ES2378936B1

ES2378936B1 - Soportes biofuncionalizados covalentemente.

Info

Publication number: ES2378936B1
Application number: ES200931092A
Authority: ES
Inventors: María Valeria Grazú Bonavia; Jesús Martínez De La Fuente; Helene Feracci
Original assignee: Universidad de Zaragoza; Fundacion Agencia Aragonesa para la Investigacion y el Desarrollo ARAID; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Universidad de Zaragoza; Fundacion Agencia Aragonesa para la Investigacion y el Desarrollo ARAID; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 2009-12-01
Filing date: 2009-12-01
Publication date: 2013-08-13
Anticipated expiration: 2029-12-01
Also published as: WO2011067450A8; ES2378936A1; WO2011067450A3; WO2011067450A2

Abstract

Soportes biofuncionalizados covalentemente.#La presente invención se refiere a un proceso para la funcionalización orientada y covalente de un soporte con una proteína (PROT) mediante enlaces de residuos de histidina con un grupo quelante de metales con grupos, y a los soportes funcionalizados obtenidos por tal proceso.

Description

Soportes biofuncionalizados covalentemente.

La presente invención se reﬁere a un proceso para la funcionalización orientada y covalente de un soporte con una proteína (PROT), y a los soportes funcionalizados obtenidos. Por lo tanto pertenece al campo de la biomedicina.

Estado de la técnica anterior

Las superﬁcies biofuncionales son ampliamente empleadas en terapia y diagnóstico mediante ensayos celulares (Geiger et al, 2009), ingeniería tisular (Curtis & Riehle, 2001), desarrollo de biosensores (Wong et al, 2009), bioelectrónica y de manera más general para el desarrollo de dispositivos médicos (Bettinger et al., 2009; Jonkheijm et al 2008). La superﬁcie biofuncional ideal debe de ser fácil de preparar, caracterizar, sencilla de diseñar, biocompatible y eﬁcaz. En este sentido, la incorporación de biomoléculas relevantes se ha publicado con anterioridad tanto para proteínas (Thery et al, 2005), péptidos (Perret et al, 2002a), carbohidratos (Fuss et al, 2008; Schatz et al, 2009), oligonucleótidos (Weisbrod & Marx, 2008) y otros (de la Fuente et al 2006; Song et al, 2009). Varias estrategias se han seguido para la modiﬁcación química de estos biomateriales. Estas aproximaciones a la hora de funcionalizar biomateriales pueden implicar uniones covalentes o no-covalentes. Ambas aproximaciones tienen aspectos positivos y negativos. La unión covalente asegura una unión fuerte y estable entre la biomolécula y la superﬁcie, sin embargo requiere la modiﬁcación superﬁcial y no garantiza generalmente una correcta orientación de la biomolécula, sobre todo cuando se trata de moléculas complejas tales como las proteínas. Cuando se inmovilizan proteínas no modiﬁcadas por esta estrategia suelen quedar unidas a la superﬁcie de forma aleatoria. Por otro lado, las uniones inespecíﬁcas constituyen una estrategia sencilla para la biofuncionalización de superﬁcies, pero son uniones reversibles cuya estabilidad es muy dependiente de las condiciones del medio (pH, fuerza iónica, temperatura, etc.). Además, estas interacciones no controladas conducen con frecuencia a una pérdida de actividad de la proteína.

El estudio de los fenómenos de adhesión celular a biomateriales es un tema de gran interés desde un punto de vista de ingeniería tisular. Las interacciones de estas células con los materiales son capaces de modular la respuesta celular a los implantes artiﬁciales o a soportes de cultivo celular (Chen et al, 1998; Stevens & George, 2005). Es por ello que el control de la adhesión celular sobre un material polimérico es clave para el desarrollo de nuevos biomateriales con estos ﬁnes. Datos bioquímicos resaltan la necesidad de funcionalizar estos materiales con proteínas de la matriz extracelular (ECM) para promocionar la adhesión celular a través de interacciones especíﬁcas. Las células, vía integrinas, son capaces de unirse a la secuencia especíﬁca RGD presente en proteínas del ECM tales como la ﬁbronectina, vitronectina, y tromboespondina. Estas proteínas generan una red de uniones que controlan la adhesión y el crecimiento celular in vivo. Además de estas proteínas, otra familia de proteínas, las caderinas, están implicadas en estos eventos de adhesión célula-célula. Las caderinas clásicas son unas glicoproteínas transmembrana implicadas en el control de la especiﬁcidad, organización y dinámica de la adhesión celular, la cual es crucial para el desarrollo y mantenimiento de la arquitectura y función de los tejidos (Hartsock & Nelson, 2008; Larue et al, 1996; Nishimura & Takeichi, 2009). Las caderinas interaccionan con otras caderinas presentes en la superﬁcie de células vecinas a través de subdominios extracelulares repetitivos (EC1-EC5) (Patel et al, 2003; Perret et al, 2002b; Perret et al, 2004). Estas uniones adhesivas inician las señales intracelulares que controlan la organización del citoesqueleto, la polaridad celular, proliferación y apoptosis, siempre a través de mecanismos de comunicación vía caderinas-citoesqueleto (Charrase et al, 2002; van Roy & Berx, 2008). Aun no se conoce bien el papel que estas fuerzas de adhesión tienen en los procesos de señalización celular, debido sobre todo a la diﬁcultad existente en la interpretación de respuestas biológicas que implican organizaciones multimoleculares complejas y dinámicas (Thiery et al., 2003).

En las superﬁcies de los biomateriales in vitro, se puede aplicar el mismo mecanismo. Cuando materiales extraños entran en contacto con un ﬂuido biológico o con medio de cultivo celular, la respuesta inicial, es la adsorción de proteínas a la superﬁcie del material. Una vez esto ocurre, el material interacciona con las células a través de la capa de proteínas previamente adsorbida. Además la composición y estructura de esta capa de proteínas juega un papel crítico en los subsiguientes desarrollos celulares (Arulanandam et al, 2009; Dupin et al, 2009; Ganz et al, 2006; Ostuni et al, 2009).

Descripción de la invención

La presente invención se reﬁere a un proceso para la biofuncionalización de la superﬁcie de soportes que es fácil de llevar a cabo, eﬁcientemente y produciendo materiales biocompatibles. Además también se reﬁere a los soportes biofuncionalizados. En la presente invención se presenta una estrategia sencilla para la modiﬁcación de superﬁcies, por ejemplo de vidrio, usando una tecnología ya establecidas, pero cumpliendo con importantes requisitos, una correcta orientación de la biomolécula y una unión estable covalente con la superﬁcie a funcionalizar. Además esta metodología se puede extender a un amplio abanico de materiales distintos. El procedimiento de la presente invención es eﬁcaz, sencillo y directo para la preparación de superﬁcies, nanopartículas o soportes funcionalizados con proteínas unidas covalentemente a la superﬁcie y además garantizando la correcta orientación de estas proteínas sobre estos materiales. El proceso de la presente invención se podría emplear con cualquier proteína (enzimas, anticuerpos, lectinas, abzimas)

o péptidos siempre que estén modiﬁcados con una cola de polihistidinas, o que presenten una zona de su superﬁcie rica en residuo de histidinas muy expuesta al medio (en su secuencia peptídica nativa o generada por técnicas de biología molecular).

El proceso de la presente invención permite la obtención de soportes funcionalizados donde la proteína se une de forma orientada y covalente. Este proceso consiste en una unión en dos etapas: i) unión reversible y selectiva por aﬁnidad a través de la cola de polihistidinas o zona rica en residuos de histidinas por los quelatos metálicos anclados al soporte, ii) posterior reacción covalente entre grupos nucleóﬁlos (aminos, tioles, etc.), sólo de la zona de la superﬁcie proteica por donde ha ocurrido la adsorción, y grupos carboxilos del agente quelante (anclados al soporte) activados previamente por el agente activante.

Al ser el mismo grupo quelante el que luego establece la unión covalente, esta estrategia presenta ventajas sobre las que utilizan dos grupos funcionales: i) grupos quelantes para unir por aﬁnidad y ii) grupos reactivos (epóxido, aldehído, etc.) capaces de establecer una unión covalente con la proteína adsorbida (Mateo et al, 2007). La principal ventaja de esta nueva estrategia es que no se pierde capacidad de carga de la proteína a inmovilizar. Sin embargo, en el caso de soportes bifuncionales es necesario sacriﬁcar la cantidad de grupos quelantes para introducir grupos capaces de unir covalentemente a la proteína.

Si bien la unión de la proteína se establece en dos etapas, al ser el grupo capaz de establecer uniones covalentes (grupo carboxilo del quelante activado con EDC y NHS) muy reactivo, la unión covalente es muy rápida después de la adsorción de la proteína por aﬁnidad. Esto es una ventaja frente a soportes bifuncionales que contienen epóxido como grupos reactivos, dado que necesitan largas incubaciones a pH alcalinos, después de la unión de la proteína por aﬁnidad, para que se establezca la unión covalente.

Por lo tanto un primer objeto de la presente invención es un proceso para la funcionalización orientada de un soporte con una proteína (PROT), que comprende acoplar covalentemente:

a) una proteína (PROT) la cual tiene una zona rica en residuos de histidina (Hp);

b) con un soporte biofuncionalizable cuya superﬁcie se le ha unido de forma covalente un complejo quelante y este se ha cargado con un catión metálico, siendo la fórmula general:

Siendo: A el soporte; X es un átomo de oxígeno, nitrógeno o azufre; L es un grupo puente opcional entre el átomoXyel grupo B; B un grupo quelante de metales con grupos carboxílicos; M es un catión metálico, preferiblemente con valencia 2 ó superior; c) en presencia de al menos un agente activante a un pH entre4y10; para la obtención de un soporte funcionalizado de fórmula:

Otro objeto de la presente invención son un soporte funcionalizado de fórmula A-X-L-B-Hp-PROT, siendo A, X, L, B, Hp y PROT como se deﬁnen en el aspecto primero y en cada una de sus realizaciones, caracterizado porque todos los grupos están unidos por enlaces covalentes.

El tercer aspecto hace referencia a un conjunto que comprende al menos:

b) un soporte biofuncionalizable cuya superﬁcie se le ha unido de forma covalente un complejo quelante y éste se ha cargado con un catión metálico, siendo la fórmula general;

Siendo:

A el soporte;

X es un átomo de oxígeno, nitrógeno o azufre;

L es un grupo puente opcional entre el átomo de oxígeno del soporte y el grupo B;

B un grupo quelante de metales con grupos carboxílicos;

M es un catión metálico, preferiblemente con valencia 2 ó superior;

c) agente activante;

siendo la deﬁnición de los grupos la misma que para el aspecto primero y en cada una de sus realizaciones.

El último aspecto de la presente invención sería el uso del conjunto del aspecto tercero para la inmovilización de proteínas in situ.

Descripción detallada de la invención

En una realización preferida del primer aspecto después del acoplamiento con el agente activante el soporte funcionalizado se lava con un agente acoplante de metales, preferiblemente EDTA y/o imidazol, con lo que se consigue eliminar cualquier proteína no unida de forma covalente al soporte de manera sencilla.

Normalmente la etapa de acoplamiento se hace en presencia de un disolvente. La temperatura de trabajo en la reacción de acoplamiento depende de varios factores, como la estabilidad de los productos, pero suele estar entre 5 y 70ºC.

En una realización preferida se hace reaccionar entre 0,001 y 50 mg de proteína por cm2 de soporte biofuncionalizable, y más preferiblemente entre 0,1 y 2 mg de proteína por cm2. Se pueden utilizar entre 0,1 y 10000 equivalentes de agente activante por mol de proteína y preferiblemente entre 1 y 100 equivalentes de agente activante por mol de proteína.

El pH de la reacción de acoplamiento debe de estar en 4 y 10, pero se obtienen mejores resultados en los intervalos más cercanos a la neutralidad, por ejemplo a un pH entre 6 y 9, más preferiblemente entre 6,5 y 8, y aun más preferiblemente de un tampón acuoso principalmente Hepes (pH 7).

Los soportes deben constar de grupos funcionales capaces de ser derivatizados. Estos grupos son conocidos en la técnica y pueden estar ya presentes en el material de partida o introducirse mediante reacciones de derivatización. Normalmente el soporte biofuncionalizable comprende grupos en la superﬁcie tales como -OH, -NH2, -SH y -N3, preferiblemente -OH. Este -OH puede estar en forma de Si-OH, CH2OH o -COOH. Los soportes útiles para la invención son vidrio, silicio, sílica, oro, plata, carbono, soportes orgánicos, micropartículas, nanopartículas magnéticas, nanopartículas de oro, nanopartículas de sílica, nanopartículas poliméricas, dendrímeros, quantum dots, nanotubos de carbono, polisacáridos, nanopartículas de paladio, nanopartículas de platino, poliestireno, poliláctico, poliacrilamida, polimetacrilato, poliuretano, polivinilalcohol, resinas epoxiacrílicas o cualquiera de sus combinaciones. Más preferidos son vidrio, sílica, oro, plata, carbono, soportes orgánicos, micropartículas, nanopartículas magnéticas, nanopartículas de oro, nanopartículas de sílica, nanopartículas poliméricas, dendrímeros, quantum dots, nanotubos de carbono o cualquiera de sus combinaciones. Todavía más preferidos son vidrio, silicio o sílica. El oro también es un soporte interesante, así como las nanopartículas de oro. Otras nanopartículas de interés para la aplicación del presente proceso de biofuncionalización son las nanopartículas magnéticas, como las de magnetita. Los quantum dots son otro grupo de soportes preferidos. En el caso de que sea un polisacárido, preferiblemente este es agarosa.

La zona rica en residuos de histidina puede ser de diferente naturaleza. Por ejemplo ésta puede estar en la proteína (PROT) en forma de una cola de entre 2 y 14 histidinas (Hp), y preferiblemente entre 4 y 10, por su extremo carboxilo terminal o en su región oligosacarídica. Otra alternativa es por modiﬁcación de varios residuos aminoacídicos de su superﬁcie por técnicas de biología molecular, por ejemplo mutagénesis dirigida.

La proteína puede ser una caderina, un péptido, una lectina, una enzima, un anticuerpo, un minianticuerpo, una abzima, un receptor proteico o cualquiera de sus combinaciones. Entre los anticuerpos, éste puede ser antiperoxidasa. Enzimas útiles son glucosidasas, peroxidasas, lacasas, amilasas, lipasas o cualquiera de sus combinaciones. Concanavalina A es un ejemplo preferido de lectinas. Cuando se usa una caderina, preferiblemente ésta es caderina E.

Un experto en la materia claramente puede identiﬁcar los complejos quelatantes útiles para la presente invención. El artículo Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, páginas 9618 a 9647, describe diferentes grupos quelantes útiles para la presente invención. Adicionalmente el contendido total de dicho artículo, y en especial los grupos quelante y puentes, es introducido en la presente memoria por referencia. Ejemplos especíﬁcos de grupos quelantes son ácido nitrilotriacético (NTA), ácido iminodiacético (IDA), ácido aspártico carboximetilado (CM-Asp), tris(carboximetil)etilenodiamina (TED) o cualquiera de sus combinaciones. Entre los preferidos esta el ácido nitriloacético (NTA).

El grupo puente L, es opcional, por lo que en una realización particular agente quelante está directamente unido a la superﬁcie de soporte. En el caso de que exista tal grupo L, estos son conocidos en la técnica. Preferiblemente estos son los descritos en Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, páginas 9618 a 9647. Otros grupos puentes pueden ser los de la siguiente fórmula:

donde:

Y es seleccionada entre Si, C(=O), -C(OH)H-y -CH2-;

Z es seleccionada entre S, O, C(=O), -C(OH)H-, -C(OH)CH2-y -CH2-;

R1 y R2 pueden ser independientemente seleccionados entre: (CH2)a siendo “a” un numero entero entre 0 y 30, preferentemente entre 1 y 16; y (OCH2CH2)b siendo “b” un número entero entro a 0 y 100, preferentemente entre 1 y 40. En una realización particular Y es -C(OH)H-y en otra Z es -C(OH)CH2-. Los silanos, y en especial cuando el átomo de Si está directamente unido a la superﬁcie del soporte son muy utilizados en la técnica debido a facilidad de introducción y estabilidad. Evidentemente el grupo L debe de ser al menos bifuncional, y antes de introducirse debe de tener grupos reactivos capaces de reaccionar con el soporte y el agente quelante directamente o con la ayuda de otro reactivo. Por ejemplo estos grupos precursores para la formación de Y pueden ser SH, OH, Si(OH)3, Si(OMe)3, Si(OEt)3, COOH, epóxido, N3,NH2 o etilino. Por ejemplo estos grupos precursores para la formación de Z pueden ser SH, OH, COOH, epóxido, N3,NH2 o etilino.

El catión metálico se puede seleccionar entre Ni2+,Cu2+ ,Zn2+,Co2+,Mn2+,Mg2+,Ag+,Ga3+,Fe3+ ,Al3+,Zr4+,Ca2+ , Be2+ ,Mg2+,Ba2+,Ti4+,V3+,Cr2+ ,Cr3+ y cualquiera de sus combinaciones. Preferiblemente este es Ni2+,Cu2+,Zn2+ , Co2+,Mn2+ ,Mg2+,Ag+ ,Ga3+,Fe3+,Al3+,Zr4+ o cualquiera de sus combinaciones. Los más preferidos son el Ni2+ , Cu2+,Co2+ o cualquiera de sus combinaciones.

El agente de acoplamiento, o activante, en una realización preferida es Sulpho-NHS, NHS, EDC, HATU, CDI, DCC o cualquiera de sus combinaciones, preferiblemente se utiliza la combinación NHS y EDC.

En un caso particular, se han empleado superﬁcies silanizadas a las que se ha incorporado un complejo (ácido nitrilotriacético (NTA)) capaz de quelar metales. En primera instancia tiene lugar la quelación de las colas de polihistidinas a los residuos del agente quelatante empleando cationes metálicos. Ésta primera unión garantiza una alta aﬁnidad y asegura la correcta orientación de las proteínas en las superﬁcies. Sin embargo, la estabilidad de esta unión polihistidina-NTA es muy dependiente de cambios de pH, fuerza iónica etc. (Crowe et al, 1994; Schmitt et al, 1993). Para garantizar una unión estable a la superﬁcie, se lleva a cabo la segunda etapa de unir covalente en forma de amida los grupos aminos de las cadenas de histidinas y los grupos carboxilados presentes, como por ejemplo en el NTA. Las superﬁcies biofuncionales preparadas así han sido caracterizadas por microscopía de ﬂuorescencia, medidas de ángulos de contacto y XPS. Además en estudios de AFM se ha conﬁrmado la estabilidad de la unión proteínabiomaterial. Estas superﬁcies han sido también probadas como una excelente plataforma de unión adhesiva para células que presentan caderinas en su superﬁcie, conﬁrmando así el gran potencial que poseen como sistemas modelo para el estudio de interacciones caderina-caderina, así como para promover la adhesión celular en implantes artiﬁciales. Además se ha conseguido un total control en la orientación de las proteínas inmovilizadas sobre estos materiales sin afectar su conformación, función, y garantizar la plena accesibilidad del sitio activo de la proteína. Al mismo tiempo debido a que estas colas de polihistidinas constituyen una de las modiﬁcaciones más utilizadas para la puriﬁcación de proteínas recombinantes, este método proporciona las bases para el desarrollo de un gran número de aplicaciones para el estudio de problemas a nivel de moléculas individuales así como para nanobiotecnología. También se consiguió una unión covalente y estable de la proteína sobre la superﬁcie del material, sin que sea dependiente de condiciones externas, y asegurando la perfecta orientación de la proteína. Esta funcionalización en los materiales les conﬁeren un gran potencial en el desarrollo de nuevos biomateriales.

En una de las realizaciones de preferidas del segundo aspecto el soporte funcionalizado es obtenible por cualquiera de los procesos como se deﬁnen en el aspecto primero y en cada una de sus realizaciones.

Los soportes una vez biofuncionalizados puede tener diferentes usos ﬁnales. Por ejemplo estos pueden ser un biochip, un implante, un scaffold 3D, un biosensor basados en superﬁcies, nanopartículas o nanotubos de carbono biofuncionalizados, sistemas de separación basados en partículas magnéticas, sistemas de separación basados en partículas de metales nobles, columnas de puriﬁcación, microarrays, biorreactor, sistemas de liberación de fármacos (basados en partículas y dendrímeros) y agentes de contraste basados en nanopartículas magnéticas. Los más preferidos es cuando el soporte biofuncionalizado es un biochip, un implante, biosensores basados en superﬁcies, nanopartículas o nanotubos de carbono biofuncionalizados, sistemas de separación basados en partículas magnéticas, microarrays y sistemas de liberación de fármacos (basados en partículas y dendrímeros).

Deﬁniciones

Por soporte biofuncionalizable en el contexto de la presente invención se reﬁere a un material que comprende grupos capaces de ser funcionalizados en la superﬁcie. Estos grupos funcionalizables pueden estar ya en el soporte en si, o haber sido introducidos por derivatización del soporte. Ejemplos preferidos de estos grupos funcionalizables son -OH, -CO2H, -NH2, -SH y -N3, preferentemente -OH (como el SiOH. -CH2OH o el -CO2H). Este material incluye pero no está limitado a vidrio, silicio, sílica, oro, plata, carbono, soportes orgánicos, micropartículas, nanopartículas magnéticas, nanopartículas de oro, nanopartículas de sílica, nanopartículas poliméricas, dendrímeros, quantum dots, nanotubos de carbono y polisacáridos.

Grupos puente L se entiende todo grupo bifuncional que sea introducido mediante un derivado de L capaz de reaccionar en uno de sus extremos con la superﬁcie, y por su otro extremo con un grupo quelante.

Grupo quelante B se entiende a un compuesto químico capaz de unirse al grupo puenteLyquelar cationes metálicos.

Las polihistidinas útiles para la presente invención son oligopéptidos de histidina, y comprenden, pero no están limitadas a, entre2y14histidinas, y preferiblemente entre4y10.

Por proteína (PROT) capaz de ser unida a estos soportes biofuncionalizados se entiende una proteína con una zona rica en residuos de histidina (al menos 2 residuos de histidina). Una forma de generar esta zona rica en residuos de histidina es introducir una cola de polihistidinas (Hp) por el extremo carboxilo terminal de la secuencia peptídica (por técnicas de biología molecular) o en su región oligosacarídica (por modiﬁcación química). También puede ocurrir que esta zona rica en residuos de histidina exista naturalmente en la estructura primaria de la proteína (IgG, proteínas de fusión de virus envueltos, histatinas, proteínas knob, glicoproteínas, proteínas de membrana, proteínas priónicas) o ser introducida por modiﬁcación de varios residuos aminoacídicos de su superﬁcie por técnicas de biología molecular (mutagénesis dirigida, etc.).

Caderinas son las glicoproteínas transmembranales de monopaso de uniones homofílicas responsables de las uniones célula-célula para mantener la integridad de los tejidos animales. Es una molécula de unos 700-750 aminoácidos, y son especíﬁcas de tipo celular. Crean uniones homofílicas dependientes de Ca2+. Hay diferentes tipos de caderinas.

1º Caderinas clásicas o tradicionales: Existen varios tipos de caderinas y siendo las más representativas:

*: Caderina-E (ivomorulina). Presente en hígado, en los epitelios y en el embrión de mamíferos antes de su nidación en el útero.

*: Caderina-N. En células nerviosas, corazón, músculo esquelético, ﬁbroblastos y en células del cristalino.

*: Caderina-P. Epidérmica, placentaria y en algunos organismos en tejidos embrionarios.

*: Caderina-V. Presente en células epiteliales que revisten los vasos sanguíneos.

2º Caderinas noclásicas o no tradicionales:

*: Demogleína y desmocolina. Aparecen en células epiteliales de la piel (en desmosomas).

*: Caderina-T. Aparece en neuronas y en células musculares.

*: Protocaderina. Aparecen en neuronas.

Descripción de las ﬁguras

Figura 1a: Activación del soporte de vidrio con epoxisilano y posterior funcionalización con NTA.

Figura 1b: Unión covalente y orientada de fragmentos de caderinas con colas de histidinas sobre superﬁcies con NTA. Los fragmentos de caderinas con las colas de hexahistidinas fueron primero inmovilizadas mediante la conocida tecnología de Ni-NTA de una manera orientada. Entonces las proteínas fueron unidas de manera covalente a los grupos carboxilo de los grupos NTA mediante EDC/NHS.

Figura 2: Inmunodetección de los fragmentos de caderinas unidos covalentemente a las superﬁcies con NTA. La microscopía confocal de los soportes de vidrio covalentemente (a) o no-covalentemente (b) funcionalizadas con los fragmentos de caderinas con hexa-histidinas. Ambos tipos de superﬁcies fueron tratados con imidazol/EDTA para eliminar las proteínas unidas de manera no covalente. Finalmente, los soportes de cristal cubiertos la mitad con (+) y la otra mitad sin (-) indican el marcaje especíﬁco (c). Barra de escala = 50 μm.

Figura 3: Análisis de microscopía de fuerzas atómicas dinámica de superﬁcies, (a) La cobertura de la proteína unida covalentemente es de alrededor del 80%, con un altura de la cobertura de una molécula individual (9 nm), como se muestra en el perﬁl. La cobertura de la proteína unida no-covalentemente (b) es cerca del 15%, con una altura correspondiente a una molécula individual. Aumentando poco a poco la fuerza de interacción entre la punta y la muestra de la muestra con proteína unida de manera no-covalente, la proteína se elimina fácilmente, como se puede observar en la ﬁgura d. La ﬁgura c muestra la superﬁcie control de la muestra NTA+Ni. La muestra presenta un perﬁl plano con pocos ˚

A de altura.

Figura 4: La dinámica de la adhesión celular depende de la biofuncionalización de la superﬁcie. Las células HC11 fueron incubadas durante diferentes tiempos de incubación sobre las superﬁcies de vidrio cubiertas con NTA y decoradas covalentemente o no con fragmentos de caderinas, como se indica en las imágenes. Los contactos adhesivos se observan claramente mediante las imágenes del microscopio electrónico de barrido.

Figura 5: Se permitió a las células HC11 adherirse a superﬁcies cubiertas con NTA (d, e, f) o E-caderinas (a, b, c) durante1h30en ausencia de suero. Las células fueron entonces ﬁjadas, permeabilizadas, marcadas para caderinas (a, d), actina (b, e) y DNA (c, f) y observadas por microscopía confocal. En las superﬁcies de caderinas, muchas células están bien extendidas y presentan un gran número de prolongaciones de membrana implicando contactos de caderinas. Las ﬁbras de actinas muestran una organización radial típica debida a las uniones de caderinas. Se observan muy pocos contactos en las superﬁcies de NTA (d, e, f). Las secciones ortogonales en los ejes x-z e y-z muestran diferencias claras sobre la adhesión y altura de las células en las diferentes superﬁcies. Las células redondeadas y las extendidas tienen entre 13-15 y 6-8 μm de altura respectivamente. Barra de escala 15 μm.

Ejemplos

Materiales

El agua empleada en las reacciones y para las etapas de lavado se ha obtenido a través de un sistema de puriﬁcación de agua MILLI-Q A10 de Millipore.

Para la activación de los soportes de vidrio, se ha empleado ácido sulfúrico (ACS, 95-98%) y peróxido de hidrógeno (30%) de Sigma-Aldrich.

Para la funcionalización de los soportes de vidrio se ha empleado NTA-NH2, (3-glycidiloxipropil)trimetoxisilano (>98%), ácido N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacético (>97%, TLC), tolueno seco (99,8%), carbonato de sodio (>99%) y bicarbonato sódico (99,7%) fueron dispensados por Sigma-Aldrich.

Para la inmovilización de proteínas, se empleó cloruro de níquel II hexahidrato, Hepes (>99,5%), hidrocloruro de N-(3-dimetilaminopropil)-N’-etilcarbodiimida cristalino, imidazol (ACS, >99%) de Sigma-Aldrich. N-hidroxisuccinimida (>97%) fue obtenido de Fluka. Cloruro sódico (ultrapuro, 5 M) de Gibco. Etilendiaminotetraacético (EDTA, >99%) fue obtenido de Panreac.

Para la microscopía electrónica de barrido, se empleó glutaraldehido (25% en agua) y hexametildisilazano (HDMS, >99%) suministrado por Sigma-Aldrich. Cacodilato sódico y tetróxido de osmio fueron suministrados por Agar Scientiﬁc. Ácido tánico ha sido distribuido por Fluka. Metano (Spectranal, >99%) se obtuvo de Riedel-de Haën. Acetato de uranilo se obtuvo de Eloïse SARL.

Para la inmunoquímica, se empleó formaldehido, Tritón X-100 y seroalbúmina de vaca (BSA) suministrada por Sigma-Aldrich. Los anticuerpos monoclonales anti-E-caderina fueron suministrados por BD Biosciences. El anti-betacatenina de ratón se suministró por Interchim.

Todos los reactivos se han usado tal como llegaron.

Activación de los soportes de vidrio

Los soportes de vidrio fueron lavados con solución piraña (H2SO4 y 30% H2O2 3:1) durante 30 min. a temperatura ambiente (RT). Los vidrios fueron lavados varias veces con agua milli-Q y secados bajo una corriente de nitrógeno.

Funcionalización de los soportes de vidrio con ácido N-(5-amino-1-carboxipentil)iminoacético (NTA-NH2)

Una disolución al 2% de 3-(2,3-epoxipropoxi)propiltrimetoxisilano en tolueno seco fue añadida a temperatura ambiente solo los soportes previamente activados y se dejó reaccionar durante una noche. Después de lavar abundantemente con tolueno y con una disolución 10 mM de tampón carbonato pH 10,8, los soportes de vidrio se incubaron durante una noche a temperatura ambiente con una disolución 25 mM de NTA-NH2 en tampón carbonato a pH 10,8. Los soportes se lavaron y secaron después.

Expresión y puriﬁcación de los fragmentos de caderinas (E/EC12) marcadas con hexahistidina

El fragmento extracelular de E-caderina de ratón (MIERG-E/EC12) correspondiente a los dos módulos más externos de la caderina han sido modiﬁcadas en su extremo C-terminal con una etiqueta de hexahistidinas siguiente protocolos previamente descritos (Courjean et al, 2008). Brevemente, la secuencia IEGR se ha introducido en el plásmido del fragmento de caderina, para obtener la correcta unión del fragmento de caderina en el término N-ter. Para la producción de la proteína quimera, 500 mL de Terriﬁc Broth suplementado con 50 ug/mL de kanamicina fue inoculado con una colonia transformada y síntesis de proteínas inducida por IPTG. Las células se resuspendieron después en buffer de lisis (4 M urea, 50 mM Na2HPO4 (pH 7,8), 20 mM imidazol, y 20 mM beta-mercaptoetanol). El lisado resultante fue lavado por centrifugación y el sobrenadante fue incubado durante 2 h con Ni-NTA Superﬂow resinas de agarosa (Qiagen). Esta resina fue ampliamente lavada y dializada frente a PBS. La digestión de la proteasa de factor Xa (Qiagen) de MIEGR-E/EC12 fue obtenido durante 60 h a 16ºC. Para ﬁnalizar este proceso se eliminó al enzima de la disolución con Xa Removal Resin (Qiagen). Finalmente los fragmentos E/EC12 resultantes fueron dializados frente a 20 mM Hepes y 150 mM NaCl (pH 7) para eliminar los iones Ca2+ y el péptido. La pureza de la proteína fue comprobada por SDS-PAGE, Western blotting y espectrometría de masas.

Inmovilización de proteínas

Las superﬁcies de NTA fueron entonces incubadas con una disolución acuosa de NiCl2 para formar el medio de complejación para los grupos hexahistidinas. El fragmento de caderina (0,1 mg/mL) fue incubado a temperatura ambiente durante1hylas superﬁcies fueron lavadas con 150 mM NaCl, 20 mM Hepes (pH 7,0).

Los fragmentos de caderinas fueron conjugados a los soportes de cristal mediante la reacción covalente entre los grupos carboxílicos del NTA con los grupos amino de las proteínas, empleando 50 mM EDC, 75 mM NHS, 20 mM Hepes (pH 7) durante 45 min a temperatura ambiente.

Las proteínas no unidas covalentemente se han eliminado empleando 1 M imidazol, 10 mM EDTA en 150 mM NaCl Hepes 20 mM (pH 7,5). Las muestras se lavaron abundantemente con 150 mM NaCl, 20 mM Hepes (pH 7).

Medidas de ángulos de contacto

Las medidas de ángulos de contacto se llevaron a cabo usando un equipo de gota comercial (Krüss, Alemania). Agua MilliQ (3 μL) se ha añadido sobre cada superﬁcie usando una jeringa Hamilton a 25ºC. Se han realizado tres medidas por muestras y el ángulo de contacto se calculó empleando el Sessile Drop Fitting Method.

X-ray Photoelectro Spectroscopy (XPS)

Las medidas de XPS se han realizado empleando un ESCALAB 220-iXL (Thermo-Electron, VG Company). La fotoemisión fue estimulada por una radiación monocromatizada Al Kα (1486,6 eV). Un área de cerca de 150 μmde diámetro fue analizada para cada muestra.

Caracterización por AFM

Los análisis de microscopía de fuerzas atómicas se han desarrollado usando un instrumento comercial (www.nanotec.es) trabajando en modo dinámico en líquidos (PBS+Ca2+ o agua milli-Q). Para caracterizar las muestras con unión covalente de caderinas se ha empleado una micropalanca con una constante de fuerzas nominal de 2,8 N/m (www.nanosensors.com). Para obtener las imágenes de las superﬁcies funcionalizadas con caderinas no unidas covalentemente, se han empleado micropalancas más suaves con constantes de fuerza de 0,03 N/m (BioLevers, www.olympus.com).

Cultivo celular

Las células epiteliales mamarias de ratón HC11 han sido previamente descritas (Wojcik et al, 2006) y han sido suministradas por Dr. L. Raptis (Kingston, ON Canada). Estas células han sido empleadas para los ensayos de unión de las células sobre las superﬁcies cubiertas con caderinas. Las células crecieron en RPMI (Gibco) suplementado con 10% FCS, 100 U/mL penicilina G, y 100 mg/mL de estreptomicina, insulina, EGF. El cultivo celular se mantuvo a 37ºC en una atmósfera húmeda y al 5% de CO2.

Para los ensayos de adhesión celular, las muestras cubiertas con caderinas fueron cultivadas en un plato de cultivo de 24 pocillos. Las células fueron sembradas sobre las superﬁcies funcionalizadas a la densidad de 1,2x106 células/mL y cultivadas durante 2 h 30 min. Para cada periodo de cultivo (0,5, 1, 1,5 y 2,5 h), las muestras fueron retiradas y colocadas en un nuevo plato de cultivo.

Microscopía electrónica de barrido

Las células cultivadas sobre los cristales tratados e incubados con células, fueron lavados previamente con tampón cacodilato y las células fueron ﬁjadas con 2,5% glutaraldehído (Sigma) en 0,1 M de cacodilato pH 7,4 durante 90 min a 4ºC. Las muestras fueron tratadas con 1% de tetróxido de osmio, 1% ácido tánico y después deshidratadas con una serie de baños en agua/metanol, marcados con 2% de acetato de uranilo en un 70% metanol antes del lavado crítico con HMDS. Las muestras fueron después cubiertas con oro y observadas en un Jeol JSM 6700F Field Emission Microscopio electrónico de barrido trabajandoa5kV.

Inmunoquímica

Las células HC11 fueron sembradas sobre cubres a una densidad subconﬂuente e incubadas durante diferentes periodos de tiempo. Las células se ﬁjaron entonces en 4% formaldehído en PBS durante 20 min, permeabilizadas con 0,2% Tritón X-100 en PBS durante 5 min, lavadas en PBS, bloqueadas durante 10 min en PBS conteniendo 0,2% BSA, y marcadas con los anticuerpos apropiados. Las células fueron entonces incubadas durante 1 h con anticuerpos primeros, lavados e incubados con anticuerpos secundarios durante 1 h. Anticuerpos monoclonales anti-E-cadherina (BD Biosciences) y anti-b-catenina de ratón (clon 14, Transduction Laboratories, Interchim) se han empleado a la dilución de 1:25 y 1:100 respectivamente en PBS conteniendo 0,2% BSA. Las imágenes obtenidas con el microscopio confocal (Leica DMR TCS SP2 AOBS9).

Soportes de vidrio modiﬁcados con ácido nitriloacético (NTA)

El vidrio ha sido utilizado como material modelo muy ampliamente para su uso en cultivo celular. El primer paso de esta funcionalización es eliminar los residuos orgánicos presentes sobre la superﬁcie del vidrio, en orden de que la superﬁcie quede completamente cubierta de grupos epoxisilanos, como se ha descrito en la parte experimental. Como se muestra en el Figura 1a, hemos empleado un método en dos pasos: i) primero, cubierta del soporte de vidrio con 3-(2,3-epoxipropoxi)-propiltrimetoxisilano; ii) unión, a través de grupos epóxidos del ácido (S)-N-(5-amino-1carboxipentil)iminodiacético (NTA-NH2). La incorporación de los epoxisilanos se desarrolló empleando tolueno seco para evitar la polimerización de los silanos. Los grupos epóxidos sobre la superﬁcie garantizan una reacción eﬁcaz con el grupo amino del NTA a pH básico (pH 10,8). A este pH, el amino del NTA fácilmente abre los grupos epoxi. Finalmente, las muestras fueron incubadas con una disolución 100 mM NiCl2 para quelar los iones metálicos sobre el grupo NTA.

Las medidas de ángulos de contacto se han llevado a cabo para monitorizar la funcionalización. Estos datos pueden proporcionar información muy útil sobre la estructura y composición de la superﬁcie. Después de lavar las muestras de vidrio con solución piraña, el ángulo de contacto cambió de 62º a cerca de 0º debido a la aparición de grupos hidroxilos sobre la superﬁcie del cristal usando estas condiciones oxidativas. Después de la etapa de silanización usando 3-(2,3epoxipropoxi)propiltrimetoxisilano, el ángulo de contacto cambia a 54º. Finalmente, la incorporación de los grupos NTA originó una disminución del ángulo de contacto a 36º debido a la aparición de los grupos carboxílicos sobre la superﬁcie del cristal y por lo tanto al aumento de la hidroﬁcidad de la superﬁcie.

Inmovilización de las proteínas derivatizadas con grupos hexahistidinas

Una manera muy común de puriﬁcar proteínas recombinantes es empleando un grupo polihistidinas, e inmovilizarlas a soportes derivatizados con los grupos Ni-NTA. Nosotros hemos empleado esta estrategia para unir fragmentos de caderinas recombinantes con el grupo 6xHis a las superﬁcies de vidrio (ﬁgura 1b). La orientación de las proteínas sobre el soporte vendrá dado por la posición de las histidinas en la secuencia de las proteínas. Los grupos amino de las colas de polihistidinas o de las caderinas en las proximidades de la superﬁcie, son después unidas covalentemente con los grupos carboxilos de los NTA mediante EDC/NHS, dando lugar a un método sencillo y novedoso para unir proteína derivatizadas con 6xHis de una manera orientada y covalente. Se empleó una mezcla de EDTA/imidazol para eliminar los iones Ni2+, y por lo tanto eliminar las proteínas unidas de manera no-covalente (ﬁgura 2a, b).

Para evaluar la eﬁcacia en la unión de caderinas, hemos tapado la mitad de un soporte de vidrio con un trozo de PDMS limpio y fresco. Los fragmentos de caderinas fueron incubados en la zona no tapada, y tratadas para asegurar una unión covalente, tal y como se ha descrito previamente. La proteína presente en la superﬁcie se visualizó mediante inmunoﬂuorescencia usando un anticuerpo anti-caderina marcado ﬂuorescentemente y un microscopio confocal. Como se muestra en la Figura 2c, los fragmentos de caderinas se detectaron solo en la correspondiente mitad del soporte de vidrio.

El análisis de XPS se desarrolló para determinar la composición elemental para cada paso de modiﬁcación empleado en este estudio. El análisis conﬁrmó el acoplamiento del NTA a la superﬁcie del cristal (aumento de C y N) y la incorporación de caderina (aumento deCyN) (tabla 1).

Microscopía de fuerzas atómicas (AFM) ha conﬁrmado la formación de uniones covalentes usando esta estrategia, evaluando la fuerza de unión, a nivel de molécula individual, a la superﬁcie del soporte. La ﬁgura 3a muestra una imagen de la superﬁcie con caderinas covalentemente unidas a las superﬁcies. La cubierta de la superﬁcie con proteínas es alta (en torno al 80% del área superﬁcial) y muestra la altura esperada con respecto a las superﬁcies solo funcionalizadas con NTA-Ni2+ (8-9 nm) como se muestra en el perﬁl. Además, cuando se intentó visualizar las muestras funcionalizadas con proteínas unidas no de forma covalente, la micropalanca terminaba por retirar a las proteínas de la superﬁcie incluso realizando una mínima fuerza. De hecho no se consiguió visualizar a las proteínas en estas muestras (Figura 3b) hasta que no se empleó una micropalanca 100 veces más blanda que la usada para las muestras covalentes. En esta muestra, con unión no covalente, se ha observado una menor cubierta (alrededor del 15%) y con la altura de la proteína esperada (8-9 nm).

Adhesión de células a soportes de vidrio biofuncionalizados

Las caderinas son proteínas que participan en las uniones célula-célula, especialmente en los mecanismos especíﬁcos de adhesión celular mediado por las interacciones homofílicas que establecen y las cuales deﬁnen la selectividad célula-célula. Nosotros elegimos el fragmento de E-caderina E/EC12 para cubrir nuestra superﬁcie porque promueve la adhesión de las células HC11, las cuales también expresan E-caderinas.

Con este propósito, sembramos células HC11, una línea celular mamaria de ratón, sobre las superﬁcies de vidrio modiﬁcadas o no con nuestros fragmentos de E-caderinas de ratón y seguimos sus cinéticas de unión desde 30 min hasta2h30 min. Mediante observación con un microscopio de contraste de fase después de 30 min, las células parecen que se adhieren ampliamente a las superﬁcies. La densidad de células fue baja en este punto y se observó como creció con el tiempo.

Después se investigó la inﬂuencia de la superﬁcie de caderinas sobre el desarrollo celular. Se observó que las células depositadas sobre las muestras con caderinas, redondeadas al principio, fueron desarrollando extensiones de membrana con el tiempo. Estas extensiones son mucho menos numerosas en la muestra control solo con NTA. Para obtener más información sobre estos contactos células-superﬁcies, se estudió la morfología celular empleando un microscopio electrónico de barrido (SEM). Después de distintos tiempos de incubación, las células fueron ﬁjadas con glutaraldehído y tratadas con agentes de contraste. Como se muestra en la ﬁgura 4, los análisis a altos aumentos revelan que después de 30 min sobre las superﬁcies funcionalizadas con caderinas, las células comienzan a establecer contactos con numerosas extensiones de membrana. Después de 1 hora de incubación, aunque la mayoría de las células fueron aún redondas, nosotros pudimos también observar que alguna se adhirieron de manera más fuerte a las superﬁcies.

Después de 1 h 30 y 2 h 30, muchas células estaban bien adheridas de manera fuerte a las superﬁcies. Como se muestra en la Figura 4, las células respondieron a nuestras superﬁcies decoradas con caderinas con grandes extensiones de membranas, visible después de 2 h 30, indicando que las células interaccionan fuertemente con el sustrato. Las células en los soportes control sin caderinas se comportaron de manera muy diferente. Después de 2 h 30, se encontraron muy pocas células adheridas, y la mayoría de ellas tenían forma circular. Un zoom de estas células mostró que no había presentes extensiones de membranas en estos casos.

Se empleó también un microscopio confocal para obtener mayor información. Se compararon la distribución de Ecaderinas y actinas en las células adheridas HC11 sobre las superﬁcies con caderinas unidas covalentemente (ﬁgura 5). Observamos que después de 1 h 30 una topografía similar a la obtenida por SEM: cuando las células se cultivan sobre superﬁcies con caderinas, muchas células HC11 estaban bien adheridas y muy pocas adoptan formas circulares. Sobre estas células adheridas, la distribución de actina del citoesqueleto fue más densa en la periferia celular mientras que las caderinas fue más uniformemente distribuida sobre la superﬁcie de las células. Sobre las pocas células adheridas con forma esférica encontradas sobre las superﬁcies con caderinas (ﬁgura 5b), el marcaje ﬂuorescente mostró que las ﬁbras de actina formaban una red circular de ﬁlamentos rodeando el núcleo celular, junto con ﬁbras radiales conectadas directamente con los extremos celulares, tal y como había sido descrito previamente (Gavard et al, 2004). En el plano X-Z y Y-Z, las caderinas fueron distribuidas sobre las áreas de contacto sobre las células adheridas, y formando clusters sobre las células redondeadas.

Como se observó por SEM, las células no se adhirieron a substratos sin caderinas. Casi todas las células estaban redondeadas con una distribución de caderinas uniforme (ﬁgura 5d, e, f). Las ﬁbras de actina, no formaron patrones de citoesqueleto típicos controlados por caderinas (ﬁgura 5b). Finalmente las secciones X-Z y Y-Z mostraron que las caderinas con tienen una localización preferencial y que la distribución de actina es uniforme alrededor de las células, delimitando sus perﬁles.

Tabla 1: Resultados de XPS. Las muestras limpias, silanizadas y cubiertas con NTA. Estas superﬁcies fueron entonces funcionalizadas con los fragmentos de caderinas E/EC12 con colas de hexahistidinas, covalente o no covalentemente unidas. Tras la incubación las superﬁcies fueron lavadas con [imidazol 1 M/EDTA 10 mM], para eliminar las proteínas unidas no-covalentemente de las superﬁcies.

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Un proceso para la funcionalización orientada de un soporte con una proteína (PROT), que comprende acoplar covalentemente:

a) una proteína (PROT) la cual tiene una zona rica en residuos de histidina (Hp);

b) con un soporte biofuncionalizable cuya superﬁcie se le ha unido de forma covalente un complejo quelante y este se ha cargado con un catión metálico, siendo la fórmula general:

Siendo: A el soporte; X es un átomo de oxígeno, nitrógeno o azufre; L es un grupo puente opcional entre el átomoXyel grupo B; B un grupo quelante de metales con grupos carboxílicos; M es un catión metálico, preferiblemente con valencia 2 ó superior; c) en presencia de al menos un agente activante a un pH entre4y10; para la obtención de un soporte funcionalizado de fórmula:
2.

El proceso según la reivindicación 1, caracterizado porque después del acoplamiento con el agente activante el soporte funcionalizado se lava con un agente acoplante de metales, preferiblemente EDTA y/o imidazol.
3.

El proceso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la etapa de acoplamiento se hace en presencia de un disolvente.
4.

El proceso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la etapa de acoplamiento se lleva a cabo a una temperatura entre 5 y 70ºC.
5.

El proceso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se hace reaccionar entre 0,001 y 50 mg de proteína por cm2 de soporte biofuncionalizable, preferiblemente entre 0,1 y 2 mg de proteína por cm2.
6.

El proceso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende entre 0,1 y 10000 equivalentes de agente activante por mol de proteína, preferiblemente entre 1 y 100 equivalentes de agente activante por mol de proteína.
7.

El proceso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la etapa de acoplamiento se lleva a cabo a un pH entre 6 y 9, preferiblemente entre 6,5 y 8, más preferiblemente de un tampón acuoso principalmente Hepes (pH 7).
8.

El proceso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el soporte biofuncionalizable comprende grupos en la superﬁcie tales como -OH, CHO, epóxidos, -NH2,-SHy-N3, preferentemente -OH.
9.

El proceso según la reivindicación anterior, caracterizado porque el soporte biofuncionalizable es vidrio, silicio, sílica, oro, plata, carbono, soportes orgánicos, micropartículas, nanopartículas magnéticas, nanopartículas de oro, nanopartículas de sílica, nanopartículas poliméricas, dendrímeros, quantum dots, nanotubos de carbono, polisacáridos, nanopartículas de paladio, nanopartículas de platino, poliestireno, poliláctico, poliacrilamida, polimetacrilato, poliuretano, polivinilalcohol, resinas epoxiacrílicas o cualquiera de sus combinaciones.
10.

El proceso según cualquiera de las dos reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el soporte biofuncionalizable es vidrio, sílica, oro, plata, carbono, soportes orgánicos, micropartículas, nanopartículas magnéticas, nanopartículas de oro, nanopartículas de sílica, nanopartículas poliméricas, polisacáridos, dendrímeros, quantum dots, nanotubos de carbono o cualquiera de sus combinaciones.
11.

El proceso según cualquiera de las reivindicaciones8a10, caracterizado porque el soporte biofuncionalizable es vidrio, silicio o sílica.
12.

El proceso según cualquiera de las reivindicaciones8a10, caracterizado porque el soporte biofuncionalizable es oro.
13.

El proceso según cualquiera de las reivindicaciones8a10, caracterizado porque el soporte biofuncionalizable es nanopartículas de oro.
14.

El proceso según cualquiera de las reivindicaciones8a10, caracterizado porque el soporte biofuncionalizable es nanopartículas magnéticas.
15.

El proceso según cualquiera de las reivindicaciones8a10, caracterizado porque el soporte biofuncionalizable es quantum dots.
16.

El proceso según cualquiera de las reivindicaciones8a10, caracterizado porque el soporte biofuncionalizable es agarosa.
17.

El proceso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la zona rica en residuos de histidina de la proteína (PROT) ha sido introducida en forma de una cola de entre 4 y 10 histidinas (Hp) por su extremo carboxilo terminal o en su región oligosacarídica.
18.

El proceso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque la zona rica en residuos de histidina de la proteína (PROT) ha sido introducida por modiﬁcación de varios residuos aminoacídicos de su superﬁcie por técnicas de biología molecular, por ejemplo mutagénesis dirigida.
19.

El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizado porque la proteína es una caderina, un péptido, una lectina, una enzima, un anticuerpo, un minianticuerpo, una abzima, un receptor proteico o cualquiera de sus combinaciones.
20.

El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado porque el anticuerpo es antiperoxidasa.
21.

El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado porque la enzima es glucosidasa, peroxidada, lacasa, amilasa, lipasa o cualquiera de sus combinaciones.
22. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado porque la lectina es concanavalina

A.
23.

El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado porque la proteína es una caderina, preferiblemente caderina E.
24.

El proceso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el complejo quelante es ácido nitriloacético (NTA), ácido iminodiacético (IDA), ácido aspártico carboximetilado (CM-Asp), tris(carboximetil) etilenodiamina (TED) o cualquiera de sus combinaciones.
25.

El proceso según la reivindicación anterior, caracterizado porque el complejo quelante es ácido nitriloacético (NTA).
26.

El proceso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el agente quelatante está directamente unido a la superﬁcie de soporte.
27.

El proceso según cualquiera de las reivindicaciones1a25, caracterizado porque hay un grupo puente L.
28.

El proceso según la reivindicación anterior, caracterizado porque L es un grupo de fórmula:

donde:

Y es seleccionada entre Si, C(=O), -C(OH)H-y -CH2-;

Z es seleccionada entre S, O, C(=O), -C(OH)H-, -C(OH)CH2-y -CH2-;

R1 y R2 pueden ser independientemente seleccionados entre: (CH2)a siendo “a” un numero entero entre 0 y 30, preferentemente entre 1 y 16; y (OCH2CH2)b siendo “b” un número entero entroa0y 100, preferentemente entre 1 y
40.
29.

El proceso según la reivindicación 28, caracterizado porque Y es -C(OH)H-,
30.

El proceso según la reivindicación 28, caracterizado porque Z es -C(OH)CH2-.
31.

El proceso según la reivindicación 28, caracterizado porque L comprende un silano y el átomo de Si está directamente unido a la superﬁcie del soporte.
32.

El proceso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el catión metálico es Ni2+ , Cu2+,Zn2+,Co2+,Mn2+,Mg2+,Ag+,Ga3+,Fe3+,Al3+,Zr4+,Ca2+,Be2+,Mg2+,Ba2+,Ti4+,V3+,Cr2+,Cr3+ o cualquiera de sus combinaciones.
33.

El proceso según la reivindicación anterior, caracterizado porque el catión metálico es Ni2+,Cu2+,Zn2+,Co2+ , Mn2+ ,Mg2+,Ag+,Ga3+,Fe3+,Al3+ ,Zr4+ o cualquiera de sus combinaciones.
34.

El proceso según la reivindicación anterior, caracterizado porque el catión metálico es Ni2+,Cu2+,Co2+ o cualquiera de sus combinaciones.
35.

El proceso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el agente activante es Sulpho-NHS, NHS, EDC, HATU, CDI, DCC o cualquiera de sus combinaciones, preferiblemente NHS y EDC.
36.

Un soporte funcionalizado de fórmula A-X-L-B-Hp-PROT, siendo A, X, L, B, Hp y PROT como se deﬁnen en las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque todos los grupos están unidos por enlaces covalentes.
37.

El soporte funcionalizado según la reivindicación anterior, obtenible por cualquiera de los procesos como se deﬁnen en las reivindicaciones1a35.
38.

El soporte según cualquiera de las dos reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el soporte es un biochip, un implante, un scaffold 3D, un biosensor basados en superﬁcies, nanopartículas o nanotubos de carbono biofuncionalizados, sistemas de separación basados en partículas magnéticas, sistemas de separación basados en partículas de metales nobles, columnas de puriﬁcación, biorreactor, microarrays, sistemas de liberación de fármacos (basados en partículas y dendrímeros) y agentes de contraste basados en nanopartículas magnéticas.
39.

El soporte según cualquiera de la reivindicación anterior, caracterizado por que el soporte es un biochip, un implante, un biosensores basados en superﬁcies, nanopartículas o nanotubos de carbono biofuncionalizados, sistemas de separación basados en partículas magnéticas, microarrays y sistemas de liberación de fármacos (basados en partículas y dendrímeros)
40. Un conjunto que comprende al menos:

a) una proteína (PROT) la cual tiene una zona rica en residuos de histidina (Hp);

b) un soporte biofuncionalizable cuya superﬁcie se le ha unido de forma covalente un complejo quelante y este se ha cargado con un catión metálico, siendo la fórmula general;

Siendo: A el soporte; X es un átomo de oxígeno, nitrógeno o azufre; L es un grupo puente opcional entre el átomo de oxígeno del soporte y el grupo B; B un grupo quelante de metales con grupos carboxílicos; M es un catión metálico, preferiblemente con valencia 2 ó superior; c) agente activante; siendo la deﬁnición de los grupos la misma que para las reivindicaciones anteriores.
41. Uso del conjunto deﬁnido en la reivindicación anterior para la inmovilización de proteínas in situ.

OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

N.º solicitud: 200931092

ESPAÑA

Fecha de presentación de la solicitud: 01.12.2009

Fecha de prioridad:

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

51 Int. Cl. : G01N33/543 (2006.01)

DOCUMENTOS RELEVANTES

Categoría

56 Documentos citados Reivindicaciones afectadas

X

WO 2004046724 A1 (BIACORE AB, REVERSE PROTEOMICS RES INST CO) 03.06.2004, ejemplos prácticos 1-13. 1-41

X

US 2009098568 A1 (YAMADA TSUYOSHI et al.) 16. 04.2009, ejemplos 1-3; párrafo 96. 1-41

A

FICK, J., WOLFRAM, T., BELZ, F., et al. Surface-Specific Interaction of the Extracellular Domain of Protein L1 with Nitrilotriacetic Acid-Terminated Self-Assembled Monolayers. Langmuir, 9.10.2009 (publicación on line), Vol 26, Nº 2, Introducción y figura 1b. 17,23

Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud

El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones • para las reivindicaciones nº:

Fecha de realización del informe 30.03.2012

Examinador A. Barrios de la Fuente Página 1/6

INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICA

Nº de solicitud: 200931092

Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación) G01N Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de

búsqueda utilizados) INVENES,EPODOC, WPI, BIOSIS, EMBASE, NPL, XPESP

Informe del Estado de la Técnica Página 2/6

OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud: 200931092

Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 30.03.2012

Declaración

Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986)

Reivindicaciones 4-6, 11-18,20,22,23,27-31 Reivindicaciones 1-3, 7-10, 19, 21, 24-26, 32-41 SI NO

Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986)

Reivindicaciones Reivindicaciones 4-6, 11-18, 20, 22, 23, 27-31 SI NO

Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986).

Base de la Opinión.-

La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.

Informe del Estado de la Técnica Página 3/6

OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud: 200931092

1. Documentos considerados.-

A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión.

Documento

Número Publicación o Identificación Fecha Publicación

D01

WO 2004046724 A1 (BIACORE AB, REVERSE PROTEOMICS RES INST CO) 03.06.2004, ejemplos prácticos 1-13. 03.06.2004

D02

US 2009098568 A1 (YAMADA TSUYOSHI et al.) 16.04.2009, ejemplos 1-3; párrafo 96. 16.04.2009

D03

FICK, J., WOLFRAM, T., BELZ, F., et al. Surface-Specific Interaction of the Extracellular Domain of Protein L1 with Nitrilotriacetic Acid-Terminated Self-Assembled Monolayers. Langmuir, 9.10.2009 (publicación on line), Vol 26, Nº 2, Introducción y figura 1b. 9.10.2009
2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración

La presente solicitud tiene por objeto un proceso para la funcionalización orientada de un soporte con una proteína, que comprende acoplar covalentemente una proteína la cual tiene una zona rica en residuos de histidina, con un soporte biofuncionalizable en presencia de al menos un agente activante, a un PH entre 4 y 10. Sobre la superficie del soporte se une covalentemente un complejo quelante y esté se carga con un catión metálico, siendo la fórmula general A-X-L-B-M, donde A es el soporte, X es un átomo de oxígeno, nitrógeno o azufre, L es un grupo puente opcional, B un grupo quelante de metales con grupos carboxílicos y M un catión metálico (Reivindicaciones 1 y siguientes hasta 35).

También es objeto de la presente solicitud el soporte funcionalizado que responde a la fórmula A-X-L-B-Hp-PROT, siendo Hp-PROT una proteína con una zona rica en residuos de histidina (Reivindicaciones 36-39), así como el conjunto que comprende al menos una proteína rica en residuos de histidina, un soporte biofuncionalizable de fórmula general A-X-L-B-M y un agente activante (Reivindicación 40) y el uso de dicho conjunto para la inmovilización de proteínas in situ (Reivindicación 41).

El documento D01 divulga un proceso para la funcionalización orientada de un soporte con una proteína que presenta una zona rica en residuos de histidina en forma de cola.

El documento D02 divulga un proceso para la funcionalización orientada de un soporte con una proteína que presenta una cola con dos partes diferenciadas, una primera parte que se utiliza para purificar la proteína en cuestión y una segunda parte, que corresponde a una zona rica en residuos de histidina por la que se fija la proteína al soporte.

El documento D03 divulga un estudio relativo a la interacción del dominio extracelular de la proteína N-caderina con un soporte. La interacción con el soporte tiene lugar por medio de un complejo quelante NTA que se carga con Ni2+. Se trata de un soporte metálico con una monocapa autoensamblada (SAM). La cola de histidinas se encuentra situada en el extremo carboxilo terminal de la proteína.

NOVEDAD (Art. 6 Ley 11/86)

El documento D01 divulga un proceso para la funcionalización orientada de un soporte con una proteína, que comprende acoplar covalentemente una proteína con una zona rica en residuos de histidina a un soporte (ver ejemplos). Para este proceso se utiliza un soporte comercial de carboximetil dextrano al que se encuentra unido de forma covalente un complejo quelante -NTA-. Este quelante se carga con un catión metálico, Ni2+ (ver ejemplos prácticos). El soporte de carboximetil dextrano presenta grupos carboxilo en la superficie. El proceso de funcionalización se ha llevado a cabo en presencia de un agente activante (combinación de NHS y EDC) a un pH próximo a 7,4. La etapa de acoplamiento se lleva a cabo en presencia de un disolvente. Entre las proteínas que se unen al soporte se encuentran distintas enzimas, entre ellas por ejemplo, la cicloxigenasa 2, enzima que presenta actividad peroxidasa (ver ejemplo práctico 2). El soporte funcionalizado es un biochip, también denominado “sensor chip”.

Por lo tanto y sobre la base de lo divulgado en D01 se considera que el objeto de las reivindicaciones 1, 3, 7-10, 19, 21, 2426, 32-41 no es nuevo en el sentido del artículo 6 de la ley de Patentes 11/86.

Informe del Estado de la Técnica Página 4/6

OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud: 200931092

El documento D02 divulga un proceso para la funcionalización orientada de un soporte con una proteína, que comprende acoplar covalentemente una proteína con una zona rica en residuos de histidina a un soporte (ver ejemplos prácticos 1-3). Para este proceso se utiliza un soporte comercial de carboximetil dextrano al que se encuentra unido de forma covalente un complejo quelante -NTA-. Este quelante se carga con un catión metálico, Ni2+. El soporte de carboximetil dextrano presenta grupos carboxilo en la superficie. El proceso de funcionalización se ha llevado a cabo en presencia de un agente activante (combinación de NHS y EDC) a un pH próximo a 7,4. La etapa de acoplamiento se lleva a cabo en presencia de un disolvente. Tras la reacción de acoplamiento de la proteína el soporte se lava con un agente acoplante de metales, concretamente imidazol (ver ejemplo práctico 3). Entre las proteínas que se unen al soporte se encuentran distintas enzimas, entre ellas por ejemplo, ciclofilina A. El soporte funcionalizado es un biochip, también denominado “sensor chip”.

Por lo tanto y sobre la base de lo divulgado en D02, se considera que el objeto de las reivindicaciones 1-3, 7-10, 19, 2426, 32-41 no es nuevo en el sentido del artículo 6 de la ley de Patentes 11/86.

ACTIVIDAD INVENTIVA (Art. 8 de la Ley 11/86)

Reivindicación 2

La reivindicación 2 hace referencia al lavado con un agente acoplante de metales tras la utilización del agente activante en la fase de acoplamiento.

En D01 no se divulga el uso de EDTA o imidazol como agentes acoplantes de metales, sin embargo, el uso de estos agentes en este tipo de procedimientos es rutinario en el estado de la técnica, tal y como por ejemplo se anticipa en D02 (ver ejemplo práctico 3).

Reivindicación 4

En lo que respecta a la reivindicación 4, no se hace referencia en D01 y D02 a la temperatura a la que se lleva a cabo la etapa de acoplamiento, sin embargo, el rango de temperaturas señalado en la reivindicación 4 resulta muy amplio (de 5 a 70 ºC) e incluye temperaturas de trabajo habituales entre las que se encuentra por ejemplo, la temperatura ambiente o fisiológica, por lo que se considera que el objeto de la reivindicación 4, no implicaría actividad inventiva para un experto en la materia.

Reivindicación 5-6

El establecimiento de la cantidad de proteína que se hace reaccionar por cm2 de soporte biofuncionalizable (Reiv.5) y de los equivalentes de agente activante por mol de proteína, se considera que constituye una optimización del procedimiento de obtención del soporte biofuncionalizado, rutinario para un experto en la materia. Por lo que se considera que el objeto de las reivindicaciones 5 y 6 no implicaría actividad inventiva para un experto en la materia.

Reivindicaciones 11-16

A lo largo de las reivindicaciones de la 11-16, se van especificando los distintos materiales de los que puede estar formado el soporte. El tipo de soportes a los que se hace referencia, vidrio, oro, etc, son ampliamente conocidos y de uso rutinario en el estado de la técnica, por lo que se considera que el objeto de las reivindicaciones 11-16 no implica actividad inventiva para un experto en la materia.

Reivindicaciones 17-18

La reivindicación 17 concreta que la zona rica en residuos de histidina de la proteína se ha introducido en forma de cola de entre 4 y 10 histidinas en su extremo carboxilo terminal o en su región oligosacárida.

En D01 se señala que la cola de histidinas contendría, por ejemplo, entre 5-6 residuos, (Página 10, línea 14), y en D02 la cola de histinas presentaría igualmente 6 residuos (ver ejemplos). En los ejemplos divulgados en D01 y D02 la cola de hisitidinas se encuentra colocada en el extremo N-terminal. No obstante, el que esta se encuentre por ejemplo en el extremo C-terminal en lugar de en el N-terminal, corresponde simplemente a una de las posibles alternativas. Alternativa que ya aparece divulgada por ejemplo en D03 (ver figura 1) y que ya se señala de hecho en D02 (ver párrafo 34).

Con respecto a la reivindicación 18, se considera que la utilización de técnicas de biología molecular, como por ejemplo, la mutagénesis dirigida, representan una de las alternativas conocidas que el experto en la materia utilizaría para introducir una zona rica en residuos de histidina en la proteína.

Por lo tanto, se considera que el objeto de las reivindicaciones 17 y 18 no implicaría actividad inventiva para un experto en la materia

Informe del Estado de la Técnica Página 5/6

OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud: 200931092

Reivindicaciones 20, 22-23

En D01 y D02 se divulgan procesos de funcionalización orientada de un soporte con proteínas con una zona rica en residuos de histidina. Entre las proteínas que se unen al soporte en D01, se encuentran diversas enzimas, motivo por el cual, como ya se indicó anteriormente, se encuentran afectadas por novedad las reivindicaciones 19 y 21.

En lo que se refiere a las reivindicaciones 20, 22 y 23 se indican diferentes proteínas que se pueden unir al soporte, concretamente anticuerpos antiperoxidasa (Reiv. 20), concavalina A (Reiv. 22) y Caderina (Reivn.23). No obstante, aunque estas opciones no se encuentran expresamente divulgadas en D01 y D02, se considera que a priori, sería factible unir diferentes proteínas de distinta naturaleza, en la medida que la unión al soporte se lleva a cabo por ejemplo, a partir de una cola de polihistidinas. De hecho, existen ya numerosos ejemplos en los que se fijan sobre este tipo de soportes proteínas no enzimáticas, como por ejemplo, caderinas, tal y como se divulga en D03.

Por tantos, sobre la base de lo expuesto se considera que el objeto de las reivindicaciones 20, 22 y 23 no implicaría actividad inventiva para un experto en la materia.

Reivindicaciones 27-31

En lo que respecta a la reivindicación 27, y a la existencia de un grupo puente entre el soporte y el complejo quelante, el uso de este tipo de grupos puente en este tipo de soportes, es ya conocido en el estado de la técnica.

Resultaría evidente para un experto en la materia utilizar un grupo puente que presente en los extremos grupos funcionales, como por ejemplo los que se indican a lo largo de las reivindicaciones 28 a 31, capaces de interaccionar por un lado con el soporte y por otro con el complejo quelante, y separar estos grupos funcionales por ejemplo, por una cadena hidrocarbonada de longitud variable.

Por tanto, y sobre la base de lo expuesto, y teniendo en cuenta que no se desprende de la descripción que se derive ninguna ventaja técnica del uso de los grupos puente L reivindicados, se considera que el objeto de las reivindicaciones 27 a 31 no implicaría tampoco actividad inventiva para un experto en la materia.

En conclusión, se considera que el objeto de las reivindicaciones 2, 4-6, 11-19, 20, 22, 23, 27-31 no implica actividad inventiva para un experto en la materia, en el sentido del artículo 8 de la Ley de patentes 11/ 86.

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