KR20020031734A

KR20020031734A - 신규한 아미노캘릭스아렌 유도체, 그의 제조방법, 그를이용하여 제조된 (자기조립)단분자층, 이를 이용한올리고ｄｎａ 고정화방법 및 이에 의해 제조된 ｄｎａ칩

Info

Publication number: KR20020031734A
Application number: KR1020000062413A
Authority: KR
Inventors: 김태선; 송금수; 박재범
Original assignee: 김태선; 바이오메트릭스 테크놀로지(주)
Priority date: 2000-10-23
Filing date: 2000-10-23
Publication date: 2002-05-03
Also published as: KR100698763B1

Abstract

본 발명은 하기 화학식 1 및 화학식 2 의 화합물의 합성과 이를 이용하여 고체기질을 제조하고 이 고체 기질을 올리고DNA 에 비오틴 (biotin) 등이 부착된 비오틴화 올리고 DNA (biotinylated 올리고DNA) 를 자발적인 분자인식에 의해 고정화시킨 올리고DNA의 단분자층의 제조 및 올리고DNA 칩 (oligoDNA chip) 의 제조에 관한 것이다:

[화학식 1]

{식 중, X= -O- 또는 -COO-, R₁= -H, R₂= -(CH₂)_nY (식 중, Y=-SH, -CHO, n=1~16 임) 또는 -C₆H₄-CHO, R₃= -페닐, -메틸로 정의함}.

[화학식 2]

{식 중, X= -NH-, -NHC(O)-, OC(O)-, R1= -H, -CH₃, -(CH2)nCH₃(식 중, n=1~5), R2= -(CH₂)nCHO (식 중, n=1~16), -(CH₂)nCOOH (식 중, n=1~16), -(CH2)m-Ar-(CH2)c-Y (식 중, Y=-SH, -CHO, -COOH, -NH₂, m=1~10, c=1~10), R3= -H, -페닐, -방향족 (Aromatic) 유도체, -CnHm (식 중, n=1~10 탄화수소 m=2n, 2n+2) 으로 정의함}.

일반적으로 화학식 1, 2 를 아미노캘릭스아렌 유도체라 한다.

Description

신규한 아미노캘릭스아렌 유도체, 그의 제조방법, 그를 이용하여 제조된 (자기조립)단분자층, 이를 이용한 올리고ＤＮＡ 고정화방법 및 이에 의해 제조된 ＤＮＡ칩 {NOVEL AMINOCALIXARENE DERIVATIVES, METHOD OF PREPARATION THEREOF, (SELF-ASSEMBLED)MONOLAYER PREPARED BY USING THEM AND FIXING METHOD OF OLIGO-DNA BY USING THE SAME AND DNA CHIP PREPARED BY THE METHOD}

본 발명은 염기가 100개 이내인 올리고DNA 에 수소결합이 가능한 작용기를 부착한 뒤 이 작용기가 달린 올리고DNA 가 수소결합에 의한 자기조립방식으로 고체기질의 표면에 부착할 수 있게 고체기질을 단분자층을 이용하여 변형시키는 곳과이 고체 기질에 작용기가 달린 올리고DNA 가 자발적으로 인식되어 고정화되는 DNA 칩에 관한 것이다. 고체기질의 변형에 필요한 물질은 화학식 1에 도식화 되어 있고 본 발명의 목적은 이를 표면에 고정화 시키는 방법으로서 금 기질의 경우에는 티올기를 가진 아미노캘릭스아렌 자기조립 단분자층을 제조하는 방법과 유리기질 및 실리콘 웨이퍼나 수정의 표면등의 -OH 기가 외부로 노출된 고체기질의 경우에는 알려진 방법에 따라 이 기질을 먼저 변형시킨 뒤 아미노캘릭스아렌을 이민, 에스테르, 에테르, 아미드등의 화학결합방식으로 변형된 고체 기질에 결합시켜 아미노캘릭스아렌 단분자층을 제조하는 것이다. 본 발명의 또다른 목적은 상기 아미노캘릭스아렌 단분자층을 이용하여 아미노캘릭스아렌과 강한 수소결합이 가능한 비오틴등의 작용기가 부착된 올리고DNA를 아미노캘릭스아렌 단분자층에 단순히 용액상태로 뿌려서 올리고DNA가 조직적으로 배열된 DNA 단분자층을 제조하는 것이다. 본 발명의 세번째 목적은 이러한 방식을 사용하여 미세배열기 (Microarryer) 를 이용하여 아미노캘릭스아렌 단분자층위에 다양한 올리고DNA 를 단순히 뿌려놓기만 하면 조직적으로 배열된 올리고DNA칩을 제조하는 방법이다. 이 방식은 세계에서 최초로 수소결합력을 이용하여 올리고DNA칩을 제조할수 있는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 염기가 100개 이내인 올리고DNA를 표면에 단분자층으로 제조할 수 있는 새로운 기질의 개발과 고정화 공정개발 및 기질제조로 요약할 수 있다. 지금 전 세계에서 거세게 일고있는 게놈 연구의 결실로 인간 유전자의 염기서열과 유전자의 암호를 얻는 연구가 대단히 거세게 진행되고 있다. 이러한 연구의 결과로 얻은 게놈의 구조와 기능정보들은 생명의 신비를 밝히는데 결정적인 도움을 줄것이고21세기 사회전반에 걸쳐 새로운 시대를 열게 만들 것이다.

하루에도 수백개 이상 밝혀지는 새로운 유전정보들이나 모든 유전암호가 밝혀진 생물들을 기존의 방법으로 연구한다는 것은 너무나 많은 시간과 노력을 필요로 하기 때문에 이러한 연구를 가속화 하고 단순화 하기 위하여 극히 최근에야 개발된 방법이 많은 DNA를 좁은 한정된 고체기질위에 올려놓은 DNA 칩이다. 이 방법을 사용하여 적게는 수백개에서 많게는 수만개의 DNA를 수 제곱센티미터의 좁은 공간에 집어 넣을수 있게 만든 것이다. 즉 DNA 칩이란 유전자 검색용으로서 엄청나게 많은 종류의 DNA 를 고밀도로 붙여놓은 것을 말한다. 인간의 모든세포는 똑같은 유전정보를 가지고 있지만 발생단계에서 자신의 결정된 역할들에 의하여 특정 유전자 만을 발현함으로서 다른 세포들과 구별되어진다. 즉 인간의 몸을 형성하는 각각의 세포군들에게는 그들만의 독특한 유전자들이 발현되는 것이다. 이들은 서로 아주 긴밀한 관계를 유지하고 있으며, 만약 이들유전자들에 돌연변이가 생기거나 변화가 일어나면 질병이 발생한다. 그러므로 DNA 칩을 이용하여 게놈차원에서의 유전자 기능과 변화를 알아내는 것은 과학기술적인 측면 뿐만아니라 인류의 건강과 신비를 해석하는데 아주 중요하다. DNA칩은 크게 나누어 cDNA칩과 올리고DNA칩(혹은 올리고뉴클레오티드칩)으로 나눌수 있는데, 현재까지 전 세계적으로 개발되어 사용되는 칩 제조방법은 스텐포드 대학에서 개발한 핀 미세배열법 (pin microarray), 인사이트에서 사용하는 잉크 젯 (Ink jet) 원리를 이용한 미세적가법 (microdropping), 아피멕스사 (Affymetrix Co.) 에서 개발한 포토리토그래피 (Photolithography) 를 이용한 올리고뉴클레오티드 직접합성법, 그리고 전기를이용한 올리고뉴클레오티드 어드레싱법 (oligonucleotide addressing) 등이 있다. 핀 미세배열법과 미세적가법은 DNA중 염기의 개수가 1000개 이상의 길이가 아주 긴 생체에서 직접 추출해낸 cDNA가 녹아있는 용액을 유리기질의 표면에 뿌려서 말리는 것인데 이때 표면에 떨어뜨리는 DNA 가 포함된 방울의 직경이 100-200 마이크로미터 정도의 대단히 작은 크기이기 때문에 정해진 좁은 면적내에 많은 종류의 cDNA를 심을수 있는 방식이다. 하지만 이 방식은 뿌려진 cDNA가 용매가 증발하면서 말려지면서 표면에 분자가 물리흡착방식으로 부착되기 때문에 상보적 DNA 가 접근해서 짝을 이루게 될 때 짝 형성이 가능한 부위가 어느 곳인지를 알기가 쉽지 않다는 단점이 있다고 알려져 있다. 즉 유전자 검색시에 상당한 에러를 유발하는 것으로 알려져 있다. 전기를 이용한 올리고뉴클레오티드 어드레싱법은 위 두가지 방법에서 나타나는 문제점중에 표면에 고정되는 DNA의 양이 저농도여서 발현시킬 때 측정감도를 증가시키기 위하여 DNA에 존재하는 음의 성질을 이용하여 기질의 특정 위치에 양의 전하를 걸어 표면 고정화 되는 DNA 농도를 상당폭 증가시킨 것이다. 현재 시판되는 올리고DNA칩을 제조하는 유일한 회사는 아피멕스사이고 이 회사에서 사용하는 칩 제조 방법은 디-램 (D-Ram) 등의 칩을 제조할 때 사용하는 포토리토그래피법을 이용하여 염기를 유리기질위에 하나씩 합성하여 15-25개의 염기가 각각 배열이 다른상태로 1제곱센티의 표면에 수천에서 수만개의 올리고DNA가 올라간 칩을 합성하는 방법이 알려져 있다. 이 방법이 현재까지 알려진 방법 중 가장 많은 종류의 염기를 정해진 면적내에 올릴수 있는 방법이나 칩 제조공정상 고가의 시약과 고가의 포토마스크 (photomask) 를 사용해야 하기 때문에 칩의 가격이 수백만원에서 수천만원까지의 고가라는 것이 문제점으로 알려져 있다. 현재 cDNA칩은 유전자의 확보에 많은돈과 인력이 필요하고 유전자 자체가 특허화 되는 경향이 있다. 최근에는 변형유전자 검색시에 사용되는 방법인 SNP(single nucleotide polymorphism)법을 적용가능한 것이 올리고DNA칩으로 알려져 있으며 이러한 올리고DNA칩 제조법중 아피멕스사의 방법과 다른 방법을 연구하고 있다. 현재 올리고DNA칩 제조시에 전세계적으로 집중적으로 연구되고 있는 방법은 금 기질위에 티올기가 부착된 올리고DNA를 자기조립방식으로 부착하는 자기조립형 올리고DNA칩, 유리기판위에 아민이나 알데히드 등의 특정 작용기를 부착하고 여기에 올리고DNA를 화학결합방식으로 부착하는 등의 연구가 주로 진행되고 있다. 또 생명공학 분야에서 주로 사용되는 올리고DNA 부착방법 중 하나는 알려진 방법에 따라 고체기질 위에 비오틴 (비오틴) 을 부착한 뒤 이 비오틴 층위에 아비딘 (avidin) 이나 스트렙토아비딘 (streptoavidin) 을 분자간 인식에 의하여 비오틴의 표면에 부착하고 비오틴이 부착된 올리고DNA를 이용하여 삼중분자층에 의한 올리고DNA 고정화반응이 단백질의 고정화반응과 연계하여 사용되고 있다 (Science, 1993년 Vol 262, pp 1706-1708). 기존에 사용되던 물리흡착방식이나 최근에 연구되기 시작한 화학결합방식과 비오틴 - 아비딘 인력을 이용한 방식등의 올리고DNA칩 제조방법 연구에서 나타나고 있는 문제점 중 가장 많이 나타나고 있는 것은 길이가 긴 cDNA 인 경우에는 표면에 물리흡착이 되는 경우 DNA 가 짝을 이룰 때 사용할 수 있는 염기 서열이 표면으로 도출되어 일부는 측정이 가능한 상태로 되나 길이가 짧은 올리고DNA 인 경우 표면에 물리흡착이 되면 접근해 오는 상보적 DNA와 반응하여 짝을 이루는 것이 선천적으로불가능해진다. 이러한 물리흡착 문제가 올리고DNA칩을 제조할 때에 가장 큰 문제점 중의 하나로 문제점 해결에 많은 연구들이 진행되고 있고, 제조기질의 여하에 불문하고 비오틴 단분자층에 고정된 아비딘 혹은 스트렙토아비딘 층 위에 올리고DNA를 조직적으로 배열시켜 기질에 수직으로 조직적으로 정렬되게 하는 혹은 자발적으로 정렬되게 하는 기질의 필요성이 부각되고 있다. 현재 많이 연구되는 화학결합방식이나 생명공학분야에서 사용되고 있는 단백질기질 위에 정렬시키는 방식은 올리고DNA 가 자발적으로 정렬하는데 필요한 공간을 효율적으로 제공해 줄 수 있는 기질이 되기에 약간의 문제점을 가지고 있어서 정렬후 여러 가지 후처리 방식을 사용하고 있다.

본 발명에서 개발한 새로운 기질에 의하면 일반 올리고DNA는 표면에 물리흡착되지 않고 수소결합이 가능한 비오틴등의 작용기가 부착된 올리고DNA 만 선택적으로 표면에 인식되어 고정화 된다. 특히 이들 작용기가 인식될 수 있는 인식위치는 초분자인 아미노캘릭스아렌이 각각 하나씩을 가지고 있는데 이들 분자가 적절히 배열되어 있으므로 인식되어 고정된 올리고DNA가 적절한 수준의 공간을 가지고 배열되어 표면에 조직적으로 고정화 될 수 있게 하는 기질을 제공하는 것이다.

다시 말해서, 본 발명은 세계적으로 개발경쟁이 격심한 올리고DNA를 정해진 공간에 최대한 집어넣은 올리고DNA칩을 제조할수 있는 기질과 그 기질의 제조에 필요한 아미노캘릭스아렌이라는 초분자의 합성이다. 기존에 사용되고 있는 올리고DNA칩은 포토리토그래피법을 이용하여 염기를 하나씩 고체기질 위에 화학결합방식을 이용하여 합성법을 통하여 올리는 방법을 사용하였으나 이 발명에서는 기 합성된 올리고DNA를 원하는 개수만큼 원하는 고체기질의 정해진 표면에 고정화시킬 수 있는 방법을 개시하고 있다. 이 발명은 고체기질위에 하나씩 염기를 올리는 방식이 대단히 고가의 화학물질 및 많은 수자의 포토마스크를 사용하여 고가의 DNA칩만 제조할수 있는 반면에 이 방식에 따르면 외부에서 저렴한 가격으로 합성된 올리고DNA를 본 발명에서 제조한 아미노캘릭스아렌 단분자층이 고정된 고체기질위에 뿌려 놓기만 하면 조직적으로 배열된 올리고DNA칩을 제조할수 있기 때문에 대단히 저렴한 가격대의 칩을 생산할수 있는 발명이다. 또한, 올리고DNA의 고정화 시에는 DNA가 표면에 수직으로 배열될 수있게 배열하는 기술의 개발이 필수적이다. 왜냐하면 올리고DNA는 길이가 짧아서 표면에 물리흡착에 의해 부착되어 버리면 DNA칩으로서의 역할을 하지못하기 때문이다. 아미노캘릭스아렌의 단분자층은 상기의 바람직한 배열이 원천적으로 가능한 표면을 제공하고 또 아미노 캘릭스아렌의 표면에 올리고DNA가 고정화되는 과정에서는 올리고DNA가 아미노캘릭스아렌의 표면에 물리흡착이 되지 않아서 DNA 끼리 서로를 지지해주는 대단히 조직적으로 표면에 배열된 올리고DNA칩의 제조를 가능케 하는 발명이다. 또, 제조시간은 올리고DNA를 뿌려서 고정화 될 때까지 약 12시간 정도걸리기 때문에 제조공정도 간편하며 빠르게 원하는 종류의 올리고DNA를 제조해 낼수있다는 것이 본 발명의 장점이다. 조직적으로 배열된 DNA는 접근해 오는 상보적 DNA와 반응 시간이 빠르고 오차가 상대적으로 적은 chip의 생산을 가능케 하는 획기적인 발명이다. 또한 이와같은 기질의 제조에 필수적인 화학식 1 및 화학식 2 의 아미노캘릭스아렌 유도체는 현재까지 발표된 적이 없는 신규한 화합물이고 이의 수소결합력을 이용한 특정작용기의 인식연구 등의 기초연구조차도 행해진 적이 없는 다양한 아미노캘릭스아렌 유도체의 합성법도 본 발명에서 개발하였다.

도 1 은 아미노캘릭스아렌 유도체의 제조법을 나타낸다.

도 2 는 금 기질 위에 자기조립분자층 제조시 필요한 아미노캘릭스아렌 유도체의 제조법을 나타낸다.

도 3 은 유리기질 위에 단분자층 제조시 필요한 아미노캘릭스아렌 유도체의 제조법을 나타낸다.

도 4 는 유리기질을 아미노캘릭스아렌 유도체를 부착될수 있는 말단기를 가진 화합물을 이용하여 아미노캘릭스아렌 유도체중 한종류를 유리기질의 표면에 단분자층으로 제조하는 여러 방법중 한가지를 나타낸 것이다.

도 5 는 알데히드기가 부착된 아미노캘릭스아렌 유도체9를 이용하여 아민 코팅된 유리기질 위에 아미노캘릭스아렌5의 단분자층제조법을 나타낸다.

도 6 는 아미노 캘릭스아렌 유도체중 티올기가 부착된 유도체를 이용하여 금 기질위에서 제조한 아미노캘릭스아렌 유도체 자기조립 단분자층 제조법을 나타내고있다.

도 7 은 아미노캘릭스아렌 자기조립 단분자층에 비오틴화 올리고DNA (비오틴화 올리고DNA) 가 표면에 수직되게 배열되는 과정을 나타내는 전략도이다.

도 8 은 수정결정미시저울(quartz crystal microbalance, QCM)을 이용하여 상보적 올리고DNA가 결합되는 과정을 실시간대에서 측정한 것이다.

도 9 은 상보적 올리고DNA가 결합함에 따라 나타나는 무게의 변화가 실제로 표면에 부착된 DNA 와의 결합에 의한 무게변화라는 것을 나타내기 위하여 실시한 일종의 대조군 실험 (control experiment) 이다.

도 10 는 금 기질과 아미노캘릭스아렌의 자기조립단분자층, 이를비오틴이 부착된 올리고DNA 용액에 14시간 동안 두어 제조한 올리고DNA 단분자층 및 이에 상보적인 DNA를 가했을 때 나타나는 변화를 전기화학적으로 실험한 결과이다.

도 11 은 도 6 과 같은 실험조건에서 제조된 기질을 0.3 mM 의 페로센 카르복실산 (ferrocene carboxylic acid) 라는 산화환원 (redox) 분자를 사용하여 표면에 접근성이 어느정도 차이가 나는가를 실험한 결과중 하나이다.

본 발명품은 수소결합력을 이용하여 즉 분자인식이라는 분자수준에서의 분자간 인력을 이용하는 방식의 새로운 개념을 적용하여 수소결합력이 대단히 큰 초분자인 아미노캘릭스아렌을 합성하고 이의 다양한 유도체를 이용하여 고체기질위에 아미노캘릭스아렌단분자층을 제조하며 이 아미노캘릭스아렌에 가장 적절히 인식되는 비오틴 등의 강한 수소결합이 가능한 작용기를 부착한 올리고DNA가 수소결합력이라는 분자간 인력에 의해 인식되어 표면에 고정되어 올리고DNA 단분자층을 제조할 수 있는, 기존의 방식에 비하여 쉽고 저가의 올리고DNA 칩으로서 다음과 같이 구성된다.

1. 비오틴 등에 의해 강한 수소결합이 가능한 작용기를 가진 올리고DNA와 수소결합 혹은 분자간 인력에 의하여 강하게 붙잡는 인식기 역할을 하는 화학식 1 및 화학식 2 의 아미노캘릭스[4]아렌 유도체 제조법

{식 중, X= -O- , R₁= -H, R₂= -(CH₂)_nY (식 중, Y=-SH, -CHO, n=1~16 임), R₃= -페닐, -메틸로 정의함}.

{식 중, X= -NH-, -NHC(O)-, -OC(O)-, R1= -H, -CH₃, -(CH₂)nCH₃(식 중, n=1~5), R₂= -(CH₂)nCHO (식 중, n=1~16), -(CH₂)nCOOH (식 중, n=1~16), -(CH₂)m-Ar-(CH₂)c-Y (식 중, Y=-SH, -CHO, -COOH, -NH₂, m=1~10, c=1~10), R₃= -H, -페닐,-방향족 (Aromatic) 유도체, -CnHm (식 중, n=1~10 탄화수소 m=2n, 2n+2) 으로 정의함}.

화학식 1 및 화학식 2 에 있는 물질을 합성하는 출발물질은 X= -O- , R₁R₂= -H , -CH₂R₃=H 인 테트라아미노칼릭스[4]아렌 (tetraaminocalix[4]arene) 이다. 이 물질은 기존에 알려진 방법을 약간 변형하여 높은 수율로 합성한다. 알려진 칼릭스[4]아렌 (calix[4]arene) 화합물을 니트로화 (nitration) 시켜 테트라니트로칼릭스[4]아렌 (tetranitrocalix[4]arene) 을 합성하고 이에 수소를 가하면서 Pd/C 을 촉매로 사용하여 합성하였다. 이러한 출발물질과 할로겐화 알킬 혹은 기능화 벤질브로마이드 (functionalized benzylbromide) 등의 물질과 반응시키면 X=-O-, R1,R2=-H, R3= 알킬 또는 방향족인 아미노캘릭스아렌 유도체가 합성된다. 이 유도체에 금 기질에 부착할 때 필수적인 -SH (티올기)를 부착하는 방법은 R₁을 브롬화알킬 형태로 바꾼 다음 이 브롬화 부분을 티오우레아와 NaOH 를 사용하여 SH가 부착된 아미노캘릭스아렌 유도체를 제조할 수 있다. 유리등의 기질표면에 아민이나 알데히드등의 작용기를 가지도록 고체기질을 변형시키는 방법은 기존에 발표된 방식에 따라 제조한다. 이어서 이 변형된 고체기질과 반응할 때 필요한 아민이나 알데히드 작용기를 부착한 아미노캘릭스아렌 유도체의 합성은 기존에 알려진 방식에 따라 알데히드가 부착된 벤조산 등과 -OH기가 달린 아미노캘릭스아렌 유도체를 반응시켜 에스테르화 반응을 하거나 브로모프로판올 등의 물질과 반응시켜 R₂위치를 3-히드록시프로필로 변형시킨 뒤 PDC 를 이용하여 디클로로메탄 등의 할로알칸 용매에서 산화반응을 하여 알코올을 알데히드기로 변형하여 알데히드기가 부착된 아미노캘릭스아렌의 유도체를 합성한다. 산화를 더 진행시키면 카르복시기가 부착된 화합물을 생성한다. 물론 아민이 부착된 화합물은 -OH 기를 가진 아미노캘릭스아렌 유도체의 R₂위치와 디브로모알칸을 반응시켜 모노브로모알칸을 R₂위치에 에테르 형태로 부착시킨후 브롬기를 아민으로 변형시켜 아민 작용기를 부착한 아미노캘릭스아렌 유도체를 합성한다. 즉, 아민 작용기가 달린 고분자 기질에 이민결합을 사용한 아미노캘릭스아렌 유도체의 단분자층 고체기질을 제조할 수 있으며, 이 외에 고체기질에 아미노캘릭스아렌의 단분자층을 이민 이외의 에스테르, 에테르, 아미드등의 공유결합을 이용하여 제조하는 아미노캘릭스아렌 유도체의 단분자층 고체기질을 제조할 수 있다.

2. 금 기질위에 아미노캘릭스아렌 유도체 자기조립단분자층을 제조하는 방법

상기 제조한 티올기가 부착된 아미노캘릭스아렌 유도체가 1-3mM 농도로 녹아있는 용액에, 직전에 깨끗하게 만든 금 기질을 담근 뒤 약 3~8시간 후에 꺼내어 즉시 아세톤등의 유기 용매로 3회 세척한 뒤 질소를 사용하여 표면을 건조시키면 금 기질위에 아미노캘릭스아렌의 자기조립단분자층(기질 A)이 제조된다.

3. 변형된 유리, 수정, 실리콘웨이퍼, 아민 카르복시기 알코올등의 작용기가 달린 고분자 등의 고체기질 위에 아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층을 제조하는 방법

상기 제조한 알데히드기가 부착된 아미노캘릭스아렌 유도체를 이용하는 경우 아민 작용기가 부착된 변형된 유리, 수정, 실리콘웨이퍼, 아민 카르복시기 알코올등의 작용기가 달린 고분자 등의 다양한 고체기질을 유도체가 10 mM 의 농도로 녹아 있는 유기용매에 4~8시간 동안 상온에서 담근 뒤 같은 유기용매로 기질을 3회 린스해준 뒤 질소분위기에서 말려서 고체기질에 이민결합을 통하여 단분자막으로 고정화된 아미노캘릭스아렌 단분자층(기질 B)을 제조한다. 사용하는 유기용매는 아세톤, 에탄올 등의 극성용매를 사용한다.

4. 기질 A형 과 기질 B형 에 수소결합이 가능한 작용기가 부착된 올리고DNA를 용액상태로 뿌려서 올리고DNA 단분자층을 제조하는 방법

염기가 200개 이하인 비오틴화 올리고DNA같은 강한 수소결합이 가능한 작용기가 부착된 올리고DNA가 수 ㎍/mL에서 수백 ㎍/mL 수준의 저농도로 녹아있는 수용액을 기질 A형이나 기질 B형위에 수㎕에서 수백㎕의 방울형태로 뿌리고 약 5시간에서 12시간이 지난뒤에 정제수를 이용하여 깨끗이 씻은 뒤에 말려서 올리고DNA가 용액에 노출된 표면위에 조직적으로 고정화된 단분자층을 제조한다. 이렇게 제조된 단분자층은 질소를 불어주면서 말리면 다양한 올리고DNA가 기질 A형이나 기질 B형의 표면의 정해진 위치에 조직적으로 배열되어 있는 올리고DNA칩을 제조한다. 이 제조법은 현재까지 개발되어 시판되고 있는 DNA 배열기 (DNA arrayer) 를 사용하는 경우 약 1 평방센티미터에 2000개의 올리고DNA를 올릴수 있다. 앞으로 더 많은 개수를 올릴수 있는 DNA 배열기가 개발된다면 개발된 수준에 따라 더많은 수의 DNA를 올릴수 있다. 다시 말하여, 상기 제조된 아미노캘릭스아렌 유도체의 단분자층에 비오틴이 부착되어있고 염기의 개수가 10-30, 31-100 및 100-200 개인 올리고DNA 가 분자간 인력에 의해 자발적으로 고정화하는 칩을 제조할 수 있는 것이며 본 발명의 방법에 의하여 그러한 칩의 제조가 가능한 것이다.

이 때에 비오틴 대신 아미노캘릭스아렌에 수소결합이 가능한 우레아 (urea), 글리콜우릴 (glycoluril) 등의 작용기가 달린 올리고DNA를 분자간 인력에 의해 고정화하는 칩을 제조할 수 있는 것이며 본 발명의 방법에 의하여 그러한 칩의 제조도 가능하다.

이런 경우의 방법을 이용하여 상기의 아미노캘릭스아렌 단분자층 1cm²의 정해진 공간 위에 올리고DNA가 1 종 내지 10000 종이 1 개 내지 10000 개, 나아가 1 종 내지 100000 종이 10001 개 내지 100000 개가 부착된 올리고DNA칩도 제조할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

아미노캘릭스아렌 유도체의 제조 (도 1)

출발물질인 캘릭스아렌 ( 1 , 500 mg)을 CH₂Cl₂50mL에 녹인 후 아세트산 (0.5mL)와 HNO₃0.175mL (65%, 24mmol)를 가한다. 상온에서 1시간 동안 반응시키면 노란색의 침전물이 생긴다. 이 침전물을 감압필터하여 노란색의2의 화합물 5,11,17,23-테트라니트로칼릭스[4]아렌 (5,11,17,23-tetranitrocalix[4]arene)를 96%의 수율로 얻는다[참고논문:1. J. D. van Loon, A. Aruduini, L. Coppi, W. Verboom, A. Pochini, R. Ungaro, S. Harkema, and D. N. Reinhoudt, J. Org. Chem. vol 55, p5639- (1990). 2. W. Verboom, A. Durie, R. J. M. Egberink, Z. Asfari, and D. N. Reinhoudt, J. Org. Chem. vol 57, p1313 (1992). 3. P. D. Beer, M. G. B. Drew, C. Hazlewood, D. Hes다, J. Hodacova, and S. E. Stokes, J. Chem. Soc., Chem. Commun. p229 (1993)].

니트로칼릭스아렌 (nitrocalixarene 2 , 1.5g, 2.48 mmol) 와 10% Pd/C 2g 을 90mL의 디메틸포름아미드 (DMF) 에 녹인 뒤 수소기체로 상온에서 50mL/min의 속도로 36시간동안 버블링 (bubbling) 시킨다. 여과용지에 셀리트 (celite, 여과제) 를 덮은 후 감압여과하여 Pd/C를 제거한다. 여과된 반응용액을 회전증발기 (Rota-Evapotator) 에서 배스의 온도 60도로 감압증류하여 짙은 황갈색의 고체인 5,11,17,23-테트라아민칼릭스[4]아렌 (5,11,17,23-tetraaminecalix[4]arene 3 ) 을 93.1% (1.13g)의 수율로 얻었다. 이 물질을 클로로포름에서 재결정하여 연한 노란색의 결정을 78%의 수율로 얻었다. 재결정 하지않은 물질 3 을 다음 반응에 직접 이용한다. 이 캘릭스아렌 유도체인 2 와 3 은 칼릭스[4]아렌의 특징적인 콘형태 (cone-shape) 을 이루지 않아 NMR로는 구조분석이 쉽지 않아 이를 고성능질량분석기 (High Resolution Mass) 를 이용하여 니트로캘릭스아렌은 M+1인 605에서, 아민캘릭스아렌은 M+1인 485에서 페어런트 피크 (parent peak) 를 얻어 반응이 제대로 진행되었음을 확인 하였다. 이 두 반응은 참고문헌 1-4를 약간 변형시켜 진행하였다 [참고문헌:4. A. Onopchenko, E. T. Sabourin, and C. M. Selwitz J.Org. Chem. vol 44, p1233 (1979)].

아민캘릭스아렌3에 치환기가 붙은 화합물4와5는 다음과 같이 제조하였다.

특히, 화합물5는 다음의 화학식 3 의 구조를 가지며, 본 발명에서 매우 중요하다.

먼저 화합물 3 (100mg, 0.205 mmol) 을 10mL의 건조 아세토니트릴에 녹인 뒤 벤질브로미드 2.81g(16.4 mmol)을 넣은 뒤 80도로 가열한다. 이 용액에 트리에틸아민 830mg 을 아세토니트릴 5mL 에 녹인 용액을 약 6시간에 걸쳐 가하고 총 12시간동안 반응시킨 후 감압하에 용매를 제거한다. 모두 30mL의 CH₂Cl₂에 녹인 뒤 물로 두번 씻어준다. 유기용액을 무수 Na₂SO₄를 넣어 건조시킨 뒤 용액을 여과한 뒤 감압하에 용매를 제거한다. 고체를 모두 뜨거운 에탄올에 녹인 뒤 이를 서서히 식혀서 61%의 수율로 5 를 얻는다. 이 반응은 참고문헌 5를 기초로 하여 합성하였다 [참고문헌:5. B. D. Gray and P. W. Jeffs J. Chem. Soc., Chem. Commun. p1329 (1987)].

X-ray 결정술 (X-ray crystallography) 에 필요한 결정은 5 의 CHCl₃에 녹인 포화용액을 저속 증발법 (slow evaporation) 을 이용하여 결정을 얻었다. 5 의 분석결과는 아래와 같다.

¹H NMR (CDCl₃) δ10.164 (s, 4H, -OH), 7.291-7.064 (m, 40H, ArH), 6.276 (s, 8H, ArH), 4.304 (s, 16H, -CH₂- benzyl0), 4.109 (d, 4H, -CH₂-, J = 13.6 Hz), 3.125 (d, 4H, -CH₂-, J = 13.6 Hz) : FAB-Ms m/z 1205 (M+1H)⁺

4 와 5 가 혼합물로서 얻어지는 경우에는 실리카겔 칼럼을 사용하여 4 를 분리한다. 4 는 30mg을 1mL의 CH₂Cl₂에 녹인 뒤 10 ㎕의 CF₃SO₃H를 3분에 걸쳐 서서히 가하여 상온에서 반응시키면 1시간뒤에 붉은 콜로이드 형태의 용액이 된다. 이 용액에 트리에틸아민 50㎕를 사용하여 천천히 중화시킨 뒤 상온에서 감압 증류하여 용매를 모두 제거한 뒤 7cm 길이의 짧은 실리카젤 칼럼을 이용하여 CH₂Cl₂를 전개용액으로 사용하여 여과하듯이 칼럼하여 정제하면 21mg 의 5 를 얻는다.

4의 NMR 데이타는 아래와 같다.

¹H NMR (CDCl₃) δ7.805 (s, 2H, -OH), 7.291-7.051 (m, 50H, ArH), 6.331 (s, 4H, ArH), 6.293 (s, 4H, ArH), 4.929 (s, 4H, -OCH₂-), 4.260 (s, 16H, -CH₂- benzyl), 4.194 (d, 4H, -CH₂-, J = 12.7 Hz), 2.976 (d, 4H, -CH₂-, J = 12.7 Hz) : FAB-Ms m/z 1387 (M+2H)⁺

실시예 2 (도 2)

금 기질위에 자기조립단분자층 제조에 필요한 아미노캘릭스아렌 유도체 합성법

위에서 합성된 아미노캘릭스아렌 5 (1.3g, 1.07 mmol)을 100mL의 무수 Acetonitrile에 녹인 뒤 1,4-dibromobutane (786.5mg, 3.22mmol)과 K₂CO₃(444.6mg, 3.22mmol)을 넣고 70도에서 24시간동안 가열한다. 식힌 뒤 용매를 감압하에서 모두 제거하고 150 mL의 1N HCl을 가한 뒤 200mL의 CH₂Cl₂를 가하여 유기층에 결과물을 녹여 물층과 분리한다. CH₂Cl₂용액을 1N HCl 70 mL 로 두 번 씻은 뒤 살린 용액으로 두 번 닦는다. CH₂Cl₂용액을 분리하고 무수 MgSO4를 넣어 말린 뒤 여과하고 감압증류하여 용매를 제거한다. 이 물질에 뜨거운 헥산을 가하여 디브로모부탄을 녹여내고 결정화 시키면 862mg의 6 (0.58 mmol, 54.6%)을 얻는다.

6 의 NMR 데이타는 아래와 같다.

¹H NMR (CDCl₃) δ8.017 (s, 2H, -OH), 7.243-7.092 (m, 40H, ArH), 6.297 (s, 4H, ArH), 6.282 (s, 4H, ArH), 4.282 (s, 16H, -CH₂- benzyl), 4.157 (d, 4H, -CH₂-, J = 12.7 Hz), 3.905 (t, 4H, -OCH₂-, J = 6.0 Hz), 3.596 (t, 4H, -CH₂Br, J = 6.4 Hz), 3.041 (d, 4H, -CH₂-, J = 12.7 Hz), 2.202-2.013 (m, 8H, -CH₂-)

위에서 합성된 아미노캘릭스아렌 유도체 6 (643mg, 0.489mmol)을 150mL의 에탄올에 녹인 뒤 티오우레아 112mg (1.467mmol)를 넣고 70도에서 12시간동안 반응시킨다. 용매를 감압증류시켜 모두 제거한 뒤 1M KOH (1.5 mmol)을 넣고 2시간동안 환류시킨 뒤 1N HCl로 pH=4에 맞춘 뒤 100mL의 CH₂Cl₂용액을 가하고 유기층을 분리 시킨다. 유기층을 100 mL의 물로 두 번 린스한 뒤 용매를 제거하고 무수 Na₂SO₄를 가하여 말린 뒤 감압증류하여 결과물 7 을 73% (424mg)의 수율로 얻었다. 7 의 NMR 결과는 아래와 같다.

¹H NMR (CDCl₃) δ8.002 (s, 2H, -OH), 7.248-7.031 (m, 40H, ArH), 6.288 (bs, 8H, ArH), 4.278 (s, 16H, -CH₂- benzyl), 4.179 (d, 4H, -CH₂-, J = 12.7 Hz), 3.906 (t, 4H, -OCH₂-, J = 6.0 Hz), 3.030 (d, 4H, -CH₂-, J = 12.7 Hz), 2.359 (t, 4H,-CH₂SH, J = 6.4 Hz), 2.078 1.994 (m, 4H, -CH₂-), 1.322-1.253 (m, 4H, -CH₂-)

실시예 3 (도 3)

유리 기질위에 단분자층 제조에 필요한 아미노캘릭스아렌 유도체 합성법

출발물질 5 (93mg, 0.077 mmol)를 10mL의 무수 acetonitrile에 녹인 다음 K₂CO₃(29.0mg, 0.21 mmol)와 bromopropanol (29.2mg, 0.21 mmol)을 넣은 뒤 70도에서 24시간 반응시킨다. 용매를 감압하에 제거하고 100mL의 CH₂Cl₂와 10mL의 1N HCl을 가한 뒤 유기층을 분리하고 물과 포화소금물을 이용하여 rinse 한 다음 무수 Na₂SO₄를 가하여 말린다. 용매를 감압하에 제거하여 결과물 8 (63mg, 62%)을 얻었다. 8 의 NMR 데이타는 아래와 같다.

¹H NMR (CDCl₃) δ7.979 (s, 2H, -OH), 7.278-7.041 (m, 40H, ArH), 6.313(s, 4H, ArH), 6.302 (s, 4H, ArH), 4.308 (s, 8H, -CH₂- benzyl), 4.148 (d, 4H, -CH₂-, J = 12.8 Hz), 3.985 (t, 4H, -OCH₂-, J = 6.0 Hz), 3.632 (t, 4H, -CH₂OH, J = 6.0 Hz), 3.072 (d, 4H, -CH₂-, J = 12.8 Hz), 2.314 (t, 4H, -CH₂-, J = 6.4 Hz)

위의 화합물 8 (85mg, 0.064 mmol)을 30mL의 CH₂Cl₂에 녹인다음 497mg의 PDC (Pyridium dichromate, 1.32mmol)를 가하고 상온에서 2~3시간 반응시킨다. CH₂Cl₂를 70mL 더 가하고 소금물로 두 번 린스한 다음 유기층을 분리하여 무수Na₂SO₄를 가하여 말린다. 용매를 감압하에 제거하여 결과물 9 (66mg, 78%)를 얻었다. 9 의 NMR 데이타는 다음과 같다.

¹H NMR (CDCl₃) δ9.743 (s, 2H, -CHO), 8.012 (s, 2H, Ar-OH), 7.267-7.055 (m, 40H, ArH), 6.311 (s, 4H, ArH), 6.300 (s, 4H, ArH), 4.306 (s, 8H, -CH₂- benzyl), 4.152 (d, 4H, -CH₂-, J = 12.8 Hz), 3.962 (t, 4H, -OCH₂-, J = 6.0 Hz), 3.069 (d, 4H, -CH₂-, J = 12.8 Hz), 2.733 (m, 4H, -CH₂CHO), 2.012 (m, 4H, -CH₂-)

실시예 4 (도 5)

알데히드기가 부착된 아미노캘릭스아렌 유도체 9 를 이용하여 아민 코팅된 유리기질위에 아미노캘릭스아렌 5 의 단분자층 제조법

도 5 는 유리기질을 아미노캘릭스아렌 유도체를 부착될수 있는 말단기를 가진 화합물을 이용하여 아미노캘릭스아렌 유도체중 한종류를 유리기질의 표면에 단분자층으로 제조하는 여러 방법중 한가지를 나타낸 것이다. 이 경우는 기존에 알려진 방법에 따라 (ref. J. W. Park, Langmuir vol 13, 4305 (1997), T. J. Marks, Langmuir vol 12, 5338 (1996)) -OH 기가 풍부한 유리기질의 표면에 화학반응을 통하여 아민 말단기를 가지게 한 다음 이 아민 말단기를 아미노캘릭스아렌 유도체와 반응시켜 화학결합에 의해 이민 (imine) 형태로 아미노캘릭스아렌 유도체를 유리 기질위에 고정시켜 아미노캘릭스아렌 유도체 단분자층을 생성시키는 개략도이다.이 방법말고도 에스테르, 에테르, 산염기 반응 등을 사용하여 유리 기질에 아미노 캘릭스아렌을 부착할 수 있다.

보다 구체적으로, 유리기질에 아민코팅하는 방법은 기존에 알려진 방법을 사용하여 제조하였다. 위에서 제조된 화합물 9 가 10 mM 농도로 녹아있는 CHCl₃용액에 아민기를 가진 유리기질을 8-10시간 동안 담근 뒤 꺼내 CHCl₃에 3번 씻은 뒤 말리면 그림 11과 같이 이민기가 생성되며 아미노캘릭스아렌 5 의 화합물이 화학결합을 통해 유리기질위에 단분자층의 형태로 고정화 된 기질B 가 제조된다.

실시예 5 (도 6)

티올기가 부착된 아미노캘릭스아렌 유도체 7 을 이용하여 금기질위에 아미노캘릭스아렌 5 가 부착된 자기조립단분자층 제조법

도 6 는 아미노 캘릭스아렌 유도체중 티올기가 부착된 유도체를 이용하여 금 기질위에서 제조한 아미노캘릭스아렌 유도체 자기조립 단분자층 제조법을 나타내고 있다. 제조는 1-2 mM 농도로 아미노캘릭스아렌 유도체가 녹아있는 용매에 깨끗한 금 기질을 3-4시간 담근 뒤 꺼내 아세톤 용매와 알코올로 3-4회 씻어준 뒤 말리면 원하는 아미노캘릭스아렌의 자기조립 단분자층이 형성되는 개략도이다.

즉, 도 6 에서 보여지는 것처럼 아미노캘릭스아렌 유도체 7 이 1-3 mM 농도로 녹아있는 CHCl₃용액속에 금 기질을 진한황산에 30% H₂O₂에를 3:1의 비율로 섞은 피란하 (piranha) 용액에 약 30초 정도 담구어 꺼낸 다음 무이온수 (DI water)로 씻고 건조시킨 뒤에 집어넣는다. 12시간 뒤에 꺼내서 CHCl₃과 아세톤으로 닦으면 금기질위에 아미노캘릭스아렌 5 가 티올기를 이용하여 금기질위에 자기조립단분자층의 형태로 제조된 기질A 를 제조한다.

실시예 6 (도 7)

기질A 와 기질 B 에 비오틴이 부착된 올리고DNA(염기 25개)를 고정화 하는 제조법

도 7 은 그림 2에서 제조한 금 기질위에 형성된 아미노캘릭스아렌 자기조립 단분자층에 아미노 캘릭스아렌과 강한 수소결합이 가능한 비오틴(anchor로서 역할하는 분자단)이 결합된 올리고DNA (비오틴ylated 올리고DNA)를 수 ㎍/mL 의 농도로 아미노 캘릭스아렌 단분자층의 표면에 뿌렸을 때 자발적인 수소결합력에 의하여 올리고DNA가 표면에 잡히게 되고 또 DNA 분자들간의 상호작용에 의하여 분자들이 표면에 수직되게 배열되는 것을 그린 전략도이다. 또한, 이렇게 제조되어 표면에 고정된 올리고DNA 들은 그들의 상보적 DNA가 있는 용액에 노출되면 짝을 이루는 과정이 나타나 있다. 이 실험의 실제 결과들은 도 8 에 나타나 있다.

보다 구체적으로 기술하자면, 기질A에 염기서열이 비오틴-GATTACAGATTACAGATTACACACA등의 염기서열을 가진 올리고DNA 를 50㎍/mL 농도인 용액에 14-24 시간 혹은 5 시간동안 담구어두면 비오틴이 자발적으로 아미노캘릭스아렌의 고리에 수소결합에 의해 인식이 되면서 강하게 잡혀 고정화된 올리고DNA의 농도가 각각 다른 두가지의 기질이 제조된다. 이 두가지 기질중 14시간 이상 고정화 반응을 한 기질을 수정결정미시저울 (QCM)에 장착하고 여기에 비오틴이 달려있지 않은 상보적 올리고DNA 를 30㎍/mL의 농도로 가해주면 그림 4와 같이 약 60Hz 정도의 무게변화를 30분 내에 얻을수 있다. 이때 1Hz 의 주파수 (frequency)변화를 무게변화로 나타내면 약 4.425ng/cm²이므로 이를 이용하면 상보적인 올리고DNA가 265ng/cm²수준의 무게변화를 가져왔음을 알 수 있다. 아미노캘릭스아렌 자기조립단분자층인 기질A 에 직접 같은 농도의 상보적인 올리고DNA를 가한 경우에는 그림 5와 같이 무게변화가 전혀 나타나지 않음을 알 수 있다. 올리고DNA가 고정화된 기질A 에 상보적 올리고DNA가 부착된 양을 분자수로 따지면 0.0345 nmol/cm²이다. 아미노캘릭스아렌이 단분자층으로 고정화 되어있는 개수가 약 0.0975 nmol/cm²인 것으로 미루어 약 세 개의 아미노캘릭스아렌과 그들이 차지하는 면적이 한 개의 올리고DNA를 부착하는데 사용된다고 사료된다. 이는 직경이 약 1.8nm인 아미노 캘릭스아렌의 구조와 직경이 약 2.1nm인 올리고DNA의 직경차이를 이용하여 계산한 이론치와 같다. 본 결과로 미루어 기질A 에 고정화된 올리고DNA는 표면에 붙어있지 않고 서있을 것으로 사료되며 접근해 오는 상보적 올리고DNA와 대단히 빠르게 반응할 수 있게 배치되어 있다는 것을 알 수 있다. 기질B 도 같은 방법에 의해 비오틴이 부착된 올리고DNA가 고정화된다. 5시간동안 비오틴화 올리고DNA를 고정화 시킨 기질은 같은 농도의 상보적 올리고DNA를 이용한 실험에서 약 10분만에 30Hz의 진동수 변화를 보였고 더 오랜시간에서도 더 이상의 무게변화는 보이지 않았다. 이는 표면에 고정화된 올리고DNA의 양이 작으면 상보적 올리고DNA가 접근해서 짝을 이루기에는 빈공간이 많아서 좋다는 결과이다.

도 8 은 수정결정미시저울(quartz crystal microbalance, QCM)을 이용하여상보적 올리고DNA가 결합되는 과정을 실시간대에서 측정한 것이다. 이 실험에 사용한 기질은 금 기질을 사용하였고(QCM 측정을 위하여) 이를 티올기가 부착된 아미노캘릭스아렌 유도체가 1~2mM 농도로 있는 유기용매에 3시간 동안 넣은 뒤 씻어서 아미노캘릭스아렌 유도체의 자기조립 단분자층을 제조하고 이 단분자층을 비오틴이 부착된 올리고DNA 50 ㎍/mL 수용액에 12시간을 담구어 제조된 올리고DNA 한종류의 단분자층을 제조한 뒤 QCM에 장착하여 상보적 올리고DNA를 30 ㎍/mL 의 농도로 가했을 때 나타나는 무게변화를 실시간 대에서 측정한 것이다. 약 30분 정도에 60Hz 정도의 변화가 나타나는 것을 알 수 있다. 이 변화를 무게변화로 바꾸면 0.265 ㎍/cm2 정도로 상보적 DNA 가 붙었다는 것을 알 수 있다. 이 것은 0.033nmol/cm2 의 올리고DNA 가 부착된 것을 나타낸다. 즉 2x1013 개의 DNA 가 표면에 부착되어 있는 것으로 판명된다. 이 결과는 표면의 올리고DNA 1개당 1개의 상보적 DNA 가 붙었다고 가정한다면 Affymetrix 사에서 제조하는 DNA칩 보다 약 3배 정도의 높은 밀도를 가진 올리고DNA칩을 제조할수 있다는 결과라는 것을 알 수 있다. 도 9 는 올리고DNA 가 부착되지 않은 아미노캘릭스아렌의 단분자층에 직접 상보적 DNA를 가하면 표면에 올리고DNA 가 부착되어 있지 않기 때문에 아무런 무게변화도 나타나지 않는다는 것을 보여주는 실험결과이다. 도 9 에서는 도 8 의 실험에서 나타나는 무게의 변화가 실제로 표면에 부착된 DNA 와의 결합에 의한 무게변화라는 것을 나타내기 위하여 실시한 일종의 대조군 실험 (control experiment) 이다. 이 실험에서는 아미노캘릭스아렌 유도체의 단분자층에 상보적 DNA를 그림 4에서와 같은 양을 투입하고 나타나는 변화를 관찰하였다. 실험결과는 아미노캘릭스아렌 자기조립 단분자층만 있는 경우 상보적 DNA만으로는 표면에 부착되지 않는다는 사실을 무게변화가 전혀 감지되지 않음으로써 확인할수 있다.

실시예 7 [도 10 및 도 11]

기질A 와 기질B 에 비오틴이 부착된 올리고DNA (염기 25개) 의 고정화 및 상보적 올리고DNA와의 결합을 전기화학적인 방법으로 검증

도 10 및 도 11 은 금 기질에 아미노캘릭스아렌 유도체를 티올기를 이용하여 고정화한 기질A 와 이에 비오틴이 부착된 올리고DNA를 고정화 하고 이에 상보적 올리고DNA를 부착할 때 나타나는 전기화학적인 변화를 보여주고 있다.

도 10 는 금 기질과 아미노캘릭스아렌의 자기조립단분자층 또 이를 비오틴이 부착된 올리고DNA 용액에 14 시간 동안 두어 제조한 올리고DNA 단분자층 및 이에 상보적 DNA를 가했을 때 나타나는 변화를 전기화학적으로 실험한 결과이다. 이 실험결과에 따르면 아미노캘릭스아렌 자기조립단분자층이 제조된 후에 비오틴이 부착된 올리고DNA가 자기조립단분자층에 부착될 때 나타나는 변화가 대단히 커서 표면에 올리고DNA 가 상당량 붙어 있다는 것을 보여주고 있다. 표면에 올리고DNA가 조직적으로 붙어 있기 때문에 상보적 DNA용액에 20시간을 두어 DNA가 짝으로 부착되더라도 표면의 이중층 커페시턴스 (double-layer capacitance) 는 큰 감소폭을 보이지 않음을 알 수 있다.

도 11 은 도 10 과 같은 실험조건에서 제조된 기질을 0.3 mM의 페로센 카르복실산이라는 산화환원분자를 사용하여 표면에 접근성이 어느정도 차이가 나는가를 실험한 결과중 하나이다. 이 실험결과에서는 비오틴이 부착된 올리고DNA가 단분자층이 제조되더라도 표면에 산화환원분자가 접근하기에는 큰 문제가 없음을 알 수 있다. 이 결과는 DNA 단분자층이 생성되었을 때 DNA가 표면에 수직인 상태를 잘 유지하고 있음을 알 수 있다.

본 실험에서는 올리고DNA들의 농도는 정확히 실시예 6 에서 사용된 방법을 사용하였다. 다만, 비오틴화 올리고DNA를 기질A 에 14 시간동안 고정화 하였다. 이중층 커페시턴스 (double-layer capacitance) 실험은 각 단계당 커페시턴스가 빠르게 감소하는 것을 보여주므로 아미노캘릭스아렌 자기조립 단분자층에 비오틴화 올리고DNA가 잘 고정화되었음을 알 수 있다. 이때, 상보적 올리고DNA를 부착할때에는 20시간 정도 여유있는 시간동안 결합반응을 시켰는데 그 차이가 크지는 않음으로 보아 비오틴이 부착된 올리고DNA가 고정화될 때 대단히 조밀하게 고정화되었음을 말해준다. 도 11 에서는 산화환원분자인 페로센카르복실산을 이용하여 어느정도 조밀하게 고정화 되는지를 관찰한 결과이다. 이 결과에 미루어 올리고DNA단분자층이나 상보적 올리고DNA가 결합된 뒤에도 직경이 0.8 nm인 페로센 분자가 통과할수 있는 공간을 유지하고 있음을 알 수 있다. 이는 실시예 6의 이론치와 실험치에서도 예측되었고 접근해오는 상보적 올리고DNA가 결합(paring)하는데 필요한 공간을 비오틴화 올리고DNA가 부착된 기질이 유지하고 있음을 알 수 있고 또 기질이 표면에 평형되게 물리흡착되지 않았다는 것을 지지하는 결과이다.

이상 본 발명의 구성에 관하여 구체적으로 개시하였는바 그 근본적인 구성원리에 변환이 없는 한 본 발명의 범위를 벗어나지 않는다 할 것이다.

본 발명은 현재까지 전세계적으로 알려져 있는 방법과 차별화되며 더 쉽고 값싸게 올리고DNA칩을 제조할수 있는 신기술이다. 기존의 올리고DNA를 유리기판위에 올리는 방법은 포토마스크를 사용하여 특정 위치의 유리기판에만 염기가 붙을수 있게 광반응을 통하여 염기를 올리게 된다. 이 방식은 많은 종류의 올리고DNA를 유리 기판의 특정 위치에 붙일수 있는 반면에 칩 가격이 수백만원대에 이를만큼 비싼 시약과 복잡한 생산공정 때문에 제조단가를 줄이기가 힘들다. 또, DNA칩을 제조할때에 가장 문제가 되는 것이 올리고DNA가 표면의 특정위치에 고정될 때 분자들이 DNA 스트랜드가 표면에 끌려서 물리흡착되므로 실제로 칩의 역할을 제대로 수행할 수 없는 경우가 생긴다.

본 발명에서 제안하는 올리고DNA칩 제조법은 먼저 용액중에서 합성되고 정제된 올리고DNA에 강한 수소결합을 할 수 있는 앵커 (Anchor) 분자를 달아서 표면 고정화 될 때 앵커분자와 유리, 수정결정, 실리콘웨이퍼, 특정 작용기가 외부로 노출된 고분자 및 금기질등의 고체기질의 표면에 단분자막의 형태로 부착되어 있는 아미노캘릭스아렌 유도체간에 강한 수소결합력을 이용하여 앵커 분자가 초분자의 내부에 인식이 되면서 자연스럽게 올리고DNA가 표면에 고정화 하는 발명이다. 이 발명의 특징은 올리고DNA칩 제조시에 가장 문제가 되는 올리고DNA 사이에 엉김현상이나 표면에 물리흡착되어 누워버려서 접근해 오는 상보적 DNA와 결합을 하지 못하는 실험적 에러를 쉽게내어 DNA칩으로서의 역할을 하지 못하는 경우가 많다. 이 문제는 본 발명에서 단분자막 형태로 표면에 고정화 되어있는 아미노캘릭스아렌유도체들은 실시예 6에서 설명되어 있는 것처럼 DNA 사이의 간격을 인식위치를 적절히 배열하여 그 사이를 이상적인 거리로 유지시킬 수 있어 올리고DNA가 칩 위에 서 있어서 DNA칩의 역할을 완벽하게 발현하게 하는 칩을 개발한 것이다. 본 발명은 기존의 제조방식과 완전히 접근방법이 다르면서도 기존의 광반응에 의한 올리고DNA칩이 수백만원대의 고가의 칩만 생산하여야 제조원가를 맞출수 있는 기술인데 반해 본 발명은 정제된 저가의 올리고DNA를 표면에 강한 수소결합력에 의해 자발적으로 고정화되는 방식을 이용하여 수만원대의 저가의 효율적인 올리고DNA칩을 제공한다는 장점이 있다. 또, 단분자막의 형태로 고정된 아미노캘릭스아렌의 배열이 그 표면에 고정화 되는 올리고DNA의 최적배열을 가능하게해서 기존의 방식에 의해 제조된 칩보다 정확한 유전자 검색이 가능하고 에러율을 낮춘 칩 제조를 가능하게 하는 신기술이다. 본 발명에서 개발된 방법은 수개에서 수백개의 염기를 가진 올리고DNA칩의 자발적인 인식에 의한 고정화를 가능하게 하는 발명이다.

Claims

하기 화학식 1 의 아미노캘릭스아렌의 유도체:

[화학식 1]

{식 중, X= -O- , R₁= -H, R₂= -(CH₂)_nY (식 중, Y=-SH, -CHO, n=1~16 임), R₃= -페닐, -메틸로 정의함}.
하기 화학식 2 의 아미노캘릭스아렌의 유도체:

[화학식 2]

{식 중, X= -NH-, -NHC(O)-, -OC(O)-, R₁= -H, -CH₃, -(CH₂)nCH₃(식 중, n=1~5), R₂= -(CH₂)nCHO (식 중, n=1~16), -(CH₂)nCOOH (식 중, n=1~16), -(CH₂)m-Ar-(CH2)c-Y (식 중, Y=-SH, -CHO, -COOH, -NH₂, m=1~10, c=1~10), R₃= -H, -페닐, -방향족 (Aromatic) 유도체, -CnHm (식 중, n=1~10 탄화수소 m=2n, 2n+2) 으로 정의함}.
하기 화학식 3 의 아미노캘릭스아렌.

[화학식 3]
금 기질에 티올기가 부착된 아미노캘릭스아렌 유도체로 제조된 자기조립단분자층 고체기질.
유리, 실리콘웨이퍼, 수정결정등의 고체기질에 이민결합을 사용한 캘릭스아렌유도체의 단분자층 고체기질.
아민 작용기가 달린 고분자 기질에 이민결합을 사용한 아미노캘릭스아렌 유도체의 단분자층 고체기질.
제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 고체기질에 아미노캘릭스아렌의 단분자층을 이민 이외의 에스테르, 에테르, 아미드등의 공유결합을 이용하여 제조하는 아미노캘릭스아렌 유도체의 단분자층 고체기질.
제 4 항 내지 제 7 항에서 제조된 아미노캘릭스아렌 유도체의 단분자층에 비오틴이 부착되어있고 염기의 개수가 10-30 개인 올리고DNA 가 분자간 인력에 의해 자발적으로 고정화하는 칩.
제 4 항 내지 제 7 항에서 제조된 아미노캘릭스아렌 유도체의 단분자층에 비오틴이 부착되어있고 염기의 개수가 31-100 개인 올리고DNA 가 분자간 인력에 의해 자발적으로 고정화하는 칩.
제 4 항 내지 제 7 항에서 제조된 아미노캘릭스아렌 유도체의 단분자층에 비오틴이 부착되어 있고 염기의 개수가 100-200 개인 올리고DNA를 분자간 인력에 의해 자발적으로 고정화하는 칩.
제 8 항 내지 10 항에서 비오틴 대신 아미노캘릭스아렌에 수소결합이 가능한 우레아 (urea), 글리콜우릴 (glycoluril) 등의 작용기가 달린 올리고DNA를 분자간 인력에 의해 고정화하는 칩.
제 4 항 내지 제 7 항에서 제조된 아미노캘릭스아렌 유도체의 단분자층에 비오틴이 부착되어있고 염기의 개수가 10-30 개인 올리고DNA 가 분자간 인력에 의해 자발적으로 고정화하는 방법.
제 4 항 내지 제 7 항에서 제조된 아미노캘릭스아렌 유도체의 단분자층에 비오틴이 부착되어있고 염기의 개수가 31-100 개인 올리고DNA 가 분자간 인력에 의해 자발적으로 고정화하는 방법.
제 4 항 내지 제 7 항에서 제조된 아미노캘릭스아렌 유도체의 단분자층에 비오틴이 부착되어 있고 염기의 개수가 100-200 개인 올리고DNA를 분자간 인력에 의해 자발적으로 고정화하는 방법.
제 12 항 내지 14 항에서 비오틴 대신 아미노캘릭스아렌에 수소결합이 가능한 우레아 (urea), 글리콜우릴 (glycoluril) 등의 작용기가 달린 올리고DNA를 분자간 인력에 의해 고정화하는 방법.
제 12 항 내지 제 15 항의 방법을 이용하여 제 4 항 내지 제 7 항의 아미노캘릭스아렌 단분자층 1cm²의 정해진 공간 위에 올리고DNA가 1 종 내지 10000 종이 1 개 내지 10000 개가 부착된 올리고DNA칩.
제 12 항 내지 제 15 항의 방법을 이용하여 제 4 항 내지 제 7 항의 아미노캘릭스아렌 단분자층 1cm²의 정해진 공간위에 올리고DNA가 1 종 내지 100000 종이 10001 개 내지 100000 개가 부착된 올리고DNA칩.