JP2020204554A

JP2020204554A - 軽度認知障害の診断マーカー

Info

Publication number: JP2020204554A
Application number: JP2019112658A
Authority: JP
Inventors: 岡澤　均; Hitoshi Okazawa; 均岡澤
Original assignee: Tokyo Medical and Dental University NUC; Shino Test Corp
Current assignee: Tokyo Medical and Dental University NUC; Shino Test Corp
Priority date: 2019-06-18
Filing date: 2019-06-18
Publication date: 2020-12-24
Also published as: WO2020255938A1

Abstract

【課題】軽度認知障害に罹患しているか否かを精度よく判定する方法；軽度認知障害に対して候補となり得る治療法の有効・無効の評価基準；臨床症状の変動あるいは程度の客観的指標（特に、同一患者の経過を見るための指標）；等を提供すること。【解決手段】被験者から採取された生体試料中のＨＭＧＢ１の濃度を測定し、当該ＨＭＧＢ１濃度を指標として、被験者が軽度認知障害に罹患しているか否かを判定する。【選択図】なし

Description

本発明は、被験者が軽度認知障害（Mild Cognitive Impairment；以下、「ＭＣＩ」ということがある）に罹患しているか否かを判定する方法や、被験者がＭＣＩに罹患しているか否かを判定するためのキットに関する。

アルツハイマー病（Alzheimer's disease；以下、「ＡＤ」ということがある）は、不可逆的な進行性中枢神経疾患の１つであり、記憶障害や思考障害を伴う認知機能障害（認知症）、行動障害、人格変化等の症状を呈することが知られている。アルツハイマー病は、認知症患者の中で最も多い疾患であり、認知症患者全体の約６０〜８０％を占めている。アルツハイマー病は、一般に６５歳以上の高齢者で発症するが、中には６４歳以下でも発症し、その場合、若年性アルツハイマー病と呼ばれている。

内閣府の発表によると、２０１２年の日本における認知症患者数は４６２万人であり、６５歳以上の高齢者の７人に１人であったが、２０２５年には約７００万人まで増加し、５人に１人になると見込まれている。ＡＤ等の認知症患者数が増加すると、医療費の増大や介護問題等で国や患者関係者達の経済的又は精神的負担が深刻化することが予想される。

ＭＣＩ患者は、認知機能の低下は認められるものの、認知症の診断基準は満たさず、基本的な日常生活や社会生活には支障がない。ＭＣＩ患者の一部は、将来ＡＤを発症すると考えられていることから、ＭＣＩ罹患の有無を早期診断できれば、認知症を発症する前段階で、認知症予防の適切な処置を行い、認知症を予防することが期待できる。

最近、ＭＣＩ患者の脳画像を基に、将来ＡＤを発症する可能性があるかどうかを、人工知能を用いて予測する装置が報告されている（特許文献１）。また、非還元末端にマンノースを有する糖鎖を含むトランスフェリンが髄液中に存在し、かかるトランスフェリンを指標としてＭＣＩを診断できることが報告されている（特許文献２）。

特許第６４８３８９０号公報国際公開第２０１７／１９５７７８号パンフレット

本発明の課題は、軽度認知障害に罹患しているか否かを精度よく判定する方法；軽度認知障害に対して候補となり得る治療法の有効・無効の評価基準；臨床症状の変動あるいは程度の客観的指標（特に、同一患者の経過を見るための指標）；等を提供することにある。

本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を進める過程において、ＭＣＩ患者由来の生体試料中のＨＭＧＢ１濃度と、ＭＣＩに罹患していない者（具体的には、健常者、非認知症神経疾患患者、及びアルツハイマー病患者）由来の生体試料中のＨＭＧＢ１濃度とを測定し、比較したところ、ＭＣＩ患者由来の生体試料中のＨＭＧＢ１濃度は、ＭＣＩに罹患していない者由来の生体試料中のＨＭＧＢ１濃度と比べ、高いことを見いだした。また、ＨＭＧＢ１濃度の適切なカットオフ値を設定すると、被験者がＭＣＩに罹患しているか否かを精度よく判定できることを確認した。本発明は、これらの知見に基づき、完成するに至ったものである。

すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕以下の工程（ａ）及び（ｂ）を含むことを特徴とする軽度認知障害の判定方法。
（ａ）被験者から採取された生体試料中のＨＭＧＢ１の濃度を測定する工程；
（ｂ）被験者から採取された生体試料中のＨＭＧＢ１の濃度を指標として、被験者が軽度認知障害に罹患しているか否かを判定する工程；
〔２〕生体試料が脳脊髄液試料であることを特徴とする上記〔１〕に記載の判定方法。
〔３〕工程（ｂ）において、被験者から採取された生体試料中のＨＭＧＢ１の濃度と、軽度認知障害に罹患していない対照者由来の生体試料中のＨＭＧＢ１の濃度とを比較し、被験者から採取された生体試料中のＨＭＧＢ１の濃度が、軽度認知障害に罹患していない対照者由来の生体試料中のＨＭＧＢ１の濃度よりも高い場合、被験者は軽度認知障害に罹患している可能性が高いと判定することを特徴とする上記〔１〕又は〔２〕に記載の判定方法。
〔４〕軽度認知障害に罹患していない対照者が、健常者又はアルツハイマー病患者であることを特徴とする上記〔３〕に記載の判定方法。
〔５〕ヒトＨＭＧＢ１に特異的に結合する抗体、又はその標識物を備えることを特徴とする軽度認知障害の判定用キット。

また本発明の実施の他の形態として、
上記工程（ａ）と、被験者から採取された生体試料中のＨＭＧＢ１の濃度を指標として、被験者が軽度認知障害に罹患しているか否かを判定するためのデータを作成する工程（Ｂ）とを順次含む、軽度認知障害を判定するためのデータを作成する方法；や、
上記工程（ａ）及び（ｂ）を含む、軽度認知障害の診断方法；や、
生体試料中のＨＭＧＢ１の濃度が軽度認知障害に罹患していない対照者由来の生体試料中のＨＭＧＢ１の濃度よりも高い軽度認知障害患者に対して、認知症の罹患（発症）を予防する処置を施す（例えば、認知症治療薬を投与する）、又は軽度認知障害を治療する処置（例えば、認知症治療薬を投与する；軽度認知障害改善のための有酸素運動［例えば、ウォーキング、ジョギング］を行う；軽度認知障害改善のための食事療法を行う［例えば、ビタミンＣ、Ｅ、βカロチン、ＤＨＡ、ＥＰＡ、ポリフェノールを豊富に含む食べ物を食べる］；認知トレーニングを行う；）を施す工程を含む、認知症の罹患（発症）の予防方法、又は軽度認知障害の治療方法；や、
軽度認知障害の判定（診断）における使用のための、ヒトＨＭＧＢ１に特異的に結合する抗体、又はその標識物；
を挙げることができる。

本発明によると、軽度認知障害の罹患の有無を精度よく判定することができるため、軽度認知症障害患者に対して、適切な治療を行うことにより、あるいは、認知症予防の適切な処置を行うことにより、軽度認知症障害を早期に治療したり、認知症罹患（発症）を予防することにつながる。

被験者（非ＭＣＩ／ＡＤ対照者［図中の「ｃｃ」］、ＭＣＩ患者［図中の「ＭＣＩ」］、及びＡＤ患者［図中の「ＡＤ」］）由来のＣＳＦ試料中のＨＭＧＢ１濃度を測定した結果を示す図である。図中の「＊＊＊」は、統計学的に有意差（ｐ＜０．００１）があることを示す。また、図中の●は、被験者の一人ひとりを示す。図２Ａは、ＭＣＩ患者及び非ＭＣＩ／ＡＤ対照者由来のＣＳＦ試料中のＨＭＧＢ１濃度の測定結果を基に、Receiver Operating Characteristic（ＲＯＣ）曲線を作成した結果を示す図である。図２Ｂは、ＭＣＩ患者及びＡＤ患者由来のＣＳＦ試料中のＨＭＧＢ１濃度の測定結果を基に、ＲＯＣ曲線を作成した結果を示す図である。図１について、非ＭＣＩ／ＡＤ対照者を、健常者（図中の「nc」）と疾患患者（図中の「dc」）の２つに分けて表示した結果を示す図である。図４Ａは、ＭＣＩ患者及び健常者由来のＣＳＦ試料中のＨＭＧＢ１濃度の測定結果を基に、ＲＯＣ曲線を作成した結果を示す図である。図４Ｂは、ＭＣＩ患者及び非認知症神経疾患患者由来のＣＳＦ試料中のＨＭＧＢ１濃度の測定結果を基に、ＲＯＣ曲線を作成した結果を示す図である。

本発明の軽度認知障害の判定方法としては、被験者から採取された生体試料中のＨＭＧＢ１の濃度を測定（必要に応じてさらに定量）する工程（ａ）；及び被験者から採取された生体試料中のＨＭＧＢ１の濃度を指標として、被験者が軽度認知障害に罹患しているか否か（軽度認知障害を発症しているか否か）を判定する工程（ｂ）；を順次含む、軽度認知障害を判定する方法（以下、「本件判定方法」ということがある）であれば特に制限されず、本件判定方法は、医師による軽度認知障害の有無の診断を補助する方法であって、医師による診断行為を含まない。

本発明の軽度認知障害の判定用キットとしては、ヒトＨＭＧＢ１に特異的に結合する抗体（すなわち、抗ヒトＨＭＧＢ１抗体）、又は抗ヒトＨＭＧＢ１抗体の標識物を備える、軽度認知障害の判定に用いるためのキット（以下、「本件判定用キット」ということがある）であれば特に制限されず、本件判定用キットは、軽度認知障害を判定するためのキットや、軽度認知障害の診断を補助するためのキットに関する用途発明であり、これらキットには、一般にこの種のキットに用いられる成分、例えば担体、ｐＨ緩衝剤、安定剤の他、取扱説明書、軽度認知障害を判定するための説明書等の添付文書が通常含まれる。

本発明において、「軽度認知障害」とは、認知機能（例えば、記憶機能、遂行機能、注意機能、視空間認知機能、言語理解機能）の低下は認められるものの、認知症の診断基準は満たさず（換言すると、認知症に罹患しておらず）、かつ、基本的な日常生活や社会生活には支障がない状態を意味する。ここで、「認知機能の低下は認められるものの、認知症の診断基準は満たさない」とは、例えば、ミニメンタルステート検査（ＭＭＳＥ；Mini Mental State Examination）の点数が１９〜２７点の範囲内（例えば、２０〜２７点、２１〜２７点、２２〜２７点、２３〜２７点、２４〜２７点、１９〜２６点、１９〜２５点、１９〜２４点、１９〜２３点、２１〜２６点、２１〜２５点、２１〜２４点、２１〜２３点）である；及び／又は臨床的認知症尺度（ＣＤＲ；Clinical Dementia Rating）の点数が０．５点である；ことを意味する。

本明細書において、認知症としては、例えば、アルツハイマー病（アルツハイマー型認知症）、パーキンソン病で発症する認知症、Ｌｅｗｙ小体型認知症、前頭側頭型認知症、進行性非流暢性失語で発症する認知症、意味性認知症、大脳皮質基底核変性症で発症する認知症を例示することができる。

上記生体試料としては、被験者（生体）由来の試料であればよく、例えば、血液試料、脳脊髄液（ＣＳＦ；Cerebrospinal Fluid）試料、尿試料を挙げることができ、後述する本実施例において、その効果が実証されているため、ＣＳＦ試料を好適に例示することができる。

上記工程（ａ）において、生体試料中のＨＭＧＢ１の濃度を測定・定量する方法としては、生体試料中のＨＭＧＢ１タンパク質又はそれを構成するペプチドを特異的に検出できる方法であればよく、例えば、生体試料又はその処理物（例えば、血液試料の場合、血清試料や血漿試料；脳脊髄液試料の場合、遠心処理により夾雑物を除いた脳脊髄液；尿試料の場合、遠心処理により夾雑物を除いた尿）を用いて、ＨＭＧＢ１タンパク質を構成するペプチドを検出する質量分析法や、ＨＭＧＢ１タンパク質を特異的に認識する抗体を用いた免疫学的測定法を挙げることができる。

上記免疫学的測定法としては、免疫組織化学染色法、ＥＬＩＳＡ法、ＥＩＡ法、ＲＩＡ法、ウェスタンブロッティング法、フローサイトメトリー等を好適に例示することができる。フローサイトメトリーは、蛍光物質（アロフィコシアニン［ＡＰＣ］、フィコエリトリン［ＰＥ］、ＦＩＴＣ［fluorescein isothiocyanate］、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００、ＰＥ−ＴｅｘａｓＲｅｄ、ＰＥ−Ｃｙ５、ＰＥ−Ｃｙ７等）で標識したＨＭＧＢ１タンパク質に特異的に結合する抗体を用いた蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）により行うことができる。

本発明において、ＨＭＧＢ１濃度の値は、絶対値であっても、相対値であってもよい。ＨＭＧＢ１濃度の絶対値は、例えば、既知の濃度のＨＭＧＢ１を用いて、ＨＭＧＢ１由来のシグナル量（例えば、蛍光量、色素量、ペプチドピーク量）と、ＨＭＧＢ１濃度との関係を示す検量線を作成し、かかる検量線を基に算出することができる。また、ＨＭＧＢ１濃度の相対値は、例えば、軽度認知障害に罹患していない対照者由来のＨＭＧＢ１由来のシグナル量（例えば、蛍光量、色素量、ペプチドピーク量）を基準にして算出することができる。

上記工程（ｂ）において、被験者が軽度認知障害に罹患しているか否かを判定する方法や、上記工程（Ｂ）において、被験者が軽度認知障害に罹患しているか否かを判定するためのデータを作成する方法としては、例えば、ある閾値（カットオフ値）よりも高いことを基準にして、判定する方法を挙げることができ、かかるカットオフ値としては、例えば、軽度認知障害に罹患していない対照者における生体試料中のＨＭＧＢ１濃度の平均値；当該平均値＋標準偏差（ＳＤ）；当該平均値＋２ＳＤ；当該平均値＋３ＳＤ；軽度認知障害に罹患していない対照者における生体試料中のＨＭＧＢ１濃度の中央値；当該ＨＭＧＢ１濃度の第三四分位数；当該ＨＭＧＢ１濃度の最大値；等を挙げることができる。また、カットオフ値は、感度（軽度認知障害に罹患している者を、正しく陽性と判定できる割合）及び特異度（軽度認知障害に罹患していない者を、正しく陰性と判定できる割合）が高くなるように、軽度認知障害患者における生体試料中のＨＭＧＢ１濃度のデータと、軽度認知障害に罹患していない対照者における生体試料中のＨＭＧＢ１濃度のデータを基に、統計解析ソフトウェアを用いたＲＯＣ曲線を用いて算出することもできる。

上記工程（ｂ）において、被験者が軽度認知障害に罹患しているか否かを判定する方法としては、具体的には、被験者から採取された生体試料中のＨＭＧＢ１の濃度と、軽度認知障害に罹患していない対照者由来の生体試料中のＨＭＧＢ１の濃度とを比較し、被験者から採取された生体試料中のＨＭＧＢ１の濃度が、軽度認知障害に罹患していない対照者由来の生体試料中のＨＭＧＢ１の濃度よりも高い場合、被験者は軽度認知障害に罹患している可能性が高いと判定する方法等を好適に例示することができる。

また、上記工程（Ｂ）において、被験者が軽度認知障害に罹患しているか否かを判定するためのデータを作成する方法としては、具体的には、被験者から採取された生体試料中のＨＭＧＢ１の濃度と、軽度認知障害に罹患していない対照者由来の生体試料中のＨＭＧＢ１の濃度とを比較し、被験者から採取された生体試料中のＨＭＧＢ１の濃度が、軽度認知障害に罹患していない対照者由来の生体試料中のＨＭＧＢ１の濃度よりも高い場合、被験者は軽度認知障害に罹患している可能性が高いと判定するためのデータを作成する方法等を好適に例示することができる。

本明細書において、「軽度認知障害に罹患していない対照者」としては、軽度認知障害に罹患していない者（被験者のコントロール）、すなわち、１）認知機能の低下は認められない；２）認知症の診断基準を満たす；及び３）基本的な日常生活や社会生活には支障がある；の１）〜３）の基準のうち、少なくとも１つの基準を満たす者であればよく、具体的には、健常者、軽度認知障害以外の疾患（例えば、アルツハイマー病、脊髄円錐症候群、視神経脊髄炎、腫瘍随伴症候群、特発性正常圧水頭症、アルコール依存症、末梢性ニューロパチー、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、肺癌、及び帯状疱疹髄膜炎の疾患から選択される１又は２以上の疾患）に罹患している患者を挙げることができ、健常者やアルツハイマー病患者を好適に例示することができる。

本発明において、軽度認知障害の判定の指標であるＨＭＧＢ１は、ヒト由来のＨＭＧＢ１（highmobility group box 1）タンパク質であり、具体的には、以下の［Ａ群タンパク質］から選択される１又は２種以上のタンパク質を挙げることができる。
［Ａ群タンパク質］
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（ＨＭＧＢ１のアイソフォーム１［NCBI Reference Sequence：NP_001300821］）、或いは、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、軽度認知障害患者における発現量が、軽度認知障害に罹患していない対照者と比べ高いタンパク質；
（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（ＨＭＧＢ１のアイソフォーム４［NCBI Reference Sequence：NP_001350590］）、或いは、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、軽度認知障害患者における発現量が、軽度認知障害に罹患していない対照者と比べ高いタンパク質；

上記「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列」とは、通常１〜１０個の範囲内、好ましくは１〜７個の範囲内、より好ましくは１〜６個の範囲内、さらに好ましくは１〜５個の範囲内、さらにより好ましくは１〜４個の範囲内、特に好ましくは１〜３個の範囲内、特により好ましくは１〜２個の範囲内、最も好ましくは１個の数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を意味する。

本件判定用キットにおける抗ヒトＨＭＧＢ１抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などの抗体であってもよく、また、この中には、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ、ｄｉａｂｏｄｙ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、Ｓｃ（Ｆｖ）_２などの抗体の一部からなる抗体断片も含まれる。

本件判定用キットにおいて、抗ヒトＨＭＧＢ１抗体の標識物における標識物質としては、ペルオキシダーゼ（例えば、horseradish peroxidase）、アルカリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコ−ス−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ペニシリナーゼ、カタラーゼ、アポグルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ、ルシフェラーゼ若しくはアセチルコリンエステラーゼ等の酵素、フルオレスセインイソチオシアネート、フィコビリタンパク、希土類金属キレート、ダンシルクロライド若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート等の蛍光物質、緑色蛍光タンパク質（Green Fluorescence Protein；ＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（CyanFluorescence Protein；ＣＦＰ）、青色蛍光タンパク質（Blue FluorescenceProtein；ＢＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（Yellow Fluorescence Protein；ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（Red Fluorescence Protein；ＲＦＰ）、ルシフェラーゼ（luciferase）等の蛍光タンパク質、^３Ｈ、^１４Ｃ、^１２５Ｉ若しくは^１３１Ｉ等の放射性同位体、ビオチン、アビジン、又は化学発光物質を挙げることができる。

本件判定用キットにおいて、抗ヒトＨＭＧＢ１抗体は、公知の手法を用いて作製することができる。例えば、抗ヒトＨＭＧＢ１ポリクローナル抗体は、非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ）に、ヒトＨＭＧＢ１を構成するペプチドを感作抗原として免疫し、抗血清を回収し、精製する、通常の方法により製造することができる。精製は、一般的な生化学的方法、例えば塩析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどを適宜組み合わせることにより行うことができる。

また、抗ヒトＨＭＧＢ１モノクローナル抗体は、例えば、公知のハイブリドーマ法により作製することができる。まず、抗体産生ハイブリドーマを作製する。ヒトＨＭＧＢ１を構成するペプチドを感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法に従って哺乳動物に免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナル抗体産生細胞をクローニングする。感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定はされないが、細胞融合に使用する親細胞（ミエローマ細胞）との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスターなどが使用されることが多い。感作抗原で哺乳動物を免疫する方法としては、公知の方法を用いることができる。上記免疫細胞と融合されるミエローマ細胞としては、公知の種々の細胞株が使用可能である。免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は公知の方法、例えば、ミルスタインらの方法（Methods Enzymol. 73: 3-46 (1981)）などに準じて行うことができる。得られた融合細胞は、通常の選択培地、例えば、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含む培養液）で培養することにより選択することができる。このＨＡＴ培地での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するまで、通常数日から数週間継続される。次に、通常の限界希釈法を実施し、ヒトＨＭＧＢ１に結合する抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングやクローニングが行われる。このようにして得られたハイブリドーマの培養上清を精製することによって、ヒトＨＭＧＢ１に結合するモノクローナル抗体を取得することができる。精製は、一般的な生化学的方法、例えば塩析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどを適宜組み合わせることにより行うことができる。

抗ヒトＨＭＧＢ１モノクローナル抗体はまた、遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主により産生することもできる。ヒトＨＭＧＢ１を構成するペプチドを感作抗原として免疫した哺乳動物の脾細胞；リンパ球；又は、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマからｍＲＮＡを取得し、これを鋳型としてｃＤＮＡライブラリーを作製することができる。感作抗原と反応する抗体を産生しているクローンをスクリーニングし、得られたクローンを培養し、培養上清から一般的な生化学的方法、例えば塩析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどを適宜組み合わせることにより目的とするモノクローナル抗体を精製することができる。また、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、又はそれらの抗原結合性断片は、例えば、上記モノクローナル抗体の可変領域や超可変領域を用いて遺伝子工学的手法により作製することができる（例えば、Method in Enzymology 203: 99-121(1991)）。

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。

１．方法
［被験者由来のＣＳＦ試料の調製］
表１に示す被験者（ＭＣＩ及びＡＤのいずれにも罹患していない者［非ＭＣＩ／ＡＤ対照者］、ＭＣＩ患者、及びＡＤ患者）のうち、３０名の非ＭＣＩ／ＡＤ対照者（健常者１９名、疾患患者１１名）、２１名のＭＣＩ患者、及び５６名のＡＤ患者から腰椎穿刺によりＣＳＦを採取した後、夾雑物を除くために、遠心処理（１０００×ｇ、１０分間、４℃）し、上清をＣＳＦ試料として−８０℃で保存した。被験者がＭＣＩ及びＡＤに罹患しているか否かは、世界保健機関による国際疾病分類第１０版（ＩＣＤ−１０）において定義されているクライテリアを基に診断した。なお、ＭＣＩに罹患していると診断された被験者は、認知機能の低下は認められるものの、認知症の診断基準を満たさず、かつ基本的な日常生活に支障がない被験者である。

［ＣＳＦ試料中のＡβ及びｐＴａｕの測定］
ＣＳＦ試料中の２種類のＡβ（Ａβ４０及びＡβ４２）濃度は、ヒトＡβ４０を検出するＥＬＩＳＡキット（292-62301、和光純薬工業社製）と、ヒトＡβ４２を検出するＥＬＩＳＡキット（298-62401、和光純薬工業社製）とを用いて測定した。また、ＣＳＦ試料中のｐＴａｕ濃度は、INNOTEST PHOSPHO-TAU(181P)（Innogenetics社製）を用いて測定した。

［ＣＳＦ試料中のＨＭＧＢ１の測定］
ポリスチレンマイクロタイタープレート（Nunc社製）における各ウェルを、１ｍｇ／Ｌの抗ヒトＨＭＧＢ１モノクローナル抗体（２Ｄ４、シノテスト社製）を含むＰＢＳ１００μＬでコートし、２〜８℃条件下で一晩インキュベートした。その後、各ウェルを、０．０５％Tween20を含むＰＢＳで３回洗浄し、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ４００μＬ／ウェルでブロッキング処理し、０．０５％Tween20を含むＰＢＳで３回洗浄した後、１００μＬのＣＳＦ試料を各ウェルに添加し、３７℃で２４時間インキュベートした。その後、各ウェルを、０．０５％Tween20を含むＰＢＳで３回洗浄し、０．５ｍｇ／Ｌのペルオキシダーゼ（peroxidase）でコンジュゲートした抗ヒトＨＭＧＢ１、２モノクローナル抗体（Ｒ０４、シノテスト社製）を含むＰＢＳ１００μＬを各ウェルに添加し、室温で２時間インキュベートした。その後、各ウェルを、０．０５％Tween20を含むＰＢＳで３回洗浄し、発色基質であるＴＭＢ（3,3’,5,5’-tetra-methylbenzidine）（同仁化学研究所社製）を各ウェルに添加した。０．３５Ｍの硫酸ナトリウムを各ウェルに添加することによりＴＭＢの反応処理を停止し、最大吸収波長である４５０ｎｍの吸光度を、モデル６８０マイクロプレートリーダー（Bio-Rad社製）を用いて測定した。なお、かかる吸光度の標準曲線は、精製したブタ胸腺由来のＨＭＧＢ１（シノテスト社製）を用いて作成した。

表中の「年齢」、「ＭＭＳＥ値」、及び「ＣＤＲ値」は、平均値±標準偏差（Ｓ．Ｄ．）で示す。なお、上記１４名の疾患患者は、具体的には、脊髄円錐症候群（Spinal conus syndrome）患者１名、視神経脊髄炎（Neuromyelltis optica）患者１名、腫瘍随伴症候群（Paraneoplastic syndrome）患者１名、特発性正常圧水頭症（Idiopathic normal pressure hydrocephalus）患者４名、脳幹部腫瘍（Brain stem tumor）患者１名、特発性正常圧水頭症及びアルコール依存症を有する患者１名、末梢性ニューロパチー（Peripheralneuropathy）患者１名、多発性硬化症（Multiple sclerosis）患者１名、全身性エリテマトーデス（Systemic lupus erythematosus）患者１名、肺癌及び特発性正常圧水頭症を有する患者１名、並びに帯状疱疹髄膜炎（Herpes zoster meningitis）患者１名である。

２．結果
ＭＣＩ患者由来ＣＳＦ試料中のＨＭＧＢ１濃度の中央値は、１５４８ｐｇ／ｍＬであり、非ＭＣＩ／ＡＤ対照者由来ＣＳＦ試料中のＨＭＧＢ１濃度の中央値（２２９ｐｇ／ｍＬ）や、ＡＤ患者由来ＣＳＦ試料中のＨＭＧＢ１濃度の中央値（３２７ｐｇ／ｍＬ）と比べ、高かった（図１参照）。次に、非ＭＣＩ／ＡＤ対照者を、健常者と疾患患者の２つに分け、ＭＣＩ患者との比較を行った。その結果、ＭＣＩ患者由来ＣＳＦ試料中のＨＭＧＢ１濃度の中央値（１５４８ｐｇ／ｍＬ）は、健常者由来ＣＳＦ試料中のＨＭＧＢ１濃度の中央値（３３８ｐｇ／ｍＬ）や、疾患患者由来ＣＳＦ試料中のＨＭＧＢ１濃度の中央値（１３３ｐｇ／ｍＬ）と比べ、高かった（図３参照）。

これらの結果は、ＭＣＩ患者由来の生体試料中のＨＭＧＢ１濃度は、ＭＣＩ患者以外の者（例えば、健常者；ＡＤ等の認知症患者）由来の生体試料中のＨＭＧＢ１濃度と比べ、高いことを示している。なお、図１の「ｃｃ」、「ＭＣＩ」、及び「ＡＤ」の箱ひげ図における四分位範囲は、それぞれ２０〜６８０．７５ｐｇ／ｍＬ、２０５〜２７０１ｐｇ／ｍＬ、及び３〜９６１．７５ｐｇ／ｍＬである。また、図３の「ｎｃ」、「ｄｃ」、「ＭＣＩ」、及び「ＡＤ」の箱ひげ図における四分位範囲は、それぞれ５６〜７９６．５ｐｇ／ｍＬ、２０〜２９８ｐｇ／ｍＬ、２０５〜２７０１ｐｇ／ｍＬ、及び３〜９６１．７５ｐｇ／ｍＬである。

次に、非ＭＣＩ／ＡＤ対照者（具体的には、健常者及び疾患患者）、ＭＣＩ患者、及びＡＤ患者由来のＣＳＦ試料中のＨＭＧＢ１濃度の測定結果を基に、ＭＣＩ患者と、非ＭＣＩ／ＡＤ対照者又はＡＤ患者とを判別するためのＲＯＣ曲線を作成し（図２及び４参照）、カットオフ値を算出した。その結果、ＭＣＩ患者と非ＭＣＩ／ＡＤ対照者とを判別するためのカットオフ値として７５４を設定したところ、ＭＣＩ患者の感度（ＭＣＩ患者中の検査陽性者の割合）及び特異度（非ＭＣＩ／ＡＤ対照者中の検査陰性者の割合）は、それぞれ８６％及び８０％であった。また、ＭＣＩ患者とＡＤ患者とを判別するためのカットオフ値として７５４を設定したところ、ＭＣＩ患者の感度（ＭＣＩ患者中の検査陽性者の割合）及び特異度（ＡＤ患者中の検査陰性者の割合）は、それぞれ８６％及び７０％であった。また、ＭＣＩ患者と健常者とを判別するためのカットオフ値として９９２を設定したところ、ＭＣＩ患者の感度（ＭＣＩ患者中の検査陽性者の割合）及び特異度（健常者中の検査陰性者の割合）は、それぞれ７６％及び８４％であった。また、ＭＣＩ患者と疾患患者とを判別するためのカットオフ値として７５４を設定したところ、ＭＣＩ患者の感度（ＭＣＩ患者中の検査陽性者の割合）及び特異度（疾患患者中の検査陰性者の割合）は、それぞれ８６％及び９１％であった。

これらの結果は、被験者由来の生体試料中のＨＭＧＢ１濃度を測定し、適切なカットオフ値を設定すると、ＨＭＧＢ１濃度を指標として、被験者がＭＣＩに罹患しているか否かを精度よく判定できることを示している。なお、ＭＣＩ患者と非ＭＣＩ／ＡＤ対照者とを判別するためのＲＯＣ曲線（図２Ａ参照）におけるＡＵＣ（Area Under the Curve）は、０．８８７であり、ＭＣＩ患者とＡＤ患者とを判別するためのＲＯＣ曲線（図２Ｂ参照）におけるＡＵＣは、０．８０９であり、ＭＣＩ患者と健常者とを判別するためのＲＯＣ曲線（図４Ａ参照）におけるＡＵＣは、０．８６１であり、ＭＣＩ患者と疾患患者とを判別するためのＲＯＣ曲線（図４Ｂ参照）におけるＡＵＣは、０．９３１であることから、ＭＣＩ患者との判別能は高いことがわかる。

本発明は、軽度認知障害の早期診断、軽度認知障害の治療、及び認知症罹患（発症）の予防に資するものである。

Claims

以下の工程（ａ）及び（ｂ）を含むことを特徴とする軽度認知障害の判定方法。
（ａ）被験者から採取された生体試料中のＨＭＧＢ１の濃度を測定する工程；
（ｂ）被験者から採取された生体試料中のＨＭＧＢ１の濃度を指標として、被験者が軽度認知障害に罹患しているか否かを判定する工程；
生体試料が脳脊髄液試料であることを特徴とする請求項１に記載の判定方法。
工程（ｂ）において、被験者から採取された生体試料中のＨＭＧＢ１の濃度と、軽度認知障害に罹患していない対照者由来の生体試料中のＨＭＧＢ１の濃度とを比較し、被験者から採取された生体試料中のＨＭＧＢ１の濃度が、軽度認知障害に罹患していない対照者由来の生体試料中のＨＭＧＢ１の濃度よりも高い場合、被験者は軽度認知障害に罹患している可能性が高いと判定することを特徴とする請求項１又は２に記載の判定方法。
軽度認知障害に罹患していない対照者が、健常者又はアルツハイマー病患者であることを特徴とする請求項３に記載の判定方法。
ヒトＨＭＧＢ１に特異的に結合する抗体、又はその標識物を備えることを特徴とする軽度認知障害の判定用キット。