JPWO2006064807A1 - 検体前処理方法およびそれを用いた免疫測定方法 - Google Patents
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Abstract
免疫測定方法において、非特異的な反応を防止しつつ、鼻汁由来検体を測定可能にする検体前処理方法を提供する。予め、前記鼻汁由来検体をプロテアーゼで処理し、その後、免疫測定方法を実施する。前記プロテアーゼとしてセミアルカリプロテアーゼ（ＥＣ ３．４．２１．６３）を用いることが好ましい。また、本発明の前処理方法は、前記鼻汁由来検体中のインフルエンザウイルスを対象にすることが好ましい。前記免疫測定方法としては、免疫凝集法が好ましく、例えば、免疫比濁法、ラテックス免疫比濁法、スライドガラス上でのラテックス凝集法などがある。
Description
本発明は、検体前処理方法およびそれを用いた免疫測定方法に関する。
抗原抗体反応を利用した免疫測定方法は、検体若しくは試料中の成分若しくは物質を高感度に検出できるため、臨床検査の分野において、血液（血漿・血清・全血）、尿、髄液、便などの様々な検体等を対象に利用されている。抗原抗体反応を利用した免疫測定方法としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）、イムノクロマト法、免疫比濁法（ＴＩＡ法）、ラテックス免疫比濁法（ＬＴＩＡ）等の様々な方法がある。
その中でも、免疫比濁法、ラテックス免疫比濁法、スライドガラス上でのラテックス凝集法（以下、これら３つの方法をまとめて「免疫凝集法」と呼ぶことがある）は、抗原と未反応の抗体とを分離するＢ／Ｆ（Ｂｏｕｎｄ／Ｆｒｅｅ）分離の操作が不要な原理であることから、ホモジニアスイムノアッセイと呼ばれている。そして、簡便性と迅速性に優れた方法として、例えば、ＣＲＰ（Ｃ反応性蛋白）、ＡＳＯ（抗ストレプトリジンＯ）、ＲＦ（リウマチ因子）、尿中マイクロアルブミン、エラスターゼ等、多くの項目の臨床検査に適用されている。
これら免疫凝集法の測定対象検体は、血液（血清、血漿、全血）、尿、子宮頚管粘液等が一般的である。一方、鼻腔ぬぐい液、鼻腔吸引液、鼻腔洗浄液等として採取される鼻汁由来検体について測定される項目としては、インフルエンザウイルスやＲＳウイルス等、呼吸器系感染症の判定に利用されるものがある。しかし、これらの項目の測定方法は、いずれもその原理がイムノクロマト法や膜フィルターを利用したＥＩＡ法であり、鼻汁由来検体について、免疫凝集法を利用する測定方法は、未だに実用化されていない（例えば、非特許文献１〜４参照）。
さて、鼻汁由来検体は、個別の検体によって程度は違うが、ある程度の粘性を持っているものが多く、このことからもわかるように、目的とする測定対象物質の他に、糖タンパク等の高分子物質が非常に多く含まれている。イムノクロマト法や膜フィルターを利用したＥＩＡ法では、原因物質は特定されていないものの、検体中の共存物質が非特異的反応を引き起こし、間違った検査結果をもたらす場合があることが知られている。間違った検杳結果により偽陽性となる場合、真の病因特定を遅らせることになり、さらには、不適切な措置によって症状をかえって悪化させる場合もある。そのため、鼻汁由来検体は、例えば、界面活性剤を添加して粘性を低下させたり、予め、濾紙やフィルター等で鼻汁由来検体中の固形物（共存物質）を除去してから測定されている。しかしながら、それでもなお非特異的反応により多くの偽陽性が生じている。
本発明者らは、簡易なイムノクロマト法や膜フィルターを利用したＥＩＡ法と同様に、簡易な免疫凝集法でも鼻汁由来検体を測定しようと研究した。しかしながら、やはり、界面活性剤を添加したり、予め固形成分の除去処理を施すだけの検体前処理では、多くの非特異的な反応が生じてしまい、本来陰性となるべき検体が陽性、つまり偽陽性となってしまっていた。
日本小児科学会雑誌 １０８巻 ３号 ４０６−４１１（２００４） 感染症学雑誌 第７８巻 ９号 ８６５−８７１（２００４） 感染症学雑誌 第７７巻 １２号 １００７−１０１４（２００３） 医学検査 ＶＯＬ．５２ ＮＯ．２ １４１−１４４（２００３）
日本小児科学会雑誌 １０８巻 ３号 ４０６−４１１（２００４） 感染症学雑誌 第７８巻 ９号 ８６５−８７１（２００４） 感染症学雑誌 第７７巻 １２号 １００７−１０１４（２００３） 医学検査 ＶＯＬ．５２ ＮＯ．２ １４１−１４４（２００３）
そこで、本発明の目的は、免疫測定方法において、非特異的な反応を防止しつつ、鼻汁由来検体を測定可能にする検体前処理方法およびそれを用いた免疫測定方法の提供である。
前記目的を達成するために、本発明の検体前処理方法は、免疫測定方法における検体前処理方法であって、前記検体は、鼻汁由来検体であり、前記免疫測定方法の実施に先立ち、前記検体をプロテアーゼで処理する検体前処理方法である。
また、本発明の免疫測定方法は、免疫反応を利用した免疫測定方法であって、検体が鼻汁由来検体であり、この検体に対し、前記本発明の検体前処理方法により前処理を行い、その後、前記免疫反応を実施する免疫測定方法である。
このように、鼻汁由来検体を予めプロテアーゼで処理すれば、免疫測定方法であっても、非特異的な反応を防止した測定が可能となる。この結果、本発明により、簡便性と迅速性に優れた鼻汁由来検体の測定が実現できる。
つぎに、本発明について、詳しく説明する。
本発明において、前記免疫測定方法は、特に制限されないが、例えば、前記検体中の測定対象物質と、不溶性担体に担持され且つ前記測定対象物質と免疫反応する免疫学的物質とを免疫反応させ、その際に生じる前記不溶性担体の凝集度合いを測定することにより、前記測定対象物質の濃度を測定する方法（いわゆる「免疫凝集法」）がある。本発明の検体前処理方法は、前記免疫凝集法において、適用することが好ましい。
本発明に用いるプロテアーゼは、特に限定されるものではなく、例えば動物由来、植物由来の他、アスペルギルス属、バチルス属、ストレプトミセス属、リゾパス属、ペニシリウム属等の微生物由来プロテアーゼが挙げられる。具体的な酵素名としては、例えば、セミアルカリプロテアーゼ、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、ズブチリシン、プロテナーゼＫ、プロナーゼ、パパイン、ブロメラインなどが挙げられる。またプロテアーゼは、１種類だけでなく、２種類以上を併用しても良い。
鼻汁由来検体は、例えば、鼻腔ぬぐい液、鼻腔吸引液、鼻腔洗浄液として得られるものを使用することができる。
また、本発明では、測定対象物質がインフルエンザウイルスであるときに、好適に使用できる。この場合、本発明を用いると、前記不溶性担体の凝集度合いを定量することで、ウイルス量を定量的に測定することが可能である。これは、臨床症状と合わせて判断することによって、検体中のウイルス量が多い場合には、その患者での重篤度がある程度予想されるし、また、その患者から周囲の人への感染力が強いことが予想される。発症からの時間経過とともにウイルス量が減少した場合には、感染の末期であることも予想され易くなり、治療方針や患者への説明に役立てることができる。
プロテアーゼによる鼻汁由来検体の処理は、プロテアーゼを用いる以外は、特に制限されないが、例えば、プロテアーゼの酵素活性を測定する場合と同様に、酵素活性が有効なｐＨ範囲内で、一般的な条件により行うことができる。プロテアーゼがセミアルカリプロテアーゼの場合、例えば、酵素を５０ｍＭのＣＨＥＳ（Ｎ−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液（ｐＨ９．８、１重量％ｎ−Ｏｃｔａｎｏｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｃａｍｉｄｅ、０．１重量％ＥＤＴＡ・２Ｎａ、０．９重量％ＮａＣｌ、０．０９重量％アジ化ナトリウムを含む）に溶解したものを検体抽出液とし、鼻汁由来検体と反応させる。また、前記検体抽出液の緩衝液は、前述のＣＨＥＳ緩衝液に限らず、例えば、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、ＣＡＰＳ（Ｎ−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ−３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液等も好ましく使用できる。また、緩衝液のｐＨは、例えば、ｐＨ５〜１１が好ましく、このｐＨ範囲の場合、例えば、緩衝剤の種類も特に限定されるものではない。プロテアーゼがトリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、ズブチリシンの場合では、例えば、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．４、１重量％ｎ−Ｏｃｔａｎｏｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｃａｍｉｄｅ、０．０３重量％ＣａＣｌ２、０．９重量％ＮａＣｌ、０．０９重量％アジ化ナトリウムを含む）に溶解して鼻汁由来検体と反応させることができる。
これらの好ましいプロテアーゼの中でも、例えば、検体の影響を最も受け難く、さらに、前記不溶性担体との相性が特に良いことから、本発明におけるプロテアーゼとしては、セミアルカリプロテアーゼ（ＥＣ ３．４．２１．６３）を特に好ましく用いることができる。
本発明において、前記免疫測定方法は、前述のように、不溶性担体を用いた免疫凝集法を利用した方法であることが好ましい。前記不溶性担体としては、特に制限されないが、不溶性担体粒子があげられる。前記不溶性担体粒子としては、例えば、ポリスチレン製のラテックス粒子が一般的であるが、ポリスチレンに限らず、ポリプロピレン製粒子、ポリエチレン製粒子、ゼラチン粒子、金属コロイド等、抗体または抗原を感作できる粒子が使用できる。粒子と抗原又は抗体との結合は、例えば、物理的な吸着力を利用した物理吸着法を適用できるが、その他に、例えば、前記粒子上のカルボキシル基と抗原又は抗体のアミノ基を共有結合させる等、化学結合法でもよい。凝集度合いの検出方法は、例えば、濁度を測定するための分光光度計等、自動的に制御された光学測定装置を用いても良いし、凝集の有無をスライドガラス上などで目視確認する方法でも良い。
本発明において、測定対象物質がインフルエンザウイルスである場合、インフルエンザウイルスのＡ型とＢ型の鑑別を行うことが好ましい。その場合、例えば、インフルエンザウイルスの核蛋白に対して特異的な抗体を使用することが好ましい。インフルエンザウイルスの表面蛋白であるヘマグルチニン等は、抗原性が次々と変異するため、一定の抗ヘマグルチニン抗体を用いた場合、流行したウイルスの亜型によって反応性が異なってしまい、場合によっては反応しなくなる可能性がある。しかし、核蛋白に対する抗体を用いれば、核蛋白はＡ型やＢ型を分類する際の基本となる抗原性を維持しており、亜型の種類に関わらず一定の反応性を示すため、Ａ型とＢ型の鑑別に適している。
核蛋白は、ウイルス粒子の脂質二層膜からなるエンベロープの内部に局在し、ウイルス表面には存在しないため、何らかの方法で核蛋白を抽出する必要がある。その方法としては、例えば、超音波処理や凍結融解の繰り返しによる物理的なウイルス粒子の破壊や、界面活性剤等による化学的な処理方法がある。化学的な処理方法では、一般的に、Ｔｗｅｅｎ２０（商品名、一般名称：Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｓｏｒｂｉｔａｎ Ｍｏｎｏｌａｕｒａｔｅ）のような非イオン性界面活性剤等の抽出剤で抽出する方法がある。ＥＩＡ法やイムノクロマト法等の従来法では、抗原の抽出に界面活性剤であるＴｗｅｅｎ２０を用いているが、Ｔｗｅｅｎ２０をそのままラテックス免疫比濁法に適用すると、抗原に対する反応性が著しく低下してしまう。このような場合、界面活性剤として、ｎ−Ｏｃｔａｎｏｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｃａｍｉｄｅ（商品名：ＭＥＧＡ−８）を使用すれば、ラテックス免疫比濁反応の反応性に及ぼす影響が少なく、かつ、抽出効果もあるため、好ましい。
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記の実施例に限定されない。
（実験１）抗インフルエンザＡ型抗体感作ラテックスの調製
抗インフルエンザＡ型マウスモノクローナル抗体を０．８ｍｇ／ｍＬになるように調製した抗体液（５０ｍＭリン酸緩衝液 ｐＨ７．４）０．５ｍＬと、１％（ｗ／ｖ）ポリスチレンラテックス粒子（積水化学社製、平均粒子径０．５μｍ）０．５ｍＬとを混合し、３７℃で１時間インキュベートして抗体をラテックスに感作した。そこに、ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ社製、ウシ血清アルブミン）を１重量％となるように添加し、３７℃で１時間インキュベートしてブロッキングを行った。ブロッキングされた抗体感作ラテックスを５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した後、０．１％（ｗ／ｖ）になるようにラテックス分散緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液 ｐＨ８．４、０．１重量％ＢＳＡ，０．１重量％ＮａＮ３）に分散させて、抗インフルエンザＡ型抗体感作ラテックス試液とした。
抗インフルエンザＡ型マウスモノクローナル抗体を０．８ｍｇ／ｍＬになるように調製した抗体液（５０ｍＭリン酸緩衝液 ｐＨ７．４）０．５ｍＬと、１％（ｗ／ｖ）ポリスチレンラテックス粒子（積水化学社製、平均粒子径０．５μｍ）０．５ｍＬとを混合し、３７℃で１時間インキュベートして抗体をラテックスに感作した。そこに、ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ社製、ウシ血清アルブミン）を１重量％となるように添加し、３７℃で１時間インキュベートしてブロッキングを行った。ブロッキングされた抗体感作ラテックスを５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した後、０．１％（ｗ／ｖ）になるようにラテックス分散緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液 ｐＨ８．４、０．１重量％ＢＳＡ，０．１重量％ＮａＮ３）に分散させて、抗インフルエンザＡ型抗体感作ラテックス試液とした。
（実験２）抗インフルエンザＢ型抗体感作ラテックスの調製
抗インフルエンザＢ型マウスモノクローナル抗体を０．６ｍｇ／ｍＬになるように調製した抗体液（５０ｍＭリン酸緩衝液 ｐＨ７．４）０．５ｍＬと、１％（ｗ／ｖ）ポリスチレンラテックス粒子（積水化学社製、平均粒子径０．６μｍ）０．５ｍＬとを混合し、３７℃で１時間インキュベートして抗体をラテックスに感作した。ブロッキング以降の操作は（実験１）と同様に行い、抗インフルエンザＢ型抗体感作ラテックス試液とした。
抗インフルエンザＢ型マウスモノクローナル抗体を０．６ｍｇ／ｍＬになるように調製した抗体液（５０ｍＭリン酸緩衝液 ｐＨ７．４）０．５ｍＬと、１％（ｗ／ｖ）ポリスチレンラテックス粒子（積水化学社製、平均粒子径０．６μｍ）０．５ｍＬとを混合し、３７℃で１時間インキュベートして抗体をラテックスに感作した。ブロッキング以降の操作は（実験１）と同様に行い、抗インフルエンザＢ型抗体感作ラテックス試液とした。
以下の一連の実験は、プロテアーゼとして、セミアルカリプロテアーゼを使用して実験を行ったものである。
（実験３）検体抽出液の調製
セミアルカリプロテアーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｍｅｌｌｅｕｓ由来、天野エンザイム社製セミアルカリプロティナーゼ）０．４ｍｇを、１重量％ｎ−Ｏｃｔａｎｏｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｃａｍｉｄｅ（商品名ＭＥＧＡ−８、以下同様）、０．１重量％ＥＤＴＡ・２Ｎａ、０．９重量％ＮａＣｌ、０．０９重量％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭ ＣＨＥＳ（Ｎ−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液（ｐＨ９．８）１ｍＬに溶解して、検体抽出液Ａとした。
セミアルカリプロテアーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｍｅｌｌｅｕｓ由来、天野エンザイム社製セミアルカリプロティナーゼ）０．４ｍｇを、１重量％ｎ−Ｏｃｔａｎｏｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｃａｍｉｄｅ（商品名ＭＥＧＡ−８、以下同様）、０．１重量％ＥＤＴＡ・２Ｎａ、０．９重量％ＮａＣｌ、０．０９重量％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭ ＣＨＥＳ（Ｎ−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液（ｐＨ９．８）１ｍＬに溶解して、検体抽出液Ａとした。
また、セミアルカリプロテアーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｍｅｌｌｅｕｓ由来、天野エンザイム社製セミアルカリプロティナーゼ）０．４ｍｇを、１重量％ｎ−Ｏｃｔａｎｏｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｃａｍｉｄｅ、０．５重量％ＢＳＡ、０．９重量％ＮａＣｌ、０．１重量％ＥＤＴＡ・２Ｎａを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．４）１ｍＬに溶解して、検体抽出液Ｂとした。
（実験４）ラテックス免疫比濁法によるインフルエンザＡ型抗原標準液の測定
抗原として精製インフルエンザＡ型ウイルスＡ／Ｋｉｅｖ／３０１／９４（Ｈ３Ｎ２）を使用し、これを所定のウイルス濃度（４μｇ／ｍＬと２０μｇ／ｍＬ）となるように検体希釈液（１重量％ＢＳＡと０．１重量％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ ｐＨ７．４）で希釈し、二種類のウイルス液を調製した。さらに、測定の直前に、各濃度のウイルス液を、検体抽出液Ｂ（０．４ｍｇ／ｍＬセミアルカリプロテアーゼ、１重量％ｎ−Ｏｃｔａｎｏｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｃａｍｉｄｅ、０．５重量％ＢＳＡ、０．９重量％ＮａＣｌ、０．１重量％ＥＤＴＡ・２Ｎａを含む５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液 ｐＨ８．４）で１０倍希釈し、これを検体としてラテックス免疫比濁法の測定に用いた。ウイルス濃度ゼロの検体としては、前記検体希釈液を前記検体抽出液Ｂで１０倍希釈したものを用いた。
抗原として精製インフルエンザＡ型ウイルスＡ／Ｋｉｅｖ／３０１／９４（Ｈ３Ｎ２）を使用し、これを所定のウイルス濃度（４μｇ／ｍＬと２０μｇ／ｍＬ）となるように検体希釈液（１重量％ＢＳＡと０．１重量％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ ｐＨ７．４）で希釈し、二種類のウイルス液を調製した。さらに、測定の直前に、各濃度のウイルス液を、検体抽出液Ｂ（０．４ｍｇ／ｍＬセミアルカリプロテアーゼ、１重量％ｎ−Ｏｃｔａｎｏｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｃａｍｉｄｅ、０．５重量％ＢＳＡ、０．９重量％ＮａＣｌ、０．１重量％ＥＤＴＡ・２Ｎａを含む５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液 ｐＨ８．４）で１０倍希釈し、これを検体としてラテックス免疫比濁法の測定に用いた。ウイルス濃度ゼロの検体としては、前記検体希釈液を前記検体抽出液Ｂで１０倍希釈したものを用いた。
反応用緩衝液としては、２．１重量％ポリエチレングリコール２００００（ナカライ社製）、１重量％ＢＳＡ、０．９重量％ＮａＣｌ、０．１重量％ＥＤＴＡ・２Ｎａおよび０．１重量％アジ化ナトリウムを含む２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）緩衝液を用いた。吸光度の測定には、免疫反応測定装置スポットケム−ＩＭ（アークレイ社製）を使用し、以下の割合で各試薬と検体とをキュベット内で混合し、３７℃で５分間処理した際の、５分間における吸光度（測定波長６６０ｎｍ）変化量を測定した。得られた結果を、下記表１に示す。
Ｓ（検体） ： ２８μＬ
Ｒ１（反応用緩衝液） ： ５６μＬ
Ｒ２（抗体感作ラテックス試液）： ５６μＬ
Ｓ（検体） ： ２８μＬ
Ｒ１（反応用緩衝液） ： ５６μＬ
Ｒ２（抗体感作ラテックス試液）： ５６μＬ
前記表１から判断できるように、Ａ型インフルエンザウイルス濃度に比例して吸光度差が増加している（反応している）ことから、検体をセミアルカリプロテアーゼを含む検体抽出液で処理することによって、ラテックス免疫比濁法で定量的にＡ型インフルエンザウイルス量を測定できることが確認できた。
（実験５）ラテックス免疫比濁法によるインフルエンザＢ型抗原標準液の測定
抗原として精製インフルエンザＢ型ウイルスＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／５０４／００を使用し、これを所定のウイルス濃度（１μｇ／ｍＬと５μｇ／ｍＬ）となるように検体希釈液（１重量％ＢＳＡと０．１重量％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ ｐＨ７．４）で希釈し、二種類のウイルス溶液を調製した。さらに、測定の直前に、各濃度のウイルス液を、検体抽出液Ｂ（０．４ｍｇ／ｍＬセミアルカリプロテアーゼ、１重量％ｎ−Ｏｃｔａｎｏｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｃａｍｉｄｅ、０．５重量％ＢＳＡ、０．９重量％ＮａＣｌ、０．１重量％ＥＤＴＡ・２Ｎａを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液 ｐＨ８．４）で１０倍希釈し、これを検体としてラテックス免疫比濁法の測定に用いた。ウイルス濃度ゼロの検体としては、前記検体希釈液を前記検体抽出液Ｂで１０倍希釈したものを用いた。
抗原として精製インフルエンザＢ型ウイルスＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／５０４／００を使用し、これを所定のウイルス濃度（１μｇ／ｍＬと５μｇ／ｍＬ）となるように検体希釈液（１重量％ＢＳＡと０．１重量％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ ｐＨ７．４）で希釈し、二種類のウイルス溶液を調製した。さらに、測定の直前に、各濃度のウイルス液を、検体抽出液Ｂ（０．４ｍｇ／ｍＬセミアルカリプロテアーゼ、１重量％ｎ−Ｏｃｔａｎｏｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｃａｍｉｄｅ、０．５重量％ＢＳＡ、０．９重量％ＮａＣｌ、０．１重量％ＥＤＴＡ・２Ｎａを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液 ｐＨ８．４）で１０倍希釈し、これを検体としてラテックス免疫比濁法の測定に用いた。ウイルス濃度ゼロの検体としては、前記検体希釈液を前記検体抽出液Ｂで１０倍希釈したものを用いた。
反応用緩衝液としては、１．９５重量％ポリエチレングリコール２００００（ナカライ社製）、１重量％ＢＳＡ、０．９重量％ＮａＣｌ、０．１％ＥＤＴＡ・２Ｎａおよび０．１重量％アジ化ナトリウムを含む２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）緩衝液を用いた。吸光度の測定には、免疫反応測定装置スポットケム−ＩＭ（アークレイ製）を使用し、以下の割合で各試薬と検体とをキュベット内で混合し、３７℃で５分間処理した際の、５分間における吸光度（測定波長７３０ｎｍ）変化量を測定した。得られた結果を、下記表２に示す。
Ｓ（検体） ： ２８μＬ
Ｒ１（反応用緩衝液） ： ５６μＬ
Ｒ２（抗体感作ラテックス試液）： ５６μＬ
Ｓ（検体） ： ２８μＬ
Ｒ１（反応用緩衝液） ： ５６μＬ
Ｒ２（抗体感作ラテックス試液）： ５６μＬ
前記表２から判断できるように、Ｂ型インフルエンザウイルス濃度に比例して吸光度差が増加している（反応している）ことから、検体をセミアルカリプロテアーゼを含む検体抽出液で処理することによって、ラテックス免疫比濁法で定量的にＢ型インフルエンザウイルス量を測定できることが確認できた。
（実験６）インフルエンザＡ型陰性検体の測定
症状から明らかにインフルエンザではない人より鼻腔吸引液を採取し、そのうちイムノクロマト法を原理とする市販のインフルエンザウイルス検出キット（日本ベクトン・ディッキンソン社 商品名キャピリアＦｌｕＡ／Ｂ）でＡ型陰性であることが確認できた鼻腔吸引液を検体として使用し（１４検体）、インフルエンザＡ型ウイルスを測定した。綿棒にからませた鼻腔吸引液を検体抽出液１ｍＬに懸濁する点以外は、基本的に実験４と同じ方法で行った。検体抽出液としては、プロテアーゼに関する以外は、前記実験４で使用した検体抽出液Ｂと同様の組成であり、セミアルカリプロテアーゼを含まない抽出液Ｂ−１と、セミアルカリプロテアーゼを０．４ｍｇ／ｍＬ含む抽出液Ｂ−２とを使用した。そして、これらの抽出液Ｂ−１およびＢ−２を用いて、それぞれの結果を比較し、セミアルカリプロテアーゼによる非特異的反応の抑制効果を調べた。定性判定結果は、吸光度差が０．００５０以上を陽性（＋）、０．００５０未満を陰性（−）とした。これらの結果を下記表３に示す。なお、抽出液Ｂ−１を用いた例は比較例となり、抽出液Ｂ−２を用いた例が実施例となる。
症状から明らかにインフルエンザではない人より鼻腔吸引液を採取し、そのうちイムノクロマト法を原理とする市販のインフルエンザウイルス検出キット（日本ベクトン・ディッキンソン社 商品名キャピリアＦｌｕＡ／Ｂ）でＡ型陰性であることが確認できた鼻腔吸引液を検体として使用し（１４検体）、インフルエンザＡ型ウイルスを測定した。綿棒にからませた鼻腔吸引液を検体抽出液１ｍＬに懸濁する点以外は、基本的に実験４と同じ方法で行った。検体抽出液としては、プロテアーゼに関する以外は、前記実験４で使用した検体抽出液Ｂと同様の組成であり、セミアルカリプロテアーゼを含まない抽出液Ｂ−１と、セミアルカリプロテアーゼを０．４ｍｇ／ｍＬ含む抽出液Ｂ−２とを使用した。そして、これらの抽出液Ｂ−１およびＢ−２を用いて、それぞれの結果を比較し、セミアルカリプロテアーゼによる非特異的反応の抑制効果を調べた。定性判定結果は、吸光度差が０．００５０以上を陽性（＋）、０．００５０未満を陰性（−）とした。これらの結果を下記表３に示す。なお、抽出液Ｂ−１を用いた例は比較例となり、抽出液Ｂ−２を用いた例が実施例となる。
前記表３から判断されるように、ラテックス免疫比濁法によるインフルエンザＡ型ウイルスの測定において、セミアルカリプロテアーゼを含まない抽出液Ｂ−１で処理した場合は、１４検体中１２検体で非特異的に凝集反応を生じ、偽陽性を示したが、セミアルカリプロテアーゼを含む抽出液Ｂ−２で処理した場合、１４検体すべてが本来の陰性結果となった。
（実験７）インフルエンザＢ型陰性検体の測定
症状から明らかにインフルエンザではない人より鼻腔吸引液を採取し、そのうちイムノクロマト法を原理とする市販のインフルエンザウイルス検出キット（日本ベクトン・ディッキンソン社 商品名キャピリアＦｌｕＡ／Ｂ）でＢ型陰性であることを確認した鼻腔吸引液を検体として使用し（８検体）、インフルエンザＢ型ウイルスを測定した。綿棒にからませた鼻腔吸引液を検体抽出液１ｍＬに懸濁する点以外は、基本的に実験５と同じ方法で行った。検体抽出液としては、プロテアーゼに関する以外は、前記実験５で使用した検体抽出液Ｂと同様の組成であり、セミアルカリプロテアーゼを含まない抽出液Ｂ−１と、セミアルカリプロテアーゼを０．４ｍｇ／ｍＬ含む抽出液Ｂ−２とを使用した。そして、これらの抽出液Ｂ−１およびＢ−２を用いて、それぞれの結果を比較し、セミアルカリプロテアーゼによる非特異的反応の抑制効果を調べた。定性判定結果は、吸光度差が０．００５０以上を陽性（＋）、０．００５０未満を陰性（−）とした。これらの結果を表４に示す。検体＃１５〜＃１９はＡ型Ｂ型とも陰性であったが、＃２０〜＃２２の３検体はＡ型陽性Ｂ型陰性であった。なお、抽出液Ｂ−１を用いた例は比較例であり、抽出液Ｂ−２を用いた例が実施例となる。
症状から明らかにインフルエンザではない人より鼻腔吸引液を採取し、そのうちイムノクロマト法を原理とする市販のインフルエンザウイルス検出キット（日本ベクトン・ディッキンソン社 商品名キャピリアＦｌｕＡ／Ｂ）でＢ型陰性であることを確認した鼻腔吸引液を検体として使用し（８検体）、インフルエンザＢ型ウイルスを測定した。綿棒にからませた鼻腔吸引液を検体抽出液１ｍＬに懸濁する点以外は、基本的に実験５と同じ方法で行った。検体抽出液としては、プロテアーゼに関する以外は、前記実験５で使用した検体抽出液Ｂと同様の組成であり、セミアルカリプロテアーゼを含まない抽出液Ｂ−１と、セミアルカリプロテアーゼを０．４ｍｇ／ｍＬ含む抽出液Ｂ−２とを使用した。そして、これらの抽出液Ｂ−１およびＢ−２を用いて、それぞれの結果を比較し、セミアルカリプロテアーゼによる非特異的反応の抑制効果を調べた。定性判定結果は、吸光度差が０．００５０以上を陽性（＋）、０．００５０未満を陰性（−）とした。これらの結果を表４に示す。検体＃１５〜＃１９はＡ型Ｂ型とも陰性であったが、＃２０〜＃２２の３検体はＡ型陽性Ｂ型陰性であった。なお、抽出液Ｂ−１を用いた例は比較例であり、抽出液Ｂ−２を用いた例が実施例となる。
前記表４から判断されるように、ラテックス免疫比濁法によるインフルエンザＢ型ウイルスの測定において、セミアルカリプロテアーゼを含まない抽出液Ｂ−１で処理した場合は、８検体中７検体で非特異的に凝集反応を生じ、偽陽性を示したが、セミアルカリプロテアーゼを含む抽出液Ｂ−２で処理した場合、８検体すべてが本来の陰性結果となった。
（実験８）インフルエンザＡ型ウイルスの相関性試験
臨床的にインフルエンザ感染が疑われる患者６１名の鼻腔吸引液を採取し、これを検体とした。そして、これらの検体を、本発明に従ってセミアルカリプロテアーゼを含む検体抽出液Ａ（実験３で調製したもの）で処理し、ラテックス免疫比濁法で測定した。測定方法は、前記実験６と同じ方法で行った。得られた吸光度差のデータについて、前述の基準に基づき、定性的に陽性（＋）、陰性（−）の判定を行い、この結果を対象法の結果と比較した。対照法として、ＭＤＣＫ（Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ ｃａｎｉｎｅ ｋｉｄｎｅｙ）細胞を用いたウイルス分離培養法を実施した。両方法による一致結果を下記表５に示す。
臨床的にインフルエンザ感染が疑われる患者６１名の鼻腔吸引液を採取し、これを検体とした。そして、これらの検体を、本発明に従ってセミアルカリプロテアーゼを含む検体抽出液Ａ（実験３で調製したもの）で処理し、ラテックス免疫比濁法で測定した。測定方法は、前記実験６と同じ方法で行った。得られた吸光度差のデータについて、前述の基準に基づき、定性的に陽性（＋）、陰性（−）の判定を行い、この結果を対象法の結果と比較した。対照法として、ＭＤＣＫ（Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ ｃａｎｉｎｅ ｋｉｄｎｅｙ）細胞を用いたウイルス分離培養法を実施した。両方法による一致結果を下記表５に示す。
前記表５から判断されるように、セミアルカリプロテアーゼを含む検体抽出液Ａで鼻腔吸引液検体を前処理し、ラテックス免疫比濁法によりインフルエンザＡ型ウイルスの測定を行った場合、対照法のウイルス分離培養法による結果と、良好な相関性が確認された。この結果から、本発明の免疫測定方法は、従来のウイルス分離培養法の代替法として、十分に利用可能であるといえる。
（実験９）インフルエンザＢ型ウイルスの相関性試験
臨床的にインフルエンザ感染が疑われる患者３５名の鼻腔吸引液を採取し、これを検体とした。そして、これらの検体を、本発明に従ってセミアルカリプロテアーゼを含む検体抽出液Ａ（実験３で調製したもの）で処理し、ラテックス免疫比濁法で測定した。測定方法は、前記実験７と同じ方法で行った。得られた吸光度差のデータについて、前述の基準に基づき、定性的に陽性（＋）、陰性（−）の判定を行い、この結果を対照法の結果と比較した。対照法として、イムノクロマト法を原理とする市販のＢ型インフルエンザウイルス検出キット（日本ベクトン・ディッキンソン社、商品名キャピリアＦｌｕＢ）を実施した。両方法による一致結果を下記表６に示す。
臨床的にインフルエンザ感染が疑われる患者３５名の鼻腔吸引液を採取し、これを検体とした。そして、これらの検体を、本発明に従ってセミアルカリプロテアーゼを含む検体抽出液Ａ（実験３で調製したもの）で処理し、ラテックス免疫比濁法で測定した。測定方法は、前記実験７と同じ方法で行った。得られた吸光度差のデータについて、前述の基準に基づき、定性的に陽性（＋）、陰性（−）の判定を行い、この結果を対照法の結果と比較した。対照法として、イムノクロマト法を原理とする市販のＢ型インフルエンザウイルス検出キット（日本ベクトン・ディッキンソン社、商品名キャピリアＦｌｕＢ）を実施した。両方法による一致結果を下記表６に示す。
前記表６から判断されるように、セミアルカリプロテアーゼを含む検体抽出液Ａで鼻腔吸引液検体を前処理し、ラテックス免疫比濁法によりインフルエンザＢ型ウイルスの測定を行った場合、対照法のイムノクロマト法による結果と、良好な相関性が確認された。この結果から、本発明の免疫測定方法は、従来のイムノクロマト法の代替法として、十分に利用可能であるといえる。
以上のように、本発明の前処理方法を適用すれば、非特異的な反応を防止した鼻汁由来検体の免疫測定方法が実施可能となる。したがって、本発明の前処理方法は、医学や生物学等の広い分野に適用でき、特に、臨床検査の分野に有用である。
Claims (10)
- 免疫測定方法における検体前処理方法であって、
前記検体が、鼻汁由来検体であり、
前記免疫測定方法の実施に先立ち、前記検体をプロテアーゼで処理することを特徴とする検体前処理方法。 - 前記免疫測定方法が、前記検体中の測定対象物質と、不溶性担体に担持され且つ前記測定対象物質と免疫反応する免疫学的物質とを免疫反応させ、その際に生じる前記不溶性担体の凝集度合いを測定することにより、前記測定対象物質の濃度を測定する方法である、請求の範囲１記載の検体前処理方法。
- 前記プロテアーゼが、セミアルカリプロテアーゼ（ＥＣ ３．４．２１．６３）である、請求の範囲１記載の検体前処理方法。
- 前記検体中の測定対象物質が、インフルエンザウイルスである、請求の範囲１記載の検体前処理方法。
- 前記不溶性担体に担持された免疫学的物質が、前記インフルエンザウイルスに対する抗体である、請求の範囲４記載の検体前処理方法。
- プロテアーゼ処理のｐＨ条件が、５〜１１の範囲である、請求の範囲１記載の検体前処理方法。
- 免疫反応を利用した免疫測定方法であって、
検体が鼻汁由来検体であり、この検体に対し、請求の範囲１記載の検体前処理方法により前処理を行い、その後、前記免疫反応を実施することを特徴とする免疫測定方法。 - 前記免疫測定方法が、前記検体中の測定対象物質と、不溶性担体に担持され且つ前記測定対象物質と免疫反応する免疫学的物質とを免疫反応させ、その際に生じる前記不溶性担体の凝集度合いを測定することにより、前記測定対象物質の濃度を測定する方法である、請求の範囲７記載の免疫測定方法。
- 前記検体中の測定対象物質が、インフルエンザウイルスである、請求の範囲７記載の免疫測定方法。
- 前記不溶性担体に担持された免疫学的物質が、前記インフルエンザウイルスに対する抗体である、請求の範囲８記載の免疫測定方法。
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