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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum spezifischen und
frühen Nachweis einer Infektion mit Mycobacterium avium
subsp. paratuberculosis (MAP) bei Säugetieren durch den
Nachweis von Interferon-gamma (IFN-γ) in biologischen Proben
einschließlich Blut nach Inkubation von Zellen, die spezifisch
auf eine Stimulation mittels MAP-spezifischen Antigenen mit IFN-γ-Bildung
reagieren.
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Stand der Technik
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Paratuberkulose,
verursacht durch das Bakterium Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP),
ist eine chronische Darmerkrankung der Wiederkäuer, die
vor allem durch eine progrediente, granulomatöse Entzündung
der Dünndarmwand gekennzeichnet ist. Die Tiere infizieren
sich meist innerhalb der ersten Lebenswochen, zeigen aber erst Jahre
nach der Infizierung klinische Symptome. Ab einem unbekannten Zeitpunkt
während der langen Inkubationszeit beginnen infizierte
Tiere damit, den Erreger – meist intermittierend – mit
dem Kot auszuscheiden und werden damit zur Ansteckungsquelle für
andere Tiere. Die transplazentare Übertragung auf das Ungeborene
wird als weiterer Ansteckungsweg diskutiert. Wegen fehlender Krankheitszeichen
während der Inkubationszeit bleiben infizierte Tiere dem
Tierhalter verborgen. Als weiterer gesundheitspolitischer Aspekt
kommt hinzu, dass MAP im Verdacht steht, bei der als Morbus Crohn
bezeichneten Erkrankung des Menschen, einer unheilbaren chronisch-entzündlichen
Erkrankung des Verdauungstraktes, ursächlich beteiligt
zu sein bzw. das Krankheitsgeschehen zu unterhalten. Zur Sanierung
von infizierten Herden bzw. zur Paratuberkulose-Prophylaxe in den
Beständen ist es deshalb wichtig, infizierte Tiere in einem
möglichst frühen Stadium der Infektion zu erkennen
(d. h. im Kälber- und Jungtieralter).
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Für
die Diagnose einer Paratuberkulose gibt es mehrere, in Fachkreisen
bekannte Verfahren: Der sog. Goldstandard der Paratuberkulosediagnostik
ist der Erregernachweis mittels kulturell-bakteriologischer Untersuchung
von Tierkot oder des Ileocaecallymphknotens (Darmlymphknoten). Ein
weiteres Verfahren weist MAP-spezifische DNS in Proben mittels PCR-Technologie
nach. Diese beiden Methoden sind direkte Verfahren, um MAP-Infektionen
bei Tieren aufzudecken.
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Daneben
gibt es indirekte Verfahren, beispielsweise durch den Nachweis von
MAP-spezifischen Antikörpern im Blutserum der Tiere. Zum
Beispiel werden erregerspezifische IgG-Antikörper mittels
Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assays (ELISA) nachgewiesen. Für
diesen Zweck sind Testkits kommerziell erhältlich.
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Es
ist bekannt, dass eine MAP-Infektion bei Wiederkäuern in
den frühen Infektionsphasen durch eine Zunahme von gegen
MAP gerichteten T-Zellen im Blut gekennzeichnet ist. Die Quantifizierung
von IFN-γ bei restimulierten Blutleukozyten wurde bereits
als diagnostischer Ansatz zur Identifizierung junger MAP-infizierter Rinder
verfolgt. Hierzu wurden Vollblutproben ohne vorhergehende Separation
der Zellen mit MAP-Antigenen stimuliert und das von diesem heterogenen
Zellgemisch insgesamt sezernierte IFN-γ mittels ELISA quantifiziert.
Dieser Nachweis der zellulären Immunreaktionen liefert
keine frühere Diagnose, als die Kotkultur oder die nach §17
TierSeuG zugelassenen Serum-ELISA und ist prinzipiell zur MAP-Frühdiagnostik
von Jungtieren z. B. Kälbern nicht geeignet, da sich im
Zellgemisch von Jungtieren zu viele Zellen befinden die unspezifisch auf
Antigenstimulation mit IFN-γ Bildung reagieren.
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Nachteile des Standes der
Technik
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Die
derzeit verfügbaren diagnostischen Tests sind nur wenig
sensitiv und spezifisch, insbesondere was den Nachweis zu einem
frühen Zeitpunkt der Infektion (d. h. von der Geburt bis
zum 2. Lebensjahr des Tieres) angeht, so dass MAP-infizierte Tiere
nicht ausreichend sicher identifiziert werden können.
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Beim
Erregernachweis mittels kulturell-bakteriologischer Untersuchung
von Tierkot ist die Erregeranzucht sehr langwierig (mind. 8 Wochen),
und falsch negative Befunde sind sehr häufig, da Erreger
in frühen Phasen der Infektion noch nicht oder nur intermittierend
ausgeschieden werden.
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Eine
halbwegs zuverlässige Aussage über den MAP-freien
Status eines Einzeltieres ist daher erst nach mehrmaliger Beprobung
und Untersuchung mit negativem Befund möglich. Die kulturell-bakteriologische Untersuchung
des Ileocaecallymphknotens (Darmlymphknoten) hat neben der schon
erwähnten langwierigen Anzuchtdauer den weiteren Nachteil,
dass die Darmlymphknoten des Tieres für eine solche Untersuchung
nur mittels Bauchhöhlenoperation zugänglich sind.
Dieses Verfahren erscheint daher gegenwärtig nur bedingt
praxistauglich.
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Ähnliches
gilt für den direkten MAP-Nachweis mittels der erwähnten
PCR-Verfahren. Diese Diagnostik ist zwar weniger zeitaufwändig
als die kulturellbakteriologische Untersuchung, aber oft auch noch
weniger sensitiv.
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Durch
Besonderheiten bei der Erreger-Wirt-Interaktion wird die klinisch
inapparente Phase zu Beginn der Infektion von der zellulären
Immunantwort dominiert, während die humorale Immunantwort
nur schwach ausgeprägt ist. Entsprechend weisen Systeme
zum indirekten Erregernachweis mittels ELISA-Technik nur eine geringe
Spezifität und/oder Sensitivität auf (bei ca.
50%), vor allem in der frühen Phase einer MAP-Infektion.
Die Quantifizierung von IFN-γ bei restimulierten Blutleukozyten
als Maß für die zelluläre Immunantwort
ist im Stand der Technik bereits als diagnostischer Ansatz zur Identifizierung
MAP-infizierter Rinder (ab 12 Monate) bekannt. Durch starke individuelle
Unterschiede und häufig auftretende falschpositive Reaktionen
gegen Mykobakterien-Antigen im Allgemeinen besonders im Kälberalter
wird die Spezifität dieses Tests erheblich eingeschränkt.
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Hieraus
ergeben sich erhebliche Nachteile:
Obwohl ein Tier schon lange
infiziert sein kann, ist sein Infektionsstatus erst zu ermitteln,
nachdem es selbst schon wieder ein oder mehrere Nachkommen geboren
und diese möglicherweise bereits angesteckt hat.
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Auch
auf Bestandsebene kann mit den bisher verfügbaren diagnostischen
Möglichkeiten die MAP-Freiheit nicht mit ausreichender
Sicherheit festgestellt werden. Selbst wenn die serologische und
bakteriologische Untersuchung der Tiere zu einem negativen Ergebnis
führt, kann nicht ausgeschlossen werden, dass sich die
Nachzucht bereits mit dem Erreger infiziert hat.
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Eine
verlässliche Zusicherung der MAP-Freiheit von Tiere, welche
in paratuberkulose-freie Bestände integriert werden sollen,
ist derzeit unmöglich, ist aber im Hinblick auf die Verhinderung
der Weiterverbreitung dieser Infektionskrankheit von sehr großer
Bedeutung. Dies gilt insbesondere für die Zertifizierung
von Zuchtvieh im Rahmen des innergemeinschaftlichen Verbringens
und des Exports, die zukünftig von immer mehr Ländern
(bislang u. a. von Österreich) verlangt werden.
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Es
besteht daher der Bedarf an einem sensitiven und spezifischen diagnostischen
Nachweisverfahren, das eine Infektion mit MAP bereits in den frühen
Infektionsphasen vor allem auch bei Tieren bis zum 2. Lebensjahr
zuverlässig nachweist.
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Aufgabe
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Aufgabe
der vorliegenden Erfindung ist daher es, die beschriebenen Nachteile
im Stand der Technik zu beheben und ein zuverlässiges und
sicheres Verfahren zum Nachweis einer MAP-Infektion bei adulten
und insbesondere bei Säugetieren bis zum 2. Lebensjahr
sowie einen dazu geeigneten Testkit bereitzustellen.
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Lösung
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Die
Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren
gemäß der Ansprüche x-y und einen Testkit gemäß der
Ansprüche a–z gelöst.
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Grundlage
für die Entwicklung eines neuen Verfahrens war die Überlegung,
dass MAP-infizierte Tiere in ihrem Blut einen messbaren Anteil T-Zellen
(CD4+ und CD8+ T-Zellen)
aufweisen, die sich spezifisch mit MAP-Antigen sensibilisieren lassen
und dabei IFN-γ bilden, während Tiere, die nicht
mit MAP infiziert sind, zwar CD4+ bzw. CD8+ T-Zellen besitzen, diese sich jedoch nicht
mit MAP-Antigen stimulieren lassen. Es wurde jedoch gefunden, dass
bei Verwendung von Vollblut innerhalb der Immunzellen Zellsubpopulationen
vorliegen (v. a. bei Jungtieren), die unspezifisch auf eine Antigenstimulation
mittels Mykobakterien-Antigenen mit IFN-γ-Bildung reagieren
und somit leicht falschpositive oder nicht interpretierbare Ergebnisse
entstehen, die die Aussagekraft eines darauf aufbauenden Testsystems erheblich
in Frage stellen. Dies wurde erfindungsgemäß im
Verfahren zum Nachweis einer MAP-Infektion berücksichtigt.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren hat den Vorteil, dass
auch bei Verwendung von Vollblut aus adulten Säugetieren
und Säugetieren bis zum 2. Lebensjahr nur die spezifische
IFN-γ-Bildung gemessen wird, innerhalb der Zellen, die
spezifisch auf eine Stimulation mittels MAP-spezifischen Antigenen
mit IFN-γ-Bildung reagieren und damit keine falschpositiven
oder nicht interpretierbaren Ergebnisse mehr entstehen. Damit steht ein
spezifisches sowie sensitives Verfahren zum Nachweis auf eine Infektion
mit MAP zur Verfügung, die bereits in den frühen
Infektionsphasen beim adulten Säugetieren und vor allem
auch bei Säugetieren bis zum 2. Lebensjahr zuverlässige
Ergebnisse liefert und in der Diagnostik eingesetzt wird.
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Die
Spezifität und Sensitivität in den frühen
Infektionsphasen beim adulten Säugetieren und vor allem auch
bei Säugetieren bis zum 2. Lebensjahr wird dadurch erreicht,
dass aus dem Vollblut erfindungsgemäß zunächst
die mononukleären Zellen isoliert werden und anschließend
die Messung und Quantifizierung des IFN-γ-Gehaltes gezielt
innerhalb vorzugsweise der CD4+ aber auch
CD8+ T-Zell-Subpopulationen erfolgt. Dabei
ist zu beachten, dass der IFN-γ Nachweis getrennt und nur
innerhalb der CD4+ Zellpopulationen oder
der CD8+ Zellpopulationen erfolgt. Dies
hat den Vorteil, dass nur das IFN-γ gemessen wird, dass
von den Zellen, die spezifisch auf eine Antigenstimulation mittels
Mykobakterien-Antigenen mit IFN-γ-Bildung reagieren, gebildet
wird. Die Messung von unspezifischer IFN-γ-Produktion anderer
Zellpopulationen ist somit ausgeschlossen und es werden keine falschpositiven
Ergebnisse erzeugt.
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Die
Spezifität und Sensitivität wird weiterhin durch
die Auswahl bzw. die Herstellung des Antigens erreicht (z. B. Ganzzelllysat
von MAP, beispielsweise des kommerziell erhältlichen K10-Stammes,
ATCC-Nr. BAA-968 oder anderen geeigneten MAP-Stämmen),
das eine optimale MAP-spezifische IFN-γ-Antwort in vitro auslöst.
Dies hat den Vorteil, dass nur die Reaktion auf Antigen von MAP
gemessen wird und keine falschpositiven Ergebnisse, die z. B. durch
Mycobacterium avium subsp. avium (MAA) und/oder Mycobacterium phlei ausgelöst
werden.
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Erfindungsgemäß umfasst
die biologische Probe eine Organ- oder Gewebeprobe, Kot- und Milchprobe,
sowie bevorzugt Blut.
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Erfindungsgemäß stammt
die biologische Probe aus einem Säugetier inklusive einem
Menschen, bevorzugt aus einem Wiederkäuer, insbesondere
Rind, Schaf oder Ziege.
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Im
Einzelnen besteht das erfindungsgemäße Verfahren
aus folgenden Schritten:
- 1. Isolierung und
Kultivierung von Zellen, die spezifisch auf eine Stimulation mittels
MAP-spezifischen Antigenen mit IFN-γ-Bildung reagieren
- 2. Stimulation der Zellen aus Schritt 1 mit MAP-spezifischem
Antigen
- 3. Restimulation der Zellen aus Schritt 2 durch Zugabe von Mitteln,
die die IFN-γ Produktion beschleunigen und die eine vorzeitige
Sekretion von IFN-γ aus den Zellen verhindern
- 4. Markierung der Zellen aus Schritt 3 und des IFN-γ,
zur Messung der Antigen-spezifischen IFN-γ Produktion
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Ausführungsbeispiele
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1. Isolierung und Kultivierung von Zellen,
die spezifisch auf eine Stimulation mittels MAP-spezifischen Antigenen
mit IFN-γ-Bildung reagieren
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Die
Isolierung der Zellen erfolgt aus einer Probe eines Säugetieres
z. B. Organ-, Gewebe-, Kot- oder Milchprobe, vorzugsweise aus Blut
insbesondere eines Rindes. Die Blutentnahme erfolgt gemäß allgemeinem Fachwissen
z. B. durch Punktion der Vena jugularis eines Säugetieres,
z. B. Rindes. Zur Gerinnungshemmung wird das Blut in geeigneten
Gefäßen z. B. Spritzen gesammelt und mit einem
gerinnungshemmenden Stoff z. B. 0,2 ml einer 3,8%igen Na3-Citrat-Lösung pro ml Vollblut
versetzt. Alternativ erfolgt die Blutprobenentnahme z. B. in kommerziell
erhältliche EDTA-Röhrchen.
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Präparation von Antigenen z.
B. MAP-spezifische Antigene
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Die
Präparation von MAP-spezifischen Antigenen erfolgt als
Ganzzelllysat (WCS), wie es dem Fachmann bekannt ist, z. B. indem
nach Anzucht von Bakterienzellen diese mit Ultraschall und mechanisch
(z. B. durch Bead-bester) lysiert und anschließend gefiltert
und in Lösung gebracht werden, wie z. B. bekannt aus J. Pollock
(National animal Disease Center, IA, USA) „Antigen Preparation-NADC”.
Alternativ erfolgt die Präparation von Mycobacterien-Antigen
als Protein purified derivative (PPD), indem nach Anzucht von Bakterien
unter geeigneten Kultivierungsbedingungen, die Suspension autoklaviert,
die Proteine gefällt, gefiltert und anschließend
in Lösung gebracht werden, wie dem Fachmann z. B. bekannt
ist aus Haagsma und Angus in „Mycobacterium bovis Infection
in Animals and Humans”. Diese Verfahren werden für
die Präparation von MAP-spezifischen Antigenen verwendet,
aber auch für die Präparation von Kontrollantigenen
z. B. aus Mycobacterium avium subsp. avium (MAA) und/oder Mycobacterium
phlei.
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Zur
Isolierung und Kultivierung von Zellen, die spezifisch auf eine
Stimulation mittels MAP-spezifischen Antigenen mit IFN-γ-Bildung
reagieren, werden zunächst aus der Blutprobe die primären
monozytären Zellen z. B. die primären bovinen
monozytären Zellen (PBMC) isoliert z. B. über
einen Ficoll®-Gradienten nach Gebrauchsanweisung
des Herstellers. Dabei werden die monozytären Zellen aus
der Blutprobe durch Herausfiltern (z. B. Gradientenzentrifugation)
der Erythrozyten und Granulozyten gewonnen, so dass in der Zellsuspension
nur Lymphozyten und Monozyten verbleiben. Ein Alternative ist eine
Modifikation dieser Gebrauchsanweisung beschrieben in Menge et al.
(C. MENGE, L. H. WIELER, T. SCHLAPP, G. BALJER (1999): Shiga toxin
1 from Escherichia coli blocks activation and Proliferation of bovine
lymphocyte subpopulations in vitro. Infect. Immun. 67, 2209–17)
isoliert.
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Die
Zellen (z. B. PBMC) werden anschließend in einer definierten
Konzentration z. B. von 4 × 106 Zellen/ml
in 12-Well Zellkulturplatten eingesetzt.
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Innerhalb
dieser primären monozytären Zellen (z. B. den
primären bovinen monozytären Zellen (PBMC)) befinden
sich Zellsubpopulationen, die auf eine Stimulation mittels MAP-spezifischen
Antigenen mit IFN-γ-Bildung reagieren. Insbesondere sind
dies die CD4+- und CD8+-T-Zellen.
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2. Stimulation der Zellen aus Schritt
1 mit MAP-spezifischen Antigenen
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Die
Stimulation der isolierten primären monozytären
Zellen z. B. den primären bovinen monozytären Zellen
(PBMC) aus Schritt 1 mit Antigenen z. B. den MAP-spezifischen Antigenen
und ggf. mindestens eines Kontrollantigens in einem seperaten Ansatz
erfolgt in einer geeigneten Konzentration von beispielsweise 5 μg PPD/ml
Medium oder beispielsweise 1,5 μg WCS/ml PBMC Medium. Die
Stimulation erfolgt z. B. im einem Zellkulturbrutschrank über
einen Zeitraum von 100–200 h, vorzugsweise 120–160
h, ganz besonders bevorzugt 144 h bei geeigneten Standardbedingungen
z. B. 37°C und 5% CO2 (z. B. Zellkultur-Brutschrank)
Als Kontrollantigen wird z. B. eine Präparation aus Mycobacterium
avium subsp. avium (MAA) und/oder Mycobacterium phlei verwendet
und dieses als negative Kontrolle im Verfahren eingesetzt.
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3. Restimulation der Zellen aus Schritt
2 durch Zugabe von Mitteln, die die IFN-γ Produktion beschleunigen und
die eine vorzeitige Sekretion von IFN-γ aus den Zellen
verhindern
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Die
Restimulation der Zellen aus Schritt 2 erfolgt durch weitere Inkubation
in Anwesenheit eines Mittels, das die IFN-γ Produktion
beschleunigt, (z. B. Ionomycin und/oder Phorbol-Myristat-Acetat
(PMA)) in geeigneter Konzentration und (gleichzeitig) eines Mittels,
das die vorzeitige Sekretion von IFN-γ aus den Zellen verhindert
(z. B. Brefeldin A) in geeigneter Konzentration über eine
Zeitraum von 2–6 h vorzugsweise 4 h. Geeignete Konzentrationen
an Ionomycin sind z. B. 1 μg/ml, an Phorbol-Myristat-Acetat
(PMA) z. B. 50 ng/ml.
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Im
Anschluss daran werden die Zellen geerntet und in einer definierten
Konzentration in ein geeignetes Gefäß überführt
z. B. 1–2 × 105 Zellen/Well
in eine 96-Well Platte mit „V”-Form Boden.
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4. Markierung der Zellen aus Schritt 3
und des IFN-γ, zur Messung der Antigen-spezifischen IFN-γ Produktion
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Um
die IFN-γ-Bildung innerhalb der Zellen, im besonderen der
Antigenspezifischen CD4+ und/oder CD8+ Zellen, aus Schritt 3 zu detektieren und
quantitativ zu erfassen, werden die Zellsubpopulationen von Interesse
(CD4+ und/oder CD8+ Zellen)
als auch das intrazellulär befindliche IFN-γ markiert
(z. B. mit geeigneten Antikörpern). Somit kann der IFN-γ Gehalt
getrennt, entweder in CD4+ oder in CD8+ Zellen bestimmt werden. Dem Fachmann steht
dazu für eine direkte Markierung eine Vielzahl an radioaktiven,
fluoreszierenden, biolumineszierenden CD4-, CD8- und IFN-γ spezifischen
Antikörpern zur Verfügung. Aber auch eine indirekte
Markierung mittels radioaktiven, fluoreszierenden, biolumineszierenden
Sekundärantikörpern, vorzugsweise mittels eines
Biotin-Streptavidin Verstärkungsschrittes ist dem Fachmann
bekannt. Der Fachmann kennt eine Vielzahl an geeigneten Fluoreszenzfarbstoffen,
darunter z. B. APC und PE, die auch für die Detektion im Durchflusszytometer
geeignet sind.
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Zunächst
werden die Oberflächenantigene CD4 oder CD8 der Zellen
aus Schritt 3 mit kommerziell erhältlichen monoklonalen
CD4- oder CD8-spezifischen Antikörpern versetzt und markiert.
Diese CD4- oder CD8-spezifischen Antikörper werden anschließend
mit Sekundärantikörpern z. B. APC-konjugierten
Sekundärantikörpern versetzt und detektiert. Bevorzugt
erfolgt eine Vorinkubation mit Biotinkonjugierten Sekundärantikörpern,
die anschließend mit APC-konjugiertem Streptavidin versetzt
und markiert werden. Dies führt zu einer Signalverstärkung
und somit zu einer sicheren Identifizierung der CD4- oder CD8 positiven
Zellen. Anschließend werden die Zellen fixiert, permeabilisiert
und mit kommerziell erhältlichen monoklonalen Antikörper gegen
IFN-γ versetzt, um intrazellulär vorhandenes IFN-γ zu
markieren. Antikörper, die an IFN-γ gebunden haben,
werden mit Sekundärantikörpern, z. B. mit kommerziell
erhältlichen PE-konjugierten Sekundärantikörpern detektiert.
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Messung und Quantifizierung
des IFN-γ-Gehaltes
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Die
Quantifizierung (IFN-γ[%] Titer)
erfolgt z. B. im Durchflusszytometer, da hier einerseits die CD4+- oder CD8+-T-Zellen
sowie innerhalb beider Populationen solche mit und ohne IFN-γ-Bildung
deutlich voneinander unterschieden werden. Der Anteil IFN-γ-bildender
Zellen an allen CD4+- bzw. CD8+-T-Zellen
nach Inkubation mit MAP-Antigen im Vergleich zur Inkubation ohne
Antigen oder mit Kontrollantigen z. B. MAA- bzw. M. phlei-Antigen
wird als Parameter für die Bewertung der Blutproben gewählt.
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Im
Falle eines MAP-negativen Tieres ist der Quotient ca. 1,0. Im Falle
eines MAP-positiven Tieres ist der Quotient >1,0.
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Alternativ
erfolgt die Quantifizierung IFN-γ[MFLI] Titer
z. B. im Durchflusszytometer durch Abgrenzung der Zellen nach lymphozytärer
Herkunft (Region 1) von denen monozytärer bzw. lymphoblastoider
Herkunft (Region 2) und getrennter Analyse. Innerhalb der Region
2 wird die mittlere relative Fluoreszenzintensität (MFLI)
des IFN-γ-Signals aller CD4+ (oder
CD8+)-Zellen bestimmt. Die MFLI nach Inkubation
mit MAP-Antigen im Vergleich zur Inkubation ohne Antigen oder mit
Kontrollantigen z. B. Antigen aus Mycobacterium avium subsp. avium
(MAA) und/oder Mycobacterium phlei wird als Parameter für
die Bewertung der Blutproben gewählt.
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Im
Falle eines MAP-negativen Tieres ist der Quotient ca. 1,0. Im Falle
eines MAP-positiven Tieres ist der Quotient >1,0.
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Dem
Fachmann ist mit Hilfe der vorangestellten Beschreibung möglich,
dieses Prinzip des Nachweises von MAP mit geringfügigen Änderungen
und Anpassungen, die im Rahmen seines Fachwissens liegen, auch auf
den Nachweis anderer Krankheitserreger z. B. Infektionen mit Tierseuchen-
oder Zoonoseerregern anzuwenden.
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Eine
Ausführungsform der Erfindung betrifft einen einfach zu
handhabenden Testkit zum Nachweis einer Infektion mit Mycobacterium
avium ssp. paratuberculosis (MAP) in einer biologischen Probe, der
Materialien zur Messung der spezifischen IFN-γ-Bildung
aus Zellen, die auf eine Stimulation mittels MAP-spezifischen Antigenen
mit IFN-γ-Bildung reagieren, umfasst.
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Der
Testkit umfasst eine Antigenpräparation von Mycobacterium
avium ssp. paratuberculosis (MAP), alternativ als negative Kontrolle
auch zusätzlich eine Antigenpräparation von Mycobacterium
avium ssp. avium (MAA) und/oder Mycobacterium phlei (M. phlei).
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In
der erfindungsgemäßen Ausführungsform
umfasst der Testkit weiterhin Antikörper zur Bindung und Markierung
der Zellen, die spezifisch auf eine Stimulation mittels MAP-spezifischen
Antigenen mit IFN-γ-Bildung reagieren, z. B. radioaktive,
fluoreszierende, biolumineszierende CD4-, CD8 spezifische Antikörper,
weiterhin Antikörper, die IFN-γ binden und z.
B. radioaktiv, fluoreszierend oder biolumineszierend markiert sind.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst der Testkit Sekundärantikörper
zur Bindung an die Antikörper, die an Zellen binden, die
spezifisch auf eine Stimulation mittels MAP-spezifischen Antigenen
mit IFN-γ-Bildung reagieren und Sekundärantikörper
zur Bindung an die Antikörpern, die IFN-γ binden.
Diese Sekundärantikörper sind dem Fachmann bekannte
radioaktiv, fluoreszierend oder biolumineszierend markierte Sekundärantikörper zur
Bindung der CD4-, CD8- und IFN-γ spezifischen Antikörper,
die insbesondere zur Analyse mittels Durchflusszytometrie geeignet
sind.
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Auf
Grund der Lehre der vorliegenden Erfindung sowie auf Grund des allgemeinen
Fachwissens in diesem technischen Gebiet ist dem Hersteller des
erfindungsgemäßen Kits bekannt, wie er die einzelnen
Komponenten des Kits, z. B. Puffer herstellt, formuliert und lagert.
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Abbildungen
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1 zeigt
beispielhaft die Auswertung einer Messung zum Nachweis einer Infektion
mit Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) durch den
Nachweis Interferon-gamma (IFN-γ) bildender T-Zell-Subpopulationen
in Blut nach Inkubation von peripheren mononukleären Blutzellkulturen
(PBMC) mit MAP-Antigenpräparationen. Dargestellt ist der
IFN-γ[MFLI] Titer (normalisiert
anhand der Proben die nach Inkubation mit M. phlei gemessen wurden;
y-Achse) CD4+ Lymphoblasten von 3 MAP-infizierten
Tieren (in der Grafik gezeigt durch ausgefüllte Symbole)
und 3 MAP-negativen Tieren (in der Grafik gezeigt durch offene Symbole)
nach Inkubation ohne Antigen (Med) oder mit Antigenpräparationen)
von MAA (WCS-MAA) und MAP (WCS-MAP) (x-Achse).
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- - C. MENGE,
L. H. WIELER, T. SCHLAPP, G. BALJER (1999): Shiga toxin 1 from Escherichia
coli blocks activation and Proliferation of bovine lymphocyte subpopulations
in vitro. Infect. Immun. 67, 2209–17 [0026]
