ES2931536T3

ES2931536T3 - Ensayo de flujo lateral para detectar la presencia de una célula de mamífero o bacterias específicas en una muestra biológica

Info

Publication number: ES2931536T3
Application number: ES18765412T
Authority: ES
Inventors: Hincapie Frank J Hernandez; Luiza Iuliana Hernandez; Trujillo Tania Jimenez
Original assignee: Somaprobes Sl
Current assignee: Somaprobes Sl
Priority date: 2017-08-31
Filing date: 2018-08-31
Publication date: 2022-12-30
Anticipated expiration: 2038-08-31
Also published as: EP3676615B1; EP3676615A1; WO2019043187A1; EP3907508A1

Abstract

La presente invención proporciona un enfoque molecular rápido y sensible para infecciones bacterianas así como para tumores para diagnóstico clínico. Para ese propósito, la presente invención proporciona un uso in vitro en un ensayo de flujo lateral de una secuencia de polinucleótidos susceptible de ser escindida por una nucleasa específica derivada de una bacteria o una célula de mamífero, en la que la secuencia de polinucleótidos (también denominada "sustrato") se caracteriza por comprender una etiqueta de captura y una molécula informadora en cada extremo de la secuencia, para detectar la presencia de una célula de mamífero específica o bacterias en una muestra biológica. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Ensayo de flujo lateral para detectar la presencia de una célula de mamífero o bacterias específicas en una muestra biológica

Campo técnico de la invención

La presente invención se refiere al campo médico, en particular al uso de ensayos de flujo lateral para detectar la presencia de una célula de mamífero o bacterias específicas en una muestra biológica.

Antecedentes de la invención

Los patógenos emergentes y las enfermedades relacionadas con el envejecimiento de la población mundial, tales como el cáncer, representan una necesidad urgente para el desarrollo de nuevos métodos y dispositivos que reduzcan los tiempos de detección y sean capaces de ser altamente sensibles y específicos para la afección de humanos en peligro. Las características deseables para el desarrollo de dispositivos de diagnóstico deben incluir: simplicidad de diseño, rentabilidad, portabilidad y facilidad de uso, sin necesidad de instrumentación de laboratorio compleja.

Se ha demostrado que los ácidos nucleicos son moléculas de reconocimiento útiles para el desarrollo de diversas estrategias de diagnóstico, aprovechando su flexibilidad para adaptarse a diversos mecanismos de transducción, tales como fluorescencia, electroquímica, piezoeléctrica y colorimétrica. Aunque las técnicas moleculares basadas en la amplificación de ácidos nucleicos (por ejemplo, PCR) se han notificado como una posible alternativa para superar los desafíos actuales en el campo del diagnóstico, la complejidad de uso y el alto coste han limitado el uso generalizado de tales técnicas.

A diferencia de los ensayos basados en ácidos nucleicos, los inmunoensayos han encontrado una mayor aceptación debido a su asequibilidad, facilidad de uso y versatilidad de formatos de detección, lo que los convierte en una excelente opción para aplicaciones en el lugar donde se presta la asistencia sanitaria. Entre todos los sistemas descritos que usan anticuerpos como moléculas de reconocimiento, destaca el alto impacto de la inmunocromatografía de flujo lateral (LFIC), que se usa actualmente en aquellas aplicaciones donde se requiere una detección rápida y precisa.

Recientemente, se han descrito enfoques interesantes basados en sustratos de ácido nucleico para seleccionar como diana nucleasas específicas que podrían usarse como modelo de infecciones bacterianas o tipos específicos de cáncer. En el presente documento, se describe por primera vez la utilidad de sustratos de nucleasa específicos (sondas de ácido nucleico) que se incorporaron en un ensayo de flujo lateral, para la detección rápida, sensible y específica de la actividad nucleasa derivada de bacterias o células tumorales/cancerosas, con un gran potencial para usarse en los campos clínico, medioambiental y de seguridad alimentaria. El documento WO 2015/120406 A1 divulga constructos detectables similares, como la presente divulgación, que podrían usarse en el método tanto para identificar bacterias como para determinar su resistencia a antibióticos. El documento WO 2013/033436 A1 divulga el uso in vitro de un dispositivo de flujo lateral que comprende una secuencia de polinucleótido susceptible de escindirse por una nucleasa específica derivada de una bacteria o una célula de mamífero, en el que la secuencia de polinucleótido se caracteriza por comprender un marcador de captura y una molécula indicadora en cada extremo de la secuencia, para detectar la presencia de una célula de mamífero o bacterias específicas en una muestra biológica.

El documento WO 2014/076706 A1 describe métodos y composiciones dirigidos a la mejora de los métodos de PCR existentes, por ejemplo, con respecto a su capacidad para confirmar un caso sospechoso de septicemia e identificar una variedad de genes resistentes a antibióticos y patógenos habituales presentes en la sangre, incluso cuando están presentes en un número de copias muy bajo.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona un enfoque molecular rápido y sensible para el diagnóstico de infecciones bacterianas y tumores/cáncer.

Para ese propósito, un aspecto inicial de la presente invención proporciona un método para detectar bacterias y su resistencia al tratamiento con antibióticos betalactámicos en una muestra de prueba, que comprende: 1) incubar en la muestra de prueba, i) un sustrato sintético o una mezcla de sustratos para detectar la presencia de una bacteria, y 2) simultánea o posteriormente, establecer la resistencia de la bacteria al tratamiento con antibióticos betalactámicos incubando en la muestra de prueba una molécula sensible a p-lactamasa, durante un tiempo suficiente para la escisión de la molécula sensible a p-lactamasa por una p-lactamasa; en el que

a. el/los sustrato(s) comprende(n) una molécula de ácido nucleico monocatenario que contiene al menos un ribonucleótido o desoxirribonucleótido o residuo de nucleótido químicamente modificado en una posición interna que funciona como sitio de escisión de nucleasa, un marcador de captura en un extremo y i) una molécula indicadora o ii) un marcador de captura adicional capaz de unirse a la molécula indicadora situada en el lecho de conjugado de un soporte de un dispositivo de flujo lateral, en el otro extremo; y en el que

b. la molécula sensible a p-lactamasa comprende un compuesto que comprende un anillo betalactámico, preferiblemente un antibiótico betalactámico seleccionado de la lista que consiste en derivados de penicilina (penámicos), cefalosporinas (cefémicos), monobactámicos, y carbapenémicos, más preferiblemente meticilina, un marcador de captura en un extremo y i) una molécula indicadora o ii) un marcador de captura adicional capaz de unirse a la molécula indicadora situada en el lecho de conjugado de un soporte de un dispositivo de flujo lateral, en el otro extremo.

En una realización preferida, el resultado del método anterior se detecta preferiblemente de manera visual, en particular si el/los sustrato(s) y la molécula sensible a p-lactamasa se han escindido o no por una muestra de prueba, usando un dispositivo de flujo lateral o uniendo los complejos formados por el/los sustrato(s) y la molécula sensible a p-lactamasa después de la incubación a un soporte sólido que facilita técnicas de inmunoensayo tales como un ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA), un radioinmunoensayo (RIA), un ensayo inmunorradiométrico (IRMA), un inmunoensayo fluorescente (FIA), un inmunoensayo quimioluminiscente (CLIA), un inmunoensayo basado en perlas magnéticas (MBI) o un inmunoensayo electroquimioluminiscente (ECL).

En una realización preferida, el resultado se detecta preferiblemente de manera visual, en particular si el/los sustrato(s) y la molécula sensible a p-lactamasa se han escindido o no por una muestra de prueba, usando un dispositivo de flujo lateral.

En una realización preferida, dicha molécula sensible a p-lactamasa comprende (6R,7R)-3-(((4-benzamidofenil)tio)metil)-8-oxo-7-(-fenilacetamido)-5-tia-1-azabiciclo[4.2.0]oct-2-eno-2-carboxilato de 4-metoxibencilo, que es una molécula sensible a p-lactamasa truncada (sonda de CE), o ácido (6S,7S)-7-(((3’,6’-dihidroxi-3-oxo-3H-espiro[isobenzofuran-1,9’-xanten]-6-ilcarbonil)oxi)amino)-8-oxo-3-(((4-(5-((3aR,4R,6aS)-2-oxohexahidro-1H-tieno[3,4-d]imidazol-4-il)pentanamido)fenil)tio)metil)-5-tia-1-azabiciclo[4.2.0]oct-2-eno-2-carboxílico (FAM-sonda de CE-biotina), o ácido (6S,7S)-7-(5-(((3S,5R,8R,9S,10S,12R,13S,14S,17R)-12,14-dihidroxi-10,13-dimetiM7-(5-oxo-2,5-dihidrofuran-3-il)hexadecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-il)oxi)-5-oxopentanamido)-8-oxo-3-(((4-(5-((3aR,4R,6aS)-2-oxohexahidro-1H-tieno[3,4-d]imidazol-4-il)pentanamido)fenil)tio)metil)-5-tia-1-azabiciclo[4.2.0]oct-2-eno-2-carboxílico (digoxigenina-sonda de CE-biotina).

En una realización preferida, el marcador de captura del/de los sustrato(s) y/o la molécula sensible a p-lactamasa se selecciona de la lista que consiste en biotina, FITC, FAM, digoxigenina, DNP (dinitrofenilo), rojo Texas, TAMRA o cualquier otro antígeno pequeño.

En una realización preferida, la molécula indicadora del/de los sustrato(s) y/o la molécula sensible a p-lactamasa se selecciona de la lista que consiste en nanopartículas de látex y oro, partículas de carbono o cualquier otra molécula indicadora colorimétrica.

Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a un sistema que comprende:

a. un sustrato sintético o una mezcla de sustratos para detectar la presencia de una bacteria y la molécula sensible a p-lactamasa para establecer la resistencia de la bacteria a antibióticos betalactámicos y moléculas sensibles a piactamasa; en el que a1. el/los sustrato(s) comprende(n) una molécula de ácido nucleico monocatenario que contiene al menos un ribonucleótido o desoxirribonucleótido o residuo de nucleótido químicamente modificado en una posición interna que funciona como sitio de escisión de nucleasa, un marcador de captura en un extremo y i) una molécula indicadora o ii) un marcador de captura adicional capaz de unirse a la molécula indicadora situada en el lecho de conjugado de un soporte de un dispositivo de flujo lateral, en el otro extremo; y en el que a2. la molécula sensible a plactamasa comprende un compuesto que comprende un anillo betalactámico, preferiblemente un antibiótico betalactámico seleccionado de la lista que consiste en derivados de penicilina (penámicos), cefalosporinas (cefémicos), monobactámicos y carbapenémicos, más preferiblemente meticilina, un marcador de captura en un extremo y i) una molécula indicadora o ii) un marcador de captura adicional capaz de unirse a la molécula indicadora situada en el lecho de conjugado de un soporte de un dispositivo de flujo lateral, en el otro extremo;

b. un soporte adecuado para flujo lateral que comprende:

b1. una placa de soporte; y

b2. un lecho de muestra, una membrana y un lecho de absorción capilar, todos ellos encima del lecho de soporte, en el que la membrana está situada después del lecho de muestra de manera que la muestra fluye desde el lecho de muestra hasta la membrana, en el que la membrana comprende al menos dos líneas de prueba que a su vez comprenden respectivamente moléculas inmovilizadas en cada línea de prueba para capturar el marcador de captura de la(s) secuencia(s) de polinucleótido y para capturar el marcador de captura de las moléculas sensibles a plactamasa, y en el que el lecho de absorción capilar está situado en el extremo de la membrana.

En una realización preferida, la membrana comprende además una línea de control.

a. un sustrato sintético o una mezcla de sustratos para detectar la presencia de una bacteria y la molécula sensible a P-lactamasa para establecer la resistencia de la bacteria a antibióticos betalactámicos y moléculas sensibles a piactamasa, en el que a1. el/los sustrato(s) comprende(n) una molécula de ácido nucleico monocatenario que contiene al menos un ribonucleótido o desoxirribonucleótido o residuo de nucleótido químicamente modificado en una posición interna que funciona como sitio de escisión de nucleasa, un marcador de captura en un extremo y i) una molécula indicadora o ii) un marcador de captura adicional capaz de unirse a la molécula indicadora situada en el lecho de conjugado de un soporte de un dispositivo de flujo lateral, en el otro extremo; y en el que a2. la molécula sensible a plactamasa comprende un compuesto que comprende un anillo betalactámico, preferiblemente un antibiótico betalactámico seleccionado de la lista que consiste en derivados de penicilina (penámicos), cefalosporinas (cefémicos), monobactámicos y carbapenémicos, más preferiblemente meticilina, un marcador de captura en un extremo y i) una molécula indicadora o ii) un marcador de captura adicional capaz de unirse a la molécula indicadora situada en el lecho de conjugado de un soporte de un dispositivo de flujo lateral, en el otro extremo, en el que el/los sustrato(s) y las moléculas sensibles a p-lactamasa comprenden dos moléculas de captura en cada extremo de las moléculas, y en el que una de las moléculas de captura es capaz de unirse a la molécula indicadora situada en el lecho de conjugado del soporte; y

b. un soporte adecuado para flujo lateral que comprende:

b1. una placa de soporte; y

b2. un lecho de muestra, una membrana y un lecho de absorción capilar, todos ellos encima del lecho de soporte, en el que la membrana está situada después del lecho de muestra de manera que la muestra fluye desde el lecho de muestra hasta la membrana, en el que la membrana comprende al menos dos líneas de prueba que a su vez comprenden respectivamente moléculas inmovilizadas en cada línea de prueba para capturar el marcador de captura de la(s) secuencia(s) de polinucleótido y para capturar el marcador de captura de las moléculas sensibles a plactamasa, en el que el lecho de absorción capilar está situado en el extremo de la membrana,

y en el que el sistema comprende además un lecho de conjugado entre el lecho de muestra y la membrana, que a su vez comprende una molécula indicadora.

En una realización preferida, cualquiera de los sistemas anteriores comprende un soporte para incubar una muestra biológica y el sustrato sintético o la mezcla de sustratos y las moléculas sensibles a p-lactamasa.

En una realización preferida, en cualquiera de los sistemas anteriores, la molécula sensible a p-lactamasa es tal como se define en el aspecto inicial de la invención.

Un aspecto adicional de la invención se refiere al uso de cualquiera de los sistemas anteriores para detectar simultáneamente bacterias y su resistencia a antibióticos betalactámicos tales como meticilina en una muestra de prueba.

En una realización preferida, en el método del aspecto inicial, el método comprende además el uso de un sustrato sintético o una mezcla de sustratos para detectar la presencia de células cancerosas de mamífero en la muestra de prueba y/o la resistencia a un tratamiento contra el cáncer.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Esquema 1 de la cromatografía de sonda de flujo lateral (LFPC), en el que la sonda de polinucleótido se funcionaliza sobre la superficie de la molécula indicadora mediante acoplamiento químico.

Figura 2. Esquema 2 de la cromatografía de sonda de flujo lateral (LFPC), en el que la sonda de polinucleótido se modifica en ambos extremos con marcadores de captura. En este sistema el indicador se funcionaliza con una molécula de reconocimiento que se une al polinucleótido.

Figura 3. Experimento demostrativo preliminar que demuestra la viabilidad del sistema de LFPC descrito en el esquema 1.

1. Sobrenadante de S. aureus + TT Probe #1

2. Sobrenadante de S. aureus + TT Probe #2

3. S. epidermidis TT Probe #1

4. S. epidermidis TT Probe #2

Figura 4. Experimento demostrativo preliminar que demuestra la viabilidad del sistema de LFPC descrito en el esquema 2.

1. Sobrenadante de S. aureus + TT Probe

2. S. epidermidis+ TT Probe

3. TSB (medio) TT Probe

4. Agua TT Probe

5. Sobrenadante de S. aureus + sonda de control (no degradable)

6. S. epidermidis + sonda de control (no degradable)

Figura 5. Se llevaron a cabo estudios de sensibilidad de la LFPC mediante diluciones en serie de 10X de cultivos de S. aureus de 24 h. Se cuantificó la señal notificada para cada tira mediante un lector de bandas y se tomó una imagen. Los datos se adquirieron por duplicado.

1. Sobrenadantes de S. aureus no diluidos (Und) TTProbe #1

2. Sobrenadantes de S. aureus no diluidos (Und) TTProbe #2

3. Sobrenadantes de S. aureus con una dilución 10-1 (-1) TTProbe #1

4. Sobrenadantes de S. aureus con una dilución 10-1 (-1) TTProbe #2

5. Sobrenadantes de S. aureus con una dilución 10-2 (-2) TTProbe #1

6. Sobrenadantes de S. aureus con una dilución 10-2 (-2) TTProbe #2

7. Sobrenadantes de S. aureus con una dilución 10-3 (-3) TTProbe #1

8. Sobrenadantes de S. aureus con una dilución 10-3 (-3) TTProbe #2

9. Sobrenadantes de S. aureus con una dilución 10'4 (-4) TTProbe #1

10. Sobrenadantes de S. aureus con una dilución 10'4 (-4) TTProbe #2

11. Sobrenadantes de S. aureus con una dilución 10'5 (-5) TTProbe #1

12. Sobrenadantes de S. aureus con una dilución 10'5 (-5) TTProbe #2

13. Sobrenadantes de S. aureus con una dilución 10'6 (-6) TTProbe #1

14. Sobrenadantes de S. aureus con una dilución 10'6 (-6) TTProbe #2

Figura 6. Se llevaron a cabo estudios de especificidad de la LFPC sometiendo a prueba 12 sobrenadantes de bacterias inespecíficos, junto con 2 medios de cultivo como controles. Se cuantificó la señal notificada para cada tira mediante un lector de bandas y se tomó una imagen. Se enumeraron los cultivos de bacterias evaluados y se notificaron en la tabla con el valor obtenido para cada tira. Se adquirieron mediciones del lector de bandas e imágenes.

Figura 7. Se llevaron a cabo experimentos de tiempo en condiciones óptimas para el sistema de LFPC descrito en esta invención. Se seleccionaron puntos de tiempo de 10 y 20 minutos. Para cada punto de tiempo se evaluaron varias diluciones de sobrenadantes de S. aureus, tal como se indica en la tabla y en las imágenes.

Figura 8. Esquema de doble sistema de detección en flujo lateral. La primera opción muestra la detección basada en dos polinucleótidos: i) una sonda de polinucleótido para detectar bacterias y ii) una sonda de polinucleótido para detectar MRSA. La segunda opción usa iii) un polinucleótido para detectar bacterias y iv) una molécula sensible a plactamasa para detectar la presencia de p-lactamasas.

Figura 9. A) Nueva molécula sensible para detectar resistencia a antibióticos y B) ruta de síntesis.

Figura 10. Sondas de mejor rendimiento para Streptococcus pneumoniae. Las barras (panel superior) indican la actividad nucleasa notificada para cada sonda para los sobrenadantes y la superficie celular. Las barras de error son la desviación estándar de tres mediciones independientes. Se seleccionaron las diez mejores sondas para cada caso, sobrenadante y superficie celular (paneles de la izquierda) y también se muestra la diferencia en veces (muestra/controles de PBS) (paneles de la derecha).

Figura 11. Sondas de mejor rendimiento para Klebsiella pneumoniae. Las barras (panel superior) indican la actividad nucleasa notificada para cada sonda para los sobrenadantes y la superficie celular. Las barras de error son la desviación estándar de tres mediciones independientes. Se seleccionaron las diez mejores sondas para cada caso, sobrenadante y superficie celular (paneles de la izquierda) y también se muestra la diferencia en veces (muestra/controles de PBS) (paneles de la derecha).

Figura 12. Sondas de mejor rendimiento para Pseudomona aeruginosa. Las barras (panel superior) indican la actividad nucleasa notificada para cada sonda para los sobrenadantes y la superficie celular. Las barras de error son la desviación estándar de tres mediciones independientes. Se seleccionaron las diez mejores sondas para cada caso, sobrenadante y superficie celular (paneles de la izquierda) y también se muestra la diferencia en veces (muestra/controles de PBS) (paneles de la derecha).

Figura 13. Sondas de mejor rendimiento para Proteus spp. Las barras (panel superior) indican la actividad nucleasa notificada para cada sonda para los sobrenadantes y la superficie celular. Las barras de error son la desviación estándar de tres mediciones independientes. Se seleccionaron las diez mejores sondas para cada caso, sobrenadante y superficie celular (paneles de la izquierda) y también se muestra la diferencia en veces (muestra/controles de PBS) (paneles de la derecha).

Figura 14. Sondas de mejor rendimiento para Staphylococcus epidermidis. Las barras (panel superior) indican la actividad nucleasa notificada para cada sonda para los sobrenadantes y la superficie celular. Las barras de error son la desviación estándar de tres mediciones independientes. Se seleccionaron las diez mejores sondas para cada caso, sobrenadante y superficie celular (paneles de la izquierda) y también se muestra la diferencia en veces (muestra/controles de PBS) (paneles de la derecha).

Figura 15. Sondas de mejor rendimiento para Staphylococcus aureus. Las barras (panel superior) indican la actividad nucleasa notificada para cada sonda para los sobrenadantes y la superficie celular. Las barras de error son la desviación estándar de tres mediciones independientes. Se seleccionaron las diez mejores sondas para cada caso, sobrenadante y superficie celular (paneles de la izquierda) y también se muestra la diferencia en veces (muestra/controles de PBS) (paneles de la derecha).

Figura 16. Sondas de mejor rendimiento para Serratia spp. Las barras indican la actividad nucleasa notificada para cada sonda para los sobrenadantes. Las barras de error son la desviación estándar de tres mediciones independientes.

Figura 17. Sondas de mejor rendimiento para Streptococcus pyogenes. Las barras indican la actividad nucleasa notificada para cada sonda para los sobrenadantes. Las barras de error son la desviación estándar de tres mediciones independientes.

Figura 18. Sondas de mejor rendimiento para Citrobacter spp. Las barras indican la actividad nucleasa notificada para cada sonda para los sobrenadantes. Las barras de error son la desviación estándar de tres mediciones independientes.

Figura 19. Sondas de mejor rendimiento para Enterobacter spp. Las barras indican la actividad nucleasa notificada para cada sonda para los sobrenadantes. Las barras de error son la desviación estándar de tres mediciones independientes.

Figura 20. Sondas de mejor rendimiento para Providencia spp. Las barras indican la actividad nucleasa notificada para cada sonda para los sobrenadantes. Las barras de error son la desviación estándar de tres mediciones independientes.

Figura 21. Sondas de mejor rendimiento para Escherichia coli. Las barras (panel superior) indican la actividad nucleasa notificada para cada sonda para los sobrenadantes y la superficie celular. Las barras de error son la desviación estándar de tres mediciones independientes. Se seleccionaron las diez mejores sondas para cada caso, sobrenadante y superficie celular (paneles de la izquierda) y también se muestra la diferencia en veces (muestra/controles de PBS) (paneles de la derecha).

Figura 22. Sondas de mejor rendimiento para Enterococcus faecalis. Las barras indican la actividad nucleasa notificada para cada sonda para los sobrenadantes. Las barras de error son la desviación estándar de tres mediciones independientes.

Figura 23. Sondas de mejor rendimiento para Bacillus licheniformis. Las barras indican la actividad nucleasa notificada para cada sonda para los sobrenadantes. Las barras de error son la desviación estándar de tres mediciones independientes.

Figura 24. Sondas de mejor rendimiento para Bacillus amyloliquefaciens. Las barras indican la actividad nucleasa notificada para cada sonda para los sobrenadantes. Las barras de error son la desviación estándar de tres mediciones independientes.

Figura 25. Sondas de segunda generación para Streptococcus pneumoniae. Las barras indican la actividad nucleasa notificada para cada sonda para PBS, el sobrenadante y la superficie celular. Las barras de error son la desviación estándar de tres mediciones independientes.

Figura 26. Sondas de segunda generación para Klebsiella pneumoniae. Las barras indican la actividad nucleasa notificada para cada sonda para PBS, el sobrenadante y la superficie celular. Las barras de error son la desviación estándar de tres mediciones independientes.

Figura 27. Sondas de segunda generación para Proteus mirabilis. Las barras indican la actividad nucleasa notificada para cada sonda para PBS, el sobrenadante y la superficie celular. Las barras de error son la desviación estándar de tres mediciones independientes.

Figura 28. Sondas de segunda generación para Pseudomonas aeruginosa. Las barras indican la actividad nucleasa notificada para cada sonda para PBS, los sobrenadantes y la superficie celular. Las barras de error son la desviación estándar de tres mediciones independientes.

Figura 29. Sondas de segunda generación para Staphylococcus epidermidis. Las barras indican la actividad nucleasa notificada para cada sonda para PBS, los sobrenadantes y la superficie celular. Las barras de error son la desviación estándar de tres mediciones independientes.

Figura 30. Sondas de segunda generación para Staphylococcus aureus. Las barras indican la actividad nucleasa microcócica notificada para cada sonda para PBS y los sobrenadantes. Las barras de error son la desviación estándar de tres mediciones independientes.

Figura 31. Sondas de mejor rendimiento para detectar cepas de MRSA. Las barras indican la actividad nucleasa notificada para cada sonda para los sobrenadantes. Las barras de error son la desviación estándar de tres mediciones independientes.

Figura 32. Representación esquemática de los productos de reacción de la molécula sensible a p-lactamasa y actividad P-lactamasa.

Figura 33. Análisis de 1H-RMN. Espectros de RMN.

Figura 34. Análisis de CL-EM de la reacción de hidrólisis de la p-lactamasa, que muestra el material de partida y el producto hidrolizado.

Figura 35. Incorporación de la molécula sensible a p-lactamasa en un ensayo de flujo lateral.

Descripción detallada de la invención

Definiciones

En el contexto de la presente invención, se entiende por “polinucleótido” un sustrato de oligonucleótido (monocatenario o bicatenario) con la capacidad de reconocer una actividad nucleasa específica derivada de bacterias o células de mamíferos. La composición de polinucleótidos consiste en ácidos nucleicos naturales (ADN y/o ARN), ácidos nucleicos modificados químicamente o una combinación de ambos.

En el contexto de la presente invención, se entiende por “marcador de captura” la modificación en el extremo del “polinucleótido” que permite la unión con la molécula de captura y/o la molécula indicadora. Esta unión se lleva a cabo mediante la interacción antígeno-anticuerpo o un procedimiento de biorreconocimiento similar.

En el contexto de la presente invención, se entiende por “molécula de captura” una molécula de reconocimiento (por ejemplo, anticuerpo anti-biotina) inmovilizada en la línea de detección del ensayo de flujo lateral, con capacidad para unirse a uno de los extremos de la sonda de polinucleótido que se modificó previamente con un marcador de captura (por ejemplo, biotina).

En el contexto de la presente invención, se entiende por “molécula indicadora” a) la molécula que proporciona la lectura del sistema y consiste en una nanopartícula de látex/oro, una partícula de carbono o una molécula colorimétrica similar, funcionalizada con una molécula de captura (por ejemplo, un anticuerpo) que reconoce la sonda de polinucleótido a través de un marcador de captura. b) La molécula indicadora consiste en una nanopartícula de látex/oro que se funcionaliza con la sonda de polinucleótido, en uno de sus extremos mediante química de acoplamiento (por ejemplo, amina), mientras que el otro extremo se modifica con un marcador de captura (por ejemplo, biotina).

En el contexto de la presente invención, se entiende por “ensayo de flujo lateral” una metodología simple para detectar, de manera específica, la presencia o ausencia de un analito objetivo en una muestra de matriz dada. Este tipo de ensayo elimina la necesidad de equipos especializados y costosos usados en los laboratorios convencionales. La tecnología de flujo lateral se usa como herramienta de punto de atención (rápida e in situ), en una amplia gama de aplicaciones, desde la prueba de embarazo casera ampliamente usada hasta pruebas más especializadas para aplicaciones clínicas, de seguridad alimentaria, medioambientales e industriales.

En el contexto de la presente invención, se entiende por “una placa de soporte” el material en el que se montan y conectan entre sí todas las membranas (lechos de muestra, conjugado, membrana y absorción capilar). Al mismo tiempo, la placa de soporte proporciona mejor estabilidad y manipulación al dispositivo de flujo lateral.

En el contexto de la presente invención, se entiende por “un lecho de muestra” el elemento del dispositivo en el que se introduce o deposita la muestra y actúa como una esponja que retiene el fluido de muestra. Posteriormente, el fluido de muestra se transporta a la membrana por acción capilar.

En el contexto de la presente invención, se entiende por “el lecho de conjugado” la parte del dispositivo en la que se dispensan las moléculas indicadoras. Las moléculas indicadoras se liberan inmediatamente del lecho de conjugado al entrar en contacto con el fluido de muestra.

En el contexto de la presente invención, se entiende por “una membrana” el material (por ejemplo, nitrocelulosa) que transporta la muestra y proporciona soporte a las moléculas de captura (anticuerpos, aptámeros, etc.) y permite o potencia sus capacidades de unión.

En el contexto de la presente invención, se entiende por “un lecho de absorción capilar” un elemento del sistema que retiene todo el material de ensayo actuando como recipiente de desechos.

En el contexto de la presente invención, se entiende por “muestra biológica”, tal como se usa en esta invención, cualquier muestra de, relacionada con, provocada por, o que afecta a la vida o a organismos vivos de, procesos biológicos tales como el crecimiento y la digestión. Los ejemplos de una muestra biológica pueden incluir, pero no se limitan a, cultivo celular, sobrenadante de cultivo celular, saliva, lágrimas, orina, sangre, suero, plasma, sudor, fluidos vaginales, semen, heces, mucosa, leche materna, ascitis, linfa, derrame pleural, líquido sinovial, médula ósea, líquido cefalorraquídeo y lavados de cavidades corporales (por ejemplo, lavado bronquial), cabello, tejido, huesos o dientes. Preferiblemente, la muestra biológica es una muestra líquida. Líquido significa un estado de la materia con volumen definido pero sin forma definida a 25°C, como el agua.

En el contexto de la presente invención, “muestra de prueba” se refiere a cualquier material que va a someterse a ensayo para determinar la actividad nucleasa o la actividad enzimática y, en determinadas realizaciones, será un líquido.

Descripción

La identificación de un microorganismo dado (por ejemplo, Staphylococcus aureus, Salmonella) o tipo de célula (por ejemplo, célula de cáncer de mama) ahora es posible aprovechando la actividad nucleasa específica ejercida por algunos microorganismos/células. La identificación y/o el diseño de sondas de ácido nucleico específicas que se degradan por la célula o el microorganismo diana, pero no por el resto de los microorganismos/tipos de célula es crítica.

En este sentido, se han desarrollado tiras de LFPC específicas que pueden detectar sondas de polinucleótido no degradadas en una muestra dada. Por consiguiente, la presencia de una sonda de polinucleótido dará lugar a una línea de prueba coloreada. Por otro lado, si está presente una nucleasa específica en la muestra producirá de manera eventual una degradación completa de la sonda de polinucleótido y, por consiguiente, no se observará ninguna línea de prueba.

Tal sistema proporciona un sistema molecular rápido y sensible para infecciones bacterianas, así como para tumores/cánceres, en particular para análisis de diagnóstico, medioambientales y de seguridad alimentaria. Para este propósito, la presente invención proporciona para un uso in vitro de una secuencia de polinucleótido susceptible de escindirse por una nucleasa específica derivada de una bacteria o una célula de mamífero, en un ensayo de flujo lateral.

En determinadas realizaciones, dicha secuencia de polinucleótido susceptible de escindirse por una nucleasa específica derivada de una bacteria o una célula de mamífero es una sonda (sustrato) corta de oligonucleótido que se compone de ácidos nucleicos y flanqueada con un marcador de captura en un extremo y i) una molécula indicadora o ii) un marcador de captura adicional capaz de unirse a la molécula indicadora situada en el lecho de conjugado de un soporte de un dispositivo de flujo lateral, en el otro extremo. Tras la escisión de las sondas por nucleasas (por ejemplo, ribonucleasa) en una muestra, en particular en una muestra biológica, el marcador de captura se libera de la molécula indicadora indicando la presencia de dichas nucleasas en una muestra biológica en un dispositivo de flujo lateral (véanse los ejemplos de la presente invención). Dependiendo del tipo de sondas, estas pueden escindirse por determinadas nucleasas de mamífero (en particular de células tumorales/cancerosas o tejidos tumorales), y también pueden escindirse por nucleasas producidas por diversas bacterias, incluyendo bacterias patogénicas tales como Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae o Salmonella. Por tanto, las sondas pueden usarse para detectar la presencia de bacterias o tejido tumoral en muestras biológicas tales como líquidos corporales (suero sanguíneo, orina, LCR, semen, esputo, saliva, etc.) y tejido sólido homogeneizado, cultivos celulares, muestras alimentarias, medioambientales e industriales y también in vivo.

Por tanto, la presente invención se refiere a un método (primer método de la invención) para detectar actividad nucleasa (por ejemplo, ARNasa, ADNasa) en una muestra de prueba (muestra biológica), que comprende: 1) incubar un sustrato sintético o una mezcla de sustratos (de, a continuación en el presente documento, “sustrato” o “reactivo de sustrato”) en la muestra, durante un tiempo suficiente para la escisión del/de los sustrato(s) por una enzima nucleasa, en el que el/los sustrato(s) comprende(n) una molécula de ácido nucleico monocatenario (o bicatenario) que contiene al menos un ribonucleótido o desoxirribonucleótido o residuo de nucleótido químicamente modificado en una posición interna que funciona como sitio de escisión por nucleasa (por ejemplo, ribonucleasa) (y en determinadas realizaciones una purina o pirimidina modificadas con 2'-fluoro o purina o pirimidina modificadas con 2'-O-metilo que hace que el oligonucleótido sea resistente a la degradación por una actividad nucleasa no dirigida), un marcador de captura en un extremo y i) una molécula indicadora o ii) un marcador de captura adicional capaz de unirse a la molécula indicadora situada en el lecho de conjugado de un soporte de un dispositivo de flujo lateral, en el otro extremo, y 2) detectar el resultado, preferiblemente de manera visual, en particular si el sustrato se ha escindido o no por una muestra de prueba, usando un dispositivo de flujo lateral. Los dispositivos de flujo lateral específicos útiles para la práctica de la presente invención se ilustran en toda la descripción, así como en los ejemplos y dibujos.

El oligonucléotido de sustrato usado para la práctica de la presente invención comprende por tanto un marcador de captura en un extremo y i) una molécula indicadora o ii) un marcador de captura adicional capaz de unirse a la molécula indicadora situada en el lecho de conjugado del soporte del dispositivo de flujo lateral, en el otro extremo. La escisión del sustrato con una enzima nucleasa (por ejemplo, ribonucleasa) conduce a la escisión de las cadenas y la separación física del grupo de captura a partir del grupo indicador. La separación del grupo indicador y de captura elimina la posibilidad de detectar una señal en la línea de prueba del dispositivo de flujo lateral, dando como resultado así la detección de actividad nucleasa en la muestra. La ausencia de la señal resultante puede detectarse mediante inspección visual directa del dispositivo de flujo lateral.

Por tanto, la presente invención se refiere al uso in vitro de una secuencia de polinucleótido, o sustrato, susceptible de escindirse por una nucleasa específica derivada de una bacteria o una célula de mamífero, en el que la secuencia de polinucleótido se caracteriza porque comprende un marcador de captura y una molécula indicadora en cada extremo de la secuencia, para detectar la presencia de una célula de mamífero o bacteria específicas en una muestra biológica usando un dispositivo de flujo lateral.

Interesantemente, en una realización de la invención, se halló una manera en la que el uso in vitro mencionado anteriormente de un dispositivo de flujo lateral puede usarse no sólo para detectar la presencia de una bacteria específica en una muestra biológica, sino también para determinar simultáneamente la sensibilidad a antibióticos de dicha bacteria. En este sentido, se han desarrollado dos enfoques, i) en primer lugar, una prueba innovadora basada en tiras capaz de detectar bacterias tal como S. aureus y su resistencia a antibióticos tales como meticilina, la bacteria causante más común de infecciones respiratorias nosocomiales, en menos de una hora con los mismos parámetro de especificidad y sensibilidad parámetros que el cultivo cuantitativo de bacterias, usando un sustrato sintético o una mezcla de sustratos capaz de detectar la presencia de bacterias tal como S. aureus en una muestra biológica, y establecer su resistencia a antibióticos tales como meticilina. El valor de diagnóstico añadido de tal tira reactiva está representado por la capacidad innovadora de detectar simultáneamente bacterias y su resistencia a meticilina (el antibiótico usado más frecuentemente). Debido a su formato de tira simple pero eficaz, la prueba puede realizarse fácilmente in situ sin necesidad de equipos de laboratorio especializado ni personal altamente cualificado. La prueba puede realizarse fácilmente por el cuidador sanitario o la enfermera en el hospital, tomando una muestra biológica tal como una muestra de aspirado y mezclándola con los tampones de reacción y una sonda de ácido nucleico, proporcionados con el kit. A continuación, se incuba la mezcla de reacción durante 30-45 min a temperatura ambiente. Posteriormente, se sumerge la tira en la mezcla de reacción, donde se lleva a cabo la detección mediante flujo lateral en el plazo de 10 min. Finalmente, puede visualizarse la lectura positiva (sin línea) o negativa (línea) a simple vista, basándose en la presencia o ausencia de bacterias diana, junto con su sensibilidad a antibióticos. El segundo enfoque para detectar la presencia de una bacteria específica en una muestra biológica y determinar simultáneamente la sensibilidad a antibióticos de dichas bacterias, usando una prueba innovadora basada en tiras adicional capaz de detectar bacterias, en menos de una hora con los mismos parámetros de especificidad y sensibilidad que el cultivo cuantitativo de bacterias, en un método en el que se usa un sustrato sintético o una mezcla de sustratos capaz de detectar la presencia de bacterias en una muestra biológica, y establecer su resistencia a antibióticos, usando una molécula sensible a p-lactamasa que comprende un compuesto que comprende un anillo betalactámico, preferiblemente un antibiótico betalactámico seleccionado de la lista que consiste en derivados de penicilina (penámicos), cefalosporinas (cefémicos), monobactámicos y carbapenémicos, más preferiblemente meticilina, un marcador de captura en un extremo y i) una molécula indicadora o ii) un marcador de captura adicional capaz de unirse a la molécula indicadora situada en el lecho de conjugado de un soporte de un dispositivo de flujo lateral, en el otro extremo (véase la figura 8)

En este sentido, la presente invención se refiere adicionalmente a un método (segundo método de la invención) para, preferiblemente de manera simultánea, detectar bacterias y su resistencia a antibióticos betalactámicos tales como meticilina en una muestra de prueba, que comprende: 1) incubar en la muestra de prueba, i) un sustrato sintético o una mezcla de sustratos para detectar la presencia de una bacteria, y 2) simultánea o posteriormente, establecer la resistencia de las bacterias a antibióticos betalactámicos incubando en la muestra de prueba i) un sustrato sintético o una mezcla de sustratos capaz de diferenciar entre cepas resistentes a antibióticos y no resistentes a antibióticos de las bacterias y/o ii) incubando en la muestra de prueba una molécula sensible a p-lactamasa, durante un tiempo suficiente para la escisión del/de los sustrato(s) por una enzima nucleasa y la escisión de la molécula sensible a plactamasa por una p-lactamasa; en el que

a. el/los sustrato(s) comprende(n) una molécula de ácido nucleico monocatenario que contiene al menos un ribonucleótido o desoxirribonucleótido o residuo de nucleótido químicamente modificado en una posición interna que funciona como sitio de escisión de nucleasa (por ejemplo, ribonucleasa) (y en determinadas realizaciones a purina o pirimidina modificadas con 2'-fluoro o purina o pirimidina modificadas con 2'-O-metilo que hacen que el oligonucleótido sea resistente a la degradación por actividad nucleasa no dirigida), un marcador de captura en un extremo y i) una molécula indicadora o ii) un marcador de captura adicional capaz de unirse a la molécula indicadora situada en el lecho de conjugado de un soporte de un dispositivo de flujo lateral, en el otro extremo; en el que

b. la molécula sensible a p-lactamasa comprende un compuesto que comprende un anillo betalactámico, preferiblemente un antibiótico betalactámico seleccionado de la lista que consiste en derivados de penicilina (penámicos), cefalosporinas (cefémicos), monobactámicos y carbapenémicos, más preferiblemente meticilina, un marcador de captura en un extremo y i) una molécula indicadora o ii) un marcador de captura adicional capaz de unirse a la molécula indicadora situada en el lecho de conjugado de un soporte de un dispositivo de flujo lateral, en el otro extremo; y 2) detectar de manera visual el resultado, en particular si el/los sustrato(s) y opcionalmente la molécula sensible a p-lactamasa se han escindido o no por una muestra de prueba, usando un dispositivo de flujo lateral; y en el que

el sustrato sintético o la mezcla de sustratos para detectar la presencia de una bacteria puede ser igual o diferente del sustrato sintético o la mezcla de sustratos capaz de diferenciar entre cepas resistentes a antibióticos y no resistentes a antibióticos de las bacterias. Preferiblemente, el resultado del segundo método de la invención se detecta preferiblemente de manera visual, en particular si el/los sustrato(s) y opcionalmente la molécula sensible a p-lactamasa se ha escindido o no por una muestra de prueba, usando un dispositivo de flujo lateral tal como se ilustra en toda la presente memoria descriptiva o uniendo los complejos que comprenden los sustrato(s) y opcionalmente la molécula sensible a p-lactamasa después de la incubación en un soporte sólido que facilita técnicas de inmunoensayo tales como un ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA), un radioinmunoensayo (RIA), un ensayo inmunorradiométrico (IRMA), un inmunoensayo fluorescente (FIA), un inmunoensayo quimioluminiscente (CLIA), un inmunoensayo basado en perlas magnéticas (MBI) o un inmunoensayo electroquimioluminiscente (ECL).

Es importante observar que para detectar de manera correcta si el sustrato y la molécula sensible a p-lactamasa se han escindido o no por una muestra de prueba usando un dispositivo de flujo lateral, el marcador de captura (para unir el sustrato a la línea de prueba del LFA) usado en el sustrato debe ser diferente del marcador de captura (para unir la molécula sensible a p-lactamasa a la línea de prueba de p-lactamasa del LFA) usado en la molécula marcadora sensible a p-lactamasa. De esta manera, la línea de prueba de bacterias y la línea de prueba de p-lactamasa (véase la figura 8) puede diferenciarse claramente cuando se realiza el segundo método de la invención.

Un ejemplo particular de llevar a cabo el segundo método de la invención usando los dispositivos de flujo lateral específicos ilustrados en la figura 8 se detallan a continuación. En este sentido, se usa el segundo método de la invención en la tira innovadora de la figura 8 para detectar S. aureus en muestras de aspirados endotraqueales y esputo. Para este propósito, se usaron sondas de ácido nucleico susceptibles de escindirse por la nucleasa específica derivada de una infección bacteriana por S. aureus. La sonda de ácido nucleico (sustrato) se componía de una secuencia corta de polinucleótido y flanqueada con dos marcadores de captura (en este caso específico digoxigenina “Dx o marcador#1” y biotina “B o marcador#2”). El marcador de digoxigenina se unió a una molécula indicadora (partícula de látex o partículas de carbono) funcionalizada previamente con anticuerpo anti-digoxigenina y situada en el lecho de conjugado de la tira (véase la figura 8). Por otro lado, la biotina o marcador#2 capturó la sonda de ácido nucleico en la línea de prueba de la tira (línea roja para negativo y ninguna línea para positivo). Tras la escisión de la sonda de ácido nucleico por nucleasas derivadas de una muestra clínica, se liberó el marcador de digoxigenina de la molécula indicadora indicando la presencia de dichas nucleasas en las muestras biológicas en el dispositivo de flujo lateral. En la ausencia de las bacterias seleccionadas como diana, el complejo de detección habría permanecido sin escindirse y se habría visualizado como una línea roja en la tira. Simultáneamente a las sondas de ácido nucleico susceptibles de escindirse, se usó el nuevo sustrato antibiótico con capacidades de respuesta que permiten la detección de p-lactamasas basándose en una escisión específica, de una manera similar a la sonda de ácido nucleico.

Ejemplos de sustratos de antibiótico con capacidades de respuesta que permiten la detección de p-lactamasas se identifican de la siguiente manera: (6R,7R)-3-(((4-benzamidofenil)tio)metil)-8-oxo-7-(2fenilacetamido)-5-tia-1-azabiciclo[4.2.0]oct-2-eno-2-carboxilato de 4-metoxibencilo es una molécula sensible a p-lactamasa truncada (sonda de CE), o ácido (6S,7S)-7-(((3’,6’-dihidroxi-3-oxo-3H-espiro[isobenzofuran-1,9’-xanten]-6-ilcarbonil)oxi)amino)-8-oxo-3-(((4-(5-((3aR,4R,6aS)-2-oxohexahidro-1H-tieno[3,4-d]imidazol-4-il)pentanamido)fenil)tio)metil)-5-tia-1-azabiciclo[4.2.0]oct-2-eno-2-carboxílico (FAM-sonda de CE-biotina, o ácido (6S,7S)-7-(5-(((3S,5R,8R,9S,10S,12R,13S,14S,17R)-12,14-dihidroxi-10,13-dimetiM7-(5-oxo-2,5-dihidrofuran-3-il)hexadecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-il)oxi)-5-oxopentanamido)-8-oxo-3-(((4-(5-((3aR,4R,6aS)-2-oxohexahidro-1H-tieno[3,4-d]imidazol-4-il)pentanamido)fenil)tio)metil)-5-tia-1-azabiciclo[4.2.0]oct-2-eno-2-carboxílico (digoxigenina-sonda de CE-biotina), o moléculas similares que actúan como sustrato por p-lactamasas (BL). La digoxigenina-sonda de CE-biotina se describe en la figura 9 y a continuación en el presente documento:

Es importante observar que, en un aspecto de la presente invención, tanto la molécula anterior como su método de síntesis constituye una parte de la presente invención. Tal como se ilustra anteriormente, la molécula se compone de un marcador#1 o digoxigenina, un ligador (ácido glutárico) y un antibiótico dado, un grupo saliente (aminotiolfenol) y un segundo marcador de captura (marcador#3), véase la figura 9. El marcador de digoxigenina unido a una molécula indicadora (partícula de látex) funcionalizada previamente con anticuerpo anti-digoxigenina y situada en el lecho de conjugado de la tira (véase la figura 8). Por otro lado, el marcador#3 capturó la molécula sensible a p-lactamasa en la línea de prueba de p-lactamasa de la tira (línea roja para negativo y ninguna línea para positivo). Tras la escisión de la molécula sensible a p-lactamasa por p-lactamasas derivadas de una muestra clínica, se liberó el marcador de digoxigenina de la molécula sensible a p-lactamasa indicando la presencia de dichas nucleasas en las muestras biológicas en el dispositivo de flujo lateral. En la ausencia de dichas p-lactamasas, el complejo de detección habría permanecido sin escindirse y se habría visualizado como una línea roja en la tira indicando la sensibilidad de las bacterias a antibióticos betalactámicos.

Se menciona además, en el segundo método de la invención, simultáneamente a las sondas de ácido nucleico susceptibles de escindirse para determinar la presencia y el tipo de bacterias, no es obligatorio usar el sustrato de antibiótico con capacidades de respuesta que permite la detección de p-lactamasas basándose en una escisión específica, pero tal resistencia a antibióticos también podría determinarse usando sondas de ácido nucleico susceptibles de escindirse sólo para cepas resistentes a antibióticos de las bacterias, tales como MRSA, y no por bacterias sensibles a antibióticos, tales como MSSA (consulte la figura 31).

En una realización, el sustrato usado para la práctica del primer o el segundo método de la invención para identificar la presencia y el tipo de bacterias, es un oligonucleótido que comprende residuos de ribonucleótido. El sustrato también puede ser un oligonucleótido quimérico que comprende residuos escindibles por ARNasa, por ejemplo, ARN, o residuos de ARN resistentes a ARNasa modificados. Preferiblemente, la composición del sustrato es tal que la escisión es un acontecimiento específico de ribonucleasa y que no se produce la escisión por enzimas que son estrictamente desoxirribonucleasas.

Preferiblemente, el sustrato es un oligonucleótido quimérico que comprende residuo(s) de ribonucleótido y residuo(s) de ribonucleótido modificado(s). En una realización, el sustrato es un oligonucleótido quimérico que comprende residuos de ribonucleótido y residuos de ribonucleótido modificados con 2'-O-metilo. En una realización, el sustrato sintético es un oligonucleótido quimérico que comprende residuos de ribonucleótido modificados con 2'-O-metilo y uno o más de cada uno de los cuatro residuos de ribonucleótido, adenosina, citosina, guanosina y uridina. La inclusión de las cuatro bases de ribonucleótido distintas en un único sustrato permite la detección de un espectro aumentado de actividades de enzima ribonucleasa por un único oligonucléotido de sustrato.

Preferiblemente, el sustrato es un oligonucleótido que comprende residuos de desoxirribonucleótido. El sustrato sintético también puede ser un oligonucleótido quimérico que comprende residuos escindibles por ADNasa, por ejemplo, ADN, o residuos de ADN resistentes a ADNasa modificados. Preferiblemente, la composición del sustrato es tal que la escisión es un acontecimiento específico de desoxirribonucleasa y que no se produce la escisión por enzimas que son estrictamente ribonucleasas.

Preferiblemente, el sustrato es un oligonucleótido quimérico que comprende residuo(s) de desoxirribonucleótido y residuo(s) de desoxirribonucleótido modificados. En una realización, el sustrato sintético es un oligonucleótido quimérico que comprende residuos de desoxirribonucleótido y residuos de ribonucleótido modificados con 2'-O-metilo. En una realización, el sustrato sintético es un oligonucleótido quimérico que comprende residuos de desoxirribonucleótido modificados con 2'-O-metilo y uno o más de cada uno de los cuatro residuos de desoxirribonucleótido, desoxiadenosina, desoxicitosina, desoxiguanosina y desoxitimidina. La inclusión de las cuatro bases de desoxirribonucleótido distintas en un único sustrato permiten la detección de un espectro aumentado de actividades de enzima desoxirribonucleasa por un único oligonucléotido de sustrato.

En otra realización, el oligonucleótido del sustrato se selecciona de la lista que consiste en las SEQ ID No 1-2 (S. aureus), SEQ ID No 3 (sonda de control), SEQ ID No 4-11 (Salmonella).

En otra realización, el oligonucleótido del sustrato se selecciona de la lista que consiste en SEQ ID No 12 y es útil para la detección de tejido normal de mama.

En otra realización, el oligonucleótido del sustrato se selecciona de la lista que consiste en SEQ ID No 13 y es útil para la detección de tejido normal de mama.

En otra realización, el oligonucleótido del sustrato se selecciona de la lista que consiste en SEQ ID No 14 y es útil para la detección de tejido normal de mama.

En otra realización, el oligonucleótido del sustrato se selecciona de la lista que consiste en SEQ ID No 15 y es útil para la detección de tumores de cáncer de mama.

En otra realización, el oligonucleótido del sustrato se selecciona de la lista que consiste en SEQ ID No 16 y es útil para la detección de tumores de cáncer de mama.

En otra realización, el oligonucleótido del sustrato se selecciona de la lista que consiste en SEQ ID No 17 y es útil para la detección de tumores de cáncer de mama.

En otra realización, el oligonucleótido del sustrato se selecciona de la lista que consiste en SEQ ID No 18 y es útil para la detección de tumores de cáncer de mama.

En otra realización, el oligonucleótido del sustrato se selecciona de la lista que consiste en SEQ ID No 19 y es útil para la detección de tumores de cáncer de mama.

En otra realización, el oligonucleótido del sustrato se selecciona de la lista que consiste en SEQ ID No 20 y es útil para la detección de tumores de cáncer de mama.

En otra realización, el oligonucleótido del sustrato se selecciona de cualquiera de las secuencias de la lista que consiste en las SEQ ID No 21 a 145.

Sondas de 2’-fluoro

ARN-Pir2'-F-AG fUfCfUAGfUAfCGAfUf

ARN-Pir2'-F-A fUfCfUAAfUAfCAAfUf ARN-Pir 2'-F-G fUfCfUGGfUGfCGGfU ADN-Pir 2’-F-AG fUfCfUAGfUAfCGAfUf ADN-Pir 2'-F-A fUfCfUAAfUAfCAAfUf ADN-Pir 2’-F-G fUfCfUGGfUGfCGGfU ARN-Pur 2 ’-F UCUCfGUfACfGUUC ADN-Pur 2'-F TCTCfGTfACfGTTC ARN-Pur 2 ’-F-U ..y_- ..-_o UfAfAUfGUfAUfGfGU ARN-Pur 2 ’-F-C Cf A f ACf G Cf ACf G f G Cf AD N-Pur 2'-F-T TfAfATfGTfATfGfGTfA ARN-Pur 2'-F UC-CU f A f A f G U Cf G U f G f AC U f

ADN-Pur 2'-FTC-CT fAfAfGTCfGTfGfACTfA

Sondas de 2’-0-propargilo

Segunda generación de sondas

Sondas de Streptococcus pneumoniae

Sondas de Klebsiella pneumoniae

Sondas de Pseudomona aeruginosa

Sondas de Proteus mirabilis

Sondas de S. epidermidis

Sondas de S. aureus

En aún otra realización el oligonucleótido del sustrato se selecciona de la lista que consiste en cualquiera de las sondas identificadas a continuación (la secuencia de nucleótidos particular para cada una de estas sondas se identifica en las tablas que describen las secuencias 1 a 145).

^{P a tó g e n o}

^{S. p n e u m o n ia e}

Las sondas identificadas en la tabla anterior, son particularmente útiles para detectar S. pneumoniae en una muestra de prueba según el primer o el segundo método de la invención (véase la figura 10). Por consiguiente, la presente invención se refiere además al primer o el segundo método para detectar bacterias de la invención, en el que la bacteria es S. pneumoniae y en el que el método se lleva a cabo preferiblemente usando una o más de las sondas capaces de detectar la presencia de bacterias en suspensión en la muestra de prueba.

En aún otra realización, el oligonucleótido del sustrato se selecciona de la lista que consiste en cualquiera de las sondas identificadas a continuación (la secuencia de nucleótidos particular para cada una de estas sondas se identifica en las tablas que describen las secuencias 1 a 145).

Patógeno

K, pneumoniae

Las sondas identificadas en la tabla anterior son particularmente útiles para detectar K. pneumoniae en una muestra de prueba según el primer o el segundo método de la invención (véase la figura 11). Por consiguiente, la presente invención se refiere además al primer o el segundo método para detectar bacterias de la invención, en el que la bacteria es K. pneumoniae y en el que el método se lleva a cabo preferiblemente usando una o más de las sondas capaces de detectar la presencia de bacterias en suspensión en la muestra de prueba y/o en el que el método se lleva a cabo preferiblemente usando una o más de las sondas capaces de detectar indirectamente la presencia de las bacterias detectando las nucleasas secretadas en la muestra de prueba.

Patógena

P. aeruginosa

Las sondas identificadas en la tabla anterior son particularmente útiles para detectar P. aeruginosa en una muestra de prueba según el primer o el segundo método de la invención (véase la figura 12). Por consiguiente, la presente invención se refiere además al primer o el segundo método para detectar bacterias de la invención, en el que la bacteria es P. aeruginosa y en el que el método se lleva a cabo preferiblemente usando una o más de las sondas capaces de detectar la presencia de bacterias en suspensión en la muestra de prueba.

Patógeno

Proteus spp

Las sondas identificadas en la tabla anterior son particularmente útiles para detectar Proteus spp en una muestra de prueba según el primer o el segundo método de la invención (véase la figura 13). Por consiguiente, la presente invención se refiere además al primer o el segundo método para detectar bacterias de la invención, en el que la bacteria es Proteus spp y en el que el método se lleva a cabo preferiblemente usando una o más de las sondas capaces de detectar la presencia de bacterias en suspensión en la muestra de prueba y/o en el que el método se lleva a cabo preferiblemente usando una o más de las sondas capaces de detectar indirectamente la presencia de las bacterias detectando las nucleasas secretadas en la muestra de prueba.

_Patógeno

S. epidermidis

Las sondas identificadas en la tabla anterior son particularmente útiles para detectar S. epidermidis en una muestra de prueba según el primer o el segundo método de la invención (véase la figura 14). Por consiguiente, la presente invención se refiere además al primer o el segundo método para detectar bacterias de la invención, en el que la bacteria es S. epidermidis y en el que el método se lleva a cabo preferiblemente usando una o más de las sondas capaces de detectar la presencia de bacterias en suspensión en la muestra de prueba y/o en el que el método se lleva a cabo preferiblemente usando una o más de las sondas capaces de detectar indirectamente la presencia de las bacterias detectando las nucleasas secretadas en la muestra de prueba.

Patógeno

S. aureus

Las sondas identificadas en la tabla anterior son particularmente útiles para detectar S. aureus en una muestra de prueba según el primer o el segundo método de la invención (véase la figura 15). Por consiguiente, la presente invención se refiere además al primer o el segundo método para detectar bacterias de la invención, en el que la bacteria es S. aureus y en el que el método se lleva a cabo preferiblemente usando una o más de las sondas capaces de detectar la presencia de bacterias en suspensión en la muestra de prueba y/o en el que el método se lleva a cabo preferiblemente usando una o más de las sondas capaces de detectar indirectamente la presencia de las bacterias detectando las nucleasas secretadas en la muestra de prueba.

Patógeno

Sobrenadante

Sonda Veces

ADN-Poli CG _{: 21,8}

ARN 14,4

ADN-Poli AGTC vi v v 17,4

Al 2'-F 3 í I I / v 22,7

ARN-Pir 2'-F i: 28,5

ADN Pir 2'-F I I H ,4

ARN-Pir 2'-F AG _{:■: 14,4}

ARN-Pur 2 'F I 19,6

ADN -Pur 2-F T I | 11,4

ARN Pur 2' F UC CU 3 .38,9

Las sondas identificadas en la tabla anterior son particularmente útiles para detectar Serratia spp en una muestra de prueba según el primer o el segundo método de la invención (véase la figura 16). Por consiguiente, la presente invención se refiere además al primer o el segundo método para detectar bacterias de la invención, en el que la bacteria es Serratia spp y en el que el método se lleva a cabo preferiblemente mediante una o más de las sondas anteriores capaces de detectar indirectamente la presencia de las bacterias detectando las nucleasas secretadas en la muestra de prueba.

Patógeno Sobrenadante

Sonda Veces

Streptococcus

ADN-Poli AT

pyogenes 26,2

ADN-Poli CG ; ; 37,3

ADN-poii AGTC 30,9

ADN-Pur 2'-OMe TC-CT 41,1

Al 2'-F 43,0

ARN-Pir 2 -F 39,0

ARN-Pur 2'-F 26,5

ADN-Pur 2'-F v : 26,1

ADN-Pur 2'-FT : 28,8

ARN -Pur 2'-F UC-CU :■ 59,7

Las sondas identificadas en la tabla anterior son particularmente útiles para detectar Streptococcus pyogenes en una muestra de prueba según el primer o el segundo método de la invención (véase la figura 17). Por consiguiente, la presente invención se refiere además al primer o el segundo método para detectar bacterias de la invención, en el que la bacteria es Streptococcus pyogenes y en el que el método se lleva a cabo preferiblemente mediante una o más de las sondas anteriores capaces de detectar indirectamente la presencia de las bacterias detectando las nucleasas secretadas en la muestra de prueba.

Patógeno Sobrenadante

Sonda Veces

Citrobacter spp

29,1

42 ,3

31,8

33,6

33,2

35,9

44 ,0

27,0

35,4

27,0

Las sondas identificadas en la tabla anterior son particularmente útiles para detectar Citrobacter spp en una muestra de prueba según el primer o el segundo método de la invención (véase la figura 18). Por consiguiente, la presente invención se refiere además al primer o el segundo método para detectar bacterias de la invención, en el que la bacteria es Citrobacter spp y en el que el método se lleva a cabo preferiblemente mediante una o más de las sondas anteriores capaces de detectar indirectamente la presencia de las bacterias detectando las nucleasas secretadas en la muestra de prueba.

Patógeno

^ARN 27,6

ARN-Poli AU _19,5

ARN-Poli AGUC 33,3

ARN-Pur 2'-OMe 28,6

ARN-Pur 2'-OMe C 30,8

ARN -Pur 2'-OMe UC-CU 18,9

ARN-Pir 2'-F AG 18,6

ARN-Pur 2‘-F 33,0

ARN-Pir 2'-Oprop AG 20,2

ARN-Pur2'-Oprop 21,4

Las sondas identificadas en la tabla anterior son particularmente útiles para detectar Enterobacter spp en una muestra de prueba según el primer o el segundo método de la invención (véase la figura 19). Por consiguiente, la presente invención se refiere además al primer o el segundo método para detectar bacterias de la invención, en el que la bacteria es Enterobacter spp y en el que el método se lleva a cabo preferiblemente mediante una o más de las sondas anteriores capaces de detectar indirectamente la presencia de las bacterias detectando las nucleasas secretadas en la muestra de prueba.

Patógeno

Sobrenadante

Sonda Veces

^{Providencia spp} ADN-Poli AT _' _2,9

ARN ■ 3,3

^{ARN-Pir 2'-OIVIe AG}

ARN-Pir 2 -OMe G 1 23,,81

a i 2'-f 3,6

ARN-Pir 2 -F 3,6

ARN-Pir 2'-F AG \ ; 4,3

ARN-Pir 2'-F G ' í 3,9

ARN-Pir 2'-Oprop AG í 3,2

ARN-Pir 2' OpropG 3,9

Las sondas identificadas en la tabla anterior son particularmente útiles para detectar Providencia spp en una muestra de prueba según el primer o el segundo método de la invención (véase la figura 20). Por consiguiente, la presente invención se refiere además al primer o el segundo método para detectar bacterias de la invención, en el que la bacteria es Providencia spp y en el que el método se lleva a cabo preferiblemente mediante una o más de las sondas anteriores capaces de detectar indirectamente la presencia de las bacterias detectando las nucleasas secretadas en la muestra de prueba.

Patógeno

E. co li

Las sondas identificadas en la tabla anterior son particularmente útiles para detectar E. coli en una muestra de prueba según el primer o el segundo método de la invención (véase la figura 21). Por consiguiente, la presente invención se refiere además al primer o el segundo método para detectar bacterias de la invención, en el que la bacteria es E. coli y en el que el método se lleva a cabo preferiblemente usando una o más de las sondas capaces de detectar la presencia de bacterias en suspensión en la muestra de prueba y/o en el que el método se lleva a cabo preferiblemente usando una o más de las sondas capaces de detectar indirectamente la presencia de las bacterias detectando las nucleasas secretadas en la muestra de prueba.

Patógeno Sobrenadante

Sonda Veces

ADN-Poli AT

1 25,1

ADN-Poli AGTC _{- : 18,4}

ARN-Poli AU ; 9,1

ARN-Poli UC 7,1

ARN-Poli AGUC 2 8,7

ARN-Pur Z'-ÓMe 12,7

ARN-Pur 2'-OMe C 10,6

ARN-Pur 2'-F 7,1

AR.M Pir 2'-Oprop A 9,5

ARN-Pur 2‘-Oprop ;;2; 10,6

Las sondas identificadas en la tabla anterior son particularmente útiles para detectar Enterococcus faecalis en una muestra de prueba según el primer o el segundo método de la invención (véase la figura 22). Por consiguiente, la presente invención se refiere además al primer o el segundo método para detectar bacterias de la invención, en el que la bacteria es Enterococcus faecalis y en el que el método se lleva a cabo preferiblemente mediante una o más de las sondas anteriores capaces de detectar indirectamente la presencia de las bacterias detectando las nucleasas secretadas en la muestra de prueba.

Patógeno Sobrenadante

Sonda Veces

^{ADN-Poli AT -i;}; 34,7

ARN ' _24,6

ARN-Poli AGUO 27,2

ARN-Pir 2'-OMe ; 32,9

ARN-Pir 2'-OMe AG 24,4

26,2

ARN-Pir 2 -F . . :V 33,8

ARN-Pur 2'-F : 32,6

ADN-Pur 2'-F ;; : 26,2

ARN-Pir 2' Oprop i 26,3

Las sondas identificadas en la tabla anterior son particularmente útiles para detectar Bacillus licheniformis en una muestra de prueba según el primer o el segundo método de la invención (véase la figura 23). Por consiguiente, la presente invención se refiere además al primer o el segundo método para detectar bacterias de la invención, en el que la bacteria es Bacillus licheniformis y en el que el método se lleva a cabo preferiblemente mediante una o más de las sondas anteriores capaces de detectar indirectamente la presencia de las bacterias detectando las nucleasas secretadas en la muestra de prueba.

Sobrenadante

da Veces

ac us

amyloliquefaciens ^ARN

ARN-

ARN- ,

ARN-Pur 2'-OMeUC-CU 66,9

Al 2'-F 48,0

ARN-Pir 39,7

ARN-Pur 67,0

ARN-Pir

33,2

Las sondas identificadas en la tabla anterior son particularmente útiles para detectar Bacillus amyloliquefaciens en una muestra de prueba según el primer o el segundo método de la invención (véase la figura 24). Por consiguiente, la presente invención se refiere además al primer o el segundo método para detectar bacterias de la invención, en el que la bacteria es Bacillus amyloliquefaciens y en el que el método se lleva a cabo preferiblemente mediante una o más de las sondas anteriores capaces de detectar indirectamente la presencia de las bacterias detectando las nucleasas secretadas en la muestra de prueba.

Se observa que los métodos primero y segundo de la invención se realizan en dos etapas. En primer lugar, se mezcla la muestra de prueba con el reactivo de sustrato y, en el caso del segundo método, también con la molécula sensible a p-lactamasa y/o las sondas de ácido nucleico susceptibles de escindirse sólo por cepas resistentes a antibióticos de las bacterias, tales como MRSA, y no por bacterias sensibles a antibióticos, tales como MSSA (consulte la figura 31), y se incubaron. Tanto el/los sustrato(s) como opcionalmente la molécula sensible a p-lactamasa pueden mezclarse solos con la muestra de prueba o se mezclarán con un tampón apropiado. En segundo lugar, hay una detección, preferiblemente visual, del resultado usando un dispositivo de flujo lateral. Tal como se ilustra en los ejemplos y las figuras de la presente invención, la presencia de una línea de control y la falta de la presencia de una línea de prueba en el dispositivo de flujo lateral, indica si está presente actividad nucleasa y/o B-lactamasa en la muestra de prueba. Los métodos prevén que esta etapa pueda realizarse con inspección visual no asistida.

Mientras que los métodos de la invención, cuando se practican usando un dispositivo de flujo lateral, pueden ponerse en práctica sin el uso de una línea de control en el dispositivo de flujo lateral, en determinadas realizaciones de la invención es deseable incluir dichas líneas de control, como cuando la línea de control se usa como control negativo, la muestra de control, en algunas realizaciones, no contiene actividad nucleasa o B-lactamasa detectable. Por tanto, la presente invención proporciona además un método, según el primer método de la invención, para detectar actividad nucleasa en una muestra de prueba, que comprende: (a) poner en contacto la muestra de prueba con un sustrato, creando de ese modo una mezcla de reacción de prueba, en el que el sustrato comprende una molécula de ácido nucleico que comprende (i) un dominio de escisión que comprende una región de cadenas sencillas; (ii) un marcador de captura en un lado de la molécula de ácido nucleico; y (iii) i) una molécula indicadora o ii) una molécula de captura adicional capaz de unirse a la molécula indicadora situada en el lecho de conjugado del soporte del dispositivo de flujo lateral, en el otro lado de la molécula de ácido nucleico; (b) incubar la mezcla de reacción de prueba durante un tiempo suficiente para la escisión del sustrato por una nucleasa en la muestra; y (c) determinar si está presente una señal detectable en la línea de prueba del dispositivo de flujo lateral, en el que la presencia de dicha señal y la presencia de una señal en la línea de control indica que la muestra no contiene actividad nucleasa y la ausencia de dicha señal y la presencia de una señal en la línea de control indica que la muestra contiene actividad nucleasa.

Además, la presente invención proporciona además un método, según el segundo método de la invención, para detectar la presencia de una bacteria y su resistencia a antibióticos en una muestra de prueba, que comprende: (a) poner en contacto la muestra de prueba con un sustrato y un molécula sensible a p-lactamasa y/o las sondas de ácido nucleico susceptibles de escindirse sólo por cepas resistentes a antibióticos de las bacterias, tales como MRSA, y no por bacterias sensibles a antibióticos, tales como MSSA (consulte la figura 31), creando de ese modo una mezcla de reacción de prueba, en el que el sustrato comprende una molécula de ácido nucleico que comprende (i) un dominio de escisión que comprende una región de cadenas sencillas; (ii) un marcador de captura en un lado de la molécula de ácido nucleico; y (iii) i) una molécula indicadora o ii) una molécula de captura adicional capaz de unirse a la molécula indicadora situada en el lecho de conjugado del soporte del dispositivo de flujo lateral, en el otro lado de la molécula de ácido nucleico; y en el que la molécula sensible a p-lactamasa comprende un compuesto que comprende un anillo betalactámico, preferiblemente un antibiótico betalactámico seleccionado de la lista que consiste en derivados de penicilina (penámicos), cefalosporinas (cefémicos), monobactámicos y carbapenémicos, más preferiblemente meticilina, un marcador de captura en un extremo y i) una molécula indicadora o ii) un marcador de captura adicional capaz de unirse a la molécula indicadora situada en el lecho de conjugado de un soporte de un dispositivo de flujo lateral, en el otro extremo; y (b) incubar la mezcla de reacción de prueba durante un tiempo suficiente para la escisión del sustrato y la molécula sensible a p-lactamasa por una nucleasa y p-lactamasa en la muestra; y (c) determinar si está presente una señal detectable en la línea de prueba de nucleasa y la p-lactamasa del dispositivo de flujo lateral, en el que la presencia de dicha señal en la línea de prueba de nucleasa y la presencia de una señal en la línea de control indica que la muestra no contiene actividad nucleasa, en el que la ausencia de dicha señal en la línea de prueba de nucleasa y la presencia de una señal en la línea de control indica que la muestra contiene actividad nucleasa, en el que la ausencia de la señal y la presencia de una señal en la línea de control indica que la muestra no contiene actividad nucleasa, en el que la ausencia de dicha señal en la línea de prueba de nucleasa, la presencia de una señal en la línea de control y la ausencia de dicha señal en la línea de prueba de p-lactamasa indica que la muestra contiene actividad nucleasa y actividad p-lactamasa y en el que la ausencia de dicha señal en la línea de prueba de nucleasa, la presencia de una señal en la línea de control y la presencia de dicha señal en la línea de prueba de p-lactamasa indica que la muestra contiene actividad nucleasa, pero no actividad p-lactamasa.

Los métodos de la invención pueden implicar adicionalmente poner en contacto la muestra de prueba con un tampón antes o durante la etapa (a).

La presente invención divulga además composiciones y kits para poner en práctica los presentes métodos. Por tanto, en determinadas realizaciones, la presente invención divulga un kit que comprende: (a) en un recipiente, un sustrato, comprendiendo el sustrato una molécula de ácido nucleico que comprende una región de cadenas sencillas, comprendiendo la región de cadenas sencillas: (i) un dominio de escisión; (ii) un marcador de captura en un lado de la molécula de ácido nucleico; (iii) i) una molécula indicadora o ii) un marcador de captura adicional capaz de unirse a la molécula indicadora situada en el lecho de conjugado del soporte del dispositivo de flujo lateral, en el otro lado de la molécula de ácido nucleico; y opcionalmente una molécula sensible a p-lactamasa que a su vez comprende un compuesto que comprende un anillo betalactámico, preferiblemente un antibiótico betalactámico seleccionado de la lista que consiste en derivados de penicilina (penámicos), cefalosporinas (cefémicos), monobactámicos y carbapenémicos, más preferiblemente meticilina, un marcador de captura en un extremo y i) una molécula indicadora o ii) un marcador de captura adicional capaz de unirse a la molécula indicadora situada en el lecho de conjugado de un soporte de un dispositivo de flujo lateral, en el otro extremo; y (b) preferiblemente un dispositivo de flujo lateral. Estos kits se describen adicionalmente al final de la descripción en la presente memoria descriptiva, en la sección titulada “Dispositivos de flujo lateral y pruebas”.

Con respecto a los marcadores de captura, puede usarse cualquier compuesto que pueda capturarse en un ensayo de flujo lateral y que pueda unirse a la región de cadenas sencillas en los métodos y las composiciones de la invención. Numerosos compuestos son capaces de ello, tal como biotina, FITC, FAM, digoxigenina, DNP (dinitrofenilo), rojo Texas, TAMRA o cualquier otro antígeno pequeño.

En determinadas realizaciones, la molécula de captura es un anticuerpo u otras moléculas de reconocimiento tales como fragmentos Fab, nanocuerpos, aptámeros, etc.

Con respecto al grupo indicador, numerosos compuestos son capaces de ello, tal como nanopartículas de látex u oro, partículas de carbono, u otras moléculas indicadoras colorimétricas.

Los ácidos nucleicos de la invención, incluyendo aquellos para su uso como sustratos en los métodos de la invención, en determinadas realizaciones son moléculas monocatenarias o bicatenarias. En otras realizaciones, los ácidos nucleicos de la invención son oligonucleótidos quiméricos que comprenden un residuo de ribonucleótido modificado resistente a nucleasa. Los residuos de ribonucleótido modificados resistentes a ARNasa a modo de ejemplo incluyen ribonucleótidos modificados con 2'-fluoro, ribonucleótidos modificados con 2'-O-metilo, ribonucleótidos modificados con 2'-metoxietoxilo, ribonucleótidos modificados con 2'-O-alilo, ribonucleótidos modificados con 2'-O-pentilo, ribonucleótidos modificados con 2'-O-butilo LNA y UNA. En un modo de la realización, el residuo de ribonucleótido modificado está en el extremo 5'-terminal o el extremo 3'-terminal del dominio de escisión. En aún otras realizaciones, los ácidos nucleicos de la invención son oligonucleótidos quiméricos que comprenden un residuo de desoxirribonucleótido modificado resistente a desoxirribonucleasa. En modos específicos de las realizaciones, el residuo de desoxirribonucleótido modificado resistente a desoxirribonucleasa es un desoxirribonucleótido fosfotriéster, un desoxirribonucleótido metilfosfonato, un desoxirribonucleótido fosforamidato, un desoxirribonucleótido fosforotioato, un desoxirribonucleótido fosforoditioato o un desoxirribonucleótido boranofosfato. En aún otras realizaciones de la invención, los ácidos nucleicos de la invención comprenden un residuo de ribonucleótido modificado escindible por ribonucleasa.

Los ácidos nucleicos de la invención, incluyendo aquellos para su uso como sustratos en los métodos de la invención, tienen una longitud de al menos 3 nucleótidos, tal como una longitud de 5-30 nucleótidos. En determinadas realizaciones específicas, los ácidos nucleicos de la invención tienen una longitud de 5-20, 5-15, 5-10, 7-20, 7-15, 7 10, 5-50 ó 10-50 nucleótidos.

En determinadas realizaciones, el marcador de captura de los ácidos nucleicos de la invención está en 5' con respecto al dominio de escisión y la molécula indicadora está en 3' con respecto al dominio de escisión. En una realización específica, el marcador de captura está en el extremo 5'-terminal del sustrato. En otra realización específica, la molécula indicadora está en el extremo 3'-terminal del sustrato.

En determinadas realizaciones, la molécula indicadora de los ácidos nucleicos de la invención está en 5' con respecto al dominio de escisión y la molécula de captura está en 3' con respecto al dominio de escisión. En una realización específica, la molécula indicadora está en el extremo 5'-terminal del sustrato. En otra realización específica, el marcador de captura está en el extremo 3'-terminal del sustrato.

En una realización de la invención, un ácido nucleico de la invención que comprende la fórmula: 5'-N1-n-N2-3', en la que: (a) “N1” representa de cero a cinco residuos de ribonucleótido modificados en 2'; (b) “N2” representa de uno a cinco residuos de ribonucleótido modificados en 2'; y (c) “n” representa de uno a diez, tal como de cuatro a diez residuos de ribonucleótido no modificados. En una determinada realización específica, “N1” representa de uno a cinco residuos de ribonucleótido modificados en 2'. En determinados modos de la realización, la molécula de captura o la molécula indicadora está unida al residuo de ribonucleótido modificado en 2' 5'-terminal de N1.

En los ácidos nucleicos de la invención, incluyendo los ácidos nucleicos con la fórmula: 5'-N1-n-N2-3', el marcador de captura puede estar en 5' con respecto al dominio de escisión y la molécula indicadora está en 3' con respecto al dominio de escisión; alternativamente, la molécula indicadora está en 5' con respecto al dominio de escisión y la molécula de captura está en 3' con respecto al dominio de escisión.

Las moléculas sensibles a p-lactamasa adecuadas para su uso en los métodos de la invención se indican ya en toda la memoria descriptiva como cualquier molécula que comprende un compuesto que comprende un anillo betalactámico, preferiblemente un antibiótico betalactámico seleccionado de la lista que consiste en derivados de penicilina (penámicos), cefalosporinas (cefémicos), monobactámicos y carbapenémicos, más preferiblemente meticilina, un marcador de captura en un extremo y i) una molécula indicadora o ii) un marcador de captura adicional capaz de unirse a la molécula indicadora situada en el lecho de conjugado de un soporte de un dispositivo de flujo lateral, en el otro extremo. Preferiblemente tal molécula es la mostrada en la figura 9.

Con respecto a los kits de la invención, además de que comprenden un ácido nucleico de la invención, los kits pueden comprender además uno o más de los siguientes: una nucleasa; agua libre de ribonucleasa, un tampón y material de laboratorio de plástico libre de nucleasa.

Oligonucleótidos de sustrato

Tal como se ha comentado ya los sustratos de oligonucleótido usados para poner en práctica la presente invención, sin importar si se usan para detectar la presencia de una bacteria o aquellos susceptibles de escindirse sólo por cepas resistentes a antibióticos de las bacterias, tal como MRSA, y no por bacterias sensibles a antibióticos, tal como MSSA (consulte la figura 31) o viceversa, son sustratos para enzimas nucleasa (por ejemplo, ribonucleasa). Tales oligonucleótidos de sustrato comprenden: 1) una o más bases escindibles por nucleasa, por ejemplo, bases de ARN, de las cuales todas o algunas funcionan como enlaces escindibles, 2) un marcador de captura y i) una molécula indicadora o ii) un marcador de captura adicional capaz de unirse a la molécula indicadora situada en el lecho de conjugado del soporte del dispositivo de flujo lateral, y 3) pueden contener opcionalmente bases de ARN modificadas resistentes a ARNasa, bases de ADN resistentes a nucleasa o bases de ADN no modificadas. En las patentes estadounidenses n.^os6.773.885 y 7.803.536 se describen quimeras de ARN-ADN de oligonucleótidos sintéticas en las que los enlaces de ARN internos funcionan como un enlace escindible.

En determinadas realizaciones, las sondas de oligonucleótido de sustrato son oligorribonucleótidos monocatenarios o bicatenarios. En determinadas realizaciones, las sondas de oligonucleótido están compuestas por oligorribonucleótidos modificados. El término “modificado” abarca nucleótidos con una base y/o un azúcar modificado covalentemente. Por ejemplo, los nucleótidos modificados incluyen nucleótidos que tienen azúcares, que están unidos covalentemente a grupos orgánicos de bajo peso molecular distintos de un grupo hidroxilo en la posición 3' y distintos de un grupo fosfato en la posición 5'. Los nucleótidos así modificados también pueden incluir azúcares sustituidos en 2' tales como 2'-O-metil-; 2-O-alquil-; 2'-O-alil-; 2'-S-alquil-; 2'-S-alil-; 2'-fluoro-; 2'-halo- o 2'-azido-ribosa, análogos de azúcar carbocíclicos, azúcares a-anoméricos; azúcares epiméricos tales como arabinosa, xilosas o lixosas, azúcares de piranosa, azúcares de furanosa y sedoheptulosa. En determinadas realizaciones, el sustrato incluye, pero no se limita a, 2'-O-metil ARN, 2'-metoxietoxil ARN, 2'-O-alil ARN, 2'-O-pentil ARN y 2'-O-butil ARN.

En la técnica se conocen nucleótidos modificados e incluyen, por ejemplo y no a modo de limitación, purinas y/o pirimidinas alquiladas; purinas y/o pirimidinas aciladas; u otros heterociclos. Estas clases de pirimidinas y purinas se conocen en la técnica e incluyen, pseudoisocitosina; N4,N4-etanocitosina; 8-hidroxi-N6-metiladenina; 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroxilmetil)uracilo; 5-fluorouracilo; 5-bromouracilo; 5-carboximetilaminometil-2-tiouracilo; 5-carboximetilaminometiluracilo; dihidrouracilo; inosina; N6-isopentil-adenina; 1-metiladenina; 1-metilpseudouracilo; 1-metilguanina; 2,2-dimetilguanina; 2-metiladenina; 2-metilguanina; 3-metilcitosina; 5-metilcitosina; N6-metiladenina; 7-metilguanina; 5-metilaminometiluracilo; 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo; p-D-manosilqueosina; 5-metoxicarbonilmetiluracilo; 5-metoxiuracilo; 2-metiltio-N6-isopenteniladenina; éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético; pseudouracilo; 2-tiocitosina; 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo; 4-tiouracilo; 5-metiluracilo; éster metílico del ácido N-uracil-5-oxiacético; ácido uracil-5-oxiacético; queosina; 2-tiocitosina; 5-propiluracilo; 5-propilcitosina; 5-etiluracilo; 5-etilcitosina; 5-butiluracilo; 5-pentiluracilo; 5-pentilcitosina; y 2,6,-diaminopurina; metilpseudouracilo; 1-metilguanina; 1-metilcitosina.

Los oligonucleótidos usados para poner en práctica la presente invención pueden sintetizarse usando nucleótidos unidos por fosfodiésteres convencionales y sintetizados usando técnicas convencionales en fase sólida o en disolución, que se conocen en la técnica. Los enlaces entre nucleótidos pueden usar moléculas de unión alternativas. Por ejemplo, grupos de unión de fórmula P(O)S, (tioato); P(S)S, (ditioato); P(O)NR'2; P(O)R'; P(O)OR6; CO; o CONR'2 en los que R es H (o una sal) o alquilo (C^1-12) y R6 es alquilo (C^1-9), está unido a nucleótidos adyacentes a través de -O- o -S-.

En determinadas realizaciones de la presente invención, los oligonucleótidos tienen modificaciones adicionales, tales como una modificación con 2'-O-metilo de las pirimidinas. En otras realizaciones, todos los nucleótidos en los oligonucleótidos están modificados con 2'-O-metilo. Alternativamente, las pirimidinas, o todos los nucleótidos, pueden modificarse con 2' fluoros (tanto pirimidinas como purinas).

Los oligonucleótidos son cortos, tal como con una longitud de entre 2 y 30 nucleótidos (o cualquier valor entre los mismos). En determinadas realizaciones, ese oligonucleótido tiene una longitud de entre 10 y 15 nucleótidos. En determinadas realizaciones, ese oligonucleótido tiene una longitud de entre 11 y 13 nucleótidos. En general, secuencias más cortas darán una mejor relaciones señal/ruido que sondas más largas y, por tanto, serán más sensibles. Sin embargo, en determinadas realizaciones, las sondas más cortas podrían no ser el mejor sustrato para la nucleasa, por lo que se necesita cierto grado de optimización empírica para la longitud. En determinadas realizaciones, el oligonucleótido comprende el 0-50% de purinas (o cualquier valor entre los mismos). En determinadas realizaciones, el oligonucleótido comprende el 100% de pirimidinas.

Cabe señalar que la secuencia específica del oligonucleótido no es crítica. Determinadas combinaciones de purinas y pirimidinas son susceptibles a endonucleasas bacterianas, mientras que resisten a nucleasas de mamíferos. Las endonucleasas son enzimas que escinden el enlace fosfodiéster dentro de una cadena de polinucleótido, al contrario que las exonucleasas, que escinden enlaces fosfodiéster en el extremo de una cadena de polinucleótido. Estas nucleasas bacterianas no son específicas de secuencia como las enzimas de restricción, que normalmente requieren un sitio de reconocimiento y un patrón de escisión. Algunas endonucleasas escinden moléculas de ácido nucleico monocatenario, mientras que otras escinden moléculas de ácido nucleico bicatenario.

Ligadores o agentes de unión

En determinadas realizaciones, el oligonucleótido y/o las moléculas sensibles a p-lactamasa se unen al marcador de captura y/o la molécula indicadora por medio de un ligador o agente de unión. La molécula de captura podría ser un anticuerpo u otras moléculas de biorreconocimiento tales como fragmentos Fab, nanocuerpos, aptámeros, etc.

En determinadas realizaciones, se usa un ligador alifático o de etilenglicol (tal como se conocen bien por los expertos en la técnica). En determinadas realizaciones, el ligador es un enlace fosfodiéster. En determinadas realizaciones, el ligador es un enlace fosforotioato.

Síntesis de sustratos

La síntesis de los sustratos de ácido nucleico usados para poner en práctica la presente invención puede realizarse, pero sin limitarse a, usando química de fosforamidita en fase sólida (patente estadounidense n.° 6.773.885) con sintetizadores automatizados, aunque pueden usarse otros métodos de síntesis de ácido nucleico (por ejemplo, el método de H-fosfonato). La síntesis química de ácidos nucleicos permite la producción de diversas formas de los ácidos nucleicos con enlaces modificados, composiciones quiméricas y bases o grupos de modificación no convencionales unidos en lugares elegidos a lo largo de toda la longitud del ácido nucleico.

Métodos de detección

La presente invención proporciona un primer método para detectar bacterias o células tumorales en una muestra y un segundo método para detectar simultáneamente bacterias y su resistencia a antibióticos tales como meticilina en una muestra de prueba in vitro usando un dispositivo de flujo lateral. Los métodos de la invención se realizan en las siguientes: combinar la “muestra de prueba o biológica” con sustrato(s), y opcionalmente en el contexto del segundo método de la invención, moléculas sensibles a p-lactamasa y/o las sondas de ácido nucleico susceptibles de escindirse sólo por cepas resistentes a antibióticos de las bacterias, tal como MRSA, y no por bacterias sensibles a antibióticos, tal como MSSA (consulte la figura 31) o viceversa, para producir una mezcla, siendo la mezcla la mezcla de ensayo, incubar, y detectar si se produce una señal en una línea de prueba de un dispositivo de flujo lateral, para poner en práctica el segundo método de la invención, el dispositivo de flujo lateral debe comprender al menos una línea de prueba de actividad nucleasa y una línea de prueba adicional de actividad B-lactamasa. “Muestra de prueba” se refiere a cualquier material que va a someterse a ensayo para determinar la actividad nucleasa y opcionalmente la actividad B-lactamasa o la resistencia a antibióticos y en determinadas realizaciones será un líquido. Los sólidos pueden someterse a prueba indirectamente para determinar la presencia de contaminación por nucleasa mediante lavado o inmersión en disolvente, por ejemplo, agua, seguido por un ensayo del disolvente.

Por ejemplo, se puede poner en contacto una muestra con una sonda de oligonucleótido y opcionalmente moléculas sensibles a p-lactamasa tal como se describe en el presente documento, y detectar la presencia de endonucleasas bacterianas y opcionalmente actividad B-lactamasa usando un dispositivo de flujo lateral.

En determinadas realizaciones, las sondas y moléculas de la presente invención también son útiles para detectar contaminación bacteriana en entornos tales como laboratorios de investigación.

Cada una de las etapas del método se ilustrará adicionalmente, pero sin limitarse a, de la siguiente manera a continuación:

1. Mezcla de ensayo. Se mezcla(n) el/los sustrato(s) y opcionalmente las moléculas sensibles a p-lactamasa y se incuba(n) con la muestra de prueba. Esta mezcla constituye la mezcla de ensayo. De manera ideal, la mezcla de ensayo es un volumen pequeño, de desde aproximadamente 1 |il hasta aproximadamente 10 ml, o, de desde aproximadamente 10 hasta 100 |il. El volumen preciso de la mezcla de ensayo variará con la naturaleza de la muestra de prueba y el método de detección. Opcionalmente, puede añadirse un tampón a la mezcla de ensayo. Las nucleasas, incluyendo algunas ribonucleasas, requieren la presencia de cationes divalentes para una actividad máxima y proporcionando una disolución tamponada optimizada puede aumentar la velocidad de reacción y aumentar de ese modo la sensibilidad del ensayo. Pueden usarse tampones de diferente composición, tal como se describe en la patente estadounidense n.° 6.773.885.

2. Incubación. Se incuba la mezcla de ensayo (por ejemplo, la muestra de prueba más sustrato(s) y opcionalmente moléculas sensibles a p-lactamasa). El tiempo y las condiciones de incubación pueden variar desde unos pocos minutos hasta 24 horas o más dependiendo de la sensibilidad requerida. Son deseables tiempos de incubación de una hora o menos. Las nucleasas son catalíticas. Por tanto, aumentar el tiempo de incubación debería aumentar la sensibilidad del ensayo, siempre que la escisión de fondo del sustrato (hidrólisis) permanezca bajo. Como resulta evidente, el fondo del ensayo es estable a lo largo del tiempo y la sensibilidad del ensayo aumenta con el tiempo de incubación. La temperatura de incubación puede variar generalmente desde temperatura ambiente hasta 37°C, pero puede ajustarse a la temperatura óptima de una nucleasa específica que se sospecha que está presente como contaminante.

. Detección de señal.

Para la detección de señal pueden emplearse dos sistemas diferentes según la presente invención:

un primer sistema comprende:

a. La(s) secuencia(s) de polinucleótido tal como se define en el primer aspecto de la invención y opcionalmente moléculas sensibles a p-lactamasa conjugadas con una molécula indicadora;

b. un soporte adecuado para flujo lateral que comprende:

b1. una placa de soporte; y

b2. un lecho de muestra, una membrana y un lecho de absorción capilar, todos ellos encima del lecho de soporte, en el que la membrana está situada después del lecho de muestra de manera que la muestra fluye desde el lecho de muestra hasta la membrana, en el que la membrana comprende una línea de prueba que a su vez comprende moléculas inmovilizadas en la línea de prueba para capturar la molécula de captura de la secuencia de polinucleótido, y opcionalmente una segunda línea de prueba que a su vez comprende moléculas inmovilizadas en dicha segunda línea de prueba para capturar la molécula de captura de las moléculas sensibles a p-lactamasa, y en el que el lecho de absorción capilar está situado en el extremo de la membrana.

Mezcla de ensayo. Se incuba la muestra con la secuencia de polinucleótido tal como se define en el primer aspecto de la invención y opcionalmente moléculas sensibles a p-lactamasa conjugadas con una molécula indicadora, en este sistema pueden usarse nanopartículas de látex/oro para funcionalizar la secuencia de polinucleótido tal como se define en el primer aspecto de la invención y opcionalmente las moléculas sensibles a p-lactamasa usando química de acoplamiento (por ejemplo, acoplamiento de aminas) en un extremo de cada uno de estos restos. El otro extremo de los restos puede modificarse con un marcador de captura, si se pone en práctica el segundo método de la invención debe usarse un marcador de captura diferente para cada uno de los restos. Después de la incubación a temperatura y tiempo deseados para permitir una degradación eficiente del polinucleótido y opcionalmente la molécula sensible a p-lactamasa, se dispensa la mezcla de ensayo en el lecho de muestra del dispositivo de flujo lateral. Posteriormente, se transporta el fluido de muestra a la membrana y los marcadores de captura pueden detectarse por las moléculas de captura en la(s) línea(s) de prueba. Si está presente la actividad nucleasa, la molécula de captura detectará un fragmento del polinucleótido que se funcionalizó con el marcador de captura, sin señal visible. Si está ausente la actividad nucleasa, la molécula de captura capturará el polinucleótido biotinilado junto con la molécula indicadora y, por tanto, proporcionará una señal de lectura que puede evaluarse a simple vista. Una representación esquemática de este sistema se proporciona en la figura 1 y la figura 8. La determinación de la presencia o ausencia de actividad B-lactamasa se determina dentro del mismo dispositivo de flujo lateral de manera similar a la manera mediante la cual se determina la actividad nucleasa ya explicada a lo largo de la presente memoria descriptiva.

Un segundo sistema comprende:

a. La(s) secuencia(s) de polinucleótido tal como se define(n) en el tercer aspecto de la invención y opcionalmente moléculas sensibles a p-lactamasa conjugadas en ambos extremos con moléculas de captura, en el que una de las moléculas de captura de cada resto (la secuencia de polinucleótido y opcionalmente la molécula sensible a plactamasa) es capaz de unirse a la molécula indicadora situada en el lecho de conjugado del soporte; y

b. un soporte adecuado para flujo lateral que comprende:

b1. una placa de soporte; y

b2. un lecho de muestra, un lecho de conjugado, una membrana y un lecho de absorción capilar, todos ellos encima del lecho de soporte, en el que la membrana está situada después del lecho de muestra de manera que la muestra fluye desde el lecho de muestra hasta la membrana, en el que la membrana comprende una línea de prueba que a su vez comprende moléculas inmovilizadas en la línea de prueba para capturar la molécula de captura de la secuencia de polinucleótido, y opcionalmente una segunda línea de prueba, para poner en práctica el segundo método de la invención, que a su vez comprende moléculas inmovilizadas en dicha segunda línea de prueba para capturar la molécula de captura de las moléculas sensibles a p-lactamasa, en el que el lecho de absorción capilar está situado en el extremo de la membrana,

y en el que el sistema comprende además un lecho de conjugado entre el lecho de muestra y la membrana que a su vez comprende una molécula indicadora.

Mezcla de ensayo. En este sistema, se incuba la muestra con la sonda de polinucleótido y opcionalmente la molécula sensible a p-lactamasa, en el que ambos restos se modifican en ambos extremos con dos marcadores de captura diferentes. Después de la incubación a la temperatura y el tiempo deseados para permitir la degradación eficiente del polinucleótido y de la molécula sensible a p-lactamasa, se dispensa la mezcla de ensayo en el lecho de muestra del dispositivo de flujo lateral. Posteriormente, se transporta el fluido de muestra al lecho de conjugado, en el que se dispensó previamente la molécula indicadora. Esta molécula indicadora se modificó con una molécula de captura (por ejemplo, anticuerpo anti-digoxigenina) que reconoce uno de los marcadores de captura del polinucleótido (por ejemplo, digoxigenina) y opcionalmente la molécula sensible a p-lactamasa. A continuación, la mezcla de ensayo y la molécula indicadora se transportan a la membrana en la que está(n) situada(s) la(s) línea(s) de prueba y se inmoviliza la molécula de captura para detectar cada uno de los restos. A este respecto, debe usarse una línea de prueba (la línea de prueba de nucleasa) para poner en práctica el primer método de la invención y deben usarse al menos dos líneas de prueba (la línea de prueba de nucleasa y la línea de prueba de p-lactamasa) para poner en práctica el segundo método de la invención. En cuanto a la primera, se indica de nuevo que ambas moléculas de captura inmovilizadas en cada línea de prueba deben ser diferentes para diferenciar claramente la actividad nucleasa de la actividad plactamasa en el momento de poner en práctica el segundo método de la invención. Si la actividad nucleasa está presente en la muestra, la molécula de captura presente en la línea de prueba de nucleasa detectará un fragmento del polinucleótido que se funcionalizó con el segundo marcador de captura (por ejemplo, biotina), sin señal visible. Asimismo, si la actividad p-lactamasa está presente en la muestra, la molécula de captura presente en la línea de prueba de p-lactamasa detectará el fragmento de la molécula sensible a p-lactamasa que se funcionalizó con el marcador de captura adicional diferente de la segunda molécula de captura, sin señal visible. Si está ausente la actividad nucleasa, la segunda molécula de captura detectará el polinucleótido biotinilado junto con la molécula indicadora y, por tanto, proporcionará una señal de lectura que puede evaluarse a simple vista. Una representación esquemática de este sistema se proporciona en la figura 2 y la figura 8.

4. Método de detección visual. Tras la incubación, se usa la mezcla de ensayo en cada uno de los sistemas descritos anteriormente tal como se detalla a continuación.

En cuanto al primer sistema, la mezcla de ensayo usada una vez incubada se coloca en el lecho de muestra del sistema de flujo lateral. A continuación, se transporta el fluido de muestra a la membrana y la molécula de captura inmovilizada en la(s) línea(s) de prueba (por ejemplo, anticuerpo anti-biotina) reconocerá (cada uno) de los marcadores de captura situado en uno de los extremos de la sonda de polinucleótido y opcionalmente la molécula sensible a plactamasa. Si está presente la actividad nucleasa, la molécula de captura detectará un fragmento del polinucleótido que se funcionalizó con el marcador de captura, sin señal visible. Si está ausente la actividad nucleasa, la molécula de captura capturará el polinucleótido biotinilado junto con la molécula indicadora y, por tanto, proporcionará una señal de lectura que puede evaluarse a simple vista. La determinación de la presencia o ausencia de actividad B-lactamasa se determina dentro del mismo dispositivo de flujo lateral de manera similar a la manera mediante la cual se determina la actividad nucleasa ya explicada a lo largo de la presente memoria descriptiva.

Este sistema proporcionará una señal de lectura que puede evaluarse a simple vista.

En cuanto al segundo sistema, la mezcla de ensayo usada una vez incubada se coloca en el lecho de muestra del sistema de flujo lateral y posteriormente se mezcla con el lecho de conjugado, en el que se dispensó previamente la molécula indicadora. A continuación, el fluido de muestra se transporta a la membrana y el marcador de captura inmovilizado en la(s) línea(s) de prueba reconocerá los marcadores de captura situados en uno de los extremos de la sonda de polinucleótido y opcionalmente la molécula sensible a p-lactamasa. A este respecto, debe usarse una línea de prueba (la línea de prueba de nucleasa) para poner en práctica el primer método de la invención y al menos dos líneas de prueba (la línea de prueba de nucleasa y la línea de prueba de B-lactamasa) deben usarse para poner en práctica el segundo método de la invención. En cuanto a la primera, se indica de nuevo que ambas moléculas de captura inmovilizadas en cada línea de prueba deben ser diferentes para diferenciar claramente la actividad nucleasa de la actividad B-lactamasa en el momento de poner en práctica el segundo método de la invención. Si está presente la actividad nucleasa en la muestra, la molécula de captura presente en la línea de prueba de nucleasa detectará un fragmento del polinucleótido que se funcionalizó con el segundo marcador de captura (por ejemplo, biotina), sin señal visible. Asimismo, Si la actividad B-lactamasa está presente en la muestra, la molécula de captura presente en la línea de prueba de B-lactamasa detectará el fragmento de la molécula sensible a p-lactamasa que se funcionalizó con el marcador de captura adicional diferente de la segunda molécula de captura, sin señal visible. Si está ausente la actividad nucleasa, la segunda molécula de captura detectará el polinucleótido biotinilado junto con la molécula indicadora y, por tanto, proporcionará una señal de lectura que puede evaluarse a simple vista.

Por tanto, una mezcla de ensayo en la que el sustrato permanece intacto proporcionará una señal de prueba y aparecerá de manera visual. Una mezcla de ensayo en la que el sustrato se ha escindido no proporcionará una señal de prueba y aparecerá de manera visual transparente u oscura (sin color). El método de detección visual se destina principalmente a su uso como ensayo cualitativo de nucleasa, siendo los resultados simplemente o bien “positivo” o bien “negativo”.

La mezcla de ensayo constituirá de manera ideal un volumen relativamente pequeño, por ejemplo, de 10 |il a 1000 |il aunque pueden emplearse volúmenes mayores o menores. Los volúmenes pequeños permiten mantener altas concentraciones de sustrato, pero conserva el uso de sustrato. En una realización, el ensayo de detección visual usa 50 pmoles de sustrato a una concentración de 0,5 |iM en un volumen final de 100 |il de mezcla de ensayo. Una concentración menor de sustrato (por ejemplo, por debajo de 0,1 pM) disminuirá la sensibilidad del ensayo. Concentraciones mayores de sustrato (por ejemplo, por encima de 1 |iM) aumentarán el fondo y consumirán sustrato de manera innecesaria.

La etapas (mezclado, incubación) pueden realizarse en uno tubo. En una realización, el tubo es un microtubo pequeño, de pared fina, transparente a radiación UV, aunque pueden usarse tubos de otra configuración.

Dispositivos y pruebas de flujo lateral

La presente invención divulga además dispositivos de flujo lateral y kits que contienen los mismos para detectar actividad nucleasa y opcionalmente actividad B-lactamasa en una muestra, que comprende ácido(s) nucleico(s) de sustrato, opcionalmente molécula sensible a p-lactamasa e instrucciones para su uso. Tales kits pueden contener opcionalmente uno o más de: una nucleasa de control positivo, agua libre de ADNasa/ARNasa, un tampón y otros reactivos.

Las pruebas de flujo lateral, también conocidas como pruebas de inmunocromatografía de flujo lateral (LFIC) o simplemente inmunoensayos de flujo lateral (LFI), son dispositivos pequeños simples destinados a detectar un analito objetivo en una muestra dada. Estas pruebas son simples, rápidas y económicas y no requieren equipos especializados y costosos ni personal cualificado. Aunque la tecnología LFIC nació a principios de los años 80, seguirá siendo un actor importante en las próximas décadas en la industria de las pruebas rápidas. Al comienzo, las pruebas de LFIC se usaron exclusivamente en diagnósticos médicos (ya sea para pruebas en el hogar, pruebas en el punto de atención o uso en laboratorio), pero su presencia en otras áreas es ahora muy común. La primera aplicación fue la conocida prueba de embarazo casera. Aunque varias pruebas semicuantitativas disponibles comercialmente, las pruebas de LFIC son principalmente pruebas cualitativas y simplemente proporcionan un resultado positivo o negativo basándose en la presencia o ausencia del analito objetivo en una concentración específica.

La tecnología se basa en una serie de lechos capilares con materiales porosos que tienen la capacidad de transportar líquidos de manera espontánea. Cuando el analito objetivo es grande (por ejemplo, una proteína) se usa habitualmente un formato de sándwich. Habitualmente, el primer elemento (el lecho de conjugado) ha almacenado los denominados coloides, un formato seco de partículas bioactivas (principalmente nanopartículas de oro o micropartículas de látex unidas a un anticuerpo específico contra el analito objetivo) en una matriz de sal-azúcar. Este lecho de conjugado actúa habitualmente también como lecho de muestra y contiene todo para facilitar el reconocimiento del antígeno diana por el coloide. Una vez que se empapa el lecho de conjugado por la muestra, el fluido disuelve la matriz de salazúcar y los coloides. Por tanto, la muestra y los coloides se mezclan mientras fluyen a través de la estructura porosa. De esta manera, el analito se une al coloide y el complejo se transporta a la membrana nitrocelulosa. Este material tiene un área específica denominada línea de prueba en la que se ha inmovilizado una tercera molécula (habitualmente otro anticuerpo diferente contra el analito objetivo). Cuando el complejo (coloide-antígeno) alcanza la línea de prueba se une a este anticuerpo y después de un tiempo, cuando ha fluido más y más fluido, se acumulan los coloides y la línea de prueba adquiere color. Normalmente, también existe una línea de control (después de la línea de prueba) que captura los coloides que no se han unido a la línea de prueba. En la línea de control, se adsorbe una cuarta molécula (podría ser un anticuerpo contra la fracción Fc del primer anticuerpo) y su adquisición de color asegura la funcionalidad de la prueba. Después de pasar por estas zonas de reacción el fluido entra en el material poroso final, la guía o desagüe que actúa simplemente como recipiente de desechos.

Para poner en práctica la presente invención, podrían usarse una gran variedad de dispositivos de sistema de flujo lateral diferentes, sin embargo, dos dispositivos, a los que la presente invención no se limita, se proporcionan en el presente documento simplemente con fines ilustrativos:

Un primer dispositivo de flujo lateral que comprende un soporte adecuado para flujo lateral, que a su vez comprende:

a1. una placa de soporte; y

a2. un lecho de muestra, una membrana y un lecho de absorción capilar, todos ellos encima del lecho de soporte, en el que la membrana está situada después del lecho de muestra de manera que la muestra fluye desde el lecho de muestra hasta la membrana, en el que la membrana comprende una línea de prueba que a su vez comprende moléculas inmovilizadas en la línea de prueba para capturar la molécula de captura de la secuencia de polinucleótido, y opcionalmente una segunda línea de prueba, para poner en práctica el segundo método de la invención, que a su vez comprende moléculas inmovilizadas en dicha segunda línea de prueba para capturar la molécula de captura de las moléculas sensibles a p-lactamasa, en el que las moléculas inmovilizadas en la línea de prueba son diferentes de las inmovilizadas en la segunda línea de prueba ya que las moléculas de captura de las moléculas sensibles a plactamasa y de la secuencia de polinucleótido deben diferir entre sí, y en el que el lecho de absorción capilar está situado en el extremo de la membrana.

Un segundo dispositivo de flujo lateral que comprende un soporte adecuado para flujo lateral, que a su vez comprende:

a1. una placa de soporte; y

a2. un lecho de muestra, una membrana y un lecho de absorción capilar, todos ellos encima del lecho de soporte, en el que la membrana está situada después del lecho de muestra de manera que la muestra fluye desde el lecho de muestra hasta la membrana, en el que la membrana comprende una línea de prueba que a su vez comprende moléculas inmovilizadas en la línea de prueba para capturar la molécula de captura de la secuencia de polinucleótido, y opcionalmente una segunda línea de prueba, para poner en práctica el segundo método de la invención, que a su vez comprende moléculas inmovilizadas en dicha segunda línea de prueba para capturar la molécula de captura de las moléculas sensibles a p-lactamasa, en el que el lecho de absorción capilar está situado en el extremo de la membrana, en el que las moléculas inmovilizadas en la línea de prueba son diferentes de las inmovilizadas en la segunda línea de prueba ya que las moléculas de captura de las moléculas sensibles a p-lactamasa y de la secuencia de polinucleótido deben diferir entre sí;

y en el que el soporte comprende además un lecho de conjugado entre el lecho de muestra y la membrana, que a su vez comprende una molécula indicadora.

Además, un kit de la invención incluye un sustrato universal. El kit se destina a detectar la actividad nucleasa de una o de una variedad de fuentes. El kit incluye además un dispositivo de flujo lateral, en particular un dispositivo de flujo lateral tal como se ilustró anteriormente. En determinadas realizaciones, el sustrato se proporcionará en forma seca en microtubos individuales, de pared fina, transparentes a radiación UV, o en formatos multipocillo (por ejemplo, 96 pocillos) adecuados para procedimientos de alto rendimiento. El sustrato liofilizado tiene una estabilidad a largo plazo mejorada en comparación con una disolución líquida en agua o tampón. Si se proporciona en disolución líquida, la estabilidad se mejora con almacenamiento al menos por debajo de -20°C., tal como a -80°C. El almacenamiento en alícuotas individuales limita el potencial de contaminación con nucleasas ambientales. Alternativamente, el sustrato puede proporcionarse a granel, o bien liofilizado o bien en disolución líquida. Alternativamente, el sustrato puede proporcionarse a granel y dispersarse a la discreción del usuario.

Los siguientes ejemplos sirven simplemente para ilustrar la presente invención y no limitan la misma.

Ejemplos

Ejemplo 1. DETECCIÓN DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS MEDIANTE FLUJO LATERAL (prototipo A)

La identificación de un microorganismo dado (por ejemplo, Staphylococcus aureus) o un tipo de célula (por ejemplo, célula de cáncer de mama) es ahora posible aprovechando la actividad nucleasa específica ejercida por los microorganismos/células o tejido mencionados. La identificación y/o el diseño de sondas de ácido nucleico específicas que se degradan por la célula o microorganismo diana, pero no por el resto de microorganismos/tipos de célula son críticos.

Se han desarrollado tiras de LFPC específicas que pueden detectar sondas de ácido nucleico no degradadas en una muestra dada. Por consiguiente, la presencia de una sonda de ácido nucleico dará como resultado una línea de prueba coloreada. Por otro lado, si una nucleasa específica está presente en la muestra, producirá de manera eventual una degradación completa de la sonda de ácido nucleico y, por consiguiente, no se observará ninguna línea de prueba.

Material y métodos.

La conjugación de sonda de polinucleótido y partículas de látex y las tiras se prepararon tal como se describe en el esquema 1. El protocolo para el prototipo A fue de la siguiente manera:

La mezcla de ensayo contiene: 100 |il de muestra y 20 |il de TT Probe* (800 fmol) diluido en PBS /+

*TT Probe (SEQ No 1 o SEQ No 2) se modificó con un grupo amina en el extremo 5' y una biotina en el extremo 3'. Se usó el grupo amina para acoplar con las nanopartículas de látex y la biotina como marcador detectado por la molécula de captura (anticuerpo anti-biotina) inmovilizada en la línea de prueba.

Luego se incubó la mezcla de ensayo a 37°C durante 1 hora en un tubo de 1,5 ml. A continuación, se colocó una tira dentro del tubo de 1,5 ml. Después de 10 minutos, se retire la tira del tubo y se visualizó la señal de detección.

Resultados

Como prueba de concepto, se incubaron muestras de sobrenadantes de Staphylococcus aureus (SA) y sobrenadantes de Staphylococcus epidermidis (Epi) con el prototipo de polinucleótido descrito en la figura 1. En resumen, se funcionalizó la molécula indicadora (nanopartícula de látex/oro) con la sonda de polinucleótido usando uno de los extremos, a través de acoplamiento de aminas. El otro extremo de la sonda de polinucleótido se modificó con biotina. Se incubó este reactivo con cultivos de S. aureus y S. epidermidis tal como se describió anteriormente en la sección de métodos. A continuación, se dispensó la mezcla de ensayo en el lecho de muestra del dispositivo de flujo lateral, con un transporte posterior de la mezcla a la membrana. En la línea de prueba, se inmovilizó el anticuerpo anti-biotina para capturar la sonda de polinucleótido. Tal como se muestra en la figura 3, se observó una señal visible en rojo para las muestras de S. epidermidis. Estos resultados sugirieron que las sondas de polinucleótido no se escindieron y la molécula indicadora se retuvo en la línea de prueba, indicando la ausencia de actividad nucleasa. En cambio, las muestras de S. aureus han indicado una señal no visible en la línea de prueba, indicando la presencia de actividad nucleasa como consecuencia de la degradación de las sondas de polinucleótido. Estos resultados se observaron a simple vista por duplicado. En conjunto, estos resultados confirman que la actividad nucleasa derivada de las bacterias puede evaluarse usando un análisis de flujo lateral y que la sonda de polinucleótido se integró de manera exitosa en este sistema de detección proporcionando detección específica de S. aureus.

Ejemplo 2. DETECCIÓN DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS MEDIANTE EL PROTOTIPO B:

El ejemplo previo demuestra la identificación exitosa de bacterias usando sondas de polinucleótido y un dispositivo de flujo lateral. Para explorar otras alternativas para detectar bacterias, células o tejidos de mamífero, se ha descrito otro prototipo en el que la sonda de polinucleótido no se funcionaliza sobre la superficie de la molécula indicadora. Se espera que en algunas realizaciones este sistema pueda ser más eficiente, debido a que la sonda de polinucleótido puede ser más fácilmente accesible para la degradación por nucleasa.

Para ejemplificar lo anterior, se creó un sistema que detectará cualquier sonda de ácido nucleico modificada con digoxigenina en un extremo y biotina en el otro extremo. La clave del sistema es la producción de un tira específica de LFPC en la que se adsorbe un anticuerpo anti-biotina en la línea de prueba y se seca un coloide específico, con anticuerpo anti-digoxigenina conjugado en la superficie de una micropartícula de látex, en el lecho de conjugado. Un esquema de dicha tira de LFPC anterior se representa junto con una sonda de ácido nucleico conjugada con biotina y digoxigenina en la figura 2.

La siguiente prueba tiene como objetivo detectar Staphylococcus aureus usando una sonda de ácido nucleico específica y modificada (la denominada TT Probe). Sin embargo, y tal como se mencionó anteriormente, estas tiras de LFPC permiten la detección de cualquier sonda de ácido nucleico específica (una sonda de ADN conjugada con digoxigenina y biotina en sus extremos). Por tanto, la detección de cualquier microorganismo o tipo de célula es ahora posible modificando simplemente la secuencia de las sondas de ADN mencionadas (ya que cada sonda de ADN selecciona como diana una nucleasa específica de un microorganismo o tipo de célula específicos).

2.1 Materiales y métodos

Se prepararon las tiras tal como se describe en el esquema 2, y el protocolo para el prototipo B fue de la siguiente manera:

Se usó la cepa ATCC 15981 de Staphylococcus aureus para validar estos experimentos, junto con tampón y otras bacterias de control (Staphylococcus epidermidis). La mezcla de ensayo abarca los siguientes componentes: 1,6 |il de Tris 100 mM pH 8,0, 1,6 |il de CaCh 1000 mM en agua, 155,8 |il de muestra y 1 |il de TT Probe* o sonda de control** 250 fmol/|il

Se modificaron la TT Probe* (SEQ No 1, SEQ No 2) o la sonda de control** (SEQ No 3) con dos marcadores de captura, un grupo digoxigenina en el extremo 5' y una biotina en el extremo 3'. Se usó el marcador de digoxigenina para unir a la sonda de captura (anticuerpo anti-digoxigenina) inmovilizada sobre las nanopartículas de látex, y se usó el marcador de biotina como el marcador detectado por la molécula de captura (anticuerpo anti-biotina) inmovilizada en la línea de prueba.

Se colocaron las mezclas de ensayo en tubos de 1,5 ml, que se incubaron durante 30 minutos (o indicado de otra manera) at 37°C en un horno. Luego, se transfirieron las disoluciones de incubación a una placa de microtitulación y se colocó una tira de LFPC en cada uno de los pocillos durante 10 minutos. Finalmente, se retiraron las tiras de la placa de microtitulación, y se midieron las líneas de prueba usando un lector de bandas Qiagen y se tomaron imágenes.

1.1. Resultados

Para comprobar la viabilidad del segundo prototipo se sometieron a prueba la funcionalidad y la especificidad del presente enfoque. Para este propósito, se usó la TT Probe mencionada y se sometieron a prueba varias muestras: sobrenadante de S. aureus y sobrenadante de S. epidermidis como bacterias de control, junto con medios de cultivo TSB y agua. Tal como se muestra en la figura 4, sólo las muestras de S. aureus fueron capaces de degradar la sonda y no se observó ninguna banda (1) a simple vista. En cambio, las muestras de S. epidermidis (2), TSB (3) y agua (4) han mostrado una banda roja visible que indica la ausencia de actividad nucleasa. Luego, se buscó evaluar la especificidad de la sonda de polinucleótido sometiendo a prueba una sonda de ácido nucleico resistente a actividad nucleasa (denominada sonda de control, que tiene todos los nucleótidos modificados con 2'-O-metilo). La figura 4 ha mostrado una banda visible para ambos cultivos: sobrenadante de S. aureus (5) y sobrenadante de S. epidermidis (6), confirmando que sólo sondas de polinucleótido específicas (por ejemplo, TT Probe) pueden digerirse por cultivos de S. aureus. Estos datos confirman la utilidad de sondas de polinucleótido y sistema de flujo lateral específicos para la detección dirigida de muestras de bacterias.

A continuación, se evaluó la sensibilidad del prototipo B. Para ello, se sometieron a prueba cultivos de S. aureus usando muestras sin diluir (und) y diluciones en serie de 10 veces desde 10-1 hasta 10-6, tal como se indica en la tabla y la imagen de la figura 5. Después de la incubación y el procesamiento de las muestras tal como se indica en la sección de métodos, se tomaron la adquisición del lector de bandas para el análisis cuantitativo e imágenes. Estos resultados han demostrado que pueden detectarse diluciones de hasta 10-5 mediante este prototipo, lo que demuestra una alta sensibilidad para detectar la actividad nucleasa derivada de bacterias en un modo de flujo lateral. Luego, se completaron los estudios de especificidad usando 12 bacterias diferentes (figura 6, 1 a 12), junto con los medios de cultivo TSB (14) y LB (15). La figura 6 muestra la cuantificación de cada cultivo sometido a prueba y su imagen respectiva. Sólo los cultivos de S. aureus han informado de un valor de 0 usando la detección de lector de bandas, y ninguna banda visible en la imagen. En cambio, todas las otras muestras de cultivos de bacterias y medios de cultivo han informado valores que oscilan entre 150 y 400 unidades arbitrarias mediante el lector de bandas y las bandas visibles en la imagen. Estos resultados confirman que el prototipo B es muy sensible y específico y, por tanto, proporciona un nuevo método para detectar bacterias usando un análisis de flujo lateral.

Finalmente, se optimizó el tiempo necesario para obtener resultados fiables en el sistema de flujo lateral. Se redujo el tiempo de detección a 10 y 20 minutos y se evaluaron varias diluciones de cultivos de S. aureus. Tal como se indica en la tabla y las imágenes de la figura 7, reduciendo el tiempo a 10 y 20 min respectivamente, existe también una reducción de sensibilidad. Sin embargo, fue posible la detección de dilución 10-4 para ambos puntos de tiempo, lo que sugiere que el tiempo de reacción puede optimizarse dependiendo de la aplicación final.

Ejemplo 3. Prueba de concepto de la molécula sensible a B-lactamasa.

Metodología

La resonancia magnética nuclear de protón (1H-RMN) es la aplicación de resonancia magnética nuclear en espectroscopia RMN con respecto a los núcleos de hidrógeno-1 dentro de las moléculas de una sustancia, para determinar la estructura de sus moléculas. Se registraron los espectros de RMN en espectrómetros AVD 500 de Bruker a temperatura ambiente. En dmso-d6, se referenciaron los espectros de 1H-RMN a la señal residual de disolvente. Los desplazamientos químicos se citan en ppm y las constantes de acoplamiento en Hz.

La cromatografía de líquidos-espectrometría de masas (CL-EM) es una técnica química analítica que combina las capacidades de separación física de la cromatografía de líquidos con las capacidades de análisis de masas de la espectrometría de masas (EM). La CL (cromatografía de líquidos) separa mezclas con múltiple componentes, la EM (espectrometría de masas) proporciona identidad estructural de los componentes individuales con alta especificidad molecular y sensibilidad de detección.

Resultados

La viabilidad de la molécula sensible a p-lactamasa se sometió a prueba mediante dos técnicas independientes, en las que se validó la escisión de la molécula sensible a p-lactamasa basándose en la actividad enzimática de plactamasas.

(6R,7R)-3-(((4-benzamidofenil)tio)metil)-8-oxo-7-(2-fenilacetamido)-5-tia-1-azabiciclo[4.2.0]oct-2-eno-2-carboxilato de 4-metoxibencilo (producto de partida) es una molécula sensible a p-lactamasa truncada que actúa como sustrato para B-lactamasas (BL), generando esta escisión un producto hidrolizado. El mecanismo por el cual las BL inactivan los antibióticos betalactámicos es a través de la hidrólisis del anillo betalactámico por un residuo de serina en el sitio activo de la enzima. Después de la transposición de la nueva amina formada, se elimina un posible grupo saliente en la posición C-3' durante la reacción enzimática.

Para comprobar esta reacción enzimática, se han usado dos métodos analíticos, 1H-RMN (resonancia magnética nuclear de protón) y CL-EM (cromatografía de líquidos-espectrometría de masas).

En ambas técnicas, el producto de partida (molécula sensible) se escindió en presencia de p-lactamasas, indicando la viabilidad de esta estrategia para detectar resistencia antimicrobiana. En la figura 32, se presenta un dibujo esquemático del producto de partida y el producto hidrolizado generado por las acciones de las p-lactamasas. La caracterización de tal reacción se llevó a cabo mediante 1H-RMN y CL-EM. La figura 33 muestra los espectros de RMN de los productos de partida e hidrolizado. Mediante el uso del método de RMN, se demostró que el desplazamiento del metileno situado en la posición 3' (representada como un asterisco en la molécula sensible a plactamasa), después del tratamiento con p-lactamasas. A continuación, también se confirmó la actividad p-lactamasa mediante CL-EM. La figura 33, muestra los cromatogramas de ambos productos, A) de partida y B) hidrolizado. La figura 3C, complementa los hallazgos informando el análisis de espectrometría de masas del producto hidrolizado. La figura 34 ilustra cómo esta nueva molécula sensible p-lactamasa puede incorporarse en un sistema de flujo lateral. En la ausencia de p-lactamasas, no está presente ninguna reacción y se observa una línea visual (línea 1 en la imagen). Por otro lado, en presencia de p-lactamasas, la molécula sensible se hidroliza y no se observa ninguna línea (línea 1). Además, también está presente una línea de control (C) para validar el ensayo de flujo lateral.

En conjunto, esta evidencia demuestra la viabilidad de la molécula sensible a p-lactamasa que va a usarse como estrategia de detección para identificar resistencia antimicrobiana basada en p-lactamasas, y este enfoque tiene un gran potencial para integrarse en dispositivos de flujo lateral.

Claims

REIVINDICACIONES

i. Método para detectar bacterias y su resistencia al tratamiento con antibióticos betalactámicos en una muestra de prueba, que comprende: 1) incubar en la muestra de prueba, un sustrato sintético o una mezcla de sustratos para detectar la presencia de una bacteria, y 2) simultánea o posteriormente, establecer la resistencia de la bacteria al tratamiento con antibióticos betalactámicos incubando en la muestra de prueba una molécula sensible a p-lactamasa, durante un tiempo suficiente para la escisión de la molécula sensible a P-lactamasa por una p-lactamasa; en el que

a. el/los sustrato(s) comprende(n) una molécula de ácido nucleico monocatenario que contiene al menos un ribonucleótido o desoxirribonucleótido o residuo de nucleótido químicamente modificado en una posición interna que funciona como un sitio de escisión de nucleasa, un marcador de captura en un extremo y i) una molécula indicadora o ii) un marcador de captura adicional capaz de unirse a la molécula indicadora situada en el lecho de conjugado de un soporte de un dispositivo de flujo lateral, en el otro extremo; y en el que

b. la molécula sensible a p-lactamasa comprende un compuesto que comprende un anillo betalactámico, preferiblemente un antibiótico betalactámico seleccionado de la lista que consiste en derivados de penicilina (penámicos), cefalosporinas (cefémicos), monobactámicos y carbapenémicos, más preferiblemente meticilina, un marcador de captura en un extremo y i) una molécula indicadora o ii) un marcador de captura adicional capaz de unirse a la molécula indicadora situada en el lecho de conjugado de un soporte de un dispositivo de flujo lateral, en el otro extremo.
2. Método según la reivindicación 1, en el que el resultado se detecta preferiblemente de manera visual, en particular si el/los sustrato(s) y la molécula sensible a p-lactamasa se han escindido o no por una muestra de prueba, usando un dispositivo de flujo lateral o uniendo los complejos formados por el/los sustrato(s) y la molécula sensible a p-lactamasa después de la incubación a un soporte sólido que facilita técnicas de inmunoensayo tales como un ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA), un radioinmunoensayo (RIA), un ensayo inmunorradiométrico (IRMA), un inmunoensayo fluorescente (FIA), un inmunoensayo quimioluminiscente (CLIA), un inmunoensayo basado en perlas magnéticas (MBI) o un inmunoensayo electroquimioluminiscente (ECL).
3. Método según la reivindicación 1, en el que el resultado se detecta preferiblemente de manera visual, en particular si el/los sustrato(s) y la molécula sensible a p-lactamasa se han escindido o no por una muestra de prueba, usando un dispositivo de flujo lateral.
4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha molécula sensible a p-lactamasa comprende (6R,7R)-3-(((4-benzamidofenil)tio)metil)-8-oxo-7-(2-fenilacetamido)-5-tia-1-azabiciclo[4.2.0]oct-2-eno-2-carboxilato de 4-metoxibencilo, que es una molécula sensible a p-lactamasa truncada (sonda de CE), o ácido (6S,7S)-7-(((3',6'-dihidroxi-3-oxo-3H-espiro[isobenzofuran-1,9'-xanten]-6-ilcarbonil)oxi)amino)-8-oxo-3-(((4-(5-((3aR,4R,6aS)-2-oxohexahidro-1H-tieno[3,4-d]imidazol-4-il)pentanamido)fenil)tio)metil)-5-tia-1-azabiciclo[4.2.0]oct-2-eno-2-carboxílico (FAM-sonda de cE-biotina), o ácido (6S,7S)-7-(5-(((3S,5R,8R,9S,10S,12R,13S,14S,17R)-12,14-dihidroxi-10,13-dimetil-17-(5-oxo-2,5-dihidrofuran-3-il)hexadecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-il)oxi)-5-oxopentanamido)-8-oxo-3-(((4-(5-((3aR,4R,6aS)-2-oxohexahidro-1H-tieno[3,4-d]imidazol-4-il)pentanamido)fenil)tio)metil)-5-tia-1-azabiciclo[4.2.0]oct-2-eno-2-carboxílico (digoxigenina-sonda de CE-biotina).
5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el marcador de captura del/de los sustrato(s) y/o la molécula sensible a p-lactamasa se selecciona de la lista que consiste en biotina, FITC, FAM, digoxigenina, DNP (dinitrofenilo), rojo Texas, TAMRA o cualquier otro antígeno pequeño.
6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la molécula indicadora del/de los sustrato(s) y/o la molécula sensible a p-lactamasa se selecciona de la lista que consiste en nanopartículas de látex y oro, partículas de carbono o cualquier otra molécula indicadora colorimétrica.
7. Sistema que comprende:

a. un sustrato sintético o una mezcla de sustratos para detectar la presencia de una bacteria y la molécula sensible a p-lactamasa para establecer la resistencia de la bacteria a antibióticos betalactámicos y moléculas sensibles a p-lactamasa; en el que

a1. el/los sustrato(s) comprende(n) una molécula de ácido nucleico monocatenario que contiene al menos un ribonucleótido o desoxirribonucleótido o residuo de nucleótido químicamente modificado en una posición interna que funciona como sitio de escisión de nucleasa, un marcador de captura en un extremo y i) una molécula indicadora o ii) un marcador de captura adicional capaz de unirse a la molécula indicadora situada en el lecho de conjugado de un soporte de un dispositivo de flujo lateral, en el otro extremo; y en el que a2. la molécula sensible a p-lactamasa comprende un compuesto que comprende un anillo betalactámico, preferiblemente un antibiótico betalactámico seleccionado de la lista que consiste en derivados de penicilina (penámicos), cefalosporinas (cefémicos), monobactámicos y carbapenémicos, más preferiblemente meticilina, un marcador de captura en un extremo y i) una molécula indicadora o ii) un marcador de captura adicional capaz de unirse a la molécula indicadora situada en el lecho de conjugado de un soporte de un dispositivo de flujo lateral, en el otro extremo;

b. un soporte adecuado para flujo lateral que comprende:

b1. una placa de soporte; y

b2. un lecho de muestra, una membrana y un lecho de absorción capilar, todos ellos encima del lecho de soporte, en el que la membrana está situada después del lecho de muestra de manera que la muestra fluye desde el lecho de muestra hasta la membrana, en el que la membrana comprende al menos dos líneas de prueba que a su vez comprenden respectivamente moléculas inmovilizadas en cada línea de prueba para capturar el marcador de captura de la(s) secuencia(s) de polinucleótido y para capturar el marcador de captura de las moléculas sensibles a p-lactamasa, y en el que el lecho de absorción capilar está situado en el extremo de la membrana.
8. Sistema según la reivindicación 7, en el que la membrana comprende además una línea de control.
9. Sistema que comprende:

a. un sustrato sintético o una mezcla de sustratos para detectar la presencia de una bacteria y la molécula sensible a p-lactamasa para establecer la resistencia de la bacteria a antibióticos betalactámicos y moléculas sensibles a p-lactamasa, en el que a1. el/los sustrato(s) comprende(n) una molécula de ácido nucleico monocatenario que contiene al menos un ribonucleótido o desoxirribonucleótido o residuo de nucleótido químicamente modificado en una posición interna que funciona como sitio de escisión de nucleasa, un marcador de captura en un extremo y i) una molécula indicadora o ii) un marcador de captura adicional capaz de unirse a la molécula indicadora situada en el lecho de conjugado de un soporte de un dispositivo de flujo lateral, en el otro extremo; y en el que a2. la molécula sensible a p-lactamasa comprende un compuesto que comprende un anillo betalactámico, preferiblemente un antibiótico betalactámico seleccionado de la lista que consiste en derivados de penicilina (penámicos), cefalosporinas (cefémicos), monobactámicos, y carbapenémicos, más preferiblemente meticilina, un marcador de captura en un extremo y i) una molécula indicadora o ii) un marcador de captura adicional capaz de unirse a la molécula indicadora situada en el lecho de conjugado de un soporte de un dispositivo de flujo lateral, en el otro extremo, y en el que el/los sustrato(s) y las moléculas sensibles a p-lactamasa comprenden dos moléculas de captura en cada extremo de las moléculas, y en el que una de las moléculas de captura es capaz de unirse a la molécula indicadora situada en el lecho de conjugado del soporte; y

b. un soporte adecuado para flujo lateral que comprende:

b1. una placa de soporte; y

b2. un lecho de muestra, una membrana y un lecho de absorción capilar, todos ellos encima del lecho de soporte, en el que la membrana está situada después del lecho de muestra de manera que la muestra fluye desde el lecho de muestra hasta la membrana, en el que la membrana comprende al menos dos líneas de prueba que a su vez comprenden respectivamente moléculas inmovilizadas en cada línea de prueba para capturar el marcador de captura de la(s) secuencia(s) de polinucleótido y para capturar el marcador de captura de las moléculas sensibles a p-lactamasa, en el que el lecho de absorción capilar está situado en el extremo de la membrana,

y en el que el sistema comprende además un lecho de conjugado entre el lecho de muestra y la membrana, que a su vez comprende una molécula indicadora.
10. Sistema según la reivindicación 9, en el que la membrana comprende además una línea de control.
11. Sistema según cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8, o sistema según cualquiera de las reivindicaciones 9 ó 10, en el que el sistema comprende un soporte para incubar una muestra biológica y el sustrato sintético o la mezcla de sustratos y las moléculas sensibles a p-lactamasa.
12. Sistema según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, en el que la molécula sensible a p-lactamasa es según la reivindicación 4.
13. Uso del sistema según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, para detectar simultáneamente bacterias y su resistencia a antibióticos betalactámicos tales como meticilina en una muestra de prueba.
14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el método comprende además el uso de un sustrato sintético o una mezcla de sustratos para detectar la presencia de células cancerosas de mamífero en la muestra de prueba y/o la resistencia a un tratamiento contra el cáncer.