JP2009507243A - 感染症を診断する方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】 図1
Description
トリ結核菌亜種パラ結核症(Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis:MAP、リンダ株)の固定化された遊離の表面抗原を以下のように準備した。2200×gの遠心分離によって900μlの細菌培養物からこの細菌を6ミリグラム収集した。300μlの、蒸留水、メタノール、エタノール、プロパノール、アセトニトリル、アセトン、クロロホルム、塩化メチレン、エーテル、及びヘキサンから選択される抽出剤とこの細菌とを混合した。その後、この混合物を1分間ボルテックスにかけて再懸濁し、遠心分離してペレットを形成し、そして、50μlの上澄みをプラスチックの96穴プレートの各ウェルに添加した。そのプレートを室温で乾燥させ、材料(遊離の表面抗原)をウェル表面に付着させた。
実施例1に記載したように、準備したウェルを100μlの緩衝液A(20%Superblock(Pierce Biotechnology,Inc.,米国イリノイ州Rockford)と0.05%Tween80とを含むリン酸緩衝生理食塩水(phosphate buffered saline:PBS))によって洗浄し、ヨーネ病を有している、若しくは有していないとわかっているウシ由来の1:50の希釈血清で室温で1時間培養した。0.5%Tween20を含む100μlのPBSで4時間洗浄した後に、そのウェルを、ビオチン化抗ウシIgGポリクローナル抗体(緩衝液Aの1:500希釈、Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.,米国ペンシルベニア州West Grove)で1時間室温で培養した。0.5%Tween20を含む100μlのPBSで4時間洗浄した後に、そのウェルを、西洋ワサビペルオキシダーゼと接合したストレプトアビジン(緩衝液Aの1:1000希釈)で室温で1時間培養した。0.5%Tween20を含む100μlのPBSで4時間洗浄した後に、結合抗体を、415nmに定められたマイクロプレートリーダ(Bio−Rad Laboratories,米国カリフォルニア州Hercules)での光学密度によって定量化した。結果を図1にグラフで示した。
MAP及びトリ結核菌亜種(Mycobacterium avium subsp. avium:MAA)の遊離の表面抗原を、前記抽出剤として様々なエタノール濃度を用いて、実施例1で説明したように準備した。ヨーネ病を有することが分かっている動物からの血清中の抗体の結合を、MAA又はMAPのいずれかの遊離の表面抗原を用いて、各々の様々な濃度で、実施例2で説明したように測定した。結果を図2に示した。
MAPに感染していることがわかっているウシとMAPに感染していないことがわかっているウシとからの血清試料を、それぞれ70%エタノール濃度を使用して得たMAAおよびMAP抽出物を用いた上述の実施例のように分析した。結果を図3にグラフで示した。
500μgのMAPを、室温で20分間、10%メタノールを含む様々な濃度のホルムアルデヒド溶液に懸濁した。その懸濁液を2秒間超音波処理し、2200×gで遠心分離し、そして、上澄みを実施例1の抗原として使用した。50μlの上澄みをプラスチックの96穴プレートの各ウェルに添加した。そのプレートを室温で乾燥させ、材料(遊離の表面抗原)をウェル表面に付着させた。
実施例5に記載したように、準備したウェルを100μlの緩衝液A(20%Superblock(Pierce Biotechnology,Inc.,米国イリノイ州Rockford)と0.05%Tween80とを含むリン酸緩衝生理食塩水(phosphate buffered saline:PBS))によって洗浄し、ヨーネ病を有している、若しくは有していないとわかっているウシ由来の1:50の希釈血清で室温で1時間培養した。0.5%Tween20を含む100μlのPBSで4時間洗浄した後に、そのウェルを、ビオチン化抗ウシIgGポリクローナル抗体(緩衝液Aの1:500希釈、Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.,米国ペンシルベニア州West Grove)で1時間室温で培養した。0.5%Tween20を含む100μlのPBSで4時間洗浄した後に、そのウェルを、西洋ワサビペルオキシダーゼと接合したストレプトアビジン(緩衝液Aの1:1000希釈)で室温で1時間培養した。0.5%Tween20を含む100μlのPBSで4時間洗浄した後に、結合抗体を、415nmに定められたマイクロプレートリーダ(Bio−Rad Laboratories,米国カリフォルニア州Hercules)での光学密度によって定量化した。結果を図4にグラフで示した。
抽出剤として10%メタノールと共に37%ホルムアルデヒドを使用して、様々な超音波処理時間で実施例6で説明したようにウェルを準備した。結果を図5にグラフで示した。
遊離の表面抗原をMAP生物から抽出し、実施例5及び6で説明したようにウェル上に固定した。10%メタノールと共に濃度37%のホルムアルデヒドを抽出剤として用いて、約2秒間一気に超音波処理をおこなった。
遊離の表面抗原をMAP生物から取得し、実施例8で説明したようにウェルに固定した。20頭のウシからの血清試料およびミルク試料(その一部はMAP陽性であり、一部はMAP陰性である)を本発明に従って試験した。結果を図7に示した。
105頭のウシを、(1)MAPの糞便培養試験の結果と、(2)ヨーネ病の症状の進展との2つの基準に基づいて3つのグループに分類した。第Iグループには30頭のウシが含まれ、それらは糞便培養試験によりMAP陰性と診断され、ヨーネ病の徴候を示さなかった。このグループの陰性の状態を確認するために、従来のELISA試験と、陰性結果のガンマインターフェロンの試験とによって、各々のウシについてMAP感染の試験をした。第IIグループには52頭のウシが含まれ、これらは糞便培養および従来のELISAによって陰性であったが、ヨーネ病の徴候を表していた。このように、これらのウシでは、前記糞便培養および従来のELISAの結果は偽陰性の試験結果であった。第IIIグループには23頭のウシが含まれ、これらはMAP存在のための糞便培養によって陽性反応を示した。糞便培養に関して陰性であると決定する前には、糞便培養は各々のウシに対して数回(通常4回)実施した。例えば、23頭の第IIIグループのウシの中の9頭は、少なくとも1回の陰性の糞便培養試験を示したが、少なくとも1回以外の他の試験では陽性反応を示した。105頭のウシの各々から血清試料を取得し、MAPに対する抗体の存在を見つけるために、それらを2つの方法で試験した。その血清を、試料と無傷MAP生物の集団とを混合し、フローサイトメトリによって抗体/MAP結合を検出することによって試験した。この方法はEda(2004年4月27日付けで出願された米国特許出願番号第10/832,761号)において開示されており、また、微生物感染を診断する際に、従来のELISA試験よりも、より感度が高く且つ特異的な方法であることを示している。0.23若しくはそれ以上のS/P値は、前記フローサイトメトリ方法により陽性試験であると決定された。その血清を、上述の実施例で説明したような本発明の方法によって試験した。37%ホルムアルデヒド及び10%メタノールのMAP懸濁液の短い一瞬の超音波処理による穏やかな除去によって、MAPの遊離の表面抗原を得た。0.35若しくはそれ以上のS/P値は、この方法によって陽性試験であると決定された。試験の結果を以下の表1に示した。
Claims (27)
- 動物における生物に起因する感染の存在を診断する方法であって、
前記動物から試験試料を入手する工程と、
前記生物の表面抗原の抗体結合部位に結合する前記試験試料中の抗体が、前記抗体結合部位に結合するのに十分な時間、前記生物の遊離の表面抗原に前記試験試料を曝す工程であって、この抗原は、前記生物を崩壊させることなく且つ前記生物から内部抗原を除去することなく、前記生物の表面から抗原を除去することによって得られるものである、前記曝す工程と、
前記試験試料が前記生物の遊離の表面抗原に結合する抗体を含むかどうかを、前記遊離の表面抗原に結合される前記試験試料中の1若しくはそれ以上の抗体の存在を検出することによって決定する工程と
を有する方法。 - 請求項1記載の方法において、前記生物は微生物である。
- 請求項2記載の方法において、前記微生物は細菌である。
- 請求項3記載の方法において、前記細菌はマイコバクテリアである。
- 請求項4記載の方法において、前記マイコバクテリアは、トリ結核菌亜種パラ結核菌(Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis)である。
- 請求項1記載の方法において、前記生物の表面からの抗原の除去は、前記生物の抽出剤による処理を組み合わせた前記生物の機械的処理によってなされるものである。
- 請求項6記載の方法において、前記機械的処理は、超音波処理またはボルテックス処理である。
- 請求項1記載の方法において、前記流体は、血液、血清、又は血漿である。
- 請求項1記載の方法において、前記試験試料を前記遊離の表面抗原に曝す工程は、前記試験試料と前記遊離の表面抗原とを容器中で混合することによってなされるものである。
- 請求項9記載の方法において、結合の検出は、フローサイトメトリによってなされるものである。
- 請求項9記載の方法において、結合の検出は、ブロット分析によってなされるものである。
- 請求項1記載の方法において、前記試験試料を前記遊離の表面抗原に曝す工程は、表面上で行われるものである。
- 請求項12記載の方法において、前記遊離の表面抗原は、1若しくはそれ以上のウェルの表面に固定化されるものであり、前記試験試料中における前記遊離の表面抗原への抗体の結合は、光学密度の測定によって決定されるものである。
- 請求項12記載の方法において、前記遊離の表面抗原は、試験表面に固定化され、前記抗原が固定化された表面を流体試験試料中に浸漬することによって前記試験試料に曝されるものである。
- 請求項14記載の方法において、前記試験表面で結合が視覚的な色の変化によって特定されるために比色分析標識が利用されるものである。
- 生物から表面抗原を取得する方法であって、
前記生物が抽出剤を含む流体中に懸濁される間、前記生物を機械的に処理する工程であって、前記処理物の量は、前記生物から表面抗原を取り除くのに十分な時間ではあるが、前記生物から内部抗原を放出させるような前記生物を崩壊させるには不十分な時間である、前記処理する工程と、
取り除かれた表面抗原以外の前記生物の部分から、前記生物から取り除かれた表面抗原を分離させる工程と
を有する方法。 - 請求項16記載の方法において、前記機械的処理は、超音波処理またはボルテックス処理である。
- 請求項16記載の方法において、前記生物は微生物である。
- 請求項18記載の方法において、前記微生物は細菌である。
- 請求項19記載の方法において、前記細菌はマイコバクテリアである。
- 請求項20記載の方法において、前記マイコバクテリアは、トリ結核菌亜種パラ結核菌である。
- 生物の遊離した表面抗原が付着した固体表面を取得する方法であって、
前記生物を崩壊させることなく、且つ前記生物の内部抗体を放出させることなく前記生物の表面から抗原を取り除く工程と、
前記取り除かれた表面抗原以外の前記生物の部分から、前記取り除かれた表面抗原を分離させる工程と、
それによって前記生物の遊離の表面抗原を得る工程と、
前記遊離の表面抗原を固体表面に固定化する工程と
を有する方法。 - 請求項22記載の方法において、前記固体表面は、不浸透性の表面である。
- 請求項22記載の方法において、前記表面抗原は、前記生物が抽出剤を含む流体中に懸濁される間、前記生物を機械的に処理することによって除去されるものである。
- 請求項22記載の方法において、前記生物は微生物である。
- 請求項25記載の方法において、前記微生物は細菌である。
- 請求項22記載の方法によって準備される固体表面。
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