 것은 이유가 있다(이하 참조). AOM은 3명의 NP-CAP 환자 및 4명의 P-CAP 환자(NS)에서 입원 시에 진단되었고, 30일 이내의 항생제 처방은 두 그룹에서 유사하다. CAP 병인에 대한 과거 전향적 연구는 다른 질환을 앓고 있는 환자 또는 건강한 아동의 공식적인 대조군을 포함하지 않았다. 흥미로운 것은, 24 내지 60개월 된 우리의 38명의 CAP 환자(평균 연령 43.1개월, P-CAP: 18명, NP-CAP: 18명, 불확정: 2명)의 입원 항체 역가가 다른 연구에서 과거 하기도 감염의 이력이 없는 대조군으로 선택된 58명의 건강한 아동(평균 연령 43.6개월)의 항체 역가보다 훨씬 낮았다(각각 Ply: 460 대 745 EU/ml, PhtD: 150 대 300 EU/ml, PhtE: 382 대 679 EU/ml, PcpA: 580 대 1440 EU/ml). 따라서, 전향적 코호트 연구에서 PhtD, PhtE 및 PcpA 면역성에 미치는 운반 획득, AOM 및 하기도 감염의 영향을 평가하는 것이 유익할 것이다.
본 명세서에 제시된 병인학적 데이터는 다른 연구자들의 발견을 상당히 확실하게 해준다. 에스. 뉴모니애의 귀인 역할은 실제로 유사한 디자인, 연구 집단 및 광대한 진단 작업 하의 US 연구(Michelow 2004)에서 44%의 증례에서 증명되었다. 또한, 7가의 폐렴구균 접합 백신의 20 내지 30% 방어 효능과도 일치했다. 이러한 PSP계 면역프로브의 높은 민감도 및 특이성이 다른 환경에서도 확인된다면, 소아 폐렴구균 질환의 존재량을 평가하는데 극히 유용하다는 것을 증명할 수 있을 것이다. 실제로, 폐렴구균의 병인은 여기서 다시 확인된 것처럼 임상 징후에서 유일하게 유래되지는 않을 것이다. 폐렴구균 CAP의 진단의 민감도 증가는 또한 다양한 국가 상황에서 폐렴구균 백신 효능을 입증하는데 필요한 연구의 규모를 상당히 감소시킬 수도 있다.
또한, 입원 시에 항-폐렴구균 면역성은 폐렴구균성 CAP 대 비-폐렴구균성 CAP로 입원한 아동에서 매우 어려운 것으로 관찰되었다. PSP-특이적 항체는 연령과 과거-노출을 반영하는 매우 다양한 농도로 모든 아동에서 발견되었다. PhtD, PhtE 및 Lyt-B에 대한 입원 항체 수준은 두 그룹에서 유사했고, 이는 아동들이 아마도 항체가 모체 기원일 수 있는 가장 어린 영아를 제외하고는, 과거에 에스.뉴모니애에 노출되었던 건강한 아동이라는 주장을 지지한다. 입원 시에, 항-Ply IgG 항체는 P-CAP 아동의 경우 ≥2배 높았다. 이러한 유의적인 차이는 본질적으로 P-CAP 아동의 상당 비율이 입원 시에 이미 높은 항-Ply 항체(>200 EU/ml; 도 2)를 보유하고 있음을 반영했다. 따라서, Ply-특이적 반응은 다른 PSP에 대한 반응보다 P-CAP를 보유한 아동에서 더욱 빠르게 유도되었다. 이것은 항-Ply 면역성이 상기 환자들에서 과거에 유도된 적이 있어서, 폐렴구균 감염 시에 빠른 병력 반응을 허용하는 것이라 생각하기 쉽다. 더 높은 입원 항-Ply 항체의 관찰은 다른 사람들의 발견들과 일치하고 폐렴구균 CAP의 혈청학적 진단 기준에서 "고" 항-Ply 역가의 포함을 지지한다.
놀랍게도 이에 반해, 항-PcpA 항체는 폐렴구균 CAP로 입원한 아동보다 3배 낮았고, 이 차이는 매우 유의적인 차이이다(p = 0.001). 이것은 폐렴구균이 Mn2+의 농도가 1000배 낮은(20nM) 폐 또는 혈류로 침입하지 않는 한, PcpA 발현이 억제될 정도로 타액이 Mn2+의 최고 생체내 농도(37μM)를 보유하기 때문이다. PcpA는 비인구 집락화 동안 발현되지 않는 바, 항-PcpA 반응은 집락화보다는 폐렴구균 질환을 반영한다. 이는 PcpA계 분석법의 고유 민감도에 기여할 수 있고(표 3), 이로써 비인두-유래의 반응과 혼동을 피할 수 있다. 이러한 PcpA 발현 패턴은 기존의 항-PcpA 면역성이 있는 아동은 과거에 폐렴구균 질환을 일으켰던 아동이라는 다른 시사도 나타낸다. 이와 반대로, CAP로 입원 시에 낮은 항-PcpA 항체 역가는 아동이 폐렴구균 질환의 최초 발병을 일으킬 수 있고, 이는 하기도 질환의 높은 위험율과 관련이 있을 수 있음을 나타낸다. PcpA 항체는 오로지 과거 질환에 의해 유발된 방어 면역성의 마커일 수 있다. 어떠한 경우이든지, PcpA는 폐렴구균성 폐렴의 확립에 중요한 역할을 하는 것으로 보이며, 이에 따라 잠재적 백신 또는 진단 성분으로 다시 평가되어야 한다.
이를 정리하면, 5가지 폐렴구균 표면 단백질(PSP)의 패널이 CAP로 입원한 75명의 어린 아동(평균 연령 33.7개월)의 전향적 연구에서 폐렴구균 감염을 동정하는데 사용되었다. 23명의 환자(31%)는 양성 뉴모리신(Ply) 혈액 PCR(20%) 또는 항-Ply 항체의 ≥2배 증가(21%)를 나타냈다. 면역학적 프로브로서 PhtD, PhtE, LytB 및 PcpA의 추가는 급성 폐렴구균 감염(P-CAP)을 보유한 36명/75명(45%)의 환자를 동정했고, 진단 민감도는 0.44(Ply 단독)에서 0.94로 증가했다. 연령, 성별, 임상 중증도에 대한 WHO 스코어, 기침/열의 지속기간 또는 과거 항생제 사용은 모두 최근 폐렴구균 노출의 증거가 없는(NP-CAP) 31명의 아동과 상기 36명의 환자를 구별하지 못했다. 입원 시에, PhtD, PhtE 및 Lyt-B에 대한 항체는 두 그룹에서 유사한 반면, 항-Ply 항체는 NP-CAP 환자보다 P-CAP 환자에서 훨씬 높았다(각각 169 대 446 EU/ml; p = 0.031). 이에 반해, P-CAP 아동은 항-PcpA 항체가 3배 더 낮았다(233 대 716 EU/ml, p=0.001). 다변량 분석은, 입원 시에 낮은 PcpA 항체가 비인두보다 폐와 같은 낮은 Mn2 + 구획에서 PcpA의 우선적 발현에 따라, 소아의 가장 유의적인 P-CAP 예측인자(p=0.004)라는 것을 확인시켜 주었다.
여기에 인용된 모든 참고문헌은 본 명세서에 전문이 참고인용된다. 본 발명은 바람직한 양태들에 의거해 설명되었지만, 변화와 변형이 일어날 수 있음은 당업자에게 자명한 것이다. 따라서, 후속되는 특허청구범위는 본 발명이 주장하는 범위에 속하는 모든 등가의 변형을 포함하고자 한다.
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<110> Sanofi Pasteur Limited <120> Assay for diagnosing Streptococcus pneumoniae <130> APL-08-02-PCT <150> US 61/063,376 <151> 2008-02-01 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 471 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 1 Met Ala Asn Lys Ala Val Asn Asp Phe Ile Leu Ala Met Asn Tyr Asp 1 5 10 15 Lys Lys Lys Leu Leu Thr His Gln Gly Glu Ser Ile Glu Asn Arg Phe 20 25 30 Ile Lys Glu Gly Asn Gln Leu Pro Asp Glu Phe Val Val Ile Glu Arg 35 40 45 Lys Lys Arg Ser Leu Ser Thr Asn Thr Ser Asp Ile Ser Val Thr Ala 50 55 60 Thr Asn Asp Ser Arg Leu Tyr Pro Gly Ala Leu Leu Val Val Asp Glu 65 70 75 80 Thr Leu Leu Glu Asn Asn Pro Thr Leu Leu Ala Val Asp Arg Ala Pro 85 90 95 Met Thr Tyr Ser Ile Asp Leu Pro Gly Leu Ala Ser Ser Asp Ser Phe 100 105 110 Leu Gln Val Glu Asp Pro Ser Asn Ser Ser Val Arg Gly Ala Val Asn 115 120 125 Asp Leu Leu Ala Lys Trp His Gln Asp Tyr Gly Gln Val Asn Asn Val 130 135 140 Pro Ala Arg Met Gln Tyr Glu Lys Ile Thr Ala His Ser Met Glu Gln 145 150 155 160 Leu Lys Val Lys 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Ser Ile Lys Lys Ile Gln Lys 130 135 140 Lys Gly Phe His Gly Ser Lys Ala Lys Thr Ile Ile Phe Asp Lys Gly 145 150 155 160 Ser Gln Leu Glu Lys Ile Glu Asp Arg Ala Phe Asp Phe Ser Glu Leu 165 170 175 Glu Glu Ile Glu Leu Pro Ala Ser Leu Glu Tyr Ile Gly Thr Ser Ala 180 185 190 Phe Ser Phe Ser Gln Lys Leu Lys Lys Leu Thr Phe Ser Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Leu Glu Leu Ile Ser His Glu Ala Phe Ala Asn Leu Ser Asn Leu 210 215 220 Glu Lys Leu Thr Leu Pro Lys Ser Val Lys Thr Leu Gly Ser Asn Leu 225 230 235 240 Phe Arg Leu Thr Thr Ser Leu Asn Met Leu Met Leu Arg Gly Met Ile 245 250 255 Val Ala Ser Val Asp Gly Val Ser Phe Gln Ser Lys Thr Gln Leu Ile 260 265 270 Tyr Tyr Pro Ser Gln Lys Asn Asp Glu Ser Tyr Lys Thr Pro Lys Glu 275 280 285 Thr Lys Glu Leu Ala Ser Tyr Ser Phe Asn Lys Asn Ser Tyr Leu Lys 290 295 300 Lys Leu Glu Leu Asn Glu Gly Leu Gln Lys Ile Gly Thr Phe Ala Phe 305 310 315 320 Ala Asp Ala Thr Lys Leu Glu Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ser Leu Glu 325 330 335 Thr Ile Glu Arg Leu Ala Phe Tyr Gly 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8 Gly Lys Ala Thr Asn Glu Asn Ala Ala Tyr Tyr Gln Val Val Pro Val 1 5 10 15 Thr Ala Asn Val Tyr Asp Ser Asp Gly Glu Lys Leu Ser Tyr Ile Ser 20 25 30 Gln Gly Ser Val Val Trp Leu Asp Lys Asp Arg Lys Ser Asp Asp Lys 35 40 45 Arg Leu Ala Ile Thr Ile Ser Gly Leu Ser Gly Tyr Met Lys Thr Glu 50 55 60 Asp Leu Gln Ala Leu Asp Ala Ser Lys Asp Phe Ile Pro Tyr Tyr Glu 65 70 75 80 Ser Asp Gly His Arg Phe Tyr His Tyr Val Ala Gln Asn Ala Ser Ile 85 90 95 Pro Val Ala Ser His Leu Ser Asp Met Ala Val Gly Lys Lys Tyr Tyr 100 105 110 Ser Ala Asp Gly Leu His Phe Asp Gly Phe Lys Leu Glu Asn Pro Phe 115 120 125 Leu Phe Lys Asp Leu Thr Glu Ala Thr Asn Tyr Ser Ala Glu Glu Leu 130 135 140 Asp Lys Val Phe Ser Leu Leu Asn Ile Asn Asn Ser Leu Leu Glu Asn 145 150 155 160 Lys Gly Ala Thr Phe Lys Glu Ala Glu Glu His Tyr His Ile Asn Ala 165 170 175 Leu Tyr Leu Leu Ala His Ser Ala Leu Glu Ser Asn Trp Gly Arg Ser 180 185 190 Lys Ile Ala Lys Asp Lys Asn Asn Phe Phe Gly Ile Thr Ala Tyr Asp 195 200 205 Thr Thr Pro Tyr Leu Ser Ala Lys Thr Phe Asp Asp Val Asp Lys Gly 210 215 220 Ile Leu Gly Ala Thr Lys Trp Ile Lys Glu Asn Tyr Ile Asp Arg Gly 225 230 235 240 Arg Thr Phe Leu Gly Asn Lys Ala Ser Gly Met Asn Val Glu Tyr Ala 245 250 255 Ser Asp Pro Tyr Trp Gly Glu Lys Ile Ala Ser Val Met Met Lys Ile 260 265 270 Asn Glu Lys Leu Gly Gly Lys Asp 275 280

Claims (26)

  1. 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)에 의한 과거 감염 또는 활동성 감염을 피검체에서 검출하기 위한 PcpA 항원의 용도로서, 피검체로부터 수득한 샘플 중의 항체가 상기 PcpA 항원에 결합함으로써 상기 감염이 측정되는 용도.
  2. PcpA 항원, 및 PhtD, PhtE, LytB 및 Ply로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 적어도 하나의 추가 항원의 용도.
  3. 제2항에 있어서, 항원의 조합물이 PcpA 및 Ply; PcpA 및 PhtD; PcpA 및 PhtE; PcpA 및 LytB; PcpA, Ply 및 PhtD; PcpA, Ply, PhtD 및 PhtE; Ply, PhtD, PhtE 및 LytB; PcpA, PhtD 및 PhtE; PcpA, PhtD, PhtE 및 LytB; PcpA, PhtE 및 LytB; PcpA, Ply, PhtE 및 LytB; PcpA, PhtD 및 LytB; PcpA, Ply 및 LytB; PcpA, Ply, PhtD 및 LytB; PcpA, Ply 및 PhtE; 및 PcpA, PhtD 및 PhtE로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 용도.
  4. 피검체로부터의 생물학적 샘플에서 PcpA 항원에 대한 항체를 검출하는 단계 (여기서, 상기 샘플 중의 상기 항체의 존재는 감염을 나타낸다)를 포함하여, 피검체에서 스트렙토코커스 뉴모니애에 의한 감염 또는 폐렴을 진단하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, PhtD, PhtE, LytB 및 Ply 또는 이들의 하나 이상의 면역학적 반응성 단편으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 적어도 하나의 추가 항원에 대한 항체를 검출하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 항원이 PcpA 및 Ply; PcpA 및 PhtD; PcpA 및 PhtE; PcpA 및 LytB; PcpA, Ply 및 PhtD; PcpA, Ply, PhtD 및 PhtE; Ply, PhtD, PhtE 및 LytB; PcpA, PhtD 및 PhtE; PcpA, PhtD, PhtE 및 LytB; PcpA, PhtE 및 LytB; PcpA, Ply, PhtE 및 LytB; PcpA, PhtD 및 LytB; PcpA, Ply 및 LytB; PcpA, Ply, PhtD 및 LytB; PcpA, Ply 및 PhtE; 및 PcpA, PhtD 및 PhtE로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 방법.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 피검체로부터의 생물학적 샘플과 상기 항원을 항원-항체 복합체 형성에 충분한 조건과 시간 동안 접촉시키고 나서 항원-항체 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 항원-항체 복합체의 형성을 검출하는 단계가 상기 항원-항체 복합체 중의 사람 면역글로불린을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 사람 면역글로불린을 검출하는 단계가 사람 면역글로불린에 결합하는 제2 항체와 상기 항원-항체 복합체를 상기 제2 항체가 상기 복합체 중의 사람 면역글로불린에 결합하기에 충분한 조건과 시간 동안 접촉시키고 나서, 결합된 항-사람 면역글로불린을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 제2 항체가 검출가능 마커 또는 리포터 분자에 의해 표지화되는 방법.
  11. 스트렙토코커스 뉴모니애에 의한 감염 또는 폐렴이 있는 피검체의, 상기 폐렴 또는 감염 치료용 화합물을 사용한 치료에 대한 반응을 측정하는 방법으로서, 상기 방법은 치료 후에 상기 피검체의 생물학적 샘플에서 PcpA 항원에 대한 항체를 검출하는 단계를 포함하고, 여기서, 검출된 항체의 양이 치료 전에 수득한 상기 피검체의 생물학적 샘플 또는 정상이거나 건강한 피검체의 생물학적 샘플에서 검출할 수 있는 항체의 양과 비교했을 때 증가하거나 변화하지 않거나 또는 감소하고, 치료 후에 항체의 양이 변화하지 않거나 감소하는 것은 상기 피검체가 치료에 반응하지 않는다는 것을 나타내는, 방법.
  12. 제11항에 있어서, PhtD, PhtE, LytB 및 Ply로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 적어도 하나의 항원과 면역반응성인 항체를 검출하는 단계를 포함하는 방법.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 생물학적 샘플과 상기 항원을 항원-항체 복합체 형성에 충분한 조건과 시간 동안 접촉시키고 나서 항원-항체 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 항원-항체 복합체의 형성을 검출하는 단계가 상기 항원-항체 복합체 중의 사람 면역글로불린을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 사람 면역글로불린을 검출하는 단계가 사람 면역글로불린에 결합하는 제2 항체와 상기 항원-항체 복합체를 상기 제2 항체가 상기 복합체 중의 사람 면역글로불린에 결합하기에 충분한 조건과 시간 동안 접촉시키고 나서, 결합된 항-사람 면역글로불린을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 제2 항체가 검출가능 마커 또는 리포터 분자에 의해 표지화되는 방법.
  17. 제7항 또는 제13항에 있어서, 효소-결합 면역흡착 분석법(ELISA)을 수행하는 단계를 포함하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, ELISA가 포획 항체 및 검출 항체를 이용하는 샌드위치 ELISA인 방법.
  19. 생물학적 샘플에서 스트렙토코커스 뉴모니애 감염을 검출하기 위한 키트로서, (i) 분리 및 정제된 PcpA 항원; 및 (ii) 항원-항체 복합체의 형성을 검출하기 위한 시약을 포함하는 키트.
  20. 제19항에 있어서, 사용 지침서를 추가로 포함하는 키트.
  21. 제4항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 샘플에서 스트렙토코커스 뉴모니애 핵산을 검출하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 핵산이 PcpA 단백질을 암호화하는 핵산에 해당하는, 방법.
  23. PcpA, Ply, PhtD, PhtE 및 LytB로 이루어진 그룹 중에서 선택된 항원이 흡착되어 있는 고체 매트릭스.
  24. 분리 및 정제된 항원의 조합물이 흡착되어 있는 고체 매트릭스로서, 상기 조합물이 PcpA 및 Ply; PcpA 및 PhtD; PcpA 및 PhtE; PcpA 및 LytB; PcpA, Ply 및 PhtD; PcpA, Ply, PhtD 및 PhtE; Ply, PhtD, PhtE 및 LytB; PcpA, PhtD 및 PhtE; PcpA, PhtD, PhtE 및 LytB; PcpA, PhtE 및 LytB; PcpA, Ply, PhtE 및 LytB; PcpA, PhtD 및 LytB; PcpA, Ply 및 LytB; PcpA, Ply, PhtD 및 LytB; PcpA, Ply 및 PhtE; 및 PcpA, PhtD 및 PhtE로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 고체 매트릭스.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 미세역가 플레이트 또는 마이크로어레이로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 고체 매트릭스.
  26. 생물학적 샘플과 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 고체 매트릭스를, 상기 하나 이상의 항원에 반응성인 항체가 상기 하나 이상의 항원에 결합하기에 적합한 조건 하에 접촉시키고, 상기 항체가 상기 하나 이상의 항원에 결합하거나 또는 상기 항원 중 어느 것에도 결합하지 않음을 검출하는 단계를 포함하여, 스트렙토코커스 뉴모니애에 의한 감염을 진단하는 방법.
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