DE102010024503A1

DE102010024503A1 - Verfahren und Testkit zum Nachweis antigenspezifischer T-Zellen zur Diagnostik von MAP-infizierten Tieren

Info

Publication number: DE102010024503A1
Application number: DE201010024503
Authority: DE
Inventors: Philip Bridger; Christian Menge; Rolf Bauerfeind
Original assignee: Justus Liebig Universitaet Giessen
Current assignee: Justus Liebig Universitaet Giessen
Priority date: 2010-06-21
Filing date: 2010-06-21
Publication date: 2011-12-22

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und ein Testkit zur labordiagnostischen Erkennung von Subjekten, welche mit dem Erreger der Erkrankung Paratuberkulose, dem Bakterium Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) infiziert sind. Das Verfahren und der Testkit beruhen auf dem Nachweis erregerspezifischer PBMC durch die Quantifizierung von CD25 auf der Oberfläche von CD4+/CD45RO+ PBMC. Insbesondere können durch das Verfahren und den Testkit Infektionen durch MAP bereits in der frühen Infektionsphase und bei Jungtieren nachgewiesen werden.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und ein Testkit zur Diagnostik einer Infektion mit dem Bakterium Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP), die die Ursache für die Erkrankung Paratuberkulose ist. Dabei werden erregerspezifische T-Zellen nachgewiesen, welche infizierte Tiere als Reaktion auf die MAP-Infektion bilden. Das Verfahren und das Testkit sind im Besonderen dazu geeignet, infizierte Tiere in der frühen Phase der Infektion (z. B. bei Jungtieren) zu erkennen.
Abkürzungen und Definitionen

CD:

Cluster of differentiation, Differenzierungsmarker an der Oberfläche von Zellen, Oberflächenantigen

ConA:

Concanavalin A

DFZM:

Durchflusszytometrie

DNA:

Deoxyribonucleic acid, Desoxyribonukleinsäure

EDTA:

Ethylendiamintetraacetat

ELISA:

Enzyme-linked Immunosorbent Assay, enzymgekoppelter Immunadsorptionstest

FSC:

Forward Scatter, Vorwärtsstreulicht im Durchflusszytometer

IFN-γ:

Interferon-gamma

MAP:

Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis; Erreger der Erkrankung Paratuberkulose, mutmaßlicher Mitverursacher des Morbus Crohn

MFI:

Mittlere Fluoreszenzintensität

M. phlei:

Mycobacterium phlei

OD:

Optische Dichte

PBMC:

Peripheral blond mononuclear cell, mononukleäre Zelle des peripheren Blutes, primäre bovine mononukleäre Zelle; mononukleäre Leukozyten mit annähernd rundem Zellkern, beispielsweise Monozyten und Lymphozyten, welche sich im Vollblut befinden.

PBS:

Phosphate Buffered Saline, phosphatgepufferte Salzlösung

SSC:

Sidewards Scatter, Seitwärtsstreulicht im Durchflusszytometer

T-Zelle:

T-Lymphozyt

T_H1-Zelle:

Typ1-T-Helferzelle

Vollblut:

Natives peripheres Blut eines Tieres mit allen seinen Bestandteilen. Das Vollblut kann mit einem dem Fachmann bekannten Verfahren gewonnen werden.

WCS:

Whole Cell Sonicate, Ganzzelllysat

Beschreibung des allgemeinen Gebietes der Erfindung
Paratuberkulose ist eine chronische Darmerkrankung bei Wiederkäuern, welche durch das Bakterium Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) verursacht wird. Sie ist vor allem durch eine progrediente granulomatöse Entzündung der Dünndarmwand gekennzeichnet. Die betroffenen Tiere infizieren sich meist innerhalb der ersten Lebenswochen, zeigen aber erst Jahre nach der Infizierung die ersten klinischen Symptome. Wegen dieser lange fehlenden Krankheitszeichen bleibt die Infektion dem Tierhalter verborgen. Im Laufe der sehr langen Inkubationszeit beginnen die infizierten Tiere den Erreger mit dem Kot auszuscheiden, in der Regel in Form einer intermittierenden Ausscheidung. Damit werden die infizierten aber noch nicht offensichtlich erkrankten Tiere zu Ansteckungsquellen für andere Tiere. MAP wird hauptsächlich fäkal-oral übertragen. Die transplazentare Übertragung des Erregers auf das Ungeborene ist ebenso möglich, die Übertragung durch die Milch wird diskutiert.
MAP steht außerdem im Verdacht, bei der als Morbus Crohn bezeichneten Erkrankung ursächlich beteiligt zu sein. Morbus Crohn ist eine unheilbare, chronisch-entzündliche Erkrankung des Verdauungstraktes beim Menschen.
Es besteht daher ein großes gesundheitspolitisches und wirtschaftliches Interesse, alle mit MAP infizierten Tiere möglichst früh zu erkennen, um die Ausbreitung der Erkrankung Paratuberkulose zu reduzieren.
Stand der Technik und dessen Nachteile
Bei einer Infektion mit Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP-Infektion) ist die frühe Infektionsphase durch die Ausbildung einer zellulären Immunantwort gekennzeichnet. Diese wird in erster Linie von CD4⁺ T_H1-Zellen dominiert.
Die derzeit verfügbaren Verfahren zur Diagnostik von MAP werden eingeteilt in direkte Verfahren zum Erregernachweis und in indirekte Verfahren, welche die Reaktion der Körperabwehr eines infizierten Tieres messen. Folgende Verfahren sind bekannt:

– Erregernachweis mittels kulturell-bakteriologische Untersuchung einer Kotprobe eine Tieres: Diese Verfahren gilt als Goldstandard. Es ist sehr zeitaufwendig (erst ca. zwölf Wochen nach der Probenentnahme ist mit einem Ergebnis zu rechnen) und damit auch kostenintensiv. Es ist wenig sensitiv, da erst im fortgeschritten Stadium einer Infektion MAP über den Kot ausgeschieden wird.
– Erregernachweis mittels kulturell-bakteriologische Untersuchung einer Gewebeprobe (beispielsweise aus einem Darmlymphknoten oder einem Darmbioptat) eine Tieres: Es ist sehr zeitaufwendig (erst ca. zwölf Wochen nach der Probenentnahme ist mit einem Ergebnis zu rechnen) und damit auch kostenintensiv. Die Probenentnahme erfordert einen chirurgischen Eingriff am betroffenen Tier und ist somit für die Routinediagnostik nur bedingt tauglich.
– Erregernachweis durch Nachweis MAP-spezifischer DNA in Kotproben mittels PCR-Verfahren: Es existieren verschiedene Verfahrensprotokolle, die sich hinsichtlich der DNA-Isolation und der amplifizierten Gensequenzen deutlich voneinander unterscheiden. Das Verfahren ist wenig sensitiv, da erst im fortgeschrittenen Stadium einer Infektion MAP über den Kot ausgeschieden wird.
– Erregernachweis durch Nachweis MAP-spezifischer DNA in Gewebeproben (beispielsweise aus einem Darmlymphknoten oder einem Darmbioptat) mittels PCR-Verfahren: Es existieren verschiedene Verfahrensprotokolle, die sich hinsichtlich der DNA-Isolation und der amplifizierten Gensequenzen deutlich voneinander unterscheiden. Die Probenentnahme erfordert einen chirurgischen Eingriff am betroffenen Tier und ist somit für die Routinediagnostik nur bedingt tauglich.
– Indirekter Erregernachweis durch den Nachweis MAP-spezifischer Antikörper mittels serologischer Tests: Dieses Verfahren wird mit kommerziell verfügbaren ELISA-Kits durchgeführt. Es ist eher für die Herdendiagnostik als für die Einzeltieruntersuchung geeignet, da die Sensitivität nur bei ca. 50% liegt. Außerdem wird eine Beprobung von Tieren erst ab einem Alter von ca. zwei Jahren als sinnvoll erachtet.
– Indirekter Erregernachweis durch die Quantifizierung von IFN-γ in MAP-Antigen stimulierten Vollblutproben: Mit diesem Verfahren können Tiere frühestens 16 bis 18 Monate nach der Infizierung mit MAP identifiziert werden. Vor allem bei Jungtieren sind die Spezifität und Sensitivität unzureichend, da die IFN-γ-Produktion große individuelle Unterschiede aufweist und in dem Verfahren häufig unspezifische (d. h. falsch positive) Reaktionen auftreten.
– Indirekter Erregernachweis durch den Nachweis von MAP-spezifischen T-Zellen anhand der mit MAP-Antigen stimulierten CD25-Expression auf T-Zellsubpopulationen: Dieses Verfahren ist noch nicht praxistauglich und wird bisher nur im Rahmen von wissenschaftlichen Studien verwendet.

Mit den derzeit verfügbaren Verfahren zur Diagnostik von MAP sind klinisch inapparent infizierte Tiere nur schlecht zu erkennen. Dies gilt vor allem für Jungtiere, welche sich in einem frühen Stadium der Infektion befinden. Als frühes Stadium der MAP-Infektion gilt der Zeitraum bis zum Ende des zweiten Lebensjahres. Die bisherigen Verfahren sind in den frühen Stadien der Infektion nur wenig sensitiv und/oder spezifisch, so dass MAP-infizierte Einzeltiere nicht ausreichend sicher identifiziert werden können.
Es ergeben sich also folgende Konsequenzen aus den Nachteilen im Stand der Technik:

– Obwohl ein Tier schon lange infiziert sein kann, ist sein Infektionsstatus erst zu ermitteln, nachdem bereits die Erregerausscheidung erfolgt und somit das Tier eine Ansteckungsquelle für andere Tiere des Bestandes darstellt. Weiterhin besteht die Gefahr, dass das infizierte Tier auch seinen Nachwuchs bereits angesteckt hat.
– Auf der Ebene eines Tierbestandes bzw. einer Tierherde kann mit den bisher verfügbaren diagnostischen Möglichkeiten die MAP-Freiheit nicht mit ausreichender Sicherheit festgestellt werden. Selbst wenn die serologische und kulturell-bakteriologische Untersuchung der Tiere zu einem negativen Ergebnis führt, kann nicht ausgeschlossen werden, dass es noch infizierte Tiere im Bestand gibt. Dies gilt im Besonderen für die Nachzucht.
– Eine verlässliche Zusicherung der MAP-Freiheit von Tieren, welche in paratuberkulosefreie Tierbestände integriert werden sollen, ist derzeit nicht möglich. Dies ist aber in Hinblick auf die Verhinderung der Weiterverbreitung und der Eindämmung von MAP-Infektionen von sehr großer Bedeutung. Dies gilt insbesondere für die Zertifizierung von Zuchttieren im Rahmen des innergemeinschaftlichen Verbringens und des Exports, die zukünftig von immer mehr Ländern gefordert wird.

Aufgabe
Aufgabe der Erfindung ist daher die Bereitstellung eines praxistauglichen Verfahrens und eines Testkits zur Durchführung des Verfahrens zum Nachweis einer Infektion mit dem Erreger der Paratuberkulose, nämlich des Bakteriums Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in einem Subjekt, bevorzugt in einem Tier wie beispielsweise einem Wiederkäuer, besonders bevorzugt bei einem Rind, einem Schaf oder einer Ziege. Zusätzlich müssen das erfindungsgemäße Verfahren und das Testkit dabei eine möglichst frühe Identifizierung von MAP-infizierten Jungtieren, wie beispielsweise Kälbern, Lämmern oder Zicklein, gewährleisten.
Lösung
Die Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren und durch ein Testkit zur Diagnose einer Infektion mit MAP bei einem Subjekt, bevorzugt bei einem Tier wie beispielsweise einem Rind, einem Schaf oder einer Ziege, welche folgende Schritte umfassen:

(a) Zur Verfügung stellen einer Probe aus einem Subjekt.
(b) Quantifizieren eines Markers in der genannten Probe, wobei der Marker ausgewählt wird aus einer oder mehrerer Komponenten des Systems der zellulären Immunabwehr des zu untersuchenden Subjektes.
(c) Vergleich des/der für die zu untersuchende Probe erhaltenen Ergebnisse/s mit Referenzwerten und/oder den Werten einer Positiv- und/oder einer Negativkontrolle unter Anwendung einer besonderen Auswertungsstrategie.

Bevorzugt ist hierbei das oben genannte Verfahren ein in-vitro-Verfahren.
Der Begriff „zur Verfügung stellen” einer zu untersuchenden Probe, wie hier verwendet, umfasst ein Bereitstellen zumindest einer Probe, mit der das erfindungsgemäße Verfahren durchgeführt werden kann. Dazu gehören beispielsweise die Gewinnung von peripherem Blut mit allen seinen Bestandteilen (Vollblut) durch Venenpunktion und die Behandlung des gewonnenen Vollblutes mit Gerinnungshemmern wie beispielsweise EDTA, Heparin oder Zitrat. Die Durchführung dieses Verfahrensschrittes und die dafür notwendigen Vorrichtungen sind dem Fachmann bekannt.
Der Begriff „Marker” bezeichnet endogene Substanzen oder Zellen wie beispielsweise PBMC, durch dessen Identifizierung und Quantifizierung das Auftreten eines pathophysiologischen Ereignisses in einem Organismus nachgewiesen werden kann, wie beispielsweise eine Infektion mit MAP.
Im Kontext der vorliegenden Erfindung betrifft „Diagnose” die Überprüfung, ob ein Subjekt mit MAP infiziert ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren und das Testkit basieren auf den Nachweis der MAP-spezifischen zellulären Immunität mittels einer durchflusszytometrischen Analyse von mit MAP-Antigen stimulierten Blutzellkulturen, wobei die Blutzellen für die Blutzellkulturen von Tieren gewonnen werden, welche getestet werden sollen. Der Marker für das erfindungsgemäße Verfahren und für das Testkit ist CD25 auf der Oberfläche von CD4⁺/CD45RO⁺ T-Zellen.
Nach der Gewinnung von Vollblut des zu testenden Tieres (mit Hilfe eines dem Fachmann bekannten Blutentnahmeverfahrens) werden PBMC aus der Vollblutprobe in geeigneter Weise isoliert und kultiviert, damit sie für die weiteren Verfahrensschritte zur Verfügung stehen.
Anschließend werden die PBMC mit MAP-spezifischen Antigenen inkubiert. Sofern MAP-antigenspezifische CD4⁺/CD45RO⁺ T-Zellen in der Probe vorhanden sind, werden diese sensibilisiert (aktiviert, stimuliert). In Folge der Sensibilisierung proliferieren die antigenspezifischen Zellen und exprimieren vermehrt das Protein CD25, das in der Zellmembran der Zellen verankert wird und nach außen gerichtet ist.
Zum Nachweis dieser spezifischen Oberflächenantigene auf den PBMC werden diese in geeigneter Weise markiert, beispielsweise durch eine Immundekoration mit monoklonalen Antikörpern, welche gegen CD4, CD45RO und CD25 gerichtet sind. Zur Sichtbarmachung der Bindung der jeweiligen Antikörper an CD4, CD45RO und CD25 können die Antikörper direkt mit jeweils geeigneten Substanzen wie beispielsweise mit unterschiedlichen Fluorochromen konjugiert sein, oder es werden in geeigneter Weise markierte, z. B. fluorochromkonjugierte Sekundärantikörper zur Markierung der Primärantikörper verwendet.
Zur quantitativen Erfassung der markierten PBMC kann ein durchflusszytometrisches Verfahren eingesetzt werden, in dem das Fluoreszenzsignal der einzelnen PBMC detektiert und quantifiziert wird.
In eigenen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass PBMC von MAP-infizierten Tieren nach der erfindungsgemäßen Sensibilisierung mit MAP-Antigen einen höheren Gehalt von CD4⁺/CD45RO⁺ T-Zellen aufweisen, die eine signifikant erhöhte CD25-Expression zeigen, als antigenstimulierte PBMC von nicht infizierten Tieren. Damit kann eine Unterscheidung zwischen MAP-infizierten Tieren und nicht infizierten Tieren getroffen werden, welche mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens und Testkits bereits 12 bis 16 Wochen nach einer Infektion mit MAP möglich ist (Ergebnisse aus Untersuchungen an experimentell infizierten Tieren). Das erfindungsgemäße Verfahren und das erfindungsgemäße Testkit ermöglichen also auch die Diagnostik einer MAP-Infektion bei Jungtieren wie beispielsweise bei Kälbern, Lämmern oder Zicklein.
Vorteilhaft wird das Verfahren mit Hilfe eines Testkits durchgeführt, um den Materialverbrauch und die benötigte Probenmenge zu minimieren. Das erfindungsgemäße Testkit beinhaltet in einer bevorzugten Ausführungsform eine Mikrotiterplatte, bevorzugt eine 96-Well-Mikrotiterplatte, mit wenigstens je einem Well, MAP-Antigen, ggf. Kontrollantigen (z. B. aus Mycobacterium phlei, M. phlei) und ConA, sowie für den Nachweis der erfolgten Stimulierung von PBMC geeignete (Primär-)Antikörper, vorzugsweise geeignete Sekundärantikörper sowie geeignete Medien und Puffer.
Zur Qualitätskontrolle und zur Auswertung der Messung werden vorteilhaft eine Negativkontrolle (Mediumkontrolle und/oder Kontrollantigen) und eine Positivkontrolle (Stimulationskontrolle) parallel zur den Testansätzen mitgeführt. Besonders vorteilhaft für die Negativkontrolle ist die Inkubation von PBMC ohne Zusätze wie beispielsweise der MAP-Antigenpräparation und/oder die Inkubation mit einem Kontrollantigen wie beispielsweise die Inkubation mit M. phlei. Für die Positivkontrolle ist die Inkubation mit ConA besonders vorteilhaft.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform werden die gemessenen Ergebnisse mit Hilfe einer Auswertungsstrategie so ausgewertet, dass ein möglichst sensitives und spezifisches Endergebnis erzielt wird.
Gemäß einer detailierteren Beschreibung des erfindungsgemäßen Verfahrens und des Testkits können die oben angeführten Schritte (a), (b) und (c) wie folgt durchgeführt werden:
Schritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens und Testkits („Zur Verfügung stellen einer Probe”):
Als besonders geeignete Probe hat sich Vollblut erwiesen. Die Blutentnahme erfolgt in geeigneter Weise mit einem dem Fachmann bekannten Verfahren wie beispielsweise durch Punktion der Vena jugularis mit einer Kanüle. Um die Gerinnung des so gewonnenen Vollblutes zu hemmen, wird dem Vollblut ein geeigneter Gerinnungshemmer zugesetzt, beispielsweise Heparin, EDTA oder Zitrat. Besonders geeignet ist die Sammlung des Vollblutes in Spritzen, die bereits mit 0,2 ml einer 3,8%igen Natriumcitrat-Lösung pro ml Vollblut befüllt wurden. Für das erfindungsgemäße Verfahren und das Testkit werden 5–10 ml Vollblut benötigt.
Die Probe soll möglichst bald dem weiteren Verfahren zugeführt werden, jedenfalls innerhalb von 24 Stunden nach der Probengewinnung. Bis dahin soll die Probe bei Raumtemperatur gelagert werden, ein Kühlung soll vermieden werden.
Schritt (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens und Testkits („Messung eines Markers in der Probe”):
Zur Messung eines Markers in der Probe sind mehrere Unterschritte notwendig. Die Zusammensetzung der verwendeten, besonders vorteilhaften Lösungen sind im Anhang detailliert dargelegt
Unterschritt (b1): Antigenpräparation (WCS-MAP)
Ein wesentliches Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens und des Testkits ist die Stimulierung von PBMC aus der Probe mit einer MAP-Antigenpräparation. Dazu muss eine Kultur von MAP in einer geeigneten Form angelegt und Antigen gewonnen werden.
Als besonders vorteilhaft hat sich dazu der MAP-Referenzstamm MAP-K10 erwiesen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der MAP-Referenzstamm MAP-K10 in einem Flüssigkulturmedium angezüchtet, das sich aus Middlebrook 7H9 Flüssigmedium (4,7 g/l), Mycobactin J (2 mg/l) und Dubos Oleic Albumin Complex (100 ml/l) zusammensetzt. Die Wachstumskinetik der MAP wird kontrolliert, vorteilhaft mittels OD_660nm-Messungen, damit die angezüchteten MAP für die Stimulierung der PBMC zu demjenigen Zeitpunkt der Wachstumsphase verwendet werden, in dem sie ihre höchste antigene Eigenschaft aufweisen. Als besonders vorteilhaft hat es sich erwiesen, die kultivierten MAP bei Erreichen der log-Phase für die Stimulierung der PBMC einzusetzen.
Zur Gewinnung der MAP aus dem Kulturmedium kann die Zentrifugation oder ein anderes geeignetes Verfahren eingesetzt werden.
Als Alternative können auch andere MAP-Stämme, beispielsweise solche mit einer höheren Virulenz verwendet werden.
Eine weitere Alternative ist die Verwendung eines standardisierten MAP-Antigens, welches für das Testkit verwendet wird. Besonders vorteilhaft werden einzelne MAP-spezifische Antigene wie z. B. Proteine oder Peptide verwendet.
Unterschritt (b2): Herstellung eines WCS (WCS-MAP)
Anschließend an die Gewinnung von MAP aus dem Kulturmedium werden die MAP zu einem Ganzzelllysat (WCS) weiterverarbeitet, damit die Stimulierung der PBMC in geeigneter Weise durchgeführt werden kann. Als vorteilhaft hat sich dabei die Methode von J. Pollock (National Animal Disease Center, IA, USA, „Antigen Preparation NADC") erwiesen. Eine Konzentration von 1,5 μg pro ml PBMC-Medium war für das erfindungsgemäße Verfahren besonders vorteilhaft. Ein bevorzugtes PBMC-Medium besteht aus 89 ml RPMI 1640, 10 ml fetales Kälberserum 10%-ig, 1 ml Penicillin/Streptomycin 1%-mg und 300 μl 2-Mercaptoethanol 1 mM.
Die Antigenität des hergestellten WCS muss überprüft werden, um trotz unterschiedlicher Chargen vergleichbare Werte mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und mit dem Testkit zu erhalten. Dies kann als Messung (nach dem hier beschriebenen Verfahren) von Kontrollproben von Tieren, die bekanntermaßen mit MAP infiziert sind, erfolgen.
Unterschritt (b3): Isolierung von PBMC
Für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens und des Testkits werden PBMC benötigt. Vorteilhaft werden diese aus der Probe gewonnen, beispielsweise durch eine dem Fachmann bekannte Zentrifugation über einen Ficoll^®-Gradienten. Als vorteilhaft hat es sich erwiesen, als Probe ungerinnbar gemachtes Vollblut zu verwenden. Für die Durchführung der Zentrifugation über einen Ficoll^®-Gradienten ist es vorteilhaft, die Probe vorher zu verdünnen (beispielsweise im Verhältnis 1:1), beispielsweise mit einem Puffer, besonders vorteilhaft mit PBS/EDTA-Puffer. Ein bevorzugter PBS/EDTA-Puffer besteht aus 14,2 g Na₂HPO₄ × H₂O, 2 g KH₂PO₄, 20 g Dinatrium-EDTA × H₂O, 2 g KCl, 80 g NaCl und Aqua Bidest auf 10.000 ml, eingestellt mit 5 N NaOH auf einen pH von 7,4. Nach der Verdünnung wird die Probe auf einen Ficoll^®-Gradienten aufgeschichtet und so zentrifugiert (vorteilhaft über 45 min bei 800 × g und 20°C, ohne Bremse), dass sich die PBMC in der Interphase des Gradienten ansammeln und somit abpipettiert werden können. Im Anschluss erfolgt ein Waschschritt in PBS/EDTA-Puffer mit anschließender Zentrifugation (vorzugsweise über 8 min bei 257 × g und 20°C) und Verwerfen des Überstandes. Um eine möglichst homogene PBMC-Fraktion zu erreichen ist es vorteilhaft, ggf. vorhandene andere Probenbestandteile, wie beispielsweise Erythrozyten zu entfernen. Bevorzugt wird dies durch Inkubation (beispielsweise über 5 min bei Raumtemperatur) des Zellpellets in einem geeigneten Erythrozytenlysis-Puffer erreicht. Ein bevorzugter Erythrozytenlysis-Puffer besteht aus 8,26 g NH₄Cl, 1,09 g NaHCO₃, 0,037 g Na₂EDTA × 2H₂O und Aqua Bidest ad 1000 ml. Im Anschluss erfolgen zwei Waschschritte in PBS/EDTA-Puffer bzw. PBS-Puffer mit anschließender Zentrifugation (beispielsweise über 7 min bei 212 × g und 20°C) und Verwerfen des Überstandes. Das Pellet wird dann in einem geeigneten Medium, beispielsweise PBMC-Medium resuspendiert. Als vorteilhaft hat es sich erwiesen, die Zellkonzentration der PBMC zu bestimmen, beispielsweise mit einer Zellzählkammer oder einem automatisierten Zellzählverfahren) und mittels Zusatz eines geeigneten Mediums, beispielsweise PBMC-Medium die Suspension auf eine Endkonzentration von 3–4 × 10⁶ PBMC pro ml Medium einzustellen.
Alternativ kann für das erfindungsgemäße Testkit die Zellzählung entfallen. Als vorteilhaft hat sich erwiesen, eine Ficoll^®-Zentrifugation in einem 15 ml Zentrifugenröhrchen durchzuführen, welches mit ca. 6 ml Vollblut (vorzugsweise 1:1 verdünnt mit PBS/EDTA-Puffer) überschichtet wird, damit eine Konzentration von PBMC von ca. 1 × 10⁷ Zellen/ml erreicht wird. Diese Konzentration von PBMC ist ausreichend, um drei Ansätze (Probenansatz mit MAP-Antigen, Positivkontrolle, Negativkontrolle) zu beschicken.
Alternativ zur Isolation von PBMC mittels Ficoll^®-Gradient können PBMC auch durch eine Erythrozytenlyse der Vollblutprobe mit anschließender Zentrifugation der Probe isoliert werden.
Unterschritt (b4): Aussaat von PBMC und Stimulation mit der Antigenpräparation (Testansatz)
Zur Vorbereitung werden je 500 μl der Zellsuspension (PBMC in PBMC-Medium) auf mehrere, vorzugsweise vier geeignete Probengefäße (beispielsweise 1,5 ml-Reaktionsgefäße) aufgeteilt. Dann werden die Antigenpräparationen aus Unterschritt (b1) zugegeben (siehe dazu Unterschritt (b5)). Zur weiteren Inkubation hat es sich als besonders vorteilhaft erwiesen, alle genannten Ansätze vor der Inkubation in geeignete Gefäße zu überführen, vorzugsweise in eine 96-Well-Mikrotiterplatte mit einem rundförmigen Wellboden. Für die Inkubation hat sich als vorteilhaft erwiesen, je Ansatz 150 μl PBMC-Suspension in einem Doppelansatz auszusäen.
Unterschritt (b5): Stimulation von PBMC mit der Antigenpräparation (Testansatz)
Die nach Unterschritt (b4) ausgesäten PBMC werden so mit der Antigenpräparation aus Unterschritt (b1) inkubiert, dass die PBMC spezifisch auf die in der Antigenpräparation vorhandenen MAP-Antigene reagieren können. Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, die Antigenpräparationen (WCS-MAP bzw. WCS-M. phlei) mit einer Endkonzentration von 1,5 μg/ml PBMC-Suspension (entspricht 0,75 μg pro 500 μl PBMC-Suspension) zuzugeben.
In einer bevorzugten Alternative werden parallel zu dem Probenansatz eine Positivkontrolle (Stimulationskontrolle) und eine oder mehrere Negativkontrollen (Mediumkontrolle, Kontrolle durch Inkubation mit WCS-M. phlei) angesetzt, welche im weiteren Verfahren analog zum Probenansatz behandelt werden.
Die Negativkontrolle dient zum Nachweis, dass die eingesetzten PBMC ohne eine Stimulierung eine andere CD-Expression (niedrige CD25-Expression auf CD4⁺/CD45RO⁺-Zellen) zeigen. Als Negativkontrollen dient einerseits die Mediumkontrolle (Ansatz ohne Zusätze) als auch die Inkubation mit WCS-M. phlei, alternativ wird als Negativkontrolle nur die Inkubation mit WCS-M. phlei eingesetzt. Bei einem MAP-positiven Tier kommt es nach der Inkubation mit WCS-MAP zu einer erhöhten CD-Expression im Vergleich zu den Negativkontrollen.
Die Positivkontrolle (Stimulationskontrolle mit ConA) dient zum Nachweis, ob die eingesetzten PBMC sich überhaupt stimulieren lassen. Als vorteilhaft hat sich dabei eine Endkonzentration von 2,5 μg ConN/ml PBMC-Suspension erwiesen.
Nach Aussaat der PBMC in die dafür vorgesehenen Gefäße und Zugabe der Stimulantien schließt sich eine Inkubation in einem Zellkulturbrutschrank an, vorzugsweise über eine Dauer von fünf Tagen bei einer Temperatur von 37°C, einer 5%-igen CO₂-Atmosphäre und einer geeigneten Luftfeuchtigkeit. Als besonders vorteilhaft hat sich erwiesen, alle genannten Ansätze anschließend in geeignete Gefäße zu überführen, vorzugsweise in eine 96-Well-Mikrotiterplatte mit V-förmigen Wellboden.
Unterschritt (b6): Immunmarkierung der PBCM im Probenansatz und Sichtbarmachung der Bindung der jeweiligen Antikörper an CD4, CD45RO und CD25
Um eine antigenspezifische Stimulierung der PBMC nachzuweisen, wird eine Nachweismethode eingesetzt, die auf der Sichtbarmachung einer spezifischen Antikörper-Antigenreaktion beruht. Als Antigene fungieren dabei CD4, CD45RO und CD25, welche von den PBCM exprimiert werden. Als (Primär-)Antikörper fungieren dabei anti-CD4, anti-CD45RO und anti-CD25-Antikörper. Diese Antikörper können entweder direkt mit einer geeigneten Markierung (beispielsweise Fluorochrom) konjugiert sein oder es wird die Antigen-Antikörperreaktion mittels eines geeigneten Sekundärantikörpers nachgewiesen. Folgende Ausführungsbeispiele sind für die Durchführung des Unterschrittes (b6) besonders vorteilhaft:

– Zentrifugation der verwendeten Inkubationsgefäße wie z. B. der Mikrotiterplatten nach Abschluss der Inkubation, beispielsweise bei 400 × g über drei Minuten und Verwerfen des Überstandes.
– Verwendung von tierartspezifischem anti-CD4-Antikörper, beispielsweise der Klon IL-A11 als (Primär-)Antikörper für die Bindung an CD4.
– Verwendung von tierartspezifischem anti-CD45RO-Antikörper, beispielsweise der Klon IL-A116 als (Primär-)Antikörper für die Bindung an CD45RO.
– Verwendung von tierartspezifischem anti-CD25-Antikörper, beispielsweise der Klon CACT116A als (Primär-)Antikörper für die Bindung an CD25.
– Alternativ ist die Verwendung eines Gemisches von tierartspezifischem anti-CD4-Antikörper, anti-CD45RO-Antikörper und anti-CD25-Antikörper, beispielsweise die Klone IL-A11, IL-A116 und CACT116A als (Primär-)Antikörper für die Bindung an CD4, CD45RO und CD25 besonders vorteilhaft. Dieses Gemisch wird vorteilhaft mit PBS (enthält zusätzlich 1% Bovines Serum Albumin und 0,01% NaN₃) in einem geeigneten Verhältnis verdünnt.
– In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform wird mit 50 μl des mit PBS (enthält zusätzlich 1% Bovines Serum Albumin und 0,01% NaN₃) verdünnten Gemisches von tierartspezifischem anti-CD4-Antikörper, anti-CD45RO-Antikörper und anti-CD25-Antikörper die zentrifugierte PBCM-Suspension nach Verwerfen des Überstandes resuspendiert.
– Nach einem weiteren Inkubationsschritt (vorteilhaft über 15 Minuten bei Raumtemperatur) werden alle Testansätze zentrifugiert (vorteilhaft bei 400 × g über drei Minuten) und die Überstände verworfen.
– Als besonders vorteilhafter Sekundärantikörper für den Nachweis der Bindung der (Primär-)Antikörper an die Antigene wird ein Gemisch aus spezifischem anti-IgG2a-APC-Konjugat-Sekundärantikörper, anti-IgG3-FITC-Konjugat-Sekundärantikörper und anti-IgG1-PE-Konjugat-Sekundärantikörper verwendet. Besonders vorteilhaft ist eine geeignete Verdünnung des spezifischen anti-IgG2a-APC-Konjugat-Sekundärantikörpers, des spezifischen anti-IgG3-FITC-Konjugat-Sekundärantikörpers und des spezifischen anti-IgG1-PE-Konjugat-Sekundärantikörpers mit PBS (enthält zusätzlich 1% Bovines Serum Albumin und 0,01% NaN₃). Vorteilhaft ist die Zugabe von 50 μl des Sekundärantikörpergemisches pro Ansatz und eine anschließende Inkubation über 15 Minuten bei Raumtemperatur.
– Sofern eine Inkubation mit Sekundärantikörpern durchgeführt wurde, werden anschließend als weiterer vorteilhafter Schritt werden anschließend alle Ansätze zentrifugiert (beispielsweise bei 400 × g über drei Minuten) und anschließend der Überstand verworfen.
– Als weiterer vorteilhafter Schritt wird anschließend ein Waschschritt durchgeführt, bevorzugt indem zu allen Ansätzen 100 μl PBS (enthält zusätzlich 1% Bovines Serum Albumin und 0,01% NaN₃) hinzugefügt wird und somit die PBCM resuspendiert werden. Diese Suspension wird erneut zentrifugiert (beispielsweise bei 400 × g über drei Minuten) und anschließend der Überstand verworfen.

Unterschritt (b7): Messung der Antikörper-Antigenreaktion
Die Messung der Antikörper-Antigenreaktion beruht auf der Sichtbarmachung der Bindung der jeweiligen Antikörper an CD4, CD45RO und CD25, welche von den nach Unterschritt (b4) ausgesäten PBMC exprimiert werden, nachdem die PBMC gemäß Unterschritt (b5) mit der Antigenpräparation aus Unterschritt (b1) inkubiert wurden. Vorteilhaft erfolgt die Sichtbarmachung der Bindung der jeweiligen Antikörper an CD4, CD45RO und CD25 mit Hilfe eines Immunfluoreszenzverfahrens und anschließender Messung (Analyse) der Fluoreszenz mittels eines Durchflusszytometers.
Folgende Ausführungsbeispiele sind für die Durchführung des Unterschrittes (b7) besonders vorteilhaft:

– Anschließend zum letzten Waschschritt aus Unterschritt (b6) werden alle Ansätze mit 100 μl PBS resuspendiert.
– Anschließend werden alle Ansätze in für die Durchführung der DFZM geeignete Gefäße überführt. Besonders vorteilhaft ist die Verwendung von Messröhrchen, welche bereits mit 150 μl PBS vorgefüllt sind. Alternativ können bei dafür geeigneten Durchflusszytometern die bevorzugten 96-Well-Mikrotiterplatten direkt für die Messung im Durchflusszytometer verwendet werden.
– Das verwendete Durchflusszytometer soll gemäß den Herstellerangaben kalibriert werden.
– Bei dem verwendeten Durchflusszytometer soll die Messung der unterschiedlichen Fluoreszenzen aufeinander abgestimmt sein.
– Bei der Darstellung der Parameter FSC und SSC ist es vorteilhaft, die morphologisch intakten Lymphozyten und Lymphoblasten in einem Auswertefenster (Gate) auszuwählen.
– Zur Erzielung eines aussagekräftigen Messergebnisses ist es vorteilhaft, mindestens 10.000 Ereignisse, besonders vorteilhaft mindestens 15.000 Ereignisse pro Probe in dem Auswertefenster zu messen.
– Zur Erzielung eines aussagekräftigen Messergebnisses ist es weiterhin vorteilhaft, erst die morphologisch intakten Lymphozyten und Lymphoblasten in einem Auswertefenster (Gate) auszuwählen und anschließend die CD4⁺/CD45RO⁺-PBMC aus der Gesamtheit der morphologisch intakten Lymphozyten und Lymphoblasten auszuwählen.
– Als besonders vorteilhaft für die Erzielung eines aussagekräftigen Messergebnisses wird die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) des CD25-Signals der CD4⁺/CD45RO⁺-PBMC als Parameter für die Auswertung der Messung verwendet.

Schritt (c) des erfindungsgemäßen Verfahrens und Testkits („Auswertung der Messung”):
Die Auswertung der Messung beruht auf der Erkenntnis, dass sich PBMC von MAP-infizierten Subjekten mit der nach Unterschritt (b1) hergestellten Antigenpräparation stimulieren lassen und somit überraschenderweise ein anderes Expressionsmuster von CD25 auf den CD4⁺/CD45RO⁺-PBMC zeigen als PBMC von nicht infizierten Subjekten. Dieses unterschiedliche Expressionsmuster wird mit den im Schritt (b) beschriebenen Verfahrensschritten nachgewiesen und stellt die Grundlage für die Auswertung der Messung gemäß Schritt (c) dar.
Für die Auswertung der Messung sind mehrere Unterschritte notwendig.
Unterschritt (c1): Auswertung der Positivkontrolle zum Nachweis, dass die verwendeten PBMC stimulierbar waren
Für die Auswertung der Positivkontrolle (Ansätze mit ConA nach Unterschritt (b5)) sind folgende weitere Unterschritte notwendig:

– Die MFI des CD25-Signals auf den CD4⁺/CD45RO⁺-Zellen der Ansätze für die Positivkontrolle wird gemessen.
– Die MFI des CD25-Signals auf den CD4⁺/CD45RO⁺-Zellen der Ansätze für die Negativkontrolle wird gemessen.
– Der Quotient aus den beiden MFI wird gebildet.
– Liegt der Quotient über einem bestimmten Grenzwert, beispielsweise bei zwei oder höher (d. h. ConA bewirkte eine Stimulation der PBMC um mindestens das Zweifache), dann wird das Ergebnis der Positivkontrolle als positiv bewertet. Die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens und der erfindungsgemäße Testkit können als valide eingestuft werden und die Messergebnisse können für die weitere Auswertung verwendet werden.

Unterschritt (c2): Auswertung der MFI des CD25-Signals der CD4⁺/CD45RO⁺-PBMC nach Inkubation mit der Antigenpräparation (WCS-MAP) nach Unterschritt (b1)
Für die Auswertung der Probenansätze sind folgende Unterschritte notwendig:

– Die MFI des CD25-Signals auf den CD4⁺/CD45RO⁺-PBMC der Probenansätze wird gemessen.
– Die MFI des CD25-Signals auf den CD4⁺/CD45RO⁺-PBMC der Ansätze für die Negativkontrolle werden gemessen.
– Der Quotient aus den beiden MFI wird gebildet.
– Liegt der Quotient über einem bestimmten Grenzwert, beispielsweise bei zwei oder höher (d. h. die Antigenpräparation nach Unterschritt (b1) bewirkt eine Stimulation der PBMC in den Probenansätzen um mindestens das 1,7-fache), dann gilt das getestete Subjekt als MAP-positiv und es liegt eine Infektion mit MAP vor.
– Liegt der Quotient unter einem bestimmten Grenzwert, beispielsweise unter 1,7 (d. h. die Antigenpräparation nach Unterschritt (b1) bewirkt keine Stimulation der PBMC in den Probenansätzen), dann gilt das getestete Subjekt als MAP-negativ und es liegt keine Infektion mit MAP vor.

Fig. 1: Schematische Darstellung der Vorgehensweise bei der Bestimmung der MFI des CD25-Signals auf CD4⁺/CD45RO⁺-PBMC anhand von „dotplot”-Darstellungen [oben links und rechts] und einem Histogramm [unten rechts] der durchflusszytometrischen Messungen sowie Berechnung des MAP-spezifischen Reaktionstiters [unten links]
Ausführungsbeispiele
Ausführungsbeispiel 1: Verfahren betreffend das zur Verfügung stellen einer Probe nach Schritt (a), zur Messung eines Markers nach Schritt (b) und zur Auswertung der Messung nach Schritt (c).
Ausführungsbeispiel 2: Testkit zur Durchführung des Verfahrens betreffend das zur Verfügung stellen einer Probe nach Schritt (a), zur Messung eines Markers nach Schritt (b) und zur Auswertung der Messung nach Schritt (c), beinhaltend folgende dafür notwendigen Materialien:

– Geeignete Gefäße, vorzugsweise 96-Well-Mikrotiterplatten.
– MAP-Antigen (vorzugsweise WCS-MAP)
– ConA
– Geeignete (Primär-)Antikörper, vorzugsweise anti-CD4-, anti-CD45RO- und anti-CD25-Antikörper. Alternativ können diese Antikörper direkt mit einer geeigneten Markierung (Fluorochromen) versehen sein, damit die Bindung dieser (Primär-)Antikörper an die korrespondierenden Antigene (Antigen-Antikörperreaktion) mittels einer geeigneten Nachweismethode (beispielsweise DFZM) nachgewiesen werden kann.
– Alternativ und bevorzugt geeignete Sekundärantikörper zum Nachweis der Bindung der (Primär-)Antikörper an den korrespondierenden Antigenen (Antigen-Antikörperreaktion) mittels einer geeigneten Nachweismethode (beispielsweise DFZM). Vorzugsweise sind diese Sekundärantikörper mit Fluorochromen konjugiert.
– Geeignete Puffer und Medien, beispielsweise Erythrozytenlysis-Puffer, PBMC-Medium, PBS, PBS/EDTA.

Abbildungslegende
1 zeigt die Dotplots der durchflusszytometrischen Messungen sowie die Auswertung der MFI des CD25-Signals der CD4⁺/CD45RO⁺-PBMC gemäß Unterschritt (c3). In dem Dotplot FSC vs. SSC werden die morphologisch intakten Lymphozyten und Lymphoblasten ausgewählt (Region 1, R1). Dann werden in einem weiteren Dotplot die CD4⁺/CD45RO⁺-PBMC der Region 1 ausgewählt. Von diesen Zellen wird nun die MFI des CD25-Signals mit der MFI des CD25-Signals der Negativkontrolle (Mediumkontrolle) in ein Verhältnis gesetzt, um eine Aussage über den MAP-spezifischen Reaktionstiter zu erhalten. Es ist zu beachten, dass bei der Berechnung des MAP-spezifischen Reaktionstiters auch die Werte nach Inkubation mit WCS-M. phlei als alternative oder zusätzliche Negativkontrolle eingesetzt werden können.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Nicht-Patentliteratur

J. Pollock (National Animal Disease Center, IA, USA, „Antigen Preparation NADC”) [0033]

Claims

Verfahren zum Nachweis einer Infektion mit Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) in einem Subjekt, vorzugsweise in einem Wiederkäuer, gekennzeichnet durch folgende Schritte: (a) Zur Verfügung stellen einer Probe aus einem Subjekt. (b) Quantifizieren eines Markers in der genannten Probe, wobei der Marker ausgewählt wird aus einer oder mehrerer Komponenten des Systems der zellulären Immunabwehr des zu untersuchenden Subjektes. (c) Vergleich des/der für die zu untersuchende Probe erhaltenen Ergebnisse/s mit Referenzwerten und/oder den Werten einer Positiv- und/oder einer oder mehrerer Negativkontrolle/n unter Anwendung einer besonderen Auswertungsstrategie.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (a) als Probe Vollblut verwendet wird, dem zur Hemmung der Gerinnung ein geeigneter Gerinnungshemmer zugesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt (b) folgende Unterschritte umfasst: (b1) Antigenpräparation (b2) Herstellung eines WCS (MAP-WCS und M. phlei-WCS (b3) Isolierung von PBMC (b4) Aussaat von PBMC in parallele Test- und Kontrollansätze (b5) Parallele Stimulation von PBMC mit der Antigenpräparation (Testansatz) mit ConA (Positivkontrollansatz) und Medium (Negativkontrollansatz) (b6) Immunmarkierung der PBCM-Suspension und Sichtbarmachung der Bindung der jeweiligen Antikörper (b7) Messung der Antikörper-Antigenreaktionen
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt (c) folgende Unterschritte aufweist: (c1) Auswertung der Positiv- und Negativkontrollen (c2) Auswertung der MFI des CD25-Signals der CD4⁺/CD45RO⁺-PBMC
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass im Unterschritt (b1) je eine Kultur von MAP sowie von M. phlei in einer geeigneten Form angelegt und gewonnen wird, bevorzugt in der log-Phase der Wachstumsphase der Bakterien.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass im Unterschritt (b2) die im Unterschritt (b1) gewonnenen MAP-Kulturen zu einem Ganzzelllysat (WCS) weiterverarbeitet werden.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass im Unterschritt (b3) aus dem gemäß Schritt (a) ungerinnbar gemachten Vollblut PBMC isoliert werden.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass im Unterschritt (b4) die in Unterschritt (b3) isolierten PBMC in ein geeignetes Gefäß verbracht werden.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass im Unterschritt (b5) die nach Unterschritt (b4) ausgesäten PBMC so mit der Antigenpräparation aus Schritt (b1) inkubiert werden (Testansatz), dass die PBMC spezifisch auf die in der Antigenpräparation vorhandenen MAP-Antigene reagieren können. Parallel zu dem Testansatz werden eine Positivkontrolle (Stimulationskontrolle) und eine oder mehrere Negativkontrolle/n (Mediumkontrolle, Kontrolle mit WCS-M. phlei) angesetzt, welche im weiteren Verfahren analog zum Testansatz behandelt werden.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass im Unterschritt (b6) eine Immundekoration der PBCM im Testansatz sowie in der Positivkontrolle und in der/den Negativkontrolle/n durchgeführt wird, um die Bindung der jeweiligen Antikörper an CD4, CD45RO und CD25 sichtbar zu machen, wobei als Antigene CD4, CD45RO und CD25, welche von den PBMC exprimiert werden, fungieren und als (Primär-)Antikörper anti-CD4, anti-CD45RO und anti-CD25 fungieren.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass im Unterschritt (b7) die Antikörper-Antigenreaktion mit Hilfe eines geeigneten Verfahrens, bevorzugt mit Hilfe eines Durchflusszytometers gemessen wird, nachdem die Bindung der jeweiligen Antikörper anti-CD4, anti-CD45RO und anti-CD25 an CD4, CD45RO und CD25 mit einer geeigneten Markierung sichtbar gemacht wurde.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass im Unterschritt (c1) die Positivkontrolle ausgewertet wird, indem die MFI des CD25-Signals auf den CD4⁺/CD45RO⁺-PBMC der Ansätze für die Positivkontrolle und die MFI des CD25-Signals auf den CD4⁺/CD45RO⁺-PBMC der Ansätze für die Negativkontrolle/n gemessen werden und der Quotient aus den beiden MFI gebildet wird.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass im Unterschritt (c2) die Testansätze ausgewertet werden, indem die MFI des CD25-Signals auf den CD4⁺/CD45RO⁺-PBMC der Testansätze und die MFI des CD25-Signals auf den CD4⁺/CD45RO⁺-PBMC der Ansätze für die Negativkontrolle/n gemessen werden und der Quotient aus den beiden MFI gebildet wird.
Testkit zum Nachweis einer Infektion mit Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) in einem Subjekt gemäß dem Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch folgende Materialien: – Gefäße, – MAP-Antigen, – M. phlei-Antigen, – PBMC, – ConA, – (Primär-)Antikörper, – Sekundärantikörper zum Nachweis der Bindung der (Primär-)Antikörper an den korrespondierenden Antigenen (Antigen-Antikörperreaktion), – Geeignete Puffer und Medien
Testkit nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass – als Gefäße 96-Well-Mikrotiterpaltten verwendet werden – als MAP-Antigen ein WCS-MAP verwendet wird – als M. phlei-Antigen ein WCS-M. phlei verwendet wird – als (Primär-)Antikörper spezifische anti-CD4, anti-CD45RO und anti-CD25-Antikörper verwendet werden – als Sekundärantikörper spezifische anti-IgG2a-APC-Konjugat-Antikörper, anti-IgG3-FITC-Konjugat-Antikörper und anti-IgG1-PE-Konjugat-Antikörper verwendet werden.
Testkit nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass entweder die (Primär-)Antikörper oder die Sekundärantikörper zum Nachweis der Antigen-Antikörperreaktion mit Fluorochromen konjugiert sind.