CN116003618A

CN116003618A - 一种检测表达非洲猪瘟抗原蛋白的嵌合prrsv的抗体及其应用

Info

Publication number: CN116003618A
Application number: CN202211454942.8A
Authority: CN
Inventors: 高飞; 童光志; 李国新; 童武; 李丽薇; 周艳君; 姜一峰; 郑浩; 虞凌雪; 刘长龙
Original assignee: Shanghai Veterinary Research Institute CAAS
Current assignee: Shanghai Veterinary Research Institute CAAS
Priority date: 2022-11-21
Filing date: 2022-11-21
Publication date: 2023-04-25

Abstract

本发明提供一种有效区分嵌合非洲猪瘟病毒p1217蛋白的猪繁殖与呼吸综合征病毒的疫苗株和野生毒株的抗体及其应用，可以区分嵌合疫苗rPRRSV‑p1217、野生型的非洲猪瘟和PRRSV，所述纳米抗体具有较强的抗原特异性，仅与表达非洲猪瘟病毒(ASFV)p1217蛋白的猪繁殖与呼吸综合征病毒rPRRSV‑p1217发生抗原抗体反应，与亲本病毒并没有相应的亲和反应。可以有效的区分疫苗株和野生型，便于对疫苗株进行监控，提高疫苗的安全性和可控性。

Description

一种检测表达非洲猪瘟抗原蛋白的嵌合PRRSV的抗体及其应用

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体地说，涉及一种检测表达非洲猪瘟抗原蛋白的嵌合PRRSV的抗体及其应用。

背景技术

ASFV是感染家猪或者野猪引起的一种急性、烈性、出血性，高度接触性传染病。其特征是病程短、高热和出血性病变，急性感染死亡率高达100％。严重威胁全球养猪业。目前尚没有有效的疫苗和治疗方法。ASF疫情使我国生猪存栏量和出栏量下降20％-50％，许多猪场因ASF疫情完全覆没，严重削弱了我国猪肉的有效供给，导致我国生猪和猪肉价格均出现翻番。ASF的病原ASFV是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属的唯一成员，为大型双链DNA病毒，主要在巨噬细胞中复制，其基因组约170-193kb，含有150-167个ORF，编码150-200种蛋白质。ASFV粒子直径约为200nm，呈20面体结构，由多层同心圆结构组成，由内到外依次是类核(Nucleoid)、核壳(Core shell)、内囊膜(Inner envelope)、衣壳(Capsid)和外囊膜(External envelope)。

ASFV的p12蛋白是ASFV感染晚期表达的膜蛋白，由O61R基因编码，共186nt，其分子量大小约为6.7kD。其C-末端区域富含半胱氨酸的结构域，参与病毒的吸附。有学者通过免疫电子显微镜发现，该蛋白位于病毒粒子层，细胞表面的膜蛋白是ASFV的受体。在病毒侵染细胞时，可吸附细胞膜，使病毒进入细胞内。在机体外，p12蛋白的抗体可阻断ASFV侵入宿主细胞。另外，利用HEK293细胞表达p12蛋白，纯化后免疫猪能产生针对p12的特异性抗体，表明p12具有一定的免疫原性。另一方面，ASFV的P17蛋白是ASFV表达的晚期膜蛋白，由D117L基因编码，核苷酸序列共354nt，编码蛋白大小为13.1kD。位于病毒内膜的跨膜蛋白。与早期膜蛋白p1217一样，p17对于病毒活力至关重要，能促进ASFV病毒的二十面体颗粒形成。若缺失p17，组装后的病毒将变得不稳定，失去感染作用。p17蛋白还同时具有抑制蛋白水解的作用，使多聚蛋白pp220和pp62不能进一步水解。

本实验室前期研究成果证实了在高致病性PRRSV弱毒疫苗株HuN4-F112的全长感染性克隆骨架上，插入ASFV的p12蛋白和p17蛋白，获得能够稳定表达ASFV p12和p17融合蛋白的重组PRRS病毒。已经成功开发出一种表达非洲猪瘟病毒(ASFV)p12和p17蛋白的猪繁殖与呼吸综合征病毒重组质粒pA-ASFV-p1217，使用重组质粒pA-ASFV-p1217，转染MARC-145细胞后所拯救出来的病毒具有和亲本病毒vHuN4-F112相似的病毒生物学特性。并且在至少连续20代次的细胞传代过程中能够保持遗传稳定性。同时，基于上述重组质粒，转染MARC-145细胞后拯救出的一株重组PRRS病毒：rPRRSV-p1217。能与p12或p17的鼠源多抗以及PRRSV的N蛋白的单抗发生抗原抗体反应，出现特异性的免疫荧光。说明该重组病毒rPRRSV-p1217能够稳定高效的表达ASFV的p12和p17蛋白是一种新型的基因工程活载体疫苗用于非洲猪瘟的免疫保护。

但是在临床应用中，由于非洲猪瘟的临床症状和古典猪瘟、猪繁殖与综合征的极为相似，无法进行鉴别诊断，只能通过实验室的病原学和血清学方法进行确诊。病原学诊断包括(1)病毒的分离培养及红细胞吸附试验，红细胞吸附试验是检测非洲猪瘟的金标准；(2)基于病毒核酸的分子生物学诊断方法，主要包括PCR、qPCR、LAMP等。血清学诊断方法包括间接ELISA、竞争ELISA、双抗夹心ELISA、间接免疫荧光法、直接免疫荧光法、免疫印迹法等，但是PCR和qPCR方法对技术人员和仪器的要求较高，且很容易造成污染、出现假阳性等缺点，而ELISA检测方法具有耗时短、对技术人员要求低、成本低、适合大批量检测等优点。为了更好地区分前期研究中的嵌合疫苗、野生型的非洲猪瘟和野生型的PRRSV，便于对疫苗株进行监控，提高疫苗的安全性和可控性，因此需要一种可以特异性针对前期嵌合疫苗的抗体。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种可以区分嵌合疫苗rPRRSV-p1217、野生型的非洲猪瘟和野生型的PRRSV的纳米抗体。

本发明提供了针对表达非洲猪瘟病毒(ASFV)p12和17蛋白的猪繁殖与呼吸综合征病毒rPRRSV-p1217的纳米抗体AP1217-NANO，所述纳米抗体AP1217-NANO的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明的目的还在于提供了一种有效的区分嵌合疫苗rPRRSV-p1217的方法，所述方法为利用本发明所述的纳米抗体进行抗原抗体检测，所述方法为非疾病的治疗和诊断应用。

进一步的，所述抗原抗体检测是通过胶体金试剂条实现的，所述胶体金试剂条具有快速、准确且特异性强的特点。

进一步的，所述胶体金试剂条包括底板、吸水垫纸、NC膜、金垫、样品层析垫，从底板上从上到下依次粘贴吸水垫纸、NC膜、金垫、样品层析垫，所述NC膜上设置有相互分离的结合垫区、检测区和质控区，所述结合垫区喷涂胶体金标记的纳米抗体AP1217-NANO，所述检测区喷涂针对抗原的混合抗体，所述质控区喷涂有与胶体金标记的纳米抗体AP1217-NANO特异结合的抗体。

有益效果

本发明提供一种可以区分嵌合疫苗rPRRSV-p1217、野生型的非洲猪瘟和野生型的PRRSV的纳米抗体，所述纳米抗体具有较强的抗原特异性，仅与表达非洲猪瘟病毒(ASFV)p1217蛋白的猪繁殖与呼吸综合征病毒rPRRSV-p1217发生抗原抗体反应，与亲本病毒并没有相应的亲和反应。可以有效的区分疫苗株和野生型，便于对疫苗株进行监控，提高疫苗的安全性和可控性。

本发明提供了一种胶体金试剂条，能够实现快速、准确检测，检测阳性率达到100％。经过交叉实验发现，本发明提供的ELISA试剂盒或者胶体金试剂条与我国流行的II型ASFV毒株、PRRSV流行株、以及常见的口蹄疫病毒、猪细小病毒、伪狂犬病毒、圆环病毒等均不发生反应，特异性高。

附图说明

图1是ASFV p12和p17蛋白嵌合PRRSV重组质粒pA-ASFV-p1217构建示意图；

图2是pA-ASFV-p1217抗原表位高级结构预测图；

图3是纳米抗体AP1217-NANO的Western blot鉴定结果，其中，M为marker，箭头所指为纯化的1b-p1217-2抗原表位融合蛋白；

图4是纳米抗体AP1217-NANO胶体金试剂条的结构示意图，其中1为PVC底板，2为样品层析垫，3为金垫，4为NC膜，5为吸水垫纸。

具体实施方式

在本发明中，所述嵌合重组质粒指的是，在本申请前期研究(CN110904153A20200324)基础上，利用反向遗传操作技术，将ASFV基因组p12和p17蛋白依次融合连接后同时插入HuN4-F112基因组骨架中所获得的pA-ASFV-p1217

在本发明中，所述高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4的Genbank登录号是EF635006。

在本发明中，所述高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株的感染性克隆HuN4-F112指的是，参考文献Shanru Zhang,Yanjun Zhou,Yifeng Jiang,Guoxin Li,Liping Yan,Hai Yu,Guangzhi Tong.Generation of an infectious clone of HuN4-F112,an attenuated live vaccine strain of porcine reproductive andrespiratory syndrome virus的方法所构建的感染性克隆。

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室手册》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件进行。

在本发明的实施例中，使用的病毒和细胞：MARC-145细胞(非洲绿猴肾细胞系)。

在本发明的实施例中，使用的质粒与菌株：pBlueScript II SK(+)载体购自Invitrogen公司，pBS-T载体、TOP10感受态细胞购自TIANGENE公司。

在本发明的实施例中，使用的其他试剂：QIAamp Viral RNA Mini Kit购自QIAGENE公司，pfu II DNA Polymerase购自Strategene公司，T7 mMESSAGE High YieldCapped RNA Transcription Kit购自Ambion公司，胶回收试剂盒和Quant ReverseTranscriptase购自TIANGENE公司，rTaq DNA聚合酶，dNTP和限制性内切酶购自TaKaRa公司，质粒提取试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司，DMRIE-C转染试剂购自Invitrogen公司，Opti-MEM购自Invitrogen公司。

在本发明的实施例中，MARC-145单层细胞采用以下方法制备：

MARC-145细胞在含有10％FBS的DMEM培养基的六孔板中贴壁长满单层后，弃培养基，PBS洗两遍后加入0.01MOI的病毒500微升吸附1小时后，弃吸附液，PBS洗两遍后加入维持液(含有2％FBS的DMEM)培养基，37℃5％CO₂培养箱中培养。

实施例1构建同时表达p12和p17的嵌合疫苗株pA-ASFV-p1217

参见前期研究专利(CN110904153A 20200324)的方法，在pA-ASFV-p12或pA-ASFV-p17的基础上利用SOE PCR方法构建并鉴定pA-ASFV-p1217。简而言之，其过程为：

扩增p12-SOE-5和p17-SOE-5的PCR产物。PCR反应体系为：以pA-ASFV-p12以分别带有Asc I/BamHI的引物扩增出P12基因；以pA-ASFV-p17作为模板，以分别带有BamHI/EcoR V的引物扩增出P17基因，取PCR反应产物，用1％琼脂糖凝胶电泳检测，根据检测结果，获得的目的片段p12和p17的大小约为1800bp和2000bp。

将上述p12和p17的PCR产物分别使用Asc I，BamHI和BamHI、EcoR V进行酶切，再分别与经过Asc I和EcoR V双酶切的亲本病毒全长质粒pHuN4-F112的大片段通过T4 DNA连接酶连接，经测序鉴定后筛选出阳性克隆，获得pA-ASFV-p12p17。对所获得的待鉴定质粒进行全长质粒电泳鉴定，与亲本全长感染性克隆进行电泳图谱比较鉴定，筛选获得相应的pA-ASFV-p1217全长质粒。

经过病毒RNA的制备、RNA的转染、细胞培养等获得的重组质粒pA-ASFV-p1217具有感染性，能够从单一的基因组序列成功转变为具有活性的病毒粒子并具有相应的病毒感染性。

经间接免疫荧光检测、病毒细胞半数感染量(TCID50)测定、病毒多步生长曲线的绘制等验证获得了表达ASFV p12和p17蛋白的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒rPRRSV-p1217。实施例2表达ASFV p1217蛋白的重组PRRSV质粒pA-ASFV-p1217的抗原表位分析

由于本申请所要求解决的技术问题是需要筛选出一株特异性识别我国流行的II型ASFV基因组p12和p17蛋白及其HuN4-F112基因组骨架的抗体，因此需要对获得的重组PRRSV质粒pA-ASFV-p1217的抗原表位进行分析，其重点在于同时嵌合了p12和p17蛋白的ORF1-2区域(见图1)，因此将上述序列调整翻译出的嵌合蛋白1b-p1217-2a进行生物信息学分析，筛选潜在的线性表位和空间表位，同时进一步优化其中的氨基酸残基，尽可能暴露筛选表位。根据Genbank公布的EF635006和MH766894的核苷酸序列为参考，设计优化基因序列，为使抗原的N/C端抗原表位更容易暴露出来，显现出更多的优势，从而筛选到比较合适的单克隆抗体，本发明通过DNAstar及IEDB数据库对该蛋白序列优势表位区域进行分析，在抗原表位的优化设计过程中，保留1b-p1217-2a的排列顺序，其中几个短的抗原表位之间为直接相连，同时以GGGS为linker对较长的抗原表位区域进行串联表达，在保留了较多的氨基酸的同时尽量减小其空间位阻的影响(见图2)。优化后的1b-p1217-2抗原表位通过固相合成多肽技术合成，命名为AP1217，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

GQSEAAYAHALRIELAQEVDKVGGGKAEECTSECTCNNGSCSLKQSHIPSDEQLAEGGGSKAGTKSTANSSKSGSSHIPSDEQLAELARGHTGKTHASVNIAGGGSRSRGIPISELEKKIKRSGGGSLPETTVVR

实施例2针对AP1217的天然纳米抗体的筛选过程

本领域内针对已知蛋白筛选纳米抗体已经是成熟或者商业化的手段，简要概括步骤为：

(1)将已建立的天然纳米抗体噬菌体文库进行扩增：100μL甘油菌文库加入2×YT培养基，OD600＝0.5时，加入20MOI辅助噬菌体，静置30min，离心后将沉淀用2×YT培养基重悬，再培养1h，再加抗生素培养16h后离心，其上清经预冷PEG-NaCl(1/4体积)沉淀，1mL PBS重悬即为扩增的纳米抗体文库；

(2)免疫管淘选：将经过生物信息学分析优化抗原表位后的AP1217蛋白50μg/管包被免疫管过夜，去除包被液后洗涤3次，用2mL BSA(1％)封闭2h，PBST洗涤3次，加入100μL(1)步扩增的纳米抗体文库作为一抗，37℃作用2h，PBST洗涤3次，用Glycine-HCI(PH2.2)洗脱，洗脱液用Tris-HCI调节至PH 7.4，获得淘选的第一轮天然纳米抗体文库；

(3)将(2)步获得的第1轮天然纳米抗体文库按照(1)步进行扩增，获得第1轮天然纳米抗体重悬文库，然后重复(2)步免疫管淘选步骤，只是一抗加入的是100μL扩增的第1轮天然纳米抗体重悬文库，最后获得淘选的第2轮天然纳米抗体文库；

(4)将(3)步获得的第2轮天然纳米抗体文库按照(1)步进行扩增，获得第2轮天然纳米抗体重悬文库，然后重复(2)步免疫管淘选步骤，只是一抗加入的是100μL扩增的第2轮天然纳米抗体重悬文库，最后获得淘选的第3轮天然纳米抗体文库。

(5)淘选单个阳性克隆：将淘选的第3轮天然纳米抗体文库接种于2×YT培养基，OD600nm＝0.5时，加入20MOI辅助噬菌体，静置30min，离心后将沉淀用2×YT培养基重悬，再培养1h，然后涂布于含抗生素的2×YT平板，培养过夜，次日挑选40个单菌落接种到2×YT培养基中，OD600＝0.5时，加入20MOI辅助噬菌体，静置30min，离心后将沉淀用2×YT培养基重悬，再培养，并加入IPTG进行诱导表达8h。

(6)ELISA鉴定：将AP1217蛋白(带生物素标签并且纯化、浓度1ng/μL)100μL/孔包被ELISA板过夜，去除包被液后洗涤3次，用200μL/孔BSA(3％)封闭2h，PBST洗涤3次，加入100μL/孔(5)步分别扩增的纳米抗体文库作为一抗(文库构建载体带M13)，37℃作用2h，PBST洗涤3次，二抗加入M13-HRP，终止后检测OD450nm值，结果判读：比对照组OD450nm值高出3倍判为阳性。

将通过ELISA检测结果确定为的阳性(大于阴性值3倍以上)的单克隆菌液，测序。通过软件MegAlign进行对测序结果的比对，并进行分类。根据序列分类结果，ELISA方法检测所筛选出的纳米抗体粗提物按1：2、1:20、1:200、1:2000倍比稀释，再次测定其效价。利用ELISA分析纳米抗体的特异性和亲和力，最终筛选到的针对AP1217融合蛋白的纳米抗体氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示(QVTNWSSGVEAGGMNSVKLAYSNYCMGSMGWIRQGWFRQAPISSGGADNATYYADFT IMNSVKLTAASLPEMNSVKLEDTAYCSRAAPTFEALFQDAGACGSGQGTQVTVS)。将此纳米抗体命名为AP1217-NANO。

实施例2纳米抗体AP1217-NANO的抗原特异性验证

将上述序列送交华大基因(北京)纯化合成，获得可以识别表达ASFV p1217蛋白的重组PRRSV质粒pA-ASFV-p1217的纳米抗体AP1217-NANO，对其进行Western blot鉴定：A.蛋白电泳：将纯化的AP1217蛋白用6x SDS蛋白电泳加样缓冲液稀释至60μg,100℃煮沸5min,预染Marker 2μL，进行蛋白电泳浓缩胶80v，分离胶120v。B.转膜：将凝胶放在硝酸纤维素膜(NC膜)上，上下各放3张Whatman 3mm滤纸，将上述物品放至转膜电泳缓冲液中浸泡15min，以驱除留于滤膜上的气泡。按顺序安装电转移装置，在阴性电极板上依次放置3张滤纸、凝胶、NC膜、3张滤纸，确保各层精确对齐(从下到上)，并驱除各层间气泡，标记方位，合上阳极板。2mA/cm²恒流2h条件下转膜。先用5％脱脂奶粉、4℃过夜封闭；再加纯化后带His标签的纳米抗体AP1217-NANO(5％脱脂奶以1:3000稀释)，室温下孵育膜3h；再用PBST(吐温为1‰)洗膜三次，每次10min；然后加羊抗His的Dy800抗体(5％脱脂奶以1:20000稀释)，室温下避光孵育40min；最后利用Odyssey的荧光通道进行扫描鉴定(见图3)，结果说明本发明获得的纳米抗体AP1217-NANO与抗原表位融合蛋白特异性结合。

采用间接竞争ELISA方法测定纳米抗体AP1217-NANO的抗体特异性，具体用交叉反应率描述，测试方法如下：将亲本毒株我国流行的II型ASFV毒株、PRRSV流行株、以及常见的口蹄疫病毒、猪细小病毒、伪狂犬病毒、圆环病毒等其他常见病毒的标准品储存液，用10％甲醇/PBS梯度稀释至十个不同的工作浓度，同等条件下采用间接竞争ELISA方法进行测定，依次绘制纳米抗体AP1217-NANO的竞争ELISA曲线，求出各自抑制率为50％时的标准品浓度，用IC50表示，并根据下述计算公式计算交叉反应率：交叉反应率(％)＝(纳米抗体AP1217-NANO IC50/类似物IC50)×100％，得到纳米抗体AP1217-NANO对rPRRSV-p1217的50％抑制浓度IC50为1.03ng/mL；与上述各种易感病原的交叉反应率均小于0.1％。因此，纳米抗体AP1217-NANO是一种针对本发明所针对的疫苗株pA-ASFV-p1217的高特异性纳米抗体，能够应用于特异性区分疫苗株和野生毒株。

实施例3纳米抗体AP1217-NANO检测试纸条的制备

根据本领域同样也已经成熟或者商业化的手段制备胶体金检测试纸条，简而言之，包括底板、吸水垫纸、NC膜、金垫、样品层析垫，从底板上从上到下依次粘贴吸水垫纸、NC膜、金垫、样品层析垫(见图4)，所述NC膜上设置有相互分离的结合垫区、检测区和质控区，所述结合垫区喷涂胶体金标记的纳米抗体AP1217-NANO，所述检测区喷涂针对抗原的混合抗体，所述质控区喷涂有与胶体金标记的纳米抗体AP1217-NANO特异结合的抗体。

验证试纸条在检测HCV与其他肝炎相关病毒的特异性，将rPRRSV-p1217、II型ASFV毒株、PRRSV流行株、以及常见的口蹄疫病毒、猪细小病毒、伪狂犬病毒、圆环病毒感染的血液进行实验，发现，本发明的试纸条只能针对rPRRSV-p1217的血液发生反应，其他病毒毒株并未有阳性反应，证明其具有良好的特异性。

为了验证本申请所筛选到的纳米抗体的敏感性，将AP1217蛋白(带生物素标签并且纯化、浓度10⁵ng/mL)，分别以1:10(10⁴ng/mL)，1:100(10³ng/mL)，1:1000(10²ng/mL)，1:10000(10ng/mL)，1:100000(1ng/mL)进行倍比稀释，进行检测，重复三次。检测结果表明，当血清稀释比例为1:10000时(即最低检测限为浓度为10ng/mL时)，仍能检测到阳性结果，具有很高的灵敏性。

4℃贮藏稳定性试验：将制作好的胶体金试纸条和干燥剂一起用铝箔袋密封包装，至于4℃冰箱内，每两个月取出2条，检测可视检测限浓度的AP1217蛋白标准系列溶液，观察稳定性测试结果(包括检测线和质控线的有无、条带的清晰度、金标垫放金标记抗体的程度及试纸条的灵敏度等)。结果证实试纸条在4℃保存8个月以上仍能保持良好的检测效果。

经过上述测试可以证明，上述的胶体金试纸条，具有高特异性、高灵敏度、高精确度、高准确度等特点，其检测范围宽、假阳性率低、检测结果可靠。使用胶体金试纸条时，样品前处理时间短，标准品的检出限为10ng/mL。该检测方法适用于临床样品检测或者防疫检测；可以在较短时间内快速区分疫苗株和野生型。由于样品处理简便易行，检测又无需昂贵的仪器设备，因此，适合在基层检验检疫单位推广使用。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.一种可以区分嵌合疫苗rPRRSV-p1217、野生型的非洲猪瘟和野生型的PRRSV的纳米抗体，其特征在于所述抗体为纳米抗体AP1217-NANO，所述纳米抗体AP1217-NANO的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.一种非疾病的治疗和诊断方法的，有效的区分嵌合疫苗rPRRSV-p1217的方法，所述方法为利用权利要求1所述的纳米抗体进行检测。

3.一种胶体金试剂条，所述胶体金试剂条包括底板、吸水垫纸、NC膜、金垫、样品层析垫，从底板上从上到下依次粘贴吸水垫纸、NC膜、金垫、样品层析垫，所述NC膜上设置有相互分离的结合垫区、检测区和质控区，所述结合垫区喷涂胶体金标记的权利要求1所述的纳米抗体AP1217-NANO，所述检测区喷涂针对抗原的混合抗体，所述质控区喷涂有与胶体金标记的权利要求1所述的纳米抗体AP1217-NANO特异结合的抗体。

4.如权利要求3所述的胶体金试剂条的应用，所述应用为非疾病的治疗和诊断的区分rPRRSV-p1217、亲本猪瘟病毒、PRRSV HuN4-F112株。