KR101337046B1 - 안지오제닌을 포함하는 건성안 진단용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 건성안 진단 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 안지오제닌(angiogenin)을 포함하는 건성안 진단용 바이오마커 조성물, 건성안 진단용 키트 및 건성안 진단 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 건성안 환자의 눈물에서 특이적으로 발현이 감소하는 안지오제닌(angiogenin)을 이용하여 특이적으로 건성안 정도를 진단하거나 예후를 판정할 수 있다.

Description

안지오제닌을 포함하는 건성안 진단용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 건성안 진단 방법 {Biomarker Composition for Diagnosis of Xerophthalmia Comprising Angiogenin, and Method for Diagnosis of Xerophthalmia Using the same}

본 발명은 안지오제닌을 포함하는 건성안 진단용 바이오마커 조성물, 건성안 진단용 키트 및 건성안 진단 방법에 관한 것이다.

건성안(xerophthalmia)이란 눈물의 과다증발 및 눈물의 생성부족으로 안구표면에 문제(결막 및 각막의 손상으로 이물감, 작열감 등의 일련의 증상과 심하면 시력의 저하를 유발)를 유발하는 질환이다. 이런 건성안은 안검염으로 인한 증발가능형 그리고 누액(눈에서 생성되는 눈물)의 부족으로 올수 있으나 대부분의 경우 두 가지가 중복되는 현상이 지배적이다.　

2007년 Dry Eye Workshop (DEWS)에서는 건성안을 ‘눈의 불편감 및 시력 장애, 그리고 안구 표면에 손상을 줄 수 있는 눈물층의 불안정성을 일으키는 눈물층과 안구 표면의 복합적인 질환으로 정의하고 있다.

건성안의 평가 방법들을 살펴보면, 눈물막 파괴시간은 눈물막의 불안정성에 영향을 미치는 요소 중 눈물의 증발 정도와 직접적으로 연관성 있는 검사이다. 눈물막 파괴 시간은 Norn에 의해 제안되었으며, 건성안 진단에 있어 형광눈물막 파괴시간은 신뢰성 및 재현성이 높은 검사이다. 하지만 이는 검사자의 주관이 개입되어 검사자에 따른 차이를 보인다는 단점이 있다. 또한 눈물 생성의 부족을 평가하기 위해 사용되는 것으로 쉬르머 검사가 있다. 그러나 점안 마취제를 사용하지 않은 쉬르머 검사는 검사지의 말단에 의해 발생되는 이물감에 의해 잔여 눈물량 외에 반사 눈물의 생성량이 더해진다. 그리고 쉬르머 검사는 5분이라는 비교적 긴 검사 시간이 소요되며, 이로 인한 반사성 눈물 생성도 증가된다. 쉬르머 검사에서 마취제를 사용한다고 해도 이물감에 의한 반사성 눈물은 일부 발생되며, 이는 마취되지 않은 속눈썹, 눈꺼풀테두리에 의한 자극 때문이다. 따라서 쉬르머 검사는 순수한 눈물 생성 부족을 평가하는 데 있어서는 한계가 있으며, 검사의 재현성이 낮고, 건성안의 진단에 있어 민감도가 낮다는 문제가 있다.

이에 따라 이전에 눈물의 삼투압 (osmolarity) 측정과 라이소자임 (lysozyme) 진단 키트 등이 나와 있으나 이는 건성안이 있으면 감소하는 일반적 증상으로 확진을 위한 진단을 조금 도와주는 정도이고, 어떤 성분이 부족한 것인지 알아내는 것은 제한이 있어 맞춤형 진단 및 치료가 어렵다는 문제점이 있다.

안지오제닌 (Angiogenin)은 안과 분야에서 아직 많이 연구되지 않은 물질로 혈관내피성장인자 (VEGF)와 함께 혈관생성을 유발하는 분비성 단백질 중의 하나이다. 이는 리보 핵산 분해 효소(RNase)의 일종으로 특히 종양세포에서 성장과 혈관생성을 유발하는 것이 잘 알려져 있다. 또한 최근에는 근위축성 축삭경화증 (Amyotrophic lateral sclerosis, ALS)에 있어서 안지오제닌 유전자 변이가 그 발생에 관계가 있으며, 안지오제닌 투여를 통한 근위축성 축삭경화증과 파킨슨병 등의 퇴행성 신경계 질환(neurodegenerative diseases)에서 그 신경 보호 효과(neuroprotection)가 알려짐으로써 연구가 활발히 진행되고 있다.

그러나 현재까지 안지오제닌과 건성안의 관계에 관한 연구는 구체적으로 수행된 바 없는 실정이며, 국내 공개특허공보 10-2006-0077374호 또한 건성안의 진단을 위한 바이오마커 단백질을 개시하고 있으나, 안지오제닌에 대해서는 전혀 개시하고 있지 않다.

따라서 본 발명은 건성안을 정확하기 분자 진단할 수 있는 신규한 바이오마커 및 이의 검출을 위한 키트, 이를 이용한 건성안 진단 방법을 제공하고자 한다.

상기 과제의 해결을 위하여, 본 발명은 안지오제닌(angiogenin)을 포함하는 건성안 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 안지오제닌 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 포함하는 건성안 진단용 키트를 제공한다.

또한 본 발명은 눈물 내 안지오제닌을 검출하는 단계를 포함하는 건성안 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 건성안 환자의 눈물에서 특이적으로 발현이 감소하는 안지오제닌(angiogenin)을 이용하여 특이적으로 건성안 정도를 진단하거나 예후를 판정할 수 있다.

도 1은 인간 사이토카인 항체 어레이를 이용한 정상 및 건성안 환자(등급 1~2, 3, 및 4) 의 눈물 내 사이토카인 확인 결과이다.
도 2는 ELISA를 이용한 정상 및 건성안 환자(등급 1~2, 3, 및 4) 의 눈물 내 존재하는 락토페린(A) 및 안지오제닌(B)의 농도 측정 결과이다.

본 발명은 안지오제닌(angiogenin)을 포함하는 건성안 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.

본 발명의 발명자들은 건성안 환자의 눈물 내 존재하는 사이토카인을 기초로 건성안 진단 마커에 대해 연구하던 중, 건성안 환자의 중증도가 증가할수록 눈물 내 안지오제닌의 농도가 유의하게 감소한다는 점을 확인하였고, 이를 통해 건성안을 객관적으로 간편하게 진단할 수 있다는 점을 확인한 후 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 한 구체예에서, 상기 안지오제닌은 정상인의 눈물에서 보다 건성안 환자의 눈물에서 더 적게 발현되는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에서, 상기 바이오마커는 건성안의 발생 및 발전에 대한 지표가 될 수 있으며, 이에 따라 건성안의 발생 및 발전의 진단에 이용될 수 있다.

본 명세서에서 용어 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.

본 발명은 또한 안지오제닌 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 포함하는 건성안 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 안지오제닌은 눈물에 포함되어 있는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에서, 상기 항체는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다. 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan , CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다.

폴리클로날 항체는 단백질 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, 상기 건성안 진단용 키트는 면역분석용 키트일 수 있다.

상기 면역분석은 종래에 개발된 다양한 정량적 또는 정성적 면역분석 프로토콜에 따라 실시될 수 있다. 상기 면역분석 포맷은 효소면역분석법(ELISA), 방사능면역분석법(radioimmnoassay, RIA), 샌드위치 측정법(sandwich assay), 웨스턴 블롯팅, 면역침강법, 면역조직화학염색법(immnohistochemical staining), 유체 세포 측정법 (flow cytometry), 형광활성화 세포분류법(FACS), 효소기질발색법 및 항원-항체 응집법을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일실시예에서, 항체 대신에 본 발명의 마커에 특이적으로 결합하는 앱타머를 이용할 수 있으며, 앱타머는 올리고핵산 또는 펩타이드 분자이며, 앱타머의 일반적인 내용은 Bock LC et al., Nature 355(6360):5646(1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R . "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24):142727(1998)에 상세하게 개시되어 있다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 키트는 마이크로 어레이일 수 있으며, 이때 마이크로어레이의 고상 표면에 항체 또는 엡타머가 고정화 되어 있을 수 있다.

또한 본 발명의 키트는 마커 성분에 특이적으로 결합하는 항체, 기질과의 반응에 의해서 발색하는 표지체가 접합된 2차 항체 접합체(conjugate), 상기 표지체와 발색 반응할 발색 기질 용액, 세척액 및 효소반응 정지용액 등을 포함할 수 있으며, 사용되는 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

상기 2차 항체 접합체의 표지체는 발색반응을 하는 통상의 발색제가 바람직하며, HRP(horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase), 콜로이드 골드(coloid gold), FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 등의 형광물질(fluorescein), 및 색소(dye) 등이 사용될 수 있다.

상기 발색 기질 용액은 표지체에 따라 사용하는 것이 바람직하며, TMB (3,3',5,5'-tetramethyl bezidine), ABTS[2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)], OPD(o-phenylenediamine) 등을 사용할 수 있다. 이때, 발색 기질은 완충용액(0.1M NaOAc, pH 5.5)에 용해된 상태로 제공되는 것이 더욱 바람직하다.

세척액은 인산염 완충용액, NaCl 및 트윈 20을 포함하는 것이 바람직하며, 0.02M 인산염 완충용액, 0.13M NaCl, 및 0.05% 트윈 20으로 구성된 완충용액 (PBST)이 더욱 바람직하다. 세척액은 항원-항체 결합반응 후 항원-항체 결합체에 2차 항체를 반응시킨 다음 적당량을 고정체에 가하여 3 내지 6회 세척한다. 반응 정지용액은 황산 용액이 사용될 수 있다.

또한 본 발명은 눈물 내 안지오제닌을 검출하는 단계를 포함하는 건성안 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 안지오제닌의 검출은 항원-항체 반응 방식으로 실시될 수 있으며, 보다 구체적으로 상기 항원-항체 반응은 효소면역분석법(ELISA), 방사능면역분석법(radioimmnoassay, RIA), 샌드위치 측정법(sandwich assay), 웨스턴 블롯팅, 면역침강법, 면역조직화학염색법(immnohistochemical staining), 유체 세포 측정법 (flow cytometry), 형광활성화 세포분류법(FACS), 효소기질발색법 및 항원-항체 응집법으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상술한 항원-항체 반응에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석함으로써, 건성안을 진단할 수 있다. 즉, 눈물에서 본 발명의 안지오제닌에 대한 시그널이 정상안의 눈물보다 약하게 나오는 경우에는 건성안으로 진단된다.

본 발명의 일실시예에서, 본 발명의 마커 안지오제닌이 눈물에 80ppb 이하의 농도로 포함되어 있는 경우, 건성안으로 진단될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실시예 1> 실험 대상 및 시료 채취

2011년 9월 1일부터 2011년 11월 30일까지 중앙대학교 안과 외래에 내원한 건성안 환자 중, 추적관찰이 가능했던 36명(72안)을 대상으로 하였다. 모든 환자 개개인의 동의를 얻었으며 중앙대학교 병원 임상시험윤리위원회의 승인을 받았다. 눈물은 75 mm / 75 μl Haematocrit-capillary tubes (Code-No. 910 02 75)를 이용하여 환자의 하측 결막낭에서 자극을 최소한으로 줄인 후 20 μL 이상을 채취하였고, 마이크로튜브에 모아 -70 ˚C에 보관한 후 ELISA (Enzyme-linked-immunosorbent assay)와 ImmunoDot blot assay를 시행하였다.

건성안 환자의 건성안은 델피 분류(Delphi classification)에 따라 건성안 정도 1, 2, 3, 4, 로 분류하였고, 건성안 4가 가장 심한 건성안 상태이다.

< 실시예 2> 눈물 내 사이토카인 측정

눈물 내 존재하는 다양한 사이토카인을 확인하기 위하여 인간 사이토카인 항체 어레이(RayBiotech, USA)를 이용하였으며, 이미지는 Chemidoc (Bio-Rad, USA)를 이용하여 획득하였고 결과 분석은 농도 측정으로 (Quantity One software, Bio-Rad, USA) background 및 양성 대조군 대비 보정하여 나타냈다. 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1의 A는 인간 사이토카인 항체 어레이 분석 결과이고, B는 상기 어레이의 사이토카인 지도이다. C는 상기 결과를 사이토카인별로 도표화한 것이다.

도 1을 참조하면, 정상안(normal)의 눈물에서는 Angiogenin이 상당히 많이 존재한다는 것을 확인하였으며, 그 밖에 SDF-1α, VEGF, bFGF, TGF-β2, TNF-α, IL-10, IL-17, Angiostatin, Fas Ligand의 발현은 적게 나타남을 알 수 있었다. 그러나 건성안(DES)의 정도가 1~2에서 3, 및 4로 심해질수록 안지오제닌(angiogenin)의 발현이 감소하였으며, bFGF, TGF-β2, TNF-α, IL-10은 건성안 grade 4에서 발현이 증가함을 알 수 있었다. 이는 눈물 내 사이토카인의 균형이 깨지면서 회복할 수 없는　대상부전상태(decompensated state)가 된 것으로 판단된다.

이를 종합한 도 1의 C를 참조하면, 건성안의 정도가 심해질수록(그래프 좌측부터 일반안, 건성안 등급 1~2, 건성안 등급 3, 건성안 등급 4) 안지오제닌의 발현은 감소하는 경향을 보이나, 그 밖의 다른 사이토카인의 발현은 건성안 정도와의 상관관계가 낮음을 알 수 있었다.

< 실시예 3> 눈물 내 단백질 농도 측정

눈물의 총 단백질 양은 Thermo Fisher Scientific (Wilmington, USA)사의 NanoDrop 1000 Spectrophotometer를 이용하여 280 nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. 락토페린은 인간 락토페린 ELISA 키트 (Bethyl Laboratories, USA)를 이용하였고, 안지오제닌은 안지오제닌 인간 ELISA 키트 (ABcam, USA)를 사용하여 측정하였다.

눈물의 총 단백질 농도를 측정한 결과, 정상은 1.93 ± 0.52 mg/ml, 건성안 grade 1~2는 1.89 ± 0.53 mg/ml, 건성안 grade 3는 1.12 ± 0.27 mg/ml, 건성안 grade 4는　1.21 ± 0.32 mg/ml로 나타났다. 총 단백질 중 락토페린의 농도를 확인한 결과, 정상은 0.25 ± 0.05 mg/ml, 건성안 grade 1~2는 0.22 ± 0.08 mg/ml, 건성안 grade 3는 0.11 ± 0.03 mg/ml, 건성안 grade 4는 0.08 ± 0.02mg/ml로 나타났다. 안지오제닌의 경우, 정상은 116.40±16.14 ppb, 건성안 grade 1은 75.39±5.41 ppb, 건성안 grade 3는 68.74±6.84 ppb, 건성안 grade 4는 43.76±16.15 pp b 로 나타났다. . 눈물의 단백질 농도가 각 군별로 차이가 나므로 락토페린과 안지오제닌을 전체 단백질에 대한 비율로 나타냈고 이는 도 2와 같다. 도 2의 A는 락토페린, 도 2의 B는 안지오제닌에 관한 실험 결과이다.

도 2를 참조하면, 정상에 비해 건성안에서 락토페린과 안지오제닌의 전체 단백질 내 차지하는 비율이 감소하였으며, 건성안의 정도가 심해질수록 유의적으로 두 단백질의 발현 모두 감소하는 경향을 보임을 알 수 있었다.

특히 건성안 4 상태는 안구의 화학 화상, 반흔선 유천포창, 스티븐스-존슨 증후군 등과 같은 자가 면역 질환의 경우, 심한 건성안이 발생했을 경우의 안구 표면 상태가 유사하다고 할 수 있으며 안구 표면의 정상 방어 기제 및 조화 기능이 소실된 대상부전 상태라고 (decompensated sate) 할 수 있다. 본 발명의 안지오제닌은 건성안 4 상태의 안구까지 진단할 수 있다. 즉, 이러한 난치성 안구 표면 질환에서도 질환의 정도 및 치료의 평가 혹은 치료법으로 안지오제닌을 유용하게 사용할 수 있을 것으로 판단된다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (9)

1. 안지오제닌(angiogenin)을 포함하는 건성안 진단용 바이오마커 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 안지오제닌(angiogenin)은 정상인의 눈물에서 보다 건성안 환자의 눈물에서 더 적게 발현되는 것인 건성안 진단용 바이오마커 조성물.
3. 안지오제닌 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 포함하는 건성안 진단용 키트.
4. 제3항에 있어서,
   상기 안지오제닌은 눈물에 포함되어 있는 것인 건성안 진단용 키트.
5. 제3항에 있어서,
   상기 키트는 면역분석(immunoassay)용 키트인 것인 건성안 진단용 키트.
6. 제3항에 있어서,
   상기 키트는 마이크로어레이인 것인 건성안 진단용 키트.
7. 눈물 내 안지오제닌을 검출하는 단계를 포함하는 건성안 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
8. 제7항에 있어서,
   상기 검출은 항원-항체 반응 방식으로 실시되는 것인 건성안 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
9. 제8항에 있어서,
   상기 항원-항체 반응은 효소면역분석법(ELISA), 방사능면역분석법(radioimmnoassay, RIA), 샌드위치 측정법(sandwich assay), 웨스턴 블롯팅, 면역침강법, 면역조직화학염색법(immnohistochemical staining), 유체 세포 측정법 (flow cytometry), 형광활성화 세포분류법(FACS), 효소기질발색법 및 항원-항체 응집법으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법을 이용하여 수행되는 것인 건성안 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
   

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