KR100965244B1

KR100965244B1 - 리포솜을 이용한 바이오센서 또는 가스센서의 제조방법

Info

Publication number: KR100965244B1
Application number: KR1020070138373A
Authority: KR
Inventors: 최석정; 최병학
Original assignee: 강릉원주대학교산학협력단
Priority date: 2007-12-27
Filing date: 2007-12-27
Publication date: 2010-06-25
Also published as: KR20090070379A

Abstract

본 발명은 리포솜을 이용한 바이오센서 또는 가스센서의 제조방법에 관한 것으로, 자기조립단분자층에 수용체 고정용 작용기를 포함하는 지질단일층을 결합시킴으로써, 본 발명의 제조방법을 이용시 기존방법에 비해 간편하고 시간이 단축될 뿐만 아니라 수용체 고정에 있어서 효율 및 재현성이 높은 효과가 있다. 또한 여러 시약을 사용할 필요가 없고 간단하여 화학비전공자들도 쉽게 제조할 수 있으므로 매우 뛰어난 발명이라 할 것이다.

바이오센서, 가스센서, 리포솜, 자기조립단분자층, 지질층

Description

리포솜을 이용한 바이오센서 또는 가스센서의 제조방법{A preparation method of biosensor or gas-sensor using liposome}

본 발명은 리포솜을 이용한 바이오센서 또는 가스센서의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 수용체 고정에 필요한 작용기를 포함하는 지질로 이루어진 리포솜을 이용하여 간편한 방법으로 수용체 분자를 센서 칩 표면에 고정시키거나, 서로 다른 작용기를 갖는 지질로 센서 칩 표면을 코팅함으로써 기체상의 유기화합물을 검출하는 방법에 관한 것이다.

바이오센서 표면에 수용체 분자를 고정시키기 위해서 종래에 티올기(thiol group)를 포함하는 화합물로 자기조립 단분자층(self-assembled monolayer, SAM)을 만든 후 자기조립 단분자층 표면에 적절한 작용기를 도입하는 화학적인 방법이 가장 일반적으로 사용되고 있다.

수용체 분자에 있는 작용기들 가운데 아미노기(amino group)가 수용체 고정에 가장 많이 사용되고 있으며, 티올기가 사용되기도 한다. 항체를 고정시킬 때는 항체에 포함된 탄수화물을 부분적으로 산화시킴으로써 형성되는 알데하이드기(aldehyde group)를 이용하기도 한다.

종래의 기술을 살펴보면, 아미노기를 갖는 수용체를 고정시키기 위하여 11-머캅토-1-운데칸산 (11-mercapto-1-undecanoic acid, MUA)과 같은 화합물로 자기조립 단분자층을 만든 후, 상기 자기조립 단분자층 표면에 있는 카르복시기에 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 [N-ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide; EDC]와 N-하이드록시석신이미드 (N-hydroxysuccinimide; NHS)를 차례로 반응시켰다. 그 결과 카르복시기가 있던 자리에 NHS 기가 도입되어 여기에 아미노기를 갖는 수용체 분자를 반응시킬 수 있었다.

또한 수용체 분자가 티올기를 가지고 있을 경우에는, 11-아미노-1-운데칸티올 (11-amino-1-undecanethiol)과 같은 화합물로 자기조립 단분자층을 만들었다. 그리고 나서, 자기조립 단분자층 표면에 있는 아미노기에 N-[γ-말레이미도부티릴옥시]석신이미드 {N - [γ - Maleimidobutyrtloxy] succinimide; GMBS}를 반응시켜 아미노기가 있던 자리에 말레이미드(maleimide)기를 도입하였다. 그 결과 티올기를 갖는 수용체 분자를 반응시켜 수용체를 고정시킬 수 있었다.

한편, 항체를 고정시킬 때는 항체를 소듐 m-피리오데이트 (sodium m-periodate) (또는, 요오드산 나트륨)와 반응시켜 항체에 있는 탄수화물에 알데하이드기가 형성되도록 하였다. 센서 칩의 표면에는 아미노기를 고정시킬 때와 동일한 방법으로 NHS 기를 도입하고 카르보하이드라자이드(carbohydrazide)를 반응시켜 아자이드기(azide group)를 도입하였다. 여기에 알데하이드기를 포함하는 항체를 반 응시키면 시프 염기(Schiff's base)가 형성되는데 이를 다시 시아노보로하이드라이드 (cyanoborohydride)로 반응시켜 결합을 안정화시켰다.

이처럼 종래 방식대로 하이드라자이드(hydrize) 작용기를 이용하여 항체를 고정시킬 경우 SAM이 형성된 센서칩에서부터 시작하면 EDC/NHS 반응,카보하이드라자이드(carbohydrazide) 반응, 에탄올아민(ethanolamine) 반응, 항체 고정 반응, 시아노보로하이드라이드 반응의 5단계를 거쳐야 하며 총 시간은 약 5시간이 소요된다.

이와 같이 종래의 기술인 화학적인 반응을 통해 적절한 작용기를 도입하는 방법은 화학을 전공하지 않은 사용자들에게는 매우 어려운 과정이 될 수 있다. 또한 여러 단계의 화학반응이 필요한 경우에는 반응의 수득률이 낮아 수용체 고정 효율이 낮아질 수도 있고 실험을 반복할 때 동일한 결과를 얻기 어렵게 하는 원인이 된다.

화학적인 고정 방법의 이와 같은 단점들을 해결하기 위해 종래에 아비딘(avidin) 단백질을 고정시킨 센서 칩을 사용하기도 하였다. 아비딘은 바이오틴(biotin)과 강하게 그리고 선택적으로 결합하는 특성이 있는데 수용체 분자에 바이오틴을 화학적으로 결합시키는 것은 비교적 간단할 뿐만 아니라, 항체의 경우에는 미리 바이오틴을 결합시켜놓은 항체를 구입할 수도 있다.

따라서 바이오틴을 결합시킨 수용체를 아비딘이 고정된 센서 칩에 더해주면 빠른 시간에 간단하게 수용체를 고정시킬 수 있었다. 그러나 아비딘은 비교적 쉽게 변성되기 때문에 아비딘을 포함하는 센서 칩은 보관이 어렵고 가격이 매우 비싸다는 단 점이 있었다.

이러한 종래 기술들의 단점을 극복하고자 본 발명자는 리포솜을 응용하게 되었다. 도 1에 도시한 바와 같이, 지질은 극성 머리 부분과 비극성 꼬리 부분으로 이루어져 있으며, 극성 머리에 두 개의 비극성 꼬리를 갖는 구조로 나타낼 수 있다. 이와 같은 지질의 구조적 특성으로 인하여 지질이 수용액 환경에 놓이게 되면 소수성 꼬리를 내부로 감추기 위해, 도 2에 도시한 바와 같이, 지질 두겹층(lipid bilayer)을 형성하게 되는데, 결과적으로 리포솜(liposome)이 만들어지게 된다.

옥타데칸티올(octadecanethiol)로 만들어진 자기조립 단분자층은 소수성표면을 가지고 있으며, 지질 두겹층(lipid bilayer)을 형성하고 있는 리포솜을 이에 반응시키면 도 3에 도시한 바와 같이, 리포솜 내의 지질의 소수성 꼬리가 소수성 표면과 접촉하며 지질 한겹층(monolayer)을 형성할 수 있다. 이러한 지질 중에 수용체를 고정할 수 있는 작용기를 가진 지질을 혼합하면 효과적으로 수용체 고정 바이오센서를 제작할 수 있는 것이다.

본 발명자는 이에 대한 노력을 거듭한 결과 수용체 고정용 작용기를 포함하는 지질을 바탕지질과 섞어 리포솜으로 제조하여 SAM과 결합시킴으로써 간편하게 수용체 고정용 작용기를 도입하는 본 발명에 이르게 되었다. 또한 이 발명은 다음과 같이 가스 센서의 제작에도 응용될 수 있다.

기존의 가스 센서는 주로 금속산화물에 기체가 흡착되는 성질을 이용한 것이다. 그러나 금속 산화물은 다양한 표면을 제공하지 못하기 때문에 휘발성 유기화합물과 같이 다양한 기체를 구별하는 것이 어렵다. 따라서 가스 센서 표면의 다양성 을 높이기 위해 센서 표면을 고분자 (McGil, 2000, Sensors and Actuators B, vol.65. p5-9; Seyama, 2005, Analytical Chemistry, vol.77, p4228-4234), 작용기를 추가한 티올 화합물 (Pasquinet, 2004, Journal of Colloid and Interface Science, vol.272, p21-27), 이온성 액체(ionic liquid)(Jin, 2006, Analytical Chemistry, vol.78, p6980-6989) 등으로 코팅하는 연구들이 진행되어 왔으나 만족할만한 효과를 달성하지는 못하였다.

이에 본 발명자들은 바이오센서의 연구 결과를 응용하여 다양한 휘발성 유기화합물을 구별할 수 있는 가스센서를 제조하는 본 발명에 이르게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 바이오센서 표면에 적절한 작용기를 도입하는 데 있어 여러 단계의 화학적인 반응을 거치지 않고 간단하게 수용체를 고정시키는 바이오센서 제조방법을 제공하고, 또한 이를 응용하여 다양한 휘발성 유기화합물을 선택적으로 검출할 수 있는 가스센서의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 목적은 수용체 고정용 작용기를 포함한 지질을 포함한 리포솜을 제조하고 이를 바이오센서의 SAM에 결합시킨 간단한 바이오센서의 제조방법을 확립하고, 이에 따라 제조된 센서의 적용여부를 확인함으로써 달성하였다.

본 발명은 수정미소저울에 연결된 센서칩의 표면에 티올기(thiol group)를 포함하는 탄화수소 화합물을 가하여 자기조립 단분자층(self-assembled monolayer)을 코팅하는 단계; 바탕지질 및 수용체 고정용 작용기를 포함하는 물질로 구성되는 리포솜을 제조하는 단계 및 상기 제조된 리포솜을 자기조립 단분자층으로 코팅된 센서칩에 반응시켜 자기조립 단분자층 위에 재코팅하는 단계로 구성되어 수용체가 고정된 바이오센서의 제조방법을 제공함을 특징으로 한다.

본 발명에서 상기 수용체 고정용 작용기를 가지는 물질은 수용체 고정용 작용기를 포함하는 지질 및 탄화수소 화합물로 구성되는 군 중 어느 하나인 것이 바람직하다.

본 발명을 응용하여 바람직하게는 리포솜을 MBP-PE 지질 및 바탕지질을 혼합하여 제조하여 티올기를 갖는 수용체가 고정된 바이오센서를 제조할 수 있으며 팔미틱 히드라자이드(palmitic hydrizide) 탄화수소화합물 및 바탕지질을 혼합하여 리포솜을 제조함으로써 알데하이드기를 갖는 수용체가 고정된 바이오센서를 제조할 수도 있다. 또한 상기 리포솜을 biotin-PE 지질및 바탕지질로 구성하면 아비딘 단백질이 고정된 바이오센서를 제조할 수 있다.

본 발명 중 리포솜을 제조시 바람직하게는 바탕지질 및 수용체 고정용 작용기를 포함하는 물질을 한 개의 바이알(vial)에 한 개의 센서칩을 코팅할 수 있는 양만큼 필름형태로 말려서 보관하고 이를 이용하여 리포솜을 제조할 수 있다.

본 발명 중 바탕지질은 실험조건보다 상전이온도가 높은 것을 사용하는 것이 바람직하며, 그 예로 상전이온도가 41℃인 디파밀토일 포스파타딜 콜린(dipamitoyl phosphatadyl cholin;DPPC)을 사용할 수 있다.

본 발명은 상기의 방법으로 제조되어 센서칩, 자기조립단분자층 및 작용기를 포함하는 지질단일층으로 구성되는 수용체 고정 바이오센서를 제공함을 특징으로 한다.

한편, 본 발명은 상기와 동일한 방법으로 유기화합물을 반응 및 검출할 수 있는 가스센서의 제조방법을 제공함을 특징으로 한다.

또한 상기의 방법에 의하여 제조되어 센서칩, 자기조립단분자층 및 작용기를 포함하는 지질단일층으로 구성되는 가스센서를 제공함을 특징으로 한다.

본 발명은 리포솜을 이용한 바이오센서 또는 가스센서의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명의 제조방법을 이용시 기존방법에 비해 간편하고 시간이 단축될 뿐만 아니라 수용체 고정에 있어서 효율 및 재현성이 높은 효과가 있다. 또한 여러 시약을 사용할 필요가 없고 간단하여 화학비전공자들도 쉽게 제조할 수 있으므로 매우 뛰어난 발명이라 할 것이다.

이하, 본 발명이 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 바이오센서는 자기조립 단분자층 형성 단계, 리포솜 제조 단계, 제조된 리포솜을 자기조립단분자층 위에 결합시키는 단계로 구성된다. 이하 실시예에서는 티올기를 갖는 바이오센서, 알데하이드기를 갖는 바이오센서, 아비딘 단백질을 갖는 바이오센서 및 이를 응용한 가스센서에 대하여 상세히 설명하기로 한다. 이들의 구조식은 도 4에 나타내었다.

실시예 1 : 티올기를 갖는 수용체가 고정된 바이오센서의 제조

바이오센서용 측정기 준비

수정미소저울 (quartz crystal microbalance, QCM)은 일본 크리스탈 썬라이 프(crystal sunlife)사에서 구입하였다. 사각형인 수정미소저울 크기는 8× 8mm이고 원형인 금 전극의 직경은 5mm이며 수정미소저울의 고유진동수는 약 10MHz이다. 수정미소저울의 진동수는 질량 증가에 비례하여 감소하기 때문에 수정미소저울 표면에 분석 대상 물질이 결합할 수 있는 수용체가 고정되어 있으면 분석 대상물질이 결합함에 따라 주파수가 변하는 원리를 이용하여 바이오센서로 사용될 수 있다. 수정미소저울 바이오센서 시스템은 본 연구실에서 제작되었으며 수정미소저울을 장착하는 cell, 수정미소저울에 전기를 공급하고 수정미소저울의 진동정보를 주파수 측정기로 보내주는 oscillator 회로, 용매를 이송하는 syringe pump (KDS, Holliston, USA), 시료를 주입하는 주입밸브(injection valve, Upchurch, Oak Harbor, USA), 주파수 측정기(Dagatron, 한국), 그리고 컴퓨터 등으로 구성되어있다. 본 발명에서는 수정미소저울 전극 위에 용액을 더할 수 있는 우물을 가지고 있는 batch cell과 용액이 tubing을 통해 흘러가며 수정미소저울 전극과 접촉하도록 되어있는 flow cell을 함께 사용하였다. 먼저 batch cell에서 검출 물질과 특이적 결합을 하는 수용체 단백질을 고정시킨 다음 flow cell로 교체하여 완충용액을 펌프를 통해 주입하고 검출하고자 하는 시료는 주입밸브(injection valve)를 통해 주입한다. 분석물질이 flow cell에 장착된 crystal의 표면을 통과하면서 항체에 결합하면 질량이 변하여 진동 주파수에 변화가 일어나게 되고 주파수 측정기에서 이 진동수를 측정하여 컴퓨터로 보냄으로써 데이터를 분석할 수 있도록 하였다.

자기조립단분자층 ( SAM ) 형성

수정미소저울의 전극 표면을 세척하기 위해 수정미소저울을 1분 동안 60℃ piranha solution (H₂SO₄:H₂O₂= 7:3)에 담근 후 증류수와 에탄올로 헹구고 질소가스로 건조시켰다. 다음으로 1-옥타데칸티올(1-octadecanethiol , Sigma-Aldrich, USA)을 에탄올에 2mM로 녹인 용액에 수정미소저울을 넣고 12∼15시간 동안 교반하여 전극 표면에 자기조립 단분자층 (self-assembled monolayer, SAM)이 형성되도록 하였다. SAM이 형성된 센서 칩을 꺼내서 에탄올로 헹구고 질소가스로 건조시킨 후 cell에 장착하였다.

이와 같이 옥타데칸티올(octadecanethiol)과 같은 티올기 (thiol group)를 포함하는 탄화수소 화합물, 즉 알칸티올 분자를 더해주면 황 원자가 금속 표면에 화학흡착을 하고 소수성 탄화수소 사슬 사이에 인력이 작용하여, 도 5에 도시한 바와 같이, 자기조립 단분자층(self-assembled monolayer, SAM)이 만들어진다.

리포솜 제조

상기 SAM과 결합시킬 리포솜을 제조하였다. 리포솜 제조시, 수용체 고정에 필요한 작용기를 포함하는 지질을 바탕지질 (background lipid)과 섞어 만들면, 센서 칩 표면에 수용체를 고정할 수 있는 작용기를 쉽게 도입할 수 있다. 이 경우 바탕지질로 상전이온도(phase transition temperature)가 실험조건보다 높은 지질을 사용함으로써, 보다 딱딱한 지질 단일층을 만들 수 있다. 수정미소저울(quartz crystal microbalance, QCM)과 같이 표면의 점탄성이 중요한 경우에는 이와 같이 딱딱한 표면을 만드는 것이 유리하다. 대부분의 실험 조건에서는 상전이온도가 41℃인 디파미토일 포스파타딜 콜린(dipamitoyl phosphatadyl cholin;DPPC)을 바탕지질로 사용하는 것이 바람직하다.

본 실시에서는 디팔미토일 포스파티딜콜린(dipalmitoyl phosphatidyl cholin;DPPC)과 1,2-Dipalmitoyl-sn-Glycero-Phosphoethanolamine-N-[4-(p-maleimidophenyl)butyramide (MBP-PE)의 두 가지 지질을 혼합하여 리포솜을 만들었다. 여기에서 DPPC는 리포솜을 형성하는 바탕지질로 사용되었고 MBP-PE는 이 리포솜에 말레이미드(maleimide) 기가 나타나도록 하기 위해 사용되었다. 클로로포름: 메탄올(1:2) 용매를 이용하여 1,2-Dipalmitoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine (DPPC) 용액을 12mg/mL 농도로 만들었다. 1,2-Dioleoyl-sn-(Glycero-3-Phosphoethanolamine-N-[4-(p-maleimidophenyl)butyramide] (MBP-PE)를 클로로포름에 8.2mg/ml 농도로 녹였다. DPPC용액 200μL에 MBP-PE 용액 200μL를 섞어 그 가운데 40μL를 유리 바이알 바닥에 고르게 펼쳤다. 질소가스를 부드럽게 불어넣으며 지질 용액을 말려 필름이 형성되도록 하였다. 바로 사용하지 않는 바이알은 질소 기체로 채운 후 -20℃ 또는 -70℃의 저온에 보관하였다.

이와 같이 한 개의 센서칩에 수용체를 고정할 수 있는 분량의 리포솜을 만들 수 있도록 지질을 필름 형태로 미리 말려놓은 바이알을 제공함으로써 사용자가 매우 간편하게 수용체를 고정할 수 있게 된다. 바이알 형태가 아닌 리포솜을 미리 만들어 제공하는 경우 사용이 더 편리하긴 하지만 장기관 보관이 어려워지는 단점이 있으므로 상기와 같이 지질을 필름형태로 미리 말려서 저온에 보관할 경우 장기간 보관이 가능해진다.

지질필름 바이알에 pH를 7.0으로 맞춘 0.1M 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) 완충용액 120μL를 더하고 부드럽게 펼쳐준다. 질소가스로 충전한 후 위를 막고 초음파를 가하여 small unilamella vesicle (SUV)가 되게 한다.

초음파를 가하는 방법은 두 가지를 사용할 수 있다. 첫 번째 방법으로는 물의 온도를 50-60℃ 정도로 맞춘 초음파 세척기에 바이알을 한 시간 정도 띄워놓는다. 두 번째 방법으로는 500mL 비커에 물을 3분의 2정도 채우고 바이알을 띄워놓은 상태에서 초음파 균질기 (ultrasonic homogenizer)로 20분 정도 초음파를 가한다. SUV가 되는 것은 불투명한 흰색이 약간 뿌연 맑은 색으로 바뀌는 것을 통해 알 수 있다. 지질필름 바이알에 완충용액을 넣어주면 처음에는 지질이 여러 층으로 겹쳐있는 multilamella vesicle (MLV)이 형성되어 불투명한 흰색을 띠게 된다. 여기에 초음파 에너지를 가하면 지질 분자들 사이의 인력이 파괴되어 재배치가 일어나면서 평형에 도달하게 된다. 그 결과 작은 크기의 리포솜인 small unilamella vesicle (SUV)이 형성되어 약간 뿌연 투명한 색을 띠게 된다.

상기 리포솜과 자기조립단분자층의 결합

옥타데칸티올(octadecanethiol)로 만들어진 자기조립 단분자층은 소수성표면을 가지고 있으며, 지질 두겹층(lipid bilayer)을 형성하고 있는 리포솜을 이에 반응시키면 도 6에 도시한 바와 같이, 리포솜 내의 지질의 소수성 꼬리가 소수성 표 면과 접촉하며 지질 한겹층(monolayer)을 형성할 수 있다. 또한 리포솜 제조시, 수용체 고정에 필요한 작용기를 포함하는 지질을 바탕지질 (background lipid)과 섞어 만들면, 도 7에 도시한 바와 같이 센서 칩 표면에 수용체를 고정할 수 있는 작용기를 쉽게 도입할 수 있다. 이를 응용하여 상기 제조된 리포솜을 자기조립단분자층이 형성되어 있는 센서칩과 다음과 같은 방법으로 반응시켰다. 1-옥타데칸티올로 SAM을 형성한 QCM을 batch cell에 장착하였다. 1-옥타데칸티올로 형성된 SAM의 소수성 표면에는 불순물이 잘 붙기 때문에 먼저 40 mM 옥틸 글루코시드(octyl glucoside) 100μL로 3회 씻은 후 바로 이어 즉시 리포솜 용액 100μL를 넣고 50℃에 1시간 30분 동안 놓아두었다. 상기 batch cell을 주파수 측정기에 연결하고 리포솜 용액을 제거한 후 0.1M 수산화나트륨(NaOH)을 100μL 넣고 30초 동안 놓아두었다. 그리고 나서 인산완충식염수(phosphate buffered saline, PBS)으로 3회 세척하였다. 이렇게 제조된 티올기 수용체 고정용 바이오센서의 수용체 고정여부를 확인하였다.

티올기를 갖는 수용체의 고정여부 확인

펩티드에는 시스테인 잔기를 추가함으로써 간단하게 티올기를 도입할 수 있다. 단백질의 경우에는 Traut's reagent (2-iminothiolane-HCl)와 반응시킴으로써 티올기를 도입할 수 있다. 항체에 Traut's reagent로 티올기를 도입한 후 50μg/mL 농도의 항체를 100μL 가하고 1시간 동안 반응시켰다. 그 후 항체 용액을 제거하고 PBS로 3회 세척하였다. 50μg/mL 농도의 bovine serum albumin (BSA)를 100μL 가 하고 30분 동안 반응시킨다. 이와 같은 방법으로 수정미소저울에 티올기를 포함하는 항체 (anti-goat IgG antibody)를 고정시킨 후 서로 다른 농도의 항원 (goat IgG)을 차례로 주입한 결과 도 8과 같이 농도에 비례하는 주파수 변화가 관찰되었다. 이 때 한 농도의 항원을 주입하여 주파수 변화를 관찰한 후에는 Dissociation solution (0.2M Glycine-HCl, pH2.3 + 1% DMSO)을 주입하여 결합한 항원을 완전히 제거한 후 다음 농도의 항원을 주입하였다. 이와 같이 수정미소저울이 농도에 비례하여 주파수가 변할 뿐만 아니라 반복 사용이 가능한 것은 곧 수용체인 항체가 화학결합을 통해 안정하게 고정되었다는 것을 의미한다.

실시예 2 : 알데하이드기를 갖는 산화된 항체가 고정된 바이오센서의 제조

자기조립단분자층(SAM) 형성

자기조립단분자층의 형성은 실시예 1과 같은 방법으로 수행하였다.

리포솜 제조

리포솜의 제조는 MBP-PE 용액 대신 클로로포름에 녹인 2.16mg/mL 의 팔미틱 히드라자이드(palmitic hydrazide)를 사용한 것 외에는 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였다. 팔미틱 히드라자이드는 지질은 아니지만 긴 소수성 사슬을 가지고 있어 지질들 사이에 삽입될 수 있다. 또한 상기와 같이 지질이 아닌 동일한 작용기를 갖는 긴 사슬 탄화수소를 사용함으로써 동일한 결과를 얻을 수 있고 일반적으로 지질보다는 긴 사슬 탄화수소가 합성이 십고, 안정하며, 가격이 저렴하기 때문에 더 경제적이다. 상기 반응으로 DPPC와 팔미틱 히드라자이드 리포솜을 생성할 수 있었다.

상기 리포솜과 자기조립단분자층의 결합

실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였다. 팔미틱 히드라자이드가 혼합된 리포솜으로 결합시킨 제조된 바이오센서는 도 9에 도식화하였다.

알데하이드기를 갖는 수용체의 고정여부 확인

센서칩 금속표면에 자기조립단분자층이 형성되고, 이 위에 리포솜 지질 한겹층을 결합시킨 후 QCM 표면을 pH가 5.5인 100mM sodium acetate 완충용액으로 3회 씻은 후 소듐 m-피리오데이트로 산화시킨 항체를 더하여 1시간 동안 반응 시켰다. 마지막으로 초순수로 3회 씻은 후 이중결합의 환원을 위해 0.1M 시아노보로하이드라이드(cyanoborohydride) 100μL를 가하고 1시간 동안 반응시켜 알데하이드기를 갖는 수용체의 고정을 안정화시켰다. 이와 같은 방법으로 수정미소저울에 산화시켜 알데하이드기를 도입한 항체 (anti-goat IgG antibody)를 고정시킨 후 서로 다른 농도의 항원 (goat IgG)을 차례로 주입한 결과 도 10과 같이 농도에 비례하는 주파수 변화가 관찰되었다. 이 때 한 농도의 항원을 주입하여 주파수 변화를 관찰한 후에는 Dissociation solution (0.2M Glycine-HCl, pH2.3 + 1% DMSO)을 주입하여 결합한 항원을 완전히 제거한 후 다음 농도의 항원을 주입하였다. 이와 같이 수정미소저울이 농도에 비례하여 주파수가 변할 뿐만 아니라 반복 사용이 가능한 것은 곧 수용체인 항체가 화학결합을 통해 안정하게 고정되었다는 것을 의미한다.

본 실시예를 통하여 기존의 방법이 약 5시간이 소요되는 반면에 본 발명은 지질 한겹층 형성과정, 항체 고정반응, 시아노보로하이드라이드 반응의 3단계 과정으로 약 2시간 30분이 소요되어 시간을 크게 단축할 수 있다. 뿐만 아니라 기존의 방법에서는 항체를 고정하기까지 4단계의 반응이 필요한데 비해 우리가 고안한 방법은 단 한 단계 반응만 필요하기 때문에 고정 효율이나 재현성이 더 높아질 수 있다. 또한 여러 종류의 시약을 사용할 필요가 없어 화학에 익숙하지 않은 사용자들이 쉽게 접근할 수 있다.

실시예 3 : 아비딘 단백질이 고정된 바이오센서의 제조

자기조립단분자층 ( SAM ) 형성

자기조립단분자층의 형성은 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였다..

리포솜 제조

리포솜의 제조는 MBP-PE 용액 대신 클로로포름에 녹인 0.5㎎/㎖ 바이오틴-PE (biotin-PE; 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-phosphatidylethanolamine -n-Biotinyl)를 사용한 것 외에는 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였다.

상기 리포솜과 자기조립단분자층의 결합

실시 예 1과 동일한 방법으로 수행하였다.

아비딘 고정 여부 확인

센서칩 금속표면에 자기조립단분자층이 형성되고, 이 위에 리포솜 지질 한겹층을 결합시킨 후 50μg/mL 아비딘 단백질 용액을 더하여 10분 동안 반응시켰다. 이와 같은 방법으로 수정미소저울에 아비딘을 고정시킨 후 그 아비딘에 다시 바이오틴을 결합시킨 항체 (anti-rabbit IgG antibody)를 더해주었다. 아비딘 단백질에는 4개의 바이오틴이 결합할 수 있기 때문에 수정미소저울 표면의 바이오틴에 결합한 아비딘은 다시 항체에 결합된 바이오틴과 결합함으로써 항체를 수정미소저울 표면에 고정시킬 수 있다. 이렇게 항체가 고정된 수정미소저울에 서로 다른 농도의 항원 (rabbit IgG)을 차례로 주입한 결과 도 11과 같이 농도에 비례하는 주파수 변화가 관찰되었다. 이 때 한 농도의 항원을 주입하여 주파수 변화를 관찰한 후에는 Dissociation solution (0.2M Glycine-HCl, pH2.3 + 1% DMSO)을 주입하여 결합한 항원을 완전히 제거한 후 다음 농도의 항원을 주입하였다. 이와 같이 수정미소저울이 농도에 비례하여 주파수가 변할 뿐만 아니라 반복 사용이 가능한 것은 곧 수용체인 아비딘이 화학결합을 통해 안정하게 고정되었다는 것을 의미한다.

실시예 4 : 가스센서의 제조

자기조립단분자층 ( SAM ) 형성

자기조립단분자층의 형성은 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였다.

리포솜 제조

DPPC를 바탕지질로 한 4종류의 가스센서용 리포솜을 제조하였다. 한 종류는 바탕지질만으로 리포솜을 만들었고 나머지 세 종류는 바탕지질에 biotin-PE, MBP-PE, 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (NBD-PE)를 각각 24:1의 질량비로 섞어 만들었다. 리포솜을 만드는 방법은 실시예 1과 동일하게 수행하였다.

상기 리포솜과 자기조립단분자층의 결합

실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였다.

e- nose 의 제조

상기 방법으로 제조된 다양한 작용기를 갖는 센서들을 어레이로 배열하여 e-nose를 제조하였다.

본 실시예에서 수행한 방법 외에도 당업자의 관점에서 1개의 가스센서만 이용할 수도 있으며, 또 다른 여러 센서들을 배열하여 다양한 화합물을 분석하기 위한 e-nose를 제조할 수도 있다. 여러 개의 가스센서는 서로 다른 유기 화합물에 대해 서로 다른 패턴으로 반응하기 때문에 이러한 패턴을 분석함으로써 유기화합물의 종류를 파악할 수 있게 된다. 도 12 내지 도 14에 각각의 가스센서에 대하여 나타내었다.

본 실험에서는 4개의 수정미소저울을 DPPC, 바이오틴-PE, MBP-PE 및 NBD- PE[1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)] 4가지 지질로 각각 코팅하여 네 종류의 가스센서를 제조하고, 기체 상태의 유기화합물에 대한 반응을 측정하였다. 그 결과 도 15에 도시한 바와 같이, 가스의 종류에 따라 서로 다르게 반응하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 5 : 바탕지질에 따른 센서의 효율 검토

바탕지질에 따른 센서의 효율을 검토하기 위하여, 바탕지질을 달리하여 바이오센서를 제조하였다. 바탕지질은 실온에서 액체 상태로 존재하는 지질인 포스파티딜 콜린(phosphatidyl cholin)과 콜레스테롤의 혼합 지질(PC-CH) 및 실온에서 고체 상태인 DPPC 2종을 비교하였다.

각 바탕지질에 바이오틴-PE를 섞어 리포솜을 만들고 그 리포솜을 이용하여 옥타데칸티올의 자기조립 단일층 위에 지질 한겹층을 만들었다. 여기에 아비딘 단백질을 결합시키고, 그 아비딘에 다시 바이오틴이 결합된 토끼 면역글로불린 G에 대한 항체(anti-rabbit IgG antibody)를 결합시켰다. 여기에 서로 다른 농도의 토끼 면역글로불린 G를 주입하면서 주파수 변화를 측정하였다.

그 결과 도 16에 도시한 바와 같이, PC-CH를 바탕지질로 사용하는 것에 비해 DPPC를 사용하였을 때 반응성이 거의 두 배 증가하였다. 뿐만 아니라, 도 17에 도시한 바와 같이, 동일한 농도의 시료를 주입하고 결합한 시료를 산성 완충용액으로 해리시키는 과정을 반복하는 실험에서도 거의 일정한 값을 얻을 수 있어 매우 안정한 표면을 형성하고 있음을 알 수 있었다.

도 1은 지질(lipid)의 구조를 도식화한 것이다.

도 2는 지질 두겹층 (lipid bilayer)과 리포솜 (liposome)의 구조를 도식화한 것이다.

도 3은 소수성 표면에 지질 한겹층 (lipid monolayer)이 형성된 구조를 도식화한 것이다.

도 4는 각 용도에 사용할 수 있는 몇 가지 지질 또는 탄화수소 구조를 나타낸 것이다.

도 5는 센서의 금속 표면에 알칸티올 (alkane thiol) 화합물을 더해줄 때 형성되는 자기조립 단분자층 (self-assembled monolayer) 구조를 도식화한 것이다.

도 6는 센서 표면의 소수성 자기조립 단분자층 위에 리포솜을 더해줄 때 형성되는 지질 한겹층 구조를 도식화한 것이다.

도 7은 바탕지질에 수용체 고정에 필요한 작용기를 갖는 지질을 섞어 리포솜을 만들고 그 리포솜을 소수성 자기조립 단분자층 위에 더해줄 때 형성되는 지질 한겹층 구조를 도식화한 것이다.

도 8은 티올기를 갖는 항체가 고정된 바이오센서에 항원을 주입하여 발생하는 주파수 변화를 나타낸 그래프이다.

도 9는 바탕지질에 수용체 고정에 필요한 작용기를 갖는 긴 사슬 탄화수소를 섞어 리포솜을 만들고 그 리포솜을 소수성 자기조립 단분자층 위에 더해줄 때 형성되는 지질 한겹층 구조를 도식화한 것이다.

도 10은 알데하이드기를 갖는 항체가 고정된 바이오센서에 항원을 주입하여 발생하는 주파수 변화를 나타낸 그래프이다.

도 11은 항체가 고정된 수정미소저울에 항원(rabbit IgG)을 주입한 결과 나타난 주파수 변화를 나타낸 그래프이다.

도 12는 특정 작용기를 갖는 지질로만 구성된 리포솜을 이용하여 코팅한 가스 센서 표면 구조를 나타낸 것이다.

도 13은 특정 작용기를 갖는 지질을 바탕지질과 섞어 리포솜을 만든 후 그 리포솜을 이용하여 코팅한 가스 센서 표면 구조를 나타낸 것이다.

도 14는 특정 작용기를 갖는 긴 사슬 탄화수소 화합물을 바탕지질과 섞어 리포솜을 만든 후 그 리포솜을 이용하여 코팅한 가스 센서 표면 구조를 나타낸 것이다.

도 15는 DPPC, biotin-PE, MBP-PE, NBD-PE의 네 가지 지질로 각각 코팅하여 만든 네 종류의 가스 센서의 기체 상태의 유기 화합물에 대한 반응 비교를 나타낸 그래프이다.

도 16은 포스파티딜 콜린(phosphatidyl cholin)과 콜레스테롤의 혼합 지질(PC-CH)을 바탕지질로 사용했을 때와 DPPC를 바탕지질로 사용했을 때 반응성 비교를 나타낸 그래프이다.

도 17은 포스파티딜 콜린(phosphatidyl cholin)과 콜레스테롤의 혼합 지질(PC-CH)을 바탕지질로 사용했을 때와 DPPC를 바탕지질로 사용했을 때 반응성 비교를 나타낸 그래프이다.

Claims

수정미소저울 표면에 수용체를 고정시켜 수정미소저울 바이오센서를 제조하는 방법에 있어서,

상기 수정미소저울 표면에 티올기(thiol group)를 포함하는 탄화수소 화합물을 가하여 자기조립 단분자층(self-assembled monolayer)을 코팅하는 단계;

바탕지질과 수용체 고정용 작용기를 포함하는 물질로 구성되는 리포솜을 제조하는 단계; 및

상기 제조된 리포솜을 자기조립 단분자층으로 코팅된 수정미소저울 표면에 반응시켜 자기조립 단분자층 위에 재코팅하는 단계;

로 구성된, 표면에 수용체를 고정시킨 수정미소저울 바이오센서의 제조방법.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 리포솜 제조에 이용되는 수용체 고정용 작용기를 포함하는 물질로 MBP-PE 지질이 사용되어 수정미소저울 표면에 티올기를 갖는 수용체를 고정시킨 것을 특징으로 하는 수정미소저울 바이오센서의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 리포솜 제조에 이용되는 수용체 고정용 작용기를 포함하는 물질로 팔미틱 히드라자이드(palmitic hydrizide)가 사용되어 수정미소저울 표면에 알데하이드기를 갖는 수용체를 고정시킨 것을 특징으로 하는 수정미소저울 바이오센서의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 리포솜 제조에 이용되는 수용체 고정용 작용기를 포함하는 물질로 biotin-PE 지질이 사용되어 수정미소저울 표면에 아비딘 단백질을 고정시킨 것을 특징으로 하는 수정미소저울 바이오센서의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 바탕지질과 수용체 고정용 작용기를 포함하는 물질로 제조된 리포솜이 한 개의 바이알(vial)에 한 개의 수정미소저울을 코팅할 수 있는 양만큼 필름형태로 말려서 보관하여 사용되는 것을 특징으로 하는 수정미소저울 바이오센서의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 리포솜 제조에 이용되는 바탕지질이 DPPC인 것을 특징으로 하는 수정미소저울 바이오센서의 제조방법.
제 1항의 방법에 따라 수정미소저울, 자기조립단분자층 및 수용체 고정용 작용기를 포함하는 물질이 순서대로 코팅되어 이루어진 표면에 수용체를 고정시킨 수정미소저울 바이오센서.
제 8항에 따른 수정미소저울 바이오센서를 하나 이상 어레이로 배열하여 e-nose로 사용하는 것을 특징으로 하는 가스 센서.
삭제