JP2007187647A - 物質固定化担体、及び物質の固定化方法 - Google Patents

Abstract

【課題】フッ素化合物同士の親和力によって所望の物質が担体に固定化されている物質固定化担体等を提供する。
【解決手段】担体の表面に所望の物質が固定化された物質固定化担体であって、前記担体の表面の一部又は全部はフッ素化合物からなり、前記物質にはフッ素化合物タグが結合しており、該フッ素化合物タグが担体表面に結合していることを特徴とする物質固定化担体が提供される。フッ素化合物タグはスペーサーを介して物質に結合していてもよい。物質が蛋白質の場合には、所望の蛋白質と分子シャペロンとの融合蛋白質が固定化されていてもよい。フッ素化合物タグを介して所望の物質を担体に固定化する物質の固定化方法も提供される。フッ素化合物タグに所望の物質を結合させる方法として、カルボン酸チオエステル基と１級アミノ基を有するチオール基との縮合反応や、化学架橋反応を利用することができる。
【選択図】図４

Description

本発明は、物質固定化担体及び物質の固定化方法に関し、さらに詳細には、フッ素化合物同士の親和力によって所望の物質が担体に固定化されている物質固定化担体、及び、フッ素化合物同士の親和力を利用して所望の物質を担体に固定化する物質の固定化方法に関する。

ヒトゲノムの解読が完了し、ヒトの遺伝子の機能解析が急速に進められている。その解析を支えるツールの一つにＤＮＡチップ（ＤＮＡマイクロアレイ）がある。ＤＮＡチップは、プローブとしてのＤＮＡが基板等の担体（支持体）に固定化されたものであり、担体上のＤＮＡと解析対象の分子（アナライト）との相互作用等を網羅的に解析する目的に使用される。現在、ＤＮＡチップは基礎研究のみならず、遺伝子診断等にも利用され始めている。

ＤＮＡチップ以外にも、プローブとなる種々の物質が担体に固定化されたチップが開発されている。例えば、「蛋白質チップ」（「プロテインチップ」ともいう）は、プローブとしての蛋白質が担体に固定化されたものであり、担体上の蛋白質とアナライトとの相互作用等を解析する目的に使用される。蛋白質チップによれば、例えば、蛋白質−蛋白質相互作用、蛋白質−低分子薬剤相互作用、蛋白質−リガンド相互作用、抗原−抗体反応等の種々の相互作用の解析を行なうことができる。蛋白質チップによれば、ＤＮＡチップでは解析が不可能な生体内での蛋白質の量的又は質的な変化を解析することができる。蛋白質チップは、臨床診断や創薬研究等に大きな威力を発揮すると期待されている。

その他のプローブとなる物質としては、糖鎖が挙げられる。すなわち、プローブとしての糖鎖が担体に固定化された「糖鎖チップ」が開発されている（非特許文献１〜５）。糖鎖チップは、糖鎖とアナライトとの相互作用等の解析や、細菌やウイルスの検出等を目的として使用されている。さらに、低分子化合物が担体に固定化されたチップも開発されている（非特許文献６〜９）。このチップは、蛋白質の内在性リガンドの探索やアゴニスト、アンタゴニストのスクリーニング等に使用されている。以上のようなプローブが固定化されたチップを総称して「バイオチップ」と呼ぶ。

しかし、ＤＮＡチップ以外のバイオチップには、実用化に際してなお課題が存在する。例えば、核酸同士の結合様式は水素結合に限定されているのに対し、蛋白質と他の物質との結合様式は多様である。これは、蛋白質と他の物質との結合の強さが多様であることを示す。したがって、蛋白質チップにおいては、プローブとなる蛋白質とアナライトとの結合の強さが多様であり、ＤＮＡチップと比較してアナライトとの相互作用の解析が難しいことがある。また、蛋白質には、その立体構造が壊れて変性や失活するおそれが常にある。例えば、担体に固定化されただけで変性や失活する蛋白質も多い。これは、例えば、担体と蛋白質の疎水性部分とが予期しない相互作用を起こすことにより起こる。さらに、蛋白質は核酸のように増幅することができないので、微量の蛋白質を検出する技術が別途必要となる。さらに、プローブとしての蛋白質が基板等の担体に固定化される際に、その蛋白質の配向性が制御されずに固定化されている例が多い。この場合には、担体に固定化された蛋白質上のアナライトと相互作用する部位が表面に十分露出せず、うまくアナライトと相互作用できなくなる。その結果、解析結果が大きくばらつくことがある。

このような蛋白質チップが有する課題を解決するために、種々の改良技術が提案されている。例えば、ヒスチジンタグとニッケル、ビオチンとアビジン等の相互作用を利用した物質の固定化方法が提案されている（非特許文献１０，１１）。また、基板と蛋白質との相互作用の影響を軽減するため、ポリエチレングリコール等のスペーサーを介して、蛋白質を基板に固定化する方法が提案されている（非特許文献１２）。この方法の利点の１つは、ポリエチレングリコールのスペーサーがあるため、基板と固定化された蛋白質との予期しない相互作用が起こりにくいことである。別の利点は、スペーサーのポリエチレングリコールにより蛋白質のまわりが親水性の環境となり、蛋白質が変性しにくいことである。さらに別の利点は、ビオチンを介して基板に蛋白質を固定化するので、蛋白質の配向性を制御しやすいことである。
ワング Ｄ（Wang D）ら，ネイチャー・バイオテクノロジー（Nature Biotechnology），２００２年，第２０巻，ｐ．２７５−２８１ フクイ Ｓ（Fukui S）ら，ネイチャー・バイオテクノロジー（Nature Biotechnology），２００２年，第２０巻，ｐ．１０１１−１０１７ ファジオ Ｆ（Fazio F）ら，ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ（Journal of American Chemical Society），２００２年，ｐ．１４３９７−１４４０２ ハウスマン ＢＴ（Houseman BT）ら，ケミストリー・アンド・バイオロジー（Chemistry & Biology），２００２年，第９巻，ｐ．４４３−４５４ パーク Ｓ（Park S），アンゲバンテ・ヘミー・インターナショナル・エディション（Angewandte Chemie International Edition），２００２年，第４１巻， ｐ．３１８０−３１８２ ウイルソン ＳＲ（Wilson SR）とクザルニック ＡＷ（Czarnik AW）著，「コンビナトリアル・ケミストリー」（Combinatorial Chemistry），１９９７年，ジョン・ウィレイ・アンド・サンズ・インク（John Wiley & Sons, Inc.）発行 テレット ＮＫ（Terrett NK）著，「コンビナトリアル・ケミストリー」（Combinatorial Chemistry），１９９８年，オックスフォード・ユニバーシティ・プレス（Oxford University Press）発行 ユング Ｇ（Jung G,）「コンビナトリアル・ケミストリー」（Combinatorial Chemistry），１９９６，ウィレイ−ＶＣＨ（Wiley-VCH）発行 フェニリ Ｈ（Fenniri H），「コンビナトリアル・ケミストリー」（Combinatorial Chemistry），２０００年，オックスフォード・ユニバーシティ・プレス（Oxford University Press）発行 キャッチャー Ａ（Chacher A），ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー（Journal of Chromatography），１９８７年，第４１１巻，ｐ．１７７−１８４ ホワイトサイズ ＧＭ（Whitesides GM）ら，アナリティカル・ケミストリー.（Analytical Chemistry），１９９６年，第６８巻，ｐ．９０−４９７ ルイズ−テイラー ＬＡ（Ruiz-Taylor LA），プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・Ｕ．Ｓ．Ａ（Proceedings of National Academy of Sciences of the U.S.A.），２００１年，第９８巻，ｐ．８５２−８５７

しかし、ヒスチジンタグとニッケル、ビオチンとアビジン等の相互作用を利用する物質の固定化方法においては、担体と固定化された蛋白質との予期しない相互作用によって、固定化された蛋白質が変性することがある。さらに、アナライトと共存している夾雑蛋白質やアナライト自身が担体に非特異的に吸着し、アナライトの解析が妨害されることもある。これらの問題点を改善するために、上記したようなポリリジンがグラフトされたポリエチレングリコールポリマーを利用する物質の固定化方法も提案されている。しかし、この方法は、プローブとなる蛋白質を固定化する操作が煩雑である。

また、低分子化合物を固定化したチップにおいても、アナライトに共存している夾雑蛋白質が担体に非特異的に吸着することがある。そして、夾雑蛋白質が非特異的に担体に吸着することを防ぐために、担体に対してブロッキングが行なわれている。すなわち、血清アルブミンやカゼイン等を用いて担体表面をコーティングし、夾雑蛋白質の非特異的な吸着が防がれている。しかし、ブロッキングを行なっても夾雑蛋白質の非特異的吸着を完全に防ぐことは難しい。さらに、ブロッキングを行なう場合には、担体に固定化される物質やアナライトの種類に応じて適するブロッキング剤を選択する必要があり、煩雑である。またブロッキング剤のロット差が解析の結果に影響することもある。以上より、プローブとなる物質とアナライトとの相互作用等の解析をより正確かつ簡便に行なえる物質固定化担体、及び夾雑物質やアナライト自身が非特異的に吸着する割合がきわめて低く、かつ簡便な操作で所望の物質を担体に固定化できる物質の固定化方法が求められている。

本発明者らは、フッ素化合物同士が特異的な親和性を有することに着目し、フッ素化合物からなる表面を有する基板（担体）に、フッ素化合物タグを介して所望の物質が固定化された基板を作製した。そして、この物質固定化基板（物質固定化担体）によれば、当該物質とアナライトとの相互作用等の解析をより正確かつ簡便に行なえることを見出した。さらに、当該フッ素化合物同士の親和力を利用する物質の固定化方法により、種々の用途に用いられる物質固定化担体を提供できることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明の要旨は以下のとおりである。

請求項１に記載の発明は、担体の表面に所望の物質が固定化された物質固定化担体であって、前記担体の表面の一部又は全部はフッ素化合物からなり、前記物質にはフッ素化合物タグが結合しており、該フッ素化合物タグが担体表面のフッ素化合物からなる部分に結合していることを特徴とする物質固定化担体である。

本発明の物質固定化担体は、その表面の一部又は全部はフッ素化合物からなる担体と、フッ素化合物タグと、物質とからなる。そして、該フッ素化合物タグは、担体表面のフッ素化合物との間の親和力によって担体表面に結合している。その結果、該フッ素化合物タグを介して前記物質が担体表面に固定化されている。一般に、フッ素化合物にはフッ素化合物以外の物質が吸着しにくい性質があるので、担体表面がフッ素化合物からなる本発明の物質固定化担体においては、夾雑物質の非特異的吸着がきわめて少ない。よって、本発明の物質固定化担体においては、担体表面における所望の物質の純度（例えば、プローブ純度）が高い。その結果、例えば、本発明の物質固定化担体を該物質とアナライトとの相互作用等の解析に用いると、当該相互作用等を正確かつ高感度に解析することができる。さらに、この場合にはアナライトやアナライトに共存する夾雑物質の担体表面への非特異的吸着もきわめて少ないため、ブロッキング操作が不要となり、該物質とアナライトとの相互作用等を簡便に解析することができる。またさらに、この場合には特定の溶媒を用いることによって固定化した物質を容易に剥がすことができ、担体を再利用することができる。
また、本発明の物質固定化担体においては、担体表面における所望の物質の純度が高いので、上記した解析以外の目的に使用する場合にも好都合である。

ここでいう「担体」とは、所望の物質が固定化される際の土台となるものを指す。そして、表面の一部または全部がフッ素化合物からなる固体は、全て本発明における担体になり得る。本発明における担体は「支持体」と換言することができる。

ここで「フッ素化合物タグ」とは、パーフルオロアルキル基又はフルオロアルキル基を有する化合物又は置換基を意味するものとする。換言すれば、「フッ素化合物タグ」は、一般に「フルオラス・タグ」、「フルオラス保護基」、又は「フルオラス置換基」と呼ばれているものと同義である。なお、パーフルオロアルキル基とは、アルキル基の全ての水素原子がフッ素原子に置換したものである。また、フルオロアルキル基とは、アルキル基の一部の水素原子がフッ素原子に置換したものである。

請求項２に記載の発明は、前記担体は、基板であることを特徴とする請求項１に記載の物質固定化担体である。

かかる構成により、物質とアナライトとの相互作用等をより簡便に解析することができる。

請求項３に記載の発明は、前記担体は、フッ素樹脂からなる担体であることを特徴とする請求項１又は２に記載の物質固定化担体である。

本発明の物質固定化担体においては、担体そのものがフッ素樹脂からなるので、担体を容易に調製することができる。すなわち、本発明の物質固定化担体は製造が容易である。

請求項４に記載の発明は、前記フッ素樹脂は、テトラフロロエチレン樹脂、パーフロロアルコキシ樹脂、及びフッ化エチレンプロピレン樹脂からなる群より選ばれた少なくとも１種のフッ素樹脂であることを特徴とする請求項３に記載の物質固定化担体である。

かかる構成により、担体をより容易に調製することができる。

請求項５に記載の発明は、前記フッ素化合物タグは、スペーサーを介して前記物質に結合していることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の物質固定化担体である。

本発明の物質固定化担体においては、フッ素化合物タグがスペーサーを介して前記物質に結合している。すなわち、本発明の物質固定化担体においては、該物質が担体表面からスペーサーの長さ分に相当する距離をおいて固定化されている。したがって、本発明の物質固定化担体においては、固定化された物質に対する担体からの作用の影響が少なく、物質と担体との予期しない相互作用が起こりにくい。その結果、本発明の物質固定化担体によれば、例えば、該物質とアナライトとの相互作用等をより正確に解析することができる。

請求項６に記載の発明は、前記物質は、蛋白質又はペプチドであることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の物質固定化担体である。

かかる構成により、配向性が制御された蛋白質又はペプチドが固定化された物質固定化担体が提供される。すなわち、本発明の物質固定化担体によれば、例えば、該蛋白質又はペプチドとアナライトとの相互作用等をより正確に解析することができる。

請求項７に記載の発明は、前記蛋白質は、所望の蛋白質と分子シャペロンとの融合蛋白質であることを特徴とする請求項６に記載の物質固定化担体である。

本発明の物質固定化担体においては、所望の蛋白質と分子シャペロンとの融合蛋白質が固定化されている。当該融合蛋白質においては、所望の蛋白質が分子シャペロンの作用によってより確実に正しい立体構造を保持することができる。したがって、本発明の物質固定化担体によれば、例えば、該蛋白質とアナライトとの相互作用等をより正確に解析することができる。

請求項８に記載の発明は、前記分子シャペロンは、シャペロニンであることを特徴とする請求項７に記載の物質固定化担体である。

かかる構成により、担体に固定化された所望の蛋白質がシャペロニンの作用によってより確実に正しい立体構造を保持することができる。なお、「所望の蛋白質とシャペロニンとの融合蛋白質」とは、所望の蛋白質とシャペロニンサブユニットとの融合蛋白質、又は所望の蛋白質とシャペロニンサブユニット連結体との融合蛋白質をいうものとする。さらに、「シャペロニンサブユニット連結体」とは、複数のシャペロニンサブユニットがペプチド結合を介して直列に連結された蛋白質をいう。またさらに、シャペロニンサブユニットの数がＮ個であるシャペロニンサブユニット連結体を「シャペロニンサブユニットＮ回連結体」と呼ぶこととする。

請求項９に記載の発明は、前記分子シャペロンは、ペプチジル−プロリル シス−トランス イソメラーゼであることを特徴とする請求項７に記載の物質固定化担体である。

かかる構成により、担体に固定化された所望の蛋白質がペプチジル−プロリル シス−トランス イソメラーゼ（Ｐｅｐｔｉｄｙｌ−ｐｒｏｌｙｌ ｃｉｓ−ｔｒａｎｓ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ。以下、「ＰＰＩａｓｅ」と称する。）の作用によってより確実に正しい立体構造を保持することができる。

請求項１０に記載の発明は、前記物質は、糖又は糖鎖であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の物質固定化担体である。

本発明の物質固定化担体によれば、例えば、該糖又は糖鎖とアナライトとの相互作用等を正確かつ簡便に解析することができる。

請求項１１に記載の発明は、前記物質は、分子量２０００以下の低分子化合物であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の物質固定化担体である。

本発明の物質固定化担体によれば、例えば、ブロッキングを行なうことなく該低分子化合物とアナライトとの相互作用等を解析することができる。

請求項１２に記載の発明は、担体の表面に所望の物質を固定化する物質の固定化方法であって、表面の一部又は全部がフッ素化合物からなる担体の表面に所望の物質とフッ素化合物タグとの結合物を接触させ、該フッ素化合物タグを担体表面のフッ素化合物からなる部分に結合させることを特徴とする物質の固定化方法である。

本発明は物質の固定化方法にかかり、その表面の一部又は全部はフッ素化合物からなる担体表面に、フッ素化合物タグを介して所望の物質を固定化するものである。本発明の物質の固定化方法においては、所望の物質とフッ素化合物タグとの結合物を、該担体の表面に接触させる。このとき、該フッ素化合物タグと担体表面のフッ素化合物との間の親和力によって、該フッ素化合物タグが担体表面に結合する。その結果、所望の物質がフッ素化合物タグを介して担体表面に結合される。本発明の物質の固定化方法によれば、フッ素化合物同士の親和力を利用して物質を固定化するので、所望の物質以外の夾雑物質が固定化される割合がきわめて低い。その結果、担体表面における所望の物質の純度（例えば、プローブ純度）がきわめて高い物質固定化担体を作製することができる。さらに、本発明の物質の固定化方法では、担体表面に該結合物を接触させるだけで所望の物質を固定化できるので、操作が簡便である。

前記担体が基板である構成が推奨される（請求項１３）。

請求項１４に記載の発明は、前記担体は、フッ素樹脂からなる担体であることを特徴とする請求項１２又は１３に記載の物質の固定化方法である。

また、請求項１５に記載の発明は、前記フッ素樹脂は、テトラフロロエチレン樹脂、パーフロロアルコキシ樹脂、及びフッ化エチレンプロピレン樹脂からなる群より選ばれた少なくとも１種のフッ素樹脂であることを特徴とする請求項１４に記載の物質の固定化方法である。

かかる構成により、所望の物質をより容易に担体に固定化することができる。

請求項１６に記載の発明は、前記結合物は、所望の物質とフッ素化合物タグとがスペーサーを介して結合したものであることを特徴とする請求項１２〜１５のいずれかに記載の物質の固定化方法である。

本発明の物質の固定化方法においては、フッ素化合物タグがスペーサーを介して前記物質に結合してなる結合物を、担体表面に接触させる。本発明の物質の固定化方法によれば、所望の物質を担体表面から距離をおいて固定化することができる。その結果、固定化された物質に対する担体からの作用の影響が少なく、物質と担体との予期しない相互作用が起こりにくい物質固定化担体を作製することができる。

請求項１７に記載の発明は、化学架橋反応によって前記結合物を調製することを特徴とする請求項１２〜１６のいずれかに記載の物質の固定化方法である。

かかる構成により、所望の物質とフッ素化合物タグとの結合物をより簡便に調製することができる。

請求項１８に記載の発明は、前記物質はカルボン酸チオエステル基を有し、前記フッ素化合物タグは１級アミノ基を有するチオール基を有し、該カルボン酸チオエステル基と該チオール基との縮合反応によって前記結合物を調製することを特徴とする請求項１２〜１６のいずれかに記載の物質の固定化方法である。

また、請求項１９に記載の発明は、前記物質は１級アミノ基を有するチオール基を有し、前記フッ素化合物タグはカルボン酸チオエステル基を有し、該チオール基と該カルボン酸チオエステル基との縮合反応によって前記結合物を調製することを特徴とする請求項１２〜１６のいずれかに記載の物質の固定化方法である。

本発明の物質の固定化方法においては、１級アミノ基を有するチオール基とカルボン酸チオエステル基との縮合反応を利用して、所望の物質をフッ素化合物タグとの結合物を調製する。本縮合反応は中性かつ室温条件下で行なうことができるので、本発明の物質の固定化方法では、所望の物質が強酸性、強アルカリ性、高温等の厳しい条件下に曝されることがない。したがって、固定化の過程で所望の物質が分解、変性、失活等するおそれがない。

請求項２０に記載の発明は、前記物質は蛋白質又はペプチドであり、前記チオール基は該蛋白質又はペプチドのＮ末端のシステイン残基であることを特徴とする請求項１９に記載の物質の固定化方法である。

かかる構成により、固定化の過程で蛋白質又はペプチドが分解、変性、失活等するおそれがない。

本発明の物質固定化担体においては、担体表面における所望の物質の純度が高い。そのため、本発明の物質固定化担体によれば、例えば、固定化された所望の物質とアナライトとの相互作用等をより正確、高感度かつ簡便に解析することができる。

本発明の物質の固定化方法によれば、担体表面における所望の物質の純度が高い物質固定化担体を作製することができる。また、本発明の物質の固定化方法によれば、より効率的に所望の物質を担体表面に固定化することができる。

以下、本発明を実施するための最良の形態について、詳しく説明する。

本発明の物質固定化担体は、表面の一部又は全部がフッ素化合物からなる担体に、フッ素化合物タグを介して所望の物質が固定化されたものである。すなわち、該物質にはフッ素化合物タグが結合しており、該フッ素化合物タグと担体表面のフッ素化合物との間の親和力によって該フッ素化合物タグが担体表面に結合している。

担体の形状としては特に限定はなく、例えば、平板状（基板など）、球状（ビーズなど）、糸状などが挙げられる。さらに、後に詳述する人工器官・人工臓器のような一定の面積を有する複雑な形状の担体が挙げられる。

担体の表面を構成するフッ素化合物としては特に限定はないが、パーフルオロアルキル基又はフルオロアルキル基を有し、これらの官能基が表面に露出されているものが好ましい。

「フッ素化合物タグ」とは、パーフルオロアルキル基又はフルオロアルキル基を有する化合物又は置換基を意味する。換言すれば、「フッ素化合物タグ」は、一般に「フルオラス・タグ」、「フルオラス保護基」、又は「フルオラス置換基」と呼ばれているものと同義である。本発明の物質固定化担体においては、各種のフルオラス保護基がフッ素化合物タグとしてそのまま使用可能である。なお、フルオラス保護基（フッ素化合物タグ）導入用の化合物が試薬としてすでに市販されている。例えば、ビスフルオラス・チェイン・タイプ・プロピオン酸（Bisfluorous chain type propionic acid、Ｃ₂₅Ｈ₁₅Ｆ₃₄ＮＯ₃、以下「Ｂｆｐ−ＯＨ」と称する。）、２−［２−（パーフルオロアルキル）イソプロポキシカルボニルオキシイミノ］−２−フェニルアセトニトリル、４−（パーフルオロアルキル）ベンジルアルコール、パーフルオロアルキルチオール等がフルオラス保護基導入用の試薬として市販されており、本発明の物質固定化担体におけるフッ素化合物タグとして使用できる。また一般に、フッ素化合物同士の親和力は、該フッ素化合物におけるフッ素原子の含量が大きいほど強い。よって、本発明の物質固定化担体においてもフッ素化合物タグはフッ素原子の含量が大きい方が好ましく、フッ素化合物タグ中のパーフルオロアルキル基又はフルオロアルキル基の炭素原子において、フッ素原子が結合している炭素原子を３個以上含むことが好ましい。

好ましい実施形態では、担体そのものがフッ素樹脂からなる。本実施形態におけるフッ素樹脂の好ましい例としては、テトラフロロエチレン樹脂（ポリテトラフルオロエチレンとも言う。以下、「ＰＴＦＥ」と称する。）、パーフロロアルコキシ樹脂（テトラフルオロエチレン・パーフルオロアルコキシエチレン共重合体、テトラフルオロエチレン・パーフルオロアルキルビニルエーテル共重合体、又はパーフルオロアルコキシアルカンとも言う。以下、「ＰＦＡ」と称する。）、及びフッ化エチレンプロピレン樹脂（テトラフルオロエチレン・ヘキサフルオロプロピレン共重合体とも言う。以下、「ＦＥＰ」と称する。）が挙げられる。その他のフッ素樹脂、例えば、テトラフルオロエチレン・エチレン共重合体（ＥＴＦＥ）、ポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）、ポリクロロトリフルオロエチレン（ＰＣＴＦＥ）等のフッ素樹脂も使用可能である。これらのフッ素樹脂は、テフロン（登録商標）、ポリフロン（登録商標）、ネオフロン（登録商標）、フルオン（登録商標）、アフロン（登録商標）等の商品名で販売されている。なお、これらのフッ素樹脂については、１種のみを用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

フッ素樹脂以外の素材からなる担体を採用する場合は、例えば、表面にフッ素化合物を塗布した担体を用いることができる。その他の例としては、担体として基板を採用する場合に、表面にフッ素樹脂からなる薄板を貼り合わせた基板を用いることができる。

好ましい実施形態では、フッ素化合物タグがスペーサーを介して物質に結合している。スペーサーの例としては、ポリエチレングリコール、ポリペプチド、その他各種のポリマーからなるスペーサーが挙げられる。本実施形態では、スペーサーの種類、長さ、分子量等を調節することにより、固定化される物質と担体表面との距離を調整することができる。さらに、固定化される物質の周囲の環境（例えば、親水的環境）を整えることが可能となる。これにより、例えば、固定化された物質とアナライトとの相互作用等の解析をより正確かつ効率的に行なうことができる。

固定化される物質に対して特異的な親和性を有する物質をスペーサーとして用いることもできる。例えば、固定化される物質が抗体である場合には、プロテインＡやプロテインＧがスペーサーとして使用できる。例えば、まずプロテインＡ又はプロテインＧが結合したフッ素化合物タグを調製する。次いで、該プロテインＡ又はプロテインＧに抗体を結合させる。これにより、プロテインＡ又はプロテインＧ（スペーサー）を介して抗体（物質）が結合したフッ素化合物タグが調製される。同様にして、ＺＺタグをスペーサーとし、物質として抗体が担体に固定化された物質固定化担体も作製できる。なお、ＺＺタグは、プロテインＡが有するＩｇＧ結合領域の２つが互いに結合されたペプチドである。

好ましい実施形態では、蛋白質又はペプチドが担体に固定化されている。すなわち、本実施形態の物質固定化担体は、蛋白質チップとして使用することができる。

この好ましい実施形態においては、所望の蛋白質が分子シャペロンと融合されていてもよい。換言すれば、所望の蛋白質と分子シャペロンとの融合蛋白質が担体に固定化されていてもよい。一般に、単独では正しい立体構造を保持することが難しい蛋白質やペプチドであっても、分子シャペロンとの融合蛋白質として発現させることにより、正しい立体構造を保持できることが多く見出されている。よって、本実施形態においては、所望の物質が単独では正しい立体構造を保持することが難しい蛋白質やペプチドであっても、正しい立体構造を保持した状態で担体に固定化されている。本実施形態で採用される分子シャペロンとしては特に限定はなく、蛋白質の折り畳みを助ける作用を有するものであれば、すべて適用可能である。

好ましい実施形態では、分子シャペロンがシャペロニンである。換言すれば、所望の蛋白質とシャペロニンサブユニットとの融合蛋白質、又は所望の蛋白質とシャペロニンサブユニット連結体との融合蛋白質が、担体に固定化されている。

シャペロニンは、約６０ｋＤａのサブユニット（シャペロニンサブユニット）が１〜約２０個程度集まった複合体である。シャペロニンは、細胞に熱ショックなどのストレスを与えることにより誘導されるヒートショック蛋白質の一種としても知られている。シャペロニンは、バクテリア（例えば、大腸菌など）、古細菌（例えば、Thermococcus sp.、Pyrococcus horikoshii、Aeropyrum pernixなど）及び真核生物（例えば、酵母、マウス、ヒトなど）等の全ての生物に存在し、蛋白質の折り畳み支援や変性防御の機能を有している。

複数のシャペロニンサブユニットがペプチド結合を介して直列に連結された蛋白質であるシャペロニンサブユニット連結体も、天然のシャペロニンと同様に複合体を形成することが知られている。この際、２〜約１０個のシャペロニンサブユニットは、天然のシャペロニンと同様にリング状（以下、「シャペロニンリング」ともいう。）あるいは直線状の構造をとることが知られている。なお、「シャペロニンサブユニット連結体」という用語に対比して、他のシャペロニンサブユニットとはペプチド結合を介して連結されていないシャペロニンサブユニットを「単独のシャペロニンサブユニット」と呼ぶこととする。

好ましい他の実施形態では、分子シャペロンがＰＰＩａｓｅである。換言すれば、所望の蛋白質とＰＰＩａｓｅとの融合蛋白質が担体に固定化されている。

ＰＰＩａｓｅは、細胞内でフォールディング途上のターゲット蛋白質中のアミノ酸のうち、プロリン残基のＮ末端側ペプチド結合のシストランス異性化反応を触媒する活性（ＰＰＩａｓｅ活性）を有する分子シャペロンである。ＰＰＩａｓｅはその阻害剤に対する感受性から、ＦＫ５０６ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ型（ＦＫＢＰ型）、シクロフィリン型、及びパーブリン型の３種類に分類されている。ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、免疫抑制剤の１つであるＦＫ５０６により活性が阻害されるＰＰＩａｓｅ及びそのホモログである。シクロフィリン型ＰＰＩａｓｅは、別の免疫抑制剤であるシクロスポリンに対して感受性を持つＰＰＩａｓｅ及びそのホモログである。一方、パーブリン型ＰＰＩａｓｅは、いずれの免疫抑制剤に対しても感受性を示さず、ジュグロン（ｊｕｇｌｏｎｅ）によりその活性が阻害される。この３種類のＰＰＩａｓｅは、アミノ酸一次配列上の相同性はほとんどない。

本実施形態におけるＰＰＩａｓｅとしては特に限定されず、上記の３種類のＰＰＩａｓｅのうち、いずれのタイプのＰＰＩａｓｅであってもよい。ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの例としては、古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ、トリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅ（Ｈｕａｎｇ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．，第９巻、ｐ．１２５４，２０００年）、ＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅ（Ａｒｉｅ，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，第３９巻，ｐ．１９９，２００１年）、及び、ＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅ（Ｂｏｓｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２７４巻，ｐ．１７１５，１９９６年）が挙げられる。シクロフィリンタイプＰＰＩａｓｅの例としては、ＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅが挙げられる（Ｐｉｒｋｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，第３０８巻，ｐ．７９５，２００１年）。パーブリンタイプＰＰＩａｓｅの例としては、ＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅ（Ｂｅｈｒｅｎｓ，ＥＭＢＯ Ｊ．，ｐ．第２０巻，ｐ．２８５，２００１年）が挙げられる。なお、本実施形態においては、これらのＰＰＩａｓｅとアミノ酸配列がきわめて似ておりかつ同様の作用を有する実質的に同一の蛋白質や、これらのＰＰＩａｓｅの一部分を含みかつ同様の作用を有する蛋白質も、所望の蛋白質やペプチドと融合されるＰＰＩａｓｅとして採用できる。

なお、古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの機能については、興味深いことに、ＰＰＩａｓｅ活性だけでなく、蛋白質の不可逆的凝集を抑制すると同時に、変性蛋白質のリフォールディングを促進させる分子シャペロン活性を有することが見出されている（Ｆｕｒｕｔａｎｉ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第３９巻，ｐ．４５３，２０００年；Ｉｄｅｎｏ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，第２６７巻，ｐ．３１３９，２０００年；Ｉｄｅｎｏ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，第３５７巻，ｐ．４６５，２００１年；Ｉｄｅｎｏ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，第６８巻，ｐ．４６４，２００２年）。分子シャペロン活性は、本来、分子シャペロンの１つとして知られるシャペロニンやＤｎａＫ／ＤｎａＪ／ＧｒｐＥ系の蛋白質折り畳みシステムに見いだされた活性である。これらは、細胞内で合成されたポリペプチドが正しい形に折り畳まれるよう、サポートする機能を果たしている。その際、ＡＴＰなどの高エネルギー物質の加水分解を必要とする。一方、古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、その分子シャペロン活性を発揮する際、上記高エネルギー物質の加水分解反応を必要としない点でその性質が異なる。古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、分子シャペロン活性を有しないＰＰＩａｓｅに比べて、融合される所望の蛋白質をより正しく折り畳むことができる。したがって、古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、本実施形態の融合蛋白質に含まれるＰＰＩａｓｅとして、特に好適である。

他の実施形態では、所望の物質として糖又は糖鎖が担体の表面に固定化されている。すなわち、本実施形態の物質固定化担体は、例えば、糖チップ又は糖鎖チップとして使用することができる。さらに他の実施形態では、所望の物質として分子量２０００以下の低分子化合物が担体の表面に固定化されている。すなわち、本実施形態の物質固定化担体は、例えば、蛋白質の内在性リガンドの探索やアゴニスト、アンタゴニストのスクリーニング等に使用することができる。

上記した主な実施形態の物質固定化担体の構造について、図面を参照しながら説明する。第１の例は、担体、フッ素化合物タグ、及び物質の最小限の構成からなる物質固定化担体である。図１は、本発明の物質固定化担体の第１の例の構造を表す模式図である。すなわち、図１に示される物質固定化担体１は、担体２と、フッ素化合物タグ３と、物質５とからなる。物質５にはフッ素化合物タグ３が結合している。一方、担体２の表面６はフッ素化合物からなり、フッ素化合物同士の親和力によってフッ素化合物タグ３がフッ素化合物からなる表面６に結合している。その結果、物質５がフッ素化合物タグ３を介して担体２に固定化されている。なお、図１は模式図であり、担体２、フッ素化合物タグ３、及び物質５の大きさは実際とは異なる。

第２の例は、スペーサーを介して物質が担体に固定化されている物質固定化担体である。図２は、本発明の物質固定化担体の第２の例の構造を表す模式図である。すなわち、図２に示される物質固定化担体１１は、担体２と、フッ素化合物タグ３と、スペーサー７と、物質５とからなる。そして、物質５がスペーサー７を介してフッ素化合物タグ３に結合している。一方、フッ素化合物同士の親和力によってフッ素化合物タグ３がフッ素化合物からなる表面６に結合している。その結果、物質５がスペーサー７とフッ素化合物タグ３とを介して担体２に固定化されている。なお、図２は模式図であり、担体２、フッ素化合物タグ３、物質５、及びスペーサー７の大きさは実際とは異なる。

第３の例は、所望の物質が蛋白質であり、該蛋白質と分子シャペロンとの融合蛋白質が担体に固定化されている物質固定化担体である。図３は、本発明の物質固定化担体の第３の例の構造を表す模式図である。この例は、さらに、フッ素化合物タグが分子シャペロンに結合している場合と、フッ素化合物タグが所望の蛋白質に結合している場合とに分けられる。前者の例を図３（ａ）に、後者の例を図３（ｂ）に示す。

図３（ａ）に示される物質固定化担体２１は、担体２と、フッ素化合物タグ３と、融合蛋白質１０とからなる。さらに、融合蛋白質１０は蛋白質（物質）１５と分子シャペロン８とからなり、分子シャペロン８がフッ素化合物タグ３に結合している。一方、フッ素化合物同士の親和力によってフッ素化合物タグ３がフッ素化合物からなる表面６に結合している。その結果、融合蛋白質１０がフッ素化合物タグ３を介して担体２に固定化されている。換言すれば、蛋白質１５が分子シャペロン８とフッ素化合物タグ３とを介して担体２に固定化されている。この例の場合は、分子シャペロン８がスペーサーの役目も兼ねることができる。

一方、図３（ｂ）に示される物質固定化担体３１は、融合蛋白質２０が蛋白質１５と分子シャペロン８とからなり、蛋白質１５がフッ素化合物タグ３に結合している。一方、フッ素化合物同士の親和力によってフッ素化合物タグ３がフッ素化合物からなる表面６に結合している。その結果、蛋白質１５がフッ素化合物タグ３を介して担体２に固定化されており、かつ蛋白質１５に分子シャペロン８が結合されている。なお、図３（ａ）の物質固定化担体２１、図３（ｂ）の物質固定化担体３１のいずれにおいても、分子シャペロン８の作用によって蛋白質１５が正しい立体構造をより容易に保持することができる。なお、図３（ａ）、図３（ｂ）はいずれも模式図であり、担体２、フッ素化合物タグ３、蛋白質１５、及び分子シャペロン８の大きさは実際とは異なる。

以下、本発明の物質固定化担体の具体的な用途の例を担体の種類とともに説明する。当該用途は、分析や解析を目的とする用途と、それ以外の用途に大きく２つに分けられる。分析や解析を目的とする用途の１つの例は、基板等を担体として用い、固定化された物質とアナライトとの相互作用等を網羅的に分析する用途、すなわちバイオチップとしての用途である。具体的には、プローブとなる物質が基板等の表面にフッ素化合物タグを介して配列および固定化された物質固定化担体が、当該物質とアナライトとの相互作用等を網羅的に解析できるバイオチップとして使用できる。プローブとなる物質の例としては、上記したように、蛋白質又はペプチド、糖又は糖鎖、分子量２０００以下の低分子化合物等が挙げられる。

分析や解析を目的とする用途の他の例としては、免疫測定法への応用が挙げられる。すなわち、ビーズ、マイクロチューブ、マイクロタイタープレート等の担体表面にフッ素化合物タグを介して所望の抗体又は抗原が固定化された（被覆された）物質固定化担体が、免疫測定法に使用できる。この際、担体として、フッ素樹脂からなるビーズや、表面がフッ素樹脂で被覆されたマイクロチューブ等を使用することができる。

分析や解析を目的とする用途のさらに他の例としては、ラテックス凝集法への応用が挙げられる。具体的には、フッ素樹脂からなるラテックス（担体）の表面にフッ素化合物タグを介して所望の抗体又は抗原が固定化された（被覆された）物質固定化担体が、ラテックス凝集法に使用できる。

分析や解析以外の用途としては、人工器官や人工臓器への応用が挙げられる。例えば、多孔性ＰＴＦＥからなる人工血管（担体）の内壁にヘパリン等の抗血液凝固物質がフッ素化合物タグを介して固定化され、内壁の全体が当該抗血液凝固物質で被覆された人工血管（物質固定化担体）が挙げられる。この人工血管によれば、血栓の生成が高度に抑えられる。

人工骨への応用も可能である。例えば、人工骨においては、他の骨との接合部分には生体親和性を付与せず、その他の部分（主に側面）には生体親和性を付与したい場合がある。そこで、フッ素含有ヒドロキシアパタイトからなる人工骨（担体）の側面のみにフッ素化合物タグを介してコラーゲン等の生体親和性物質が固定化された（被覆された）人工骨（物質固定化担体）が、前記目的に使用できる。その他、フッ素含有ヒドロキシアパタイトからなる義歯、フッ素樹脂からなる人工臓器、フッ素樹脂を含有するコンタクトレンズ等も、本発明における担体となりうる。

その他の用途としては、細胞培養技術への応用が挙げられる。例えば、フッ素樹脂等からなる培養容器（担体）の表面に、細胞分化誘導物質等がフッ素化合物タグを介して固定化された（被覆された）培養容器（物質固定化担体）が、細胞培養に使用できる。すなわち、そのような培養容器を用いることにより、細胞に対して所望の分化誘導を行うことができ、特に再生医療分野等に有用である。

本発明の物質の固定化方法は、表面の一部又は全部がフッ素化合物からなる担体表面に所望の物質とフッ素化合物タグとの結合物を接触させ、該フッ素化合物タグを担体表面に結合させるものである。その結果、フッ素化合物タグを介して所望の物質が担体表面に固定化される。

本発明の物質の固定化方法では、所望の物質とフッ素化合物タグとの結合物を使用する。該結合物は、所望の物質とフッ素化合物タグとを直接的に結合させたものでもよいし、スペーサーを介して所望の物質とフッ素化合物タグとを間接的に結合させたものでもよい。該結合物を調製する方法としては特に限定はないが、好ましい実施形態では、化学架橋反応を利用する。化学架橋反応としては特に限定はないが、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドとカルボジイミドによる、カルボキシル基とアミノ基との結合反応が挙げられる。すなわち、所望の物質とフッ素化合物タグのどちらか一方にカルボキシル基、他方にアミノ基を導入しておき、該物質と該フッ素化合物タグとをＮ−ヒドロキシスクシンイミドとカルボジイミドの作用による縮合反応により結合させる。スペーサーを用いる場合には、例えば、所望の物質とフッ素化合物タグのいずれか一方にスペーサーをあらかじめ結合させておく。そして、該スペーサーにカルボキシル基又はアミノ基を導入し、同様の縮合反応を行えばよい。使用可能な他の化学架橋反応としては、二価性試薬架橋剤を用いた結合反応が挙げられる。具体的には、マレイミド基とＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステルを分子の両端に持ち、アミノ基にはＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステルが反応し、チオール基にはマレイミド基が選択的に反応するような試薬を用いた結合反応が挙げられる。

他の好ましい実施形態では、カルボン酸チオエステル基と１級アミノ基を有するチオール基との縮合反応を利用して、所望の物質とフッ素化合物タグとの結合物を調製する。本縮合反応は、ネイティブケミカルライゲーション（Native Chemical Ligation）と呼ばれる反応と同一の反応機構を有する反応である。

ネイティブケミカルライゲーションは、元来は、Ｃ末端にチオエステル基を有するポリペプチドと、Ｎ末端がシステイン残基であるポリペプチドとが、中性かつ室温条件下で結合する反応として報告されたものである（Dawson et al., Science, 266, 117-119 (1994); Tam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 12485-12489 (1995)）。すなわち、該カルボン酸チオエステル基と該Ｎ末端システイン残基とが位置特異的に反応し、アミド結合（ペプチド結合）を形成する。ネイティブケミカルライゲーションによれば、末端が保護されていないペプチド同士を結合させることができる。このように、元来のネイティブケミカルライゲーションはペプチド同士が結合する反応であるが、この反応機構はペプチド同士以外でも起こる。すなわち、カルボン酸チオエステルを有する化合物と、Ｎ末端システイン残基と同じ構造のチオール基を有する化合物との間でも、元来のネイティブケミカルライゲーションと同様に、両化合物間にアミド結合が形成される。このようなペプチド以外の化合物同士をネイティブケミカルライゲーションと同一の反応機構で結合する反応を含めて「広義のネイティブケミカルライゲーション」と呼ぶこととする。なお、「Ｎ末端システイン残基と同じ構造のチオール基」は、「１級アミノ基を有するチオール基」や「Ｎ末端システイン残基と同様のアミノ基とチオール基とを有する官能基」等と換言することができる。

そして本実施形態においては、所望の物質とフッ素化合物タグとの結合物を調製する際に、カルボン酸チオエステル基と１級アミノ基を有するチオール基との縮合反応を利用する。これは、換言すれば、広義のネイティブケミカルライゲーションを利用して所望の物質とフッ素化合物タグとの結合物を調製するということである。本実施形態においては、中性かつ室温というマイルドな条件下で所望の物質とフッ素化合物タグとの結合物を調製することができるので、所望の物質が分解、変性、失活等することがない。よって、本実施形態の物質の固定化方法は、蛋白質を担体に固定化する際に特に有用である。なお、本実施形態においては、固定化される物質にカルボン酸チオエステル基を導入し、フッ素化合物タグに１級アミノ基を有するチオール基を導入してもよいし、固定化される物質に１級アミノ基を有するチオール基を導入し、フッ素化合物タグにカルボン酸チオエステル基を導入してもよい。スペーサーを用いる場合には、例えば、所望の物質とフッ素化合物タグのいずれか一方にスペーサーをあらかじめ結合させておく。そして、該スペーサーにカルボン酸チオエステル基又は１級アミノ基を有するチオール基を導入すればよい。

所望の物質が蛋白質の場合で、該蛋白質のＣ末端にカルボン酸チオエステル基を簡便に導入する方法の一つとして、インテインの自己切断作用を利用する方法が挙げられる。インテインは真核動物、古細菌、真正細菌のすべてで見つかっているプロテインスプライシングを行なう蛋白質である。該プロテインスプライシングにより、ペプチド結合の切断と再結合が自己触媒的に行なわれる。このうちの切断作用（自己切断作用）を利用して、所望の蛋白質のＣ末端にカルボン酸チオエステル基を導入することができる。具体的には、まず、インテインのＮ末端側に所望の蛋白質が結合した融合蛋白質を作製する。この際、インテインと所望の蛋白質との間にシステイン残基を導入しておく。次に、該融合蛋白質にメルカプトエタンスルホン酸ナトリウム（ＭＥＳＮＡ）等のチオール化合物を接触させ、インテインの自己切断作用を惹起する。すると、所望の蛋白質とシステイン残基との間のペプチド結合が切断され、同時に該蛋白質のＣ末端がチオエステル化される。このようにして、所望の蛋白質のＣ末端にカルボン酸チオエステル基を導入することができる。なお、インテインの自己切断作用等の詳細については国際公開２００４／０９６８６０号パンフレットに記載されている。さらに、インテインを利用したカルボン酸チオエステル基を導入する方法の詳細については、アイモト Ｓ．「カレント・オーガニック・ケミストリー（Current Organic Chemistry）」，２００１年，第５巻，ｐ４５−８７に記載されている。

本発明の物質の固定化方法においても、ＰＴＦＥ、ＰＦＡ、ＦＥＰ等のフッ素樹脂からなる担体を用いることができる。また、フッ素化合物の分離・精製用に市販されているパーフルオロアルキル基やフルオロアルキル基が結合した樹脂担体（例えば、国産化学社のＦｌｕｏｒｏＦｌａｓｈＳＰＥカートリッジ、ＦｌｕｏｒｏＦｌａｓｈＨＰＬＣカラム等）を、そのまま担体として用いることもできる。ただし、当該樹脂担体を採用した場合は、固定化された物質とアナライトとの相互作用等を解析する目的には不適である。

本発明の物質の固定化方法は、蛋白質若しくはペプチド、糖若しくは糖鎖、又は分子量２０００以下の低分子化合物を担体に固定化する際に用いることができる。もちろん、所望の蛋白質と分子シャペロンとの融合タンパク質を固定化する際にも用いることができる。さらに、所望の蛋白質と分子シャペロンとの融合蛋白質を固定化するのではなく、該融合蛋白質から切り出した所望の蛋白質を固定化してもよい。

以下に実施例を掲げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。

本実施例では、フッ素樹脂基板（担体）の表面にフルオラス・タグ（フッ素化合物タグ）を介してフルオレセイン（分子量２０００以下の低分子化合物）が固定化された基板（物質固定化担体）を作製した。

（１）フルオレセインとフルオラス・タグとの結合物の調製
エチレンジアミン（和光純薬社）をＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（Ｎ，Ｎ’−ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ，ＤＭＦ，ナカライテスク社）に溶解し、１Ｍのエチレンジアミン溶液を調製した。一方、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド−フルオレセイン（ＮＨＳ−フルオレセイン、ピアス社）をＤＭＦに溶解し、０．１ＭのＮＨＳ−フルオレセイン溶液を調製した。調製したＮＨＳ−フルオレセイン溶液のエチレンジアミン０．２当量相当分を、調製したエチレンジアミン溶液に滴下しながら攪拌し、一晩反応させた。反応液を、ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩカラム（ナカライテスク社）を用いた逆相ＨＰＬＣに供した。溶出は、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む水と、０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリルとのグラジエントにて行った。黄色に着色したピークフラクションのうち、ニンヒドリン反応で陽性を示したフラクションを回収した。回収したフラクションを乾固させた。

フルオラス・タグ導入用試薬Ｂｆｐ−ＯＨ（国産化学社）をＤＭＦに溶解し、０．０５ＭのＢｆｐ−ＯＨ溶液を調製した。１．２当量のＮ−ヒドロキシスクシンイミドと１．２当量の水溶性カルボジイミド（1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride、渡辺化学社）とを、調製したＢｆｐ−ＯＨ溶液に固体のまま添加し、攪拌しながら室温で３時間反応させた。この反応液の０．０１ｍｍｏｌ分を乾固させたフラクション０．０１ｍｍｏｌ分に加えた。さらに、０．０３ｍｍｏｌのＤＩＰＥＡ（N,N'-diisopropylethylamine、渡辺化学社）を添加し、攪拌しながら室温で２時間反応させた。この反応液をＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩカラムを用いた逆相ＨＰＬＣに供した。溶出は、０．１％ＴＦＡを含む水と、０．１％ＴＦＡを含むメタノールとのグラジエントにて行った。黄色に着色したフラクションを回収した。回収したフラクションを、エレクトロスプレーイオン化マススペクトロメトリー（Electrospray Ionization Mass Spectrometry、以下「ＥＳＩ−ＭＳ」と称する。）に供したところ、分子量が１４２４．０のピークが得られた。これにより、フルオレセインにＢｆｐ基が導入され、フルオレセインとフルオラス・タグとの結合物が調製された。

（２）フルオラス・タグを介したフルオレセインの基板への固定化
（１）で得られたフルオレセインとフルオラス・タグとの結合物を乾固させ、メタノールに再溶解した。この溶液２μＬをＦＥＰからなるフッ素樹脂基板（ネオフロンＦＥＰ、ダイキン社）にスポットし、乾燥させた。乾燥後、基板表面をＰＢＳで３回洗浄し、基板表面の状態を目視で観察した。対照として、フルオレセインのみのメタノール溶液を同様にしてスポットした（比較例１）。対照では、ＰＢＳによる洗浄は１回とした。図４に基板表面の状態を示す。図４（ａ）は本実施例で作製した基板の表面の写真であり、図４（ｂ）は比較例１の基板の表面の写真である。なお、図４の写真には画像処理が施されており、黄色の部分が強調されている。図４（ａ）に示されるように、本実施例で作製された基板では、スポット部分が黄色を呈した。これは、フルオレセインとフルオラス・タグとの結合物がＰＢＳに洗い流されることなく、フルオレセインがフルオラス・タグを介して基板表面に固定化されていることを示していた。一方、図４（ｂ）に示されるように、比較例１の基板では、フルオレセインが固定化されずに洗浄溶液中に分散し、基板の全体が黄色を呈した。以上より、フッ素樹脂基板の表面に、フルオラス・タグを介してフルオレセインを固定化することができた。

本実施例では、リンカー（スペーサー）を有するフルオラス・タグ（フッ素化合物タグ）を用い、緑色蛍光蛋白質（Green Fluorescent Protein。以下「ＧＦＰ」と称する。）（蛋白質）がフルオラス・タグとリンカーを介して固定化された基板（物質固定化担体）を作製した。リンカーには、カルボン酸チオエステル基が導入されたリンカーを使用した。

（１）リンカーとフルオラス・タグとの結合及びチオエステル化
５０ｍｇのＦｍｏｃ−Ａｌａ−Ａｌｋｏ−ＰＥＧ−Ｒｅｓｉｎ（１００−２００メッシュ、渡辺化学社）を２５％ピペリジン（ナカライテスク社）／Ｎ−メチル−ピロリドン（ＮＭＰ、ナカライテスク社）で処理してＦｍｏｃ基を外し、Ａｌａ−Ａｌｋｏ−ＰＥＧ−Ｒｅｓｉｎを調製した。このＡｌａ−Ａｌｋｏ−ＰＥＧ−ＲｅｓｉｎをＮＭＰで洗浄した。一方、Ｆｍｏｃ基で保護されたアミノ基を有するＰＥＧリンカーとして、O-(N-Fmoc-2-aminoethyl)-O'-(2-carboxyethyl)undecaethyleneglycol（ｎｏｖａｃｈｅｍ社）を選択した。ＮＭＰに、当該ＰＥＧリンカーが０．０６ｍｍｏｌ、１−ヒドロキシルベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ、渡辺化学社）が０．０６ｍｍｏｌ、及びジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、国産化学社）が０．０６５ｍｍｏｌとなるように溶解した。この溶解液を洗浄したＡｌａ−Ａｌｋｏ−ＰＥＧ−Ｒｅｓｉｎに加え、一晩反応させた。これにより、当該ＰＥＧリンカーがＡｌａ−Ａｌｋｏ−ＰＥＧ−ＲｅｓｉｎのＡｌａ（アラニン残基）に結合し、Ｆｍｏｃ−ＰＥＧリンカー−Ａｌａ−Ａｌｋｏ−ＰＥＧ−Ｒｅｓｉｎが生成した。

Ｆｍｏｃ−ＰＥＧリンカー−Ａｌａ−Ａｌｋｏ−ＰＥＧ−Ｒｅｓｉｎを２５％ピペリジン／ＮＭＰで処理してＦｍｏｃ基を外し、ＰＥＧリンカー−Ａｌａ−Ａｌｋｏ−ＰＥＧ−Ｒｅｓｉｎを調製した。このＰＥＧリンカー−Ａｌａ−Ａｌｋｏ−ＰＥＧ−ＲｅｓｉｎをＮＭＰで洗浄した。一方、ＮＭＰに、フルオラス・タグ導入用試薬Ｂｆｐ−ＯＨが０．０６ｍｍｏｌ、ＨＯＢｔが０．０６ｍｍｏｌ、及びＤＣＣが０．０６５ｍｍｏｌとなるように溶解した。この溶解液を洗浄したＰＥＧリンカー−Ａｌａ−Ａｌｋｏ−ＰＥＧ−Ｒｅｓｉｎに加え、一晩反応させた。これにより、ＰＥＧリンカーにＢｆｐ基が結合し、Ｂｆｐ−ＰＥＧリンカー−Ａｌａ−Ａｌｋｏ−ＰＥＧ−Ｒｅｓｉｎが生成した。当該ＲｅｓｉｎをＤＭＦとＮＭＰとで交互に洗浄し、次いでメタノールで洗浄し、未反応のＢｆｐ−ＯＨを除去した。当該Ｒｅｓｉｎをデシケータ内にて陰圧下で乾燥させた。

洗浄及び乾燥させたＢｐｆ−ＰＥＧリンカー−Ａｌａ−Ａｌｋｏ−ＰＥＧ−Ｒｅｓｉｎを５％水／９５％ＴＦＡで２時間処理し、Ｂｆｐ−ＰＥＧリンカー−Ａｌａを生成させた。この反応液を、試料前処理用ＯＤＳカラム（ＴＯＹＯＰＡＫ ＯＤＳ Ｍ、東ソー社）に通し、溶出液を回収した。溶出液を凍結乾燥させた後、メタノールに再溶解させた。この溶解液を水−メタノール系の逆相ＨＰＬＣに供し、フラクションを回収した。このフラクションをＥＳＩ−ＭＳに供したところ、分子量が１６９４のピークが得られた。これにより、このフラクションにリンカーとフルオラス・タグ（Ｂｆｐ基）との結合物（Ｂｐｆ−ＰＥＧリンカー−Ａｌａ）が含まれていることが確認された。

得られたフラクションを乾燥させた後、ＤＭＦに再溶解した。この溶解液に、メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム（ナカライテスク社）、ＨＯＢｔ、及び水溶性カルボジイミド・塩酸塩（ＷＳＣＩ・ＨＣｌ、渡辺化学社）を加え、Ａｌａのカルボキシル基をチオエステル化した。この反応液を水−メタノール系の逆相ＨＰＬＣに供し、フラクションを回収した。このフラクションをＥＳＩ−ＭＳに供したところ、分子量が１８１８のピークが得られた。これにより、このフラクションにＡｌａのカルボキシル基がチオエステル化されているＢｆｐ−ＰＥＧリンカー−Ａｌａが含まれていることが確認された。以上より、カルボン酸チオエステル基を有するリンカー（チオエステル化リンカー）とフルオラス・タグとの結合物が調製された。

（３）ＰＰＩａｓｅとの融合蛋白質を発現するためのベクターの構築
超好熱性古細菌であるＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ＫＳ−１株（ＪＣＭ Ｎｏ．１１８１６）からゲノムＤＮＡを調製した。このゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１と２に示されるオリゴヌクレオチドをプライマー対として用いてＰＣＲを行い、配列番号３に示されるＰＰＩａｓｅ遺伝子（ＴＰＰＩａｓｅ遺伝子）を含むＤＮＡ断片を増幅した。一方、配列番号４に示されるオリゴヌクレオチドと、それに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、これらをアニーリングさせて２本鎖ＤＮＡ断片を得た。該増幅ＤＮＡ断片をＮｃｏＩとＳｐｅＩで処理した。さらに、該２本鎖ＤＮＡ断片をＳｐｅＩとＥｃｏＲＩで処理した。制限酵素で処理されたこれらのＤＮＡ断片を、あらかじめＮｃｏＩとＥｃｏＲＩで処理されたｐＥＴ２１ｄプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ社）のＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩサイトに導入し、ｐＥＴ ＴＰＰＩａｓｅを構築した。図５にｐＥＴ ＴＰＰＩａｓｅの主要部の構成を模式的に示す。すなわち、ｐＥＴ ＴＰＰＩａｓｅはＴ７プロモーターを有し、さらにその下流に、ＴＰＰＩａｓｅ遺伝子、ＳｐｅＩサイト、ＢａｍＨＩサイト、及びＮｏｔＩサイトを有する。そして、ｐＥＴ ＴＰＰＩａｓｅのＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩサイトに所望の蛋白質をコードする遺伝子を挿入することにより、所望の蛋白質とＴＰＰＩａｓｅとの融合蛋白質を発現させることができる。

ｐＩＶＥＸ２．３−ＧＦＰ ＷＴ（ロシュ・ダイアグノスティックス社）を鋳型とし、配列番号５と６に示されるオリゴヌクレオチドをプライマー対として用いてＰＣＲを行い、配列番号７に示されるＧＦＰ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。プライマーに由来して、この増幅ＤＮＡ断片の５’末端にはＢａｍＨＩサイト、プロテアーゼＦＸａの認識配列、及びシステインに対応するコドン（ＴＧＣ）が導入され、３'末端にはＨｉｓタグをコードする塩基配列、終止コドン、及びＮｏｔＩサイトが導入された。この増幅ＤＮＡ断片をＢａｍＨＩとＮｏｔＩで処理し、あらかじめ同じ制限酵素で処理された発現ベクターｐＥＴ ＴＰＰＩａｓｅに組み込んだ。これにより、ＧＦＰとＴＰＰＩａｓｅとの融合蛋白質を発現するベクターｐＥＴ ＴＰＰＩａｓｅ・ＦＸａ・Ｃｙｓ・ＧＦＰ・６Ｈが構築された。

（４）ＧＦＰとＴＰＰＩａｓｅとの融合蛋白質の調製
（３）で得られた発現ベクターｐＥＴ ＴＰＰＩａｓｅ・ＦＸａ・Ｃｙｓ・ＧＦＰ・６Ｈを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、カルベニシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含む２×Ｙ．Ｔ．培地（１６ｇ／Ｌ バクトトリプトン、１０ｇ／Ｌ 酵母エキス、５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ）で、２５℃で２４時間培養した。培養終了後、菌体を回収した。回収した菌体を、プロテアーゼインヒビターカクテル（ナカライテスク社）及び０．２ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、超音波処理を行って菌体を破砕した。菌体破砕液を遠心処理し、上清を得た。得られた上清をＨｉＴｒａｐ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇカラム（アマシャムバイオサイエンス社）に供し、融合蛋白質を含むフラクションを回収した。

（５）融合蛋白質からのＧＦＰの切り出し
（４）で回収したフラクションを、１００ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対する透析に供した。透析内液を回収し、ＣａＣｌ２を最終濃度が２ｍＭになるように添加した。さらに、ＦＸａ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）を添加し、融合蛋白質内のＦＸａ認識配列の部分を切断した。これにより、Ｎ末端にシステイン残基を有し、Ｃ末端側にＨｉｓタグを有するＧＦＰ（以下、「Ｃｙｓ・ＧＦＰ・６Ｈ」と称する。）を得た。

（６）チオエステル化リンカー−フルオラス・タグ結合物と蛋白質との結合
（１）で調製されたチオエステル化リンカーとフルオラス・タグとの結合物を、０．１Ｍ ナトリウムリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、フルオラス・タグ溶液を調製した。一方、（５）で得られたＣｙｓ・ＧＦＰ・６Ｈを含むフラクションを、０．１Ｍ ナトリウムリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対する透析に供した。透析内液を回収し、調製したフルオラス・タグの溶液を添加し、室温で１時間反応させた。添加量は、１００μｇ／ｍＬ（３．７μＭ）の蛋白質に対し、約１５倍のモル濃度のフルオラス・タグ溶液を等量とした。これにより、カルボン酸チオエステル基を有するリンカーに結合したフルオラス・タグに、Ｃｙｓ・ＧＦＰ・６Ｈを結合させた。

（７）基板への固定化
反応終了後、反応液をＦＥＰからなるフッ素樹脂基板（ネオフロンＦＥＰ、ダイキン社）の表面にスポットした。３０分経過後、基板表面をＰＢＳで２回洗浄した。基板表面にＵＶを照射して、ＧＦＰが発する蛍光の有無を目視で観察した。対照として、フルオラス・タグ溶液の代わりに０．１Ｍ ナトリウムリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）のみを用いて、同様の操作を行った（比較例２）。図６に基板表面の状態を示す。図６（ａ）は、本実施例及び比較例２の基板の表面の写真、図６（ｂ）は各スポットの位置を表す模式図である。図６（ｂ）のａ及びｂは本実施例のスポット位置、ｃ及びｄは比較例のスポット位置を表す。図６（ａ）に示されるように、ａ及びｂの位置にはＧＦＰ由来の蛍光が観察され、白く光っていた。これは、Ｃｙｓ・ＧＦＰ・６ＨがＰＢＳに洗い流されることなく、リンカーとフルオラス・タグとを介して基板表面に固定化されていることを示していた。一方、ｃ及びｄの位置にはＧＦＰ由来の蛍光が観察されなかった。これは、Ｃｙｓ・ＧＦＰ・６ＨがＰＢＳに洗い流されたことを示していた。

本実施例では、フッ素樹脂基板を用いることで、蛋白質の非特異的吸着を防ぐことができることを示した。

実施例２で得られた組換え蛋白質Ｃｙｓ・ＧＦＰ・６Ｈを０．１Ｍ ナトリウムリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析した後、１０００、１００、１０、１、０．１、及び、０μｇ／ｍＬに濃度調整した。ＦＥＰからなるフッ素樹脂基板（ネオフロンＦＥＰ、ダイキン社）の表面に、各濃度の溶液を１０μＬスポットした。基板表面を乾燥させた後、ＰＢＳで３回洗浄し、以下の手順でＥＬＩＳＡを行った。

まず、ブロックエース（大日本製薬社）をＰＢＳで３倍希釈し、ブロッキング液を調製した。１次抗体液として、マウス抗Ｈｉｓモノクローナル抗体（アマシャムバイオサイエンス社）をブロッキング液で１０００倍希釈したものを調製した。２次抗体液として、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰコンジュゲート（バイオラッド社）をブロッキング液で１０００倍希釈したものを調製した。洗浄液として、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳを調製した。

基板上の各スポット部分にブロッキング液を２０μＬずつ滴下し、２５℃で１時間静置し、ブロッキングを行なった。ブロッキング液を除去し、各スポット部分を洗浄液で洗浄した。次に、各スポット部分に１次抗体液を１０μＬずつ滴下し、２５℃で１時間静置した。１次抗体液を除去し、各スポット部分を洗浄液で洗浄した。次に、各スポット部分に２次抗体液を１０μＬずつ滴下し、２５℃で１時間静置した。２次抗体液を除去し、各スポット部分を洗浄液で洗浄した。次に、各スポット部分にＨＲＰの基質となる発色試薬（TMB Microwell 1 Component Peroxidase Substrate、BioFX Laboratories社）を１０μＬずつ滴下し、青色の発色の有無を観察した。対照として、フッ素樹脂基板の代わりにポリスチレン製の９６穴ＥＬＩＳＡプレート（ＳＵＭＩＬＯＮ、Ｈ−ｔｙｐｅ、住友ベークライト社）を用い、同様の操作を行った（比較例３）。ただし、比較例３においては、蛋白質は５０μＬずつ、ブロッキング液は１００μＬずつ、１次抗体液は１００μＬずつ、２次抗体は１００μＬずつを用いた。結果を図７に示す。図７（ａ）は本実施例のＥＬＩＳＡの結果を表す写真であり、図７（ｂ）は比較例３のＥＬＩＳＡの結果を表す写真である。図７（ａ）に示されるように、フッ素樹脂基板を用いた本実施例ではいずれの濃度においても青色の発色は観察されず、Ｃｙｓ・ＧＦＰ・６Ｈが吸着していないことが示された。一方、ポリスチレン製のプレートを用いた比較例３では、濃度に比例した強度の青色の発色が観察され、Ｃｙｓ・ＧＦＰ・６Ｈがプレートに吸着していた。以上より、フッ素樹脂基板を用いることで、蛋白質の非特異的吸着を抑えることができた。

なお、本実施例ではブロッキングを行なったが、ブロッキングを行なわなくても同様の結果を得ることができる。

本実施例では、固定化されたフルオレセインをフッ素樹脂基板から除去できることを示した。

実施例１で作製した、フルオラス・タグを介して基板表面にフルオレセインが固定化された物質固定化基板を、（ａ）メタノール、（ｂ）２０％エチレングリコール水溶液、（ｃ）１０％エチレングリコール水溶液、（ｄ）グリセロール、又は（ｅ）０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ、で洗浄してみた。結果を図８に示す。図８は実施例１で作製した物質固定化基板を各種の溶媒で洗浄した結果を表す写真である。なお、図８の写真には画像処理が施されており、黄色の部分が強調されている。すなわち、（ａ）、（ｂ）に示されるように、メタノール又は２０％エチレングリコール水溶液で洗浄した場合は、固定化されていたフルオレセインが剥がれてフルオレセインが洗浄溶液中に分散し、基板の全体が黄色を呈した。一方、（ｃ）〜（ｅ）に示されるように、１０％エチレングリコール水溶液、グリセロール、又は０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄した場合は、固定化されていたフルオレセインが剥がれることはなく、スポット部分が黄色を呈した。以上より、実施例１で作製したフルオレセインが固定化された基板においては、特定の溶媒を用いることでフルオレセインを剥がせることが示された。

本実施例では、モデル蛋白質としてＧＦＰを採用し、フッ素樹脂基板（担体）の表面にフルオラス・タグ（フッ素化合物タグ）を介してＧＦＰ（蛋白質）が固定化された基板（物質固定化担体）を作製した。さらに、当該ＧＦＰ固定化基板（物質固定化担体）を用いることで、高感度の分析（ＥＬＩＳＡ）が行えることを示した。

フルオラス・タグ導入用試薬Ｂｆｐ−ＯＨ（国産化学社）をＤＭＦに溶解し、０．０５ＭのＢｆｐ−ＯＨ溶液を調製した。１．２当量のＮ−ヒドロキシスクシンイミドと１．２当量の水溶性カルボジイミド（1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride、渡辺化学社）とを、調製したＢｆｐ−ＯＨ溶液に固体のまま添加し、攪拌しながら室温で１時間反応させた。この溶液を「溶液Ａ」とした。一方、対照用としてＢｆｐ−ＯＨを添加せずに同様の操作を行った。この溶液を「溶液Ｂ」とした。

実施例２で得られた組換え蛋白質Ｃｙｓ・ＧＦＰ・６Ｈを０．１Ｍ ナトリウムリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析した後、１０μｇ／ｍＬ（溶液Ｃ１）、１μｇ／ｍＬ（溶液Ｃ２）、０．１μｇ／ｍＬ（溶液Ｃ３）、０．０１μｇ／ｍＬ（溶液Ｃ４）、１ｎｇ／ｍＬ（溶液Ｃ５）、０．１ｎｇ／ｍＬ（溶液Ｃ６）、０．０１ｎｇ／ｍＬ（溶液Ｃ７）、１ｐｇ／ｍＬ（溶液Ｃ８）、及び０ｐｇ／ｍＬ（溶液Ｃ９）の各濃度の溶液を調製した。なお、溶液Ｃ９は０．１Ｍ ナトリウムリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）そのものである。

ＦＥＰからなるフッ素樹脂基板（ネオフロンＦＥＰ、ダイキン社）の表面に、溶液Ａを１μＬずつ９箇所×１列にスポットした。各スポット部分ごとに、溶液Ｃ１〜Ｃ９を１０μＬさらにスポットした。基板表面を乾燥させた後、ＰＢＳで３回洗浄し、以下の手順でＥＬＩＳＡを行った。

ブロックエース（大日本製薬社）をＰＢＳで３倍希釈し、ブロッキング液を調製した。１次抗体液として、マウス抗Ｈｉｓモノクローナル抗体（アマシャムバイオサイエンス社）をブロッキング液で１００倍希釈したものを調製した。２次抗体液として、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）モノクローナル抗体−ＨＲＰコンジュゲート（バイオラッド社）をブロッキング液で５００倍希釈したものを調製した。洗浄液として、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳを調製した。

ＰＢＳで洗浄した基板上の各スポット部分にブロッキング液を２０μＬずつ滴下し、２５℃で１時間静置し、ブロッキングを行なった。ブロッキング液を除去し、各スポット部分を洗浄液で洗浄した。次に、各スポット部分に１次抗体液を１０μＬずつ滴下し、２５℃で１時間静置した。１次抗体液を除去し、各スポット部分を洗浄液で洗浄した。次に、各スポット部分に２次抗体液を１０μＬずつ滴下し、２５℃で１時間静置した。２次抗体液を除去し、各スポット部分を洗浄液で洗浄した。次に、各スポット部分にＨＲＰの基質となる発色試薬（TMB Microwell 1 Component Peroxidase Substrate、BioFX Laboratories社）を１０μＬずつ滴下し、青色の発色の有無と強度を観察した。
対照として、溶液Ａの代わりに溶液Ｂを用いて、同様のＥＬＩＳＡを行った（比較例５）。

結果を図９に示す。図９（ａ）は本実施例で作製した基板を用いたＥＬＩＳＡの結果を表す写真であり、図９（ｂ）は比較例５のＥＬＩＳＡの結果を表す写真である。図９（ａ）に示されるように、本実施例で作製した基板（溶液Ａを使用）を用いた場合には、Ｃｙｓ・ＧＦＰ・６Ｈの濃度に比例した強度の青色の発色が観察された。一方、図９（ｂ）に示されるように、比較例５の基板（溶液Ｂを使用）では、いずれの濃度においても青色の発色は観察されなかった。以上より、フッ素樹脂基板の表面に、フルオラスタグを介してＣｙｓ・ＧＦＰ・６Ｈを固定化することができ（ＧＦＰ固定化基板）、かつ当該ＧＦＰ固定化基板を用いることにより、ＥＬＩＳＡによるＣｙｓ・ＧＦＰ・６Ｈの定性および定量が可能であった。
なお、本実施例ではブロッキングを行なったが、ブロッキングを行なわなくても同様の結果を得ることができる。

本実施例では、モデル蛋白質として大腸菌由来シャペロニン（ＧｒｏＥＬ）サブユニット連結体とヒトエンドセリンレセプタータイプＡ（ＥＴＡＲ）とＦＬＡＧペプチドとの融合蛋白質を採用し、フッ素樹脂基板（担体）の表面にフルオラス・タグ（フッ素化合物タグ）を介して当該融合蛋白質（蛋白質）が固定化された基板（物質固定化担体）を作製した。さらに、当該融合蛋白質固定化基板（物質固定化担体）を用いることで、高感度の分析（ＥＬＩＳＡ）が行えることを示した。

（１）変異型ＧｒｏＥＬサブユニット７回連結体とヒトエンドセリンレセプタータイプＡとＦＬＡＧペプチドとの融合蛋白質（ＳＲＩＩ）７・ＥＴＡＲ・ＦＬＡＧの発現系構築
大腸菌Ｋ１２株ゲノムＤＮＡを鋳型とし、プライマーＧｒｏ−Ｆ１（配列番号８）とプライマーＧｒｏ−Ｒ１（配列番号９）をプライマー対としてＰＣＲを行い、大腸菌シャペロニンＧｒｏＥＬサブユニット遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。このＧｒｏＥＬサブユニット遺伝子中のＤｒａＩＩＩサイトからＢａｍＨＩサイトまでの部分（１３２８〜１４８７番）を同制限酵素で切り出した後、配列番号１０で表される塩基配列からなる２本鎖ＤＮＡを代わりに組み込み、ＧｒｏＥＬサブユニットの４５２番目のアルギニン（Ｒ）をグルタミン酸（Ｅ）に、４６１番目のグルタミン酸（Ｅ）をアラニン（Ａ）に、４６３番目のセリン（Ｓ）をアラニン（Ａ）に、及び４６４番目のバリン（Ｖ）をアラニン（Ａ）に置換する変異を導入した。これにより、シングルリングを形成する変異型ＧｒｏＥＬ（以下、「ＳＲＩＩ」と称する。）のサブユニット（ＳＲＩＩサブユニット）をコードする遺伝子（配列番号１１。以下、「ＳＲＩＩサブユニット遺伝子」と称する。）が得られた。

さらに、ｔｒｃプロモーターを有し、ＳＲＩＩサブユニット遺伝子が一方向に７回連結した遺伝子（ＳＲＩＩサブユニット７回連結体遺伝子）が挿入された発現ベクターｐＴ(ＳＲＩＩ)７を構築した。なお、ＳＲＩＩサブユニット７回連結体遺伝子の下流には、目的蛋白質をコードする遺伝子を挿入するためのサイトとして、ＢｇｌＩＩサイト及びＸｈｏＩサイトを設けた。ｐＴ(ＳＲＩＩ)７のＸｈｏＩサイトの下流に、翻訳されてＦＬＡＧペプチド（配列番号１２）となる遺伝子を導入し、ｐＴ(ＳＲＩＩ)７・ＦＬＡＧを構築した。図１０にｐＴ(ＳＲＩＩ)７・ＦＬＡＧの主要部の構成を模式的に示す。すなわち、ｐＴ(ＳＲＩＩ)７・ＦＬＡＧはｔｒｃプロモーターを有し、さらにその下流に、ＮｃｏＩサイト、ＳＲＩＩサブユニット７回連結体遺伝子、ＸｂａＩサイト、ＢｇｌＩＩサイト、ＸｈｏＩサイト、ＦＬＡＧペプチド遺伝子、終止コドン、及びＨｉｎｄＩＩＩサイトを有する。そして、ｐＴ(ＳＲＩＩ)７・ＦＬＡＧのＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩサイトに所望の蛋白質をコードする遺伝子を挿入することにより、ＳＲＩＩサブユニット７回連結体（ＳＲＩＩ）７と所望の蛋白質とＦＬＡＧペプチドとの融合蛋白質を発現させることができる。なお、天然型ＧｒｏＥＬが２層リング構造体を形成するのに対し、変異型ＧｒｏＥＬであるＳＲＩＩは１層リング（シングルリング）構造体を形成する。そして、ＳＲＩＩサブユニット７回連結体も１層リング構造体を形成する。

ＰＣＲ法にてヒトエンドセリンレセプタータイプＡ（ＥＴＡＲ）遺伝子（配列番号１３）を増幅し、ｐＴ(ＳＲＩＩ)７・ＦＬＡＧのＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩサイトに組み込んだ。これにより、ＳＲＩＩサブユニット７回連結体（ＳＲＩＩ）７とＥＴＡＲとＦＬＡＧペプチドとの融合蛋白質（ＳＲＩＩ）７・ＥＴＡＲ・ＦＬＡＧを発現する発現ベクターｐＴ(ＳＲＩＩ)７・ＥＴＡＲ・ＦＬＡＧを構築した。図１１にｐＴ(ＳＲＩＩ)７・ＥＴＡＲ・ＦＬＡＧの主要部の構成を模式的に示す。

（２）（ＳＲＩＩ）７・ＥＴＡＲ・ＦＬＡＧの調製
（１）で得られた発現ベクターｐＴ(ＳＲＩＩ)７・ＥＴＡＲ・ＦＬＡＧを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、カルベニシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含む２ＸＹ．Ｔ．培地にて、３０℃で２４時間培養した。培養終了後、菌体を回収した。回収した菌体を、５０ｍＭ ナトリウム燐酸緩衝液 ｐＨ７・０に懸濁し、プロテアーゼインヒビターカクテル（ナカライテスク製）存在下、超音波処理にて菌体を破砕後、遠心により菌体破砕液上清を得た。得られた菌体破砕液上清を抗ＦＬＡＧペプチド抗体担持カラムに供し、ＳＲＩＩサブユニット７回連結体とＥＴＡＲとＦＬＡＧペプチドとの融合蛋白質（ＳＲＩＩ）７・ＥＴＡＲ・ＦＬＡＧを精製した。

（３）（ＳＲＩＩ）７・ＥＴＡＲ・ＦＬＡＧ固定化基板の作製とそれを用いたＥＬＩＳＡ
実施例５と同様にして、Ｂｆｐ−ＯＨとＮ−ヒドロキシスクシンイミドと水溶性カルボジイミドを反応させて「溶液Ａ」を調製した。また、対照用としてＢｆｐ−ＯＨを添加せずに同様の操作を行って「溶液Ｂ」を調製した。

（２）で得られた（ＳＲＩＩ）７・ＥＴＡＲ・ＦＬＡＧを０．１Ｍ ナトリウムリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析した後、１μｇ／ｍＬ（溶液Ｄ１）、０．１μｇ／ｍＬ（溶液Ｄ２）、０．０１μｇ／ｍＬ（溶液Ｄ３）、１ｎｇ／ｍＬ（溶液Ｄ４）、０．１ｎｇ／ｍＬ（溶液Ｄ５）、０．０１ｎｇ／ｍＬ（溶液Ｄ６）、１ｐｇ／ｍＬ（溶液Ｄ７）、及び０ｐｇ／ｍＬ（溶液Ｄ８）の各濃度の溶液を調製した。なお、溶液Ｄ８は０．１Ｍ ナトリウムリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）そのものである。

ＦＥＰからなるフッ素樹脂基板（ネオフロンＦＥＰ、ダイキン社）の表面に、溶液Ａを１μＬずつ８箇所×１列にスポットした。各スポット部分ごとに、溶液Ｄ１〜Ｄ９を１０μＬさらにスポットした。基板表面を乾燥させた後、ＰＢＳで３回洗浄した。その後、１次抗体としてマウス抗ＦＬＡＧペプチドモノクローナル抗体（シグマ社）を用いる以外は全て実施例５と同様にしてＥＬＩＳＡを行い、各スポットにおける青色の発色の有無と強度を観察した。
対照として、溶液Ａの代わりに溶液Ｂを用いて、同様のＥＬＩＳＡを行った（比較例６）。

結果を図１２に示す。図９（ａ）は本実施例で作製した基板を用いたＥＬＩＳＡの結果を表す写真であり、図９（ｂ）は比較例６のＥＬＩＳＡの結果を表す写真である。図１２（ａ）に示されるように、本実施例で作製した基板（溶液Ａを使用）を用いた場合には、（ＳＲＩＩ）７・ＥＴＡＲ・ＦＬＡＧの濃度に比例した強度の青色の発色が観察された。一方、図９（ｂ）に示されるように、比較例６の基板（溶液Ｂを使用）では、いずれの濃度においても青色の発色は観察されなかった。以上より、フッ素樹脂基板の表面に、フルオラスタグを介して（ＳＲＩＩ）７・ＥＴＡＲ・ＦＬＡＧを固定化することができ（（ＳＲＩＩ）７・ＥＴＡＲ・ＦＬＡＧ固定化基板）、かつ当該（ＳＲＩＩ）７・ＥＴＡＲ・ＦＬＡＧ固定化基板を用いることにより、ＥＬＩＳＡによる（ＳＲＩＩ）７・ＥＴＡＲ・ＦＬＡＧの定性および定量が可能であった。
なお、本実施例ではブロッキングを行なったが、ブロッキングを行なわなくても同様の結果を得ることができる。

本実施例で作製した（ＳＲＩＩ）７・ＥＴＡＲ・ＦＬＡＧ固定化基板は、例えば、レセプターバインディングアッセイにも用いることができる。すなわち、当該基板に被験物質を接触させ、ＥＴＡＲに結合するリガンドの検索等を行うことができる。

本実施例では、モデル蛋白質としてＳＲＩＩサブユニット連結体とＺＺタグとＦＬＡＧペプチドとの融合蛋白質を採用し、フッ素樹脂基板（担体）の表面にフルオラス・タグ（フッ素化合物タグ）を介して当該融合蛋白質（蛋白質）が固定化された基板（物質固定化担体）を作製した。さらに、当該融合蛋白質固定化基板（物質固定化担体）を用いることで、高感度の分析（ＥＬＩＳＡ）が行えることを示した。

（１）ＳＲＩＩサブユニット７回連結体とＺＺタグとＦＬＡＧペプチドとの融合蛋白質(ＳＲＩＩ)７・ＺＺ・ＦＬＡＧの発現系構築
ｐＥＺＺ １８ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ（アマシャムバイオサイエンス社)を鋳型としてＰＣＲを行い、ＺＺタグ遺伝子（配列番号１４）をクローニングした。実施例６で構築したｐＴ(ＳＲＩＩ)７・ＦＬＡＧのＸｂａＩ−ＢｇｌＩＩサイトに、クローニングしたＺＺタグ遺伝子を両端にＸｂａＩサイトとＢｇｌＩＩサイトを設けた状態で組み込み、ＳＲＩＩサブユニット７回連結体(ＳＲＩＩ)７とＺＺタグとＦＬＡＧペプチドとの融合蛋白質(ＳＲＩＩ)７・ＺＺ・ＦＬＡＧを発現する発現ベクターｐＴ(ＳＲＩＩ)７・ＺＺ・ＦＬＡＧを構築した。図１３にｐＴ(ＳＲＩＩ)７・ＺＺ・ＦＬＡＧの主要部の構成を模式的に示す。

（２）(ＳＲＩＩ)７・ＺＺ・ＦＬＡＧの調製
得られたｐＴ(ＳＲＩＩ)７・ＺＺ・ＦＬＡＧについて、実施例６と同様にして、大腸菌への導入、大腸菌の培養、菌体破砕液上清調製、抗ＦＬＡＧペプチド抗体担持カラムでの精製を行い、ＳＲＩＩサブユニット７回連結体とＺＺタグとＦＬＡＧペプチドとの融合蛋白質(ＳＲＩＩ)７・ＺＺ・ＦＬＡＧを精製した。

（３）(ＳＲＩＩ)７・ＺＺ・ＦＬＡＧ固定化基板の作製とそれを用いたＥＬＩＳＡ
実施例５，６と同様にして、Ｂｆｐ−ＯＨとＮ−ヒドロキシスクシンイミドと水溶性カルボジイミドを反応させて「溶液Ａ」を調製した。また、対照用としてＢｆｐ−ＯＨを添加せずに同様の操作を行って「溶液Ｂ」を調製した。

（２）で得られた(ＳＲＩＩ)７・ＺＺ・ＦＬＡＧを０．１Ｍ ナトリウムリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析した後、１００μｇ／ｍＬ（溶液Ｅ１）、１０μｇ／ｍＬ（溶液Ｅ２）、１μｇ／ｍＬ（溶液Ｅ３）、０．１μｇ／ｍＬ（溶液Ｅ４）、０．０１μｇ／ｍＬ（溶液Ｅ５）、１ｎｇ／ｍＬ（溶液Ｅ６）、０．１ｎｇ／ｍＬ（溶液Ｅ７）、０．０１ｎｇ／ｍＬ（溶液Ｅ８）、１ｐｇ／ｍＬ（溶液Ｅ９）、及び０ｐｇ／ｍＬ（溶液Ｅ１０）の各濃度の溶液を調製した。なお、溶液Ｅ１０は０．１Ｍ ナトリウムリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）そのものである。

ＦＥＰからなるフッ素樹脂基板（ネオフロンＦＥＰ、ダイキン社）の表面に、溶液Ａを１μＬずつ１０箇所×５列にスポットした。各列の各スポット部分ごとに、溶液Ｅ１〜Ｅ９を１０μＬさらにスポットした。基板表面を乾燥させた後、ＰＢＳで３回洗浄し、以下の手順でＥＬＩＳＡを行った。

ブロックエースをＰＢＳで３倍希釈し、ブロッキング液を調製した。抗体液として、マウス抗フルオレセインモノクローナル抗体−ＨＲＰコンジュゲート（ケミコン社）をブロッキング液で１０００倍希釈（抗体濃度：１μｇ／ｍＬ）、１００倍希釈（抗体濃度：１０μｇ／ｍＬ）、２０倍希釈（抗体濃度：５０μｇ／ｍＬ）、及び１０倍希釈（抗体濃度：１００μｇ／ｍＬ）したものを調製した。さらに、ブロッキング液そのもの（抗体濃度：０μｇ／ｍＬ）も調製した。洗浄液として、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳを調製した。

基板上の各スポット部分にブロッキング液を２０μＬずつ滴下し、２５℃で１時間静置し、ブロッキングを行なった。ブロッキング液を除去し、各スポット部分を洗浄液で洗浄した。次に、各スポット部分に各濃度の抗体液を重ならないように１０μＬずつ滴下し、２５℃で１時間静置した。各抗体液を除去し、各スポット部分を洗浄液で洗浄した。次に、各スポット部分にＨＲＰの基質となる発色試薬（TMB Microwell 1 Component Peroxidase Substrate、BioFX Laboratories社）を１０μＬずつ滴下し、青色の発色の有無と強度を観察した。
対照として、溶液Ａの代わりに溶液Ｂを用いて、同様のＥＬＩＳＡを行った（比較例７）。

結果を図１４に示す。図１４（ａ）は本実施例で作製した基板を用いたＥＬＩＳＡの結果を表す写真であり、図１４（ｂ）は比較例７のＥＬＩＳＡの結果を表す写真である。図１４（ａ）に示されるように、本実施例で作製した基板（溶液Ａを使用）を用いた場合には、抗体液の希釈率が１００倍以下（抗体濃度が１０μｇ／ｍＬ以上）の条件で、(ＳＲＩＩ)７・ＺＺ・ＦＬＡＧの濃度に比例した強度の青色の発色が観察された。一方、図１４（ｂ）に示されるように、比較例７の基板（溶液Ｂを使用）では、いずれの濃度においても青色の発色は観察されなかった。以上より、フッ素樹脂基板の表面に、フルオラスタグを介して(ＳＲＩＩ)７・ＺＺ・ＦＬＡＧを固定化することができ（(ＳＲＩＩ)７・ＺＺ・ＦＬＡＧ固定化基板）、かつ当該(ＳＲＩＩ)７・ＺＺ・ＦＬＡＧ固定化基板を用いることにより、ＥＬＩＳＡによる(ＳＲＩＩ)７・ＺＺ・ＦＬＡＧの定性および定量が可能であった。
なお、本実施例ではブロッキングを行なったが、ブロッキングを行なわなくても同様の結果を得ることができる。

本実施例で作製した(ＳＲＩＩ)７・ＺＺ・ＦＬＡＧ固定化基板は、例えば、イムノアッセイの系を構築するのに用いることができる。すなわち、(ＳＲＩＩ)７・ＺＺ・ＦＬＡＧ固定化基板のＺＺタグ部分に所望の抗原に対する抗体を結合させることにより、当該抗原の定性および定量が可能なイムノアッセイの系が構築できる。

本発明の物質固定化基板の第１の例の構造を表す模式図である。 本発明の物質固定化基板の第２の例の構造を表す模式図である。 本発明の物質固定化基板の第３の例の構造を表し、（ａ）はフッ素化合物タグが分子シャペロンに結合している場合の構造を表す模式図であり、（ｂ）はフッ素化合物タグが所望の蛋白質に結合している場合の構造を表す模式図である。 （ａ）は実施例１で作製した基板の表面の写真であり、（ｂ）は比較例１の基板の表面の写真である。 ｐＥＴ ＴＰＰＩａｓｅの主要部の構成を模式的に表す図である。 （ａ）は実施例２及び比較例２の基板の表面の写真であり、（ｂ）は各スポットの位置を表す模式図である。 （ａ）は実施例３のＥＬＩＳＡの結果を表す写真であり、（ｂ）は比較例３のＥＬＩＳＡの結果を表す写真である。 実施例４において、実施例１で作製した物質固定化基板を各種の溶媒で洗浄された基板の表面の写真であり、（ａ）はメタノール、（ｂ）は２０％エチレングリコール水溶液、（ｃ）は１０％エチレングリコール水溶液、（ｄ）はグリセロール、（ｅ）は０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ、で洗浄された場合を表す。 （ａ）は実施例５のＥＬＩＳＡの結果を表す写真であり、（ｂ）は比較例５のＥＬＩＳＡの結果を表す写真である。 ｐＴ(ＳＲＩＩ)７・ＦＬＡＧの主要部の構成を模式的に表す図である。 ｐＴ(ＳＲＩＩ)７・ＥＴＡＲ・ＦＬＡＧの主要部の構成を模式的に表す図である。 （ａ）は実施例６のＥＬＩＳＡの結果を表す写真であり、（ｂ）は比較例６のＥＬＩＳＡの結果を表す写真である。 ｐＴ(ＳＲＩＩ)７・ＺＺ・ＦＬＡＧの主要部の構成を模式的に表す図である。 （ａ）は実施例７のＥＬＩＳＡの結果を表す写真であり、（ｂ）は比較例７のＥＬＩＳＡの結果を表す写真である。

符号の説明

１ 物質固定化担体
２ 基板
３ フッ素化合物タグ
５ 物質
６ 表面
７ スペーサー
８ 分子シャペロン
１０ 融合蛋白質
１１ 物質固定化担体
１５ 蛋白質（物質）
２０ 融合蛋白質
２１ 物質固定化担体
３１ 物質固定化担体

Claims (20)

1. 担体の表面に所望の物質が固定化された物質固定化担体であって、前記担体の表面の一部又は全部はフッ素化合物からなり、前記物質にはフッ素化合物タグが結合しており、該フッ素化合物タグが担体表面のフッ素化合物からなる部分に結合していることを特徴とする物質固定化担体。
2. 前記担体は、基板であることを特徴とする請求項１に記載の物質固定化担体。
3. 前記担体は、フッ素樹脂からなる担体であることを特徴とする請求項１又は２に記載の物質固定化担体。
4. 前記フッ素樹脂は、テトラフロロエチレン樹脂、パーフロロアルコキシ樹脂、及びフッ化エチレンプロピレン樹脂からなる群より選ばれた少なくとも１種のフッ素樹脂であることを特徴とする請求項３に記載の物質固定化担体。
5. 前記フッ素化合物タグは、スペーサーを介して前記物質に結合していることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の物質固定化担体。
6. 前記物質は、蛋白質又はペプチドであることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の物質固定化担体。
7. 前記蛋白質は、所望の蛋白質と分子シャペロンとの融合蛋白質であることを特徴とする請求項６に記載の物質固定化担体。
8. 前記分子シャペロンは、シャペロニンであることを特徴とする請求項７に記載の物質固定化担体。
9. 前記分子シャペロンは、ペプチジル−プロリル シス−トランス イソメラーゼであることを特徴とする請求項７に記載の物質固定化担体。
10. 前記物質は、糖又は糖鎖であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の物質固定化担体。
11. 前記物質は、分子量２０００以下の低分子化合物であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の物質固定化担体。
12. 担体の表面に所望の物質を固定化する物質の固定化方法であって、表面の一部又は全部がフッ素化合物からなる担体の表面に所望の物質とフッ素化合物タグとの結合物を接触させ、該フッ素化合物タグを担体表面のフッ素化合物からなる部分に結合させることを特徴とする物質の固定化方法。
13. 前記担体は、基板であることを特徴とする請求項１２に記載の物質の固定化方法。
14. 前記担体は、フッ素樹脂からなる担体であることを特徴とする請求項１２又は１３に記載の物質の固定化方法。
15. 前記フッ素樹脂は、テトラフロロエチレン樹脂、パーフロロアルコキシ樹脂、及びフッ化エチレンプロピレン樹脂からなる群より選ばれた少なくとも１種のフッ素樹脂であることを特徴とする請求項１４に記載の物質の固定化方法。
16. 前記結合物は、所望の物質とフッ素化合物タグとがスペーサーを介して結合したものであることを特徴とする請求項１２〜１５のいずれかに記載の物質の固定化方法。
17. 化学架橋反応によって前記結合物を調製することを特徴とする請求項１２〜１６のいずれかに記載の物質の固定化方法。
18. 前記物質はカルボン酸チオエステル基を有し、前記フッ素化合物タグは１級アミノ基を有するチオール基を有し、該カルボン酸チオエステル基と該チオール基との縮合反応によって前記結合物を調製することを特徴とする請求項１２〜１６のいずれかに記載の物質の固定化方法。
19. 前記物質は１級アミノ基を有するチオール基を有し、前記フッ素化合物タグはカルボン酸チオエステル基を有し、該チオール基と該カルボン酸チオエステル基との縮合反応によって前記結合物を調製することを特徴とする請求項１２〜１６のいずれかに記載の物質の固定化方法。
20. 前記物質は蛋白質又はペプチドであり、前記チオール基は該蛋白質又はペプチドのＮ末端のシステイン残基であることを特徴とする請求項１９に記載の物質の固定化方法。