KR101365676B1

KR101365676B1 - 지질을 이용한 고체 표면의 기능화 방법

Info

Publication number: KR101365676B1
Application number: KR1020120020333A
Authority: KR
Inventors: 최석정
Original assignee: 강릉원주대학교산학협력단
Priority date: 2012-02-28
Filing date: 2012-02-28
Publication date: 2014-02-21
Anticipated expiration: 2032-02-28
Also published as: KR20130098647A

Abstract

본 발명은 지질을 이용한 고체 표면의 기능화 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, 친지질 앵커 화합물(lipophilic anchor compound)을 지질과 혼합하여 고체 표면에 도입하거나, 고분자화가 가능한 고분자화 지질(polymerizable lipid)을 고체 표면에 도입한 후 고분자화를 유도하거나, 또는 친지질 앵커 화합물(lipophilic anchor compound)을 고분자화 지질(polymerizable lipid)과 혼합하여 고체 표면에 도입한 후 고분자화를 유도함으로써 지질층을 안정화하는 방법이 제공된다.
또한, 고체 표면에 특정 작용기를 도입하기 위해서는 상기 본 발명의 각 방법에 특정 작용기를 갖는 기능성 지질이나 기능성 친지질 화합물(functional lipophilic compound)을 추가로 혼합하여 사용할 수 있다. 본 발명에 따라 고체 표면을 기능화 하는 방법은 지질을 이용하는 종래의 방법에 비해 더욱 안정한 지질층을 형성할 수 있다.

Description

지질을 이용한 고체 표면의 기능화 방법{Method for functionalization of solid surface using lipid}

본 발명은 지질을 이용한 고체 표면의 기능화 방법에 관한 것으로, 상세하게는 지질로 고체 표면 특히, 입자(particle)에 층을 형성하여 기능화(functionalization)함에 있어 입자의 표면에 도입되는 지질층의 안정성을 강화할 수 있는 지질을 이용한 고체 표면의 기능화 방법에 관한 것이다.

일반적인 의미에서 입자(particle)는 특정의 부피와 질량을 지닌 공간적으로 국한된 작은 물체(small localized object)라고 할 수 있다. 입자를 크기에 따라 분류하면 직경이 2.5∼10㎛ 정도인 굵은 입자(coarse particle), 0.1∼2.5㎛ 정도인 미세입자(fine particle), 1∼100㎚ 정도인 초미세입자(ultra fine particle) 또는 나노입자(nanoparticle)로 나눌 수 있다.

입자는 다양한 용도로 사용되고 있으며, 특히 금 나노입자(gold nanoparticle, AuNP), 자성 나노입자(magnetic nanoparticle, MNP), 양자점(quantum dot), 실리카 나노입자(silica nanoparticle) 등의 나노입자(nanoparticle)는 그 독특한 성질로 인하여 의료, 전자, 인쇄, 화학 등 다양한 분야에 응용하는 연구가 진행되고 있다. 이러한 나노입자의 응용을 위해서는 입자 표면의 화학적 특성을 변화시키는 기능화가 매우 중요하다.

입자에 도입되는 '기능'이라 함은 입자를 분산된 상태로 안정화시킬 수 있는 기능, 입자에 특정 화학반응을 일으킬 수 있는 기능, 입자와 다른 물질의 결합을 조절할 수 있는 기능, 표면 전하와 친수성과 같은 입자의 성질을 변화시킬 수 있는 기능 등 입자에 물리적 또는 화학적 특성을 부여할 수 있는 모든 기능을 의미한다.

본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 지질층의 형성에 관한 기본적 사항을 먼저 설명하기로 한다. 도 1은 포스파티딜콜린(phosphatidyl choline)의 화학적 구조와 도식화된 일반적인 지질의 구조를 나타낸 것이고, 도 2는 지질 이중층과 리포솜(liposome)의 구조를 나타낸 것이다.

도 1에 나타낸 것과 같이, 가장 흔한 지질 가운데 하나인 포스파티딜콜린(phosphatidyl choline)의 구조를 보면, 지질은 극성 머리에 두 개의 비극성 꼬리를 갖는 구조로 되어 있다. 지질의 이와 같은 구조적 특성으로 지질이 수용액 환경에 놓이게 되면 소수성 꼬리를 내부로 감추기 위해 도 2에 도시한 바와 같이, 지질 이중층(lipid bilayer)을 형성하여 결과적으로 리포솜(liposome)이 만들어지게 된다.

이 때 기능성 작용기(functional group)를 갖는 기능성 지질(functional lipid)을 바탕지질(background lipid)인 포스파티딜콜린과 섞어 리포솜을 제조하면 표면에 기능성 작용기를 갖는 리포솜이 만들어진다. 도 3에는 기능성 지질을 바탕지질인 포스파티딜콜린과 섞어 제조한 리포솜의 지질 이중층을 나타낸 것이다. 여기에서 바탕지질은 지질층을 유지하기 위한 매트릭스 역할을 하는 지질을 의미한다. 또한 기능성 작용기는 사용자가 원하는 기능을 나타낼 수 있는 작용기를 의미하는데 예를 들면, 다른 분자를 리포솜 표면에 고정하는데 사용되거나, 리포솜을 추적하는 표지(label)로 사용되거나 또는 리포솜 표면의 전하를 변화시키는데 사용될 수 있다. 도 4에는 각각 비오틴(biotin), 말레이미드(maleimide), 트리카르복시(tricarboxyl) 작용기를 갖는 기능성 지질의 예를 나타내었다.

지질 이중층은 비극성 꼬리들 사이에서 발생하는 소수성 상호작용(hydrophobic interaction)에 의해 유지되기 때문에 지질 외에 비극성 사슬을 갖는 친지질성 화합물(lipophilic compound)도 삽입되어 함께 층을 형성할 수 있다. 친지질성 화합물에 특정 작용기가 붙어있는 이러한 기능성 친지질 화합물(functional lipophilic compound) 역시 리포솜 표면에 원하는 작용기를 도입하는데 사용될 수 있다. 도 5는 기능성 친지질 화합물(functional lipophilic compound)을 바탕지질인 포스파티딜콜린과 섞어 제조한 리포솜의 지질 이중층을 나타낸 것이고, 도 6에는 각각 비오틴, 하이드라자이드(hydrazide), 말레이미드, 트리카르복시 작용기를 갖는 기능성 친지질 화합물의 예를 나타내었다.

앞에서 언급한 것처럼, 나노입자의 응용을 위해서는 입자 표면의 기능화(functionalization)가 요구되며, 기능화의 목적은 표면의 특성을 변화시키는 것이다. 여기에서 바람직한 특성은 입자의 분산이 촉진되거나, 화학반응 또는 물리적인 상호작용을 통해 단백질과 같은 분자가 입자에 결합할 수 있게 되거나, 입자에 자성, 형광, 또는 발광과 같은 다양한 기능이 부여되는 것 등을 예로 들 수 있다.

한편, 입자의 표면을 기능화하는 방법으로는 자기조립 단분자층(self-assembled monolayer, SAM)을 형성하는 방법, 고분자로 코팅하는 방법, 지질 또는 계면활성제로 입자 표면에 층을 형성하는 방법 등이 사용되고 있다.

이 중에서 지질을 사용하는 방법은 공정이 매우 간편할 뿐 아니라, 균일한 층이 형성된다는 장점이 있어 자발적으로 층을 형성할 수 있는 지질의 특성을 이용하여 나노입자를 기능화하는 방법들이 제안된 바 있다.(NMR Biomed. 2006, 19, 142-164; Acc. Chem. Res. 2009, 42, 904-914) 여기에는 입자를 직접 지질 이중층(lipid bilayer)으로 둘러싸거나, 또는 도 7에 도시한 바와 같이 입자에 먼저 소수성 자기조립 단일층(self-assembled monolayer)을 형성한 후 여기에 다시 지질 단일층(lipid monolayer)을 도입하여 입자를 혼성 이중층(hybrid bilayer)으로 둘러싸는 방법이 사용된다. (한국특허 제 10-0965244 호, 동 제 10-1044922 호, 및 동 제 10-1045525 호 참조)

그러나 지질을 사용하는 종래의 방법에 의하면, 지질층은 공유결합이 아닌 소수성 상호작용에 의해 유지되기 때문에 지질의 유동적 성질로 인해 안정성이 떨어진다는 단점이 있다. 특히, 크기가 작은 나노입자의 경우 입자를 둘러싸고 있는 지질층의 구조가 불안정하여 서로 다른 입자의 지질층 사이의 융합에 의해 입자들이 서로 응집하는 현상이 나타난다.

한국특허 제 10-0965244 호 한국특허 제 10-1044922 호 한국특허 제 10-1045525 호

NMR Biomed. 2006, 19, 142-164; Acc. Chem. Res. 2009, 42, 904-914

따라서 본 발명의 목적은 상기와 같은 종래기술의 한계를 극복하기 위하여 제안된 것으로, 입자 표면의 기능화를 위해 입자 표면에 도입되는 지질층의 안정화를 강화할 수 있는 고체 표면의 기능화 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적들은 아래에 기재하는 본 발명의 구체적 설명에 의해 분명하게 이해될 것이다.

이러한 목적을 달성하기 위해 본 발명에 따르면, 고체 표면과 공유결합을 형성할 수 있는 친지질 앵커 화합물을 지질과 혼합하여 고체의 표면에 도입하는 것을 특징으로 하는 지질을 이용한 고체 표면 기능화 방법이 제공된다.

또한 본 발명에 따르면, 고분자화 지질을 고체 표면에 도입한 후 고분자화 반응을 통해 상기 지질의 고분자화를 유도하는 것을 특징으로 하는 지질을 이용한 고체 표면 기능화 방법이 제공된다.

또한 본 발명에 따르면, 고체 표면과 공유결합을 형성할 수 있는 친지질 앵커 화합물을 고분자화 지질과 혼합하여 고체 표면에 도입한 후 고분자화 반응을 통해 상기 지질의 고분자화를 유도하는 것을 특징으로 하는 지질을 이용한 고체 표면 기능화 방법이 제공된다.

본 발명에 의하면, 지질을 이용한 고체 표면의 기능화 방법에 있어 고체 표면에 도입되는 지질층의 안정성을 크게 향상시킬 수 있어 바이오센서의 센서 칩이나 기능화된 입자의 제조 등과 같은 다양한 분야에 유용하게 적용할 수 있을 것이다.

도 1은 포스파티딜콜린의 화학적 구조와 도식화된 일반적인 지질의 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 지질 이중층과 리포솜의 구조를 나타낸 것이다.
도 3은 기능성 지질을 바탕지질과 섞어 제조한 리포솜의 지질 이중층을 나타낸 것이다.
도 4는 기능성 지질의 예들을 나타낸 것이다.
도 5는 기능성 친지질 화합물을 바탕지질과 섞어 제조한 리포솜의 지질 이중층을 나타낸 것이다.
도 6은 기능성 친지질 화합물들의 예를 나타낸 것이다.
도 7은 기능성 지질이나 기능성 친지질 화합물을 포함하는 리포솜으로 소수성 자기조립 단일층 위에 지질 단일층을 형성함으로써 고체 표면에 기능성 작용기를 도입하는 방법을 모식적으로 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명에서 사용 가능한 고분자화 지질의 예로 디인 포스파티딜콜린(diyne phosphatidyl choline; diyne)을 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명에서 사용 가능한 친지질 앵커 화합물의 예로 알킬 알콕시 실란(alkylalkoxysilane)을 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명에 따라 알킬 알콕시 실란(alkylalkoxysilane)을 diyne에 섞어 입자를 둘러싼 후 빛으로 고분자화를 유도함으로써 지질층과 입자 표면 사이에 그리고 지질층 분자들 사이에 공유결합을 형성하는 과정을 모식적으로 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명에 따라 서로 다른 지질 혼합물을 이용하는 4종류의 방법으로 기능화한 자성 나노입자들의 크기를 측정한 후 입자 크기의 증가율을 나타낸 것이다. (지질에 Diyne이 포함된 경우에는 자외선을 조사하여 고분자화를 유도하였다.)
도 12는 도 11의 4종류의 방법으로 기능화한 자성 나노입자에 streptavidin과 연결된 alkaline phosphatase 효소(SA-AP) 또는 streptavidin과 연결된 horseradish peroxidase 효소(SA-HRP)를 넣어 결합시킨 후 자성 나노입자에 결합한 효소 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 도 11의 4종류의 방법으로 기능화한 자성 나노입자에 streptavidin과 연결된 horseradish peroxidase 효소(SA-HRP)를 넣어 결합시키고 자성 나노입자를 계면활성제로 세척한 후 자성 나노입자에 결합한 효소 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 DPPC와 diyne의 비율을 다르게 하여 혼합한 6종류의 리포솜으로 자성 입자를 기능화하고 SA-AP를 자성 나노입자에 고정시킨 후 자성 나노입자에 결합한 효소 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 DPPC만으로 기능화한 자성 나노입자(A)와 Diyne+Si로 기능화한 자성 나노입자(B)를 Isopore 필터로 걸러서 보관하면서 1일과 3일째에 다시 동일한 필터로 걸렀을 때 필터를 빠져나온 입자의 비율을 나타낸 것으로, Diyne+Si로 기능화한 입자는 자외선을 조사한 것과 조사하지 않은 것을 함께 비교하였다.
도 16은 도 11의 4종류의 방법으로 기능화한 후 SA-HRP를 결합시킨 자성 나노입자를 구멍크기가 0.6 ㎛인 isopore 필터로 걸러서 3일간 보관하면서 다시 동일한 필터로 걸렀을 때 필터에 남은 입자의 양을 HRP 효소 활성으로 나타낸 것이다.
도 17은 DPPC로 기능화한 입자와 Diyne+Si로 기능화한 입자의 주사전자 현미경 사진이다.
도 18은 Diyne+Si로 기능화하고 Yersinia enterocolitica에 대한 항체와 HRP 효소를 고정시킨 자성 나노입자를 이용하여 Yersinia enterocolitica를 검출한 결과를 나타낸 것이다.

이하에서 본 발명을 보다 상세하게 설명하기로 한다.

먼저, 본 발명자는 상기한 종래기술의 문제점을 극복하기 위해 고체 표면에 안정한 지질층을 형성할 수 있도록 다음의 두 가지 방법으로 접근을 하였다.

첫째, 고분자화 지질(polymerizable lipid)을 이용하여 고체 표면에 층을 형성한 후, 고분자화 반응을 일으킴으로써 고체 입자를 둘러싼 지질 분자들이 그물과 같은 구조로 연결되도록 하였다. 여기서 '고분자화 지질'이란 자외선을 조사하는 것과 같은 특정 조건하에서 지질 분자들 사이에 교차 결합이 형성될 수 있는 지질로서 대표적인 고분자화 지질로는 도 8에 도시된 것과 같은 각 소수성 사슬에 두 개의 3중 결합을 포함하는 지질인 디인 포스파티딜콜린(diyne phosphatidyl choline; diyne)을 비롯하여 비스-디에노일 포스파티딜콜린(bis-dienoyl phosphatidyl choline)이나 아크릴레이트 포스파티딜콜린(acrylate phosphatidyl choline) 등을 들 수 있다.

둘째, 고체 표면과 공유결합을 형성할 수 있는 친지질 앵커 화합물(lipophilic anchor compound)을 지질과 섞어 고체 표면에 층을 형성하게 함으로써 지질 이중층이 공유결합을 통해 고체 표면에 고정되도록 하였다. 이러한 친지질 앵커 화합물의 예로는, 실리카나 자성입자와 같이 히드록시기를 포함하는 표면에 사용할 수 있는 알킬 알콕시 실란(alkyl alkoxy silane)이나 금속 표면에 사용할 수 있는 알칸 티올(alkane thiol) 등을 들 수 있다. 도 9에는 알킬 알콕시 실란의 일종인 옥타데실 트리에톡시 실란(octadecyl triethoxy silane; ODTES) 구조를 나타내었다.

이 두 가지 방법은 각각 독립적으로 사용될 수도 있지만, 함께 사용될 수도 있다. 예를 들어, 고체 표면에 혼성 이중층(hybrid bilayer)을 형성하는 방법을 사용할 경우에는 소수성 자기조립 단일층이 이미 고체 표면과 공유결합을 형성하고 있기 때문에 친지질 앵커 화합물은 사용할 필요가 없고 단지 고분자화 지질만 사용하면 된다. 이때 혼성 이중층을 구성하는 한 층은 소수성 자기조립 단일층이 되고 다른 층은 고분자화 지질층이 된다.

그러나 고체 표면을 지질 이중층(lipid bilayer)으로 한 번에 기능화할 때는 일반적인 바탕 지질과 친지질 앵커 화합물의 혼합물을 사용하거나, 고분자화 지질을 사용하거나, 또는 고분자화 지질과 친지질 앵커 화합물의 혼합물을 사용하는 세 가지 방법이 모두 가능하다.

그리고 상기한 모든 방법에서, 지질층에 특정 기능을 추가로 부여하고자 하는 경우에는 앞에서 설명한 것처럼, 특정 작용기를 지니는 기능성 지질이나 기능성 친지질 화합물을 추가로 혼합하여 사용할 수도 있다. 여기에서 '특정 작용기'란 고체 표면에 수용체 분자를 고정시키는데 필요한 작용기, 고체 표면에서 수용체로 작용할 수 있는 작용기, 고체 표면에서 표지 역할을 하는 작용기, 고체 표면의 전하를 변화시킬 수 있는 작용기, 고체 표면을 친수성으로 만들 수 있는 작용기, 고체 표면을 소수성으로 만들 수 있는 작용기, 고체 표면에 비특이적인 흡착을 억제할 수 있는 작용기 등을 의미한다. 이러한 작용기의 예로는 아미노기, 카르복시기, 히드록시기, 비오틴(biotin)기, 말레이미드(maleimide)기, 하이드라자이드(hydrazide)기, 피리딜디티오(pyridyldithio)기, 티올(thiol)기, 트리카르복시(tricarboxyl)기, PEG(polyethylene glycol), 시아누르산 염화물(cyanuric chloride), DTPA(diethylenetriaminepentaacetic acid), 플루오레신(fluorescein), 로다민(rhodamine), 댄실(dansyl), 피렌(pyrene) 등을 들 수 있다.

도 10은 알킬 알콕시 실란(alkyl alkoxy silane)을 diyne에 섞어 입자를 둘러싼 후 빛으로 고분자화를 유도함으로써 지질층과 입자 표면 사이에 그리고 지질층 분자들 사이에 공유결합을 형성하는 과정을 나타내었다.

이와 같이 고분자화 지질이나 친지질 앵커 화합물을 이용하여 지질층을 안정화하는 방법은 수정 미소저울(quartz crystal microbalance) 또는 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance) 등 바이오센서의 센서 칩과 같은 평평한 고체 표면은 물론 자성 나노입자, 금 나노입자, 양자점(quantum dot), 실리카 나노입자 등 입자형 고체 표면에도 동일하게 적용될 수 있다.

고분자화 지질과 친지질 앵커 화합물의 효과를 확인하기 위해 표 1과 같이 4종류의 지질 혼합물로 리포솜을 만들고, 이 리포솜으로 자성 나노입자를 기능화 하였다. 리포솜의 사용 비율은 자성 나노입자 1mg에 더해지는 리포솜에 포함된 전체 지질의 질량이 약 0.3mg이 되도록 조정하였다. 자성 나노입자로는 직경 100nm의 Fe₃O₄ 입자를 사용하였다. 지질로 둘러싸인 나노입자에 효소를 고정시켜 기능화 여부 및 지질층의 안정성을 확인하기 위해 각 지질 혼합물에 비오틴(biotin) PE를 포함시켰다.

자성 나노입자의 기능화에 사용된 4종류 리포솜의 지질조성

리포솜 번호	리포솜 약자	리포솜 조성 몰 비 (molar ratio)
1	DPPC	DPPC:Biotin PE=10:2
2	DPPC+Si	DPPC:Biotin PE:Si=10:2:1
3	Diyne	Diyne:Biotin PE=10:1
4	Diyne+Si	Diyne:Biotin PE:Si=10:2:1
DPPC; 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Diyne; 1,2-bis(10,12-tricosadiynoyl)-sn-glycero-3-phosphocholine Biotin PE; 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) Si; Trimethoxy(octadecyl)silane

표 1의 각 지질 혼합물을 클로로포름(chloroform)에 녹인 후 유리 바이알에서 말려 지질 필름을 만들었다. 자성 나노입자를 PBS(phosphate-buffered saline)에 1mg/ml의 농도로 분산시킨 후, 초음파를 이용하여 응집된 입자를 추가로 분산시켜 주었다. 지질 필름이 있는 바이알에 자성 나노입자를 넣고 PBS를 더하여 자성 나노입자의 최종 농도가 0.5mg/ml이 되도록 하였다. 바이알을 질소로 채워준 후 초음파 세척기에 넣고 50∼60℃의 온도에서 3시간 반응시켰다. 디인(Diyne)에 고분자화 반응을 일으킬 경우에는 질소가스를 불어넣어 주면서 파장 254nm의 자외선 램프로 바이알 위에서 30분 정도 빛을 조사하였다.

지질로 코팅된 자성 나노입자의 안정성을 확인하기 위해 Zeta Potential Analyzer(Nicomp 380/ZLS)로 3일과 14일 후에 입자의 크기를 각각 측정하여 입자 크기의 증가율을 도 11에 그래프로 나타냈다.

도 11에서와 같이, 기능화하지 않은 자성 나노입자(MNP)와 DPPC로 기능화한 입자는 11일 만에 입자의 크기가 약 35% 정도 증가하였다. 이러한 결과로부터 DPPC 지질층은 입자의 응집을 억제하는 효과가 거의 없다는 것을 알 수 있다. DPPC는 세포막의 주성분인 포스파티딜콜린(phosphatidyl choline) 지질들 가운데 하나이며, 세포막은 다른 세포막과의 비특이적인 결합에 대해 저항성을 가지고 있다. 그럼에도 불구하고 DPPC로 기능화된 입자들이 응집되는 이유는 지질로 둘러싸인 입자들의 결합에 의한 것이라기보다는 서로 다른 입자를 둘러싸고 있는 지질층들 간의 융합에서 비롯된 것으로 추측된다.

한편, DPPC+Si로 기능화한 입자는 23% 정도로 크기가 증가하여 약간의 응집 억제 효과를 보여주었는데, 이는 친지질성 앵커 화합물로 사용된 트리메톡시 옥타데실 실란(Trimethoxy(octadecyl)silane; Si)이 지질층을 안정화시키는 효과가 있음을 시사한다.

또한, Diyne으로 기능화한 입자는 크기가 10% 정도만 증가하여 친지질성 앵커 화합물에 비해 고분자화 지질의 안정화 효과가 더 크다는 것을 알 수 있다. 고분자화 지질의 경우 지질층을 구성하는 지질들이 서로 공유결합으로 연결되어 있기 때문에 지질층의 융합에 대한 저항성이 친지질성 앵커 화합물을 사용하는 경우보다 더 클 것으로 생각된다.

마지막으로, Diyne+Si로 기능화한 입자는 크기가 5%정도만 증가하여 고분자화 지질과 앵커 화합물이 함께 사용될 때 가장 높은 안정화 효과를 달성할 수 있음을 알 수 있다.

한편, 표 1에 제시된 각 방법으로 기능화한 자성 나노입자에 고정된 효소의 활성을 알아보기 위해 상기 4종류의 방법으로 기능화한 동일한 양의 자성 나노입자에 스트렙타비딘(streptavidin)과 연결된 알칼리 포스파타제(alkaline phosphatase) 효소(SA-AP) 또는 스트렙타비딘(streptavidin)과 연결된 호스라디쉬 퍼옥시다제(horseradish peroxidase) 효소(SA-HRP)를 넣어 결합시킨 후, 결합하지 않은 효소를 씻어서 제거하여 자성 나노입자에 고정된 효소의 활성을 측정하여 도 12에 나타내었다. 여기에서, 알칼리 포스파타제(alkaline phosphatase) 효소의 활성은 p-니트로페닐 포스페이트(p-nitrophenyl phosphate) 기질 분해에 의한 흡광도(A_405nm)의 증가 정도로 평가하였고, 호스라디쉬 퍼옥시다제(horseradish peroxidase) 효소의 활성은 루미놀(luminol)과 H₂O₂ 기질반응에 의한 발광 정도(light intensity)로 평가하였다. 또한, 자성 나노입자와 효소의 양, 그리고 자성 나노입자를 기능화하는데 사용한 지질에 포함된 Biotin PE의 양은 모든 시료에서 동일하게 하였다.

Biotin PE와 SA-AP 또는 SA-HRP의 연결은 매우 강하기 때문에 효소 활성이 높다는 것은 Biotin PE가 지질층에 안정하게 삽입되어 있다는 것을 의미하고, 이는 곧 자성 나노입자를 둘러싸고 있는 지질층이 안정하다는 것을 의미한다.

도 12의 결과를 보면, 상기 두 가지 효소에서 모두 DPPC<DPPC+Si<Dyine<Diyne+Si의 순서로 활성이 증가하는 것을 알 수 있는데 이로부터 첫째, 앵커로 사용된 Si는 DPPC 지질층을 안정화하는데 기여하며, 둘째, Diyne으로 고분자화된 지질층은 앵커 화합물보다 안정화 효과가 더 크며, 셋째, 고분자화 지질과 앵커 화합물은 지질층을 안정화시키는데 있어서 시너지 효과를 나타낸다는 사실을 확인할 수 있고 이러한 결과는 도 11의 결과와 실질적으로 일치하는 것이라 할 수 있다.

한편, 도 13은 도 11의 4종류의 방법으로 기능화한 자성 나노입자에 streptavidin과 연결된 horseradish peroxidase 효소(SA-HRP)를 넣어 결합시키고 자성 나노입자를 계면활성제 0.1% Triton X-100으로 처리한 후 입자에 남아있는 효소 활성을 계면활성제로 처리하기 전의 입자의 효소 활성과 비교하여 나타낸 결과이다.

도 13의 결과에서, 계면활성제는 지질층을 녹여내는 역할을 하기 때문에 DPPC로 기능화한 입자는 지질층과 함께 효소가 입자로부터 제거되어 약 8% 정도의 효소 활성만 남아있는 것을 알 수 있다. 그러나 앵커 화합물이나 고분자화 지질을 이용할 경우 도 12의 결과와 마찬가지로 남아있는 효소 비율이 DPPC<DPPC+Si<Dyine<Diyne+Si의 순서로 증가하여 앵커 화합물이나 고분자화 지질의 안정화 효과를 다시 한 번 확인할 수 있다.

지질층에 특정 기능을 부여하기 위해서는 지질에 기능성 지질이나 기능성 친지질 화합물을 추가해야 한다. 그러나 기능성 지질이나 기능성 친지질 화합물이 첨가되어 Diyne의 비율이 낮아지면 공유결합으로 연결되는 지질의 비율이 감소하기 때문에 지질층의 안정화 효과가 감소할 수 있다. 따라서 Diyne의 비율에 따라 안정화 정도가 어떻게 달라지는지 확인하기 위해 표 2에 나타낸 바와 같이, DPPC와 Diyne의 비율을 서로 다르게 혼합한 6종류의 리포솜으로 자성 나노입자를 기능화였다.

6종류의 리포솜에서 DPPC와 Diyne의 비율

리포솜 번호	1	2	3	4	5	6
DPPC의 중량 비	8	6	4	2	1	0
Diyne의 중량 비	2	4	6	8	9	10
Si의 중량 비	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
Biotin PE의 중량 비	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1

기능화한 자성 나노입자에 SA-AP를 고정시킨 후, 입자에 고정되지 않은 SA-AP를 세척하여 제거하고 입자에 고정된 효소 활성을 측정한 결과를 도 14에 나타내었다.

도 14에서, x축은 DPPC와 Diyne만을 합한 양에서 Diyne이 차지하는 비율을 중량%로 표시하였다. 도 14로부터, Diyne의 비율이 80중량%가 될 때까지는 효소 활성이 지수 함수적으로(exponentially) 증가하는 것을 알 수 있다. 이러한 사실은 Diyne 비율이 낮을 때는 지질들 사이의 공유결합 네트워크가 형성되지 않아 안정화 효과가 거의 없다가 Diyne 비율이 60~80중량% 구간에서 지질들 사이에 공유결합 네트워크가 형성됨에 따라 급격하게 안정화가 진행된다는 것을 의미한다. 한편, Diyne 비율이 80중량%을 초과하면 효소 활성 증가율이 완만해지는데 이때에는 지질들 사이의 공유결합 네트워크가 이미 충분히 형성되어 있어서 Diyne 비율의 추가적인 증가가 안정화 효과에는 그다지 큰 역할을 하지 못한다는 것을 의미한다.

여기에서 Diyne의 80중량%를 DPPC, Diyne, Si, 및 Biotin PE을 포함하는 전체 지질을 기준으로 해서 몰%로 환산하면 이러한 임계수치는 약 70%에 해당된다. 이러한 결과로부터, Diyne이 리포솜을 구성하는 전체 지질 가운데 몰 비율로 70%까지만 포함되어 있으면 나머지 30%는 친지질 앵커 화합물이나 기능성 지질 또는 기능성 친지질 화합물을 포함시켜도 충분히 안정한 지질층이 형성된다는 것을 알 수 있다.

다음으로, 앵커 화합물이나 고분자화 지질의 안정화 효과를 필터 방법으로 확인하였다.

표 1의 4종류 리포솜으로 자성 나노입자를 기능화한 후, SA-HRP까지 결합시킨 입자들을 구멍크기가 0.6㎛인 이소포어(isopore) 필터로 걸러주었다. Diyne과 Diyne+Si의 경우에 있어 비교를 위해 자외선을 조사하지 않고 제조한 입자도 실험에 사용하였다. 필터를 통해 나온 입자들만 모아 3일까지 보관하며 다시 동일한 필터로 거름으로써 입자의 크기가 그대로 유지되는지를 알아보았다. 입자가 응집되지 않고 크기가 그대로 유지되면 다시 거를 때 대부분 필터를 빠져나오고 필터에 남는 입자는 거의 없을 것이다. 입자의 양은 루미놀(luminol)과 H₂O₂로 HRP 활성을 측정하여 평가하였으며, 그 결과를 도 15에 나타내었다.

도 15의 (A)로부터, DPPC로 기능화한 입자는 전체의 양은 줄어들지 않았지만 필터를 빠져나온 입자(filtered particle)의 양은 크게 줄어든 것을 알 수 있다. 이러한 결과는 입자가 많이 응집되었음을 의미한다. 반면에, 도 15의 (B)를 보면, Diyne+Si로 기능화한 입자는 자외선을 조사하지 않았을 때는 필터를 빠져나온 입자의 양이 크게 줄어들지만 자외선을 조사하면 입자의 양의 감소 폭이 그다지 크지 않다는 것을 알 수 있다. 이러한 결과를 통해 Diyne+Si로 기능화한 입자는 분산된 상태가 잘 유지되며 이러한 안정화 효과에는 자외선 조사에 의한 고분자화 반응이 크게 기여한다는 것을 알 수 있다.

도 16은 도 15와는 반대로 필터에 남아 있는 효소 활성을 측정한 결과이다. 입자가 응집될수록 필터에 걸리는 입자가 많아져 필터에 남은 효소 활성도 높아지게 된다. DPPC는 앞서 설명한 결과들과 마찬가지로 입자를 기능화한 후 시간이 지날수록 필터에 남는 효소 활성이 증가하여 입자들이 많이 응집되는 것을 알 수 있다. DPPC+Si 역시 DPPC보다 그 정도는 작지만 역시 입자가 응집됨을 알 수 있다. 반면에, Diyne으로 기능화한 입자의 경우 고분자화 지질의 응집 억제 효과가 앵커 화합물보다 훨씬 크다는 것을 알 수 있다. 마지막으로, 고분자화 지질과 앵커 화합물을 함께 사용할 경우 필터에 남은 효소의 활성이 거의 증가하지 않아 입자가 매우 안정하게 분산되어 있다는 것을 알 수 있다.

한편, 본 발명에 의한 고분자화 지질과 친지질 앵커 화합물의 안정화 효과는 도 17의 전자현미경 사진을 통해서도 확인할 수 있다. 즉, 도 17에서 보는 바와 같이, DPPC로 기능화한 입자는 지질층의 융합에 의해 응집이 나타나지만, Diyne+Si로 기능화한 입자는 잘 분산되어 있는 것을 알 수 있다.

본 발명자에 의해 제시된 선행특허문헌(한국특허출원 제10-2009-0110609호 , 동 제10-2010-0119993호, 및 동 제10-2011-0016604호)에는, 직경이 50∼100nm 정도인 자성 나노입자에 박테리아에 대한 항체와 효소를 고정시킨 후, 이 자성 나노입자를 박테리아를 포함하는 시료에 넣어 박테리아와 자성입자의 복합체를 형성한 다음, 구멍이 0.4∼0.8μm인 필터를 사용하여 이 시료를 거르면 박테리아와 자성입자의 복합체는 필터에 남고 박테리아와 결합하지 않은 자유로운 입자는 필터를 빠져나가 제거되어, 결과적으로 박테리아와 결합한 자성입자만 필터에 남기 때문에 필터에 남은 효소의 활성을 측정함으로써 박테리아를 정량적으로 검출할 수 있는 기술이 개시되어 있다. 따라서 이 방법에서는 만일, 응집된 입자들이 존재하게 되면 그 입자들이 필터에 잔류하여 잘못된 결과를 나타낼 수 있는데 자성입자의 분산이 특히 중요한 것은 바로 이러한 이유 때문이다.

Diyne+Si으로 기능화한 입자가 분산된 상태를 매우 안정하게 유지하는 것을 도 16의 결과로 확인하였기 때문에 이 기능화 방법을 박테리아 검출에 응용하였다. 질량비로, Diyne:Si:dodecanoic acid가 20:1:1이 되도록 혼합한 리포솜으로 직경 100nm의 자성입자를 기능화한 후, EDC/NHS{1-ethyl-3-(dimethylaminopropyl) carbodiimide/N-hydroxysuccinimide} 방법으로 활성화시켰다. 여기에서 도데칸 산(dodecanoic acid)은 카르복시기를 표면에 제공하는데 이 카르복시기는 EDC/NHS 반응을 통해 단백질과 공유결합을 형성할 수 있는 NHS 작용기를 생성한다. 여기에 Yersinia enterocolitica에 대한 항체와 HRP 효소를 질량 기준 1:10의 비율로 고정시켰다. 이렇게 기능화한 입자를 이용하여 Yersinia 박테리아를 검출한 결과, 도 18과 같이 3×10¹∼3×10⁶ cfu(colony forming unit) 범위에서 박테리아를 검출할 수 있다는 사실을 확인하였다.

이상에서는 입자를 기능화하는 방법들에 대해 설명하였지만, 본 발명은 입자뿐만 아니라 센서 칩 표면과 같은 평평한 고체 표면의 기능화에도 동일하게 적용될 수 있을 것이다.

이상에서는 본 발명을 특정의 바람직한 실시예를 예를 들어 도시하고 설명하였으나, 본 발명은 상기한 실시예에 한정되지 아니하며 본 발명의 정신을 벗어나지 않는 범위 내에서 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 변경과 수정이 가능할 것이다.

Claims

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지질 분자들 사이의 교차 결합 형성을 유도할 수 있는 고분자화 지질을 고체 표면에 도입한 후, 상기 고분자화 지질들 사이의 교차 결합 형성을 통해 상기 고분자화 지질의 고분자화를 유도하는 것을 특징으로 하는 지질을 이용한 고체 표면 기능화 방법.
고체 표면과 공유결합을 형성할 수 있는 작용기와 소수성 사슬을 지닌 친지질 앵커 화합물을, 지질 분자들 사이의 교차 결합 형성을 유도할 수 있는 고분자화 지질과 혼합하여 고체 표면에 도입한 후, 상기 고분자화 지질들 사이의 교차 결합 형성을 통해 상기 고분자화 지질의 고분자화를 유도하는 것을 특징으로 하는 지질을 이용한 고체 표면 기능화 방법.
제 2항 또는 제 3항에 있어서,
고체 표면에 수용체 분자를 고정하는데 필요한 작용기, 고체 표면에서 수용체로 작용할 수 있는 작용기, 고체 표면에서 표지 역할을 하는 작용기, 고체 표면의 전하를 변화시킬 수 있는 작용기, 고체 표면을 친수성으로 만들 수 있는 작용기, 고체 표면을 소수성으로 만들 수 있는 작용기, 및 고체 표면에 비특이적인 흡착을 억제할 수 있는 작용기 중에서 선택된 어느 하나의 작용기를 지닌 기능성 지질을 추가로 혼합함으로써 상기 작용기를 고체 표면에 도입하는 것을 특징으로 하는 지질을 이용한 고체 표면 기능화 방법.
제 2항 또는 제 3항에 있어서,
고체 표면에 수용체 분자를 고정하는데 필요한 작용기, 고체 표면에서 수용체로 작용할 수 있는 작용기, 고체 표면에서 표지 역할을 하는 작용기, 고체 표면의 전하를 변화시킬 수 있는 작용기, 고체 표면을 친수성으로 만들 수 있는 작용기, 고체 표면을 소수성으로 만들 수 있는 작용기, 및 고체 표면에 비특이적인 흡착을 억제할 수 있는 작용기 중에서 선택된 어느 하나의 작용기를 지닌 기능성 친지질 화합물을 추가로 혼합함으로써 상기 작용기를 고체 표면에 도입하는 것을 특징으로 하는 지질을 이용한 고체 표면 기능화 방법.
제 3항에 있어서,
상기 친지질 앵커 화합물은 알킬 알콕시 실란 화합물과 알칸 티올 화합물 중에서 선택되는 적어도 1종인 것을 특징으로 하는 지질을 이용한 고체 표면 기능화 방법.
제 2항에 있어서,
상기 고분자화 지질은 디인 포스파티딜콜린(diyne phosphatadylcholine), 비스-디에노일 포스파티딜콜린(bis-dienoyl phosphatidyl choline), 및 아크릴레이트 포스파티딜콜린(acrylate phosphatidyl choline) 중에서 선택되는 적어도 1종인 것을 특징으로 하는 지질을 이용한 고체 표면 기능화 방법.
제 3항에 있어서,
상기 고분자화 지질은, 리포솜 전체 지질에 대해 70몰% 이상으로 포함하는 것을 특징으로 하는 지질을 이용한 고체 표면 기능화 방법.
제 2항 또는 제 3항에 있어서,
상기 고체 표면은 수정 미소저울(quartz crystal microbalance) 바이오센서의 센서 칩, 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance) 바이오센서의 센서 칩, 자성 나노입자, 금 나노입자, 양자점(quantum dot), 및 실리카 나노입자 중의 어느 하나의 표면인 것을 특징으로 하는 지질을 이용한 고체 표면 기능화 방법.
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제 4항에 있어서,
상기 작용기는 아미노기, 카르복시기, 히드록시기, 비오틴(biotin)기, 말레이미드(maleimide)기, 하이드라자이드(hydrazide)기, 피리딜디티오(pyridyldithio)기, 티올(thiol)기, 트리카르복시(tricarboxyl)기, PEG(polyethylene glycol), Cyanuric chloride, DTPA(diethylenetriaminepentaacetic acid), 플루오레신(fluorescein), 로다민(rhodamine), 댄실(dansyl), 및 피렌(pyrene) 중의 어느 하나인 것을 특징으로 하는 지질을 이용한 고체 표면 기능화 방법.
제 5항에 있어서,
상기 작용기는 아미노기, 카르복시기, 히드록시기, 비오틴(biotin)기, 말레이미드(maleimide)기, 하이드라자이드(hydrazide)기, 피리딜디티오(pyridyldithio)기, 티올(thiol)기, 트리카르복시(tricarboxyl)기, PEG(polyethylene glycol), Cyanuric chloride, DTPA(diethylenetriaminepentaacetic acid), 플루오레신(fluorescein), 로다민(rhodamine), 댄실(dansyl), 및 피렌(pyrene) 중의 어느 하나인 것을 특징으로 하는 지질을 이용한 고체 표면 기능화 방법.
제 2항에 있어서,
상기 고분자화 지질은 상기 고체 표면에 혼성 이중층(hybrid bilayer) 또는 지질 이중층(lipid bilayer)의 형태로 도입되는 것을 특징으로 하는 지질을 이용한 고체 표면 기능화 방법.