JP4875846B2 - 固定化方法 - Google Patents
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Description
(A)センサーチップとタンパク質を共有結合によってある程度強固にカップリングすることで固定化を行う方法
(B)センサーチップとタンパク質の親和性を利用してマイルドにセンサーチップ上に結合させる方法、に大別される。
上記第1工程の後、上記固定化担体に対して、上記固定化対象の1種以上の生体分子を含む溶液を作用させる第2工程とを含み、
上記第2工程では、上記タグ部と上記固定化担体のタグ部結合部位との間の相互作用及び上記反応基と上記1種以上の生体分子との間の共有結合を介して、上記1種以上の生体分子を上記固定化担体に固定化する。
或いは、上記第2工程における固定化担体のタグ部結合部位はタグ部に対する抗体であってもよい。
タグ部は、天然の生体分子における特有の一部であってもよい。
上記固定化担体に固定化された生体分子と、上記試料に含まれる低分子化合物との親和性及び/又は反応速度を決定する工程とを含む生体分子-低分子化合物親和性及び/又は反応速度決定方法を提供する。
上記固定化担体に固定化された1種以上のタンパク質と、上記試料に含まれる1種以上のタンパク質との親和性及び/又は反応速度を決定する工程とを含むタンパク質-タンパク質親和性及び/又は反応速度決定方法を提供する。
比較例1として、センサーチップに対して、共有結合(アミンカップリング)を介してタンパク質を固定化する方法を説明する。
比較例2では、固定化対象のタンパク質として酸性タンパク質を使用した以外は、比較例1と同様にして行った例である。具体的には、酸性タンパク質としてヒトトリプシンを用いた。
比較例3として、センサーチップに対して、タンパク質のタグ部(His−タグ)を介して当該タンパク質を固定化する方法を説明する。
比較例4では、固定化対象のタンパク質として、N末端にHis-タグを付加したFK506結合タンパク質(N末端His-タグFKBP)を使用した以外は、比較例3と同様にして行った例である。なお、N末端His-タグFKBPを含む溶液は、N末端His-タグFKBPを発現させた大腸菌を超音波処理等で破砕した溶菌液をランニング緩衝液で100倍に希釈して調製した。
比較例5では、比較例3で作製したNTAセンサーチップに対して低分子化合物を作用させたときのN末端His-タグCOX-2と化合物との相互作用を解析した。低分子化合物としては、COX-2に対する選択的阻害剤として知られているNS398を用いた。
比較例6では、比較例4で作製したNTAセンサーチップに対して低分子化合物を作用させたときのN末端His-タグFKBPと化合物との相互作用を解析した。低分子化合物としては、FKBPに結合することが知られているFK506を用いた。
実施例1では、本発明を適用して、センサーチップに対して、共有結合(アミンカップリング)及びタグ部を介してタンパク質を固定化する方法を説明する。本例では、タンパク質として、N末端にHis−タグを付加したFKBPを用い、センサーチップとして固定化担体にnitrilotriacetic acidを導入したNTAセンサーチップ(ビアコア社製、ウプサラ、スウェーデン)を用い、測定装置としてBiacore3000(ビアコア社製)を用いた。
実施例2では、タンパク質としてN末端HisタグCOX-2を用いた以外は、実施例1と同様にしてタンパク質を固定化する方法を説明する。なお、N末端HisタグCOX-2を含む溶液は、上記ランニング緩衝液で100nM程度に希釈することで調製した。
実施例3では、本発明を適用して、センサーチップに対して、共有結合(アミンカップリング)及びタグ部を介してタンパク質を固定化する方法を説明する。本例では、タンパク質として、N末端HisタグCyclophilin Aを用い、センサーチップとして抗Hisタグ抗体を固定したCM5センサーチップ(ビアコア社製、ウプサラ、スウェーデン)を用い、測定装置としてBiacore3000(ビアコア社製、ウプサラ、スウェーデン)を用いた。
実施例4では、タンパク質としてN末端HisタグAkt1/PKBα(Upstate Biotechnology社製、ウォルサム、マサチューセッツ州、アメリカ合衆国、商品名14-341)を用いた以外は、実施例1と同様にしてタンパク質を固定化する方法を説明する。Akt1/PKBαは、セリン/スレオニン・プロテインカイネースであることが知られている。なお、本例においてAkt1/PKBαは、市販品保存溶液から脱塩カラムにてイミダゾールを除去した後に使用した。
実施例5では、タンパク質としてN末端HisタグMSK1(Upstate Biotechnology社製、ウォルサム、マサチューセッツ州、アメリカ合衆国、商品名14-438)を用いた以外は、実施例1と同様にしてタンパク質を固定化する方法を説明する。MSK1は、セリン/スレオニン・プロテインカイネースであることが知られている。
実施例6では、タンパク質としてN末端HisタグPKA(Upstate Biotechnology社製、ウォルサム、マサチューセッツ州、アメリカ合衆国、商品名14-440)を用いた以外は、実施例1と同様にしてタンパク質を固定化する方法を説明する。PKAは、セリン/スレオニン・プロテインカイネースであることが知られている。
実施例7では、タンパク質としてN末端HisタグPRAK(Upstate Biotechnology社製、ウォルサム、マサチューセッツ州、アメリカ合衆国、商品名14-334)を用いた以外は、実施例1と同様にしてタンパク質を固定化する方法を説明する。PRAKは、セリン/スレオニン・プロテインカイネースであることが知られている。
実施例8では、タンパク質としてN末端HisタグROKα/ROCK-II(Upstate Biotechnology社製、ウォルサム、マサチューセッツ州、アメリカ合衆国、商品名14-338)を用いた以外は、実施例1と同様にしてタンパク質を固定化する方法を説明する。ROKα/ROCK-IIは、セリン/スレオニン・プロテインカイネースであることが知られている。
実施例9では、実施例1で作製したNTAセンサーチップに対して低分子化合物を作用させたときのN末端His-タグFKBPと化合物との相互作用を解析した。低分子化合物としては、FKBPに結合することが知られているFK506を用いた。
実施例10では、実施例2で作製したNTAセンサーチップに対して低分子化合物を作用させたときのN末端HisタグCOX-2と化合物との相互作用を解析した。低分子化合物としては、COX-2に結合することが知られているNS-398を用いた。
実施例11では、実施例3で作製したCM5センサーチップに対して低分子化合物を作用させたときのN末端His-タグCyclophilin Aと化合物との相互作用を解析した。低分子化合物としては、Cyclophilin Aに結合することが知られているCyclosporin Aを用いた。
実施例12では、本発明を適用して、センサーチップに対して、共有結合(アミンカップリング)及びタグ部を介してタンパク質を固定化する方法を説明する。本例では、タンパク質として、マウスIgGを用い、センサーチップとして固定化担体にnitrilotriacetic acidを導入したCM5センサーチップ(ビアコア社製、ウプサラ、スウェーデン)を用い、測定装置としてBiacore3000(ビアコア社製)を用いた。
実施例13では、実施例12で作製したCM5センサーチップに抗マウスIgGを作用させることによって、マウスIgG抗体と抗マウスIgGとの相互作用を解析した。
Claims (17)
- 固定化対象の生体分子におけるタグ部に対するタグ部結合部位を有する物質が結合され、当該生体分子に共有結合可能な反応基を有する固定化担体における、当該反応基を活性化する第1工程と、
上記第1工程の後、活性化した反応基を有する固定化担体に対して、上記固定化対象の生体分子を含む溶液を接触させる第2工程とを含み、
上記第2工程では、上記タグ部と上記タグ部結合部位との相互作用の働きで上記固定化対象の生体分子を上記固定化担体上へ濃縮させつつ、上記反応基と上記生体分子との間の共有結合及び上記相互作用により、上記生体分子を上記固定化担体に固定化することを特徴とする生体分子の固定化方法。 - 上記反応基はカルボキシル基であり、第2工程では、当該カルボキシル基と上記固定化対象の生体分子におけるアミノ基と間でアミンカップリングさせることを特徴とする請求項1記載の方法。
- 上記タグ部はヒスチジンタグであり、上記第2工程では、当該ヒスチジンタグと固定化担体との間でタグ部結合部位を有する物質を介して相互作用させることを特徴とする請求項1又は2記載の方法。
- 上記第2工程で、上記ヒスチジンタグと固定化担体との間で金属イオンキレートを介して相互作用させることを特徴とする請求項3記載の方法。
- 上記第2工程で、上記ヒスチジンタグと固定化担体との間でNi2+-nitrilotriacetic acid(Ni-NTA)を介して相互作用させることを特徴とする請求項4記載の方法。
- 上記第2工程で、当該ヒスチジンタグと固定化担体との間でNi2+-iminodiacetic acid(Ni-IDA)を介して相互作用させることを特徴とする請求項4記載の方法。
- 上記タグ部結合部位を有する物質はタグ部に対する抗体であることを特徴とする請求項1又は2記載の方法。
- 上記タグ部はヒスチジンタグであり、上記抗体は抗ヒスチジンタグ抗体であり、第2工程では、当該ヒスチジンタグと固定化担体との間で抗ヒスチジンタグ抗体を介して相互作用させることを特徴とする請求項7記載の方法。
- 上記タグ部は、天然の生体分子における特有の一部であることを特徴とする請求項1又は2記載の方法。
- 上記生体分子はタンパク質であることを特徴とする請求項1〜9いずれか1項記載の方法。
- 請求項1〜10いずれか一項記載の生体分子の固定化方法により固定化した生体分子を有する固定化担体に対して、決定対象の1種以上の低分子化合物を含む試料を作用させる工程と、
上記固定化担体に固定化された生体分子に対する、上記試料に含まれる低分子化合物の親和性及び/又は反応速度を決定する工程とを含む生体分子-低分子化合物親和性及び/又は反応速度決定方法。 - 上記親和性及び/又は反応速度を決定する工程では、表面プラズモン共鳴の原理により生体分子と低分子化合物との親和性及び/又は反応速度を決定することを特徴とする請求項11記載の方法。
- 上記生体分子はタンパク質であることを特徴とする請求項11又は12記載の方法。
- 請求項1〜10いずれか一項記載の生体分子の固定化方法により固定化したタンパク質を有する固定化担体に対して、決定対象の1種以上のタンパク質を含む試料を作用させる工程と、
上記固定化担体に固定化された1種以上のタンパク質と、上記試料に含まれる1種以上のタンパク質との親和性及び/又は反応速度を決定する工程とを含むタンパク質-タンパク質親和性及び/又は反応速度決定方法。 - 上記親和性及び/又は反応速度を決定する工程では、表面プラズモン共鳴の原理により上記試料中のタンパク質と上記固定化されたタンパク質との親和性及び/又は反応速度を決定することを特徴とする請求項14記載の方法。
- 請求項1〜10いずれか一項記載の方法により固定化された生体分子を有する固定化担体。
- 上記生体分子はタンパク質であることを特徴とする請求項16記載の固定化担体。
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