WO2023058627A1 - 認知症の検査方法 - Google Patents

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WO2023058627A1
WO2023058627A1 PCT/JP2022/037054 JP2022037054W WO2023058627A1 WO 2023058627 A1 WO2023058627 A1 WO 2023058627A1 JP 2022037054 W JP2022037054 W JP 2022037054W WO 2023058627 A1 WO2023058627 A1 WO 2023058627A1
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ecrg4
antibody
dementia
polypeptide
patients
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亨 近藤
一郎 矢部
直輝 池田
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国立大学法人北海道大学
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a method for testing dementia, and more particularly to a method for testing dementia using the blood level of ECRG4 as an index.
  • the present invention also relates to methods for detecting ECRG4 polypeptide levels by immunological methods, systems for performing such detection, and the like.
  • Dementia such as Alzheimer's disease (AD) is a progressive neurodegenerative disease that mainly occurs in presenile to old age. Its main symptoms are memory impairment, higher brain dysfunction (aphasia, apraxia, agnosia, structural apraxia), personality changes, and the like. Due to such symptoms, not only the quality of life of the patient himself/herself is lowered, but also the life of the family and others around the patient is greatly affected. Furthermore, the number of patients with dementia is steadily increasing with the aging of the population, and dementia has become a serious problem faced by modern society worldwide.
  • AD Alzheimer's disease
  • acetylcholinesterase inhibitors are actually used in clinical settings, and have achieved some results, and it has become possible to suppress the progression of symptoms to some extent.
  • aducanumab anti-amyloid beta (A ⁇ ) antibody
  • MCI mild cognitive impairment
  • MCI The stage before the onset of dementia, that is, the stage when mild clinical symptoms appear, is called MCI, and it is defined as the intermediate stage between normal aging (healthy state) and dementia.
  • a variety of neuropsychological tests are commonly used to test for MCI, such as orientation, short-term and long-term memory, behavior, language and comprehension, and scoring for cognitive impairment.
  • MMSE Folstein's Mini-Mental State Examination
  • interview method is only used for screening purposes and does not lead to a definitive diagnosis.
  • Non-Patent Documents 1 to 3 There is a demand for discovery and development of inspection methods using it (Non-Patent Documents 1 to 3).
  • the present invention has been made in view of the problems of the prior art, and identifies a blood biomarker molecule that makes it possible to distinguish between dementia patients and healthy subjects, and uses the amount of the molecule as an index.
  • the purpose is to provide a test method for dementia that
  • ECRG4 is a protein that has been revealed by the present inventors to be involved in neuronal cell senescence from a cell senescence experimental system using neural stem/progenitor cells (Non-Patent Document 4).
  • Non-Patent Document 4 a report that the expression of ECRG4 is remarkably enhanced in comparison with healthy subjects in a comprehensive gene expression analysis of the hippocampus of AD patients.
  • Ecrg4 full length 148 amino acids
  • Non-Patent Documents 6-8) The region consisting of amino acids (C peptide region)) activates microglia / macrophages and induces inflammatory cytokine expression, reported by the present inventors and another group (Non-Patent Documents 6-8) . However, it has not been clarified what the blood level of the protein is.
  • an ECRG4 detection system was constructed by an enzyme-linked immunosorbent method (ELISA method).
  • a polyclonal antibody that recognizes the amino acid sequence consisting of positions 107-132 of ECRG4 and a monoclonal antibody that recognizes the amino acid sequence of positions 116-124 of ECRG4 or a monoclonal antibody that recognizes the amino acid sequence of positions 134-139 of ECRG4. It was found that ECRG4 can be detected with high quantification by the ELISA method used in combination.
  • the positive rate and concentration of ECRG4 in the plasma of dementia patients including Alzheimer's disease, mild cognitive impairment (MCI) patients, non-dementia patients with neuropathy, etc. were detected.
  • MCI mild cognitive impairment
  • the plasma level of ECRG4 in dementia patients and MCI patients is much higher than that in non-dementia patients, and it was found that ECRG4 is extremely effective as a blood biomarker for dementia, and the present invention was completed. came to.
  • the present invention relates to a method for testing dementia using the blood level of ECRG4 as an index, and more specifically to the following.
  • a method of testing for dementia comprising the following steps (a) to (c): (a) the step of detecting the amount of ECRG4 polypeptide in a blood sample separated from a subject; (b) comparing the amount of polypeptide detected in step (a) to a reference amount; (c) determining that the subject is suffering from dementia if the result of the comparison in step (b) is that the amount of polypeptide in the subject is higher than the reference amount;
  • ⁇ 2> The method according to ⁇ 1>, wherein the blood sample is plasma.
  • ⁇ 3> The method according to ⁇ 1> or ⁇ 2>, wherein the amount of ECRG4 polypeptide is detected by an immunological method.
  • the immunological method is a method that uses at least an antibody that recognizes the region consisting of the amino acid sequence of positions 71 to 132 of ECRG4. the method of.
  • ⁇ 5> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 4>, wherein the immunological method is an enzyme-linked immunosorbent method.
  • ⁇ 6> A drug for testing dementia by the method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 5>, which contains an antibody that recognizes an ECRG4 polypeptide.
  • ⁇ 7> The agent according to ⁇ 6>, wherein the antibody recognizes a region consisting of the amino acid sequence of positions 71-132 of ECRG4.
  • ⁇ 10> Including an antibody that recognizes the region consisting of the amino acid sequence of positions 107-132 of ECRG4 and an antibody that recognizes the region consisting of the amino acid sequence of positions 133-148 of ECRG4 or the amino acid sequence of positions 71-132 of ECRG4 , a system for detecting the amount of ECRG4 polypeptide in a sample by an immunological method.
  • dementia it is possible to test for dementia.
  • the present invention since blood samples are targeted, dementia can be tested with low invasiveness.
  • an antibody that recognizes a region consisting of an amino acid sequence consisting of positions 107 to 132 of ECRG4, an antibody that recognizes a region consisting of an amino acid sequence of positions 133 to 148 of ECRG4, or an antibody that recognizes a region consisting of an amino acid sequence of positions 133 to 148 of ECRG4 or positions 71 to 132 of ECRG4 It is also possible to detect ECRG4 with high quantification by an immunological method in combination with an antibody that recognizes a region consisting of an amino acid sequence.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of detection of ECRG4 by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA method).
  • ELISA method enzyme-linked immunosorbent assay
  • the horizontal axis indicates the addition concentration of the ECRG4 partial polypeptide (polypeptide consisting of the amino acid sequence of positions 71 to 148 of human ECRG4 (amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2)) added to the detection system
  • the vertical axis indicates The axis indicates relative signal (absorbance at 450 nm).
  • a formula represents each approximation curve.
  • error bars represent ⁇ standard deviation (SD). It is a graph which shows the result of having detected ECRG4 by ELISA method.
  • an anti-ECRG4 mouse monoclonal antibody (2A8, addition concentration: 1 ⁇ g/ml (open circle) or 2 ⁇ g/ml (open triangle)
  • an anti-ECRG4 rabbit polyclonal antibody (OB1264) was used as the detection antibody.
  • addition concentration 1 ⁇ g/ml (left figure) or 2 ⁇ g/ml (right figure)).
  • the horizontal axis indicates the addition concentration of the ECRG4 partial polypeptide (polypeptide consisting of the amino acid sequence of positions 71 to 132 of human ECRG4 (amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2)) added to the detection system, and the vertical axis indicates The axis indicates relative signal (absorbance at 450 nm). Also, error bars represent ⁇ standard deviation (SD).
  • FIG. 4 is a dot plot diagram and graph showing the results of analyzing plasma levels of ECRG4.
  • “Dementia+MCI”, “AD” and “Non-dementia” indicate the analysis results for dementia patients, MCI patients, Alzheimer's disease patients and non-dementia patients, respectively.
  • the horizontal axis of the dot plot diagram indicates the age of each patient, and the vertical axis indicates the ECRG4 concentration in each individual patient. Also, white circles indicate females, and black circles indicate males. The vertical axis of the graph indicates the average concentration of ECRG4 in each patient group, and the error bars represent the standard deviation. Statistical significance was determined by t-test, * P ⁇ 0.05, ** P ⁇ 0.01, *** P ⁇ 0.001, *** P ⁇ 0.0001 represents that FIG. 3 is a dot plot diagram showing the results of analysis of plasma levels of ECRG4, amyloid beta (A ⁇ ) 40 and A ⁇ 42 in healthy subjects (8 individuals).
  • FIG. 4 is a dot plot diagram and graph showing the results of analyzing the ratio of A ⁇ 42/A ⁇ 40 in plasma.
  • the notation in the figure is the same as in FIG. 2A.
  • FIG. 2 is a dot plot diagram and graph showing the results of analyzing plasma levels of A ⁇ 40.
  • FIG. 2 is a dot plot diagram and graph showing the results of analyzing plasma levels of A ⁇ 42.
  • FIG. 2A The notation in the figure is the same as in FIG. 2A.
  • FIG. 4 is a dot plot diagram and graph showing the results of analyzing the ratio of A ⁇ 42/A ⁇ 40 in plasma.
  • the notation in the figure is the same as in FIG. 2A.
  • FIG. 2 is a dot plot diagram and graph showing the results of analyzing plasma levels of A ⁇ 42.
  • FIG. The notation in the figure is the same as in FIG. 2A.
  • FIG. 4 is a dot plot and graph showing the results of analyzing cerebrospinal fluid (CSF) levels of ECRG4.
  • CSF cerebrospinal fluid
  • FIG. 2 is a dot plot diagram and graph showing the results of analyzing CSF levels of A ⁇ 40.
  • FIG. 2 is a dot plot diagram and graph showing the results of analyzing CSF levels of A ⁇ 42.
  • FIG. 4 is a dot plot diagram and graph showing the results of analyzing the ratio of A ⁇ 42/A ⁇ 40 in CSF.
  • the notation in the figure is the same as in FIG. 2A.
  • the present invention has been completed based on the above findings, and provides a method for testing dementia, including the following steps (a) to (c). (a) detecting the amount of ECRG4 polypeptide in a blood sample separated from a subject; (b) comparing the amount of polypeptide detected in step (a) to a reference amount; (c) determining that the subject is suffering from dementia if the result of the comparison in step (b) is that the amount of polypeptide in the subject is higher than the reference amount;
  • Dementia is a type of cognitive disorder, and means a state in which intelligence, once normally developed, is irreversibly reduced due to an acquired organic disorder of the brain.
  • AD normal pressure hydrocephalus
  • iNPH idiopathic normal pressure hydrocephalus
  • PNFA progressive non-fluent aphasia
  • PSP progressive supranuclear palsy
  • DLB dementia with Lewy bodies
  • FTLD frontotemporal lobar degeneration
  • VaD vascular dementia
  • NIID neuronal intranuclear inclusion disease
  • dementia according to the present invention includes not only the so-called dementia described above, but also mild cognitive impairment (MCI), which is a pre-stage of dementia.
  • MCI mild cognitive impairment
  • the "subject” is not particularly limited as long as it is a human. include those who are determined to be suffering from the disease.
  • the "blood sample” separated from such a subject may be any sample containing blood, and examples thereof include whole blood, serum, and plasma.
  • Blood can be collected from a subject by methods known to those skilled in the art.
  • blood whole blood
  • Serum is a portion of whole blood from which blood cells and specific blood coagulation factors have been removed, and can be obtained, for example, as a supernatant after coagulation of whole blood.
  • Plasma is the portion of whole blood from which blood cells have been removed, e.g., by centrifugation under conditions that do not clot whole blood (e.g., in the presence of chelating agents such as EDTA, anticoagulants such as sodium citrate and heparin). It can be obtained as a supernatant when subjected to.
  • chelating agents such as EDTA, anticoagulants such as sodium citrate and heparin
  • the blood sample according to the present invention when the blood sample according to the present invention is subjected to a method for detecting the amount of polypeptide described later, it may be in a form suitable for the method (e.g., protein solution extracted from blood sample, formalin fixation, alcohol fixation, etc.). processed, frozen, or paraffin-embedded tissue, etc.).
  • a person skilled in the art can select and prepare a known technique in consideration of the type and condition of the blood sample.
  • the "ECRG4 polypeptide" detected as a blood marker for dementia is a human-derived polypeptide also referred to as AUGURIN, typically the nucleotide set forth in SEQ ID NO: 1 A polypeptide encoded by the sequence (a polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:2). It should be noted that the DNA sequence of a gene encoding a polypeptide may mutate naturally (that is, non-artificially) due to its mutation or the like. Therefore, ECRG4 polypeptides to be detected in the present invention are not limited to the typical amino acid sequences described above, but also include natural variants of those amino acid sequences.
  • ECRG4 polypeptides to be detected in the present invention include not only those consisting of full-length amino acid sequences, but also partial peptides thereof.
  • a partial peptide is not particularly limited, but is preferably a polypeptide comprising the amino acid sequence of positions 31-148 set forth in SEQ ID NO:2, more preferably a polypeptide containing the amino acid sequence of positions 71-148 set forth in SEQ ID NO:2.
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence more preferably a polypeptide comprising the amino acid sequence of positions 71 to 132 set forth in SEQ ID NO: 2 (a polypeptide comprising the M region of human ECRG4), more preferably SEQ ID NO: 2
  • the "amount of ECRG4 polypeptide" detected in the present invention may be not only an absolute amount but also a relative amount.
  • Relative amounts include, for example, percentages of the total polypeptide amount.
  • the relative amount includes a ratio of polypeptide amounts based on the measuring method or measuring device used for detection (a numerical value expressed in so-called arbitrary units (AU)).
  • AU arbitrary units
  • the relative amount for example, a value calculated based on the amount of the reference protein may be used.
  • the "reference protein” according to the present invention may be any protein that is stably present in a blood sample and has a small difference in amount between different blood samples.
  • an endogenous control (internal standard) protein and more specifically ⁇ -actin, ⁇ -tubulin, COX-4, GAPDH, Lamin B1, PCNA, TBP, VDCA1/Porin.
  • Detection of the amount of polypeptide can be carried out by a person skilled in the art by appropriately adopting a known technique.
  • known techniques include, for example, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), CLEIA (chemiluminescent enzyme immunoassay), latex agglutination, antibody array, immunoblotting, immunochromatography, imaging cytometry, flow cytometry, Methods of detection using antibodies (immunological methods), such as radioimmunoassay, immunoprecipitation, immunohistochemical staining, and mass spectrometry.
  • an antibody that recognizes an ECRG4 polypeptide is used, the antibody is brought into contact with the ECRG4 polypeptide, and the amount of the ECRG4 polypeptide is detected using the binding property of the antibody to the ECRG4 polypeptide as an index. be done.
  • the ECRG4 polypeptide in the blood sample is brought into contact with an antibody that recognizes the Ecrg4 polypeptide (capture antibody) immobilized on a solid phase such as a substrate.
  • an antibody that recognizes a labeled Ecrg4 polypeptide described below is allowed to act on the captured Ecrg4 polypeptide, and the label is chemically or optically detected to obtain Ecrg4
  • the amount of polypeptide can be detected.
  • the “capture antibody” and the “detection antibody” may be the same antibody or different antibodies as long as they recognize the ECRG4 polypeptide. From the viewpoint of being able to capture and detect, different antibodies are preferred. Examples of different antibodies include, for example, a combination in which the capture antibody is a polyclonal antibody that recognizes ECRG4 polypeptide and the detection antibody is a monoclonal antibody that recognizes ECRG4 polypeptide, and a combination in which the capture antibody is a monoclonal antibody that recognizes ECRG4 polypeptide.
  • the detecting antibody is a polyclonal antibody that recognizes the ECRG4 polypeptide, or the capturing antibody is a monoclonal antibody that recognizes the ECRG4 polypeptide, and the detecting antibody is the capturing antibody in the ECRG4 polypeptide
  • at least one of the capturing antibody and the detecting antibody is an antibody that recognizes a region consisting of the amino acid sequence of positions 71 to 148 of ECRG4, and more preferably, the capturing antibody and the detecting antibody.
  • At least one of the antibodies for is an antibody that recognizes a region consisting of the amino acid sequence of positions 71 to 132 of ECRG4, more preferably, at least one of the capture antibody and the detection antibody is an antibody that recognizes positions 107 to 132 of ECRG4.
  • An antibody that recognizes a region consisting of the amino acid sequence of, and more preferably, a combination of a capture antibody and a detection antibody An antibody (more preferably a monoclonal antibody) that recognizes a region consisting of an amino acid sequence at positions 71 to 132 (more preferably positions 107 to 132, more preferably positions 116 to 124) of ECRG4 and an amino acid sequence at positions 107 to 132 of ECRG4 Combination with an antibody (more preferably a polyclonal antibody) that recognizes a region consisting of; An antibody (more preferably a polyclonal antibody) that recognizes a region consisting of the amino acid sequence at positions 107 to 132 of ECRG4 and an amino acid sequence at positions 71 to 132 (more preferably positions 107 to 132, still more preferably positions 116 to 124) of ECRG4 combination with an antibody (more preferably a monoclonal antibody) that recognizes a region consisting of; An antibody (more preferably a monoclonal antibody
  • a method using a secondary antibody conjugated with a labeling substance or a method of binding a secondary antibody and a labeling substance can be used. Indirect detection methods can also be used, such as those that utilize a polymer that has been exposed.
  • the term "secondary antibody” refers to an antibody that exhibits specific binding to the antibody of the present invention.
  • protein G, protein A, or the like bound with a labeling substance may be used instead of the secondary antibody.
  • Mass spectrometry is a method in which a peptide sample (the aforementioned blood sample) is ionized using an ion source, and the peptide sample is ionized by moving it in a vacuum and using electromagnetic force or by a time-of-flight difference in the analysis unit.
  • a measurement method using a mass spectrometer that can separate and detect according to the mass-to-charge ratio.
  • Methods of ionization using an ion source include the EI method, the CI method, the FD method, the FAB method, the MALDI method, A method such as the ESI method can be selected as appropriate.
  • a separation method such as a magnetic field deflection type, a quadrupole type, an ion trap type, a time of flight (TOF) type, a Fourier transform ion cyclotron resonance type, etc. is appropriately selected. be able to.
  • tandem mass spectrometry combining two or more mass spectrometry methods and triple quadrupole mass spectrometry can be used.
  • multiple biomarker molecules are measured simultaneously in a single measurement by selected reaction monitoring (SRM) or multiple reaction monitoring (MRM) with a triple quadrupole mass spectrometer. be able to.
  • the mass spectrometer may be used alone, or by combining liquid chromatography (LC) and high performance liquid chromatography (HPLC), to separate and purify the peptides constituting the target polypeptide (ECRG4 polypeptide). can be used as a sample.
  • LC liquid chromatography
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • the amount of ECRG4 polypeptide thus detected is compared with a standard amount of the same polypeptide.
  • a person skilled in the art can make such a comparison by appropriately selecting and setting a statistical analysis method suitable for the above-described detection method, for example.
  • Statistical analysis methods include, for example, t-test, Mann-Whitney U-test, analysis of variance (ANOVA), Kruskal-Wallis test, Wilcoxon test, odds ratio, hazard ratio, Fisher's exact test, and receiver operating characteristic analysis. (ROC analysis), classification tree and decision tree analysis (CART analysis). Also, normalized or standardized and normalized data can be used in the comparison.
  • the "reference amount of ECRG4 polypeptide" to be compared is not particularly limited. It can be set as a so-called cut-off value that can distinguish between a person without dementia (for example, a healthy person or a non-dementia patient (a person suffering from a disease other than dementia)) and a dementia sufferer.
  • a reference amount for discriminating between dementia and non-dementia for example, a population not suffering from dementia (e.g., a healthy population, a population of non-dementia patients) ECRG4 poly detected in Median or mean values for peptides are included.
  • a value determined by comparing the amount of ECRG4 polypeptide in a population not suffering from dementia and a population suffering from dementia e.g., a population not suffering from dementia and the amount of polypeptide in a population suffering from dementia
  • a more specific example of such a reference amount is 0.1 ng/ml, preferably 0.2 ng/ml, and more preferably 0.4 ng/ml, as shown in Examples (FIG. 2A) described later.
  • ml more preferably 0.6 ng/ml, more preferably 0.7 ng/ml, still more preferably 0.8 ng/ml, more preferably 0.9 ng/ml.
  • the amount of polypeptide in the subject is higher than the reference amount can be appropriately determined, for example, by a person skilled in the art based on the statistical analysis method described above. Also, for example, the detected amount of polypeptide is higher than the reference amount, and the difference is statistically significant (eg, P ⁇ 0.05). Also, for example, the amount of the detected polypeptide is twice or more the corresponding reference amount (preferably, 3 times or more, 4 times or more, 5 times or more, 6 times or more, 7 times or more, 8 times or more, 9 times or more ) is also mentioned. Then, in the test method of the present invention, when the polypeptide amount in the subject is higher than the reference amount, the subject is determined to be suffering from dementia.
  • the term “affected” includes not only having already developed dementia, but also a state where there is a risk of developing dementia.
  • the method of the present invention includes a method of collecting data on the above-mentioned polypeptide amount for diagnosis by a doctor, a method of presenting the data to the doctor, and a method of comparing and analyzing the above-mentioned polypeptide amount and a reference amount. , a method for assisting diagnosis by a doctor.
  • testing method of the present invention may be performed in combination with other testing methods for dementia.
  • Such other examination methods are not particularly limited, but for example, electroencephalogram diagnosis, biochemical examination for blood/cerebrospinal fluid, CT, MRI, PET/SPECT, amyloid imaging (amyloid PET examination), etc. diagnostic imaging.
  • dementia can be tested according to the present invention. Then, based on the result of such evaluation, it is possible to determine whether or not to treat dementia.
  • the present invention can also provide a method for treating dementia, including the step of treating a subject determined to have dementia by the testing method of the present invention.
  • treatments for dementia are not particularly limited, but include, for example, immunotherapy and methods of administering agents for suppressing lesions of dementia.
  • Immunotherapies include, for example, active immunotherapy (vaccine therapy) using partial peptides of A ⁇ for suppression of aggregation of amyloid beta (A ⁇ ), and passive immunotherapy in which antibodies against A ⁇ are administered.
  • drugs administered to suppress dementia lesions include, for example, drugs for suppressing A ⁇ production ( ⁇ secretase modulator (GSM), ⁇ secretase modulator inhibitor (GSI), non-steroidal anti-inflammatory drugs, etc.), drugs for suppressing A ⁇ aggregation (curcumin, polysulfate compounds, clioquinol, etc.), drugs for suppressing tau aggregation (aminothienopyridazine, cyanine dyes, methylene blue, etc.), neuroprotective drugs ( dimebon etc.), cholinesterase inhibitors (donepezil etc.), acetylcholinesterase inhibitors (galantamine etc.), glutamic acid NMDA receptor inhibitors (memantine etc.).
  • GSM secretase modulator
  • GSI ⁇ secretase modulator inhibitor
  • non-steroidal anti-inflammatory drugs etc.
  • drugs for suppressing A ⁇ aggregation curcumin, polysulfate compounds, clioquinol, etc.
  • the presence or absence of dementia can be determined by detecting the amount of ECRG4 polypeptide using an antibody that recognizes the polypeptide.
  • the present invention provides an agent for testing dementia by the method described above, the agent comprising an antibody that recognizes Ecrg4 polypeptide.
  • the “antibody” contained in the agent of the present invention may be a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, or a functional fragment of an antibody.
  • Antibody includes all classes and subclasses of immunoglobulins.
  • a “polyclonal antibody” is an antibody preparation containing different antibodies directed against different epitopes.
  • a “monoclonal antibody” also means an antibody (including antibody fragments) obtained from a substantially homogeneous population of antibodies. In contrast to polyclonal antibodies, monoclonal antibodies recognize a single determinant on an antigen.
  • the term "functional fragment” of an antibody means a portion (partial fragment) of an antibody that specifically recognizes a target protein. Specifically, Fab, Fab', F(ab')2, variable region fragment (Fv), disulfide bond Fv, single chain Fv (scFv), sc(Fv)2, diabodies, multispecific antibodies, and polymers thereof.
  • the antibody according to the present invention is a polyclonal antibody, immunize an immunized animal with an antigen (ECRG4 polypeptide, cells expressing it, etc.), and remove the antiserum by conventional means (e.g., salting out, centrifugation) , dialysis, column chromatography, etc.).
  • an antigen ECRG4 polypeptide, cells expressing it, etc.
  • remove the antiserum by conventional means (e.g., salting out, centrifugation) , dialysis, column chromatography, etc.).
  • monoclonal antibodies can be produced by the hybridoma method or recombinant DNA method.
  • a representative example of the hybridoma method is Kohler and Milstein's method (Kohler & Milstein, Nature, 256:495 (1975)).
  • the DNA encoding the antibody of the present invention is cloned from hybridomas, B cells, etc., incorporated into an appropriate vector, and transformed into host cells (e.g., mammalian cell lines, E. coli, yeast cells, insect cells, etc.).
  • the antibody according to the present invention is not particularly limited as long as it can recognize the ECRG4 polypeptide.
  • At least one selected from an antibody (more preferably a monoclonal antibody) that recognizes the region consisting of the amino acid sequence of and an antibody (more preferably a polyclonal antibody) that recognizes the region consisting of the amino acid sequence of positions 107 to 132 of ECRG4 is an antibody.
  • Antibodies according to the present invention may also be provided in a solid-phased form for use in ELISA, antibody arrays, and the like.
  • the solid phase include plates such as plastic plates, fibrous substances such as nitrocellulose, and particles such as magnetic particles and latex particles.
  • the antibody may be labeled with a labeling substance in accordance with the above detection method.
  • Labeling substances include, for example, enzymes such as HRP, ⁇ -D-glucosidase and luciferase; luminous substances such as luminol, luciferin and lucigenin; fluorescent substances such as FITC, FAM, DEAC, R6G, TexRed and Cy5 ; Examples include radioactive isotopes such as H, 14 C, 32 P, 35 S and 123 I, and affinity substances such as biotin and streptavidin.
  • enzymes such as HRP, ⁇ -D-glucosidase and luciferase
  • luminous substances such as luminol, luciferin and lucigenin
  • fluorescent substances such as FITC, FAM, DEAC, R6G, TexRed and Cy5 ;
  • radioactive isotopes such as H, 14 C, 32 P, 35 S and 123 I
  • affinity substances such as biotin and streptavidin.
  • the agent of the present invention can contain other ingredients that are acceptable as a composition, in addition to the antibody.
  • Such other ingredients include, for example, pharmacologically acceptable carriers or diluents (sterile water, physiological saline, vegetable oils, excipients, disintegrants, buffers, emulsifiers, suspending agents, stabilizers, preservatives, preservatives, etc.).
  • pharmacologically acceptable carriers or diluents sterile water, physiological saline, vegetable oils, excipients, disintegrants, buffers, emulsifiers, suspending agents, stabilizers, preservatives, preservatives, etc.
  • excipients lactose, starch, sorbitol, D-mannitol, white sugar and the like can be used.
  • Starch, carboxymethyl cellulose, calcium carbonate and the like can be used as the disintegrant.
  • Phosphate, citrate, acetate and the like can be used as
  • Gum arabic, sodium alginate, tragacanth and the like can be used as emulsifiers.
  • suspending agents glyceryl monostearate, aluminum monostearate, methylcellulose, carboxymethylcellulose, hydroxymethylcellulose, sodium lauryl sulfate and the like can be used.
  • Propylene glycol, dietyrin sulfite, ascorbic acid and the like can be used as stabilizers.
  • Preservatives that can be used include phenol, benzalkonium chloride, benzyl alcohol, chlorobutanol, methylparaben, and the like.
  • antiseptics sodium azide, benzalkonium chloride, paraoxybenzoic acid, chlorobutanol and the like can be used.
  • substrates necessary for label detection solutions for dissolving proteins in samples (blood samples, etc.) (protein dissolution reagents), buffers used for sample dilution and washing Solution (diluent, washing solution), reagent for stopping the detection reaction of the label (reaction stopping agent), positive control (e.g., ECRG4 polypeptide, standard, blood sample derived from dementia patient), negative control (e.g. , a blood sample derived from a person not suffering from dementia), an isotype control antibody against the antibody according to the present invention, etc. can be combined, and a kit for testing dementia can be prepared.
  • ECRG4 polypeptide e.g., ECRG4 polypeptide, standard, blood sample derived from dementia patient
  • negative control e.g. , a blood sample derived from a person not suffering from dementia
  • kits include, for example, at least one antibody that recognizes an ECRG4 polypeptide, and at least one article selected from an isotype control antibody against the antibody, a positive control, and a negative control for testing dementia. Kits are included. Moreover, when an unlabeled antibody is used as an antibody sample, it can be combined with a labeled substance (eg, secondary antibody, protein G, protein A, etc.) that binds to the antibody. Additionally, such kits can include instructions for use of the kit.
  • a labeled substance eg, secondary antibody, protein G, protein A, etc.
  • an antibody that recognizes a region consisting of an amino acid sequence consisting of positions 107 to 132 of ECRG4 and an antibody that recognizes a region consisting of an amino acid sequence of positions 134 to 139 of ECRG4 or 116 to 124 of ECRG4 It is possible to detect ECRG4 with high quantification by using an immunological method in combination with an antibody that recognizes the region consisting of the amino acid sequence (see Fig. 1, etc.).
  • the present invention An antibody that recognizes a region consisting of the amino acid sequence of positions 107 to 132 of ECRG4 polypeptide and an antibody that recognizes a region consisting of the amino acid sequence of positions 133 to 143 of ECRG4 or a region consisting of the amino acid sequence of positions 71 to 132 of ECRG4.
  • a method of detecting the amount of ECRG4 polypeptide in a sample by an immunological method using a recognizing antibody An antibody that recognizes a region consisting of the amino acid sequence of positions 107 to 132 of ECRG4 polypeptide and an antibody that recognizes a region consisting of the amino acid sequence of positions 133 to 143 of ECRG4 or a region consisting of the amino acid sequence of positions 71 to 132 of ECRG4.
  • an agent for detecting the amount of ECRG4 polypeptide in a sample comprising a recognizing antibody;
  • a system is provided for detecting the amount of ECRG4 polypeptide in a sample by an immunological method.
  • the explanation of the methods, drugs and systems, and their components conforms to the explanations in ⁇ Method for testing dementia> and ⁇ Drugs for testing dementia> above.
  • the "sample” targeted by these is not limited to the above blood sample, as long as it can contain the ECRG4 polypeptide. tissue, its cells, etc.).
  • the system of the present invention may include a unit capable of performing an immunological method in addition to the antibody or drug containing the antibody.
  • units include, for example, units for detecting a labeling substance directly or indirectly bound to an antibody and measuring the amount of antibody bound to an ECRG4 polypeptide in a sample (spectrophotometer, fluorescence spectrophotometer, etc.); units for injecting or removing samples, antibodies, washing solutions, reagents, etc.; units for handling the solid phases such as plates (eg, robot arms); and units for controlling these units. It is not limited.
  • An anti-ECRG4 rabbit polyclonal antibody (hereinafter also referred to as "OB1264") is prepared by injecting a synthetic peptide (a polypeptide consisting of positions 107 to 132 of human ECRG4 (amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2)) into a rabbit using a conventional method. It was prepared by immunization (produced by Medical and Biological Laboratories Co., Ltd.).
  • Anti-ECRG4 mouse monoclonal antibodies were prepared by synthesizing various partial peptides of human ECRG4 using a conventional method and immunizing mice to prepare hybridomas. Then, 5 million of each selected hybridoma was intraperitoneally injected into 8-week-old NOD/SCID mice, and ascites was collected. As a result, monoclonal antibodies recognizing each of the partial peptides shown below could be obtained.
  • an anti-ECRG4 mouse monoclonal antibody that recognizes positions 116-124 of human ECRG4 hereinafter also referred to as "2A8”
  • An anti-ECRG4 mouse monoclonal antibody hereinafter also referred to as "1H4"
  • 1H4 an anti-ECRG4 mouse monoclonal antibody that recognizes a polypeptide consisting of positions 134-139 of human ECRG4.
  • the anti-ECRG4 rabbit polyclonal antibody and anti-ECRG4 mouse monoclonal antibody were purified by fast flow using Protein A Sepharose 4 (manufactured by GE Healthcare) according to the instructions for use.
  • ECRG4 sandwich ELISA assay First, a 96-well plate (manufactured by Falcon) was treated overnight at 4° C. with 50 ⁇ l of mouse anti-ECRG4 antibody (1 ⁇ g/ml or 2 ⁇ g/ml)-containing carbonate buffer (0.05 M, pH 9.5). coated. After washing the plate five times with wash buffer (0.05% Tween-20/PBS), the plate was incubated with 150 ⁇ l of blocking buffer (5% skimmed milk in carbonate buffer) for 90 minutes at room temperature.
  • wash buffer 0.05% Tween-20/PBS
  • TMB Microwell Peroxidase Substrate System manufactured by KPL
  • Amyloid beta (A ⁇ )40 and A ⁇ 42 ELISA assay The concentrations of A ⁇ 40 and A ⁇ 42 in plasma and CSF were measured using Human/Rat ⁇ Amyloid40 and ⁇ Amyloid42 ELISA Kits WAKO (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) according to the contents of the instruction manual.
  • MMSE Mini-Mental State Examination
  • AD Alzheimer's disease
  • NPH normal pressure hydrocephalus
  • iNPH idiopathic normal pressure hydrocephalus
  • PNFA progressive non-fluent aphasia
  • PSP progressive supranuclear palsy
  • DLB dementia with Lewy bodies
  • FTLD frontal Temporal lobe degeneration
  • VaD vascular dementia
  • NIID neuronal intranuclear inclusion disease
  • MCI mild cognitive impairment.
  • the diseases shown in Table 2 are as follows. Myospasm: muscle spasm, Myoclonus: myoclonus, migraine: migraine, syringomyelia: syringomyelia, hysteria: hysteria, limbic encephalitis: limbic encephalitis, myopathy: myopathy, Neuromyelitis optic: neuromyelitis optica, epilepsy: epilepsy Aseptic meningitis, psychogenic reaction, episodic ataxia, sarcoidosis, neuro-Behcet, tuberculous meningitis, femoral neuropathy, multiple cerebral infarction: multiple cerebral infarction, multiple sclerosis: multiple sclerosis, postsuscitation encephalopathy: postresuscitative encephalopathy, myelopathy: myelopathy, fibromyalgia: fibromyalgia, dystonia: dystonia, spastic paraplegia: spastic paraplegia, musculopathy Atrophy, Huntington'
  • Plasma and CSF samples treated with EDTA were used in patients diagnosed with dementia, including AD, normal pressure hydrocephalus (NPH) and mild cognitive impairment (MCI), as well as multiple system atrophy (MSA) and myopathy. were obtained using standard methods (Waybright et al, 2010, Menck et al, 2017) from a patient diagnosed as non-demented with neuropathy. Plasma samples were also obtained from 8 healthy individuals as controls (Fig. 2B). Informed consent was obtained from all subjects, and this study was approved by the Ethics Committee of Hokkaido University.
  • a sense oligonucleotide and an antisense oligonucleotide encoding a polypeptide consisting of amino acids 133 to 148 of mouse Ecrg4 (amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4) are annealed, pFUSE-mEcrg4(133-148)-hIgG1Fc2 ( 133-148) were inserted into pFUSE-hIgG1Fc2.
  • the following primer set was used to synthesize a cDNA encoding a polypeptide consisting of amino acids 32-70 of mouse Ecrg4 (amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4).
  • the following primer set was used to synthesize a cDNA encoding a polypeptide consisting of amino acids 71-132 of mouse Ecrg4.
  • 5′ primer 5′-TGATATCGCAGCTGTGGGACCGTACG-3′ (SEQ ID NO: 7) and 3′ primer: 5′-AAGATCTGTGGGGACCAATGGCCGCA-3′ (SEQ ID NO: 8)
  • the following primer set was used to synthesize a cDNA encoding a polypeptide consisting of amino acids 133-148 of mouse Ecrg4.
  • 5′ primer 5′-ATCGAGCCGGAAAGCTTCAGGCATGGAGCCAGTGTCAACTATAATGACTATA-3′ (SEQ ID NO: 9) and 3′ primer: 5′-GATCTATAGTCATTATAGTTGACACTGGCTCCATGCCTGAAGCTTTCCCGGCTCGAT-3′ (SEQ ID NO: 10).
  • the nucleotide sequences of the cDNAs cloned using these primer sets were confirmed using BigDye Terminator Kit version 3.1 (manufactured by Thermo Fisher Scientific) and ABI sequencer model 3130xl (manufactured by Thermo Fisher Scientific).
  • Ecrg4 (addition concentration: 1 ⁇ g / ml, detection antibody: OB1264), Ecrg4 (addition concentration: 1 ⁇ g / ml, detection antibody: 2A8) or GAPDH (dilution: 1:1000, detection antibody: anti-mouse Ab, Chemicon) made).
  • these primary antibodies are HRP-labeled anti-mouse IgG antibody (dilution: 1:5000, manufactured by Santa Cruz Biotechnology), HRP-labeled anti-rabbit IgG antibody (dilution: 1 :5000, Santa Cruz Biotechnology) and HRP-labeled anti-human IgG antibody (dilution: 1:500, Bethyl Laboratories).
  • Immunostaining was performed according to the method described in Nishide et al, 2009, Kujuro et al, 2010. Briefly, first, various vectors were introduced into 293T cells as described above. Three days after the gene transfer, the cells were fixed and subjected to immunostaining with 2A8 (1 ⁇ g/ml) and OB1264 (1 ⁇ g/ml), respectively.
  • Human Fc, mouse Fc and rabbit Fc are Alexa488-labeled anti-human IgG antibody (dilution: 1:1000, ThermoFisher Scientific), Alexa594-labeled anti-mouse IgG antibody (dilution: 1:1000, ThermoFisher Scientific), and Alexa594-labeled anti-rabbit IgG antibody (dilution ratio: 1:1000, ThermoFisher Scientific).
  • Cells were counterstained with Hoechst 33342 (addition concentration: 1 ⁇ g/ml, ThermoFisher Scientific) to visualize nuclei. Fluorescence images were acquired using an AxioImager M1 microscope (manufactured by Carl Zeiss).
  • the optimum concentrations of both OB1264 and 2A8 to be used are 1 ⁇ g/ml in detecting the ECRG4 polypeptide.
  • the aforementioned Western blotting and immunostaining analyzes were performed to confirm that OB1264 and 2A8, respectively, can detect ECRG4 polypeptide, but not detect proteins other than Ecrg4.
  • these antibodies do not detect Ecrg4 regions other than positions 71-132, while the ECRG4 polypeptide (positions 71-132) can be detected by OB1264 and 2A8, respectively.
  • Plasma ECRG4 levels were analyzed using the ECRG4 ELISA assay in subjects with dementia, MCI, and non-dementia with neuropathy, as described above. As a result, as shown in Table 3 below and FIG. 80), ECRG4 was detected in each plasma.
  • the ECRG4 positive rate (ECRG4 signal detection rate in plasma) in female dementia patients and MCI patients is 51% (46/91) and 35% (6/17), respectively, and those in male patients are 49% (33/68) and 9% (1/11) respectively.
  • ECRG4 was detected in 47% (61/129) of AD patients and 60% (18/30) of non-AD dementia patients.
  • the ECRG4 positive rate in AD patients was 44% (24/54) in males and 49% (37/75) in females.
  • the positive rate of ECRG4 in plasma in non-dementia patients with neurological disease was 5% (4/80).
  • the average ECRG4 level in plasma was 0.96 ng/ml in dementia and MCI patients and 1.02 ng/ml in AD patients, as shown in Figure 2A. On the other hand, it was 0.08 ng/ml in non-dementia patients. Furthermore, in contrast to these, ECRG4 could not be detected in the plasma of healthy subjects as shown in FIG. 2B.
  • the MMSE score is 23 points or less and dementia is suspected
  • the positive rate of ECRG4 in plasma was 34% (23/67), and the positive rate of ECRG4 in plasma was 13% ( 4/31).
  • a ⁇ 40 and A ⁇ 42 are known to be involved in the formation of amyloid plaques in the brain parenchyma, resulting in decreased levels thereof in the plasma and CSF of AD patients.
  • aggregation of A ⁇ 42 occurs earlier than A ⁇ 40 (Hampel et al, 2010), which has been shown to reduce the ratio of A ⁇ 42/A ⁇ 40 in the plasma and CSF of AD patients (Palmqvist et al, 2019).
  • ECRG4 was not detected in 95% of non-dementia patients in plasma, although it was detected in 50% of dementia and MCI patients.
  • ECRG4 levels in dementia patients and MCI patients were much higher than those in non-dementia patients, demonstrating that ECRG4 is extremely effective as a plasma biomarker for dementia.
  • Palmqvist S Zinc S
  • Werner S Zinc S
  • Zetterberg H Brix B
  • Eichenlaub U Dage JL
  • Chai X Blennow K
  • Mattsson N Hansson O.; (2019).
  • the present invention it is possible to test for dementia.
  • the test can be performed using a blood sample, it is less invasive and does not place a heavy burden on the subject. Therefore, the present invention is extremely useful in the medical field related to dementia.

Abstract

認知症患者と健常者とを判別することを可能とする血中バイオマーカー分子を同定し、当該分子の量を指標とする認知症の検査方法を提供することを目的とし、認知症患者、軽度認知障害患者及び非認知症患者等の血漿における、ＥＣＲＧ４の陽性率及び濃度を検出した。その結果、血漿においてＥＣＲＧ４は、認知症患者及び軽度認知障害の５０％において検出されたにも関わらず、非認知症患者の９５％において検出されなかった。さらに、認知症患者及びＭＣＩ患者におけるＥＣＲＧ４の血漿レベルは、非認知症患者におけるそれと比してはるかに高く、認知症の血中バイオマーカー分子としてＥＣＲＧ４が極めて有効であることを見出した。

Description

認知症の検査方法
　本発明は、認知症の検査方法に関し、より詳しくは、ＥＣＲＧ４の血中レベルを指標として認知症を検査する方法等に関する。本発明はまた、免疫学的方法によりＥＣＲＧ４ポリペプチド量を検出する方法、及び当該検出を行うためのシステム等に関する。
　アルツハイマー病（ＡＤ）等の認知症は、主に初老期～老年期に生じる進行性の神経変性疾患である。その主な症状は、記憶障害、高次脳機能障害（失語、失行、失認、構成失行）、人格の変化等である。そして、このような症状故、患者本人の生活の質の低下のみならず、家族等の周囲の生活にも多大な影響を与えている。さらに、その患者数は人口の高齢化に伴い増加の一途を辿っており、認知症は世界的に現代社会の抱える深刻な問題となっている。
　しかしながら、昨今、認知症の症状の進行を遅らせることは可能となりつつある。例えば、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤が、実際に臨床の場で使用され、それなりの成果をあげ、症状の進行をある程度抑えることも可能になっている。また、アデュカヌマブ（抗アミロイドベータ（Ａβ）抗体）が、米国においてＡＤ治療薬として承認され、ＡＤによる軽度認知障害（ＭＣＩ）及び軽度ＡＤの臨床状態の悪化を遅らせること等が期待されている。そのため、かかる状況を鑑み、認知症の治療においては、早期又は発症前診断法の開発が喫緊の課題となっている。
　認知症が発症する前段階、すなわち軽度の臨床的症状が現れる段階は、ＭＣＩと称され、それは正常な老化（健常状態）と認知症との中間段階として定義されている。そして、ＭＣＩを検査する方法として、様々な神経心理学的検査が主に用いられており、例えば、見当識、短期及び長期の記憶、行動、言語及び理解について検査し、認知障害をスコア化する、フォルスタインのミニメンタルステート検査（ＭＭＳＥ）が用いられている。しかしながら、このような問診法はあくまでスクリーニング目的で用いられ、確定診断に至ることはない。
　また、リン酸化タウ、Ａβ４０、Ａβ４２等が、ＡＤバイオマーカーとして利用されているが、実際の臨床において、それらの有効性はまだ不十分な現状にあり、さらに感度や特異度の高いバイオマーカーの発見とそれを利用した検査方法の開発が求められている（非特許文献１～３）。
　さらに、これらバイオマーカーを検出する上でも、認知症の検査方法として、ＣＴ、ＭＲＩ、ＰＥＴ／ＳＰＥＣＴ等の画像診断等の開発が進められている。しかしながら、画像診断には特殊な設備を必要とするため、実施できる医療機関が限られる。また現状の画像診断技術により、認知症が発症する前段階と健常状態等との差を捉えることは依然として難しいため、画像を見る医師によって判断が異なることがあり、客観性に欠けるという欠点も有する。
　このように、客観的かつ精度高く認知症患者と健常者とを判別できる方法は、確立していないのが現状である。そのため、血液のような容易に得られる被検体の試料を用い、客観的な診断を可能にするバイオマーカーの探索が、認知症の検査方法において重要視されている。
　しかしながら、ＡＤ等やその前段階であるＭＣＩに関しては、未だ有用な血中バイオマーカーとなり得る分子は見出されておらず、精度高く認知症を検査できる方法は未だ開発されていないのが現状である。
Ｋｒａｎｃｅ　ｅｔ　ａｌ，２０１９，Ｊ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，　３９，７４２８－７４３７． Ｍａｎｃａ　ｅｔ　ａｌ，２０１９，Ｊ　Ｎｅｕｒｏｌ，２６６，　１６８５－１６９２． Ｒｅｉｍａｎｄ　ｅｔ　ａｌ，２０１９，Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ　Ｒｅｓ　Ｔｈｅｒ，１１，１００． Ｋｕｊｕｒｏ　ｅｔ　ａｌ，２０１０，ＰＮＡＳ，１０７，８２５９－８２６４． Ｘｕ　ｅｔ　ａｌ，２００７，Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，３６，３１３－３３１． Ｂａｉｒｄ　ｅｔ　ａｌ，２０１２，Ｊ　Ｌｅｕｋｏｃ　Ｂｉｏｌ，９１，７７３－７８１． Ｍｏｒｉｇｕｃｈｉ　ｅｔ　ａｌ，２０１６，ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｏｌｏｇ，５，ｅ１２４２５４７ Ｍｏｒｉｇｕｃｈｉ　ｅｔ　ａｌ，２０１８，Ｓｃｉ　Ｒｅｐ，８，４０４８．
　本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、認知症患者と健常者とを判別することを可能とする血中バイオマーカー分子を同定し、当該分子の量を指標とする認知症の検査方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ＥＣＲＧ４に着目した。ＥＣＲＧ４は、本発明者らによって、神経幹細胞／前駆細胞を用いた細胞老化実験系から、神経細胞の細胞老化に関与していることが明らかになったタンパク質である（非特許文献４）。また、ＥＣＲＧ４は、ＡＤ患者の海馬についての網羅的な遺伝子発現解析にて、健常者と比較して顕著に発現が亢進しているという報告もある（非特許文献５）。さらに、Ｅｃｒｇ４（全長１４８アミノ酸）は、様々なプロテアーゼによりペプチドに分解されることが知られているが、これらペプチド断片（７１～１３２位のアミノ酸からなる領域（Ｍペプチド領域）、１３３～１４８位のアミノ酸からなる領域（Ｃペプチド領域））は、ミクログリア／マクロファージを活性化し炎症性サイトカイン発現を誘導することが、本発明者らや別のグループによって報告されている（非特許文献６～８）。しかしながら、当該タンパク質の血中レベルがどのようになっているかは明らかになっていなかった。
　そこで、本発明者らは、先ず、ＥＣＲＧ４の１０７～１３２位からなるアミノ酸配列を認識するウサギポリクローナル抗体と、ＥＣＲＧ４の７１～１４８位からなるアミノ酸配列を認識するマウスモノクローナル抗体等とを組み合わせて用いることにより、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ法）によるＥＣＲＧ４検出系を構築した。
　特に、ＥＣＲＧ４の１０７～１３２位からなるアミノ酸配列を認識するポリクローナル抗体と、ＥＣＲＧ４の１１６～１２４位のアミノ酸配列を認識するモノクローナル抗体又はＥＣＲＧ４の１３４～１３９位のアミノ酸配列を認識するモノクローナル抗体とを組み合わせて用いたＥＬＩＳＡ法によって、ＥＣＲＧ４を高い定量性をもって検出できることを見出した。
　そして、かかる検出系を用い、アルツハイマー病等を含む認知症の罹患者、軽度認知障害（ＭＣＩ）の患者、神経障害を伴う非認知症患者等の血漿における、ＥＣＲＧ４の陽性率及び濃度を検出した。その結果、血漿においてＥＣＲＧ４は、認知症患者及びＭＣＩ患者の５０％において検出されたにも関わらず、非認知症患者の９５％において検出されなかった。さらに、認知症患者及びＭＣＩ患者におけるＥＣＲＧ４の血漿レベルは、非認知症患者におけるそれと比してはるかに高く、認知症の血中バイオマーカーとしてＥＣＲＧ４が極めて有効であることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、ＥＣＲＧ４の血中レベルを指標として認知症を検査する方法等に関し、より具体的には以下に関する。
　＜１＞　下記（ａ）～（ｃ）の工程を含む、認知症を検査する方法
（ａ）被検体から分離された血液試料について、ＥＣＲＧ４ポリペプチドの量を検出する工程、
（ｂ）工程（ａ）で検出したポリペプチド量を基準量と比較する工程、
（ｃ）工程（ｂ）における比較の結果、前記被検体におけるポリペプチド量が基準量よりも高い場合、前記被検体は認知症を罹患していると判定する工程。
　＜２＞　前記血液試料が血漿である、＜１＞に記載の方法。
　＜３＞　前記ＥＣＲＧ４ポリペプチドの量の検出を、免疫学的方法により行う＜１＞又は＜２＞に記載の方法。
　＜４＞　前記免疫学的方法は、ＥＣＲＧ４の７１～１３２位のアミノ酸配列からなる領域を認識する抗体を、少なくとも用いる方法である、＜１＞～＜３＞のうちのいずれか一項に記載の方法。
　＜５＞　前記免疫学的方法は、酵素結合免疫吸着法である、＜１＞～＜４＞のうちのいずれか一項に記載の方法。
　＜６＞　ＥＣＲＧ４ポリペプチドを認識する抗体を含む、＜１＞～＜５＞のうちのいずれか一項に記載の方法によって認知症を検査するための薬剤。
　＜７＞　前記抗体は、ＥＣＲＧ４の７１～１３２位のアミノ酸配列からなる領域を認識する抗体である、＜６＞に記載の薬剤。
　＜８＞　ＥＣＲＧ４の１０７～１３２位のアミノ酸配列からなる領域を認識する抗体と、ＥＣＲＧ４の１３３～１４８位のアミノ酸配列からなる領域を認識する抗体又はＥＣＲＧ４の７１～１３２位のアミノ酸配列からなる領域を認識する抗体とを用いる免疫学的方法により、試料中のＥＣＲＧ４ポリペプチド量を検出する方法。
　＜９＞　前記免疫学的方法は、酵素結合免疫吸着法である、＜８＞に記載の方法。
　＜１０＞　ＥＣＲＧ４の１０７～１３２位のアミノ酸配列からなる領域を認識する抗体と、ＥＣＲＧ４の１３３～１４８位のアミノ酸配列からなる領域又はＥＣＲＧ４の７１～１３２位のアミノ酸配列を認識する抗体とを含む、試料中のＥＣＲＧ４ポリペプチド量を免疫学的方法により検出するためのシステム。
　＜１１＞　前記免疫学的方法は、酵素結合免疫吸着法である、＜１０＞に記載のシステム。
　本発明によれば、認知症を検査することが可能となる。特に、本発明においては、血液試料を対象とするため、侵襲性低く認知症を検査できる。
　また、本発明において、ＥＣＲＧ４の１０７～１３２位からなるアミノ酸配列からなる領域を認識する抗体と、ＥＣＲＧ４の１３３～１４８位のアミノ酸配からなる領域列を認識する抗体又はＥＣＲＧ４の７１～１３２位のアミノ酸配列からなる領域を認識する抗体とを組み合わせて用いる免疫学的方法によって、ＥＣＲＧ４を高い定量性をもって検出することも可能となる。
酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ法）によりＥＣＲＧ４を検出した結果を示すグラフである。ＥＬＩＳＡによるＥＣＲＧ４検出系において、捕獲用抗体（Ｃａｐｔｕｒｅ　Ａｂ）として抗ＥＣＲＧ４マウスモノクローナル抗体（２Ａ８又は１Ｈ４、添加濃度：１μｇ／ｍｌ）を用い、検出用抗体として抗ＥＣＲＧ４ウサギポリクローナル抗体（ＯＢ１２６４、添加濃度：１μｇ／ｍｌ）を用いた。図中、横軸は、ＥＣＲＧ４部分ポリペプチド（ヒトＥＣＲＧ４（配列番号：２に記載のアミノ酸配列）の７１～１４８位のアミノ酸配列からなるポリペプチド）の前記検出系への添加濃度を示し、縦軸は、相対的シグナル（４５０ｎｍにおける吸光度）を示す。数式は各近似曲線を表す。また、エラーバーは±標準偏差（ＳＤ）を表す。 ＥＬＩＳＡ法によりＥＣＲＧ４を検出した結果を示すグラフである。ＥＬＩＳＡによるＥＣＲＧ４検出系において、Ｃａｐｔｕｒｅ　Ａｂとして抗ＥＣＲＧ４マウスモノクローナル抗体（２Ａ８、添加濃度：１μｇ／ｍｌ（白丸）又は２μｇ／ｍｌ（白三角））を用い、検出用抗体として抗ＥＣＲＧ４ウサギポリクローナル抗体（ＯＢ１２６４、添加濃度：１μｇ／ｍｌ（左図）又は２μｇ／ｍｌ（右図））を用いた。図中、横軸は、ＥＣＲＧ４部分ポリペプチド（ヒトＥＣＲＧ４（配列番号：２に記載のアミノ酸配列）の７１～１３２位のアミノ酸配列からなるポリペプチド）の前記検出系への添加濃度を示し、縦軸は、相対的シグナル（４５０ｎｍにおける吸光度）を示す。また、エラーバーは±標準偏差（ＳＤ）を表す。 ＥＣＲＧ４の血漿レベルを分析した結果を示す、ドットプロット図とグラフである。図中、「Ｄｅｍｅｎｔｉａ＋ＭＣＩ」、「ＡＤ」及び「Ｎｏｎ－ｄｅｍｅｎｔｉａ」は、認知症患者及びＭＣＩ患者、アルツハイマー病患者、並びに非認知症患者についての分析結果を各々示す。ドットプロット図の横軸は、各患者の年齢を示し、縦軸は各患者個々におけるＥＣＲＧ４濃度を示す。また、白丸は女性を示し、黒丸は男性を示す。グラフの縦軸は、各患者群におけるＥＣＲＧ４の平均濃度を示し、エラーバーは標準偏差を表す。なお、統計的有意性はｔ検定によって決定し、＊はＰ＜０．０５，＊＊はＰ＜０．０１，＊＊＊はＰ＜０．００１，＊＊＊＊はＰ＜０．０００１であることを表す。 健常人（８個体）における、ＥＣＲＧ４、アミロイドベータ（Ａβ）４０及びＡβ４２の血漿レベルを分析した結果を示す、ドットプロット図である。ドットプロット図の横軸は、健常人個々を表し、縦軸は各健常人個々におけるＥＣＲＧ４等の濃度を示す。 血漿におけるＡβ４２／Ａβ４０の比率を分析した結果を示す、ドットプロット図とグラフである。図中の表記については図２Ａと同様である。 Ａβ４０の血漿レベルを分析した結果を示す、ドットプロット図とグラフである。図中の表記については図２Ａと同様である。 Ａβ４２の血漿レベルを分析した結果を示す、ドットプロット図とグラフである。図中の表記については図２Ａと同様である。 ＥＣＲＧ４の脳脊髄液（ＣＳＦ）レベルを分析した結果を示す、ドットプロット図とグラフである。図中の表記については図２Ａと同様である。 Ａβ４０のＣＳＦレベルを分析した結果を示す、ドットプロット図とグラフである。図中の表記については図２Ａと同様である。 Ａβ４２のＣＳＦレベルを分析した結果を示す、ドットプロット図とグラフである。図中の表記については図２Ａと同様である。 ＣＳＦにおけるＡβ４２／Ａβ４０の比率を分析した結果を示す、ドットプロット図とグラフである。図中の表記については図２Ａと同様である。
　＜認知症の検査方法＞
　後述の実施例に示すとおり、認知症患者、軽度認知障害（ＭＣＩ）患者及び非認知症患者等の血漿における、ＥＣＲＧ４の陽性率及び濃度を検出した結果、血漿においてＥＣＲＧ４は、認知症患者及びＭＣＩ患者の５０％において検出されたにも関わらず、非認知症患者の９５％において検出されなかった。さらに、認知症患者及びＭＣＩ患者におけるＥＣＲＧ４の血漿レベルは、非認知症患者におけるそれと比してはるかに高く、認知症の血中バイオマーカー分子としてＥＣＲＧ４が極めて有効であることを見出した。
　本発明は、以上の知見に基づき完成されたものであり、下記（ａ）～（ｃ）の工程を含む、認知症を検査する方法を提供する。
（ａ）被検体から分離された血液試料について、ＥＣＲＧ４ポリペプチドの量を検出する工程、
（ｂ）工程（ａ）で検出したポリペプチド量を基準量と比較する工程、
（ｃ）工程（ｂ）における比較の結果、前記被検体におけるポリペプチド量が基準量よりも高い場合、前記被検体は認知症を罹患していると判定する工程。
　「認知症」は、認知障害の一種であり、後天的な脳の器質的障害により、いったん正常に発達した知能が不可逆的に低下した状態を意味し、例えば、アルツハイマー病（アルツハイマー型認知症、ＡＤ）、正常圧水頭症（ＮＰＨ）、突発性正常圧水頭症（ｉＮＰＨ）、進行性非流暢性失語症（ＰＮＦＡ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、血管性認知症（ＶａＤ）、神経核内封入体病（ＮＩＩＤ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、本発明にかかる認知症には、前述の所謂認知症のみならず、その前段階である軽度認知障害（ＭＣＩ）も含まれる。
　本発明において、「被検体」とは、ヒトであれば特に制限はなく、例えば、認知機能の低下を感じている者、認知症を罹患しているおそれがある者、他の検査方法において認知症を罹患していると判断されている者が挙げられる。また、かかる被検体から分離される「血液試料」としては、血液を含む試料であればよく、例えば、全血、血清、血漿が挙げられる。血液は、当業者に公知の方法で被検体から採取することができる。例えば、血液（全血）は、注射器等を用いた採血によって採取することができる。血清は、全血から血球及び特定の血液凝固因子を除去した部分であり、例えば、全血を凝固させた後の上澄みとして得ることができる。血漿は、全血から血球を除去した部分であり、例えば、全血を凝固させない条件下（例えば、キレート剤（ＥＤＴＡ等）、クエン酸ナトリウム及びヘパリン等の抗凝固剤の存在下）で遠心分離に供した際の上澄みとして得ることができる。また、本発明にかかる血液試料は、後述のポリペプチド量を検出する方法に供する際には、更にその方法に適した形態（例えば、血液試料から抽出されたタンパク質溶液、ホルマリン固定処理、アルコール固定処理、凍結処理又はパラフィン包埋処理が施された組織等）に適宜調製されていてもよい。当業者であれば、血液試料の種類及び状態等を考慮し、公知の手法を選択して調製することが可能である。
　本発明において、認知症の血中マーカーとして検出される「ＥＣＲＧ４ポリペプチド」は、ヒト由来であって、ＡＵＧＵＲＩＮとも称されるポリペプチドであり、典型的には、配列番号：１に記載のヌクレオチド配列がコードするポリペプチド（配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド）である。なお、ポリペプチドをコードする遺伝子のＤＮＡ配列は、その変異等により、自然界において（すなわち、非人工的に）変異しうる。したがって、本発明において検出対象となるＥＣＲＧ４ポリペプチドは、前記典型的なアミノ酸配列に特定されることなく、それらアミノ酸配列の天然の変異体も含まれる。
　また、本発明において検出対象となるＥＣＲＧ４ポリペプチドは、全長のアミノ酸配列からなるもののみならず、その部分ペプチドも含まれる。かかる部分ペプチドとしては、特に制限はないが、好ましくは、配列番号：２に記載の３１～１４８位のアミノ酸配列を含むポリペプチド、より好ましくは、配列番号：２に記載の７１～１４８位のアミノ酸配列を含むポリペプチド、さらに好ましくは、配列番号：２に記載の７１～１３２位のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ヒトＥＣＲＧ４のＭ領域を含むポリペプチド）、より好ましくは、配列番号：２に記載の１０７～１３２位のアミノ酸配列を含むポリペプチド、さらに好ましくは、配列番号：２に記載の１１６～１２４位のアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。
　本発明において検出する「ＥＣＲＧ４ポリペプチドの量」とは、絶対量のみならず、相対量であってもよい。相対量としては、例えば、総ポリペプチド量に対する割合が挙げられる。また、相対量としては、検出に用いる測定方法又は測定装置に基づくポリペプチド量の比（所謂、任意単位（ＡＵ）で表される数値）が挙げられる。相対量としてはまた、例えば、参照タンパク質の量を基準として算出した値を用いてもよい。本発明にかかる「参照タンパク質」は、血液試料において安定して存在しており、また異なる血液試料間において、その量の差が小さいタンパク質であればよく、例えば、内在性コントロール（内部標準）タンパク質が挙げられ、より具体的には、β－アクチン、α－チューブリン、ＣＯＸ－４、ＧＡＰＤＨ、ラミンＢ１、ＰＣＮＡ、ＴＢＰ、ＶＤＣＡ１／Ｐｏｒｉｎが挙げられる。
　「ポリペプチドの量の検出」は、当業者であれば、適宜公知の手法を採用して実施することができる。かかる公知の手法としては、例えば、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ法）、ＣＬＥＩＡ（化学発光酵素免疫測定法）、ラテックス凝集法、抗体アレイ、イムノブロッティング、イムノクロマトグラフィー、イメージングサイトメトリー、フローサイトメトリー、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降法、免疫組織化学的染色法等の抗体を用いて検出する方法（免疫学的方法）や、質量分析法が挙げられる。
　「免疫学的方法」では、ＥＣＲＧ４ポリペプチドを認識する抗体が使用され、当該抗体をＥＣＲＧ４ポリペプチドに接触させ、当該抗体のＥＣＲＧ４ポリペプチドへの結合性を指標として、ＥＣＲＧ４ポリペプチドの量が検出される。
　より具体的に、ＥＬＩＳＡ法（サンドイッチＥＬＩＳＡ法）においては、先ず、基板等の固相に固定した、Ｅｃｒｇ４ポリペプチドを認識する抗体（捕獲用抗体）に、前記血液試料中のＥＣＲＧ４ポリペプチドを接触させることにより、当該抗体が認識する該ポリペプチドは捕獲される。次いで、捕捉されたＥｃｒｇ４ポリペプチドに対して、後述の標識がなされたＥｃｒｇ４ポリペプチドを認識する抗体（検出用抗体）を作用させ、当該標識を化学的に又は光学的に検出することにより、Ｅｃｒｇ４ポリペプチドの量を検出することができる。
　なお、「捕獲用抗体」と「検出用抗体」とは、ＥＣＲＧ４ポリペプチドを認識する限り、同一の抗体であってもよく、異なる抗体であってもよいが、ＥＣＲＧ４ポリペプチドを非競合的に捕獲、検出することができるという観点から、異なる抗体であることが好ましい。異なる抗体としては、例えば、捕獲用抗体がＥＣＲＧ４ポリペプチドを認識するポリクローナル抗体であり、検出用抗体がＥＣＲＧ４ポリペプチドを認識するモノクローナル抗体であるという組み合わせ、捕獲用抗体がＥＣＲＧ４ポリペプチドを認識するモノクローナル抗体であり、検出用抗体がＥＣＲＧ４ポリペプチドを認識するポリクローナル抗体であるという組み合わせ、または捕獲用抗体がＥＣＲＧ４ポリペプチドを認識するモノクローナル抗体であり、検出用抗体が、ＥＣＲＧ４ポリペプチドにおいて当該捕獲用抗体の認識する部位（エピトープ）とは異なる部位を認識するモノクローナル抗体であるという組み合わせが挙げられる。より具体的に、好ましくは、捕獲用抗体及び検出用抗体の少なくともいずれかが、ＥＣＲＧ４の７１～１４８位のアミノ酸配列からなる領域を認識する抗体であり、さらに、好ましくは、捕獲用抗体及び検出用抗体の少なくともいずれかが、ＥＣＲＧ４の７１～１３２位のアミノ酸配列からなる領域を認識する抗体であり、より好ましくは、捕獲用抗体及び検出用抗体の少なくともいずれかが、ＥＣＲＧ４の１０７～１３２位のアミノ酸配列からなる領域を認識する抗体であり、さらに好ましくは、捕獲用抗体と検出用抗体との組み合わせが、
ＥＣＲＧ４の７１～１３２位（より好ましくは１０７～１３２位、さらに好ましくは１１６～１２４位）のアミノ酸配列からなる領域を認識する抗体（より好ましくはモノクローナル抗体）とＥＣＲＧ４の１０７～１３２位のアミノ酸配列からなる領域を認識する抗体（より好ましくはポリクローナル抗体）との組み合わせ；
ＥＣＲＧ４の１０７～１３２位のアミノ酸配列からなる領域を認識する抗体（より好ましくはポリクローナル抗体）とＥＣＲＧ４の７１～１３２位（より好ましくは１０７～１３２位、さらに好ましくは１１６～１２４位）のアミノ酸配列からなる領域を認識する抗体（より好ましくはモノクローナル抗体）との組み合わせ；
ＥＣＲＧ４の１３３～１４８位（より好ましくは１３４～１３９位）のアミノ酸配列からなる領域を認識する抗体（より好ましくはモノクローナル抗体）とＥＣＲＧ４の１０７～１３２位のアミノ酸配列からなる領域を認識する抗体（より好ましくはポリクローナル抗体）との組み合わせ；又は
ＥＣＲＧ４の１０７～１３２位のアミノ酸配列からなる領域を認識する抗体（より好ましくはポリクローナル抗体）とＥＣＲＧ４の１３３～１４８位（より好ましくは１３４～１３９位）のアミノ酸配列からなる領域を認識する抗体（より好ましくはモノクローナル抗体）との組み合わせ
が挙げられる。
　また、標識物質を結合させた抗体を用いてＥＣＲＧ４ポリペプチドに結合した抗体量を直接測定する方法以外に、標識物質を結合させた二次抗体を利用する方法や二次抗体と標識物質を結合させたポリマーを利用する方法などの間接的検出方法を利用することもできる。ここで「二次抗体」とは、本発明に係る抗体に特異的な結合性を示す抗体である。また、二次抗体に代えて、標識物質を結合させたプロテインＧやプロテインＡ等を用いることも可能である。
　「質量分析法」とは、ペプチド試料（前述の血液試料）を、イオン源を用いてイオン化し、分析部において、真空中で運動させ電磁気力を用いて、あるいは飛行時間差によりイオン化したペプチド試料を質量電荷比に応じて分離し、検出できる質量分析計を用いた測定方法のことをいい、イオン源を用いてイオン化する方法としては、ＥＩ法、ＣＩ法、ＦＤ法、ＦＡＢ法、ＭＡＬＤＩ法、ＥＳＩ法等の方法を適宜選択することができる。また、分析部において、イオン化したペプチド試料を分離する方法としては、磁場偏向型、四重極型、イオントラップ型、飛行時間（ＴＯＦ）型、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型等分離方法を適宜選択することができる。また、２以上の質量分析法を組み合わせたタンデム型質量分析（ＭＳ／ＭＳ）やトリプル四重極型質量分析を利用することができる。特に、トリプル四重極型質量分析計による選択反応モニタリング（ＳＲＭ：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ，ＳＲＭ）又は多重反応モニタリング（ＭＲＭ：Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）によって、１回の測定で多種のバイオマーカー分子を同時に測定することができる。また、質量分析計は単独で用いられてもよいし、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）や高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を組み合わせることにより、対象ポリペプチド（ＥＣＲＧ４ポリペプチド）を構成するペプチドを分離・精製してサンプルとすることができる。
　本発明の検査方法においては、このようにして検出されたＥＣＲＧ４ポリペプチドの量と、同ポリペプチドの基準量とを比較する。かかる比較は、当業者であれば、例えば、上記検出方法に合った統計学的解析方法を適宜選択し設定して行うことができる。統計学的解析方法としては、例えば、ｔ検定、マン・ホイットニーのＵ検定、分散分析（ＡＮＯＶＡ）、クラスカル・ウォリス検定、ウィルコクソン検定、オッズ比、ハザード比、フィッシャーの正確検定、受信者動作特性解析（ＲＯＣ解析）、分類木と決定木解析（ＣＡＲＴ解析）が挙げられる。また、比較の際には、正規化された又は標準化かつ正規化されたデータを用いることもできる。
　比較対象となる「ＥＣＲＧ４ポリペプチドの基準量」としては特に制限はなく、当業者であれば上記検出方法及び統計学的解析方法に合わせ、それを基準とすることにより、認知症を罹患していない者（例えば、健常者又は非認知症患者（認知症以外の疾患を罹患している者））と認知症罹患者とを判別することのできる、所謂カットオフ値として設定することができる。
　認知症と非認知症とを判別するための基準量としては、例えば、認知症を罹患していない個体群（例えば、健常な個体群、非認知症患者の個体群）において検出されたＥＣＲＧ４ポリペプチドの中央値又は平均値が挙げられる。また、認知症を罹患していない個体群と認知症を罹患している個体群とにおいて、ＥＣＲＧ４ポリペプチドの量を比較することにより決定される値（例えば、認知症を罹患していない個体群のＥＣＲＧ４ポリペプチドの量と、認知症に罹患している個体群のポリペプチド量との、間の値）であってもよい。かかる基準量として、後述の実施例（図２Ａ）に示すように、より具体的な例としては、０．１ｎｇ／ｍｌが挙げられ、好ましくは０．２ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは０．４ｎｇ／ｍｌ、さらに好ましくは０．６ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは０．７ｎｇ／ｍｌ、さらに好ましくは０．８ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは０．９ｎｇ／ｍｌが挙げられる。
　「前記被検体におけるポリペプチド量が基準量よりも高い」とは、例えば、当業者であれば上記統計学的解析方法に基づき適宜判断することができる。また、例えば、検出されたポリペプチド量が基準量より高く、その差が統計的に有意と認められること（例えば、Ｐ＜０．０５）が挙げられる。また、例えば、検出されたポリペプチド量が対応する基準量の２倍以上（好ましくは、３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上、７倍以上、８倍以上、９倍以上）であることも挙げられる。そして、本発明の検査方法において、前記被検体におけるポリペプチド量が基準量よりも高い場合、前記被検体は認知症を罹患していると判定される。なお、ここで「罹患している」とは、既に認知症を発症していることのみならず、その発症のおそれ（リスク）がある状態も含まれる。
　また、認知症の検査は、通常、医師（医師の指示を受けた者も含む）によって行われるが、上述のポリペプチド量等に関するデータは、医師による治療のタイミング等の判断も含めた診断に役立つものである。よって、本発明の方法は、医師による診断のために上述のポリペプチド量に関するデータを収集する方法、当該データを医師に提示する方法、上述のポリペプチド量と基準量とを比較し分析する方法、医師による診断を補助するための方法とも表現し得る。
　さらに、本発明の検査方法は、他の認知症の検査方法と組み合わせて行ってもよい。かかる他の検査方法としては、特に制限はないが、例えば、脳波診断、血液・脳脊髄液を対象とした生化学的検査、ＣＴ、ＭＲＩ、ＰＥＴ／ＳＰＥＣＴ、アミロイドイメージング（アミロイドＰＥＴ検査）等の画像診断が挙げられる。
　以上の通り、本発明によれば、認知症を検査することができる。そして、かかる評価の結果により、認知症の治療を行うか否かを判断することもできる。
　したがって、本発明は、本発明の検査方法により認知症を罹患していると判定された被検体に、認知症の治療を施す工程を含む、認知症の治療方法を提供することもできる。かかる認知症の治療としては特に制限はないが、例えば、免疫療法、認知症の病変を抑えるための薬剤を投与する方法が挙げられる。免疫療法としては、例えば、アミロイドベータ（Ａβ）の凝集の抑制を対象とする、Ａβの部分ペプチドを用いる能動免疫療法（ワクチン療法）、Ａβに対する抗体を投与する受動免疫療法が挙げられる。また、認知症の病変を抑えるために投与される薬剤としては、例えば、Ａβの産生を抑制するための薬剤（γセクレターゼモジュレーター（ＧＳＭ）、γセクレターゼモジュレーター阻害剤（ＧＳＩ）、非ステロイド性抗炎症薬等）、Ａβの凝集を抑制するための薬剤（クルクミン、ポリ硫酸化合物、クリオキノール等）、ｔａｕの凝集を抑制するための薬剤（アミノチエノピリダジン、シアニン色素、メチレンブルー等）、神経保護薬（ジメボン等）、コリンエステラーゼ阻害薬（ドネぺジル等）、アセチルコリンエステラーゼ阻害薬（ガランタミン等）、グルタミン酸ＮＭＤＡ受容体阻害薬（メマンチン等）が挙げられる。
　＜認知症を検査するための薬剤＞
　上述の通り、本発明の検査方法においては、ＥＣＲＧ４ポリペプチドの量を、当該ポリペプチドを認識する抗体を用いて検出することにより、認知症罹患の有無を判定することができる。
　したがって、本発明は、上述の方法により、認知症を検査するための薬剤であって、Ｅｃｒｇ４ポリペプチドを認識する抗体を含む薬剤を提供する。
　本発明の薬剤に含まれる「抗体」は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよく、また、抗体の機能的断片であってもよい。「抗体」には、免疫グロブリンの全てのクラス及びサブクラスが含まれる。「ポリクローナル抗体」は、異なるエピトープに対する異なる抗体を含む抗体調製物である。また、「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体（抗体断片を含む）を意味する。ポリクローナル抗体とは対照的に、モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を認識するものである。本発明において抗体の「機能的断片」とは、抗体の一部分（部分断片）であって、標的蛋白質を特異的に認識するものを意味する。具体的には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、可変領域断片（Ｆｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）２、ダイアボディー、多特異性抗体、及びこれらの重合体等が挙げられる。
　本発明にかかる抗体は、ポリクローナル抗体であれば、抗原（ＥＣＲＧ４ポリペプチド、またはこれを発現する細胞等）で免疫動物を免疫し、その抗血清から、従来の手段（例えば、塩析、遠心分離、透析、カラムクロマトグラフィー等）によって、精製して取得することができる。
　また、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法や組換えＤＮＡ法によって作製することができる。ハイブリドーマ法としては、代表的には、コーラー及びミルスタインの方法（Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５））が挙げられる。組換えＤＮＡ法は、上記本発明に係る抗体をコードするＤＮＡをハイブリドーマやＢ細胞等からクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主細胞（例えば哺乳類細胞株、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞等）に導入し、本発明に係る抗体を組換え抗体として産生させる手法である（例えば、Ｐ．Ｊ．Ｄｅｌｖｅｓ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９７　ＷＩＬＥＹ、Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ　ａｎｄ　Ｃ．Ｄｅａｎ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，２０００　ＯＸＦＯＲＤ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ　ＰＲＥＳＳ、Ｖａｎｄａｍｍｅ　Ａ．Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９２：７６７－７７５（１９９０））。
　本発明にかかる抗体としては、ＥＣＲＧ４ポリペプチドを認識し得る限り、特に制限はないが、好ましくは、ＥＣＲＧ４の７１～１４８位のアミノ酸配列からなる領域を認識する抗体、ＥＣＲＧ４の７１～１３２位（さらにより好ましくは１０７～１３２位、さらに好ましくは１１６～１２４位）のアミノ酸配列からなる領域を認識する抗体（より好ましくはモノクローナル抗体）、ＥＣＲＧ４の１３３～１４８位（さらに好ましくは１３４～１３９位）のアミノ酸配列からなる領域を認識する抗体（さらに好ましくはモノクローナル抗体）、及び、ＥＣＲＧ４の１０７～１３２位のアミノ酸配列からなる領域を認識する抗体（より好ましくはポリクローナル抗体）から選択される少なくとも１の抗体である。
　本発明にかかる抗体はまた、ＥＬＩＳＡ法や抗体アレイ等に用いるべく、固相化された形態で提供されてもよい。固相としては、例えば、プラスチックプレート等のプレート、ニトロセルロース等の繊維状物質、磁性粒子やラテックス粒子等の粒子を用いることができる。また、上記検出方法に合わせ、抗体は標識用物質で標識されていてもよい。標識用物質としては、例えば、ＨＲＰ、β－Ｄ－グルコシダ―ゼ、ルシフェラーゼ等の酵素、ルミノール、ルシフェリン、ルシゲニン等の発光物質、ＦＩＴＣ、ＦＡＭ、ＤＥＡＣ、Ｒ６Ｇ、ＴｅｘＲｅｄ、Ｃｙ５等の蛍光物質、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２３Ｉ等の放射性同位体、ビオチン、ストレプトアビジン等の親和性物質が挙げられる。
　本発明の薬剤は、前記抗体の他、組成物として許容される他の成分を含むことができる。このような他の成分としては、例えば、薬理学上許容される担体又は希釈剤（滅菌水、生理食塩水、植物油、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、安定剤、保存剤、防腐剤等）が挙げられる。賦形剤としては、乳糖、デンプン、ソルビトール、Ｄ－マンニトール、白糖等を用いることができる。崩壊剤としてはデンプン、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。乳化剤としてはアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。懸濁剤としてはモノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、ジエチリン亜硫酸塩、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としてはアジ化ナトリウム、塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等を用いることができる。
　また、上記本発明にかかる抗体又は薬剤の他、標識の検出に必要な基質、試料（血液試料等）のタンパク質を溶解するための溶液（タンパク質溶解用試薬）、試料の希釈や洗浄に用いる緩衝液（希釈液、洗浄液）、標識の検出反応を停止するための試薬（反応停止薬）、陽性対照（例えば、ＥＣＲＧ４ポリペプチド、標品、認知症患者に由来する血液試料）、陰性対照（例えば、認知症を罹患していない者に由来する血液試料）、本発明にかかる抗体に対するアイソタイプコントロール抗体等を組み合わせることができ、認知症を検査するためのキットとすることもできる。かかるキットとしては、例えば、少なくとも１のＥＣＲＧ４ポリペプチドを認識する抗体と、前記抗体に対するアイソタイプコントロール抗体、陽性対照及び陰性対照から選択される少なくとも１の物品とを含む、認知症を検査するためのキットが挙げられる。また、標識されていない抗体を抗体標品とした場合には、当該抗体に結合する物質（例えば、二次抗体、プロテインＧ、プロテインＡ等）を標識化したものを組み合わせることができる。さらに、かかるキットには、当該キットの使用説明書を含めることができる。
　以上、本発明の好適な実施形態について説明したが、本発明は上記実施形態に限定されるものではない。後述の実施例に示すとおり、ＥＣＲＧ４の１０７～１３２位からなるアミノ酸配列からなる領域を認識する抗体と、ＥＣＲＧ４の１３４～１３９位のアミノ酸配からなる領域列を認識する抗体又はＥＣＲＧ４の１１６～１２４位のアミノ酸配列からなる領域を認識する抗体とを組み合わせて用いる免疫学的方法によって、ＥＣＲＧ４を高い定量性をもって検出することが可能となる（図１等　参照）。
　よって、本発明は、
　ＥＣＲＧ４ポリペプチドの１０７～１３２位のアミノ酸配列からなる領域を認識する抗体と、ＥＣＲＧ４の１３３～１４３位のアミノ酸配列からなる領域を認識する抗体又はＥＣＲＧ４の７１～１３２位のアミノ酸配列からなる領域を認識する抗体とを用いる免疫学的方法により、試料中のＥＣＲＧ４ポリペプチド量を検出する方法、
　ＥＣＲＧ４ポリペプチドの１０７～１３２位のアミノ酸配列からなる領域を認識する抗体と、ＥＣＲＧ４の１３３～１４３位のアミノ酸配列からなる領域を認識する抗体又はＥＣＲＧ４の７１～１３２位のアミノ酸配列からなる領域を認識する抗体とを含む、試料中のＥＣＲＧ４ポリペプチド量を検出するための薬剤、
　ＥＣＲＧ４ポリペプチドの１０７～１３２位のアミノ酸配列からなる領域を認識する抗体と、ＥＣＲＧ４の１３３～１４３位のアミノ酸配列からなる領域又はＥＣＲＧ４の７１～１３２位のアミノ酸配列を認識する抗体とを含む、試料中のＥＣＲＧ４ポリペプチド量を免疫学的方法により検出するためのシステム
を提供する。
　なお、かかる方法、薬剤及びシステム、並びにこれらの構成要素（抗体等）についての説明は、上記＜認知症の検査方法＞及び＜認知症を検査するための薬剤＞における説明に準ずる。また、これらが対象とする「試料」としては、上記血液試料に限定されることなく、ＥＣＲＧ４ポリペプチドを含み得るものであればよく、例えば、上述の血液の他、脳脊髄液、脳（その組織、その細胞等）が挙げられる。
　また、本発明のシステムにおいては、前記抗体又は当該抗体を含む薬剤の他、免疫学的方法を実施できるようなユニットを備えていてもよい。かかるユニットとして、例えば、抗体に直接又は間接的に結合した標識物質を検出し、試料中のＥＣＲＧ４ポリペプチドに結合した抗体量を測定するためのユニット（分光光度計、蛍光分光光度計等）；試料、抗体、洗浄液、試薬等を注入又は除去するためのユニット；プレート等の上記固相をハンドリングするためのユニット（ロボットアーム等）；これらユニットを制御するためのユニットが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。本実施例は以下に示す材料及び方法を用いて行った。なお、本［実施例］の記載における文献の表記は、最後に列挙してある引用文献に対応する。
　＜材料及び方法＞
　（化合物及び試薬）
　全ての化合物は、特に断りがない場合を除き、Ｎａｃａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ社又はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入して用いた。
　（マウス及びウサギの抗ＥＣＲＧ４抗体）
　抗ＥＣＲＧ４ウサギポリクローナル抗体（以下「ＯＢ１２６４」とも称する）は、合成ペプチド（ヒトＥＣＲＧ４（配列番号：２に記載のアミノ酸配列）の１０７～１３２位からなるポリペプチド）を、常法を用い、ウサギに免疫することにより調製した（株式会社医学生物学研究所にて作製）。
　抗ＥＣＲＧ４マウスモノクローナル抗体は、常法を用い、ヒトＥＣＲＧ４の部分ペプチドを種々合成し、マウスに免疫することにより、ハイブリドーマを調製した。そして、選択した各ハイブリドーマ５００万個を、８週齢のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの腹腔内に注射し、腹水を採取した。結果、以下に示す各部分ペプチドを認識するモノクローナル抗体を取得することができた。
ヒトＥＣＲＧ４の１１６～１２４位を認識する抗ＥＣＲＧ４マウスモノクローナル抗体（以下「２Ａ８」とも称する）、
ヒトＥＣＲＧ４の１３４～１３９位からなるポリペプチドを認識する抗ＥＣＲＧ４マウスモノクローナル抗体（以下「１Ｈ４」とも称する）。
　抗ＥＣＲＧ４ウサギポリクローナル抗体及び抗ＥＣＲＧ４マウスモノクローナル抗体は、プロテインＡセファロース４（ＧＥヘルスケア社製）を用い、その使用説明書の記載に沿って、ｆａｓｔ　ｆｌｏｗにて精製した。
　（ＥＣＲＧ４サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイ）
　先ず、９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）を、４℃で一晩中、５０μｌのマウス抗ＥＣＲＧ４抗体（１μｇ／ｍｌ又は２μｇ／ｍｌ）含有炭酸緩衝液（０．０５Ｍ、ｐＨ９．５）にて、コーティングした。洗浄バッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０／ＰＢＳ）にて、プレートを５回洗浄した後、プレートを室温で９０分間、ブロッキングバッファー（炭酸緩衝液中の５％スキムミルク）１５０μｌでインキュベートした。
　次に、洗浄バッファーにて前記プレートを３回洗浄した後、５０μｌの各試料を添加し、室温下９０分間インキュベートした。添加した試料は、ＥＣＲＧ４ペプチド（７１～１４８位からなるペプチド又は７１～１３２位からなるペプチド（共に、Ｐｈｏｅｎｉｘ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社製））、血漿（２倍希釈）又は脳脊髄液（ＣＳＦ、２倍希釈）であり、これら試料は、いずれもアッセイバッファー（２．５％スキムミルク含有洗浄バッファー）にて希釈して用いた。
　次に、洗浄バッファーを用いてプレートを５回洗浄した後、アッセイバッファーで希釈したＯＢ１２６４（１μｇ／ｍｌ）５０μｌをウェルに塗布し、プレートを室温下６０分間インキュベートした。
　次に、洗浄バッファーを用いてプレートを３回洗浄した後、アッセイバッファーで希釈した５０μｌのヤギ抗ウサギＩｇＧ－ＨＲＰ（希釈率：１：１０００、Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）をウェルに塗布し、プレートを室温下６０分間遮光してインキュベートした。
　次に、洗浄バッファーを用いてプレートを５回洗浄した後、基質溶液（ＴＭＢ　Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　Ｓｙｓｔｅｍ，ＫＰＬ社製）５０μｌを各ウェルに加え、プレートを室温下３０分間遮光してインキュベートした。
　そして、２Ｎ硫酸　２５μｌを加えて反応を停止した後、ベンチマークマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）を用いて４５０ｎｍで吸光度を測定した。
　（アミロイドベータ（Ａβ）４０及びＡβ４２　ＥＬＩＳＡアッセイ）
　血漿及びＣＳＦにおけるＡβ４０及びＡβ４２の濃度は、Ｈｕｍａｎ／Ｒａｔ　βＡｍｙｌｏｉｄ４０　ａｎｄ　βＡｍｙｌｏｉｄ４２　ＥＬＩＳＡ　Ｋｉｔｓ　ＷＡＫＯ（富士フィルム和光純薬株式会社製）を用い、その使用説明書の記載内容に沿って、測定した。
　（認知症、アルツハイマー病及び非認知症患者についての診断）
　認知症患者は、認知症及びアルツハイマー病（ＡＤ）のガイドラインに従って判別した（ＭｃＫｈａｎｎ　ｅｔ　ａｌ　２０１１，７；２６３－２６９、Ａｌｂｅｒｔ　ｅｔ　ａｌ，２０１１）。また、ミニメンタルステート検査（ＭＭＳＥ）は認知症診断において部分的に用いた（Ｆｏｌｓｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ，１９７５，Ｋａｕｆｅｒ　ｅｔ　ａｌ，２００８，Ｓａｘｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ，２００９）。認知症患者及び非認知症患者の内訳は、下記表１及び２に各々示すとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　なお、表１に示す各略称が表す疾患は、以下のとおりである。
ＡＤ：アルツハイマー病、ＮＰＨ：正常圧水頭症、ｉＮＰＨ：突発性正常圧水頭症、ＰＮＦＡ：進行性非流暢性失語症、ＰＳＰ：進行性核上性麻痺、ＤＬＢ：レビー小体型認知症、ＦＴＬＤ：前頭側頭葉変性症、ＶａＤ：血管性認知症、ＮＩＩＤ：神経核内封入体病、ＭＣＩ：軽度認知障害。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　なお、表２に示す疾患は、以下のとおりである。
Ｍｙｏｓｐａｓｍ：筋痙攣、Ｍｙｏｃｌｏｎｕｓ：ミオクローヌス、ｍｉｇｒａｉｎｅ：片頭痛、ｓｙｒｉｎｇｏｍｙｅｌｉａ：脊髄空洞症、ｈｙｓｔｅｒｉａ：ヒステリー、ｌｉｍｂｉｃ　ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ：辺縁系脳炎、ｍｙｏｐａｔｈｙ：ミオパチー、Ｎｅｕｒｏｍｙｅｌｉｔｉｓ　ｏｐｔｉｃａ：視神経脊髄炎、ｅｐｉｌｅｐｓｙ：てんかん、ａｓｅｐｔｉｃ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ：無菌性髄膜炎、ｐｓｙｃｈｏｇｅｎｉｃ　ｒｅａｃｔｉｏｎ：心因反応、ｅｐｉｓｏｄｉｃ　ａｔａｘｉａ：周期性失調症、ｓａｒｃｏｉｄｏｓｉｓ：サルコイドーシス、ｎｅｕｒｏ‐Ｂｅｈｃｅｔ：神経ベーチェット、ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｕｓ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ：結核性髄膜炎、ｆｅｍｏｒａｌ　ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ：大腿神経障害、ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｃｅｒｅｂｒａｌ　ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ：多発脳梗塞、ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：多発性硬化症、ｐｏｓｔｒｅｓｕｓｃｉｔａｔｉｏｎ　ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ：蘇生後脳症、ｍｙｅｌｏｐａｔｈｙ：脊髄症、ｆｉｂｒｏｍｙａｌｇｉａ：線維筋痛症、ｄｙｓｔｏｎｉａ：ジストニア、ｓｐａｓｔｉｃ　ｐａｒａｐｌｅｇｉａ：痙性対麻痺、ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｓｙｓｔｅｍ　ａｔｒｏｐｈｙ：多系統萎縮症、Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ　ｄｉｓｅａｓｅ：ハンチントン病、ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ：脳炎、ｃｅｒｖｉｃａｌ　ｄｙｓｔｏｎｉａ：頚部ジストニア、Ｃｅｒｖｉｃａｌ　ｃｏｒｄ　ｓａｒｃｏｉｄｏｓｉｓ：頚髄サルコイドーシス、ｐｏｌｙｍｙｏｓｉｔｉｓ：多発筋炎、ｄｉａｂｅｔｉｃ　ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ：糖尿病性末梢神経障害、ｂｒａｃｈｉａｌ　ｎｅｕｒｉｔｉｓ：腕神経叢炎、ｉｍｍｕｎｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ：免疫介在性ニューロパチー、ｓｙｒｉｎｇｏｍｙｅｌｉａ：脊髄空洞症、Ｃａｖｅｒｎｏｕｓ　ｖｅｉｎ　ｓｉｎｕｓ　ｍｅｎｉｎｇｅｓ：海綿静脈洞髄膜、ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ　ｌｅｓｉｏｎ：視床病変、ｂｒａｃｈｉａｌ　ｐｌｅｘｕｓ　ｎｅｕｒｉｔｉｓ：腕神経叢炎、ｔｈｏｒａｃｉｃ　ｍｙｅｌｏｐａｔｈｙ：胸髄症、ｌｅｕｋｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ：白質脳症、ａｓｅｐｔｉｃ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ：無菌性髄膜炎、ｐａｒａｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ　ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ：傍腫瘍症候群、ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ　ａｔａｘｉａ：小脳失調症、ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ：末梢神経障害、ｍｕｓｃｕｌａｒ　ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ：筋ジストロフィー、ｓｐａｓｔｉｃ　ｐａｒａｐｌｅｇｉａ：痙性対麻痺、ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ：脳症、ｃｅｒｖｉｃａｌ　ｓｐｏｎｄｙｌｏｔｉｃ　ｍｙｅｌｏｐａｔｈｙ：頸椎症性脊髄症、ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ　ｐａｃｈｙｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ：肥厚性硬膜炎、ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｃｒａｎｉａｌ　ｎｅｒｖｅ　ｐａｌｓｙ：多発脳神経麻痺、ｍｙｅｌｉｔｉｓ：脊髄炎、Ｍｕｓｃｌｅ　ｓａｒｃｏｉｄｏｓｉｓ：筋サルコイドーシス、ｎｅｕｒｏｓａｒｃｏｉｄｏｓｉｓ：神経サルコイドーシス、Ｓｅｑｕｅｌａｅ　ｏｆ　ｍｙｅｌｉｔｉｓ：脊髄炎後遺症、ｌｉｍｂｉｃ　ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ：辺縁系脳炎、ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ　ａｔａｘｉａ：小脳失調症、ｍｙｅｌｏｐａｔｈｙ：脊髄症、ｓｐａｓｔｉｃ　ｐａｒａｐｌｅｇｉａ：痙性対麻痺、ａｌｃｏｈｏｌｉｃ　ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ　ａｔｒｏｐｈｙ：アルコール性小脳萎縮症、ｃｏｒｔｉｃｏｂａｓａｌ　ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：大脳皮質基底核変性症、ｃｅｒｅｂｒａｌ　ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ　ｓｅｑｕｅｌａｅ：脳梗塞後遺症、Ｌｅｆｔ　ｌｏｗｅｒ　ｌｉｍｂ　ｗｅａｋｎｅｓｓ：左下肢脱力、ｌａｔｅ－ｏｎｓｅｔ　ｈｙｐｏｇｏｎａｄｉｓｍ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ：　ＬＯＨ症候群、ｓｐｏｎｄｙｌｏｓｉｓ　ｄｅｆｏｒｍａｎｓ：変形性脊椎症、Ｐｕｒｅ　ａｋｉｎｅｓｉａ：純粋無動症、Ｓｅｎｓｏｒｙ　ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ：感覚性ニューロパチー、ｄｕｒａｌ　ａｒｔｅｒｉｏｖｅｎｏｕｓ　ｆｉｓｔｕｌａ：硬膜動性脈ろう、ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ　ｂｏｄｙ　ｍｙｏｓｉｔｉｓ：封入体筋炎、ｓｐａｓｔｉｃ　ｐａｒａｐｌｅｇｉａ：痙性対麻痺、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｃｒａｎｉａｌ　ｎｅｒｖｅ　ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ：多発脳神経障害、ｍｏｔｏｒ　ｎｅｕｒｏｎ　ｄｉｓｅａｓｅ：運動ニューロン病、ｃｒａｎｉａｌ　ｐｏｌｙｎｅｕｒｉｔｉｓ：多発脳神経炎。
　（ヒト血漿とＣＳＦの調製）
　ＥＤＴＡにて処理した血漿及びＣＳＦの試料は、ＡＤ、正常圧水頭症（ＮＰＨ）及び軽度認知障害（ＭＣＩ）を含む認知症と診断された患者、並びに、多発系萎縮症（ＭＳＡ）及びミオパシー等の神経障害を伴う非認知症と診断された患者から、標準的な方法（Ｗａｙｂｒｉｇｈｔ　ｅｔ　ａｌ，２０１０，Ｍｅｎｃｋ　ｅｔ　ａｌ，２０１７）を用い、取得した。血漿試料については、コントロールとして健康な８名からも取得した（図２Ｂ）。なお、全ての被験者からインフォームド・コンセントを得ており、本研究は、北海道大学倫理委員会が承認したものである。
　（発現ベクター）
　マウスＥｃｒｇ４（配列番号：４に記載のアミノ酸配列）の３２～７０位のアミノ酸からなるポリペプチド及び７１～１３２位のアミノ酸からなるポリペプチドを各々コードするフラグメントは、ｐＣＭＳ－ＥＧＦＰ－ｍＥｃｒｇ４（Ｋｕｊｕｒｏ　ｅｔ　ａｌ，２０１０）を鋳型とし、ＫＯＤ　ｐｌｕｓ－Ｖｅｒ．２ポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ株式会社製）を用い、その使用説明書の記載に沿って増幅した。次いで、ｐＦＵＳＥ－ｍＥｃｒｇ４（３２－７０）－ｈＩｇＧ１Ｆｃ２（３２－７０）及びｐＦＵＳＥ－ｍＥｃｒｇ４（７１－１３２）－ｈＩｇＧ１Ｆｃ２（７１－１３２）を調製するため、これらフラグメントを各々ｐＦＵＳＥ－ｈＩｇＧ１Ｆｃ２（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製）に挿入した。
　マウスＥｃｒｇ４（配列番号：４に記載のアミノ酸配列）の１３３～１４８位のアミノ酸からなるポリペプチドをコードするセンスオリゴヌクレオチド及びアンチセンスオリゴヌクレオチドをアニールし、ｐＦＵＳＥ－ｍＥｃｒｇ４（１３３－１４８）－ｈＩｇＧ１Ｆｃ２（１３３－１４８）を調製するため、ｐＦＵＳＥ－ｈＩｇＧ１Ｆｃ２に挿入した。
　なお、マウスＥｃｒｇ４（配列番号：４に記載のアミノ酸配列）の３２～７０位のアミノ酸からなるポリペプチドをコードするｃＤＮＡを合成するために、下記プライマーセットを用いた。
５’プライマー：５’－ＴＧＡＴＡＴＣＧＡＡＣＡＡＡＣＴＣＡＡＧＡＡＧＡＴＧＣＴＣＣ－３’（配列番号：５）及び
３’プライマー：５’－ＡＡＧＡＴＣＴＴＣＧＴＴＴＧＧＣＡＣＧＣＴＴＣＡＧＧ－３’（配列番号：６）
　マウスＥｃｒｇ４の７１～１３２位のアミノ酸からなるポリペプチドをコードするｃＤＮＡを合成するために、下記プライマーセットを用いた。
５’プライマー：５’－ＴＧＡＴＡＴＣＧＣＡＧＣＴＧＴＧＧＧＡＣＣＧＴＡＣＧ－３’（配列番号：７）及び
３’プライマー：５’－ＡＡＧＡＴＣＴＧＴＧＧＧＧＡＣＣＡＡＴＧＧＣＣＧＣＡ－３’（配列番号：８）
　マウスＥｃｒｇ４の１３３～１４８位のアミノ酸からなるポリペプチドをコードするｃＤＮＡを合成するために、下記プライマーセットを用いた。
５’プライマー：５’－ＡＴＣＧＡＧＣＣＧＧＧＡＡＡＧＣＴＴＣＡＧＧＣＡＴＧＧＡＧＣＣＡＧＴＧＴＣＡＡＣＴＡＴＡＡＴＧＡＣＴＡＴＡ－３’（配列番号：９）及び
３’プライマー：５’－ＧＡＴＣＴＡＴＡＧＴＣＡＴＴＡＴＡＧＴＴＧＡＣＡＣＴＧＧＣＴＣＣＡＴＧＣＣＴＧＡＡＧＣＴＴＴＣＣＣＧＧＣＴＣＧＡＴ－３’（配列番号：１０）。
　そして、これらプライマーセットを用いてクローニングしたｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｋｉｔ　ｖｅｒｓｉｏｎ　３．１（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）及びＡＢＩ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ　ｍｏｄｅｌ　３１３０ｘｌ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて確認した。
　（ウェスタンブロッティング）
　ウエスタンブロッティングは、Ｔａｋａｎａｇａ　ｅｔ　ａｌ，２００９に記載の方法に沿って行なった。簡潔に説明すると、ｐＦＵＳＥ－ｈＩｇＧ１Ｆｃ２、ｐＦＵＳＥ－ｍＥｃｒｇ４（３２－７０）－ｈＩｇＧ１Ｆｃ２（３２－７０）、ｐＦＵＳＥ－ｍＥｃｒｇ４（７１－１３２）－ｈＩｇＧ１Ｆｃ２（７１－１３２）及びｐＦＵＳＥ－ｍＥｃｒｇ４（１３３－１４８）－ｈＩｇＧ１Ｆｃ２（１３３－１４８）を、ＥｎｄｏＦｅｃｔｉｎ（ＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ社製）を用い、その使用説明書の記載に沿って、２９３Ｔ細胞に導入した。当該遺伝子導入の３日後に、前記細胞をＲＩＰＡバッファーにて処理し、細胞抽出物を調製した。次いで、それら抽出物を、ゲル電気泳動に供し、Ｈｙｂｏｎｄ－Ｐメンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）に転写した。
　そして、当該メンブレンについて以下に示す抗原を、括弧内にて併記する一次抗体を用いて各々検出した。
Ｅｃｒｇ４（添加濃度：１μｇ／ｍｌ、検出用抗体：ＯＢ１２６４）、Ｅｃｒｇ４（添加濃度：１μｇ／ｍｌ、検出用抗体：２Ａ８）又はＧＡＰＤＨ（希釈率：１：１０００、検出抗体：抗マウスＡｂ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製）。
　さらに、これら一次抗体（マウスＩｇＧ、ウサギＩｇＧ及びヒトＩｇＧ）は各々、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（希釈率：１：５０００、Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（希釈率：１：５０００、Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）及びＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（希釈率：１：５００、Ｂｅｔｈｙｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いて検出した。
　なお、検出には、ＥＣＬシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ製）を用い、またこれら抗体によるウェスタンブロット画像解析は、ＣｈｅｍｉＤｏｃ　ＭＰ　Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｌａｂシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）を用いて取得した。
　（免疫染色）
　免疫染色は、Ｎｉｓｈｉｄｅ　ｅｔ　ａｌ，２００９，Ｋｕｊｕｒｏ　ｅｔ　ａｌ，２０１０に記載の方法に沿って行なった。簡潔に説明すると、先ず、前述のとおり、各種ベクターを２９３Ｔ細胞に導入した。当該遺伝子導入の３日後に、前記細胞を固定し、２Ａ８（１μｇ／ｍｌ）及びＯＢ１２６４（１μｇ／ｍｌ）を各々用いた免疫染色に供した。
　ヒトＦｃ、マウスＦｃ及びウサギＦｃは、Ａｌｅｘａ４８８標識抗ヒトＩｇＧ抗体（希釈率：１：１０００、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、Ａｌｅｘａ５９４標識抗マウスＩｇＧ抗体（希釈率：１：１０００、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、及びＡｌｅｘａ５９４標識抗ウサギＩｇＧ抗体（希釈率：１：１０００、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を各々用いて検出した。細胞は、核を可視化するために、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（添加濃度：１μｇ／ｍｌ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）にて対比染色を行なった。蛍光画像は、ＡｘｉｏＩｍａｇｅｒ　Ｍ１　顕微鏡（Ｃａｒｌ　Ｚｅｉｓｓ社製）を用いて取得した。
　以上の材料及び方法を用いて得られた結果を、以下に示す。
　＜ヒトＥＣＲＧ４　ＥＬＩＳＡアッセイシステムの開発＞
　ＥＣＲＧ４サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイシステムを確立するために、本発明者らは、上述の抗ＥＣＲＧ４ウサギポリクローナル抗体（ＯＢ１２６４）と抗ＥＣＲＧ４マウスモノクローナル抗体（１Ｈ４、２Ａ８）とを組み合わせて用い、ＥＣＲＧ４ポリペプチド（７１～１４８位のアミノ酸からなるポリペプチド、７１～１３２位のアミノ酸からなるポリペプチド）を検出できるかどうかを調べた。
　その結果、図１Ａ及び１Ｂに示すとおり、ＯＢ１２６４と１Ｈ４又は２Ａ８との組み合わせを用いることによって、用量依存的に前記ＥＣＲＧ４ポリペプチドを検出できることが明らかになった。さらに、ＯＢ１２６４と２Ａ８との組み合わせによるシグナルは、ＯＢ１２６４と１Ｈ４との組み合わせによるそれよりも高かった。よって、以降のＥＣＲＧ４　ＥＬＩＳＡアッセイには、ＯＢ１２６４と２Ａ８との組み合わせを用いることにした。
　なお、図には示さないが、ＥＣＲＧ４ポリペプチドの検出において、ＯＢ１２６４と２Ａ８の使用濃度は共に１μｇ／ｍｌが最適であることを見出している。また、上述のウェスタンブロッティング及び免疫染色による分析を行ない、ＯＢ１２６４及び２Ａ８各々によってＥＣＲＧ４ポリペプチドを検出できる一方で、Ｅｃｒｇ４以外のタンパク質を検出しないということを確認している。さらに、ＥＣＲＧ４ポリペプチド（７１～１３２位）はＯＢ１２６４及び２Ａ８各々によって検出できる一方で、これらの抗体は７１～１３２位以外のＥｃｒｇ４領域を検出しないことも確認している。
　＜認知症患者由来の血漿におけるＥＣＲＧ４の増加＞
　上述のとおり、認知症、ＭＣＩ及び神経障害を伴う非認知症の各々の罹患者を対象とし、前記ＥＣＲＧ４　ＥＬＩＳＡアッセイを用い、血漿中のＥＣＲＧ４レベルを分析した。その結果、下記表３及び図２Ａに示すとおり、認知症患者においては約５０％（７９／１５９）、ＭＣＩ患者においては２５％（７／２８）、非認知症患者においては５％（４／８０）の割合で、ＥＣＲＧ４が各々の血漿において検出された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　また、女性の認知症患者及びＭＣＩ患者におけるＥＣＲＧ４の陽性率（血漿中のＥＣＲＧ４シグナル検出率）は各々、５１％（４６／９１）及び３５％（６／１７）であり、男性患者におけるそれらは各々、４９％（３３／６８）及び９％（１／１１）であった。さらに、認知症患者のうち、ＥＣＲＧ４は、ＡＤ患者の４７％（６１／１２９）において検出され、ＡＤ以外の認知症患者の６０％（１８／３０）において検出された。また、ＡＤ患者におけるＥＣＲＧ４陽性率は、男性において４４％（２４／５４）、女性において４９％（３７／７５）であった。一方、神経疾患を伴う非認知症患者における血漿中のＥＣＲＧ４の陽性率は、５％（４／８０）であった。
　また、血漿中の平均ＥＣＲＧ４レベルは、図２Ａに示すとおり、認知症及びＭＣＩ患者において０．９６ｎｇ／ｍｌであり、ＡＤ患者において１．０２ｎｇ／ｍｌであった。一方、非認知症患者では０．０８ｎｇ／ｍｌであった。さらに、これらに対し、図２Ｂに示すとおり、健常者の血漿ではＥＣＲＧ４を検出することができなかった。
　次に、ＭＭＳＥテスト（Ｆｏｌｓｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ，１９７５，Ｋａｕｆｅｒ　ｅｔ　ａｌ，２００８，Ｓａｘｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ，２００９）によって評価した結果、下記表４に示すとおり、ＭＭＳＥスコアが２３点以下であり認知症罹患が疑われる者における、血漿中のＥＣＲＧ４の陽性率は、３４％（２３／６７）であり、ＭＭＳＥスコアが２７点以下でありＭＣＩ罹患が疑われる者における、血漿中のＥＣＲＧ４の陽性率は、１３％（４／３１）であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　以上の結果から、ＥＣＲＧ４が認知症診断のための新しい血漿マーカーとして有効であることが明らかになった。
　また、Ａβ４０及びＡβ４２は、脳実質におけるアミロイドプラークの形成に関与し、ＡＤ患者の血漿及びＣＳＦにおけるそれらのレベル低下をもたらすことが知られている。さらに、Ａβ４２の凝集体はＡβ４０より早く生じるため（Ｈａｍｐｅｌ　ｅｔ　ａｌ，２０１０）、ＡＤ患者の血漿及びＣＳＦにおけるＡβ４２／Ａβ４０の比が低下することが示されている（Ｐａｌｍｑｖｉｓｔ　ｅｔ　ａｌ，２０１９）。
　そこで、上述の血漿試料についてＡβ４０レベル及びＡβ４２レベルを調べた結果、Ａβ４２／Ａβ４０の比については各試料間での変化が認められなかったにも関わらず（図３Ａ）、認知症患者及びＭＣＩ患者、並びにＡＤ患者における血漿中Ａβ４０及びＡβ４２の平均濃度は、非認知症患者のそれらと比して低下していた（図３Ｂ、認知症患者及びＭＣＩ患者におけるＡβ４０の血漿レベル（平均）：８２ｐｍｏｌ、ＡＤ患者におけるＡβ４０の血漿レベル（平均）：８５ｐｍｏｌ、非認知症患者におけるＡβ４０の血漿レベル（平均）：１０５ｐｍｏｌ、認知症患者及びＭＣＩ患者におけるＡβ４２の血漿レベル（平均）：９．４ｐｍｏｌ、ＡＤ患者におけるＡβ４２の血漿レベル（平均）：９．７ｐｍｏｌ、非認知症患者におけるＡβ４２の血漿レベル（平均）：１１．５ｐｍｏｌ）。
　また、上述のＣＳＦについてもＡβ４０レベル及びＡβ４２レベルを調べた結果、認知症患者及びＭＣＩ患者、並びにＡＤ患者におけるこれらの平均濃度は、非認知症患者のそれらと比して低下していた（図４Ｂ及び４Ｃ、認知症患者及びＭＣＩ患者におけるＡβ４０のＣＳＦレベル（平均）：９０９ｐｍｏｌ、ＡＤ患者におけるＡβ４０のＣＳＦレベル（平均）：９０９ｐｍｏｌ、非認知症患者におけるＡβ４０のＣＳＦレベル（平均）：１１５４ｐｍｏｌ、認知症患者及びＭＣＩ患者におけるＡβ４２のＣＳＦレベル（平均）：１０８ｐｍｏｌ、ＡＤ患者におけるＡβ４２のＣＳＦレベル（平均）：１０７ｐｍｏｌ、非認知症患者におけるＡβ４２のＣＳＦレベル（平均）：１５２ｐｍｏｌ）。
　さらに、Ｐａｌｍｑｖｉｓｔら、２０１９において示されているように、認知症患者及びＭＣＩ患者、並びにＡＤ患者のＣＳＦにおけるＡβ４２／Ａβ４０の比は、非認知症患者におけるそれらと比して、低下していることが認められた（図４Ｄ）。
　なお、ＥＣＲＧ４レベルはＣＳＦサンプル間で有意に変化しなかった（図４Ａ）。
　これらの結果から、ＣＳＦ及び血漿中のＡβ４０レベル、Ａβ４２レベル及びＡβ４２／Ａβ４０の比に関しては、認知症患者及び非認知症患者間の差は非常に少なく、これらは認知症診断のための信頼できるマーカーではないことが示される。
　これとは対照的に、血漿においてＥＣＲＧ４は、認知症患者及びＭＣＩ患者の５０％において検出されたにも関わらず、非認知症患者の９５％において検出されなかった。また、認知症患者及びＭＣＩ患者におけるＥＣＲＧ４レベルは、非認知症患者におけるそれと比してはるかに高く、認知症の血漿バイオマーカーとしてＥＣＲＧ４が極めて有効であることが明らかになった。
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　以上説明したように、本発明によれば、認知症を検査することが可能となる。特に、血液試料を用いて検査できるため、侵襲性低く、被検者に大きな負担をかけることがない。そのため、本発明は、認知症に関する医療分野において極めて有用である。

Claims (11)

  1. 　下記（ａ）～（ｃ）の工程を含む、認知症を検査する方法
    （ａ）被検体から分離された血液試料について、ＥＣＲＧ４ポリペプチドの量を検出する工程、
    （ｂ）工程（ａ）で検出したポリペプチド量を基準量と比較する工程、
    （ｃ）工程（ｂ）における比較の結果、前記被検体におけるポリペプチド量が基準量よりも高い場合、前記被検体は認知症を罹患していると判定する工程。
  2. 　前記血液試料が血漿である、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記ＥＣＲＧ４ポリペプチドの量の検出を、免疫学的方法により行う、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記免疫学的方法は、ＥＣＲＧ４の７１～１３２位のアミノ酸配列からなる領域を認識する抗体を、少なくとも用いる方法である、請求項１～３のうちのいずれか一項に記載の方法。
  5. 　前記免疫学的方法は、酵素結合免疫吸着法である、請求項１～４のうちのいずれか一項に記載の方法。
  6. 　ＥＣＲＧ４ポリペプチドを認識する抗体を含む、請求項１～５のうちのいずれか一項に記載の方法によって認知症を検査するための薬剤。
  7. 　前記抗体は、ＥＣＲＧ４の７１～１３２位のアミノ酸配列からなる領域を認識する抗体である、請求項６に記載の薬剤。
  8. 　ＥＣＲＧ４の１０７～１３２位のアミノ酸配列からなる領域を認識する抗体と、ＥＣＲＧ４の１３３～１４８位のアミノ酸配列からなる領域を認識する抗体又はＥＣＲＧ４の７１～１３２位のアミノ酸配列からなる領域を認識する抗体とを用いる免疫学的方法により、試料中のＥＣＲＧ４ポリペプチド量を検出する方法。
  9. 　前記免疫学的方法は、酵素結合免疫吸着法である、請求項８に記載の方法。
  10. 　ＥＣＲＧの１０７～１３２位のアミノ酸配列からなる領域を認識する抗体と、ＥＣＲＧ４の１３３～１４８位のアミノ酸配列からなる領域又はＥＣＲＧ４の７１～１３２位のアミノ酸配列を認識する抗体とを含む、試料中のＥＣＲＧ４ポリペプチド量を免疫学的方法により検出するためのシステム。
  11. 　前記免疫学的方法は、酵素結合免疫吸着法である、請求項１０に記載のシステム。
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