CN114295522B - 基于振动光谱成像的渗透深度及空间浓度分布的分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于振动光谱成像的渗透深度及空间浓度分布的分析方法，包括：在人造皮肤中引入外源性待测目标物，得到人造皮肤样品，并进行光谱采集；基于采集的光谱数据，提取最优的特征性光谱；提取待分析物的浓度贡献系数，将浓度贡献系数与待测目标物的分布关联；对人造皮肤中待测目标物的渗透深度及空间浓度分布进行成像。与现有技术相比，本发明实现了化妆品分子，药物分子，有毒物质等在皮肤中的渗透深度以及空间浓度分布的可视化分析，能够直观地看到目标组分是否穿透角质层及其在皮肤中能够渗透到的深度；本发明开发的方法可以实现在体皮肤中目标物的三维原位分析。
Description
技术领域
本发明涉及分析化学技术领域，尤其是涉及一种基于振动光谱成像的渗透深度及空间浓度分布的分析方法。
背景技术
皮肤是人体免疫系统最外层的有效屏障，也是人体最大的器官，可以防止外界异物进入身体内部，但同时也阻止了有效成分的吸收。在皮肤学中，研究外源性物质，如药物，化妆品成分或有害物质等在皮肤中的实际分布是非常有意义的。以治疗皮肤病的药物为例，研究其在皮肤中的吸收情况、浓度分布、渗透深度以及代谢情况等，不仅能够协助评估疗法的有效性，协助药物配方的持续改进，而且还能够对药物中化学成分的安全性进行评估。皮肤由外到里由角质层，表皮层和真皮层组成。角质层处于皮肤的最外层，质地坚厚，是皮肤天然的屏障，药物中的活性成分要能够穿透角质层到达表皮层或是更深的区域，接触到致病病原体并达到有效的浓度才能起到相应的作用。因此，研究药物中活性成分在皮肤中不同位点的浓度分布情况以及渗透深度能更好地指导经皮给药药物的剂量，评估其有效性。
人造皮肤(Artificial Skin)人造皮肤是利用工程学和细胞生物学的原理和方法，在体外人工研制的皮肤代用品，可以通过人造皮肤进行渗透深度及空间浓度分布的分析，以此模拟进行真实皮肤的应用场景。
目前常用黏性胶带移除角质层的方法来评估药物穿透能力、皮下药物浓度梯度和药物随时间变化浓度关系等。然而，移除角质层的方法具有破坏性，费时费力，并且不能实时地观察药物的分布或者代谢情况。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种基于振动光谱成像的渗透深度及空间浓度分布的分析方法，本技术方案采用多元线性回归建立数学模型，从皮肤的本底信号中提取目标物的信号，采用最小二乘计算浓度系数，从而实现对其浓度分布的二维以及三维成像分析。以上这些特点，为可视化分析人造皮肤中目标物的浓度空间分布奠定了良好的基础。
申请人在构思本技术方案过程中，从以下方面进行了分析，以此获取解决背景技术中问题的关键所在：
拉曼光谱是一种理想的皮肤分析技术，具有无损，原位分析等特点。通过面扫描技术采集皮肤中不同层的拉曼信号，结合化学计量学算法，实现了皮肤中外源性物质的空间分布分析。然而，目前，缺少有效的方法来检测药物分子，化妆品成分以及有毒物质在皮肤中的渗透深度以及浓度分布。
申请人进一步分析认为，拉曼和红外光谱是一种振动光谱技术，能够反映化合物的结构，携带丰富的指纹信息。光谱信号强度与待分析物浓度之间的关系遵循比尔定律，在一定浓度范围内信号强度与浓度成正比。此外，拉曼光谱是采用可见区的激光来研究中红外区的分子振动信息，具有微米级的空间分辨率和良好的穿透能力，能够高空间分辨率地研究待分析物在皮肤内的空间分布。由于皮肤本身是由蛋白质，脂肪等组成，皮肤自身的拉曼信号富含丰富的指纹信息，待分析物的拉曼信号容易被皮肤的信号所掩盖，难以通过常规的寻找特征峰的方式对其进行简单的成像。因此，需要采用合适的数据处理方法，将目标物的指纹信息从皮肤的指纹信息中提取出来。化学计量学是化学与数学、统计学、计算机科学的交叉学科，目前广泛应用于化学量测的各种数据分析。其强大的数据处理功能尤其适用于复杂体系的信息提取和分析。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明的目的是保护一种基于振动光谱成像的渗透深度及空间浓度分布的分析方法，包括以下步骤：
S1：在人造皮肤中引入外源性待测目标物，得到人造皮肤样品，并进行光谱采集；
S2：基于采集的光谱数据，提取最优的特征性光谱；
S3：从人造皮肤的最优的特征性光谱中提取待分析物的浓度贡献系数，将浓度贡献系数与待测目标物的分布关联；
S4：对人造皮肤中待测目标物的渗透深度及空间浓度分布进行成像。
进一步地，S1中包括以下步骤：
S1-1：对人造皮肤样品冷冻切片，并施加目标待测物，得到样品切片；
S1-2：在样品切片上进行二维光谱采集，以二维成像的模式间接反应目标物的纵向分布。
进一步地，S1中包括以下步骤：直接采集人造皮肤的三维光谱，即从人造皮肤表面深入逐层进行光谱采集。
进一步地，S1-2中，光谱采集过程采用面扫描方式，设置步长1～10微米，扫描宽10～1000微米、长10～1000微米的选定区域内皮肤剖面的光谱信号，得到各个空间位点的光谱数据。
进一步地，S1-1中，包括以下过程：
将目标待测物涂抹在人造皮肤表面处理0.2～24h，移除剩余没有渗透的样品，用包埋液将人造皮肤样本包埋，于-20℃条件下冷冻1～10h，采用冷冻切片机切成5～100微米厚的薄片，并平铺在CaF2窗片上。
进一步地，S2中包括以下步骤：
S2-1：计算光谱之间的相关系数；
S2-2：选择相关系数小的2～5个表性光谱数据；
S2-3：进一步选出含有信息量最多的光谱数据，得到最优的特征性光谱。
进一步地，S3中包括以下步骤：
S3-1：对提取的特征性光谱进行基线校正；
S3-2：对校正后的光谱数据进行多元线性回归建模，对人造皮肤中目标物信号进行提取；
S3-3：计算信号强度对目标物浓度的贡献系数，得到的对应浓度贡献系数的大小与待分析物浓度呈正比关系。
进一步地，S3-1中，采用自适应迭代重加权惩罚最小二乘(airPLS)对人造皮肤的光谱信号进行基线校正。
进一步地，S3-2中，对于多组分混合样品，通过对混合样本及其所含纯物质样本进行相应的矢量型的拉曼光谱测量，根据朗伯-比尔定律的加和原理，将合物的光谱信号与其中所含各物质的纯光谱信号用线性加和数学模型表出：
y＝c1x1+c2x2+…+cnxn+e(1)
式中，向量y为混合物的拉曼光谱信号，xn为第n个物质的拉曼光谱，cn为第n个物质对混合光谱y的贡献。对于面扫描数据，采用矩阵表示，式(1)可以改写成如下形式：
式中，X为各个物质的纯光谱矩阵，β为各个物质的贡献系数向量。上式可以利用最小二乘进行求解，结果为β＝(XTX)-1XTy。但是，通过最小二乘求得的β可能含有负数的系数，这与实际不符，一个物质的拉曼光谱贡献最小为0，而不可能是负值。因此对回归系数进行非负数约束，使得系数不会出现负值，结果更符合实际情况，故本文采用此方法来求解式(2)。
从混合光谱中提取目标物的光谱信号时，需将皮肤中各组分的纯光谱以及待测物的光谱放入式(2)中的X中，利用最小二乘计算混合物拉曼光谱中各个物质的贡献系数,并对计算结果进行非负数约束。然而，实际应用中，不可能测得皮肤中每种物质的纯拉曼光谱。本发明采用的解决方法是先采集空白皮肤样本的面扫描数据，从中挑选出相关性最小的一定数量的代表性光谱进行后续的研究，选出的代表性光谱是皮肤中各个物质纯光谱的线性组合。将选出的光谱连同待测配方中活性组分的光谱一同代入式(2)的矩阵X，编辑程序，对渗透有目标物的复杂拉曼光谱进行解析，求得待测物的浓度贡献系数。贡献系数的大小与皮肤中目标物的浓度呈正比。
进一步地，S4中，将S3中计算求得的浓度贡献系数以热图的方式呈现，得到待测物在人造皮肤中的渗透深度以及空间浓度分布图。
与现有技术相比，本发明具有以下技术优势；
[1]本技术方案实现了化妆品分子，药物分子，有毒物质等在皮肤中的渗透深度以及空间浓度分布的可视化分析，能够直观地看到目标组分是否穿透角质层及其在皮肤中能够渗透到的深度；
[2]本技术方案能够通过模拟实验获得皮肤角质层、表皮以及靠近表皮的真皮层中的化合物的浓度分布信息，比传统的胶带剥离角质层方法更加科学和先进，获得的信息量也更丰富；
[3]本技术方案开发的方法可以实现在体皮肤中目标物的三维原位分析，具有显著的推广价值。
附图说明
图1皮肤剖面的显微镜明场图；
图2皮肤的拉曼光谱(A)和红外光谱图(B)；
图3维生素B3的拉曼光谱(A)及其在皮肤中的分布图(B)；
图4水杨酸的拉曼光谱(左)及其在皮肤中的拉曼成像图(右)；
图5 2％透明质酸的红外光谱(A)及其红外成像图(B)；
图6羟基乙酸的拉曼光谱(A)及其在皮肤中的三维成像分析(B)。
具体实施方式
本发明属于分析化学技术领域，特别涉及一种药物分子，化妆品分子以及有毒物质在皮肤中的渗透深度以及浓度分布情况。在复杂体系中，单一指标很难解决实际问题，在全光谱范围内提取多维信息，引入多种数据处理手段，从数据驱动的角度，将光谱技术和数学手段结合，从大数据中提取有效的、多维度信息，实现皮肤中低含量目标物空间浓度分布的可视化成像分析。
本技术方案中的人造皮肤可以选用由CN108392681A方法或其他主流方法制备，或者直接从市场上购买商业化的人造皮肤。
在主要核心技术功能上：
本发明的第一个功能，提供了获取皮肤中目标物浓度分布的样品前处理方法；
本发明的第二个功能是采用化学计量学算法计算光谱之间的相关性，选取相关性最小的光谱，优化信号质量，提高计算效率；
本发明的第三个功能是采用多元线性回归建立了计算皮肤中目标物浓度的数学模型，获取了待分析物信号强度与其浓度相对应的贡献系数，将样品浓度和信号贡献系数相关联；
本发明的第四个功能，将贡献系数以热图的形式展示，实现了目标物分子在皮肤中空间浓度分布的可视化分析。
在关键的核心构思上，本技术方案中采用振动光谱成像技术(包括显微拉曼光谱成像技术和显微红外光谱成像技术)结合多元线性回归建立模型，用于研究外源性物质(包括药物分子、化妆品分子以及其他经皮渗透的物质)经皮渗透后在皮肤中的渗透深度以及空间浓度分布，包括：1)样品的制备方法；2)从混合猪皮的光谱信号中提取代表性的特征光谱数目，减小计算的工作量；3)采用特定的回归方式计算待测物分子的浓度贡献系数的方法；4)将浓度系数以热图的形式可视化显示的方法。本发明提供了一种待分析物在皮肤中渗透深度以及空间浓度分布的可视化分析方法。可以用于外源性物质如药物分子、化妆品、有毒物质在皮肤中的穿透深度、空间浓度分布等的成像分析，具有良好的应用前景。
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。本技术方案中如未明确说明的部件型号、材料名称、连接结构、控制方法、算法等特征，均视为现有技术中公开的常见技术特征。
实施例1
本实施例中皮肤中外源性物质渗透深度以及浓度分布的二维可视化分析方法包括以下步骤：
(1)人造皮肤样品的准备
取一片人造皮肤样品，用刀片切成一厘米见方，将2％的维生素B3溶解在水中，溶液涂抹在皮肤表面，2小时后，采用冷冻切片机切成20微米厚的薄片，皮肤剖面的显微镜明场图参见图1，平铺在载体(玻璃或是CaF2窗片)上。
(2)光谱信号采集
采用面扫描技术，选定18微米宽，150微米深的长方形区域，步长3微米，X轴取7个点，Y轴取50个点，采集空白人造皮肤以及渗透有待分析物的人造皮肤的拉曼光谱，图2为皮肤样本的拉曼(A)和红外光谱图(B)。
(3)提取维生素B3的浓度系数
根据朗伯-比尔定律信号加和原理，充分利用采集的光谱全波段信息，建立多元线性回归数学模型。编辑程序，通过计算空白样本光谱两两之间的相关系数，从中选出一定数量相关性最小、携带样品信息最多的光谱。再利用选出的光谱、维生素B3的光谱建立多元线性回归模型，并用最小二乘进行求解，对求解结果进行非负约束，得到不同位置的目标物浓度的贡献系数，此系数和目标物的浓度正相关。
(4)维生素B3在皮肤中渗透深度以及浓度分布的可视化分析。
通过热图的形式，将浓度贡献系数(与目标物浓度正相关)可视化显示。图3为维生素B3的拉曼光谱(A)及其在人造皮肤中的分布图(B)。
实施例2
本实施例中皮肤中外源性物质渗透深度以及浓度分布的二维可视化方法包括以下步骤：
(1)人造皮肤样品的准备
取一片人造皮肤样品，用刀片切成一厘米见方，将2％的水杨酸溶液涂抹在皮肤表面，2小时后，将皮肤表面的样品移走，采用冷冻切片机切成20微米厚的薄片，平铺在载体(玻璃或是CaF2窗片)上。
(2)光谱数据采集
采集目标物的拉曼光谱，采用mapping技术采集空白人造皮肤样品切片以及渗透有待分析物的皮肤切片的拉曼光谱。选取18微米宽，150微米长的长方形区域，步长3微米，X轴取7个点，Y轴取50个点。
(3)计算样品浓度贡献系数
通过多元线性回归建立分析模型，编辑程序，提取代表性光谱数目，计算样品浓度贡献系数。
(4)水杨酸在皮肤中渗透深度以及浓度分布的可视化分析
编辑程序，将空间各个位点的浓度贡献系数通过热图的形式可视化显示，如图4所示。
实施例3
本实施例中皮肤中外源性物质渗透深度以及浓度分布的二维可视化方法包括以下步骤：
(1)皮肤样品的准备
取一片人造皮肤样品，用刀片切成一厘米见方，将2％的透明质酸(Mw＝20万)溶液涂抹在皮肤表面，6小时后，将皮肤表面的样品移走，采用冷冻切片机切成7微米厚的薄片，平铺在载体(玻璃或是CaF2窗片)上。
(2)光谱数据采集
采集透明质酸的红外光谱，采用面扫描技术采集空白人造皮肤切片以及渗透有待分析物的皮肤切片的红外光谱，选取30微米宽，60微米长的长方形区域采集谱图。
(3)计算样品浓度贡献系数
通过多元线性回归建立分析模型，编辑程序，提取代表性光谱数目，计算浓度贡献系数。
(4)透明质酸在皮肤中渗透深度以及浓度分布的可视化分析
编辑程序，将空间各个位点的浓度贡献系数通过热图的形式可视化显示，如图5所。
实施例4
本实施例中皮肤中外源性物质渗透深度以及浓度分布的三维可视化方法包括以下步骤：
(1)皮肤样品的准备
取一片人造皮肤样品，用刀片切成一厘米见方，将2％的羟基乙酸溶液涂抹在皮肤表面，0.5小时后，将样品表面残留的样品清理干净。
(2)光谱数据采集
采集羟基乙酸的单光谱，采用mapping技术采集空白人造皮肤以及渗透有待分析物的人造皮肤的三维拉曼光谱。采集区域设置为12微米长，6微米宽，72微米深的长方体区域，步长3微米，X轴取6个点，Y轴取3个点，Z轴取14个点。
(3)计算样品浓度贡献系数
采用多元线性回归建立分析模型，编辑程序，提取代表性光谱数目，计算浓度贡献系数。
(4)羟基乙酸在皮肤中的可视化分析
通过热图的形式，将浓度贡献系数及样品在皮肤中的渗透深度可视化显示，如图6所示。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种基于振动光谱成像的渗透深度及空间浓度分布的分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：在人造皮肤中引入外源性待测目标物，得到人造皮肤样品，并进行光谱采集；
S2：基于采集的光谱数据，提取最优的特征性光谱；
S3：从人造皮肤的最优的特征性光谱中提取待分析物的浓度贡献系数，将浓度贡献系数与待测目标物的分布关联；
S4：对人造皮肤中待测目标物的渗透深度及空间浓度分布进行成像；
S1中包括以下步骤：
S1-1：对人造皮肤样品冷冻切片，并施加目标待测物，得到样品切片；
S1-2：在样品切片上进行二维光谱采集，以二维成像的模式间接反应目标物的纵向分布；
S1-1中，包括以下过程：
将目标待测物涂抹在人造皮肤表面处理0.2~24 h，移除剩余没有渗透的样品，用包埋液将人造皮肤样本包埋，于-20℃条件下冷冻1~10 h，采用冷冻切片机切成5~100微米厚的薄片，并平铺在CaF2窗片上。
2.根据权利要求1所述的一种基于振动光谱成像的渗透深度及空间浓度分布的分析方法，其特征在于，S1中包括以下步骤：直接采集人造皮肤的三维光谱，即从人造皮肤表面深入逐层进行光谱采集。
3.根据权利要求1所述的一种基于振动光谱成像的渗透深度及空间浓度分布的分析方法，其特征在于，S1-2中，光谱采集过程采用面扫描方式，设置步长1~10微米，扫描宽10~1000微米、长10~1000微米的选定区域内皮肤剖面的光谱信号，得到各个空间位点的光谱数据。
4.根据权利要求1所述的一种基于振动光谱成像的渗透深度及空间浓度分布的分析方法，其特征在于，S2中包括以下步骤：
S2-1：计算光谱之间的相关系数；
S2-2：选择相关系数小的2~5个表性光谱数据；
S2-3：进一步选出含有信息量最多的光谱数据，得到最优的特征性光谱。
5.根据权利要求4所述的一种基于振动光谱成像的渗透深度及空间浓度分布的分析方法，其特征在于，S3中包括以下步骤：
S3-1：对提取的特征性光谱进行基线校正；
S3-2：对校正后的光谱数据进行多元线性回归建模，对人造皮肤中目标物信号进行提取；
S3-3：计算信号强度对目标物浓度的贡献系数，得到的对应浓度贡献系数的大小与待分析物浓度呈正比关系。
6.根据权利要求5所述的一种基于振动光谱成像的渗透深度及空间浓度分布的分析方法，其特征在于，S3-1中，采用自适应迭代重加权惩罚最小二乘对人造皮肤的光谱信号进行基线校正。
7.根据权利要求5所述的一种基于振动光谱成像的渗透深度及空间浓度分布的分析方法，其特征在于，S3-2中，对于多组分混合样品，通过对混合样本及其所含纯物质样本进行相应的矢量型的拉曼光谱测量，根据朗伯-比尔定律的加和原理，将合物的光谱信号与其中所含各物质的纯光谱信号用线性加和数学模型表出。
8.根据权利要求1所述的一种基于振动光谱成像的渗透深度及空间浓度分布的分析方法，其特征在于，S4中，将S3中计算求得的浓度贡献系数以热图的方式呈现，得到待测物在人造皮肤中的渗透深度以及空间浓度分布图。
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