CN111474133B - 检测胎盘素里黄体酮和雌酮两种激素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了检测胎盘素里黄体酮和雌酮两种激素的方法，该方法使用傅里叶红外光谱仪对雌酮，黄体酮和胎盘素进行光谱采集，得到两种标准品与胎盘素对应的吸收峰频率；设置胎盘素不同浓度，采集不同浓度胎盘素远红外及太赫兹波段光谱，并用高效液相色谱法检测出不同浓度胎盘素对应雌酮和黄体酮激素的含量；将不同浓度胎盘素对应两种激素吸收频率的吸收峰面积与不同浓度胎盘素对应两种激素在溶液中含量通过偏最小二乘法建立预测模型，使得只要检测胎盘素在远红外及太赫兹频率段的吸收光谱，并计算出吸收峰面积，就能得到待测胎盘素溶液中黄体酮和雌酮激素的含量。这种方法相较于传统检测手段大大降低了检测繁琐程度，节约了时间，并且成本很低。
Description
技术领域
本发明涉及太赫兹波段的远红外光谱技术领域，尤其涉及检测胎盘素里黄体酮和雌酮两种激素的方法。
背景技术
胎盘素是一种提取胎盘中营养物质成分得到的一类具有生物活性成分的针剂，其所含有的主要成份包括蛋白质、核酸、激素、磷脂类、多糖体、氨基酸、矿物质、维生素类等。由于胎盘素中所含的生物活性物质对体内细胞的活性起到了很好的活化作用，所以近年来越来越受到生物医学界的关注。
黄体酮是卵巢分泌的具有生物活性的主要孕激素。黄体酮可以保护女性的子宫内膜，在女性怀孕期间，孕酮激素可以给胎儿的早期生长及发育提供支持和保障，而且能够对子宫起到一定的镇定作用。雌酮为人体和动物体内天然的雌激素,能够维持雌性个体的第二生理特征及正常的内分泌系统,经常被添加到化妆品中,可以防止皮肤老化增加皮肤弹性。黄体酮和雌酮都是属于胎盘素中的活性物质，因此提供一个有效快速的激素检测方法对胎盘素中激素检测是很有意义的。
远红外光有较强的渗透力和辐射力，具有显著的温控效应和共振效应，它易被物体吸收并转化为物体的内能。远红外光被人体吸收后，可使体内水分子产生共振，使水分子活化，增强其分子间的结合力，从而活化蛋白质等生物大分子，使生物体细胞处于最高振动能级。
太赫兹波是对一个特定波段的电磁福射的统称，其频率范围在0.1-10Hz，太赫兹波具有瞬时性、相干性、低能型、透视性以及水吸收特性。通常生物分子内化学键的振动吸收频率主要在红外波段，但对于分子间的弱相互作用，如氨键、分子的旋转和晶体的声子振动等则对应于太赫兹波段，使得太赫兹技术可用于研究生物分子的结构、构型等问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测胎盘素里黄体酮和雌酮两种激素的方法，其解决了目前检测胎盘素中黄体酮和雌酮激素时使用高效液相色谱法的繁琐、耗时、高成本的问题。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：一种检测胎盘素里黄体酮和雌酮两种激素的方法，该方法包括：
(1)利用傅里叶红外光谱仪获得胎盘素针剂样本溶液的远红外及太赫兹波段光谱；
(2)利用傅里叶红外光谱仪获得黄体酮、雌酮标准品的光谱，并对比步骤(1)获取的胎盘素光谱，找到两种标准品与胎盘素对应的吸收峰频率；
(3)将胎盘素针剂溶液稀释至浓度为100％，90％，80％，70％，60％，50％，40％，30％，20％九个浓度共计九个样本，每个样本准备两份；
(4)将其中一组样品利用傅里叶红外光谱仪来检测不同浓度胎盘素溶液的光谱图；
(5)将另一组样品利用高效液相色谱法检测不同浓度胎盘素溶液中黄体酮激素和雌酮激素的含量；
(6)将不同浓度胎盘素溶液光谱图对应两种激素的吸收峰面积的数据与对应两种激素的含量真实值进行偏最小二乘法(PLS)模型的建立，得到基于谱峰峰面积的激素含量预测模型。
所述步骤(1)中，傅里叶红外光谱检测过程中，使用光源为高压弧汞灯的远红外照射，背景和扫描样品次数均为64次，分辨率为4cm-1，样品扫描波数范围从30cm-1到680cm-1；
液体池取50um厚度，液体池窗使用聚乙烯材料。
所述步骤(2)中，黄体酮与雌酮纯品采用压片处理制备样本，分别提取50mg黄体酮与60mg雌酮，在研磨机中设置70Hz参数进行研磨，研磨后取粉末，放置压片磨具中以4.5T的压力进行2分钟压片，此时压制成片效果做光谱采集较佳。此外，纯品采集光谱时不需要用液体池，以空气背景做参考。
所述步骤(2)中，黄体酮与胎盘素对应吸收峰频率为13.52THz和13.96THz；
雌酮与胎盘素对应吸收峰频率为7.45THz和10.83THz。
本发明中，对获得的光谱数据还包括：用matlab进行去趋势与平滑预处理的步骤以及使用Unscrambler X软件对所得数据进行基线矫正的步骤。对远红外太赫兹波段黄体酮激素与雌酮激素对应胎盘素中7.45THz、10.83THz、13.52THz、13.96THz频率区域做小波降噪处理。使用母小波函数选用db2,分解层数为1，去噪阈值函数选择软阈值。
所述步骤(5)中，高效液相色谱法采用色谱柱Agilent C18(4.6mm×250.0mm，5μm)，流动相采用乙腈-水(70∶30)等梯度洗脱，流速1.0mL/min，检测波长225nm，柱温30℃，进样量10μL。
所述步骤(6)中，使用偏最小二乘法进行预测模型得到的黄体酮激素含量与黄体酮对应峰面积变化相关性为0.96，雌酮激素含量与黄体酮对应峰面积变化相关性为0.98。
与现有技术相比，本发明的优点为：本发明实现了基于使用太赫兹波段的远红外光谱指纹技术检测胎盘素里黄体酮和雌酮两种激素的方法，不需要耗费很长时间进行高效液相色谱法的事先准备工作，且费用高，更明显的，从拿到样品直到光谱采出配合软件分析差不多20分钟就可以得到激素含量的数据，简化了繁琐的程序。
附图说明
图1为黄体酮对比胎盘素远红外太赫兹波段光谱图。
图2为雌酮对比胎盘素远红外太赫兹波段光谱图。
具体实施方式
下面将结合示意图对本发明所采用的技术方案作进一步的说明。
本发明提供的检测胎盘素里黄体酮和雌酮两种激素的方法采用布鲁克VERTEX70v红外光谱仪，室温保持在20摄氏度的外界条件。取胎盘素针剂里溶液，灌入聚乙烯材料作为池窗的液体池，选用50um光程的规格。红外光谱仪采用高压弧汞灯为光源的远红外波段，分辨率为4cm-1，波数选择范围从30cm-1到680cm-1，选用64次采集次数，多次采集并使用matlab进行去趋势和平滑处理，采集光谱前用空液体池取背景参考。同时，用分析天平称量50mg黄体酮和60mg雌酮放入红外压片磨具中，使用4.5T压力进行2mins压片，取片后，采用空气为背景去噪，同上述使用红外光谱仪参数为依据进行对激素的光谱采集。由于本实验采用的红外光谱仪为抽真空光路，用空光路采集背景单光束光谱，这时扣除的背景单光束光谱主要是扣除光路仪器各种因素的影响。得到胎盘素光谱，黄体酮光谱与雌酮光谱后对比得到，雌酮激素与胎盘素对应光谱频率为7.45THz和10.83THz，黄体酮激素与胎盘素对应光谱频率为13.52THz与13.96THz。
取胎盘素针剂等体积溶液9份，将其稀释至100％，90％，80％，70％，60％，50％，40％，30％，20％九个不同浓度的液体，每个浓度预备两份，用塑料软管将液体池腔体两端出入口连接好，并在一段连上蠕动泵，通过蠕动泵的慢速流速，将不同浓度的胎盘素充入液体池，在这个过程中，一定要保持塑料软管中没有气泡，否则无法保证液体池腔体内是否充满胎盘素溶液。基于远红外及太赫兹波段的检测，液体池的池窗材料要采用聚乙烯，聚乙烯材料在远红外波段的透射中基本没有干扰。
得到数据后，由于各种因素的影响，需要对数据进行预处理才能得到最终可以使用的数据，首先在matlab软件上对光谱线进行去趋势和平滑处理，去趋势与平滑处理可以去除一些信号的噪音，使光谱中吸收峰更加平滑有利于后续处理。由于现在的小波变换处理可以很好的对太赫兹远红外波段进行去除水汽噪声影响，我们对黄体酮激素和雌酮激素对应的四个吸收频率进行小波变换处理，使用母小波函数选用db2,分解层数为1，去噪阈值函数选择软阈值。
处理后的光谱信息，我们用Unscrambler X软件对取基线后的峰值面积进行计算得到九组数据。同时，另一组样本采用高效液相色谱法来测定含量，色谱条件参数如下：色谱柱Agilent C18(4.6mm×250.0mm，5μm)，流动相：乙腈-水(70∶30)等梯度洗脱，流速1.0mL/min；检测波长225nm；柱温30℃；进样量10μL。也可以得到九组数据。
将红外光谱仪中采集到的九组数据与高效液相色谱法采集到数据同时输入matlab编译的偏最小二乘法(PLS)模型中，得到模型的预测相关系数分别为：黄体酮激素0.96和雌酮激素0.98，这样我们可以通过建立的PLS模型得到待测胎盘素中黄体酮和雌酮的含量值。
上述仅为本发明的优选实施例而已，并不对本发明起到任何限制作用。任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的技术方案的范围内，对本发明揭露的技术方案和技术内容做任何形式的等同替换或修改等变动，均属未脱离本发明的技术方案的内容，仍属于本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种检测胎盘素里黄体酮和雌酮两种激素的方法，其特征在于，该方法包括：
(1)利用傅里叶红外光谱仪获得胎盘素针剂样本溶液的远红外及太赫兹波段光谱；
(2)利用傅里叶红外光谱仪获得黄体酮、雌酮标准品的光谱，并对比步骤(1)获取的胎盘素光谱，找到两种标准品与胎盘素对应的吸收峰频率；
(3)将胎盘素针剂溶液稀释至浓度为100％，90％，80％，70％，60％，50％，40％，30％，20％九个浓度共计九个样本，每个样本准备两份；
(4)将其中一组样品利用傅里叶红外光谱仪来检测不同浓度胎盘素溶液的光谱图；
(5)将另一组样品利用高效液相色谱法检测不同浓度胎盘素溶液中黄体酮激素和雌酮激素的含量；
(6)将不同浓度胎盘素溶液光谱图对应两种激素的吸收峰面积的数据与对应两种激素的含量真实值进行偏最小二乘法模型的建立，得到基于谱峰的峰面积的激素含量预测模型；
对获得的光谱数据还包括：用matlab进行去趋势与平滑预处理的步骤以及使用UnscramblerX软件对所得数据进行基线矫正的步骤；
所述步骤(5)中，高效液相色谱法采用色谱柱AgilentC18，流动相采用乙腈-水等梯度洗脱，流速1.0mL/min，检测波长225nm，柱温30℃，进样量10μL；
所述步骤(6)中，使用偏最小二乘法进行预测模型得到的黄体酮激素含量与黄体酮对应峰面积变化相关性为0.96，雌酮激素含量与雌酮对应峰面积变化相关性为0.98；
所述步骤(2)中，黄体酮与胎盘素对应吸收峰频率为13.52THz和13.96THz；
雌酮与胎盘素对应吸收峰频率为7.45THz和10.83THz。
2.根据权利要求1所述的检测胎盘素里黄体酮和雌酮两种激素的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，傅里叶红外光谱检测过程中，使用光源为高压弧汞灯的远红外照射，背景和扫描样品次数均为64次，分辨率为4cm-1，样品扫描波数范围从30cm-1到680cm-1；
液体池取50um厚度，液体池窗使用聚乙烯材料。
3.根据权利要求1所述的检测胎盘素里黄体酮和雌酮两种激素的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，在对黄体酮和雌酮标准品检测时，取黄体酮50mg，雌酮60mg，压片采用4.5T进行2分钟压片。
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