BR112020015686A2 - Métodos para determinar um analito, para melhorar a especificidade da detecção de um analito e para identificar uma amostra, kit, dispositivo para determinar um analito, usos de uma composição e de pelo menos um primeiro e um segundo composto detector de um analito - Google Patents

Métodos para determinar um analito, para melhorar a especificidade da detecção de um analito e para identificar uma amostra, kit, dispositivo para determinar um analito, usos de uma composição e de pelo menos um primeiro e um segundo composto detector de um analito Download PDF

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Abstract

a presente invenção refere-se a um método para determinar um analito em uma amostra, compreendendo a) colocar em contato a referida amostra com pelo menos um primeiro e um segundo composto detector; b) determinar a quantidade de complexos compreendendo pelo menos um composto detector; e, c) determinar o referido analito em uma amostra com base no resultado da etapa b). a presente invenção refere-se ainda a um kit para detectar um analito em uma amostra; e a um dispositivo para determinar um analito em uma amostra; e meios para determinar pelo menos um sinal obtido a partir do referido primeiro marcador e do referido segundo marcador; e ao uso de uma composição compreendendo pelo menos um primeiro e um segundo composto detector para detectar um analito.

Description

“MÉTODOS PARA DETERMINAR UM ANALITO, PARA MELHORAR A ESPECIFICIDADE DA DETECÇÃO DE UM ANALITO E PARA IDENTIFICAR UMA AMOSTRA, KIT, DISPOSITIVO PARA DETERMINAR UM ANALITO, USOS DE UMA COMPOSIÇÃO E DE PELO MENOS UM PRIMEIRO E UM SEGUNDO COMPOSTO DETECTOR DE UM ANALITO”
[001] A presente invenção refere-se a um método para determinar um analito em uma amostra, compreendendo a) colocar em contato a referida amostra com pelo menos um primeiro e um segundo composto detector; b) determinar a quantidade de complexos compreendendo pelo menos um composto detector; e, c) determinar o referido analito em uma amostra com base no resultado da etapa b), em que o referido primeiro composto detector compreende uma primeira porção de ligação e um primeiro marcador, e o referido segundo composto detector compreende uma segunda porção de ligação e um segundo marcador, e em que o primeiro marcador e o segundo marcador são não idênticos. A presente invenção refere-se ainda a um kit para detectar um analito em uma amostra, compreendendo pelo menos um primeiro e um segundo composto detector para o referido analito, em que o referido primeiro composto detector compreende uma primeira porção de ligação e um primeiro marcador e o referido segundo composto detector compreende uma segunda porção de ligação e um segundo marcador, e em que o primeiro marcador e o segundo marcador são não idênticos; e a um dispositivo para determinar um analito em uma amostra, compreendendo pelo menos um primeiro e um segundo composto detector para o referido analito, em que o referido primeiro composto detector compreende uma primeira porção de ligação e um primeiro marcador, e o referido segundo composto detector compreende uma segunda porção de ligação e um segundo marcador, e em que o primeiro marcador e o segundo marcador são não idênticos; e meios para determinar pelo menos um sinal obtido a partir do referido primeiro marcador e do referido segundo marcador; e ao uso de uma composição compreendendo pelo menos um primeiro e um segundo composto detector para detectar um analito, em que o referido primeiro composto detector compreende uma primeira porção de ligação e um primeiro marcador, e o referido segundo composto detector compreende uma segunda porção de ligação e um segundo marcador, e em que o primeiro marcador e o segundo marcador são não idênticos.
[002] Os testes de laboratório, em particular os testes imunológicos, se tornaram ferramentas valiosas no diagnóstico de doença. Os imunoensaios, em particular, forneceram a possibilidade de detectar especificamente analitos ou grupos de analitos em misturas complexas, por exemplo, fluidos corporais, como sangue, soro ou plasma. No entanto, foram identificadas várias causas de interferência em imunoensaios, por exemplo, a reatividade cruzada de uma substância interferente, com um composto de captura, a ligação não específica de um composto detector a uma fase sólida, “ponte” de ligação do composto de captura e composto detector por anticorpos heterofílicos, ou anticorpos humanos anti-ccamundongo (HAMA), para citar alguns (consulte, por exemplo, WO 2016/097116 A1; Park & Kricka (2013), cap.
5.3- Interferences in Immunoassay, no The Immunoassay Handbook (Quarta Edição), editado por David Wild, Elsevier, Oxford: 403; Schiettecatte (2012), Interferences in Immunoassays, Advances in Immunoassay Technology, Dr. Norman HL Chiu (Ed.)). Um outro alvo de interferência pode ser o marcador, ou seja, a unidade geradora de sinal no ensaio (por exemplo, Buijs et al. (2011), Ann Clin Biochem. 48 (Pt 3): 276; Heijboer et al. (2009), Ann Clin Biochem.46 (Pt 3): 263; Ando et al. (2007), Intern Med. 46 (15): 1225).
[003] Em imunoensaios competitivos, os analitos compreendidos em uma amostra competem com um analito marcado (especificador) pela ligação a um composto de captura, que é frequentemente um anticorpo ou, no caso de ser testada a presença de anticorpos para, por exemplo, um agente patogênico, um antígeno do referido agente patogênico. Caso a concentração de analito na amostra seja alta, há uma forte concorrência, levando a uma diminuição da ligação do especificador ao composto de captura, causando redução do sinal, o que, dependendo do formato do teste, leva a um resultado de teste quantitativo ou qualitativo. Se houver uma redução de sinal causada por interferências anti-marcador, isso pode causar resultados falso-positivos.
[004] Em imunoensaios não competitivos, o analito é detectado ao colocar em contato o analito com um composto que se liga especificamente ao analito e carregando um marcador próprio ou sendo alvo de uma segunda molécula carregando um marcador. Assim, em imunoensaios não competitivos, a quantidade de analito é determinada determinando a quantidade de complexos formados entre o analito e um composto detector portador de uma marcador. Por conseguinte, os problemas de especificidade análogos podem ser enfrentados como descrito acima. Interferências anti-marcador tendem a reduzir o sinal ligando-se ao marcador, causando uma redução no rendimento do sinal e, portanto, resultados falso-negativos. Em alguns casos, interferências anti- marcador também podem aumentar o sinal em formatos de ensaio não competitivo, levando a resultados falso-positivos.
[005] Atualmente, existem duas estratégias diferentes conhecidas de como reduzir interferências anti-marcador: O método mais comumente usado é adicionar o marcador da substância interferente (o marcador ou um alvo levemente modificado que não é capaz de gerar um sinal (um marcador-análogo) para o ensaio em concentrações geralmente excedentes à concentração do marcador original. A adição de marcador ou marcador-análogo serve como alvo alternativo para a substância de interferência, que conduzem a uma redução de ligação pelo interferente ao marcador, eliminando ou reduzindo a interferência. No entanto, pode ser impossível reduzir suficientemente a interferência por adição de marcador mais ativo, por exemplo, porque a adição de marcador ativo iria interferir com o ensaio. O método de escolha, neste caso, é adicionar o análogo de marcador inativo que não gera sinal, mas é o alvo do interferente. No entanto, como há uma diferença estrutural entre o marcador reativo e o marcador-análogo, a eficiência dos marcadores-análogos para reduzir interferências anti-marcador podem ser limitadas.
[006] Uma segunda possibilidade para reduzir a interferência específica do marcador é direcionar especificamente o marcador afetado com os parceiros de ligação adicionados ao ensaio que não são reativos no ensaio, mas protegem a substância interferente da ligação ao marcador, assim, levando também à redução da interferência (ver, por exemplo, DE 19519973 A1, WO 2017093271 A1; Sapin et al. (2007), Clin Chern Lab Med. 45 (3): 416; DeForge (2010), J. Immunol Methods 362 (1-2): 70). No entanto, tal processo pode acarretar uma redução significativa do sinal de rendimento e, assim, provocar uma diminuição ou prejudicar o limite de detecção.
PROBLEMA A SER RESOLVIDO
[007] Portanto, é um objetivo da presente invenção fornecer imunoensaios aprimorados, evitando os problemas descritos acima.
DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO
[008] Esses problemas são resolvidos pelos métodos, kits, dispositivos e composições com as características das reivindicações independentes. Formas de realização típicas, que podem ser realizadas de maneira isolada ou em qualquer combinação arbitrária, estão listadas nas reivindicações dependentes.
[009] Por conseguinte, a presente invenção refere-se a um método para determinar um analito em uma amostra, compreendendo a) colocar em contato a referida amostra com pelo menos um primeiro e um segundo composto detector; b) determinar a quantidade de complexos compreendendo pelo menos um composto detector; e, c) determinar o referido analito em uma amostra com base no resultado da etapa b), em que o referido primeiro composto detector compreende uma porção de ligação e um primeiro marcador, e o referido segundo composto detector compreende uma porção de ligação e um segundo marcador, e em que o primeiro marcador e o segundo marcador são não idênticos.
[0010] Conforme usado a seguir, os termos “ter”, “compreender” ou “incluir” ou quaisquer variações gramaticais arbitrárias dos mesmos são usados de maneira não exclusiva. Assim, esses termos podem se referir a uma situação em que, além da característica introduzida por esses termos, nenhuma característica adicional está presente na entidade descrita neste contexto e a uma situação em que uma ou mais característica adicionais estão presentes. Como exemplo, as expressões “A tem B”, “A compreende B” e “A inclui B” podem se referir a uma situação em que, além de B, nenhum outro elemento está presente em A (ou seja, uma situação em que A apenas e exclusivamente consiste em B) e em uma situação em que, além de B, um ou mais elementos adicionais estejam presentes na entidade A, como elemento C, elementos C e D ou ainda outros elementos.
[0011] Além disso, conforme usado a seguir, os termos “preferencialmente”, “mais preferencialmente”, “muito mais preferencialmente”, “particularmente”, “mais particularmente”, “especificamente”, “mais especificamente" ou termos similares são usados em conjunto com as características opcionais, e não se destinam a restringir outras possibilidades. Portanto, as características introduzidas por esses termos são opcionais e não pretendem restringir o escopo das reivindicações de forma alguma. A invenção pode, como o técnico no assunto reconhecerá, ser realizada usando características alternativas. Da mesma forma, as características introduzidas por
“em uma forma de realização da invenção” ou expressões semelhantes devem ser opcionais, sem nenhuma restrição em relação a outras formas de realização da invenção, sem nenhuma restrição com relação ao escopo da invenção e sem nenhuma restrição quanto à possibilidade de combinar as características introduzidas de tal maneira com outras características opcionais ou não opcionais da invenção.
[0012] Se não indicado de outra forma, o termo “cerca de” refere- se ao valor indicado com a precisão técnica comumente aceita no campo relevante, de preferência refere-se ao valor indicado + 20% mais preferencialmente + 10%, mais preferencialmente + 5%. Além disso, o termo “essencialmente” indica que os desvios que influenciam o resultado ou uso indicado estão ausentes, ou seja, desvios potenciais não fazem com que o resultado indicado se desvie em mais de + 20%, mais preferencialmente + 10%, mais preferencialmente + 5%. Assim, “consistindo essencialmente em” significa incluir os componentes especificados, mas excluir outros componentes, exceto os materiais presentes como impurezas, materiais inevitáveis presentes como resultado de processos utilizados para fornecer os componentes e componentes adicionados para uma finalidade diferente da obtenção do efeito técnico da invenção. Por exemplo, uma composição definida usando a frase “consistindo essencialmente em” engloba qualquer aditivo aceitável conhecido, excipiente, diluente, veículo e similares. De preferência, uma composição consistindo essencialmente em um conjunto de componentes compreenderá menos que 5% em peso, mais preferencialmente menos que 3% em peso, ainda mais preferencialmente menos que 1%, mais preferencialmente menos que 0,1% em peso do(s) componente(s) não especificado(s).
[0013] O método da presente invenção, em uma forma de realização, é um método in vitro. Além disso, pode compreender etapas além daquelas especificamente mencionadas. Em particular, a etapa a) pode ser precedida por uma etapa de fornecimento de uma amostra, ou as etapas a) e/ ou b) podem compreender a adição de outros compostos, a fim de facilitar a ligação e a detecção. Além disso, algumas ou todas as etapas podem ser auxiliadas por equipamento automatizado. Em uma forma de realização, o método é um método imunológico, isto é, em uma forma de realização pelo menos um dos analitos e os compostos detectores são ou compreendem um anticorpo.
[0014] O termo “molécula biológica” é conhecido do técnico no assunto e, tipicamente, refere-se a uma molécula produzida pelo metabolismo de pelo menos um organismo. Por conseguinte, o termo “macromolécula biológica” refere-se a um polímero produzido por um organismo, em uma forma de realização, a partir de precursores monoméricos. Uma macromolécula biológica típica é um polipeptídeo, DNA, RNA ou um polissacarídeo.
[0015] O termo “polipeptídeo”, como aqui utilizado, em uma forma de realização, inclui variantes e fragmentos dos polipeptídeos especificamente indicados. As variantes incluem polipeptídeos compreendendo sequências de aminoácidos que são pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idênticos às sequências de aminoácidos indicadas especificamente. Os valores percentuais de identidade são, de preferência, calculados em toda a região de sequência de aminoácidos. Uma série de programas baseados em uma variedade de algoritmos está disponível para o trabalhador qualificado para comparar diferentes sequências. Nesse contexto, os algoritmos de Needleman e Wunsch ou Smith e Waterman fornecem resultados particularmente confiáveis. Para realizar os alinhamentos de sequência, o programa PileUp (J. Mol. Evolution,, 25, 351-360, 1987, Higgins et al., CABIOS, 5 1989: 151-153) ou os programas Gap e BestFit [Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. 48; 443-453 (1970)) e Smith e Waterman (Adv. Appl. Math.
2; 482-489 (1981))], que fazem parte do pacote de software GCG [Genetics Computer Group 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, EUA 53711 (1991), devem ser utilizados.
Os valores de identidade da sequência citados acima em porcentagem (%) devem ser determinados, preferencialmente, usando o programa GAP em toda a região da sequência com as seguintes configurações: Peso da Lacuna: 50, Peso do Comprimento: 3, Correspondência Média: 10.000 e Incompatibilidade Média: 0.000, que, a menos que especificado de outra forma, sempre deve ser usado como configurações padrão para alinhamentos de sequência.
Um polipeptídeo compreendendo um fragmento de qualquer uma das sequências polipeptídicas mencionadas acima, em uma forma de realização, também é abrangido como um polipeptídeo da presente invenção.
O fragmento é um polipeptídeo que ainda é adequado como analito ou para uso em um composto detector como especificado em outro local neste documento, por exemplo, tem a atividade de ser uma porção de ligação conforme especificado em outro local aqui.
Por conseguinte, o polipeptídeo pode compreender ou consistir nos domínios do polipeptídeo da presente invenção que confere a referida atividade biológica.
Um fragmento como aqui utilizado, de preferência, compreende pelo menos 50, pelo menos 100, pelo menos 250 ou pelo menos 500 resíduos de aminoácidos consecutivos de qualquer uma das sequências de aminoácidos acima mencionadas compreendendo pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 50, pelo menos 80, pelo menos 100 ou pelo menos 150 aminoácidos consecutivos de qualquer uma das sequências de aminoácidos acima mencionadas.
Os polipeptídeos da presente invenção também podem conter outras sequências polipeptídicas.
Especificamente, os polipeptídeos da presente invenção podem ser proteínas de fusão em que um parceiro da proteína de fusão é um polipeptídeo, conforme especificado aqui.
Essas proteínas de fusão podem compreender como polipeptídeos de partes adicionais para monitorar a expressão (por exemplo, proteínas fluorescentes verdes,
amarelas, azuis ou vermelhas, fosfatase alcalina e similares) ou os chamados “marcadores” que podem servir como um marcador detectável ou como uma medida auxiliar para fins de purificação ou para ligar os referidos polipeptídeos a uma superfície sólida. Os marcadores para os diferentes fins são bem conhecidos na arte e compreendem marcadores FLAG, marcadores 6-histidina, marcadores MYC, biotina e semelhantes.
[0016] O termo “anticorpo”, como aqui utilizado, inclui anticorpos monoclonais, — anticorpos — multiespecíficos “(por exemplo, anticorpos biespecíficos) formados a partir de pelo menos dois anticorpos intactos e fragmentos de anticorpos, desde que exibam a atividade de ligação desejada, conforme especificado em outras partes deste documento. Em uma forma de realização, um anticorpo não é um anticorpo compreendido em um anti-soro, normalmente não é um anticorpo policlonal ou um soro policlonal. Por conseguinte, em uma forma de realização, um anticorpo é um anticorpo compreendido em uma mistura em que pelo menos 80%, em uma forma de realização pelo menos 90%, em uma forma de realização adicional, pelo menos 95% das moléculas de anticorpo compreendidas na referida mistura são um composto detector de presente invenção. Em uma forma de realização, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Em uma forma de realização, o anticorpo é um anticorpo comprimento completo ou um fragmento de anticorpo.
[0017] Dependendo das sequências de aminoácidos dos domínios constantes de suas cadeias pesadas, os anticorpos (imunoglobulinas) podem ser atribuídos a diferentes classes. Existem cinco classes principais de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias delas podem ser divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. As estruturas das subunidades e as configurações tridimensionais de diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas e descritas geralmente em, por exemplo, Abbas et al., Cellular e Mol. Immunology, 4a ed., W.B. Saunders, Co.
(2000). Um anticorpo pode ser parte de uma molécula de fusão maior, formada por associação covalente ou não covalente do anticorpo com uma ou mais outras proteínas ou peptídeos.
[0018] Os termos “anticorpo comprimento completo”, “anticorpo intacto” e “anticorpo inteiro” são usados aqui de forma intercambiável para se referir a um anticorpo em sua forma substancialmente intacta, não a fragmentos de anticorpo, conforme definido abaixo. Os termos referem-se particularmente a um anticorpo com cadeias pesadas que contêm uma região Fc. “Fragmentos de anticorpo” compreendem uma porção de um anticorpo intacto, em uma forma de realização, compreendendo a região de ligação ao antígeno do mesmo. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 e Fv; diacorposs; anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de cadeia simples; e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos. À digestão de anticorpos por papaína produz dois fragmentos idênticos de ligação ao antígeno, chamados fragmentos “Fab”, cada um com um único local de ligação ao antígeno, e um fragmento residual “Fc”, cujo nome reflete sua capacidade de cristalizar rapidamente. O tratamento com pepsina produz um fragmento F(ab')2 que possui dois locais de combinação ao antígeno e ainda é capaz de se reticular ao antígeno. “Fv” é o fragmento de anticorpo mínimo que contém um local de ligação ao antígeno completo. Em uma forma de realização, uma espécie de Fv de duas cadeias consiste em um dímero de um domínio variável de cadeia pesada e um de cadeia leve em associação estreita e não covalente. Em uma espécie de Fv de cadeia simples (scFv), um domínio variável de cadeia pesada e um de cadeia leve pode ser covalentemente ligado por um ligante peptídico flexível, de modo que as cadeias leve e pesada possam se associar em uma estrutura “dimérica” análoga à de umA espécie Fv de duas cadeias. É nessa configuração que as três regiões hipervariáveis (HVRs) de cada domínio variável interagem para definir um local de ligação ao antígeno.
Coletivamente, as seis HVRs conferem especificidade de ligação ao antígeno ao anticorpo. No entanto, mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv compreendendo apenas três HVRs específicos para um antígeno) tem a capacidade de reconhecer e se ligar ao antígeno, embora com uma afinidade mais baixa do que todo o local de ligação. O termo “diacorpos” refere-se a fragmentos de anticorpos com dois locais de ligação ao antígeno, cujos fragmentos compreendem um domínio variável da cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável da cadeia leve (VL) na mesma cadeia polipeptídica (VH-VL).
[0019] O termo “anticorpo monoclonal”, conforme usado aqui, refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, ou seja, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos, exceto por possíveis mutações, por exemplo, mutações que ocorrem naturalmente, que podem estar presentes em pequenas quantidades. Assim, o modificador “monoclional” indica o caráter do anticorpo como não sendo uma mistura de anticorpos discretos. Em certas formas de realização, esse anticorpo monoclonal inclui tipicamente um anticorpo compreendendo uma sequência polipeptídica que se liga a um analito, em que a sequência polipeptídica que se liga ao analito foi obtida por um processo que inclui a seleção de uma única sequência polipeptídica que se liga ao analito a partir de uma pluralidade de sequências polipeptídicas. Por exemplo, o processo de seleção pode ser a seleção de um clone único de uma pluralidade de clones, como um conjunto de clones de hibridoma, clones de fagos ou clones de DNA recombinante. Em contraste com as preparações de anticorpos policlonais, que incluem diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal de uma preparação de anticorpo monoclonal é direcionado contra um único determinante em um antígeno. Além de sua especificidade, as preparações de anticorpo monoclonal são vantajosas,
pois são tipicamente não contaminadas por outras imunoglobulinas.
[0020] O termo “analito”, como aqui utilizado, refere-se a uma molécula química, em uma forma de realização, uma molécula orgânica, que se liga aos compostos detectores da presente invenção com afinidade suficiente para permitir a detecção de complexos de composto analito/ detector. Em uma forma de realização, a constante de dissociação (Ka) do complexo de composto analito/ detector é, no máximo, 10 mol/ |, em uma outra forma de realização, no máximo, 10º mol/ |, em uma outra forma de realização, no máximo, 10º mol/ |. Em uma forma de realização, o analito é uma molécula biológica, em uma forma de realização adicional, o analito é uma macromolécula biológica. Em uma outra forma de realização, o analito é um polipeptídeo.
[0021] Em uma forma de realização, no caso de o analito ser um polipeptídeo, o polipeptídeo é um antígeno produzido por um agente infeccioso, por exemplo, um vírus, uma bactéria ou um organismo protozoário; ou o analito é um anticorpo produzido por um sujeito contra um antígeno produzido por um agente infeccioso, por exemplo, um vírus, uma bactéria ou um organismo protozoário.
[0022] Em uma forma de realização, o analito é um antígeno bacteriano, por exemplo, um antígeno de Treponema pallidum, um antígeno de Borrelia, um antígeno de Brucella, um antígeno de Chlamydia, um antígeno de Mycoplasma, um antígeno de Listeria, ou um antígeno derivado de um organismo unicelular, tal como protozoários, em uma forma de realização um antígeno de Trypanosoma cruzi. Em uma forma de realização, o analito é um anticorpo contra um antígeno bacteriano, em uma forma de realização adicional, contra um polipeptídeo bacteriano. Em uma forma de realização, o anticorpo é um anticorpo anti-Treponema pallidum, um anticorpo anti-Borrelia, um anticorpo anti-Brucella, um anticorpo anti-Chlamydia, um anticorpo anti-Mycoplasma ou um anticorpo anti-Listeria. Em ainda outra forma de realização, o analito é um anticorpo contra um organismo unicelular, em uma forma de realização um anticorpo anti-Trypanosoma cruzi. Em uma forma de realização adicional, o analito é um anticorpo anti-próprio, isto é, um anticorpo que reconhece um antígeno produzido pelo próprio sujeito, em uma forma de realização um diagnóstico de anticorpo anti-próprio e/ ou prognóstico da doença, em uma forma de realização da doença auto-imune. Anticorpos anti-próprios de diagnóstico e de prognóstico são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, anticorpos anti-nucleares indicativos de lúpus eritematoso sistêmico ou polimiosite, anticorpos anti-tireoidianos indicativos de tireoidite de Hashimoto ou doença de Grave, anticorpos anti-fator intrínseco indicativos de anemia e anticorpos anti- transglutaminase tecidual indicativos de doença celíaca ou sensibilidade ao glúten.
[0023] Em uma forma de realização, o analito é um antígeno viral, por exemplo, um antígeno de um vírus, em uma forma de realização um antígeno de um vírus selecionado a partir da lista que consiste em Vírus da Hepatite, Arbovírus, Adenovírus, Vírus de Coxsackie, Ecovírus, Influenzavírus, Parainfluenzavírus, Citomegalovírus, Herpesvírus, Vírus Epstein-Barr, Vírus da Caxumba, Norovírus, Rotavírus, Rubellavífus, Sarampo, Vírus da Imunodeficiência Humana, Vírus da Varicela-Zoster, Poliovírus e Enterovírus. Em uma forma de realização, o analito é um anticorpo contra um antígeno viral, em uma forma de realização adicional, contra um polipeptídeo viral ou, em uma forma de realização adicional, contra um polipeptídeo do capsídeo viral, em uma forma de realização de um vírus clinicamente relevante, em uma forma de realização selecionado a partir da lista conforme especificado aqui acima. Em uma forma de realização, o vírus é o vírus da Hepatite A, vírus da Hepatite B, vírus da Hepatite C. Em uma forma de realização, o polipeptídeo do capsídeo viral é um polipeptídeo do capsídeo do vírus da hepatite, em uma forma de realização, um polipeptídeo do capsídeo do vírus da Hepatite A (HA). Por conseguinte, o analito, em uma forma de realização, é um anticorpo contra um polipeptídeo do capsídeo do vírus da hepatite, por exemplo, contra um polipeptídeo do capsídeo do vírus da Hepatite A.
[0024] Em uma forma de realização, o analito é um antígeno protozoário, por exemplo, de Toxoplasma, em uma forma de realização T. gondii. Em uma forma de realização, o analito é um anticorpo contra um antígeno protozoário, em uma forma de realização adicional, contra um polipeptídeo protozoário. Em uma forma de realização, o analito é um anticorpo contra o polipeptídeo T. gondii p30 (No. de Acesso do Genbank: S85174.1).
[0025] É, no entanto, também previsto que o analito é um composto de baixo peso molecular determinável por formação de complexos com um composto detector. Em uma forma de realização, o analito tem uma massa molecular de pelo menos 100 (correspondendo a 100 unidades de massa atômica e 100 Da; 1 Da correspondendo a 1,66 x 102 kg), em uma forma de realização adicional, pelo menos 250, em uma outra forma de realização, pelo menos 500, ou, em uma outra forma de realização, pelo menos, 1000. Em uma forma de realização, o analito é tiroxina (T4), trikodotironina (T3), ácido fólico, proteína de ligação de ácido fólico, vitamina B12, ou fator intrínseco.
[0026] Como aqui utilizado, o termo “composto detector” refere-se a um composto compreendendo uma porção de ligação e um marcador, ambos conforme especificado em outra parte neste documento. Em uma forma de realização, a porção de ligação e a marcador formam um complexo de afinidade no referido composto detector, em uma forma de realização em que a constante de dissociação (Ka) do complexo porção de ligação/ marcador é, no máximo, 10 8 mol/ |, em uma outra forma de realização, no máximo 10º mol/ |, em uma forma de realização adicional, no máximo 10-"º*mol/ |. Em uma forma de realização, a porção de ligação e o marcador estão conectados covalentemente. Em uma forma de realização, o método para determinar um analito é um imunoensaio não competitivo. Em uma outra forma de realização, o método para determinar um analito é um imunoensaio competitivo; como será entendido, nesse caso o composto detector é o composto do ensaio que também é referido como “especificador” na técnica, isto é, é um composto ligado a um marcador e competindo com o analito pela ligação a um composto de captura.
[0027] O termo “porção de ligação”, tal como utilizado neste documento, refere-se às estruturas do composto detector que não são o marcador como especificado neste documento em outro local. Assim, por exemplo, no caso de o composto detector ser um anticorpo marcado com corante, o anticorpo será a porção de ligação; e caso o composto detector seja um fragmento F(ab) marcado com corante, o fragmento F(ab) será a porção de ligação. Em contraste, o termo “domínio de afinidade” é usado para se relacionar com uma subestrutura do composto detector mediando a afinidade do composto detector com um analito. Assim, o domínio de afinidade é a subestrutura da porção de ligação compreendendo os átomos que entram em contato com o analito no complexo composto detector/ analito. Assim, a porção de ligação pode compreender mais de um domínio de afinidade, por exemplo, em uma forma de realização dois domínios de afinidade idênticos no caso de a porção de ligação ser uma IgG, em uma outra forma de realização dez domínios de afinidade idênticos no caso de a porção de ligação ser uma IgM, em um forma de realização adicional dois domínios de afinidade diferentes no caso de a porção de ligação ser um diacorpo. Em uma outra forma de realização, a porção de ligação pode compreender várias, isto é, qualquer número maior que 2, de domínios de afinidade idênticos ou não idênticos, no caso de a porção de ligação ser um antígeno poliepítopo.
[0028] Em uma forma de realização, a porção de ligação do primeiro composto detector é não idêntica à porção de ligação do segundo composto detector. Assim, em uma forma de realização, o primeiro e o segundo compostos detectores podem ser anticorpos monoclonais diferentes, reconhecendo, em uma forma de realização, o mesmo epítopo do anticorpo. Em uma forma de realização, nesse caso, a constante de dissociação do complexo formado entre o primeiro composto detector e o analito e a constante de dissociação do complexo formado entre o segundo composto detector e o analito são diferentes por não mais que um fator de cinco; em uma forma de realização por não mais que um fator de dois; em uma forma de realização adicional por não mais que um fator de 1,5. Em uma forma de realização, a constante de dissociação do complexo formado entre o primeiro composto detector e o analito tem um valor de 70% a 130% da constante de dissociação do complexo formado entre o segundo composto detector e o analito. Em uma forma de realização adicional, a constante de dissociação do complexo formado entre o primeiro composto detector e o analito tem um valor de 80% a 120% da constante de dissociação do complexo formado entre o segundo composto detector e o analito. Em uma forma de realização adicional, a constante de dissociação do complexo formado entre o primeiro composto detector e o analito tem um valor de 90% a 110% da constante de dissociação do complexo formado entre o segundo composto detector e o analito. Em uma forma de realização adicional, a constante de dissociação do complexo formado entre o primeiro composto detector e o analito e a constante de dissociação do complexo formado entre o segundo composto detector e o analito são essencialmente iguais ou são iguais.
[0029] Em uma outra forma de realização, a porção de ligação do primeiro composto detector e a porção de ligação do segundo composto detector são essencialmente idênticas, isto é, diferem apenas em determinantes estruturais irrelevantes para a ligação do analito. Em uma outra forma de realização, a porção de ligação do primeiro composto detector e a porção de ligação do segundo composto detector são idênticos; assim, em uma forma de realização, o primeiro composto detector e o segundo composto detector diferem apenas no marcador. Como será entendido pelo técnico no assunto, esta diferença pode, em uma forma de realização, incluir diferenças ditadas por diferentes químicas de acoplamento do primeiro e do segundo marcador.
[0030] O termo “marcador”, como utilizado neste documento, refere-se a um composto adaptado para tornar detectável a presença de uma molécula ou complexo compreendendo o referido marcador. Normalmente, o marcador tem uma propriedade detectável, tipicamente uma propriedade óptica ou enzimática. No entanto, também está previsto que a referida propriedade detectável seja a propriedade de emitir radioatividade. Como será entendido, o parâmetro determinado para detectar a referida propriedade detectável também será referido como “sinal” ou “sinal detectável”. Para evitar dúvidas, note-se que um sinal pode também ser detectado como sendo igual a zero ou abaixo de um limite de detecção.
[0031] O termo “propriedade enzimática”, como utilizado neste documento, refere-se a uma propriedade de um marcador de produzir um produto detectável a partir de um substrato por meio de catálise biológica. Por conseguinte, uma propriedade enzimática é tipicamente conferida pela presença de um polipeptídeo possuindo a referida propriedade enzimática no referido marcador. Tipicamente, a propriedade enzimática é pelo menos uma atividade enzimática selecionada a partir do grupo que consiste em: atividade de fosfatase (por exemplo, em fosfatase alcalina), atividade de peroxidase (por exemplo, em peroxidase de rábano silvestre) e atividade de glicosidase (por exemplo, em beta-galactosidase). Substratos típicos para atividades enzimáticas são bem conhecidos na técnica. Tipicamente, a referida atividade enzimática produz um produto com uma propriedade óptica detectável como especificado acima neste documento, e/ ou a referida atividade enzimática produz um produto sendo detectável por um instrumento elétrico.
[0032] O termo “propriedade óptica”, como utilizado neste documento, refere-se a qualquer propriedade que possa ser detectada por um instrumento óptico.
Especificamente, a propriedade opticamente determinável pode ser ou pode compreender pelo menos uma propriedade selecionada a partir do grupo que consiste em: uma propriedade de reflexão, uma propriedade de transmissão, uma propriedade de emissão, uma propriedade de dispersão, uma propriedade de fluorescência, uma propriedade de fosforescência, uma propriedade de difração, e uma propriedade de polarização.
Outras propriedades ópticas previstas pela presente invenção são cor, fluorescência, luminescência ou refração.
Em uma forma de realização, uma propriedade opticamente determinável, conforme referido neste documento, refere-se a uma propriedade de um composto químico que pode ser detectado opticamente, como absorção de luz, emissão de luz, remissão de luz ou propriedades associadas a ele.
Será entendido que a detecção de uma propriedade opticamente determinável, conforme utilizada neste documento, abrange a detecção da presença de uma propriedade que não era detectável antes, a detecção da ausência de uma propriedade que foi detectada anteriormente e a detecção de alterações quantitativas de um propriedade, isto é, a detecção da alteração da força do sinal que se correlaciona com a extensão da alteração de pelo menos uma propriedade óptica.
Entende-se que o termo “propriedade óptica”, em uma forma de realização, também se refere à luminescência, em uma forma de realização quimioluminescência, em uma outra forma de realização eletroquimioluminescência, que também é conhecida como quimioluminescência eletrogerada.
Assim, em uma forma de realização, o sinal detectável pode ser um sinal de luminescência, em uma forma de realização um sinal de quimioluminescência, em uma outra forma de realização um sinal de eletroquimioluminescência.
De acordo com o acima, em uma forma de realização, o marcador é um corante, em uma forma de realização é um composto quimioluminescente.
[0033] Como referido neste documento, o primeiro composto detector compreende uma primeira porção de ligação e um primeiro marcador, e o segundo composto detector compreende uma segunda porção de ligação e um segundo marcador, e o primeiro marcador e o segundo marcador são não idênticos. O primeiro e o segundo marcadores da presente invenção são não idênticos, isto é, os dois marcadores podem ser diferenciados em pelo menos uma propriedade física, biológica e/ ou química. Por exemplo, o primeiro e segundo marcadores podem ser diferenciados por sua interação com certos anti- soros ou anticorpos, ou por análise cromatográfica e/ ou por espectrometria de massa. Em uma forma de realização, a referida propriedade diferenciadora é uma propriedade estrutural. Assim, em uma forma de realização, o primeiro e o segundo marcadores são diferentes em pelo menos uma característica de sua estrutura química, por exemplo, por pelo menos um átomo, ligação química e/ ou carga. Em uma forma de realização, a característica que diferencia o primeiro e o segundo marcadores não está relacionada à propriedade detectável do primeiro e do segundo marcadores; assim, em uma forma de realização, a propriedade detectável do primeiro e do segundo é idêntica, embora o primeiro e o segundo marcadores sejam estruturalmente diferentes. Em uma forma de realização adicional, a característica que diferencia o primeiro e o segundo marcadores está relacionada à propriedade detectável do primeiro e do segundo marcadores; assim, em uma forma de realização, as propriedades detectáveis do primeiro e do segundo marcadores são não idênticas e o primeiro e o segundo marcadores são estruturalmente diferentes.
[0034] Em uma forma de realização, o primeiro e o segundo marcadores (não idênticos) fornecem a mesma qualidade de propriedade detectável. Como utilizado neste documento, o termo “qualidade da propriedade detectável" refere-se à natureza física da propriedade detectável que determina o modo de sua detecção; assim, dois marcadores com a mesma qualidade de propriedade detectável são dois marcadores que permitem a detecção de suas propriedades detectáveis pelo mesmo princípio de medição, isto é, medição por radiação, transmissão, luminescência incluindo quimioluminescência, absorbância ou similares. Em uma forma de realização adicional, o primeiro e o segundo marcadores fornecem essencialmente a mesma propriedade detectável, ou seja, permitem a detecção de suas propriedades detectáveis essencialmente pelo mesmo método, dois métodos sendo “essencialmente o mesmo” se no máximo um parâmetro de medição, por exemplo, comprimento de onda de detecção, é reajustado por um fator de no máximo 2, em uma forma de realização no máximo 1,5, em uma forma de realização adicional no máximo 1,2, em uma forma de realização adicional 1,1. Em uma outra forma de realização, o primeiro e o segundo marcadores fornecem a mesma propriedade detectável, isto é, permitem a detecção de suas propriedades detectáveis pelo mesmo método. Como será entendido, no último caso, as propriedades detectáveis do primeiro e do segundo marcadores podem ser detectadas simultaneamente. Como será mais compreendido, a detecção da propriedade detectável do primeiro e/ ou do segundo marcador pode ser realizada em condições não ideais para um ou ambos os marcadores; por exemplo, no caso de dois marcadores terem espectros de absorção sobrepostos, a absorção pode ser medida com um comprimento de onda de absorção não máxima, no qual os dois marcadores têm o mesmo coeficiente de extinção molar. Assim, em uma forma de realização, determinar a quantidade de complexos na etapa b) compreende detectar a propriedade do primeiro composto detector e do segundo composto detector, em uma forma de realização compreende detectar simultaneamente a propriedade do primeiro composto detector e do segundo composto detector.
[0035] Em uma forma de realização, o primeiro marcador é Ru(bpy)2-bpyCO-OSu (também conhecido como “BP-Ru”; No. de Registro CAS 137323-76-3, = Rutênio(2+), bis(2,2'-bipiridina-kN', kN') [1-[4-(4'-metil[2,2”-
bipiridinJ-4-ilkN', KkN%)-1-oxobutoxil-2,5-pirrolidinediona]-, (OC-6-33) um éster reativo de Ru(bpy)2-bpyCO2H (= BPRu ou Ru-bpy), No. de Registro CAS 115239- 59-3)) e o segundo marcador é Sulfo-BPRu NHS Éster (também conhecido como “Sulfo-Ru”; No. de Registro CAS 482618-42-8 também conhecido na técnica como rutenato(2-), bis[[2,2'-bipiridina]-4,4'-dimetanossulfonato(2-)-KN', kN'] [1- [4-(4'-metil[2,2'-bipiridin]-4-il-kKN', kN*)-1-oxobutoxi]-2,5-pirrolidinadiona]-, sódio (1: 2), (OC-6-31).
[0036] Como utilizado neste documento, o termo “determinação” refere-se à determinação de pelo menos uma característica detectável de um analito a ser determinada pelo método da presente invenção na amostra. Em uma forma de realização, o presente método é aplicável a qualquer determinação, incluindo o uso e a detecção de pelo menos um composto detector, conforme especificado neste documento. Assim, em uma forma de realização, a determinação inclui a determinação de uma interação, direta ou indireta, de uma característica de um analito com um composto detector. Em uma forma de realização, a característica do analito é uma ligação ao domínio de ligação, em uma forma de realização, se liga especificamente a um composto detector. Assim, em uma forma de realização, a característica detectável do analito é um receptor ou um domínio receptor do mesmo, uma lectina, um aptâmero, que pode ser um aptâmero de peptídeo ou um aptâmero de polinucleotídeo, uma anticalina, uma Proteína de Repetição de Anquirina Projetada ou uma imunoglobulina ou subdomínio de ligação da mesma, e o composto detector compreende uma estrutura química especificamente ligada pela referida característica detectável. Por outro lado, em uma forma de realização, o composto detector compreende um receptor ou um domínio receptor do mesmo, uma lectina, um aptâmero, que pode ser um aptâmero de peptídeo ou um aptâmero de polinucleotídeo, uma anticalina, uma Proteína de Repetição de Anquirina Projetada ou uma imunoglobulina ou subdomínio de ligação da mesma, e a característica detectável do analito compreende uma estrutura química especificamente ligada pelo referido composto detector.
[0037] No contexto desta invenção, um “aptâmero” é uma macromolécula que se liga especificamente ao seu parceiro de interação. Os aptâmeros podem ser aptâmeros de peptídeo ou de polinucleotídeos e são, em princípio, conhecidos pelo técnico no assunto. O termo “aptâmero de peptídeo”, como utilizado neste documento, refere-se a um peptídeo que se liga especificamente ao seu parceiro de interação e que compreende 8-80 aminoácidos, em uma forma de realização 10-50 aminoácidos, em uma forma de realização adicional 15-30 aminoácidos. Eles podem, por exemplo, ser isolados de bibliotecas de expressão de peptídeos randomizados em um sistema hospedeiro adequado como levedura de padeiro (veja, por exemplo, Klevenz et al., Cell Mol Life Sci. 2002, 59: 1993-1998).
[0038] Como utilizado neste documento, o termo “anticalina” refere-se a um polipeptídeo artificial derivado de uma lipocalina que se liga especificamente ao seu parceiro de interação. Da mesma forma, uma “Proteína de Repetição de Anquirina Projetada” ou “DARPin”, como utilizado neste documento, é um polipeptídeo artificial compreendendo vários motivos de repetição de anquirina e que se liga especificamente ao seu parceiro de interação.
[0039] Em uma forma de realização, a característica detectável do analito e/ ou do composto detector compreende uma imunoglobulina ou um subdomínio de ligação do mesmo. Assim, em uma forma de realização, determinar compreende determinar uma interação, direta ou indireta, de uma característica imunológica de um analito com um composto detector e/ ou de uma interação, direta ou indireta, de uma característica de um analito com uma característica imunológica de um composto detector. Assim, em uma forma de realização, o método é um imunoensaio. As características imunológicas de acordo com a presente invenção, em uma forma de realização, são características estruturais de um analito, facilitando a detecção do analito em uma amostra por meios imunológicos. Em uma forma de realização, as referidas características imunológicas facilitam a identificação, em uma forma de realização adicional, a quantificação do analito por meios imunológicos. Por conseguinte, características imunológicas típicas são características que facilitam a diferenciação do referido analito de outros compostos químicos em uma amostra. Em uma forma de realização, determinar um analito é estabelecer se um analito está presente ou ausente na amostra em uma concentração acima do limite de detecção do método. Os métodos para determinar um limite de detecção são conhecidos do técnico no assunto. Em uma forma de realização adicional, determinar é determinar semi-quantitativamente ou quantitativamente a quantidade ou concentração de um analito em uma amostra. Para determinação quantitativa, a quantidade absoluta ou precisa do analito será determinada ou a quantidade relativa do analito será determinada. A quantidade relativa pode ser determinada em um caso em que a quantidade precisa de um analito pode ou não ser determinada. No referido caso, pode ser determinado se a quantidade na qual o analito está presente é aumentada ou diminuída em relação a uma segunda amostra compreendendo o referido analito em uma segunda quantidade.
[0040] Como será entendido pelo técnico no assunto, normalmente não haverá necessidade de determinar os complexos de primeiro composto detector/ analito e de segundo composto detector/ analito separadamente. Assim, em uma forma de realização, os complexos do primeiro composto detector e analito e do segundo composto detector e analito são determinados em conjunto, isto é, não discriminados entre o referido primeiro e o referido segundo composto detector. Assim, em uma forma de realização, a quantidade total de analito presente em um complexo com o primeiro composto detector, ou o segundo composto detector, ou ambos é determinada. Isso pode ser realizado, em uma forma de realização, determinando a propriedade detectável do primeiro e do segundo marcadores simultaneamente na etapa b), conforme especificado acima neste documento; ou determinando a propriedade detectável do primeiro e do segundo marcadores separadamente na etapa b), mas determinando um valor de soma da propriedade do primeiro composto detector e da propriedade do segundo composto detector na etapa c). Como é entendido acima, o primeiro e o segundo marcadores podem ser ligados ao mesmo tipo de porção de ligação; assim, a primeira e a segunda porções de ligação podem ser não idênticas, mas também podem ser idênticas. Assim, a determinação pode ser alcançada colocando em contato uma amostra com um anticorpo monoclional, do qual uma primeira fração está ligada a um primeiro marcador e da qual uma segunda fração está ligada a um segundo marcador. O mesmo se aplicou mutatis mutandis a preparações de anticorpos policlonais.
[0041] Como será ainda entendido pelo técnico no assunto, a determinação de complexos de analito/ composto de captura pode compreender etapas adicionais e/ ou uso de outros compostos. Por exemplo, um ou mais compostos detectores adicionais não idênticos aos primeiro e segundo compostos detectores, pelo menos no que diz respeito ao marcador, podem ser utilizados. Em uma forma de realização, o primeiro e o segundo compostos detectores são usados na proporção de 1: 5 a 5: 1, tipicamente 1: 2 a 2: 1, cerca de 1: 1 ou 1: 1. Em uma forma de realização adicional, três compostos detectores são usados em uma proporção de cerca de 2: 1: 1, 1: 2: 1 ou 1: 1: 2, cerca de 1: 1: 1 ou 1: 1: 1. Assim, em uma forma de realização, o primeiro e o segundo compostos detectores e potencialmente apresentar outros compostos detectores, estão presentes na mistura de reação quase na mesma quantidade, em uma forma de realização adicional, na mesma quantidade. Em uma forma de realização, de 2 a 10 compostos detectores são usados, em uma forma de realização de 2 a 5 compostos detectores, em uma forma de realização de 2 a 4 compostos detectores, em uma forma de realização de 2 a 3 compostos detectores e os marcadores de todos os compostos detectores utilizados são mutuamente não idênticos. Em uma forma de realização, os compostos detectores são utilizados em quantidades essencialmente iguais, em uma forma de realização em quantidades iguais.
[0042] Além disso, dependendo do formato de ensaio escolhido, um anticorpo de captura pode ser usado para ligar o analito e o complexo de analito/ composto(s) detector(es) a uma superfície sólida. Em uma forma de realização, o ensaio é um imunoensaio competitivo, tipicamente um imunoensaio competitivo e heterogêneo, ou seja, um imunoensaio, em que um analito compete com um derivado marcado do referido analito pela ligação a um composto de captura ligado a uma superfície sólida e em que é determinada a quantidade de derivado marcado do referido analito ligado ao referido composto de captura. Por conseguinte, nesse caso, o método compreende ainda misturar um especificador a uma amostra. Em uma forma de realização, o método da presente invenção é um imunoensaio competitivo heterogêneo e compreende determinar indiretamente a quantidade de complexos formados entre um analito e dois compostos de captura não idênticos, determinando a quantidade de complexos formados entre o referido especificador e os referidos compostos de captura não idênticos. Em uma forma de realização, o ensaio competitivo é um ensaio para um anti-HAV (vírus anti-hepatite A), anti-HBc (antígeno central anti- hepatite B), anti-HBe (e-antígeno anti-hepatite B), folato, RBC folato (glóbulos vermelhos), Anti-TSH-R, Vitamina D total, Vitamina B12, Tiroxina T4, FT 4 (tiroxina livre), Tiroxina T3, FT 3 (trilodotironina livre), Testosterona, Progesterona, Digitoxina, Anti-TG, Anti-TPO (anti-tireoide peroxidase), DGEA ou Estradiol.
[0043] Em uma forma de realização adicional, o imunoensaio é um ensaio em sanduíche de antígeno duplo (“DAGS”), em que um analito bivalente, por exemplo, um anticorpo, é ligado a um composto de captura ligado a uma superfície sólida e em que a quantidade de complexos de analito/ composto de captura é determinada pela ligação de um composto detector como especificado neste documento abaixo aos referidos complexos de analito/ composto de captura. Em uma forma de realização, o ensaio DAGS é um ensaio para anticorpos anti-Toxoplasma IgG, IgG de anti-rubéola, anticorpos anti-HBs (antígeno de superfície do vírus da hepatite B), antígeno central do HCV (vírus da hepatite C) ou anticorpos anti-HCV, IgG de anticorpos CMV (citomegalovírus), anticorpos de sífilis (Treponema pallidum), anticorpos HTLV (vírus linfotrópico de células T humanas), ou anticorpos de Chagas (tripanossomíase americana).
[0044] Como utilizado neste documento, o termo “composto de captura” refere-se a uma molécula química que se liga, direta ou indiretamente, ao analito, conforme especificado acima neste documento. Em uma forma de realização, o composto de captura é ligado a uma superfície sólida ou adaptado para ser ligado a uma superfície sólida. Em uma forma de realização, o composto de captura é uma molécula orgânica, em uma forma de realização adicional, uma macromolécula biológica como especificado acima neste documento, por exemplo, um polipeptídeo como especificado acima neste documento. Em uma forma de realização, o composto de captura se liga indiretamente ao analito da presente invenção com afinidade suficiente para permitir a detecção do complexo compreendendo o analito e o composto de captura; isto é, nesse caso, o composto de captura é um ligante indireto. O termo “ligação indireta”, como utilizado neste documento, refere-se a uma ligação em que o ligante não entra em contato direto com o analito, mas entra em contato com uma molécula química que liga o analito, em uma forma de realização se liga especificamente ao analito, em que, em uma forma de realização, a referida molécula que se liga ao analito é uma molécula que se liga diretamente ao analito, ou seja, é um ligante direto. Por conseguinte, em uma forma de realização, o analito, uma molécula química que se liga ao analito e o ligante indireto formam um complexo com as propriedades como indicadas acima, em particular com as constantes de dissociação como indicadas. Em uma forma de realização adicional, o composto de captura se liga diretamente ao analito da presente invenção com afinidade suficiente para permitir a detecção do complexo analito/ composto de captura, como especificado acima neste documento. Por conseguinte, em uma forma de realização, o composto de captura é um ligante direto.
[0045] Como utilizado neste documento, o termo “superfície sólida” refere-se a qualquer superfície sólida adequada adaptada para ligação ao composto de captura da presente invenção e adaptada para ser separada, por exemplo, por meios físicos, a partir de uma amostra. Em uma forma de realização, a referida superfície sólida é uma superfície de uma esfera, em uma forma de realização, uma microesfera, por exemplo, uma microesfera magnética ou paramagnética. Em uma forma de realização, a referida superfície é adaptada para melhorar a ligação do composto de captura, por exemplo, ligando, covalentemente ou não covalentemente, moléculas que se ligam a uma subestrutura do composto de captura. As moléculas típicas que ligam uma subestrutura do composto de captura são, por exemplo, anticorpos, estreptavidina, íons de níquel complexados, um componente de qualquer sistema X-anti-X no qual um composto “X” se liga especificamente a um “anti-X” (como, por exemplo, um açúcar e uma proteína/ lectina de ligação ao açúcar ou um hormônio e seu receptor) e similares. Em uma outra forma de realização, a superfície sólida se liga ao referido composto de captura por ligações covalentes ou não covalentes, por exemplo, por interação hidrofóbica. Assim, em uma forma de realização, a referida superfície sólida é uma superfície de uma placa de múltiplos aglomerados. Em uma forma de realização, a superfície da placa de múltiplos aglomerados é pré-tratada para aumentar a afinidade e/ ou capacidade de ligação de um composto de captura. Os pré-tratamentos adequados são conhecidos na técnica.
[0046] Os métodos de ligação de moléculas biológicas, tipicamente polipeptídeos, a superfícies sólidas são bem conhecidos na arte e incluem, por exemplo, ligação por interação hidrofóbica, biotinilação e ligação via estreptavidina imobilizada, ligação covalente, interação anticorpo-antígeno e similares, ou uma combinação dessas interações, por exemplo, interação anticorpo-antígeno entre um anticorpo e um polipeptídeo de um patógeno, em que o referido anticorpo é biotinilado e ligado a uma superfície sólida via estreptavidina imobilizada. Por conseguinte, o composto de captura pode, preferencialmente, também ser um complexo de captura. Em uma forma de realização, o composto de captura é o composto de um complexo de captura que se liga diretamente ao analito. O técnico no assunto sabe como ligar um composto de captura ou complexo a uma superfície sólida, dependendo da superfície sólida selecionada. Em uma forma de realização, o composto de captura é um polipeptídeo viral, por exemplo, um polipeptídeo do capsídeo viral. Em uma forma de realização, o referido composto de captura é um polipeptídeo do capsídeo do vírus da hepatite, em uma forma de realização, um polipeptídeo do capsídeo do vírus da Hepatite A (HAV). No entanto, também está previsto que o composto de captura seja um anticorpo.
[0047] O termo “amostra”, como utilizado neste documento, refere- se a uma amostra de um fluido corporal, uma amostra de um tecido ou um órgão, ou uma amostra de fluido de lavagem/ enxágue ou um swab ou esfregaço obtido a partir de uma superfície externa ou interna do corpo. Em uma forma de realização, suspeita-se que a amostra compreenda um analito conforme especificado neste documento. A amostra, em uma forma de realização, compreende pelo menos um analito, conforme especificado em outra parte deste documento. Em uma forma de realização, a amostra é uma amostra de fluido de sangue, plasma, soro, urina, saliva, lágrima. As amostras podem ser obtidas pelo uso de escovas, cotonetes (algodão), espátula, líquidos de lavagem/ enxágue, dispositivos de biópsia por punção, punção de cavidades com agulhas ou lancetas, ou por instrumentação cirúrgica. No entanto, as amostras obtidas por técnicas bem conhecidas, incluindo, em uma forma de realização, arranhões, swabs ou biópsias do trato urogenital, das regiões perianais, canal anal, da cavidade oral, do trato aerodigestivo superior e da epiderme, também estão incluídos como exemplos da presente invenção. Os fluidos livres de células podem ser obtidos a partir de fluidos corporais ou tecidos ou órgãos por técnicas de lise, como homogeneização e/ ou por técnicas de separação, como filtração ou centrifugação. Em uma forma de realização, as amostras são obtidas de fluidos corporais conhecidos por compreender polipeptídeos do vírus HA ou um anticorpo contra pelo menos um polipeptídeo do vírus HA, ou seja, em uma forma de realização, sangue, plasma, soro, saliva ou semelhante, em uma forma de realização do plasma ou do soro. Deve ser entendido que a amostra pode ser processada adicionalmente, a fim de executar o método da presente invenção. Particularmente, as células podem ser removidas da amostra por métodos e meios conhecidos na técnica. Além disso, pelo menos um analito pode ser extraído e/ ou purificado da amostra por métodos e meios conhecidos na técnica. Assim, o termo amostra também pode se referir a preparações que compreendem ou se suspeita que compreendam pelo menos um analito, diluído, enriquecido, purificado e/ ou extraído de uma amostra.
[0048] O termo “colocar em contato” como usado no contexto dos métodos da presente invenção é entendido pelo técnico no assunto. Em uma forma de realização, o termo refere-se a colocar um composto da presente invenção em contato físico com uma amostra ou com um outro composto e, assim, por exemplo, permitir que a amostra e o composto interajam.
[0049] O termo “sujeito”, como utilizado neste documento, refere-
se a um vertebrado, em uma forma de realização, a um sujeito mamífero. Em uma forma de realização, o sujeito é um animal de fazenda, um animal de companhia ou um animal experimental, por exemplo, gado, ovelha, cabra, cavalo, gato, cachorro, porquinho-da-índia, camundongo ou rato. Em uma forma de realização, o sujeito é um humano. Em uma forma de realização adicional, o sujeito é suspeito de compreender um analito como especificado neste documento.
[0050] De um modo vantajoso, verificou-se na obra subjacente à presente invenção que, utilizando diferentes marcadores em imunoensaios, que pode proporcionar essencialmente a mesma quantidade e/ ou a qualidade de um sinal, interferências por compostos anti-marcador de uma amostra podem ser reduzidas. Por exemplo, em imunoensaios competitivos, a redução do sinal causada por interferências anti-marcador, causando resultados falso-positivos, pode ser reduzida. Da mesma forma, em imunoensaios em sanduíche/ sanduíche de antígeno duplo, interferências anti-marcador tendem a reduzir o sinal por ligação ao marcador, causando uma redução da produção de sinal, desse modo, os resultados falso-negativos. Em alguns casos, também foi observado um aumento de sinal, causando assim resultados falso-negativos. Pelo menos em todos esses casos, o uso de pelo menos dois marcadores diferentes evita que as interferências causem resultados falsos.
[0051] As definições feitas acima aplicam-se mutatis mutandis ao que se segue. Definições e explicações adicionais feitas mais abaixo também se aplicam a todas as formas de realização descritas neste relatório descritivo, mutatis mutandis.
[0052] A presente invenção também se refere a um método para melhorar a especificidade da detecção de um analito em um ensaio, compreendendo a substituição de 10% a 90% de um primeiro composto detector por um segundo composto detector com um marcador não idêntico.
[0053] Como utilizado neste documento, o termo “substituir uma fração do primeiro composto detector por um segundo composto detector” refere-se à omissão da fração indicada do primeiro composto detector de um ensaio e à inclusão recente do segundo composto detector em uma quantidade correspondente à quantidade do primeiro composto detector omitido. Em uma forma de realização, as frações e quantidades do primeiro e do segundo compostos detectores são calculadas em uma base molar; assim, caso a concentração do primeiro composto detector em um ensaio seja inicialmente 10 pM e 50% seja substituída, o segundo composto detector seria incluído a uma concentração de 5 pM. Em uma outra forma de realização, as frações e quantidades do primeiro e do segundo compostos detectores são calculadas com base no rendimento do sinal. Assim, por exemplo, a concentração do primeiro composto detector no ensaio original pode ser ajustada para um rendimento de sinal arbitrário de 100%; assim, no caso de 50% do primeiro composto detector ser substituído com base no rendimento do sinal, uma quantidade do primeiro composto detector é omitida, de modo que o rendimento do sinal seja reduzido para 50%, e um segundo composto detector é adicionado, de modo que o rendimento do sinal suba para 100% novamente. Como será entendido, o acima descrito aplica-se mutatis mutandis se um primeiro composto detector for substituído por mais de um composto detector adicional e se mais de um composto detector for substituído por um ou mais composto(s) detector(es) adicionais.
[0054] Tipicamente, a fração do composto de captura ou composto detector substituída será selecionada de modo que um efeito mensurável da substituição possa ser esperado teoricamente. Como será entendido pelo técnico no assunto, a expectativa de um efeito mensurável dependerá do número de marcadores não idênticos usados para substituição. Por exemplo, se no ensaio após a melhoria forem utilizados três em vez de um composto detector,
é preferível que, por exemplo, 66% do composto detector inicial seja substituído. Como regra geral, está previsto que a fração de um determinado composto detector seja (100% / n) + 50%, com n = (número de compostos detectores não idênticos utilizados em um ensaio). Em outra forma de realização, uma fração de (100% / n) + 20% é usada. Como será entendido pelo técnico no assunto, a soma das frações utilizadas será de até 100%. Assim, em uma forma de realização, a fração do composto detector substituído é de 10% a 90%, em uma forma de realização, de 25% a 75%, em uma forma de realização adicional, de 40% a 60%, em uma forma de realização adicional, cerca de 50%.
[0055] A presente invenção refere-se ainda a um kit para detectar um analito em uma amostra, compreendendo pelo menos um primeiro e um segundo composto detector para o referido analito, em que o referido primeiro composto detector compreende uma primeira porção de ligação e um primeiro marcador e o referido segundo composto detector compreende uma segunda porção de ligação e um segundo marcador, e em que o primeiro marcador e o segundo marcador são não idênticos.
[0056] O termo “kit”, como utilizado neste documento, refere-se a uma coleção dos compostos mencionados acima, meios ou reagentes da presente invenção que podem ou não ser embalados juntos. Os componentes do kit podem ser compreendidos de frascos separados (ou seja, como um kit de partes separadas) ou fornecidos em um único frasco. Além disso, em uma forma de realização, o kit da presente invenção deve ser utilizado para a prática dos métodos referidos acima. Em uma forma de realização, está previsto que todos os componentes sejam fornecidos de maneira pronta para uso para a prática dos métodos mencionados acima. Além disso, o kit, em uma forma de realização, contém instruções para executar os referidos métodos. As instruções podem ser fornecidas pelo manual do usuário em formato papel ou eletrônico. Por exemplo, o manual pode compreender instruções para interpretar os resultados obtidos ao executar os métodos acima mencionados usando o kit da presente invenção. Em uma forma de realização, o kit para detectar um analito em uma amostra, compreendendo pelo menos dois compostos detectores não idênticos, compreende ainda pelo menos um composto de captura. Em uma outra forma de realização, o kit compreende ainda um suporte sólido para imobilizar os referidos compostos de captura ou para imobilizar um analito. Em uma forma de realização, de 2 a 10 compostos detectores para o referido analito, em uma forma de realização de 2 a 5 compostos detectores para o referido analito, em uma forma de realização de 2 a 4 compostos detectores, em uma forma de realização de 2 a 3 compostos detectores para o referido analito estão compreendidos no referido kit.
[0057] Além disso, a presente invenção refere-se a um dispositivo para determinar um analito em uma amostra, compreendendo pelo menos um primeiro e um segundo composto detector para o referido analito, em que o referido primeiro composto detector compreende uma primeira porção de ligação e um primeiro marcador e o referido segundo composto detector compreende uma segunda porção de ligação e um segundo marcador, e em que o primeiro marcador e o segundo marcador são não idênticos; e meios para determinar pelo menos um sinal obtido a partir do referido primeiro marcador e do referido segundo marcador.
[0058] O termo “dispositivo”, como utilizado neste documento, refere-se a um sistema de meios compreendendo pelo menos os meios acima mencionados operacionalmente ligados entre si, de modo a permitir a determinação. Os meios típicos para determinar as quantidades de um analito e os meios para realizar a determinação são divulgados acima em conexão com os métodos da invenção, por exemplo, meios para determinar pelo menos um sinal. Como é entendido pelo técnico no assunto, meios para determinar pelo menos um sinal incluem meios capazes de determinar um sinal; como também é entendido pelo técnico no assunto, um meio para determinar um sinal é um meio que tem a capacidade de detectar o referido sinal, mesmo no caso em que o sinal seja zero ou abaixo de um limite de detecção para uma amostra específica.
[0059] Como vincular os meios de maneira operacional dependerá do tipo de meios incluído no dispositivo. Em uma forma de realização, os meios são compreendidos por um único dispositivo. O referido dispositivo pode, portanto, incluir (i) uma unidade de análise para a medição da quantidade de analito em uma amostra aplicada e uma (ii) unidade de computador para processar os dados resultantes para a avaliação. Os meios típicos para detecção são divulgados em conexão com formas de realização relacionadas ao método da invenção acima. Nesse caso, os meios estão operacionalmente ligados, em que o usuário do sistema reúne o resultado da determinação da propriedade detectável do marcador, em uma forma de realização a propriedade ópticamente e/ ou eletroquimicamente determinável de um marcador, com base nas instruções e interpretações fornecidas em um manual; ou as referidas instruções e interpretações são compreendidas em um código de programa executável compreendido no dispositivo, de modo que, como resultado da determinação, uma quantidade ou concentração de analito na amostra aplicada seja enviada ao usuário. O técnico no assunto compreenderá como ligar os meios sem mais delongas. Dispositivos típicos são aqueles que podem ser aplicados sem o conhecimento específico de um técnico especializado, por exemplo, faixas de teste ou dispositivos eletrônicos que requerem apenas o carregamento de uma amostra. Os resultados podem ser dados como saída de dados brutos que precisam ser interpretados por um técnico. Em uma forma de realização, a saída do dispositivo é, no entanto, processada, isto é, avaliada, dados brutos, cuja interpretação não requer um técnico. Outros dispositivos típicos compreendem unidades/ dispositivos de análise (por exemplo, biossensores, matrizes, suportes sólidos acoplados a ligantes que reconhecem especificamente o peptídeo, dispositivos de ressonância de plasmon de superfície, espectrômetros de RMN, espectrômetros de massa etc.) ou unidades/ dispositivos de avaliação mencionados acima de acordo com o método da invenção. Em uma forma de realização, de 2 a 10 compostos detectores para o referido analito, em uma forma de realização de 2 a 5 compostos detectores para o referido analito, em uma forma de realização de 2 a 4 compostos detectores, em uma forma de realização de 2 a 3 compostos detectores para o referido analito estão compreendidos no referido dispositivo.
[0060] Além disso, a presente invenção refere-se ao uso de uma composição compreendendo pelo menos um primeiro e um segundo composto detector para detectar um analito, em que o referido primeiro composto detector compreende uma primeira porção de ligação e um primeiro marcador, e o referido segundo composto detector compreende uma segunda porção de ligação e um segundo marcador, e em que o primeiro marcador e o segundo marcador são não idênticos; e a presente invenção refere-se a um uso de pelo menos um primeiro e um segundo composto detector para um analito para a fabricação de uma composição de diagnóstico ou um dispositivo de diagnóstico, em que o referido primeiro composto detector compreende uma primeira porção de ligação e um primeiro marcador, e o referido o segundo composto detector compreende uma segunda porção de ligação e um segundo marcador, e em que o primeiro marcador e o segundo marcador são não idênticos; e a presente invenção refere-se a um uso de uma composição compreendendo pelo menos um primeiro e um segundo composto detector para um analito para determinar o referido analito em uma amostra, em que o referido primeiro composto detector compreende uma primeira porção de ligação e um primeiro marcador e o referido segundo composto detector compreende uma segunda porção de ligação e um segundo marcador, e em que o primeiro marcador e o segundo marcador são não idênticos.
[0061] Em vista do acima exposto, as seguintes formas de realização são particularmente previstas: 1 Método para determinar um analito em uma amostra, compreendendo a) colocar em contato a referida amostra com pelo menos um primeiro e um segundo composto detector; b) determinar a quantidade de complexos compreendendo pelo menos um composto detector; e, Cc) determinar o referido analito em uma amostra com base no resultado da etapa b), em que o referido primeiro composto detector compreende uma primeira porção de ligação e um primeiro marcador, e o referido segundo composto detector compreende uma segunda porção de ligação e um segundo marcador, e em que o primeiro marcador e o segundo marcador são não idênticos;
2. O método da forma de realização 1, em que o primeiro e o segundo marcadores fornecem a mesma qualidade de propriedade detectável;
3. O método da forma de realização 1 ou 2, em que o primeiro e o segundo marcadores fornecem a mesma propriedade detectável;
4. O método de qualquer uma das formas de realização 1 a 3, em que o primeiro e o segundo marcadores fornecem essencialmente a mesma quantidade de propriedade detectável;
5. O método de qualquer uma das formas de realização 1 a 4, em que a propriedade detectável fornecida pelo primeiro e/ ou pelo segundo composto detector é uma propriedade de radiação, em uma forma de realização uma propriedade de luminescência, em uma outra forma de realização uma propriedade de quimioluminescência;
6. O método de qualquer uma das formas de realização 1 a 5, em que o marcador no primeiro composto detector compreende Ru(bpy)2- bpyCO-OSu (No. de registro CAS 137323-76-3);
7. O método de qualquer uma das formas de realização 1 a 6, em que a marcador no segundo composto detector é Sulfo-BPRu NHS Éster (No. de registro CAS 482618-42-8);
8. O método de qualquer uma das formas de realização 1 a 7, em que a determinação da quantidade de complexos na etapa b) compreende a detecção da propriedade do primeiro composto detector e do segundo composto detector, em uma forma de realização compreende a detecção simultânea da propriedade do primeiro composto detector e do segundo composto detector;
9. O método de qualquer uma das formas de realização 1 a 8, em que a determinação do referido analito na etapa c) compreende a determinação de um valor da soma da propriedade do primeiro composto detector e da propriedade do segundo composto detector;
10. O método de qualquer uma das formas de realização 1 a 9, em que a porção de ligação se liga especificamente ao referido analito ou a um composto de captura que se liga especificamente ao analito;
11. O método de qualquer uma das formas de realização 1 a 9, em que a porção de ligação compete com o analito na ligação a um composto de captura;
12. O método de qualquer uma das formas de realização 1 a 11, em que a referida porção de ligação é uma molécula biológica ou fragmento da mesma, em uma forma de realização é um polipeptídeo ou fragmento do mesmo;
13. — O método de qualquer uma das formas de realização 1 a 12, em que a referida porção de ligação é um anticorpo ou um fragmento do mesmo;
14. “O método de qualquer uma das formas de realização 1 a 13, em que o referido método é um imunoensaio;
15. —O método de qualquer uma das formas de realização 1 a 14, em que o referido método é um ensaio competitivo;
16. O método de qualquer uma das formas de realização 1 a 14, em que o referido método é um ensaio em sanduíche, em uma forma de realização um ensaio em sanduíche de antígeno duplo;
17. O método de qualquer uma das formas de realização 1 a 16, em que o referido método é um ensaio qualitativo ou semi-quantitativo;
18. O método de qualquer uma das formas de realização 1 a 17, em que o referido método é um ensaio quantitativo;
19. O método de qualquer uma das formas de realização 1 a 18, em que o referido analito é um polipeptídeo;
20. “O método de qualquer uma das formas de realização 1 a 19, em que o referido analito é um anticorpo, em uma forma de realização um anticorpo contra um antígeno de um organismo patogênico, em uma forma de realização um anticorpo contra um antígeno viral, em uma forma de realização contra um antígeno protozoário;
21. O método de qualquer uma das formas de realização 1 a 20, em que o referido analito é um anticorpo anti-hepatite A ou um anticorpo anti- Toxoplasma;
22. “O método de qualquer uma das formas de realização 1 a 19, em que o referido analito é um antígeno de um organismo patogênico, em uma forma de realização é um antígeno bacteriano;
23. —O método de qualquer uma das formas de realização 1 a 22, em que de 2 a 10 compostos detectores são utilizados, em uma forma de realização de 2 a 5 compostos detectores, em uma forma de realização de 2 a 4 compostos detectores, em uma forma de realização de 2 a 3 compostos detectores, e em que os marcadores de todos os compostos detectores são mutuamente não idênticos;
24. "Um método para melhorar a especificidade da detecção de um analito em um ensaio, compreendendo a substituição de 10% a 90% de um primeiro composto detector por um segundo composto detector com um marcador não idêntico;
25. O método da forma de realização 24, em que de 25% a 75%, em uma forma de realização adicional de 40% a 60%, em uma forma de realização adicional, cerca de 50% do referido primeiro composto detector são substituídos;
26. Um método para identificar uma amostra compreendendo uma determinação de confusão interferente de um analito com um composto detector tendo um primeiro marcador compreendendo a) colocar em contato uma alíquota da referida amostra com um primeiro composto detector tendo o referido primeiro marcador; b) colocar em contato uma alíquota da referida amostra com um segundo composto detector possuindo um segundo marcador; c) determinar um primeiro sinal gerado pelo primeiro marcador; d) determinar um segundo sinal gerado pelo segundo marcador; e) identificar uma amostra compreendendo uma determinação de confusão interferente de um analito com um composto detector possuindo um primeiro marcador comparando o primeiro sinal da etapa c) com o segundo sinal da etapa d);
27. O método da forma de realização 26 compreende ainda determinar uma pluralidade de analitos;
28. Um Kkit para detectar um analito em uma amostra, compreendendo pelo menos um primeiro e um segundo composto detector para o referido analito, em que o referido primeiro composto detector compreende uma primeira porção de ligação e um primeiro marcador, e o referido segundo composto detector compreende uma segunda porção de ligação e um segundo marcador, e em que o primeiro marcador e o segundo marcador são não idênticos;
29. O kit da forma de realização 28, em que o referido kit compreende ainda pelo menos um composto de captura para o referido analito;
30. O kKitda forma de realização 28 ou 29, em que o referido kit compreende ainda um suporte sólido para imobilizar os referidos compostos de captura ou constituintes da referida amostra compreendendo pelo menos o referido analito;
31. Um dispositivo para determinar um analito em uma amostra, compreendendo pelo menos um primeiro e um segundo composto detector para o referido analito, em que o referido primeiro composto detector compreende uma primeira porção de ligação e um primeiro marcador, e o referido segundo composto detector compreende uma segunda porção de ligação e um segundo marcador, e em que o primeiro marcador e o segundo marcador são não idênticos; e meios para determinar pelo menos um sinal obtido a partir do referido primeiro marcador e do referido segundo marcador;
32. — Uso de uma composição compreendendo pelo menos um primeiro e um segundo composto detector para detectar um analito, em que o referido primeiro composto detector compreende uma primeira porção de ligação e um primeiro marcador, e o referido segundo composto detector compreende uma segunda porção de ligação e um segundo marcador e em que o primeiro marcador e o segundo marcador são não idênticos;
33. Uso de pelo menos um primeiro e um segundo composto detector para um analito para a fabricação de uma composição de diagnóstico ou um dispositivo de diagnóstico, em que o referido primeiro composto detector compreende uma primeira porção de ligação e um primeiro marcador, e o referido segundo composto detector compreende uma segunda porção de ligação e um segundo marcador, e em que o primeiro marcador e o segundo marcador são não idênticos;
34. O uso da forma de realização 32 ou 33, em que o referido analito é um analito conforme especificado em qualquer uma das formas de realização 19 a 22;
35. Uso de uma composição compreendendo pelo menos um primeiro e um segundo composto detector para um analito para determinar o referido analito em uma amostra, em que o referido primeiro composto detector compreende uma primeira porção de ligação e um primeiro marcador, e o referido segundo composto detector compreende uma segunda porção de ligação e um segundo marcador, e em que o primeiro marcador e o segundo marcador são não idênticos;
36. — Um método de qualquer uma das formas de realização 1 a 27, o kit de qualquer uma das formas de realização 28 a 30, o dispositivo da forma de realização 31 e/ ou um uso de qualquer uma das formas de realização 32 a 35, em que os domínios de afinidade e/ ou as porções de ligação do primeiro e do segundo compostos detectores são idênticos;
37. — Um método de qualquer uma das formas de realização 1 a 27, o Kit de qualquer uma das formas de realização 28 a 30, o dispositivo da forma de realização 31 e/ ou um uso de qualquer uma das formas de realização 32 a 35, em que os domínios de afinidade e/ ou as porções de ligação do primeiro e do segundo composto detector são não idênticos.
[0062] Todas as referências citadas neste relatório descritivo são neste documento incorporadas por referência em relação a todo o seu conteúdo de divulgação e ao conteúdo de divulgação especificamente mencionado neste relatório descritivo.
[0063] Os seguintes Exemplos meramente ilustram a invenção.
Eles não devem ser interpretados, de forma alguma, como limitantes ao escopo da invenção. Exemplo 1: Aumento da especificidade no Ensaio Qualitativo e Competitivo do Vírus Anti-Hepatite A (anti-HAV) Elecsys
[0064] O imunoensaio para a determinação in vitro de anticorpos anti-HAV foi realizado de acordo com as instruções do fabricante em um analisador automático Elecsysº cobas (Roche Diagnostics GmbH). Elecsysº é uma marca registrada do grupo Roche.
[0065] O ensaio foi realizado de acordo com o princípio da competição. Em uma primeira incubação, 50 ul da amostra foram incubados com antígeno HAV adicionado, de modo que a amostra anti-HAV se liga ao antígeno HAV. Em uma segunda etapa de incubação (subsequente), anticorpos biotinilados e marcados com rutênio, específicos para o antígeno HAV, juntamente com micropartículas revestidas com estreptavidina, foram adicionados à mistura de antígeno HAV-amostra para que os locais de ligação ainda livres no antígeno HAV fossem ocupados. Todo o complexo foi ligado à fase sólida (micropartículas) via interação de biotina e estreptavidina. Em seguida, a mistura de reação foi aspirada para a célula de medição, onde as micropartículas foram magneticamente capturadas na superfície do eletrodo. As substâncias não ligadas foram então removidas com ProCell/ ProCell M (solução tamponada compreendendo tripropilamina, necessária para geração de sinal). À aplicação de uma tensão ao eletrodo induziu então a emissão quimioluminescente que foi medida por um fotomultiplicador. Os resultados foram determinados por meio de uma curva de calibração que é instrumento especificamente gerado por calibração de 2 pontos (Cali = calibrador negativo compreendendo soro negativo anti-HAV humano; Cal2 = calibrador positivo compreendendo anti-HAV humano em soro humano). Em detalhe, foram utilizados fragmentos de anticorpo monoclonal MAK<HAV>M-2.157-F(ab')2, uma alíquota marcada com BP-Ru e a outra marcada com Sulfo-Ru; estes foram usados para gerar 3 versões diferentes de ensaios Anti-HAV: Ensaio 1: 100% da MAK<HAV>M-2.157-F(ab')) usada em R2 é rotulada com Sulfo-Ru Ensaio 2: 100% de MAK<HAV>M-2.157-F(ab')) usado em R2 é marcado com BP-Ru Ensaio 3: Foi utilizada uma mistura de 1 + 1 do Ensaio 1 R2Q e Ensaio 2 R2 (significando uma mistura de BP-Ru e Sulfo-Ru). A contribuição do sinal de BP-Ru e Sulfo-Ru para o sinal geral foi semelhante.
[0066] O primeiro marcador é “BP-Ru”, também conhecido como Ru(bpy)2-bpbyCO-OSu (No. de Registro CAS 137323-76-3, = Rutênio(2+), bis(2,2'-bipiridina-kN', kN”) [1-[4-(4-metill2,2'-bipiridin)-4-i-kKN', — <kNÍ)-1- oxobutoxi]-2,5-pirrolidinodiona]-, (OC-6-33) um éster reativo de Ru(bpy)>- bpyCO>2H (= BPRu ou Ru-bpy), No. de Registro CAS 115239-59-3)) e o segundo marcador é “Sulfo-Ru”, também conhecido como Sulfo-BPRu NHS Éster (No. de Registro CAS 482618-42-8 também conhecido na técnica como rutenato(2-), bis[[2,2'-bipiridina]-4,4'"-dimetanossulfonato(2-)-kKN', kN] [1-[4-(4'-metill2,2- bipiridin]-4-il-<KN', kN')-1-oxobutoxi]-2,5-pirrolidinadiona]-, sódio (1: 2), (OC-6- 31).
[0067] Os resultados com amostras de calibradores e padrões são mostrados na Tabela 1. Além disso, 27 amostras interferentes anti-marcador conhecidas, como amostras interferentes anti-Sulfo-Ru, bem como uma amostra interferente anti-BP-Ru conhecida, foram testadas com todos os 3 ensaios (Tabela 2) Sabe-se que essas amostras causam resultados falso-positivos quando usadas na respectiva variante de teste Antic-HAV. Como esperado, as amostras interferentes anti-Sulfu-Ru são falso-positivas no Ensaio 1, mas negativas corretas no Ensaio 2 e a amostra interferente anti-BP-Ru é negativa correta no Ensaio 1, mas falso-positiva no Ensaio 2. Interessantemente, todas as amostras exceto para uma amostra interferente anti-Sulfo Ru (PNO0206 0925), são negativos corretos no Ensaio 3, contendo a mistura de marcadores de BP-Ru e Sulfo Ru, significando uma melhora significativa na especificidade.
[0068] O índice de corte (Cut-Off, COI) é calculado da seguinte forma: O corte foi determinado usando uma calibração de 2 pontos usando um calibrador negativo (Cal1) e um positivo (Ca2). O índice de corte (COI) foi determinado dividindo-se as contagens (amostras) ponto de corte. Os resultados são interpretados como reativos se COI < 1 e não reativos se COI >
1.
Exemplo 2: Aumento da Sensibilidade do Ensaio Quantitativo DAGS Elecsys Toxo IgG
[0069] O imunoensaio para a determinação in vitro de anticorpos Toxo-lgG foi realizado de acordo com as instruções do fabricante em um analisador automatizado Elecsysº cobas (Roche Diagnostics GmbH). Elecsysº é uma marca registrada do grupo Roche.
[0070] O ensaio foi realizado de acordo com o princípio do sanduíche (anticorpos IgG ensanduichados entre dois antígenos Toxo-p30). Em uma primeira incubação 10 ul de amostra de um antígeno específico para T. gondii recombinante biotinilado, e um antígeno recombinante específico para T. gondii marcado com um complexo de rutênio formam um complexo em sanduíche. Em uma segunda etapa, foram adicionadas micropartículas revestidas com estreptavidina, de modo que o imunocomplexo de anticorpos da amostra e antígenos Toxo fossem ligados à fase sólida através da interação de biotina e estreptavidina. Em seguida, a mistura de reação foi aspirada para a célula de medição, onde as micropartículas foram magneticamente capturadas sobre a superfície do eletrodo. As substâncias não ligadas foram então removidas com ProCell/ ProCell M (solução tamponada compreendendo tripropilamina, necessária para geração de sinal). A aplicação de uma tensão ao eletrodo induziu então a emissão quimioluminescente que foi medida por um fotomultiplicador. Os resultados foram determinados por meio de uma curva de calibração que é instrumento especificamente gerado por calibração de 2 pontos (Call = calibrador negativo compreendendo soro humano, que é anti- Toxoplasma negativo; Cal2 = calibrador positivo compreendendo soro humano que é reativo para a IgG anti-Toxoplasma).
[0071] Em detalhe, foram utilizadas duas qualidades de antígeno Toxo-p30 recombinante marcado diferentemente, um foi marcado com BP-Ru e o outro foi marcado com Sulfo-Ru (nomes químicos dos marcadores, veja o Exemplo 1). As duas qualidades recombinantes do antígeno Toxo-p30 foram usadas para gerar três versões diferentes dos testes Toxo IgG: Ensaio 1: 100% do antígeno Toxo-p30 rec. usado em R2 é marcado com Sulfo-Ru Ensaio 2: 100% do antígeno Toxo-p30 rec. usado em R2 é marcado com BP-Ru Ensaio 3: Foi utilizada uma mistura 1 + 1 do Ensaio 1 R2 e Ensaio 2 R2 (significando uma mistura de BP-Ru e Sulfo-Ru). A contribuição do sinal de BP-Ru e Sulfo-Ru para o sinal geral foi semelhante.
[0072] Os resultados foram interpretados como não reativos se < 1 UI/ mL, indeterminado se 2 1 a < 3 UI/ mL, e reativa se 2 3 UI/ mL, de acordo com as instruções do fabricante. Os resultados com amostras de calibradores e padrões são mostrados na Tabela 3. Além disso, várias amostras interferentes anti-Sulfo-Ru e anti-BP-Ru, causando resultados falso-negativos ou falso indeterminados na respectiva variante de ensaio, foram testadas com todos os três ensaios (Tabela 4). Como esperado, as amostras interferentes anti-Sulfu- Ru são falso-negativas ou indeterminadas no Ensaio 1, mas corretas-
indeterminadas ou corretas-positivas no Ensaio 2. Vice-versa, o mesmo se aplica às amostras interferentes anti-BPRu que interferem no Ensaio 2. Curiosamente, todas as amostras são consideradas indeterminadas ou negativas corretas no Ensaio 3, contendo a mistura de marcadores de BP-Ru e Sulfo Ru, significando um aumento significativo da sensibilidade.
REFERÊNCIAS CITADAS - Ando et al. (2007), Intern Med. 46 (15): 1225 - Buijs et al. (2011), Ann Clin Biochem. 48 (Pt 3): 276 - DE 19519973 A1 - DeForge (2010), J. Immunol Methods. 362 (1-2): 70) - Heijboer et al. (2009), Ann Clin Biochem.46 (Pt 3): 263 - Klevenz et al., Cell Mol Life Sci. 2002, 59: 1993-1998 - Park & Kricka (2013), cap. 5.3 - Interferences in Immunoassay, no The Immunoassay Handbook (Quarta Edição), editado por David Wild, Elsevier, Oxford: 403 - Sapin et al. (2007), Clin Chern Lab Med. 45 (3): 416 - Schiettecatte (2012), Interferences in Immunoassay, Advances in Inmunoassay Technology, Dr. Norman H.L. Chiu (Ed.) - WO 2016/097116 A1 - WO 2017/093271 A1 TABELA 1: RESULTADOS COM CALIBRADORES E AMOSTRAS PADRÕES (ENSAIO COMPETITIVO) Ensaio 3 - Mistura : : (especificador sulfo- Ensaio 1 - Ensaio 2 - : Especificador sulfo- Especificador BP- mtenitado + rutenilado rutenilado ( ificad ke (MAK<HAV>) (MAK<HAV>) especilicador B1- rutenilado (MAK<HAV>)) [mta [EE 0a CESTOS co PES co ES Amostra em co! do em col do em co! do Calibrad | 167021 94152 120090 or 1 171837 93084 126023 90321 48966 63258
Ensaio 3 - Mistura Ensaio 1 - Ensaio 2 - (especificador sulfo- Especificador sulfo- Especificador BP- rutenilado t (MAK<HAV>) + rutenilado rutenilado especificador BP- (MAK<HAV>) (MAK<HAV>) uterilado (MAK<HAV>)) ama E co PESE co ESTO ca PES Amostra em co! do em co! do em co! do 1,2 não 12 não 12 não PreciCon | 157153 6 reativo | 86055 3 reativo | 109193 2 reativo trol 1 1,2 não 1,2 não 1,2 não 157333 3 reativo | 85478 2 reativo | 114982 1 reativo 0,3 0,3 0,3 PreciCon | 49587 98 | reativo | 27610 93 | reativo | 34751 88 | reativo trol 2 0,3 0,3 0,3 47884 75 | reativo | 26687 81 reativo | 35544 75 | reativo Amostra humana 1,2 não 1,2 não 1,2 não 1 155989 5 reativo | 85244 1 reativo | 107801 o reativo Amostra humana 1,0 não 1,0 não 1,0 não 2 133091 7 reativo | 70976 1 reativo | 92415 3 reativo Amostra humana 1,0 não 1,0 não 1,0 não 3 133543 7 reativo | 73909 5 reativo | 96941 8 reativo Amostra humana 0,9 0,8 0,8 4 114943 | 22 | reativo | 60840 67 | reativo | 78426 76 | reativo humana 0,8 0,8 0,8 109728 | 80 | reativo | 59414 | 46 | reativo | 76068 | 49 | reativo Amostra humana 0,6 0,6 0,6 6 83024 66 | reativo | 44244 30 | reativo | 57973 47 | reativo Amostra humana 0,0 0,0 0,0 7 541 04 | reativo 1567 22 | reativo 1056 12 | reativo TABELA 2: RESULTADOS COM AMOSTRAS DE CONFUSÃO (ENSAIO COMPETITIVO) Ensaio 3 - Mistura Ensaio 1 - Ensaio 2 - (especificados sulfo- Espanca ato O Espescada Er | (MAKZHAVD (MAK<HAV>) (MAK<HAV>) especificador BP- rutenilado (MAK<HAV>)) Contag Result | Contag Result | Contag Result | amostra | Emos [con] so" | CGme [cor] Paso! | eme [cor] São | Amostra interferent 1,2 não 0,7 AR 1,0 não e anti-BP- 159869 5 reativo so216 17 reativo | 99017 4 reativo Ru
Ensaio 3 - Mistura Ensaio 1 - Ensaio 2 - Pspecifizados, sulfo- e is rutenilado Especificador sulfo- Especificador BP- (MAK<HAV>) + rutenilado rutenilado ie (MAK<HAV>) (MAK<HAV>) especificador BP- rutenilado (MAK<HAV>)) [aros [FE eo [FE] eri5 [co] FEE] em [eo | 1 em ado em ado em ado e anti- Sulfo-Ru PNO206 0925 Amostra interferent e anti- 0,7 s 1,2 não 1,0 não Sulfo-Ru 93909 35 reativo | 85916 3 reativo 99826 5 reativo PNO0206 2129 Amostra interferent e anti- 0,7 x 11 não 1,0 não Sulfo-Ru 294703 42 reativo | 81018 6 reativo 97326 3 reativo PNO206 1262 Amostra interferent e anti- 0,7 1 11 não 1,0 não Sulfo-Ru 101832 97 reativo | 78782 2 reativo 100607 6 reativo PNO0207 0566 Amostra interferent e anti- 0,8 ; 11 não 1,0 não Sulfo-Ru 105903 29 reativo | 80791 5 reativo 101139 7 reativo PNO206 0724 Amostra interferent e anti- 0,8 ; 1,2 não 11 não Sulfo-Ru 107407 41 reativo | 84885 1 reativo 106178 2 reativo PNO206 2122 Amostra interferent e anti- 0,8 s 11 não 1,0 não Sulfo-Ru 108378 49 reativo | 82170 7 reativo 99824 5 reativo PNO206 1230 Amostra interferent e anti- 0,8 1 1,2 não 11 não Sulfo-Ru 110320 64 reativo | 85196 2 reativo 109382 5 reativo PNO0207 0477 Amostra 0,8 s 13 não 1,2 não
Ensaio 3 - Mistura Ensaio 1 - Ensaio 2 - specificados, sulfo- e is rutenilado Especificador sulfo- Especificador BP- (MAK<HAV>) + rutenilado rutenilado ie (MAK<HAV>) (MAK<HAV>) especificador BP- rutenilado (MAK<HAV>)) [aros [FE eo [FE] eri5 [co] FEE] em [eo | 1 em ado em ado em ado e anti- Sulfo-Ru PNO206 1267 Amostra interferent e anti- 0,8 s 1,2 não 11 não Sutfo-Ru | 111650 | 74 | reativo | 84128 | & | reativo | 112683 | 9 | reativo PNO0206 1916 Amostra interferent e anti- 0,8 x 1,2 não 11 não Sulfo-Ru 112114 78 reativo | 84520 1 reativo 109502 6 reativo PNO206 1745 Amostra interferent e anti- 0,8 A 1,0 não 1,0 não Sulfo-Ru 113528 89 reativo | 72598 4 reativo 96960 2 reativo PNO0206 1553 Amostra interferent e anti- 0,9 ; 1,2 não 11 não Sulfo-Ru 117513 20 reativo | 86872 4 reativo 111157 7 reativo PNO206 1817 Amostra interferent e anti- 0,9 ; 1,2 não 11 não Sulfo-Ru 117666 21 reativo | 87660 5 reativo 107823 4 reativo PNO206 0565 Amostra interferent e anti- 0,9 s 11 não 11 não Sulfo-Ru 119933 39 reativo | 78713 2 reativo 108002 4 reativo PNO0207- 0593 Amostra interferent e anti- 0,9 1 11 não 11 não Sulfo-Ru 120282 42 reativo | 78909 3 reativo 106890 3 reativo PNO206 1583 Amostra 0,9 s 11 não 1,0 não
Ensaio 3 - Mistura Ensaio 1 - Ensaio 2 - specifizados, sulfo- e is rutenilado Especificador sulfo- Especificador BP- (MAK<HAV>) + rutenilado rutenilado ie (MAK<HAV>) (MAK<HAV>) especificador BP- rutenilado (MAK<HAV>)) [aros [FE eo [FE] eri5 [co] FEE] em [eo | 1 em ado em ado em ado e anti- Sulfo-Ru PNO206 1984 Amostra interferent e anti- 0,9 s 1,0 não 1,0 não sutfo-Ru | 121810 | 54 | reativo | 71141 | 2 | reativo | 96741 | 2 | reativo PNO0206 11171 Amostra interferent e anti- 0,9 x 11 não 11 não Sulfo-Ru 122340 58 reativo | 82940 8 reativo 111595 8 reativo PNO206 2091 Amostra interferent e anti- 0,9 1 1,2 não 1,2 não Sulfo-Ru 122619 60 reativo | 87140 4 reativo 114490 1 reativo PNO0206 0198 Amostra interferent e anti- 0,9 ; 11 não 11 não Sulfo-Ru 122734 85 reativo | 82519 8 reativo 101632 3 reativo PNO0206- 1041 Amostra interferent e anti- 0,9 M 1,0 não 1,0 não Sulfo-Ru 123664 68 reativo | 75914 8 reativo 101700 7 reativo PNO206 1637 Amostra interferent e anti- 0,9 s 11 não 1,0 não Sulfo-Ru 124528 99 reativo | 79108 3 reativo 97853 9 reativo PNO0206- 0124 Amostra interferent e anti- 0,9 1 1,2 não 1,2 não Sulfo-Ru 125034 79 reativo | 89055 7 reativo 117489 4 reativo PNO206 1273 Amostra 0,9 s 1,2 não 11 não
Ensaio 3 - Mistura Ensaio 1 - Ensaio 2 - (especificados sulfo- Especificador sulfo- Especificador BP- (MAK<HAV>) + rutenilado rutenilado especificador BP- (MAK<HAV>) (MAK<HAV>) P' 3 rutenilado (MAK<HAV>)) Contag co! Result | Contag co! Result | Contag co! Result em ado em ado em ado e anti- Sulfo-Ru PNO206 0260 Amostra interferent e anti- 0,9 1 1,2 não 11 não Sulfo-Ru 125911 86 reativo | 85068 1 reativo 108449 | 4 reativo PNO0206 0529 Amostra interferent e anti- 0,9 x 1,2 não 1,2 não Sulfo-Ru 125949 86 reativo | 85310 2 reativo 113409 o reativo PNO0207- 0482 TABELA 3: RESULTADOS COM CALIBRADORES E AMOSTRAS PADRÕES (ENSAIO DAGS) Ensaio 3 - Mistura - 5 ; .: 5 - (antígeno sulfo- Ensslo A núantigena, | Ensaio 2 antzens BP | — rutenfado (30) + antígeno BP-rutenilado (p30)) Amos | contag UI/ contag UI/ contag UI/ tra em mL Resultado em mL Resultado em mL Resultado Cal 1 596 578 596 613 582 573 23073 13728 17219 Cal 2 6 o o 22893 13503 17012 6 o 2 PC1 1,1 | indetermin 1,1 | indetermin 1,1 | indetermin 1392 o ado 1060 2 ado 1171 o ado Pc2 10072 | 52, 51, 51, 9 7 reativo 57418 | O reativo 73030 | 5 reativo < < < 0,1 não 0,1 não 0,1 não NHS 3 589 3 reativo 594 3 reativo 585 3 reativo < < < 0,1 não 0,1 não 0,1 não NHS 4 587 3 reativo 552 3 reativo 553 3 reativo < < < 0,1 não 01 não 0,1 não NHS5 591 3 reativo 548 3 reativo 554 3 reativo
Ensaio 3 - Mistura ; : s (antígeno sulfo- suito-rutenitado (pão) | — rutemilado (pão) | | tenilado (p30) + antígeno BP-rutenilado (p30)) Amos | contag Ul/ contag Ul/ contag Ul/ tra em mL Resultado em mL Resultado em mL Resultado 2,2 | indetermin 2,2 | indetermin 2,3 | indetermin HS 12 2593 9 ado 1753 9 ado 2074 1 ado 2,3 | indetermin 1,5 | indetermin 1,8 | indetermin HS 10 | 2608 1 ado 1294 4 ado 1707 4 ado 2,3 | indetermin 2,3 | indetermin 2,4 | indetermin HS 9 2631 3 ado 1806 7 ado 2158 1 ado 2,4 | indetermin 2,5 | indetermin 2,5 | indetermin HS 13 | 2721 1 ado 1947 9 ado 2249 2 ado 2,4 | indetermin 2,2 | indetermin 2,3 | indetermin HS 6 2743 3 ado 1725 4 ado 2075 1 ado 2,4 | indetermin 2,5 | indetermin 2,5 | indetermin HS 11 2780 6 ado 1916 4 ado 2270 4 ado 2,4 | indetermin 2,5 | indetermin 2,6 | indetermin HS7 2807 9 ado 1915 4 ado 2318 o ado 2,5 | indetermin 2,6 | indetermin 2,5 | indetermin HS 15 | 2835 1 ado 1987 5 ado 2297 8 ado 2,7 | indetermin 2,6 | indetermin 2,7 | indetermin HS 8 3082 3 ado 1993 6 ado 2447 6 ado 31 31 31 HS 24 | 3591 7 reativo 2329 5 reativo 2788 5 reativo 41 4,3 4,2 HS 22 | 4766 4 reativo 3166 o reativo 3793 5 reativo 41 4,5 4,4 HS 17 | 4797 6 reativo 3386 9 reativo 3988 6 reativo 41 43 43 HS 23 | 4817 8 reativo 3224 8 reativo 3852 2 reativo 4,2 4,0 4,0 HS 16 | 4883 3 reativo 3011 9 reativo 3625 8 reativo 4,4 4,3 4,4 HS 14 | 5110 1 reativo 3190 3 reativo 3980 5 reativo 4,5 4,9 4,7 HS 19 | 5323 rá reativo 3638 2 reativo 4247 3 reativo 5,5 5,8 5,8 HS 25 | 6630 6 reativo 4392 6 reativo 5314 o reativo 21, 20, 21, HS5 | 34145 | 9 reativo 18575 | 3 reativo 24184 | O reativo TABELA 4: RESULTADOS COM AMOSTRAS DE CONFUSÃO (ENSAIO DAGS) Ensaio 3 - Mistura io 1. s io 9 anti, - (antígeno sulfo- Ensaio Lâmigeno, | Ensslo 2-amigensP: | — ntonfado (630) antígeno BP-rutenilado (p30))
UV la 5 eos a elas E e em mL o em mL o em L o Amostra| interfere 2,2 | indetermi 0,7 não 1, | indetermi te anti- | 2575 8 nado 870 50 reativo 1448 | 49 nado
Ensaio 3 - Mistura Ensaio 1 - Antígeno Ensaio 2 - antígeno BP- (antígeno sulfo- sulfo-rutenilado (p30) rutenilado (p30) rutenilado (p30) + antígeno BP-rutenilado p30
UV contag UI! Resultad|contag UI! Resultad|contag m Resultad em mL o em mL o em L o BP-Ru HS 10 Amostr a interfer ente anti- BP-Ru 4,0 2,3 | indetermi 3, HS 22 4610 1 reativo 1791 5 nado 2913 | 29 reativo Amostr a interfer ente anti- BP-Ru 4,0 2,5 | indetermi 3, HS 17 4715 9 reativo 1913 3 nado 3086 | 49 reativo Amostr a interfer ente anti- BP-Ru 4,1 2,3 | indetermi 3, HS 16 4734 1 reativo 1785 4 nado 2903 | 28 reativo Amostr a interfer ente anti- BP-Ru 4,1 2,4 | indetermi 3, HS 23 4818 8 reativo 1837 2 nado 2924 | 31 reativo Amostr a interfer ente anti- BP-Ru 4,3 2,3 | indetermi 3, HS 14 4988 1 reativo 1819 9 nado 3048 | 45 reativo Amostr a interfer ente anti- BP-Ru 4,3 2,6 | indetermi 3, HS 19 5016 3 reativo 1955 o nado 3232 | 65 reativo Amostr a interfer ente anti- 0,8 não 2,2 | indetermi 1, | indetermi Sulfo- 1149 15 reativo 1730 5 nado 1560 | 64 nado
Ensaio 3 - Mistura Ensaio 1 - Antígeno Ensaio 2 - antígeno BP- (antígeno sulfo- sulfo-rutenilado (p30) rutenilado (p30) rutenilado (p30) + antígeno BP-rutenilado p30
UV contag UI! Resultad|contag UI! Resultad|contag m Resultad em mL o em mL o em L o Ru HS 6T2 Amostr a interfer ente anti- Sulfo- Ru HS 0,8 não 2,6 | indetermi 1, | indetermi 772 1175 46 reativo 2013 9 nado 1758 91 nado Amostr a interfer ente anti- Sulfo- Ru HS 0,8 não 2,4 | indetermi 1, | indetermi 9T2 1195 7O reativo 1848 4 nado 1663 | 78 nado Amostr a interfer ente anti- Sulfo- Ru HS 0,8 não 2,4 | indetermi 1, | indetermi 12T2 1202 78 reativo 1842 3 nado 1643 | 76 nado Amostr a interfer ente anti- Sulfo- Ru HS 0,8 não 1,6 | indetermi 1, | indetermi 10T2 1211 89 reativo 1356 5 nado 1392 | 41 nado Amostr a interfer ente anti- Sulfo- Ru HS 0,9 não 2,6 | indetermi 1, | indetermi 1172 1231 12 reativo 1962 1 nado 1757 | 90 nado Amostr a interfer ente anti- Sulfo- Ru HS 0,9 não 2,5 | indetermi 1, | indetermi 13T2 1265 51 reativo 1940 8 nado 1753 | 90 nado
Ensaio 3 - Mistura Ensaio 1 - Antígeno Ensaio 2 - antígeno BP- (antígeno sulfo- sulfo-rutenilado (p30) rutenilado (p30) rutenilado (p30) + antígeno BP-rutenilado p30
UV contag UI! Resultad|contag UI! Resultad|contag m Resultad em mL o em mL o em L o Amostr a interfer ente anti- Sulfo- Ru HS 1,5 | indetermi 4,9 3, 19T2 1858 9 nado 3633 1 reativo 3077 | 48 reativo Amostr a interfer ente anti- Sulfo- Ru HS 1,6 | indetermi 4,2 3, 16T2 1941 7 nado 3100 1 reativo 2736 | 09 reativo Amostr a interfer ente anti- Sulfo- Ru HS 1,7 | indetermi 4,6 3, 17T2 1993 2 nado 3465 9 reativo 2978 |37 reativo Amostr a interfer ente anti- Sulfo- Ru HS 1,7 | indetermi 4,4 3, 2272 2001 3 nado 3298 8 reativo 2897 |28| reativo Amostr a interfer ente anti- Sulfo- Ru HS 1,7 | indetermi 4,3 3, 14T2 2029 6 nado 3192 4 reativo 2901 28 reativo Amostr a interfer ente anti- Sulfo- Ru HS 1,7 | indetermi 4,4 3, 2372 2038 7 nado 3246 1 reativo 2885 | 26 reativo Amostr 2,3 | indetermi 5,9 4, a 2626 2 nado 4419 o reativo 3896 | 36 reativo
Ensaio 3 - Mistura io 4 Anti, io 2 anti, - (antígeno sulfo- surfo-rutenftado (pão) | | rutenitado (pão) | | Tutenilado(p30) + antígeno BP-rutenilado p30
UV contag UI! Resultad|contag UI! Resultad|contag m Resultad em mL o em mL o em L o interfer ente anti- Sulfo- Ru HS 25T2

Claims (18)

REIVINDICAÇÕES
1. MÉTODO PARA DETERMINAR UM ANALITO em uma amostra, caracterizado por compreender a) colocar em contato a referida amostra com pelo menos um primeiro e um segundo composto detector; b) determinar a quantidade de complexos compreendendo pelo menos um composto detector; e, c) determinar o referido analito em uma amostra com base no resultado da etapa b), em que o referido primeiro composto detector compreende uma primeira porção de ligação e um primeiro marcador, e o referido segundo composto detector compreende uma segunda porção de ligação e um segundo marcador, e em que o primeiro marcador e o segundo marcador são não idênticos.
2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo primeiro e o segundo marcadores fornecerem a mesma propriedade detectável.
3. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pela propriedade detectável fornecida pelo primeiro e/ ou pelo segundo composto detector ser uma propriedade de radiação, em uma forma de realização uma propriedade de luminescência, em uma outra forma de realização uma propriedade de quimioluminescência.
4. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo marcador no primeiro composto detector compreender Ru(bpy)2-bpbyCO-OSu (No. de registro CAS 137323-76-3) e/ ou em que a marcador em o segundo composto detector compreende Sulfo-BPRu NHS Éster (No. de registro CAS 482618-42-8).
5. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações
1 a 4, caracterizado pela determinação da quantidade de complexos na etapa b) compreender a detecção da propriedade detectável do primeiro composto detector e do segundo composto detector, em uma forma de realização compreende a detecção simultânea da propriedade detectável do primeiro composto detector e do segundo composto detector.
6. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a5, caracterizado pelo referido método ser um imunoensaio.
7. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a6, caracterizado pela referida amostra ser uma amostra de um fluido corporal, em uma forma de realização de uma amostra de sangue, soro ou plasma.
8. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo referido analito ser um polipeptídeo.
9. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo referido analito ser um anticorpo, em uma forma de realização é um anticorpo anti-hepatite A ou um anticorpo anti-Toxoplasma.
10. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo referido analito ser um antígeno de um organismo patogênico, em uma forma de realização é um antígeno viral ou um antígeno bacteriano.
11. KIT paradetectar um analito em uma amostra, caracterizado por compreender pelo menos um primeiro e um segundo composto detector para o referido analito, em que o referido primeiro composto detector compreende uma primeira porção de ligação e um primeiro marcador, e o referido segundo composto detector compreende uma segunda porção de ligação e um segundo marcador, e em que o primeiro marcador e o segundo marcador são não idênticos.
12. KIT, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo referido kit compreender ainda pelo menos um composto de captura para o referido analito e/ ou um suporte sólido para imobilizar os referidos compostos ou constituintes de captura da referida amostra compreendendo pelo menos o referido analito.
13. — DISPOSITIVO PARA DETERMINAR UM ANALITO em uma amostra, caracterizado por compreender pelo menos um primeiro e um segundo composto detector para o referido analito, em que o referido primeiro composto detector compreende uma primeira porção de ligação e um primeiro marcador, e o referido segundo composto detector compreende uma segunda porção de ligação e um segundo marcador, e em que o primeiro marcador e o segundo marcador são não idênticos; e meios para determinar pelo menos um sinal obtido a partir do referido primeiro marcador e do referido segundo marcador.
14. USO DE UMA COMPOSIÇÃO, caracterizado por compreender pelo menos um primeiro e um segundo composto detector para detectar um analito, em que o referido primeiro composto detector compreende uma primeira porção de ligação e um primeiro marcador, e o referido segundo composto detector compreende uma segunda porção de ligação e um segundo marcador e em que o primeiro marcador e o segundo marcadores são não idênticos.
15. — MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 12, dispositivo, de acordo com a reivindicação 13 e/ ou uso, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelas porções de ligação do primeiro e do segundo compostos detectores serem idênticas.
16. MÉTODO PARA MELHORAR A ESPECIFICIDADE DA DETECÇÃO DE UM ANALITO em um ensaio, caracterizado por compreender a substituição de 10% a 90% de um primeiro composto detector por um segundo composto detector com um marcador não idêntico.
17. MÉTODO PARA IDENTIFICAR UMA AMOSTRA,
caracterizado por compreender uma determinação de confusão interferente de um analito com um composto detector tendo um primeiro marcador compreendendo a) colocar em contato uma alíquota da referida amostra com um primeiro composto detector tendo o referido primeiro marcador; b) colocar em contato uma alíquota da referida amostra com um segundo composto detector possuindo um segundo marcador; c) determinar um primeiro sinal gerado pelo primeiro marcador; d) determinar um segundo sinal gerado pelo segundo marcador; e) identificar uma amostra compreendendo uma determinação de confusão interferente de um analito com um composto detector possuindo um primeiro marcador comparando o primeiro sinal da etapa c) com o segundo sinal da etapa d).
18. — USO DE PELO MENOS UM PRIMEIRO E UM SEGUNDO COMPOSTO DETECTOR DE UM ANALITO, caracterizado por ser para a fabricação de uma composição de diagnóstico ou um dispositivo de diagnóstico, em que o referido primeiro composto detector compreende uma primeira porção de ligação e um primeiro marcador, e o referido segundo composto detector compreende um segunda porção de ligação e um segundo marcador, e em que o primeiro marcador e o segundo marcador são não idênticos.
Resumo “MÉTODOS PARA DETERMINAR UM ANALITO, PARA MELHORAR A
ESPECIFICIDADE DA DETECÇÃO DE UM ANALITO E PARA IDENTIFICAR UMA AMOSTRA, KIT, DISPOSITIVO PARA DETERMINAR UM ANALITO,
USOS DE UMA COMPOSIÇÃO E DE PELO MENOS UM PRIMEIRO E UM SEGUNDO COMPOSTO DETECTOR DE UM ANALITO” A presente invenção refere-se a um método para determinar um analito em uma amostra, compreendendo a) colocar em contato a referida amostra com pelo menos um primeiro e um segundo composto detector; b) determinar a quantidade de complexos compreendendo pelo menos um composto detector; e, c) determinar o referido analito em uma amostra com base no resultado da etapa b). A presente invenção refere-se ainda a um kit para detectar um analito em uma amostra; e a um dispositivo para determinar um analito em uma amostra; e meios para determinar pelo menos um sinal obtido a partir do referido primeiro marcador e do referido segundo marcador; e ao uso de uma composição compreendendo pelo menos um primeiro e um segundo composto detector para detectar um analito.
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