CN113712897B - 一种可溶性微针介导的载紫草素的透皮递药系统及其制备 - Google Patents

一种可溶性微针介导的载紫草素的透皮递药系统及其制备 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可溶性微针介导的载紫草素的透皮递药系统及其制备，可溶性微针介导的载紫草素的透皮递药系统为载细胞膜包覆紫草素聚合物胶束微针；微针基质包括细胞膜包覆的载紫草素的pH响应型聚合物胶束，细胞膜包覆的载紫草素的聚合物胶束包括载紫草素的聚合物胶束和包覆在其外的细胞膜，载紫草素的聚合物胶束包括透明质酸‑熊果酸‑N‑三苯甲基‑L‑组氨酸甲酯盐酸盐嵌段共聚物胶束和负载在其上的紫草素。本发明以人角质形成细胞膜包覆pH响应性聚合物胶束，构建具有表皮主动靶向作用的载药系统，以微针为辅助透皮递送抗炎药物紫草素，增加药物在银屑病样皮肤病变部位的蓄积，延长其作用时间，提高疗效，极具应用前景。

Description

一种可溶性微针介导的载紫草素的透皮递药系统及其制备
技术领域
本发明属于制药技术领域，涉及一种可溶性微针介导的载紫草素的透皮递药系统，特别涉及一种能够主动靶向进行银屑病的治疗的可溶性微针介导的负载紫草素的pH响应型包膜纳米胶束。
背景技术
银屑病是一种人角质形成细胞异常增殖的慢性炎症性皮肤疾病，临床表现主要为皮肤有红斑、白色片状鳞屑、角质增厚等。关于银屑病的发病机制暂不确切，一般认为IL-23/Th17轴活化是其发病的主要原因。目前被认可的治疗手段主要有局部给药治疗(如维生素D3类、糖皮质类激素等药膏)、紫外线照射疗法、全身性系统疗法(如静脉注射、口服环孢素、甲氨蝶呤等)、依那西普等生物药物治疗，但这些治疗手段均存在不同程度的缺点，如药效不佳、口服久服易对肝肾造成负担、生物疗法价格昂贵等，因此有必要研发新的毒性低、疗效好、价格低的新型制剂。
紫草素(Shikonin，SKN)是从中药紫草中提取的一种萘醌类化合物。其抗炎作用强，是治疗皮炎、皮肤创伤修复、溃疡等的常用药，在皮肤科应用广泛。关于紫草素治疗银屑病的报道较多，紫草素可分别抑制IL-17A和IL-22诱导的人角质形成细胞异常增殖，同时可抑制IL-23的表达。紫草素制剂如紫草注射液、紫草膏、复方紫草蛇蝎片等均已被临床应用于银屑病的治疗。但紫草素不溶于水，稳定性低，经皮给药吸收较差。
近年来，基于纳米载体的新型经皮给药系统可有效提升药物的经皮递送效率，且具有一定的毛囊靶向性。聚合物胶束(Polymeric micelles，PMs)是一种由人工合成的两亲性嵌段共聚物在水溶液中自组装形成的纳米载体，其中疏水嵌段为内核，亲水嵌段构成其外壳，粒径小，载药量高，结构较稳定，生物相容性较好，对难溶性药物具有增溶作用。通过对聚合物胶束化学修饰改善其脂溶性，将难溶性药物包覆或化学键合于胶束中，增强促渗作用。为改善药物的释放，目前已开发出智能聚合物胶束，该类载体通常具有热敏性或pH敏感性，可以响应特定的生理触发条件(pH、温度等)释放药物，将药物输送到活性表皮、上层真皮或毛囊等；基于细胞膜的仿生纳米粒通过将细胞膜的仿生特征与纳米材料的功能多样性相结合来提高药物的递送。细胞膜包裹仿生纳米粒技术复制了其膜来源细胞的生物学特性，将细胞膜及其表面分子完整地移接到纳米粒上，可使纳米制剂躲避机体自身的免疫清除机制，提高其在体内的稳定性，实现靶向输送药物。
由于皮肤角质层的屏障作用，常规纳米粒仍然难以直接穿越皮肤角质层而进入活性皮肤，使某些以炎性皮肤微环境为依据设计的响应型释药纳米粒的释药性能受到限制。
因此，开发一种能够穿透皮肤角质层并且针对银屑病进行主动靶向输送药物的透皮递药系统极具现实意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有递药系统难以实现靶向输送药物且难以直接穿越皮肤角质层而进入活性皮肤的缺陷，提供一种能够穿透皮肤角质层并且针对银屑病进行主动靶向输送药物的透皮递药系统，其具体是一种能够主动靶向进行银屑病的治疗的可溶性微针介导的负载紫草素的pH响应型包膜纳米胶束。该纳米胶束由具有非免疫原性、生物降解性的透明质酸以及具有酸敏感特性的组氨酸合成，其pH敏感性能在偏酸性的银屑病皮肤组织响应性释放药物；该纳米胶束以HaCaT细胞膜包覆，借助同源细胞膜在体内的归巢特性实现了主动靶向递药；该胶束以微针为载体增强了透皮效果。
微针(Microneedles，MNs)是由微米大小的穿透针构成的结构，它是一种具有皮下注射与皮肤贴片双重优势的微侵袭式经皮给药方式。微针在皮肤角质层上产生真实的微孔道，促进药物渗透，可以做到无痛药物输送且组织损伤最小，同时仅能穿透非神经支配的表皮及浅表真皮，在银屑病、特应性皮炎、皮肤感染和病毒性皮肤病等疾病治疗方面极具潜力。可溶性微针是近年微针领域的研究热点，其具有使用安全方便、给药剂量准确等优点，将纳米载体与可溶性微针联用，通过直接将纳米粒导入皮肤增加药物的经皮渗透，发挥在组织中的释药优势。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种可溶性微针介导的载紫草素的透皮递药系统，为载细胞膜包覆紫草素聚合物胶束微针；
所述载细胞膜包覆紫草素聚合物胶束微针的微针基质包括细胞膜包覆的载紫草素的pH响应型聚合物胶束，细胞膜包覆的载紫草素的聚合物胶束包括载紫草素的聚合物胶束和包覆在载紫草素的聚合物胶束外的细胞膜，载紫草素的聚合物胶束包括透明质酸-熊果酸-N-三苯甲基-L-组氨酸甲酯盐酸盐(HA-UA-His)嵌段共聚物胶束和负载在透明质酸-熊果酸-N-三苯甲基-L-组氨酸甲酯盐酸盐(HA-UA-His)嵌段共聚物胶束上的紫草素(SKN)。
作为优选的技术方案：
如上所述的一种可溶性微针介导的载紫草素的透皮递药系统，所述微针基质包括质量比为(1～10):(1～5):(1～10)的刺梧桐胶、聚乙烯醇(PVA)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，优选地，包括质量比为4:1:2的刺梧桐胶、聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮。
如上所述的一种可溶性微针介导的载紫草素的透皮递药系统，所述透明质酸-熊果酸-N-三苯甲基-L-组氨酸甲酯盐酸盐(HA-UA-His)嵌段共聚物中透明质酸、熊果酸和N-三苯甲基-L-组氨酸甲酯盐酸盐的质量比为(1～5):(1～10):(1～10)，优选地，质量比为1:6:3.7。
如上所述的一种可溶性微针介导的载紫草素的透皮递药系统，所述细胞膜为HaCaT细胞膜；所述载紫草素的聚合物胶束中透明质酸-熊果酸-N-三苯甲基-L-组氨酸甲酯盐酸盐(HA-UA-His)嵌段共聚物的浓度为1～100mg/mL，紫草素的浓度为1～1000mg/mL，优选地，载紫草素的聚合物胶束中透明质酸-熊果酸-N-三苯甲基-L-组氨酸甲酯盐酸盐(HA-UA-His)嵌段共聚物的浓度为5.0mg/mL，紫草素的浓度为1.25mg/mL。
此外，本发明还提供了制备如上所述的可溶性微针介导的载紫草素的透皮递药系统的方法，其步骤如下：
(1)合成透明质酸-熊果酸-N-三苯甲基-L-组氨酸甲酯盐酸盐(HA-UA-His)嵌段共聚物：
(2)将紫草素溶液滴入透明质酸-熊果酸-N-三苯甲基-L-组氨酸甲酯盐酸盐(HA-UA-His)嵌段共聚物溶液中混合，旋蒸、探针超声、过微孔滤膜制得载紫草素的聚合物胶束：
(3)采用差速离心法提取HaCaT细胞膜并挤出得到细胞膜囊泡挤出液，将载紫草素的聚合物胶束加入细胞膜囊泡挤出液后融合塑型制得细胞膜包覆的载紫草素的聚合物胶束；
(4)混合刺梧桐胶、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮和细胞膜包覆的载紫草素的聚合物胶束得到微针基质后，制得载细胞膜包覆紫草素聚合物胶束微针，即完成可溶性微针介导的载紫草素的透皮递药系统的制备。
作为优选的技术方案：
如上所述的方法，其具体步骤如下：
(1)合成透明质酸-熊果酸-N-三苯甲基-L-组氨酸甲酯盐酸盐(HA-UA-His)嵌段共聚物：
(1.1)在催化剂的存在下，熊果酸(UA)和N-三苯甲基-L-组氨酸甲酯盐酸盐(His)在1～200℃(优选为40℃)的第一有机溶剂下发生反应(40℃水浴搅拌24h)，得到熊果酸-N-三苯甲基-L-组氨酸甲酯盐酸盐(UA-His)反应混合液；
(1.2)将缓冲液加入到熊果酸-N-三苯甲基-L-组氨酸甲酯盐酸盐(UA-His)反应混合液，取沉淀，减压干燥得到熊果酸-N-三苯甲基-L-组氨酸甲酯盐酸盐(UA-His(Trt))中间体；
(1.3)透明质酸(HA)溶于第二有机溶剂，50℃水浴搅拌溶解，熊果酸-N-三苯甲基-L-组氨酸甲酯盐酸盐(UA-His(Trt))中间体溶于第一有机溶剂，在催化剂的存在下，两者混合(冰浴搅拌2h)在1～200℃(优选为50℃)下搅拌反应(其中50℃搅拌6h，室温继续搅拌48h)，得到反应混合液；
(1.4)反应混合液分别在第一透析液、第二透析液中透析2d，除水不溶性杂质，冷冻干燥得到透明质酸-熊果酸-N-三苯甲基-L-组氨酸甲酯盐酸盐HA-UA-His(Trt)白色粉末；
(1.5)透明质酸-熊果酸-N-三苯甲基-L-组氨酸甲酯盐酸盐HA-UA-His(Trt)白色粉末溶于第三有机溶剂，加入苯甲硫醚，在室温下搅拌24h后，分别在第三透析液、第二透析液中透析2d，除水不溶性杂质，得到透明质酸-熊果酸-N-三苯甲基-L-组氨酸甲酯盐酸盐(HA-UA-His)嵌段共聚物；
(2)制备载紫草素的聚合物胶束：
(2.1)将透明质酸-熊果酸-N-三苯甲基-L-组氨酸甲酯盐酸盐(HA-UA-His)嵌段共聚物溶于PBS缓冲溶液，得到水相；
(2.2)将紫草素与第四有机溶剂超声溶解，得到有机相；
(2.3)将有机相滴入水相混合，旋蒸除去有机相，探针超声、过微孔滤膜得到载紫草素的聚合物胶束；
(3)制备细胞膜包覆的载紫草素的聚合物胶束：
(3.1)将HaCaT细胞低渗处理，采用差速离心法提取HaCaT细胞膜，采用迷你挤出仪挤出形成细胞膜囊泡挤出液；
(3.2)将载紫草素的聚合物胶束加入细胞膜囊泡挤出液，通过迷你挤出仪融合塑型，制得细胞膜包覆的载紫草素的聚合物胶束；
(4)制备载细胞膜包覆紫草素聚合物胶束微针：
(4.1)将刺梧桐胶研碎，加入去离子水加热溶胀；
(4.2)将步骤(4.1)制得的刺梧桐胶与聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮混合，加入细胞膜包覆的载紫草素的聚合物胶束，搅拌使溶解，离心除去气泡；
(4.3)将基质浇铸于微针模具，置于真空干燥器，抽真空入模，用新凝胶状溶液填充模具，放入干燥器中干燥完全，脱模即得载细胞膜包覆紫草素聚合物胶束微针，完成可溶性微针介导的载紫草素的透皮递药系统的制备。
如上所述的方法，所述第一有机试剂为N,N-二甲基甲酰胺(DMF)；所述第二有机试剂为无水甲酰胺；所述第三有机溶剂为体积比为1:1的三氟乙酸和N,N-二甲基甲酰胺(DMF)的混合物；所述催化剂为1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合物(步骤(1.1)的催化剂为质量比为1.03:0.288的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合物，步骤(1.3)的催化剂为质量比为48:29的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合物)；所述缓冲液为Na2CO3-NaHCO3溶液(pH>8)；所述第一透析液为体积比为1:2的乙醇和水的混合物；所述第二透析液为蒸馏水；所述第三透析液为Na2CO3-NaHCO3溶液(pH＝9～10)。
如上所述的方法，步骤(2)中，所述第四有机溶剂为体积比为(1～10):(1～10)的丙酮与乙醇的混合溶液；所述有机相与水相的体积比为(1～10):(1～10)；所述旋蒸温度为1～200℃，转速为1～1000rpm；所述探针的超声功率为1～1000W，超声时间为1～120min；所述微孔滤膜的孔径为0～1000μm。
优选地，所述第四有机溶剂为体积比为3:2的丙酮与乙醇的混合溶液；所述有机相与水相的体积比为4:1；所述旋蒸温度为40℃，转速为70rpm；所述探针的超声功率为97.5W，超声时间为10min；所述微孔滤膜的孔径为0.8μm。
如上所述的方法，步骤(3)中，所述差速离心法为1～10000×g离心1～1000min，取上清，1～10000×g 1～100℃超高速离心1～1000min，取上清，1～1100000×g 1～100℃离心1～1000min，取沉淀，得到HaCaT细胞膜；
所述融合塑型是指通过聚酯纤维800nm、400nm、200nm多次挤出；
所述载紫草素的聚合物胶束与细胞膜囊泡挤出液的体积比为(1～10):(1～10)。
优选地，所述差速离心法为3000×g离心5min，取上清，2000×g 4℃超高速离心20min，取上清，110000×g 4℃离心120min，取沉淀，得到HaCaT细胞膜；
所述融合塑型是指通过聚酯纤维800nm、400nm、200nm多次挤出；
所述载紫草素的聚合物胶束与细胞膜囊泡挤出液的体积比为2:1。
如上所述的方法，步骤(4)中，所述离心为1～10000×g离心1～150min；所述抽真空的真空度为(–0.001)～(–0.99)Mpa，真空时间1～150min。
优选地，所述离心为3141×g离心15min；所述抽真空的真空度为–0.08Mpa，真空时间15min。
有益效果：
(1)本发明的可溶性微针介导的载紫草素的透皮递药系统，以人角质形成细胞(HaCaT)膜包覆pH响应性聚合物胶束，构建具有表皮主动靶向作用的载药系统，以刺梧桐胶复合微针为辅助，透皮递送抗炎药物紫草素，增加药物在银屑病样皮肤病变部位的蓄积，延长其作用时间，提高紫草素治疗银屑病的疗效；
(2)本发明的可溶性微针介导的载紫草素的透皮递药系统的制备方法，工艺简单，成本低廉，极具应用前景。
附图说明
图1为HA-UA-His嵌段共聚物的合成路线图；
图2为UA、His、HA、UA-His(Trt)及HA-UA-His的红外图谱(分别对应图中A、B、C、D、E)；
图3～7分别为UA、His、HA、UA-His(Trt)及HA-UA-His的核磁氢谱图；
图8为载紫草素的聚合物胶束的粒径电位图(对应A图)及透射电镜图(对应B图)；
图9为细胞膜包覆的载紫草素的聚合物胶束的粒径电位图(对应A图)及透射电镜图(对应B图)；
图10为载细胞膜包覆紫草素聚合物胶束微针的阵列SEM图；
图11为载细胞膜包覆紫草素聚合物胶束微针的皮肤穿刺深度测试的示意图；
图12为载细胞膜包覆紫草素聚合物胶束微针进行溶解性实验的示意图(A为透明质酸为基质的微针，B为刺梧桐胶为基质的微针)；
图13为聚合物胶束对TNF-α诱导的HaCaT细胞增殖作用的影响(A为空白载体的细胞毒作用，B为不同紫草素制剂的细胞毒作用)；
图14为HaCaT细胞对聚合物胶束的摄取能力(A为HaCaT细胞对胶束与细胞膜包覆胶束的摄取，B为HaCaT细胞与CCC-ESF-1细胞对细胞膜包覆胶束的摄取)；
图15为聚合物胶束在不同pH释放介质中的体外释放(A为载药胶束，B为细胞膜包覆载药胶束)；
图16为不同载SKN制剂体外透皮行为(A为累积透皮曲线，B为透皮速率，C为皮肤滞留量，D为表皮与真皮滞留量)；
图17为不同制剂对小鼠银屑病皮肤组织病理变化的影响；
图18为不同制剂处理后银屑病皮肤皮损组织处免疫组化检测STAT3、p-STAT3、CEBPD蛋白表达水平；
图19为WesternBlot检测STAT3、p-STAT3、CEBPD蛋白表达情况；
图20为Real-Time PCR检测细胞因子IL-17、IL-23的mRNA表达水平；
图21为血清中Th17细胞相关因子、基质金属蛋白酶、趋化因子表达水平。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式做进一步阐述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例1
一种透明质酸-熊果酸-N-三苯甲基-L-组氨酸甲酯盐酸盐(HA-UA-His)嵌段共聚物的合成方法，其合成路线如图1所示，具体包括如下步骤：
(1)称取0.6g UA溶于5mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入1.03g 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和0.288gN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温下磁力搅拌24h。
(2)称取0.37gHis溶于5mL DMF中，加入150μL三乙胺。将UA混合液缓慢加入到His混合液中，40℃水浴下磁力搅拌24h。将冷Na2CO3、NaHCO3溶液(pH>8)缓慢滴加入UA-His反应混合液中，至不再产生沉淀为止，离心取沉淀，减压干燥得UA-His(Trt)中间体。
(3)将0.1g HA溶于5mL无水甲酰胺中，50℃水浴下搅拌使其完全溶解。加入96mgEDC和58mgNHS，冰浴搅拌2h。然后将干燥好的UA-His(Trt)溶于5mL DMF中，缓慢加入到HA混合溶液中，50℃下搅拌6h，室温下继续搅拌48h。将反应混合液先后用乙醇/水(1:2，v/v)和蒸馏水各透析2d，离心除去不溶于水的杂质，冷冻干燥得HA-UA-His(Trt)白色粉末。
(4)将0.1g HA-UA-His(Trt)溶于等体积混合的5mL三氟乙酸和DMF溶剂中，加入25μL苯甲硫醚，室温搅拌24h。反应液分别在碱水(pH＝9-10)和蒸馏水中各透析2d，离心除去水不溶性杂质，冷冻干燥得HA-UA-His嵌段共聚物。
UA、His、HA、UA-His(Trt)、HA-UA-His的红外图谱如图2所示(分别对应图2中的A、B、C、D、E)，其中3449cm-1处的宽峰为HA上-COOH和-OH伸缩振动的多重峰，2990～2852cm-1处为UA上-COOH的特征吸收峰，1741cm-1和1159cm-1处新出现的峰是由His上-N＝CH＝C-和-N＝CH-引起的，属于His的特征峰，此外2956cm-1、2885cm-1的峰是由His和UA上的甲基以及亚甲基的伸缩振动引起的，3389cm-1、1655cm-1处的峰为UA与His形成的酰胺键特征吸收峰，1066cm-1处的峰为HA与UA-His形成的酯键特征峰。
UA、His、HA、UA-His(Trt)、HA-UA-His的核磁氢谱图如图3～7所示，其中显示化学位移2.0ppm处为-NHCOCH3的甲基质子，7～8ppm处为His咪唑环上的-N＝CH＝C-和-N＝CH-中的次甲基特征信号，0.75～2.0ppm处的甲基与亚甲基信号峰表明UA成功连接至HA与His上。以上检测结果证明HA-UA-His合成成功，同时其得率为55％。
实施例2
一种载紫草素的聚合物胶束的制备方法，具体如下：
精密称取HA-UA-His于西林瓶中，加入一定量PBS缓冲溶液，搅拌使溶解，使浓度为5.0mg/mL。称取适量SKN，加入丙酮与乙醇混合溶液(3:2，v/v)超声溶解，浓度为1.25mg/mL，作为有机相。将有机相在磁力搅下缓慢滴入水相中，待滴加完毕后，用旋蒸仪在40℃、70rpm下旋蒸除去有机相，97.5W冰浴探头超声10min，过0.8μm的微孔滤膜，即制得载紫草素的聚合物胶束。
载紫草素的聚合物胶束的粒径电位图及透射电镜图如图4所示，由图4可以看出，其平均粒径为241.2±7.81nm，PDI为0.243±0.045，Zeta电位为-17.7±1.0mV，可以看出制得的载药胶束的稳定性较好，粒径分布较均一，制得的载紫草素的聚合物胶束粒径呈现明显的丁达尔效应，透射电镜观察到大小均一的球形核壳结构胶束粒子。
实施例3
一种可溶性微针介导的载紫草素的透皮递药系统(载细胞膜包覆紫草素聚合物胶束微针)的制备方法，其步骤如下：
(1)HaCaT细胞膜的提取和纯化
采用差速离心法提取HaCaT细胞膜。待HaCaT细胞融合度约为100％时，用适量胰酶消化15min，加3倍量培养基终止消化，785×g离心3min，弃上清，加入PBS与超纯水的混合低渗溶液20mL(7:3，v/v)吹打均匀，冰水浴磁力搅拌4h，3000×g离心5min，取上清，2000×g 4℃超高速离心20min，取上清，110000×g 4℃离心70min，弃上清，加PBS配平后，继续110000×g 4℃离心70min，弃上清，加0.5mL PBS吹打至沉淀混合完全，放于4℃冰箱中备用。
(2)细胞膜包覆的载紫草素的聚合物胶束
取提纯的细胞膜，吹打均匀后，用迷你挤出仪依次通过聚酯纤维800nm、400nm多次挤出形成细胞膜囊泡。按照实施例2下的方法制备载SKN(紫草素)的聚合物胶束，取制备好的载紫草素的聚合物胶束1mL，加0.5mL细胞膜囊泡挤出液，依次过聚酯纤维800nm、400nm、200nm的滤膜以融合塑型，即制得HaCaT细胞膜包覆的载紫草素的聚合物胶束。
HaCaT细胞膜包覆的载紫草素的聚合物胶束的粒径电位图及透射电镜图如图9所示。
(3)制备载细胞膜包覆紫草素聚合物胶束微针
将刺梧桐胶研碎，加入适量去离子水加热搅拌，使其充分溶胀。称取0.4g刺梧桐胶、0.1g聚乙烯醇(PVA)和0.2g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，加入1mL细胞膜包覆的载紫草素聚合物胶束搅拌使其溶解，3141×g离心15min除去气泡，将其浇铸于微针模具中，置于真空干燥器中，保持-0.08mpa真空15min。刮出模具中未入模的胶状溶液，用无气泡的新凝胶状溶液填充模具，放于干燥器中干燥完全，脱模即得载细胞膜包覆紫草素聚合物胶束微针即可溶性微针介导的载紫草素的透皮递药系统。
载细胞膜包覆紫草素聚合物胶束微针阵列SEM图如图10所示，由图可以看出，刺梧桐胶复合微针易于脱模，微针阵列为20×20，针体呈金字塔型，针型完整。微针高度约526±10μm，针底圆锥面直径为345±6μm，针间距为532±9μm。
载细胞膜包覆紫草素聚合物胶束微针的皮肤穿刺深度测试示意图如图11所示，由图11可以看出，微针在皮肤中形成的微通道直径随着深度的增加而逐渐减小。由于皮肤表面特有的粘弹性质以及非均匀拓扑结构，在将微针插入皮肤过程中，皮肤弯曲变形，由此造成微针穿刺深度小于微针的实测高度。当切片深度约为320μm时荧光消失，提示微针穿刺深度约为320±40μm。
载细胞膜包覆紫草素聚合物胶束微针进行溶解性实验的示意图如图12所示，其中A为透明质酸为基质的微针，B为刺梧桐胶为基质的微针，由图中可以看出，微针插入皮肤后，在初始1min内溶解较快，但随后溶解速度减慢，至15min完全溶解。
实施例4
评价聚合物胶束的细胞毒性作用的测试：
(1)TNF-α诱导HaCaT细胞建立体外培养炎症细胞模型
细胞接种：将对数期生长的HaCaT细胞用胰酶消化，加完全培养基吹打重悬，计数器计数，加适量培养基稀释，按照8×103/孔的细胞密度接种于96孔板中，每孔加100μL的细胞悬液，于37℃、5％CO2培养箱中孵育8h。
TNF-α诱导：待贴壁细胞融合度约60％～70％时，吸去培养基，加入用完全培养基稀释浓度为80ng/ml的TNF-α100μL，于培养箱中孵育12h。建立体外培养炎症细胞模型。
(2)MTT法检测聚合物胶束对炎症细胞模型的毒性作用
采用MTT法检测空白聚合物胶束、游离SKN、载SKN聚合物胶束(SKN-PMs)、HaCaT细胞膜包覆聚合物胶束(HCM/SKN-PMs)各组对炎症细胞模型的毒性作用。
细胞接种，并通过TNF-α诱导建立体外培养炎症细胞模型后，吸弃培养基，PBS清洗2次，加入以不完全培养基稀释至各药物浓度的制剂组，孵育24h，加MTT孵育4h，吸弃溶液，加DMSO溶解，检测，计算HaCaT细胞存活率。
如图13A所示，考察空白胶束对TNF-α诱导的HaCaT细胞增殖能力的影响，各浓度的细胞存活率均在90％以上，表明聚合物载体对HaCaT细胞毒性小。游离SKN、SKN-PMs以及HCM/SKN-PMs组的IC50分别为2.07±0.12μmol/L、1.92±0.08μmol/L、1.70±0.13μmol/L；与SKN-PMs相比，HCM/SKN-PMs抑制HaCaT细胞增殖作用更强。同时两胶束组的细胞毒性均强于游离SKN，这可能是因为聚合物胶束增加了药物溶解度，提高了细胞对药物的摄取量，而表面包覆HaCaT细胞膜后，由于HaCaT细胞膜固有的归巢特性，细胞膜包覆于胶束表面的膜蛋白与HaCaT细胞发生特异性粘附作用，从而呈现主动靶向性，细胞对载药胶束的摄取量更大，引发更强的细胞毒性(图13B)。
实施例5
评价聚合物胶束的细胞摄取及细胞内分布的测试：
(1)细胞摄取
将HaCaT细胞按照5×105/孔的密度接种于6孔板中，于培养箱中孵育8h，加入80ng/mL TNF-α2mL孵育12h。除对照组(对应图14中的control组)外，其他组加入用不完全培养基稀释至1μg/mL的C6标记制剂，孵育2h后，吸弃溶液，PBS清洗3次，各组加胰酶消化15min，将细胞悬液转移至离心管中，2356×g离心3min，弃上清，加PBS1mL吹打后同样离心力离心3min，弃上清，加1mL PBS溶液不吹打直接离心，弃上清，加0.5mL PBS吹打均匀，转移至流式管中，迅速于流式细胞仪测定荧光强度。
HCM/C6-PMs组细胞荧光强度为C6-PMs组的2倍，即与裸胶束相比，细胞膜包覆显著增加了细胞对胶束的摄取量(p<0.0001)。同时比较表皮层HaCaT细胞与真皮层CCC-ESF-1细胞对HaCaT细胞膜包覆胶束的摄取，两者之间的摄取量也存在明显差异(p<0.0001)，这进一步佐证了HaCaT细胞膜包覆聚合物胶束具有同源靶向能力，能够与HaCaT细胞产生特异性粘附作用，从而增加对胶束的摄取量(图14)。
(2)细胞内分布
按照8×104/皿的密度将HaCaT细胞接种于激光共聚焦培养皿中，孵育8h，加入80ng/mL TNF-α1mL，孵育12h，弃去培养基，加入用不含FBS培养基稀释至1μg/mL的C6标记胶束，孵育2h，吸弃孵育液，PBS清洗3次，加入4％多聚甲醛溶液固定20min，PBS清洗3次，加入Hoechast 33342染料1mL，孵育13min，弃去染液，PBS清洗3次，加0.5mL PBS，避光转移放置于激光共聚焦显微镜下观察(Hoechast 33342：Ex/Em为415nm/485nm；C6：Ex/Em为498nm/568nm)。
选用Hoechast 33342作为细胞核的复染液，它与dsDNA结合可以发出蓝色荧光。C6代替难溶性药物制备胶束，它可以被细胞摄取而存在于细胞膜与细胞质中，用以上两种荧光染料定位细胞内摄取情况。C6-PMs组细胞内绿色荧光强度明显弱于HCM/C6-PMs组，表明HaCaT细胞膜包覆聚合物胶束后，形成的仿生纳米载体可以将药物靶向定位于HaCaT细胞。
实施例6
评价聚合物胶束在不同pH释放介质中的体外释放的测试：
分别将SKN-PMs和HCM/SKN-PMs以对应释放介质稀释至SKN浓度均为60μg/mL，取2mL置于透析袋(截留分子量为14000Da)中，置于pH分别为5.0、6.0、6.5、7.4的40mL释放介质(2％十二烷基硫酸钠(SDS)和30％乙醇的PBS混合溶液，满足漏槽条件)中，37℃恒温振荡器中100rpm振荡，分别于30min、1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h、48h、72h取样1mL，同时补充等体积相同温度的空白释放介质。所得样品7853×g离心5min，取上清，HPLC检测。绘制累积释放曲线。
SKN-PMs与HCM/SKN-PMs的累积释放率均随着pH的降低而增加，证明该聚合物胶束具有pH响应释药特性，且经细胞膜包覆后保留了聚合物胶束的pH响应释药特性(图15)。
实施例7
评价聚合物胶束的体外透皮行为的测试：
取新鲜SD大鼠皮肤，刮去筋膜，生理盐水清洗。Franz扩散池的接收池中均加12.5mL释放介质(20％PEG-400和20％乙醇的混合溶液)，保持32℃恒温，离体皮肤角质层朝上固定。给药池中加入2mL的各载SKN制剂，微针组按压微针于皮肤上(各组含药量均保持一致)。分别于1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h取1mL接收介质，同时补加同体积预热至32℃的新鲜释放介质。样品7853×g离心5min，取上清以HPLC检测。
各组透皮速率大小排序为MNs-SKN-PMs>MNs-HCM/SKN-PMs>MNs-Free SKN>FreeSKN，聚合物胶束粒径小且分散均一，促渗作用明显，而微针辅助可显著增加药物的经皮渗透(p<0.05)(图16)。
MNs-SKN-PMs组药物在真皮层的分布显著大于表皮层，提示微针刺入皮肤后形成的微通道可突破角质层屏障，增加向皮肤深层的药物递送。而MNs-HCM/SKNPMs组表皮层的药量却大于真皮层，表明微针溶解后，细胞膜包覆的载药胶束可主动靶向至活性表皮层。
实施例8
评价聚合物胶束的体内抗银屑病药效学的测试：
(1)BAL B/c小鼠银屑病模型建立及给药方法
取健康BALB/c小鼠60只，按照每组6只，分为①正常组、②模型组、③阳性药组、④空白微针组、⑤游离药组、⑥载SKN聚合物胶束组(SKN-PMs)、⑦微针载SKN聚合物胶束组(MNs-SKN-PMs)、⑧微针载SKN膜包覆聚合物胶束组(MNs-HCM/SKN-PMs)、⑨载SKN聚合物胶束组(尾静脉)、⑩载SKN膜包覆聚合物胶束组(尾静脉)10组。
剃毛刀剃除BAL B/c小鼠背部面积约为2cm×2cm的毛发，正常饲养1d以恢复角质层。背部裸露处涂抹80mg的咪喹莫特乳膏至皮肤吸收，6h后给予各组药物。模型组造模处涂抹适量生理盐水作为安慰剂；阳性药组造模处涂抹地塞米松乳膏(以地塞米松计，0.09mg/cm2)；空白微针组造模处施以空白刺梧桐胶复合微针；⑤～⑧组分别于造模处施以SKN原料药溶液、载SKN聚合物胶束制剂、微针载SKN聚合物胶束、微针载SKN膜包覆聚合物胶束，⑨、⑩组分别将载SKN聚合物胶束、载SKN膜包覆聚合物胶束稀释到适宜浓度，小鼠尾静脉给药。⑤～⑩各组SKN给药剂量统一为70μg/d。
(2)病理切片H&E染色
各组别小鼠造模并给药5d，第6d拍照结束后，摘眼球取血、处死，同时剥离皮损组织，取部分皮肤，4％多聚甲醛固定，石蜡包埋、切片以及H&E染色。于显微镜下观察各组切片病理状态，并用IPP 6.0软件测量相同放大倍数下各组别H&E染色切片中的棘层平均增厚厚度。
如图17所示，正常组皮肤组织中未见明显病理性变化；模型组表皮棘细胞增生且明显增厚，乳头部成杵状水肿并向上延伸，上皮表面可见痂皮覆盖，呈明显角化过度，表明造模成功；游离药组与空白微针组皮肤角化过度现象未得到改善，上皮表面均可见角质层变性坏死且大量中性粒细胞浸润；尾静脉注射组角化过度及角化不全稍有减轻，但表皮下仍有炎细胞浸润，水肿较严重。与模型组相比，空白微针组皮肤棘层厚度无明显减少(p>0.05)，而阳性药组、SKN-PMs组、MNs-SKN-PMs组、MNs-HCM/SKN-PMs组棘细胞增厚病理情况均大有改善(p<0.0001)，改善情况排序为:阳性药组>MNs-HCM/SKN-PMs组>MNs-SKN-PMs组>SKN-PMs组>游离药组。
(3)皮损组织处STAT3、p-STAT3、CEBPD蛋白表达水平
①免疫组化检测
取各组石蜡切片脱蜡，柠檬酸缓冲液抗原修复，依次加即用型免疫组化试剂盒A液孵育、B液封闭，将anti-STAT3、Phospho-Stat3(Tyr705)、anti-CEBPD作为一抗4℃孵育过夜。次日分别加入C液和D液孵育，PBS清洗后，分别加入DAB试剂盒中的A液、B液、C液孵育，随后复染封片。
免疫组化检测结果显示(图18)，模型组STAT3、p-STAT3蛋白表达显著高于正常组，空白微针组与模型组无显著性差异，游离药组显著低于模型组，尾静脉组与游离药组STAT3、p-STAT3蛋白表达无显著性差异。其他载SKN制剂组中，微针载药组STAT3、p-STAT3蛋白表达显著高于SKN-PMs组，经由微针介导的膜包覆胶束组蛋白表达水平显著高于载SKN聚合物胶束微针组。
②Western Blot
剪取各组皮损组织50mg左右，各组重量误差应保持在5％以内，冰冻切片机切片，加裂解液100μL吹打均匀后置于冰上裂解20min，10994×g离心取上清。
1)电泳：将适量的Running Buffer加入电解槽中，将蛋白样品上样。在电压140V下进行电泳。
2)转膜：将凝胶取出，在Transfer buffer中组装转膜装置，将凝胶放置于NC膜上，安装完毕后将其放置于转膜槽中，倒入适量Transfer buffer，在电压为140V、冰浴1h的条件下完成转膜。
3)封闭：转膜结束后取出NC膜，使其充分浸润于封闭液中，振荡1h。
4)抗体孵育：封闭完成后，将NC膜放入塑料袋，按照一抗与封闭液1:1000的比例加入一抗溶液，于摇床振荡过夜。一抗孵育完后，取出NC膜依次重复三次加入TBST和TBS洗膜，每次进行时间为10min，然后再将NC膜放置于塑料袋中，加入二抗，同样密封，摇床振荡1h。随后洗膜。
5)底物显色：将(4)中处理好的NC膜平铺于玻璃板上适当晾干，ECL试剂盒A液和B液按照1:1比例混匀滴加以浸润NC膜，3min后控干多余水分，平铺曝光，扫描成像。
WB检测结果(图19)显示，模型组与正常组相比，其STAT3、p-STAT3表达显著提高，而空白微针组与模型组蛋白表达无显著性差异(p>0.05)，各给药组对比模型组均显著降低(p<0.0001)。SKN-PMs组抑制作用显著优于Free SKN组及尾静脉注射组(p<0.01)，微针载药组对比其他SKN制剂组，对STAT3、p-STAT3表达的抑制作用更强(p<0.05),其中MNs-HCM/SKN-PMs的抑制作用显著优于MNs-SKN-PMs(p<0.05)。同时CEBPD蛋白各组表达差异不大，与免疫组化结果一致，提示CEBPD蛋白在银屑病表皮中的可能作用机制仍需后续深入研究。
③Real-Time PCR检测
总RNA提取
1)匀浆：在标记好的EP管里加入1mL RNAiso Plus，称取约50mg皮损组织样本，物理匀浆10min后室温静置5min，离心并转移上清液。
2)总RNA提取：加入200μL氯仿，混合至溶液呈乳白色，室温静置5min后，离心并转移无色上清液，加入200μL异丙醇，混匀，室温静置10min后离心。
3)清洗RNA沉淀：弃去上清，加入75％的乙醇200μL，上下颠倒洗涤，离心后弃去上清。
4)溶解RNA：加入RNase-free dH2O 20μL溶解RNA。
5)RNA纯度分析：分光光度计测定RNA浓度和纯度(OD260/OD280)，纯度OD260/OD280在1.8～2.2之间符合质量要求。
cDNA的合成
1)基因组DNA去除反应：按照2μL 5×gDNA Eraser Buffer、1μL gDNA Eraser、1μLTotal RNA、6μL RNase free dH2O的比例配置反应体系，去除Total RNA中的DNA，室温反应5min，储存于4℃。
2)逆转录反应(cDNA合成)：继续延续上述操作，所有步骤均在冰上操作，按照10μLReaction solution from Step1、4μL 5×PrimeScript Buffer 2、1μL PrimeScript RTEnzyme Mix 1、1μL RT Primer Mix、4μL RNase Free dH2O配制反应体系，在普通PCR仪上进行逆转录反应(cDNA合成)，在PCR仪上37℃反应15min，85℃5s，将反应好的cDNA储存于4℃备用。
SYBR GREEN法进行实时荧光定量扩增
以TE Buffer溶解、稀释GAPDH、IL-17、IL-23PCR引物至10倍，待用。参照说明书，配制反应体系于96孔板中。轻轻混匀，避免产生气泡，瞬时离心5s，封上密封膜后放入StepOnePlus PCR仪器，进行PCR扩增，95℃反应30s，95℃反应5s，60℃反应30s，共40个循环，采用2-△△CT法计算各组基因相对表达量，分析皮损处IL-17、IL-23表达水平。
IL-23/Th17炎症轴在银屑病发病机理中发挥着重要作用。树突状细胞产生IL23，随后启动IL-23/Th17炎症轴，Th17细胞开始分泌IL-17A、IL-22等炎症因子。因此IL-17、IL-23是银屑病的两个重要评价指标。结果如图20，模型组中IL-17、IL-23的mRNA表达均明显高于正常组，空白微针组与模型组无显著性差异(p>0.05)，而各给药组均显著低于模型组，MNs-HCM/SKN-PMs组对IL-17、IL-23mRNA表达的抑制作用较之其他SKN制剂组更强，其中MNs-SKN-PMs组抑制作用仅次于MNs-HCM/SKN-PMs组(p<0.05)。
④血清中Th17细胞相关因子、基质金属蛋白酶、趋化因子表达水平
造模与给药5d，于第6d早上摘眼球取全血，室温静置2h，1000×g离心20min，取上清于-80℃冷藏备用。ELISA试剂盒在使用前需提前放置于室温平衡后再拆封使用，取试剂盒中对应的6个浓度标准品以及各组血清样本各50μL，空白孔不加；除空白组外，标准品与样本组均加入HRP标记的检测样本100μL，用封板膜纸封住反应孔，恒温振荡器中孵育60min。弃去各孔液体，吸水纸吸去多余水分，每孔加入350μL洗涤液，静置1min后弃去液体，吸干水分，重复洗5次，加入A、B底物各50μL，随后于450nm下检测各孔OD值，根据标准品各孔OD值建立标曲，计算各组样本Th17细胞相关因子、基质金属蛋白酶、趋化因子浓度。
结果如图21显示，模型对照组小鼠血清中IL-6、TNF-α、IL-17、IL-17F、IL-22、IL-23、CXCL1、CXCL5、MMP3各项指标均显著高于正常对照组，表明造模成功。阳性药组以及各SKN给药组均显著低于模型对照组；微针组在各SKN给药组中效果最佳，其中微针介导的包膜胶束组各项指标均小于载聚合物胶束微针组，与阳性药组无显著性差异；空白微针组与模型组各检测指标相比无显著性差异。以上结果表明，微针辅助聚合物胶束经皮给药可增强对Th17相关细胞因子、基质金属蛋白酶、趋化因子的调节作用，改善银屑病症状，而经HaCaT细胞膜包覆后，该新型经皮给药系统的药效作用进一步提高。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是本领域的技术人员应该理解，这些仅是举例说明，在不违背本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改。

Claims (7)

1.一种可溶性微针介导的载紫草素的透皮递药系统，其特征在于，为载细胞膜包覆紫草素聚合物胶束微针；
所述载细胞膜包覆紫草素聚合物胶束微针的微针基质包括细胞膜包覆的载紫草素的pH响应型聚合物胶束，细胞膜包覆的载紫草素的pH响应型聚合物胶束包括载紫草素的聚合物胶束和包覆在载紫草素的聚合物胶束外的细胞膜，载紫草素的聚合物胶束包括透明质酸-熊果酸-N-三苯甲基-L-组氨酸甲酯盐酸盐嵌段共聚物胶束和负载在透明质酸-熊果酸-N-三苯甲基-L-组氨酸甲酯盐酸盐嵌段共聚物胶束上的紫草素；
所述微针基质包括质量比为1～10:1～5:1～10的刺梧桐胶、聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮；
所述载紫草素的聚合物胶束中透明质酸-熊果酸-N-三苯甲基-L-组氨酸甲酯盐酸盐嵌段共聚物的浓度为1～100 mg/mL，紫草素的浓度为1～1000 mg/mL；
所述透明质酸-熊果酸-N-三苯甲基-L-组氨酸甲酯盐酸盐嵌段共聚物中透明质酸、熊果酸和N-三苯甲基-L-组氨酸甲酯盐酸盐的质量比为1～5:1～10:1~10；
所述细胞膜为HaCaT细胞膜。
2.制备如权利要求1所述的可溶性微针介导的载紫草素的透皮递药系统的方法，其特征在于，其步骤如下：
（1）合成透明质酸-熊果酸-N-三苯甲基-L-组氨酸甲酯盐酸盐嵌段共聚物：
（2）将紫草素溶液滴入透明质酸-熊果酸-N-三苯甲基-L-组氨酸甲酯盐酸盐嵌段共聚物溶液中混合，旋蒸、探针超声、过微孔滤膜制得载紫草素的聚合物胶束：
（3）采用差速离心法提取HaCaT细胞膜并挤出得到细胞膜囊泡挤出液，将载紫草素的聚合物胶束加入细胞膜囊泡挤出液后融合塑型制得细胞膜包覆的载紫草素的聚合物胶束；
（4）混合刺梧桐胶、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和细胞膜包覆的载紫草素的聚合物胶束得到微针基质后，制得载细胞膜包覆紫草素聚合物胶束微针，即完成可溶性微针介导的载紫草素的透皮递药系统的制备。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，其具体步骤如下：
（1）合成透明质酸-熊果酸-N-三苯甲基-L-组氨酸甲酯盐酸盐嵌段共聚物：
（1.1）在催化剂的存在下，熊果酸和N-三苯甲基-L-组氨酸甲酯盐酸盐在1～200 ℃的第一有机溶剂下发生反应，得到熊果酸-N-三苯甲基-L-组氨酸甲酯盐酸盐反应混合液；
（1.2）将缓冲液加入到熊果酸-N-三苯甲基-L-组氨酸甲酯盐酸盐反应混合液，取沉淀，减压干燥得到熊果酸-N-三苯甲基-L-组氨酸甲酯盐酸盐中间体；
（1.3）透明质酸溶于第二有机溶剂，熊果酸-N-三苯甲基-L-组氨酸甲酯盐酸盐中间体溶于第一有机溶剂，在催化剂的存在下，两者混合在1～200 ℃下搅拌反应，得到反应混合液；
（1.4）反应混合液分别在第一透析液、第二透析液中透析，冷冻干燥得到透明质酸-熊果酸-N-三苯甲基-L-组氨酸甲酯盐酸盐白色粉末；
（1.5）透明质酸-熊果酸-N-三苯甲基-L-组氨酸甲酯盐酸盐白色粉末溶于第三有机溶剂，加入苯甲硫醚，分别在第三透析液、第二透析液中透析，得到透明质酸-熊果酸-N-三苯甲基-L-组氨酸甲酯盐酸盐嵌段共聚物；
（2）制备载紫草素的聚合物胶束：
（2.1）将透明质酸-熊果酸-N-三苯甲基-L-组氨酸甲酯盐酸盐嵌段共聚物溶于PBS缓冲溶液，得到水相；
（2.2）将紫草素与第四有机溶剂超声溶解，得到有机相；
（2.3）将有机相滴入水相混合，旋蒸除去有机相，探针超声、过微孔滤膜得到载紫草素的聚合物胶束；
（3）制备细胞膜包覆的载紫草素的聚合物胶束：
（3.1）将HaCaT细胞低渗处理，采用差速离心法提取HaCaT细胞膜，挤出形成细胞膜囊泡挤出液；
（3.2）将载紫草素的聚合物胶束加入细胞膜囊泡挤出液融合塑型，制得细胞膜包覆的载紫草素的聚合物胶束；
（4）制备载细胞膜包覆紫草素聚合物胶束微针：
（4.1）将刺梧桐胶研碎，加入去离子水加热溶胀；
（4.2） 将步骤（4.1）制得的刺梧桐胶与聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮混合，加入细胞膜包覆的载紫草素的聚合物胶束，搅拌使溶解，离心除去气泡；
（4.3）将基质浇铸于微针模具，置于真空干燥器，抽真空入模，用新凝胶状溶液填充模具，放入干燥器中干燥完全，脱模即得载细胞膜包覆紫草素聚合物胶束微针，完成可溶性微针介导的载紫草素的透皮递药系统的制备。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述第一有机试剂为N,N-二甲基甲酰胺；所述第二有机试剂为无水甲酰胺；所述第三有机溶剂为体积比为1:1的三氟乙酸和N,N-二甲基甲酰胺的混合物；所述催化剂为1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的混合物；所述缓冲液为Na2CO3-NaHCO3溶液；所述第一透析液为体积比为1～10:1～10的乙醇和水的混合物；所述第二透析液为蒸馏水；所述第三透析液为Na2CO3-NaHCO3溶液。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述第四有机溶剂为体积比为1～10:1～10的丙酮与乙醇的混合溶液；所述有机相与水相的体积比为1～10:1～10；所述旋蒸温度为1~200 ℃，转速为1~1000 rpm；所述探针的超声功率为1~1000 W，超声时间为1~120 min；所述微孔滤膜的孔径为1~1000 μm。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述差速离心法为1~10000 ×g 离心1~1000 min，取上清，1~10000 ×g 1~100 ℃超高速离心1~1000 min，取上清，1~1100000 ×g 1~100 ℃离心1~1000 min，取沉淀，得到HaCaT细胞膜；
所述融合塑型是指通过聚酯纤维800 nm、400 nm、200 nm多次挤出；
所述载紫草素的聚合物胶束与细胞膜囊泡挤出液的体积比为1~10:1~10。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（4）中，所述离心为1~10000 ×g 离心1~150 min；所述抽真空的真空度为–0.001~–0.99 Mpa，真空时间1~150 min。
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