CN110229912A

CN110229912A - 用于肾透明细胞癌诊断的循环snoRNA生物标志物和试剂盒及用途

Info

Publication number: CN110229912A
Application number: CN201910649053.9A
Authority: CN
Inventors: 何苗; 颜媛媛; 赵燕云; 魏敏杰
Original assignee: China Medical University
Current assignee: China Medical University
Priority date: 2019-07-18
Filing date: 2019-07-18
Publication date: 2019-09-13
Anticipated expiration: 2039-07-18
Also published as: CN110229912B

Abstract

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种用于肾透明细胞癌诊断的循环snoRNA生物标志物和试剂盒及用途。所述循环snoRNA生物标志物有如下循环snoRNA组成：SNORA2、SNORD12B、SNORA59B、SNORA70B、SNORD93、SNORD116‑2。本发明筛选出明显影响肾透明细胞癌患者生存期的snoRNA，并在组织及血清中验证了其差异表达及诊断能力。所述的snoRNA生物标志物可以有效用于肾透明细胞癌诊断和预后，循环snoRNA生物标志物的开发利用将为肿瘤等疾病的诊断以及进一步治疗提供新的方向。

Description

用于肾透明细胞癌诊断的循环snoRNA生物标志物和试剂盒及用途

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种用于肾透明细胞癌诊断的循环snoRNA生物标志物和试剂盒及用途。

背景技术

肾癌亦称肾细胞癌，据流行病学统计，肾细胞癌在所有类型的泌尿系统恶性肿瘤中排名第二位。发病率稍低于膀胱癌，占所有肾脏全部恶性肿瘤的90％-95％。其发病率分别位居男性和女性常见恶性肿瘤的第7位和第10位，占所有新发癌症的3.7％。男女发病比例通常随年龄的增加而增加，大多数病人的发病年龄在50岁以上，60-70岁时达到高峰。

肾细胞癌主要包括以下三种病理类型，其中透明细胞癌(ccRCC)是发病率最高的病理类型，约占所有报道病例的65％，其次是乳头状肾细胞癌(pRCC)和嫌色肾细胞癌，分别占15％～20％和5％。肾癌患者在疾病的早期阶段可能没有任何迹象或症状，在诊断后，存活率一般为5年，但整体预后很差，特别是患有高级别肾细胞癌的患者。

肾透明细胞癌早期常无症状，或症状较隐匿。可能有轻微的发热、乏力等全身症状，肿瘤体积增大时才被发现。临床上主要表现为血尿、肾区疼痛和肿块等。因此，寻找新的预后生物标志物是目前急需解决的问题。

核仁小分子RNA(small nucleolar RNA,snoRNA)是一类长度约为60-300nt的小分子非编码RNA，且多富集于核仁，代谢稳定。具有保守的结构元件，并以此划分为3大类:boxC/D snoRNA、box H/ACA snoRNA和MRP RNA。其中box C/D和box H/ACA是已知snoRNA的主要类型，以碱基配对的方式分别指导着核糖体RNA的甲基化和假尿嘧啶化修饰。它们与肿瘤的关系曾一度被人们所忽视，然而近年来有关snoRNA新功能的研究证明，它们与肿瘤的发生、发展密切相关。随着测序技术的发展，越来越多的数据表明snoRNA如SNORD50A/B、SNORD78、SNORD42、SNORD46在肿瘤中被异常调控，并发挥着功能。此外，最近的研究发现，snoRNA可以被分泌到血浆及血清中并发挥作用，为癌症研究提供了有价值的资源。

发明内容

鉴于现有技术存在的缺陷，本发明提供了一组用于肾透明细胞癌诊断的循环snoRNA生物标志物及用途，并且提供了一种检测标志物SNORA2、SNORD12B、SNORA59B、SNORA70B、SNORD93、SNORD116-2在肾透明细胞癌组织及血清中表达量的试剂盒及检测方法。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案。

一组用于肾透明细胞癌诊断的循环snoRNA生物标志物，所述循环snoRNA生物标志物如下循环snoRNA组成：SNORA2、SNORD12B、SNORA59B、SNORA70B、SNORD93、SNORD116-2，所述SNORA2具有如SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列，所述SNORD12B具有如SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列，所述SNORA59B具有如SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列，所述SNORA70B具有如SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列，所述SNORD93具有如SEQ ID N0:5所示的核苷酸序列，所述SNORD116-2具有如SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列。

进一步的，所述循环snoRNA生物标志物为人组织及血清循环snoRNA生物标志物。

SNORA2、SNORD12B、SNORA59B、SNORA70B、SNORD93、SNORD116-2联合作为肾透明细胞癌生物标志物在制备或筛选肾透明细胞癌检测试剂中的用途。

进一步的，所述肾透明细胞癌检测试剂以SNORA2、SNORD12B、SNORA59B、SNORA70B、SNORD93、SNORD116-2联合作为检测对象：所述检测试剂可以为试剂盒和/或高通量芯片。

可选地，所述肾透明细胞癌检测试剂中，含有SNORA2、SNORD12B、SNORA59B、SNORA70B、SNORD93、SNORD116-2的标准品或阳性对照。

优选地，所述肾透明细胞癌检测试剂中，含有特异性识别SNORA2的试剂，含有特异性识别SNORD12B的试剂，含有特异性识别SNORA59B的试剂，含有特异性识别SNORA70B的试剂，含有特异性识别SNORD93的试剂，含有特异性识别SNORD116-2的试剂。

特异性识别试剂可以为本领域各种形式的可实现特异性识别的物质。优选地，所述特异性识别SNORA2的试剂为SNORA2的反转录引物，所述特异性识别SNORD12B的试剂为SNORD12B的反转录引物，所述特异性识别SNORA59B的试剂为SNORA59B的反转录引物，所述特异性识别SNORA70B的试剂为SNORA70B的反转录引物，所述特异性识别SNORD93的试剂为SNORD93的反转录引物，所述特异性识别SNORD116-2的试剂为SNORD116-2的反转录引物。

根据一种优选实施方式，SNORA2的反转录引物如下所示：

Forward primer(正向引物)：5’-ATTCAAGGCCAGCAGTTTGC-3’(SEQ ID N0:7)

Reverse primer(反向引物)：5’-AGATGGCCAACAGACCATGAA-3’(SEQ ID N0:8)

根据一种优选实施方式，SNORD12B的反转录引物如下所示：

Forward primer(正向引物)：5’-TCCTGCTGGCATATATGATGACTT-3’(SEQ ID N0:9)

Reverse primer(反向引物)：5’-GCTCAAGCTGGCATATCAGAC-3’(SEQ ID N0:10)

根据一种优选实施方式，SNORA59B的反转录引物如下所示：

Forward primer(正向引物)：5’-CCTCACAACGTTTGTGCCTC-3’(SEQ ID N0:11)

Reverse primer(反向引物)：5’-AGCTGTTCCTTATCACCAACGA-3’(SEQ ID N0:12)

根据一种优选实施方式，SNORA70B的反转录引物如下所示：

Forward primer(正向引物)：5’-TCCTTATGGGGGTCCAGTGT-3’(SEQ ID N0:13)

Reverse primer(反向引物)：5’-CAACAAACAGGCCGCATACA-3’(SEQ ID N0:14)

根据一种优选实施方式，SNORD93的反转录引物如下所示：

Forward primer(正向引物)：5’-GCCAAGGATGAGAACTCTAATCTGA-3’(SEQ ID N0:15)

Reverse primer(反向引物)：5’-GGCCTCAGGTAAATCCTTTAATCCA-3’(SEQ ID N0:16)

根据一种优选实施方式，SNORD116-2的反转录引物如下所示：

Forward primer(正向引物)：5’-TGGATCGATGATGAGTCCCC-3’(SEQ ID N0:17)

Reverse primer(反向引物)：5’-AGTTCCGATGAGAATGACGGT-3’(SEQ ID N0:18)

进一步的，所述肾透明细胞癌检测试剂用于肾透明细胞癌判断、治疗方案选择、预后判断中的至少一种。

特异性识别SNORA2的试剂，特异性识别SNORD12B的试剂，特异性识别SNORA59B的试剂，特异性识别SNORA70B的试剂，特异性识别SNORD93的试剂，特异性识别SNORD116-2的试剂在制备肾透明细胞癌检测试剂盒中的用途：所述SNORA2具有如SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列，所述SNORD12B具有如SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列，所述SNORA59B具有如SEQID N0:3所示的核苷酸序列，所述SNORA70B具有如SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列，所述SNORD93具有如SEQ ID N0:5所示的核苷酸序列，所述SNORD116-2具有如SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列。

一种肾透明细胞癌检测试剂盒，所述试剂盒含有特异性识别SNORA2的试剂，特异性识别SNORD12B的试剂，特异性识别SNORA59B的试剂，特异性识别SNORA70B的试剂，特异性识别SNORD93的试剂，特异性识别SNORD116-2的试剂。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下。

本发明中实施例中调查了组织及血清中循环snoRNA作为ccRCC生物标志物的潜在用途。血清中循环生物标志物的检测属于液体活检的方法，可频繁多次检测，且该方法属于微创范畴，无入侵性，可尽可能的降低对患者的损伤及医疗成本，可节省时间。本发明提供新的、高敏感性和特异性的生物标记物用于ccRCC的诊断和预后，具有较高的临床使用和推广价值。

附图说明

图1为本发明筛选及验证肾透明细胞癌生物标志物的具体实施流程图。

图2为TCGA数据库中6个snoRNA的表达情况和TCGA数据库中6-snoRNA作为生物标志物的生存曲线和ROC曲线图，其中(A)为TCGA数据库中6个snoRNA的表达情况图(B)为TCGA数据库中6-snoRNA作为生物标志物的生存曲线图，(C)为TCGA数据库中6-snoRNA作为生物标志物的ROC曲线图。

图3为6-snoRNA作为生物标志物在肾透明细胞癌组织及血清样本中的表达情况，其中(A)为配对组织样本；(B)为血清样本。

图4为对所获得的肾透明细胞癌患者组织及血清snoRNA进行ROC曲线分析图，其中(A)为配对组织样本；(B)为血清样本。

具体实施方式

下面结合附图和实施例详细描述本发明，以下所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

实施例1本发明获取生物标志物的方法。

在TCGA数据库(https://cancergenome.nih.gov/)中下载530例肾透明细胞癌肿瘤组织和相对应的72例癌旁组织的snoRNA-seq数据，将snoRNA的表达值数据进行log2转换使其标准化，利用edger包筛选癌组织与癌旁组织差异表达的snoRNA，挑出300例患者作为测试数据集，另外230例患者作为验证数据集，然后将测试数据集中差异表达的snoRNA进行单因素及多因素cox回归分析，最终筛选出6个snoRNA联合为肾透明细胞癌患者的独立风险因素，可以作为肾透明细胞癌的预后标志物。根据每个snoRNA的风险系数及患者的表达量构建了风险模型，并将患者按照风险中位置分为了高风险组(high risk group)和低风险组(low risk group)，然后将6-snoRNArisk score作为肾透明细胞癌患者的生物标志物绘制了患者的生存曲线(p<0.0001)，同时对6-snoRNA risk score进行了ROC曲线分析。最后在验证数据集及总的数据集中绘制了患者的生存曲线，p值均小于0.0001。

本发明共纳入了大连医科大学附属医院泌尿外科32例肾透明细胞癌患者及配对的癌旁组织样本，同时收集了中国医科大学附属医院泌尿外科25例肾透明细胞癌患者及健康人群的血清样本。这些患者在手术前没有接受任何治疗，如放疗或化疗。最初的治疗是手术，术后病理证实为肾透明细胞癌。将每个组织样本储存在液氮中，并将血清样本储存在-80℃冰箱，每个血清样品在室温下12000g高速离心15分钟两次完全除去细胞碎片，回收上清液并储存于-80℃冰箱。

1.组织预处理及抽提。

取出组织约50-100mg，放入无RNA酶的2mL管中，加入500μL-1mLTRIZOL试剂使用高通量组织研磨器将其研磨。若未粉碎则进行二次研磨，或离心除去未破碎的组织。剧烈震荡15-30s。

2.血清抽提。

取出200μL-300μL血清，加入1mL TRIZOL试剂，剧烈震荡15-30s。

3.两相分离。

组织和血清样本加入TRIZOL剧烈震荡后4℃静置5-10分钟。每1mL的TRIZOL试剂匀浆的样品中加入0.2mL的氯仿。剧烈震荡15-30s后，4℃静置5-10分钟。4℃下12000g离心15-20分钟。

4.RNA沉淀。

将水相转移到新的无RNA酶的EP管中。水相与同体积的异丙醇混合以沉淀其中的RNA，剧烈震荡15-30s。4℃静置10-15分钟，于4℃下12000g离心10-15分钟。

5.RNA清洗。

移去上清液，每1mL TRIZOL试剂匀浆的样品中加入至少1mL的75％(v/v)乙醇，清洗RNA沉淀。静置5-10分钟，于4℃下12000g离心5-10分钟。

6.重新溶解RNA沉淀。

去除乙醇溶液，空气中干燥RNA沉淀10-20分钟，加入无RNA酶水混匀。室温孵育5-10分钟。

7.测量浓度定量。

每个样品的总RNA浓度及纯度通过NanoDrop2000测量。

8.cDNA合成。

(1)稀释模板RNA：使用DEPC水将RNA稀释至100ng/μL的浓度。

(2)准备反应液：将5*RT、Enzyme及Primer及DEPC水置于冰上溶解，并震荡混匀，离心。

(3)配制反应液：按表1配置下反应液

表1.反应液组成

试剂	体积(μL)	终浓度
			5*RT Buffer	2	1*
Enzyme Mix	0.5	1*
			Primer Mix	0.5	1*
总RNA模板	5	500ng
			DEPC处理水	2
总体积	10

(4)逆转录反应及热失活：将反应液于37℃温育15分钟，95℃温育5分钟以失活逆转录酶。

Real-Time PCR试剂：SYBRqPCR Mix、50*ROX、DEPC处理水、cDNA模板(100倍稀释)、snoRNA上游及下游引物。

仪器：3。

配制Real-Time PCR反应液：按表2配置反应液。

表2.反应液组成

试剂	体积(μL)	终浓度
			SYBRqPCR Mix	6.25	1*
50*ROX	0.25	1*
			Forward primer	1
Reverse primer	1
			cDNA模板	5
总体积	13.5

Real-Time PCR扩增：根据下表中的反应条件进行Real-Time PCR扩增和溶解曲线分析，Real-Time PCR循环条件见表3。

表3.Real-Time PCR循环条件

9.数据分析：采用△Ct方法。

10.风险评分分析。

基于TCGA数据库中对snoRNA的Cox回归分析得到的风险评分公式计算风险评分。然后将所有组织样本/血清样本分成高风险组和低风险组。癌旁组织及正常人主要在低风险组，而癌组织患者主要在高风险组(图3A，3B)。ROC曲线分析用于评估6-snoRNA对肾透明细胞癌患者的预测诊断价值。组织样本ROC曲线下面积为0.832(图4A)，血清样本ROC曲线下面积为0.739(图4B)，表明这6个snoRNA的组合在肾透明细胞癌患者及癌旁组织/正常人之间具有较好的鉴别能力。

序列表

<110> 中国医科大学

<120> 用于肾透明细胞癌诊断的循环snoRNA生物标志物和试剂盒及用途

<160> 6

<170> SIP0SequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 132

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

tgggtcctga atcaaggcta gcagtttgct gaagctgttg gtttcaagca ggaatataga

gaaatctctt tctttggtct gttggccttt cagaacttag gaaatgtaat agtcaattca

ttagaaacat ct 132

<210> 2

<211> 103

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

cttcctgctg gcatatatga tgacttagct tttttccccg acagatcgac tatgttgatc

taacttttct aagccagttt ctgtctgata tgccagcttg agc 103

<210> 3

<211> 152

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 3

gcccagggta tgttcacggg gcgatgctgc cctcccagct ggcccatggg tgaccctggg

aacattaact gcctcacaac gtttgtgcct cagttacccg tagatgtagt gagggtaaca

atacttactc tcgttggtga taaggaacag ct 152

<210> 4

<211> 134

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 4

tgcagccaat taagctgact gaattccttt ccttatgggg gtccagtgtg caatggctgt

aaacagcagc ttccttggta gtgtatgcgg cctgtttgtt gtataggttg ctctaaggga

ccttggagac aggc 134

<210> 5

<211> 74

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 5

tggccaagga tgagaactct aatctgattt tatgtgcttc tgctgtgatg gattaaagga

tttacctgag gcca 74

<210> 6

<211> 97

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 6

tggatcgatg atgagtcccc aaaaaaaaca ttccttggaa aagctgaaca aaatgagtga

aaactcatac cgtcattctc atcggaactg aggtcca 97

Claims

1.一组用于肾透明细胞癌诊断的循环snoRNA生物标志物，其特征在于，所述循环snoRNA生物标志物由如下循环snoRNA组成：SNORA2, SNORD12B, SNORA59B, SNORA70B,SNORD93和SNORD116-2；所述SNORA2具有如SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列，所述SNORD12B具有如SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列，所述SNORA59B具有如SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列，所述SNORA70B具有如SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列，所述SNORD93具有如SEQ ID N0:5所示的核苷酸序列，所述SNORD116-2具有如SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的循环snoRNA生物标志物，其特征在于，所述循环snoRNA生物标志物为人组织及人血清snoRNA生物标志物。

3.根据权利要求1所述的循环snoRNA生物标志物在制备或筛选肾透明细胞癌检测试剂中的用途。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述肾透明细胞癌检测试剂以SNORA2,SNORD12B, SNORA59B, SNORA70B, SNORD93, SNORD116-2联合作为检测对象；所述检测试剂为试剂盒和/或高通量芯片。

5.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述肾透明细胞癌检测试剂中，含有SNORA2, SNORD12B, SNORA59B, SNORA70B, SNORD93, SNORD116-2的标准品或阳性对照。

6.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述肾透明细胞癌检测试剂中，含有特异性识别SNORA2的试剂，含有特异性识别SNORD12B的试剂，含有特异性识别SNORA59B的试剂，含有特异性识别SNORA70B的试剂，含有特异性识别SNORD93的试剂，含有特异性识别SNORD116-2的试剂。

7.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述肾透明细胞癌检测试剂用于肾透明细胞癌判断、治疗方案选择、预后判断中的至少一种。

8.特异性识别SNORA2的试剂，特异性识别SNORD12B的试剂，特异性识别SNORA59B的试剂，特异性识别SNORA70B的试剂，特异性识别SNORD93的试剂，特异性识别SNORD116-2的试剂在制备肾透明细胞癌检测试剂盒中的用途。

9.根据权利要求6和8所述的用途，其特征在于，所述特异性识别SNORA2的试剂为SNORA2的反转录引物，所述特异性识别SNORD12B的试剂为SNORD12B的反转录引物，所述特异性识别SNORA59B的试剂为SNORA59B的反转录引物，所述特异性识别SNORA70B的试剂为SNORA70B的反转录引物，所述特异性识别SNORD93的试剂为SNORD93的反转录引物，所述特异性识别SNORD116-2的试剂为SNORD116-2的反转录引物。

10.一种肾透明细胞癌检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有特异性识别SNORA2的试剂，特异性识别SNORD12B的试剂，特异性识别SNORA59B的试剂，特异性识别SNORA70B的试剂，特异性识别SNORD93的试剂，特异性识别SNORD116-2的试剂。