CN111948306B - 一种测定苯磺酸氨氯地平中基因毒性杂质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种测定苯磺酸氨氯地平中基因毒性杂质的方法。所述方法包括：配制标准对照品溶液；配制供试品溶液；精密量取标准对照品溶液和供试品溶液，直接注入气相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算供试品中β‑氨基巴豆酸甲酯的量。本发明采用气相色谱法检测苯磺酸氨氯地平原料药中的基因毒性杂质β‑氨基巴豆酸甲酯，具有良好的精密度及线性，对柱前压、升温速率、柱箱起始温度、进样口及检测口温度的耐用性好，灵敏度高，适用于苯磺酸氨氯地平原料药中基因毒性杂质β‑氨基巴豆酸甲酯的检测。

Description

一种测定苯磺酸氨氯地平中基因毒性杂质的方法
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种利用GC法测定苯磺酸氨氯地平中潜在基因毒性杂质：β-氨基巴豆酸甲酯的药物分析方法。
背景技术
苯磺酸氨氯地平，化学名称：(±)-2-[(2-氨基乙氧基)甲基]-4-(2-氯苯基)-1,4-二氢-6-甲基-3,5-吡啶二羧酸-5-甲酯,3-乙酯苯磺酸盐分子式：C20H25ClN2O5·C6H6O3S分子量：567.06其结构式如下：
Figure BDA0002603010170000011
苯磺酸氨氯地平属于二氢吡啶类钙离子拮抗剂，为一线长效的降压药物，临床应用非常广泛。与其他药物相比，它的禁忌症较少，很适合老年高血压患者。它除了可以降低患者的血压之外，还有助于预防动脉粥样硬化的进展，预防血小板的聚集，同时还有着一定的降脂功效。这个药物可以与普利类或者是沙坦类的药物联合应用，是目前来讲非常优势的组合。
苯磺酸氨氯地平合成过程中使用到了β-氨基巴豆酸甲酯，此试剂有可能残留在成品中，而β-氨基巴豆酸甲酯具有α，β不饱和酮警示结构，此类警示结构的化合物被ICH(人用药物注册技术要求国际协调会)定义为潜在基因毒性杂质，无明确的PDE值，因此该基因毒性杂质的限度是根据TTC值来计算，即可接受其风险的摄入量一般通用的被定义为Threshold of Toxicological Concern(TTC)。具体含义为：一个“1.5μg/day”的TTC值，即相当于每天摄入1.5μg的基因毒性杂质，被认为对于大多数药品来说是可以接受的风险(一生中致癌的风险小于100000分之1)。按照这个阀值，可以根据预期的每日摄入量计算出活性药物中可接受的杂质水平。
苯磺酸氨氯地平的每日最大服用剂量为14mg，β-氨基巴豆酸甲酯的限度为：
1.5μg*100％/14mg/1000＝0.01％
近年来，随着国内外药政部门相关法规的逐步健全；以及最近在已上市缬沙坦中检出亚硝胺类基因毒性杂质事件，基因毒性杂质研究已经成为保证产品质量的关键之一。目前，尚未发现关于苯磺酸氨氯地平中基因毒性杂质β-氨基巴豆酸甲酯检测的文献报道。
因此，亟需制定出简单、灵敏度高的β-氨基巴豆酸甲酯的检测方法，以便控制苯磺酸氨氯地平原料药的质量，保障人民用药安全
发明内容
为了解决现有技术中存在的缺少苯磺酸氨氯地平原料药中基因毒性杂质检测方法的问题，本发明提供了一种苯磺酸氨氯地平中基因毒性杂质β-氨基巴豆酸甲酯的检测方法。
本发明所提供的检测苯磺酸氨氯地平中基因毒性杂质β-氨基巴豆酸甲酯的方法，包括如下步骤：
1)配制标准对照品溶液：取β-氨基巴豆酸甲酯标准品，用异丙醇定量稀释，得到每1ml中含β-氨基巴豆酸甲酯100μg的溶液，作为标准贮备液；精密量取所述标准贮备液，用异丙醇稀释，得到浓度为10μg/ml的标准对照品溶液；
2)配制供试品溶液：精密称取市售苯磺酸氨氯地平原料药，加入异丙醇，得到浓度为100mg/ml的供试品溶液；
3)检测：运用气相色谱仪对供试品溶液中基因毒性杂质β-氨基巴豆酸甲酯进行检测；即，精密量取标准对照品溶液和供试品溶液，直接注入气相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算供试品中β-氨基巴豆酸甲酯的量；
气相色谱仪工作条件如下：
色谱柱：以6％氰丙基苯基-94％二甲基聚硅氧烷为固定液的毛细管柱为色谱柱(30m*0.53mm*3.0μm，如OV-624毛细管柱)；
升温程序：起始柱温37-43℃，具体可为40℃，维持3-10min，具体可为5min，以9℃/min～11℃/min(具体可为10℃/min)升温至218-225℃，具体可为220℃，维持25-35min，具体可为30min；
进样口：温度为217℃～223℃(具体可为220℃)；柱前压为14-16kpa(具体可为15kpa)；柱流量为2.78-3.40ml/min，具体可为3.09ml/min；分流比为2:1；载气为氮气；
检测器：氢火焰离子化检测器(FID)；
载气：氮气；检测器温度：275-285℃，具体可为280℃。
进样方式：直接进样；进样量为0.9-1.1μl，具体可为1μl。
上述方法步骤3)中，可根据如下计算公式计算供试品中β-氨基巴豆酸甲酯的量：
Figure BDA0002603010170000031
m对：对照品的称样量，mg；A样：供试品溶液的峰面积；
D样：供试品溶液的稀释倍数；A对：对照品溶液的峰面积；
m样：供试品的称样量，mg；D对：对照品溶液的稀释倍数。
本发明采用气相色谱法检测苯磺酸氨氯地平原料药中的基因毒性杂质β-氨基巴豆酸甲酯，本检测方法经过系统适用性、准确度、定量限与检测限、线性范围、精密度、耐用性等方法学验证，证实了该方法专属性强、灵敏度高、准确度好、对柱前压、升温速率、柱箱起始温度、进样口及检测口温度的耐用性好，适用于苯磺酸氨氯地平原料药中基因毒性杂质β-氨基巴豆酸甲酯的检测。
附图说明
图1实施例1中甲醇为稀释剂空白溶剂的气相色谱图。
图2实施例1中标准储备液的气相色谱图。
图3实施例2中空白溶剂的气相色谱图。
图4实施例2中标准储备液的气相色谱图。
图5实施例2中对照品溶液气相色谱图。
图6实施例2中供试品溶液气相色谱图。
图7实施例4中β-氨基巴豆酸甲酯浓度与峰面积的线性关系图。
图8实施例5中β-氨基巴豆酸甲酯的定量限气相色谱图。
图9实施例5中β-氨基巴豆酸甲酯的检测限气相色谱图。
图10实施例8中柱箱升温速率为11℃/min的对照品溶液气相色谱图。
具体实施方式
苯磺酸氨氯地平(批号：C-031812001)购于常州瑞明药业有限公司；
β-氨基巴豆酸甲酯(批号：20181204)购于常州德明化工有限公司
异丙醇色谱纯MREDA
甲醇色谱纯MREDA
下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1方法摸索：甲醇为稀释剂
(1)仪器设定参数
直接进样法。
色谱柱：以6％氰丙基苯基-94％二甲基聚硅氧烷为固定液的毛细管柱为色谱柱(30m*0.53mm*3.0μm，OV-624毛细管柱)。
升温程序：起始柱温40℃，维持5min，以10℃/min升温至220℃，维持30min；
进样口：温度为220℃；柱前压为15kpa；柱流量为3.09ml/min；分流比为2：1；
载气为氮气；
检测器：氢火焰离子化检测器(FID)；
载气：氮气；检测器温度：280℃。
进样方式：直接进样；进样量为1μl。
(2)溶液配制
标准贮备液：取β-氨基巴豆酸甲酯适量，精密称定，用甲醇定量稀释制成每1ml中约含β-氨基巴豆酸甲酯100μg的溶液，作为标准贮备液。
(3)操作步骤
分别精密量取空白溶剂和标准贮备液溶液各1μl，直接注入气相色谱仪，记录色谱图。
(4)结果与结论
表1：甲醇为稀释剂试验结果
Figure BDA0002603010170000041
见图1-图2。
结论：空白溶剂无干扰。但是，主峰后面出现一个新的未知杂质，甲醇活性较高，可能与β-氨基巴豆酸甲酯中的氨基发生反应生产酰胺副产物，因此，甲醇不能作为样品配制的稀释剂。
实施例2至实施例8为对专利发明内容中描述的检测方法学验证试验，稀释剂确定为异丙醇。
实施例2专属性及系统适用性
(1)溶液的配制
标准贮备液溶液：取β-氨基巴豆酸甲酯适量，精密称定，用异丙醇定量稀释制成每1ml中约含β-氨基巴豆酸甲酯100μg的溶液，作为标准贮备液。
标准对照品溶液：精密量取标准贮备液2ml，置20ml量瓶中，用异丙醇稀释至刻度，摇匀，即得标准对照品溶液
供试品溶液：取本品约200mg，精密称定，精密量加入异丙醇2ml，振摇，过滤，取续滤液，作为供试品溶液(100mg/ml)。
(2)操作步骤
操作步骤：分别精密量取空白溶液(指不含β-氨基巴豆酸甲酯的异丙醇)、标准对照品溶液及标准贮备液溶液各1.0μl，直接注入气相色谱仪(参数见“仪器设定参数”)，记录色谱图。
(3)结果与结论
A.分离度考察结果
β-氨基巴豆酸甲酯分离度考察结果见下表。
表2：方法学验证-系统适用性考察结果
Figure BDA0002603010170000051
见图3-图6。
结论：空白溶剂不干扰测定，对照品溶液中异丙醇、β-氨基巴豆酸甲酯依次出峰，分离度大于1.5，理论板数符合要求，表明本方法专属性、系统适用性良好。
实施例3进样精密度
(1)溶液的配制
同实施例2
(2)操作步骤
操作步骤：精密量取标准对照品溶液1.0μl，直接注入气相色谱仪，记录色谱图。
(3)进样精密度考察结果
β-氨基巴豆酸甲酯进样精密度考察结果见下表。
表3：方法学验证-进样精密度峰面积考察结果
β-氨基巴豆酸甲酯 1 2 3 4 5 6 RSD(％)
保留时间(min) 17.124 17.125 17.125 17.127 17.128 17.126 0.01
峰面积 43.9 40.5 42.4 45.5 40.8 43.1 4.44
结论：采用直接进样法，对照品溶液连续进样6次，β-氨基巴豆酸甲酯峰面积的RSD小于10.0％，且β-氨基巴豆酸甲酯保留时间的RSD值小于2.0％，表明进样精密度良好。
实施例4线性范围
(1)溶液的配制
标准贮备液溶液：取β-氨基巴豆酸甲酯适量，精密称定，用异丙醇定量稀释制成每1ml中约含β-氨基巴豆酸甲酯100μg的溶液，作为标准贮备液。
精密量取标准贮备液4ml，置20ml量瓶中，用异丙醇稀释至刻度，摇匀，即得200％的标准曲线溶液。
精密量取标准贮备液3ml，置20ml量瓶中，用异丙醇稀释至刻度，摇匀，即得150％的标准曲线溶液。
精密量取标准贮备液3ml，置25ml量瓶中，用异丙醇稀释至刻度，摇匀，即得120％的标准曲线溶液。
精密量取标准贮备液2ml，置20ml量瓶中，用异丙醇稀释至刻度，摇匀，即得100％标准曲线溶液。
精密量取标准贮备液2ml，置25ml量瓶中，用异丙醇稀释至刻度，摇匀，即得80％的标准曲线溶液。
精密量取120％的标准曲线溶液5ml，置10ml量瓶中，用异丙醇稀释至刻度，摇匀，即得60％的标准曲线溶液。
精密量取80％的标准曲线溶液5ml，置10ml量瓶中，用异丙醇稀释至刻度，摇匀，即得40％的标准曲线溶液。
精密量取40％的标准曲线溶液5ml，置10ml量瓶中，用异丙醇稀释至刻度，摇匀，即得20％的标准曲线溶液。
(2)操作步骤
操作步骤：分别精密量取上述各标准曲线溶液1.0μl，直接注入气相色谱仪，记录色谱图。
(3)结果与结论
以浓度与主峰面积进行线性回归，结果见下表。
表4：方法学验证-线性试验结果
Figure BDA0002603010170000061
Figure BDA0002603010170000071
见图7为β-氨基巴豆酸甲酯浓度与峰面积的线性关系图。
结论：β-氨基巴豆酸甲酯在2.006～20.06μg/ml范围内，浓度与峰面积成良好线性关系。
实施例5定量限及检测限
(1)溶液的配制
β-氨基巴豆酸甲酯溶液：取线性项下20％标准曲线溶液，逐级稀释，直至溶剂的色谱峰信噪比应大于10，作为β-氨基巴豆酸甲酯的定量限溶液。继续稀释，直至溶剂的色谱峰信噪比大于3，作为β-氨基巴豆酸甲酯的检测限溶液。
(2)操作步骤
操作步骤：分别精密量取定量限溶液1.0μl，直接注入气相色谱仪，记录色谱图。
(3)结果与结论
定量限与检测限考察结果见下表。
表5：方法学验证-定量限与检测限试验结果
Figure BDA0002603010170000072
见图8、图9
结论：苯磺酸氨氯地平原料中β-氨基巴豆酸甲酯检查方法的定量限、检测限均能满足检测需要。
实施例6准确度
(1)溶液的配制
标准贮备液溶液：取β-氨基巴豆酸甲酯适量，精密称定，用异丙醇定量稀释制成每1ml中约含β-氨基巴豆酸甲酯100μg的溶液，作为标准贮备液。
精密量取标准贮备液3ml，置25ml量瓶中，用异丙醇稀释至刻度，摇匀，即得120％的稀释液。同法精密量取贮备液2ml，分别置20ml、25ml量瓶中，用异丙醇稀释至刻度，摇匀，即得100％、80％的稀释液。
80％准确度溶液：精密称取苯磺酸氨氯地平200mg，精密加入80％的稀释液2ml，振摇过滤，即得。同法配制3份。
100％准确度溶液：精密称取苯磺酸氨氯地平约200mg，精密加入100％的稀释液2ml，振摇过滤，即得。同法配制3份。
120％准确度溶液：精密称取苯磺酸氨氯地平约200mg，精密加入120％的稀释液2ml，振摇过滤，即得。同法配制3份。
未加标供试品溶液的配制：苯磺酸氨氯地平约200mg，精密加入异丙醇2ml，振摇过滤，即得供试品溶液。
(2)操作步骤
操作步骤：分别精密量取上述各溶液1.0μl，直接注入气相色谱仪，记录色谱图。
(3)结果与结论
依据回收率＝(测得量-样品中含有量)/加入量，按外标法以峰面积计算β-氨基巴豆酸甲酯的回收率。结果见下表
表6：方法学验证-供试品测得结果
批号 C-031812001
β-氨基巴豆酸甲酯 0.0036(％)
表6：方法学验证-准确度试验结果
Figure BDA0002603010170000081
结论：以上结果表明，β-氨基巴豆酸甲酯的平均回收率均在80％～110％范围内，且RSD值小于10.0％，本法测定β-氨基巴豆酸甲酯的准确度良好。
实施例7重复性
由于本品供试品溶液检出少量β-氨基巴豆酸甲酯，不宜评价本方法的重复性，因此，向供试品中加入对照品溶液作为加标供试品溶液，平行配制六份，计算测得β-氨基巴豆酸甲酯含量的RSD，评价本方法的重复性，具体试验如下：
(1)溶液的配制
标准贮备液溶液：取β-氨基巴豆酸甲酯适量，精密称定，用异丙醇定量稀释制成每1ml中约含β-氨基巴豆酸甲酯100μg的溶液，作为标准贮备液。
标准对照品溶液：精密量取标准贮备液2ml，置20ml量瓶中，用异丙醇稀释至刻度，摇匀，即得标准对照品溶液
加标供试品溶液：精密称取苯磺酸氨氯地平约200mg，精密加入标准对照品溶液2ml，振摇过滤，即得。同法配制6份。
(2)操作过程
操作步骤：精密量取上述空白溶剂、标准对照品溶液、加标供试品溶液各1.0μl，直接注入气相色谱仪，记录色谱图。
(3)结果与结论
重复性结果见下表。
表7：方法学验证-重复性考察结果
溶剂 1 2 3 4 5 6 RSD(％)
β-氨基巴豆酸甲酯 0.012 0.011 0.012 0.013 0.012 0.012 5.27
结论：采用直接进样法，加标供试品溶液连续测定六份，β-氨基巴豆酸甲酯含量的RSD均小于10.0％，表明本方法重复性良好。
实施例8耐用性
保持基本色谱条件不变，将柱前压(±0.2psi)、升温速率(±1℃/min)、柱箱起始温度(±3℃)和进样口温度(±3℃)进行微小改变后，考察对检测供试品中β-氨基巴豆酸甲酯含量及对照品溶液中空白与主峰分离度结果的影响。
由于本品供试品溶液检出少量β-氨基巴豆酸甲酯，不宜评价本方法的耐用性，因此，向供试品中加入对照品溶液作为加标供试品溶液，计算测得β-氨基巴豆酸甲酯含量的RSD，评价本方法的耐用性，具体试验如下：
(1)溶液的配制
标准贮备液溶液：取β-氨基巴豆酸甲酯适量，精密称定，用异丙醇定量稀释制成每1ml中约含β-氨基巴豆酸甲酯100μg的溶液，作为标准贮备液。
标准对照品溶液：精密量取标准贮备液2ml，置20ml量瓶中，用异丙醇稀释至刻度，摇匀，即得标准对照品溶液
加标供试品溶液：精密称取苯磺酸氨氯地平约200mg，精密加入标准对照品溶液2ml，振摇过滤，即得。
(2)操作过程
操作步骤：将柱前压(±0.2psi)、升温速率(±1℃/min)、柱箱起始温度(±3℃)和进样口温度(±3℃)进行微小改变后，精密量取空白溶剂、对照品溶液及供试品溶液各1.0μl，直接注入气相色谱仪，记录色谱图。
(3)结果与结论
A.不同柱前压耐用性考察
将柱前压(±0.2psi)进行微小改变后，耐用性考察结果见下表。
表8：方法学验证-不同柱前压分离度耐用性考察结果
Figure BDA0002603010170000101
表9：方法学验证-不同柱前压供试品测定耐用性考察结果
柱前压 14kpa 15kpa 16kpa RSD(％)
β-氨基巴豆酸甲酯(％) 0.010 0.011 0.012 9.09
结论：将柱前压(±0.2psi)进行微小改变后，β-氨基巴豆酸甲酯峰的保留时间及β-氨基巴豆酸甲酯与溶剂峰间的分离度略有变化，但仍满足系统适用性要求，β-氨基巴豆酸甲酯检出量RSD值小于15％，因此说明β-氨基巴豆酸甲酯检查方法的柱前压耐用性较好，可以选择柱前压为2.0psi～2.4psi，对本品β-氨基巴豆酸甲酯进行检查。
B.不同柱箱升温速率耐用性考察
将柱箱升温速率(±1.0℃/min)进行微小改变后，耐用性考察结果见下表。
表10：方法学验证-不同柱箱升温速率分离度耐用性考察结果
Figure BDA0002603010170000102
表11：方法学验证-不同柱箱升温速率供试品测定耐用性考察结果
柱箱升温速率 9℃/min 10℃/min 11℃/min RSD(％)
β-氨基巴豆酸甲酯(％) 0.014 0.011 0.012 12.73
见图10。
结论：将柱箱升温速率(±1.0℃/min)进行微小改变后，β-氨基巴豆酸甲酯峰的保留时间及β-氨基巴豆酸甲酯与溶剂峰间的分离度略有变化，但仍满足系统适用性要求，β-氨基巴豆酸甲酯检出量RSD值小于15％，因此说明β-氨基巴豆酸甲酯检查方法的柱箱升温速率压耐用性较好，可以选择柱箱升温速率为9℃/min～11℃/min，对本品β-氨基巴豆酸甲酯进行检查。
C.不同柱箱起始温度耐用性考察
将柱箱起始温度(±3℃)进行微小改变后，耐用性考察结果见下表。
表12：方法学验证-不同柱箱起始温度分离度耐用性考察结果
Figure BDA0002603010170000111
表13：方法学验证-不同柱箱起始温度供试品测定耐用性考察结果
柱箱起始温度 37℃ 40℃ 43℃ RSD(％)
β-氨基巴豆酸甲酯(％) 0.011 0.012 0.011 5.25
结论：将柱箱起始温度(±3℃)进行微小改变后，β-氨基巴豆酸甲酯峰的保留时间及β-氨基巴豆酸甲酯与溶剂峰间的分离度略有变化，但仍满足系统适用性要求，β-氨基巴豆酸甲酯检出量RSD值小于15％，因此说明β-氨基巴豆酸甲酯检查方法的柱箱起始温度压耐用性较好，可以选择柱箱起始温度为37℃～43℃，对本品β-氨基巴豆酸甲酯进行检查。
D.不同进样口温度耐用性考察
将进样口温度(±3℃)进行微小改变后，耐用性考察结果见下表。
表14：方法学验证-不同顶空平衡温度分离度耐用性考察结果
Figure BDA0002603010170000112
表15：方法学验证-不同顶空平衡温度供试品测定耐用性考察结果
进样口温度 217℃ 220℃ 223℃ RSD(％)
β-氨基巴豆酸甲酯(％) 0.011 0.011 0.010 5.25
小论：将进样口温度(±3℃)进行微小改变后，β-氨基巴豆酸甲酯峰的保留时间及β-氨基巴豆酸甲酯与溶剂峰间的分离度略有变化，但仍满足系统适用性要求，β-氨基巴豆酸甲酯检出量RSD值小于15％。因此，说明β-氨基巴豆酸甲酯检查方法的进样口温度压耐用性较好，可以选择进样口温度为217℃～223℃，对本品β-氨基巴豆酸甲酯进行检查。

Claims (2)

1.一种检测苯磺酸氨氯地平中基因毒性杂质β-氨基巴豆酸甲酯的方法，为，以气相色谱法检测苯磺酸氨氯地平中基因毒性杂质β-氨基巴豆酸甲酯的含量；
所述方法包括如下步骤：
1）以异丙醇为稀释溶剂配制标准对照品溶液；
2）以异丙醇为稀释溶剂配制供试品溶液；
3）检测：运用气相色谱仪对供试品溶液中基因毒性杂质β-氨基巴豆酸甲酯进行检测；即，精密量取标准对照品溶液和供试品溶液，直接注入气相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算供试品中β-氨基巴豆酸甲酯的量；
气相色谱仪工作条件如下：
色谱柱：以6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷为固定液的毛细管柱为色谱柱；
升温程序：起始柱温37-43℃，维持3-10min，以9℃/min-11℃/min升温至218-225℃，维持25-35min；
进样口：温度为217-223℃；柱前压为14-16kpa；柱流量为2.78-3.40ml/min；分流比为2:1；载气为氮气；
检测器：氢火焰离子化检测器；
载气：氮气；检测器温度： 275-285℃；
进样方式：直接进样；进样量为0.9-1.1μl。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法中，气相色谱仪工作条件如下：
色谱柱：以6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷为固定液的毛细管柱为色谱柱，30m*0.53 mm*3.0μm；
升温程序：起始柱温为40℃，维持5min，以10℃/min升温至220℃，维持30min；
进样口：温度为220℃；柱前压为15kpa；柱流量为3.09ml/min；分流比为2:1；载气为氮气；
检测器：氢火焰离子化检测器；
载气：氮气；检测器温度： 280℃；
进样方式：直接进样；进样量为1μl。
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