CN109459569A - 一种免血样肿瘤早期监测的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种乳腺癌体液检测的方法，包括以下两个步骤：以交联高分子的软性微针贴剂或金属刚性微针为工具，无痛提取疑似肿瘤部位皮肤体液；合成Ag3PO4/Ag纳米复合材料，构建基于Fe3O4@Ag磁性平台的夹心式比色免疫分析，检测体液中的CEA；本发明可快速无痛提取皮肤体液，相对于经典的血样分析，可以更早期的发现肿瘤细胞，无需专业人员操作，方法简单，可用于乳腺癌的“半定位”筛查而且对癌胚抗原的检测灵敏度高，重现性好。

Description

一种免血样肿瘤早期监测的方法
技术领域
本发明属于监测领域，具体涉及一种免血样肿瘤早期监测的方法。
背景技术
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，发病率占全身各种恶性肿瘤的7-10％，呈逐年上升趋势。现在位居女性恶性肿瘤第一位，世界每年大概有120万妇女发生乳腺癌，50万死于该病。早期的乳腺癌往往不具备典型的症状和体征，不易引起重视，一般发现都是晚期，但是晚期症状比较严重，容易转移，易复发，治愈率低，死亡率高，预后差，影响正常生活，因此，能否对乳腺癌进行早期诊断，是乳腺癌治疗的关键，目前对乳腺癌治疗的方法包括乳房自检、血液检测和影像学监测，乳房自检一般是在乳房有不舒服的时候才去医院检查，比如摸到肿块，乳头溢液，乳房疼痛等，自检发现的乳腺癌多半已是癌症中晚期。影像学的监测一般也需要在肿瘤发展到一定尺寸规模的时候才能明确确诊，此时也多半已是中晚期。而血检一般来说也需要肿瘤细胞在乳腺癌中已经有大量聚集并且有部分脱落到血管之后开始传播的时候才能通过血液检测发现，其次，这种取血检测的方法往往会对人造成疼痛感和不适感，在实际操作中有许多人因为畏惧抽血的过程而规避血检并最终错过了乳腺癌筛查的最佳时期。因此开发出一种早期无痛或微痛的早期肿瘤检测手段是非常有必要的，在这里我们提出了一种基于微针检测的方法，将刚性微针或者可溶性微针扎入疑似肿瘤的部位获得体液，通过基于Ag3PO4/Ag的比色传感平台检测肿瘤标记物CEA。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种可通过微针贴剂或者刚性微针迅速提取皮肤体液的方法。
本发明的第二个目的是提供一种快速检测乳腺癌患者疑似肿瘤部位的体液中癌胚抗原的免疫分析方法，该方法具有较低的检测限和较高的灵敏度。
本发明是通过以下技术方法实现的：
一种免血样肿瘤早期监测的方法，在于以下步骤：
(1)以交联高分子的软性微针贴剂或金属刚性微针为工具，无痛提取疑似肿瘤部位皮肤体液；
(2)合成Ag3PO4/Ag纳米复合材料，构建基于Fe3O4@Ag磁性平台的夹心式比色免疫分析，检测体液中的CEA。
一种免血样肿瘤早期监测的方法：所述工具的制备方法包括以下步骤：
(1)甲基丙烯酸化透明质酸的合成：将HA溶于去离子水中，在-4℃连续搅拌过夜，然后分别将DMF和MA滴加到溶液中，用NaOH调节溶液的pH为8-9，在-4℃连续搅拌18小时，随后，在反应溶液中加入NaCl，然后在乙醇中沉淀甲基丙烯酸化透明质酸，沉淀物用乙醇洗涤，然后溶于去离子水中，溶液在去离子水中透析7天，通过冻干获得第一次物料；
(2)交联甲基丙烯酸化透明质酸微针贴剂的制备：将第一次物料和光引发剂2959溶于纯水中，将混合物浇注到经等离子体处理的PDMS模具中直到填满空腔，将PDMS模具离心3分钟以迫使材料进入针孔，加入另外的透明质酸混合物溶液以产生坚固的背衬，在室温下通风橱中干燥12小时后，将交联甲基丙烯酸化透明质酸微针贴剂小心地从模具中分离并修剪，然后暴露于UV光下照射5分钟即得微针贴片成品。所述的夹心式比色免疫分析的制备方法为：
(1)合成Fe3O4@Ag纳米颗粒并修饰癌胚抗原单抗：将Fe3O4和盐酸多巴胺溶于Tris缓冲溶液并充分搅拌形成第一溶液，将AgNO3溶液加入到第一溶液中并搅拌6小时形成第二溶液，借助外部磁场获得沉积物，经清洗得Fe3O4@Ag纳米球分散液，将癌胚抗原单抗加入到Fe3O4@Ag纳米球分散液中在-4℃过夜孵育，磁性分离并清洗得到Fe3O4@Ag-Ab1纳米球分散液；
(2)合成Ag3PO4/Ag纳米颗粒并修饰癌胚抗原多抗：将AgNO3和乙二醇均匀混合，将Na2HPO4·12H2O和乙二醇均匀混合，将上述两瓶溶液混合搅拌2小时后在160℃油浴中反应30分钟，将沉淀离心分离和洗涤5次得到Ag3PO4/Ag纳米球分散液，将癌胚抗原多抗加入到Ag3PO4/Ag纳米球分散液中在-4℃过夜孵育，得到Ag3PO4/Ag-Ab2纳米球分散液；
(3)在Fe3O4@Ag-Ab1纳米球分散液中加入疑似肿瘤部位取得的体液并孵育20分钟，在磁力分离和清洗后，加入Ab2-Ag3PO4/Ag，再温育20分钟构成免疫复合物，分散到醋酸缓冲溶液中并加入TMB，通过肉眼观察颜色深浅和紫外分光光度计检测TMB的吸收定性体液中CEA的含量。
本发明的有益技术效果：
1、所制备的微针贴剂亲水性极高，可以结合大量的水。
2、所制备的微针贴剂可以在拇指按压后穿透皮肤，在1分钟内提取约1.4mg体液，并保持其结构完整性，不会在使用后留下皮肤残留物。
3、所制备的微针贴剂提取的皮肤体液可以通过离心后从微针贴片有效回收，用于后续的肿瘤标记物含量分析。
4、所制备的微针贴剂在使用后仍能保持结构完整性，可频繁使用。
5、对癌胚抗原的检测灵敏度高，重现性好。
附图说明
图1是自制交联甲基丙烯酸化透明质酸微针贴剂的宏观使用方法示意图和微针放大图。
图2是Ag3PO4/Ag纳米复合材料的SEM图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明，但应理解本发明的范围非仅限于这些实施例的范围。
实施例1：
(1)将4.0g HA溶解于200mL去离子水中，并在4℃下连续搅拌过夜，然后分别将133.3mL DMF和4.76mL MA滴加到溶液中，用1M NaOH将溶液的pH调节至pH 8，在-4℃连续搅拌18小时，随后，在反应溶液中加入9.88g NaCl，然后在乙醇中沉淀MeHA，沉淀物用乙醇洗涤3次，然后溶于去离子水中，溶液在去离子水中透析7天，通过冻干获得纯化的产物。
(2)将甲基丙烯酸化透明质酸(50mg mL-1)和光引发剂(Irgacure 2959,0.5mg mL-1)溶于纯水中，将混合物浇注到经等离子体处理的PDMS模具中直到填满空，然后将PDMS模具以4000rpm离心3分钟。加入另外的混合物溶液以产生坚固的背衬，在室温下在通风橱中干燥12小时后，将交联甲基丙烯酸化透明质酸微针贴剂小心地从模具中分离并修剪，然后暴露于UV光下照射5分钟得微针贴片。
(3)将制得的微针贴片贴在疑似肿瘤部位的皮肤上，用拇指按压提取体液，重复数次将收集到的体液保存于-4℃冰箱备用。
(4)将2mL Fe3O4(5mg mL-1)和10mg盐酸多巴胺溶于10mL Tris缓冲溶液(20mM，pH＝8.5)中并充分搅拌，将10mL AgNO3溶液(10mg mL-1)加入到上述混合溶液中并搅拌6小时，借助外部磁场获得沉积物，用蒸馏水和乙醇洗涤Fe3O4@Ag纳米颗粒并最终分散到ABS缓冲溶液中，将癌胚抗原单抗加入到Fe3O4@Ag纳米球分散液中在-4℃过夜孵育，磁性分离并清洗得到Fe3O4@Ag-Ab1纳米球分散液。
(5)在剧烈搅拌下将5mM AgNO3加入到50mL乙二醇(EG)中，在剧烈搅拌下将1mMNa2HPO4·12H2O(1mM)加入到50mL EG中。将上述两瓶溶液混合在一起并搅拌2小时。混合溶液在160℃在油浴中反应30分钟，将得到的沉淀离心并用蒸馏水和乙醇洗涤5次得到Ag3PO4/Ag纳米球分散液。将癌胚抗原多抗加入到Ag3PO4/Ag纳米球分散液中在-4℃过夜孵育，得到Ag3PO4/Ag-Ab2纳米球分散液。
(6)在Fe3O4@Ag-Ab1纳米球分散液中加入100μL疑似肿瘤部位取得的体液并常温孵育20分钟。在磁力分离和清洗后，加入Ab2-Ag3PO4/Ag，再温育20分钟构成免疫复合物，分散到1毫升pH＝3的醋酸缓冲溶液中并加入20μL TMB，通过肉眼观察颜色深浅,并通过紫外分光光度计定量检测TMB的吸收定性体液中CEA的含量。
(7)CEA含量与吸光度的对应关系如下表
X(ng/ml) 0.06 0.2 0.8 1.6 2.5 5.0
Y(Abs) 0.156 0.364 0.513 0.728 0.986 1.883
(8)实际样品分析
用构建的比色免疫分析方法检测使用微针提取的疑似肿瘤部位的体液中的CEA含量，并将检测结果与常规ELISA检测结果进行比对，证明该比色分析方法用于实际肿瘤部位体液样品中CEA的浓度检测灵敏度高，重现性好。
(9)两组结果比对如下表

Claims (3)

1.一种免血样肿瘤早期监测的方法，其特征在于以下步骤：
(1)以交联高分子的软性微针贴剂或金属刚性微针为工具，无痛提取疑似肿瘤部位皮肤体液；
(2)合成Ag3PO4/Ag纳米复合材料，构建基于Fe3O4@Ag磁性平台的夹心式比色免疫分析，检测体液中的CEA。
2.根据权利要求1所述的一种免血样肿瘤早期监测的方法，其特征在于：所述工具的制备方法包括以下步骤：
(1)甲基丙烯酸化透明质酸的合成：将HA溶于去离子水中，在-4℃连续搅拌过夜，然后分别将DMF和MA滴加到溶液中，用NaOH调节溶液的pH为8-9，在-4℃连续搅拌18小时，随后，在反应溶液中加入NaCl，然后在乙醇中沉淀甲基丙烯酸化透明质酸，沉淀物用乙醇洗涤，然后溶于去离子水中，溶液在去离子水中透析7天，通过冻干获得第一次物料；
(2)交联甲基丙烯酸化透明质酸微针贴剂的制备：将第一次物料和光引发剂2959溶于纯水中，将混合物浇注到经等离子体处理的PDMS模具中直到填满空腔，将PDMS模具离心3分钟以迫使材料进入针孔，加入另外的透明质酸混合物溶液以产生坚固的背衬，在室温下通风橱中干燥12小时后，将交联甲基丙烯酸化透明质酸微针贴剂小心地从模具中分离并修剪，然后暴露于UV光下照射5分钟即得微针贴片成品。
3.根据权利要求1所述的一种免血样肿瘤早期监测的方法，其特征在于：所述的夹心式比色免疫分析的制备方法为：
(1)合成Fe3O4@Ag纳米颗粒并修饰癌胚抗原单抗：将Fe3O4和盐酸多巴胺溶于Tris缓冲溶液并充分搅拌形成第一溶液，将AgNO3溶液加入到第一溶液中并搅拌6小时形成第二溶液，借助外部磁场获得沉积物，经清洗得Fe3O4@Ag纳米球分散液，将癌胚抗原单抗加入到Fe3O4@Ag纳米球分散液中在-4℃过夜孵育，磁性分离并清洗得到Fe3O4@Ag-Ab1纳米球分散液；
(2)合成Ag3PO4/Ag纳米颗粒并修饰癌胚抗原多抗：将AgNO3和乙二醇均匀混合，将Na2HPO4·12H2O和乙二醇均匀混合，将上述两瓶溶液混合搅拌2小时后在160℃油浴中反应30分钟，将沉淀离心分离和洗涤5次得到Ag3PO4/Ag纳米球分散液，将癌胚抗原多抗加入到Ag3PO4/Ag纳米球分散液中在-4℃过夜孵育，得到Ag3PO4/Ag-Ab2纳米球分散液；
(3)在Fe3O4@Ag-Ab1纳米球分散液中加入疑似肿瘤部位取得的体液并孵育20分钟，在磁力分离和清洗后，加入Ab2-Ag3PO4/Ag，再温育20分钟构成免疫复合物，分散到醋酸缓冲溶液中并加入TMB，通过肉眼观察颜色深浅和紫外分光光度计检测TMB的吸收定性体液中CEA的含量。
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