WO1987002064A1 - Recuperation et dosage d'adn dans un liquide biologique acellulaire - Google Patents
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
Definitions
- the present inyention is relatiye nouvea a process for recovering and laicroquantitês dosage of 1 saloxyxibonuclêique acid (DNA) in a cell free biological fluid especially the "blood plasma.
- DNA Assay circulating including the DNA in blood, in the extra-cellular position, is of great interest both physiologically and pathologically.
- DNA can also be responsible for the activation of pathogenic mechanisms such as activation of the coagulation and complement systems;
- pathogenic mechanisms such as activation of the coagulation and complement systems;
- the circulating DNA could play a pathogenic role via the formation of immune complexes DNA-antibody anti-DNA.
- DNA "specific to a pathogen" may be present in the blood.
- the detection and identification of this DNA may therefore be of etiological interest. It has for example been shown that antigen chronic patients with Hep B tite have in their plasma circulating DNA capabl of s '' hybridize with DNA extracted from virus particles of the virus of hepatitis B. On the other hand, it is also possible-that the release into the blood of DNA in abnormally high quantity -translates.the 1 precise pathological processes. We can consider, for example, that an inflamatory vascular injury is accompanied by the "rapid" passage of nuclear material in the blood due to the absence of a tissue enzymatic filter " ' and the direct" release of nuclear material in the sector. vascular.
- labeling using the "Nick Translation” technique consists in incorporating deoxyribonucleotide molecules into DNA.
- This technique uses two enzymes, deoxyribonuclease and r - - 1 DNA polymerase from Escherichia coli.
- the deoxyribonuclease cuts or nicks the strands of DNA.
- the DNA polymerase can then, under the effect of its 5'-3 'exo-nuclease activity, detach nucleotides from the 5'- side of the cut. Elimination of nucleotides and addi - "-
- RAPTIS applied the technique of "Nick Translation” in vitro to purified circu ⁇ lantplasmatic DNA, in order to obtain DNA labeled in vitro which, due to its very high radioactivity , allows very high measurement sensitivity.
- the "Nick Transaction" reaction must be carried out in a medium containing 50 mM of Tris-HCl buffer, pH 7.6, 10 M of 2-mercaptoethanol, 5 mM of MgCl 2 and 50 ⁇ g / ml of BSA (bovine serum albumin) brought into contact with 0.25 noles of each of the four labeled dXTPs , per reaction, and 1 ⁇ / reaction (or 0.1 ⁇ l) of enzyme preparation (DNA polymerase), while the resulting product is extracted twice with redistilled phenol.
- BSA bovine serum albumin
- the plasma DNA subjected to the "Nick Translation" reaction is obtained according to RAPTIS et al. From plasma diluted 4 times in 50 mM Tris-HCl buffer, pH 8.5, 20 mM EDTA containing 1% of sodium dodecyl sulfate, then incubated (20 ml) with 50 ml of pronase, for 4 hours at 37 ° C, the incubation being followed by sequential extractions with phenol, a 24: 1 mixture of chloroform and isoamy alcohol - liquique, and ether, dialysis against 20 m of buffer
- This method can be implemented on small volumes, of the order of microliter, but it cannot be used for the purpose set by the present invention, namely the recovery of DNA microquantities in an acellular liquid biological medium
- the aim of the present invention is to provide a method for recovering and assaying DNA microquantities which better meets the needs of the practice than the methods proposed in the prior art, in particular in that the new process in accordance with the present invention: - is truly quantitative, which are not the methods based " on immunochemical reactions such as the reaction for inhibiting the DNA binding described by LEON et Al. in the Article cited above, or the method of counterimmunoelectrophoresis described by DAVIS and DAVIS in ARTH. RHEUM. (1973), 1-6, 52-58;
- the subject of the present invention is a method for recovering and assaying micro amounts of DNA in an acellular biological fluid, in particular the blood plasma, which is characterized in that it comprises the following successive steps: - a first step of elimination of the proteins present in the biological fluid acellular in which we want to assay the DNA, which consists in extracting a mixture of said biological liquid and ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) with phenol saturated with Tris-hydroxyaminomethane (pH 8 approximately), to obtain an aqueous phase practically free proteins and containing substantially all of the DNA;
- EDTA ethylenediamine tetraacetic acid
- a second step for recovering the DNA from said aqueous solution which consists in precipitating the DNA by adding to said solution an appropriate coprecipitating agent and a precipitation agent advantageously consisting of a lower alcohol , in the presence of a suitable buffer such as the buffer ' Tris-hydroxyaminomethane u analog;
- a third step, of labeling by "Nick translation", "of the recovered DNA which consists in incubating the DNA with one or more labeled deoxynucleotides-triphosphates and with DNA polymerase I and deoxyribonuclease I, in a reaction medium which comprises Tris-hydroxy ⁇ aminomethane, magnesium chloride, bovine serum albumin, 5-merceptoethanol and glycerol;
- the labeling by "Nick Translation" of the recovered DNA is carried out, during the third step of the method, using at least one deoxynucleotide -triphosphate marked by a radioactive isotope, in which case the fourth step of the process which includes the determination of DNA, consists in counting the radioactivity present on a paper filter on which the DNA has been deposited marked and possibly washed by appropriate washing agents, then was dried, by direct counting or after immersion in a scintillating liquid, depending on the nature of the labeling radioisotope.
- the labeling by "Nick Translation" of the DNA recovered during the second step is carried out during the third step.
- the fourth step of the process which comprises the assay of DNA consists in revealing the DNA after fixation of the appropriate enzyme complex, in the presence of a chromogenic substrate.
- the nucleotide (s) incorporated in the DNA are labeled with biotin and the enzyme used; for its or their detection is related to avidin.
- the biologic and acellular liquid such as human plasma, in which one seeks to assay the DNA, is mixed at the rate of a few microliters, the first step of the process, with ethylenediamine tetra acetic acid (EDTA) to obtain a final concentration of EDTA of the order of 10 to 20 (approximately pH 8) and the solution obtained is extracted with saturated phenol d 'A suitable buffer such as 0.1 M Tris-hydroxy ⁇ aminomethane, pH approximately 8, in particular.
- EDTA ethylenediamine tetra acetic acid
- the co-precipitation agent introduced during the second stage of the process is taken from the group which comprises the Latin, the dia ines such as spermidine, ribonucleic acids, synthetic polynucleotides, proteins comprising reactive groups possessing positive charges such as methylated albumin and any substance having a particular affinity for DNA and not inhibiting the "Nick Translation" reaction.
- the precipitating agent used during the second step of the process is ethanol.
- ethanol or other lower alcohol used as precipitation agent is added whatever the incubation temperature and the temperature of cen trifugation, in an appropriate amount to obtain a final concentration in ethanol equal to or greater than 66%.
- the aqueous phase containing the DNA, a precipitation agent and a coprecipitation agent is centrifuged to cause the precipitation of the DNA and the precipitate is washed with a new addition of ethanol or " other similar precipitation agent " , then the solution obtained " is again centrifuged and the precipitate, essentially consisting of DNA, is recovered.
- the precipitated DNA is recovered by adding water, optionally with stirring.
- the marking with "Nick Translation” is carried out, during the third step
- the incubation is carried out at a temperature between 15 and 37 ° C approximately, for a period of 1 to 3 hours
- the filter on which the DNA is deposited is washed, preferably with stirring, with a solution of high molarity allowing the elimination of the labeled nucleotides not incorporated into the DNA while preserving the tortality of the labeled DNA on the filter.
- the present invention relates more particularly to the new process for recovering and assaying micro-amounts of DNA in an acellular biological fluid, in particular blood plasma, in accordance with the above provisions, biological analyzes using this process, as well as the physiological situations elucidated and the diagnoses established by the process in accordance with the present invention.
- the DNA dissolved in 25 microliters of bi-distilled water is incubated in 25 microliters containing 17 pico-moles of deoxyribocytidine 5 'triphosphate labeled with tri- tium and 100 picomoles of deoxyriboadenine triphosphate, deoxyriboguanine triphosphate and deoxyribothymine tri ⁇ phosphate, 0.25 Units of DNA polymerase I and 5 picograms of deoxyribonuclease I, trishydroxyaminomethane (7.5 mM) of magnesium chloride (3.5 mM), Beta-mercaptoethanol (10 M), bovine albumin (50 micrograms / ml) and glycerol (0.5%, weight / volume).
- the tubes are incubated 1.5 hrs at 37 ° C.
- the process according to the present invention seems to have a very specificity with regard to DNA: the incorporation of tritiated dCTP into samples.
- the process according to the invention makes it possible to recover practically all of the DNA contained in the plasma, which. is fully marked with "Nick Translation
- the method according to the present invention is faster than the methods proposed in the prior art and makes it possible to mark the DNA extracted from the plasma, by Nick Translation, in less than 4 hours.
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Abstract
Procédé de récupération et de dosage des microquantités d'ADN. Le procédé comprend: une première étape d'élimination des protéines présentes, une deuxième étape de récupération de l'ADN qui consiste à précipiter l'ADN par adjonction d'un agent de coprécipitation et d'un agent précipitant, une troisième étape de marquage par ''Nick Translation'' de l'ADN à récupérer, et une quatrième étape de dosage. Application à la récupération et au dosage de microquantités d'ADN dans un liquide biologique acellulaire.
Description
Récupération et dosage d'ADN dans un liquide biologique acellulaire.
La présente inyention est relatiye à un nouvea procédé de récupération et de dosage de laicroquantitês d1 acide désoxyxibonuclêique (ADN) dans un liquide biologique acellulaire en particulier le" plasma sanguin. Le dosage de l'ADN circulant et notamment de l'ADN présent dans le sang, en position extra-cellulaire, présente un grand intérêt tant sur le plan physiologique que sur le plan pathologique.
1. Sur le plan physiologique, la présence d'ADN circulant chez des personnes "en situation normale" peut dép dre de deux types de phénomènes qui peuvent être qualifiés de passifs ou d'actifs. D'un côté, en effet, la mort cellu¬ laire est un phénomène physiologique normal et permanent qui peut se traduire au delà de la lyse cellulaire, par la libé- ration dans le sang d'une certaine quantité d'acides nucléiq D'un autre côté, il est possible que la présence d'ADN dans sang soit (en partie) le résultat d'un phénomène actif d'exc tion de l'ADN par certaines cellules. Ce processus pourrait (pour certains auteurs) représenter un mécanisme d'informati ou de communication inter-cellulaire.
2. D'un point de vue pathologique,, il est possible que dans certaines circonstances/ l'ADN circulant puisse se trouver "anormalement présent" (soit d'un point de vue quan¬ titatif, soit d'un point de vue qualitatif) dans le sang. La signification de ce phénomène n'est pas univoque : a) Il est possible que l'ADN circulant puisse jouer un rôle pathogène. Plusieurs mécanismes peuvent être invoqués : (i) présent dans le sang en quantité anormalement élevée, l'ADN circulant peut perturber du fait de ses propriétés physico-chimiques {notamment de sa haute viscosité) le fonc¬ tionnement normal de la micro-circulation dans certains tissus et/ou organes. Cela peut être le cas par exemple au cours de la mise en oeuvre de traitements cytolytiques chez des patients atteints de néoplasie ou de leucémie ; (ii) l'ADN peut être également responsable de l'activation de mécanismes pathogènes telle l'activation des systèmes de la coagulation et du complément ; (iii) on peut encore supposer que l'ADN puisse, dans cer- __- taines circonstances, jouer u rôle pathogène du fait de propriétés "génétiques" spécifiques, en s'intégrant au génome de l'hôtè par.un phénomène" semblable à -une transfor¬ mation ; (iv) enfin, l'ADN circulant pourrait jouer un rôle pathogène par 1'intermédiaire de la formation de complexes immuns ADN-anticorps anti-ADN. C'est le mécanisme physiopa- thologique qui a été retenu depuis une vingtaine d'années pour expliquer le développement des lésions tissulaires (en particulier glomêrulaires) apparaissant chez les patients atteints de lupus érythémateux disséminé (LED) ainsi que chez les souris développant de manière spontanée des ala- dies lupiques comparables, telles les souris NZBxNZ . La mise en évidence in vitro d'une affinité particulière de l'ADN pour le collagène pourrait expliquer la généralisation au sein de l'organisme des dépôts de tels complexes et suggère que, dans certaines circonstances, l'ADN édsorbé sur des structures collagéniques pourrait jouer le rôle d'ixnmuno- adsorbant vis à vis d'anticorps anti-ADN libres. Il faut ajouter que les résultats d'études expérimentales effectuées
chez des souris "non lupiques" infectées par des endotoxin bactériennes ou infectées par Escherichia coli suggèrent que la formation de complexes ADN-anticorps anti-ADN peut également jouer un rôle pathogène lors du développement de diverses glomérulonéphrites à complexes immuns. b) A côté de la possibilité du rôle pathogène que peut jouer l'ADN circulant, la présence "anormale" d'ADN (sur un plan quantitatif ou qualitatif) peut revêtir une significa¬ tion étiopathogénique ou physiopathologique. Il est possi- ble tout d'abord que, au cours de certaines affections
(infectieuses en particulier), l'ADN "spécifique d'un agent pathogène" (viral par exemple) puisse être présent dans le sang. La détection et l'identification de cet ADN peut revêt alors un intérêt étiologique. Il a, par exemple, été montré que des patients porteurs chroniques de l'antigène de l'hép tite B possèdent dans leur plasma de l'ADN circulant capabl de s''hybrider avec de l'ADN- extrait de particules virales du virus de l'hépatite B. D'un autre côté, il esi également possible-que la libération dans le sang d'ADN en quantité anormalement élevée -traduise.des1processus pathologiques précis. On peut envisager par exemple qu'une atteinte infla matoire vascuiaire s'accompagne du passage "rapide" de matériel nucléaire dans le sang du fait de l'absence de filtre enzymatique tissulaire"' et de la libération "directe de matériel nucléaire dans le secteur vasculaire.
Compte tenu de l'intérêt que présente le dosage de l'ADN circulant, différentes techniques, colorimétriques, fluorimétriques ou im unologiques ont été proposées.
Cependant, l'utilisation de ces techniques,en parti lier pour le dosage de l'ADN plasmatique, rencontre des limites et présente des difficultés : ces difficultés ou limites se rapportent essentiellement à la spécificité, à la sensibilité et au caractère quantitatif des méthodes pro posées. a) La spécificité : deux aspects concernant le probl de la spécificité doivent être considérés ; (i) de nombreus
substances peuvent interférer avec les méthodes colorimétri- ques (telle la classique méthode de Burton) fluorimétriques ou i munologiques. Dans ces conditions, ne peuvent être considérés comme interprétables que les résultats des 5 méthodes comportant «in dosage contrôle de l'ADN après trai¬ tement des échantillons par une préparation purifiée de désoxyribonucléase ; (ii) le second aspect à considérer est le fait qu'il devrait être nécessaire de déterminer avec exactitude si l'ADN "spécifiquement" mis en évidence (ou 10 dosé) dans le sang se trouvait bien en situation extra¬ cellulaire au moment du prélèvement et ne provenait pas de la lyse artificielle des cellules nuclées du sang. b) La sensibilité : les méthodes ci-dessus mentionnée possèdent une sensibilité limitée qui ne permet en aucune 15 manière de doser l'ADN circulant chez les sujets normaux. La sensibilité maximale rapportée dans la littérature est de 20 à 50 ng/ml pour l'ADN en doublé- hélice et de lOOng/ml pour"l'ADN en simple hélice (STEINMAN, ARTH. RHEUM. 1982, 25, 1425-143Déconcentrations qui ne sont pas atteintes chez "20- les ^sujets normaux. c) Le caractère quantitatif : _ les techniques immunolo¬ giques qui sont parmi les plus sensibles ne sont pas quantitatives et ce pour plusieurs raisons : i) le principe même de la méthode peut faire que celle-ci 25 n'est à la base que semi-quantitative. C'est le cas de la contre-immunoélectrophorèse ; * ii) la taille des molécules d'ADN est très variable et pour une même quantité d'ADN, le nombre de molécules pouvant réagir avec le "substrat immunologique" (les anticorps 30 anti-ADN en l'occurrence) est variable d'un échantillon à 1'autre ; (iii) certaines substances (telles des protéines capables d fixer l'ADN de manière spécifique ou non) peuvent interfér dans le dosage. 35 Pour surmonter ces limites et difficultés, il a été proposé de purifier les préparations d'ADN plasmatiqu
préalablement â leur dosage, en les débarrassant des divers constituants qui les accompagnent dans le plasma, en parti¬ culier des protéines. D'autre part, il a été proposé (cf. RAPTIS.. et al. J. CLIN. INVEST., 6, Décembre 1980, 1391- 5 1399) de quantifier et de caractériser l'ADN plasmatique normal et l'ADN plasmatique provenant de patients atteints de lupus érythémateux systémique (SLE) après l'avoir purifi et l'avoir marqué in vitro en utilisant la technique de "Nick Translation"-elle-même décrite précédemment dans 0 RIGBY et al., J. MOL. BIOL. (1977), 1_1_3, 237 - 251-.
Comme on le sait, le marquage à l'aide de la technique de "Nick Translation" consiste à incorporer des molécules de désoxyribonucléotides dans l'ADN. Cette tech¬ nique utilise deux enzymes, la désoxyribonucléase et r- -1 l'ADN-polymérase d'Escherichia coli. La désoxyribonucléase réalise des coupures -ou-nicks- dans les brins d'ADN. L'ADN-polymérase peut alors, sous l'effet de son activité exo-nucléasique 5'-3', détacher des nucléotides du côté 5'- de la coupure. L'élimination des nucléotides et l'addi-"-
20 tion séquentielle de nucléotides sur le" côté 3'- en¬ traînent "la progression de la coupure ("Translation") le long de l'ADN. En remplaçant les nucléotides pré-existants par des nucléotides marqués soit par un isotope radio¬ actif soit par une substance pouvant être révélée à l'aide
25 d'une réaction enzymatique, il est possible de préparer des ADN marqués d'activité spécifique très élevée, l'activité spécifique de l'ADN étant fonction de l'activité spécifique des substrats et de l'étendue du remplacement des nucléotides.
Alors que RIGBY et Al. ont utilisé comme mati
30 première,de l'ADN d'origine cellulaire, RAPTIS a appliqué la technique de"Nick Translation"in vitro à de l'ADN circu¬ lantplasmatique purifié, pour obtenir un ADN marqué in vitr qui, en raison de sa radioactivité très élevée, permet une très grande sensibilité de mesure.
35 Selon RAPTIS et Al. la réaction de"Nick Tran tion"doit être réalisée dans un milieu contenant 50 mM de
tampon Tris-HCl, pH 7,6, 10 M de 2-mercaptoéthanol, 5 mM de MgCl2 et 50 yg/ml de BSA (sérum-albumine bovine) mis en contact avec 0,25 n oles de chacun des quatre dXTP marqués, par réaction, et 1ϋ/réaction (ou 0,1 yl) de préparation 5 enzy atique (ADN-polymérase) , tandis que le produit résultan est extrait à deux reprises par du phénol redistillé.
L'ADN plasmatique soumis à la réaction de"Nick Translation"est obtenu selon RAPTIS et Al. à partir de plasm dilué 4 fois dans 50 mM de tampon Tris-HCl, pH 8,5, 20 mM 10 d'EDTA contenant 1 % de dodécylsulfate de sodium,puis incubé (20 ml) avec 50 ml de pronase, pendant 4 heures à 37°C, l'incubation étant suivie d'extractions séquentielles avec du phénol, un mélange 24:1 de chloroforme et d'alcool isoamy- lique, et de l'éther, de dialyse contre 20 m de tampon
1.5 Tris-HCl, pH 7,6, 10 mM de NaCl, 5 M d'EDTA, d'une diges¬ tion de l'extrait par 10 yg/ml de ribonucléase pancréatique pendant 30 minutes à 37°C et éventuellement d'une étape de purification comprenant une adsorption sur une colonne de .BND-cellulose à pH 8,1 et une _élution, d'une précipitation
20 " par de -l'éthanol, suivie d'une remise, en suspension du résidu solide dans 100 yl de tampon Tris-HCl, 10" mM, pH 7,6 et 1 mM d'EDTA".
Enfin, la détermination de la radioactivité des fractions résultant de l'analyse par sédimentation neutr
25 par un gradient de saccharose et de fractions résultant de l'analyse par centrifugation à l'équilibre dans du CsCl, comparée à une courbe standard des comptages/minute obtenus en fonction de la quantité d'ADN de phages λ utilisée dans chaque réaction de Nick Translation, permet d'obtenir la
30 quantité d'ADN, à condition que celle-ci se trouve dans une gamme comprise entre 0,01 et 0,1 yg d'ADN de phages λ.
Cette méthode relativement peu sensible et passablement complexe, est issue de la méthode de RIGBY et Al. qui, si elle préconise la méthode relativement simple de
35 comptage de la radioactivité sur des disques de papier-filtr utilise cependant comme mélange réactionnelpour la"Nick
Translation",pour 120 yl, 50 mM de phosphate de potassium (pH 7,4), 5 M de MgCl-, 15 yM de dTTP et de dGTP et 15 à 20 yM de fa pJ àATP et de |a P} dCTP, avec une concentra¬ tion d'ADN de l'ordre de 15 yg/ml, et une incubation d'une minute à la température ambiante avec 1,33 ng dans 10 yl d'ADN-ase I activée,-puis à 14°C avec 6 yg (4 yl) d'ADN- poly érase I suivies de l'adjonction de 60 yl d'EDTA 0,25 M (pH 7,4) (éventuellement suivie d'une extraction par du phénol) et d'un chauffage de 10 minutes à 68°C. Cette méthode peut être mise en oeuvre sur de faibles volumes, de l'ordre du microlitre, mais elle est inutilisable pour le but que s'est fixée la présente in¬ vention, à savoir la récupération de microquantités d'ADN dans un milieu biologique liquide acellulaire. La présente invention a pour but de pourvoir à un procédé de récupération et de dosage de microquantités d'ADN, qui répond mieux aux nécessités de la pratique que les procédés proposés dans l'Art antérieur, notammenten ce que le nouveau procédé conforme à la présente invention : - est réellement quantitatif, ce que ne sont pas les méthod basées" sur des réactions immunochimiques telles que la réaction d'inhibition de la fixation de l'ADN décrite par LEON et Al. dans l'Article cité plus haut, ou la méthode de contre-immunoélectrophorêse décrite par DAVIS et DAVIS dans ARTH. RHEUM. (1973), 1_6, 52-58 ;
- est spécifique de l'ADN et ne peut être influencé ni par des anticorps anti-ADN ou d'autres protéines qui fixent l'ADN, qui peuvent interférer dans les tests basés sur de réactions immunologiques, ni par des substances suscepti- blés d'interférer dans les tests colori étriques ou fluo- rimétriques précédemment décrits (cf. notamment, STEINMAN J. CLIN, INVEST. (1975), 5_6, 512-515) ;
- ne requiert que quelques microlitres de plasma, est rapid fiable et est d'une très grande sensibilité, et peut être mis en oeuvre simultanément sur de nombreux échantillons.
La présente invention a pour objet un procédé
de récupération et de dosage de microquantités d'ADN dans un liquide biologique acellulaire, en particulier le plasma sanguin, qui est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes successives suivantes : - une première étape d'élimination des protéines présentes dans le liquide biologique acellulaire dans lequel on veut doser l'ADN, qui consiste à extraire un mélange dudit liquide biologique et d'acide éthylènediamine tétraacétique (EDTA) par du phénol saturé par du Tris-hydroxyaminométhane (pH 8 environ) , pour obtenir une phase aqueuse pratiquement dépourvue de protéines et contenant sensiblement la totalité de l'ADN ;
- une deuxième étape de récupération de l'ADN de ladite solu¬ tion aqueuse, qui consiste à précipiter l'ADN par adjonc- tion à ladite solution d'un agent coprécipitant approprié et d'un agent de précipitation avantageusement constitué par un alcool inférieur, en présence d'un tampon approprié tel que le-tampon' Tris-hydroxyaminométhane u analogue ;
- une troisième étape, de marquage par "Nick translation", "de l'ADN récupéré, qui consiste à incuber l'ADN avec un ou plusieurs-désoxynucléotides-triphosphatês marqués et avec de. l'ADN-polymérase I et de la désoxyribonucléase I, dans un milieu réactionnel qui comprend le Tris-hydroxy¬ aminométhane, le chlorure de magnésium, la sérumalbumine bovine, le 5-merceptoéthanol et le glycérol ;
- une quatrième étape de dosage de l'ADN par toute méthode appropriée révélant le marqueur incorporé à 1:ADN.
Selon un mode de mise en oeuvre préféré du procédé conforme à la présente invention, le marquage par "Nick Translation" de l'ADN récupéré est réalisé, au cours de la troisième étape du procédé, à l'aide d'au moins un désoxynucléotide-triphosphate marqué par un isotope radio¬ actif, auquel cas la quatrième étape du procédé qui com¬ prend le dosagede l'ADN, consiste à compter la radioacti- vite présente sur un filtre de papier sur lequel a été dé¬ posé l'ADN marqué et qui a éventuellement subi des lavages
par des agents de lavage appropriés, puis a été séché, par comptage direct ou après immersion dans un liquide scintillant, en fonction de la nature du radioisotope de marquage. Selon un autre mode de mise en oeuvre pré¬ féré du procédé conforme à -la présente invention, le mar¬ quage par "Nick Translation" de l'ADN récupéré au cours de la deuxième étape, est réalisé au cours de la troisième étape à l'aide d'au moins un désoxynucléotide triphos- phate marqué chimiquement par une substance pouvant être révélée à l'aide d'une réaction enzymatique, auquel cas la quatrième étape du procédé qui comprend le dosage de l'ADN consiste à révéler l'ADN après fixation du complexe enzymatique approprié, en présence d'un substrat chromo- gène.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, le ou les nucléotides incorporés dans -l'ADN sont marqués par la biotine et l'enzyme utilisée ; pour sa ou leur détection est liée à l'avidine. -" Selon un mode de mise en oeuvre avantageux du procédé conforme à la présente invention, le liquide biolo que acellulaire tel que le plasma humain, dans lequel on cherche à doser l'ADN, est mélangé à raison de quelques microlitres, au cours de la première étape du procédé, ave de l'acide éthylènediamine tétra acétique (EDTA) pour obte nir une concentration finale d'EDTA de l'ordre de 10 à 20 (pH 8 environ) et la solution obtenue est extraite par du phénol saturé d'un tampon approprié tel que Tris-hydroxy¬ aminométhane 0,1 M, pH 8 environ, notamment.
Selon un autre mode de mise en oeuvre avanta¬ geux du procédé conforme à la présente invention, l'agent de coprecipitation introduit au cours de la deuxième éta¬ pe du procédé, est pris dans le groupe qui comprend la gé¬ latine, les dia ines telles que la spermidine, les acides ribonucléiques, des polynucléotides de synthèse, des
protéines comportant des groupes réactifs possédant des charges positives tels qu'albumines méthylées et toute substance présentant une affinité particulière pour l'ADN et n'inhibant pas la réaction de "Nick Translation". .Selon encore un autre mode de mise en oeuvre avantageux du procédé conforme à la présente invention, l'agent de précipitation mis en oeuvre au cours de la seconde étape du procédé, est de l'éthanol.
Selon une modalité particulière de ce mode de mise en oeuvre, l'éthanol ou autre alcool inférieur uti¬ lisé comme agent de précipitation, est ajouté quelles que soient la température d'incubation et la température de cen trifugation, en quantité appropriée pour obtenir une concen tration finale en éthanol égale ou supérieure à 66%. Selon encore un autre mode de mise en oeuvre avantageux du procédé conforme à la présente invention, la phase aqueuse contenant l'ADN, un agent de précipitation et un agent de copr cipitation, est centrifugée pour provoquer la précipitation de l'ADN et le précipité est lavé par une nouvelle addition d'éthanol ou" autre agent"-de- précipitation analogue, puis la solution obtenue"est à nouveau centrifu¬ gée et le précipité, essentiellement constitué par de l'ADN, est récupéré.
Selon encore une modalité avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, l'ADN précipité est récupéré par addition d'eau, éventuellement sous agitation.
Selon un autre mode de mise en oeuvre du procé dé conforme à la présente invention, le marquage par "Nick Translation" est effectué, au cours de la troisième étape
Selon encore un autre mode de mise en oeuvre du procédé conforme à la présente invention, au cours de la quatrième étape du procédé, le filtre sur lequel est déposé l'ADN est lavé, de préférence sous agitation, par une - solution de forte molarité permettant d'éliminer les nu¬ cléotides marqués non incorporés à l'ADN tout en conservant sur le filtre la tortal-ité de l'ADN marqué. ""- " Outre les dispositions qui précèdent, l'inven¬ tion comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre.
La présente invention vise plus particulière¬ ment le nouveau procédé de récupération et dosage de micro- quantités d'ADN dans un liquide biologique acellulaire, en particulier le plasma sanguin, conforme aux dispositions qui précèdent, les analyses biologiques utilisant ce procé¬ dé, ainsi que les situations physiologiques élucidées et les diagnostics établis grâce au procédé conforme à la présente invention.
L'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre et d'application du procédé objet de la présente invention. II doit être bien entendu, toutefois, que ces
exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. Exemple 1 Récupération et dosage de microquantités d'ADN présentés dans du plasma sanguin 1ère étape :
Dans un tube conique en polypropylène de 1,5 ml (tube Eppendorf) on mélange 10 yl de plasma prélevé s acide êthylènediaminetétraacëtique et 50 yl d'acide éthy- lênediaminetétraacétique à 15 mM. On ajoute 25 microlitres de phénol saturé par du Trishydroxyaminométhane 0,1 M, pH 8. On mélange. Après incubation de 3 minutes, à la température de la pièce, on centrifuge 5 minutes à 12 000 g. 2ëme étape : a) une solution mère .de gélatine (DIFCO) à- 5- % en (poids/volume) dans de l'eau bidistillée, est chauffée à 110°C pendant 30 minutes.
. "'" "b) 40 microlitres de la phase supérieure (phase aqueu sont"transférés dans un autre tube Eppendorf contenant Ï0 μl de l gélatine préparée comme ci-dessus,à 0,3% (poids/volume) dans du, tampon Trishydroxyaminométhane 0,0025 M, pH 8.On ajoute 105 mic litres d'éthanol absolu à -20°C. Le tube est agité, incubé 5 minutes à 4°C puis centrifugé 15 minutes à 4°C à 12 000 g. » Le surnageant est éliminé par pipetage et après addition de 200 microlitres d'éthanol à 85 % à -20°C, le tube est immé¬ diatement centrifugé dans les mêmes conditions que précédem ment. Le surnageant est totalement éliminé par pipetage puis séchage sous vide. 25 microlitres d'eau bidistillée à 60°C sont ajoutés et le tube est ncubé 2 à 3 minutes à 60° puis centrifugé quelques secondes et placé à 4°C. 3ëme étape :
L'ADN dissous dans 25 microlitres d'eau bi¬ distillée est incubé dans 25 microlitres contenant 17 pico- moles de désoxyribocytidine 5' triphosphate marqués au tri-
tium et 100 picomoles de désoxyriboadénine triphosphate, de désoxyriboguanine triphosphate et de désoxyribothymine tri¬ phosphate, 0,25 Unités d'ADN polymérase I et 5 picogrammes de désoxyribonucléase I, du trishydroxyaminométhane (7,5 mM) du chlorure de magnésium (3,5 mM) , du Beta-mercaptoéthanol (10 M) , de l'albumine bovine (50 microgrammes/ml) et du glycérol (0,5 %, poids/volume) . Les tubes sont incubés 1,5 heu à 37°C.
4ëme étape : Les 50 microlitres de la réaction sont déposés
2 sur un carré de papier Whatmann DE 81 de 2,25 cm . Le filtr est séché puis placé dans un bêcher et lavé sous agitation rotative, successivement 3 fois 5 minutes par 100 ml de solution de formate d'ammonium (HCOONH.) 0,3 M et d'hydro- gène phosphate disodique (Na2HP0.) 0,01 M pH 7,8 2 fois
5 minutes par 100 ml d'éthanol à 95 % et 1 -fois 5 minutes p 50 ml de diéthyléther. Le^ filtre est séché à la chaleur pui placé dans un tube pour comptage radioactif, contenant 5 ml de liquide "scintillant ("Ready Solve" Beckman, par exe pie). Dans ces conditions, l'activité spécifique obtenue pour une efficacité de comptage de 30 % environ, est de 10 000 à 15 000 cpm par nanogramme d'ADN et la Radioactivit retenue sur le filtre non spécifiquement en l'absence d'ADN est de 300 à 600 cpm. Exemple 2
Dosage d'ADN dans le plasma de souris auxquelles avait été injecté un lipopolysaccharide d'ori gine bactérienne.
Pour déterminer l'efficacité du procédé conforme à la présente invention dans le cadre de recher¬ ches physiologiques et pathologiques, on a effectué une estimation en série de l'ADN présent dans le plasma de souris ayant reçu une injection d'un lipopolysaccharide d'origine bactérienne J_ connu comme capable d'entraîner dans le sang de ces souris la libération massive d'ADN en
position extra-cellulaire, FOURNI & Al. J. Exp. Méd. 140, 1189-1206 _7. L'expérimentation a été menée comme suit : des souris femelles de race C57B1/6 âgées de 8 semaines ont reçu une injection de 100 μg d'un lipopolysacchari¬ de d'origine bactérienne dans les conditions décrites par FOURNIE & Al. (référencé ci-dessus).
Des prélèvements de sang ont été collectés par ponction à partir des sinus orbitaux, à différents inter- valles de temps après l'injection du lipopolysaccharide et l'ADN libéré dans le plasma a été dosé par le procédé conforme à la présente invention, respectivement :
2hr h7 8h 10h/ 12hf χ8h après l'injection du
2 jours, 3 jours et 7 jours j lipopolysaccharide Les dosages effectués ont fait ressortir :
. une. augmentation significative de l'ADN circulant déjà 2h après l'injection du lipopolysaccharide ; . la présence de quantités élevées d'ADN (supérieures :. à 1 μg/ml) de 10 "à 18 -h parés l^injection du lipo- polysaccharide ; -" ' . '
. la persistance d'une augmentation significative de l'ADN dans le plasma au jour 3 ; . le retour à des taux normaux d'ADN au jour 7. Exemple 3 Vérification de la précision du dosage effec¬ tué par le procédé conforme à la présente invention
Pour vérifier la valeur du procédé conforme à la présente invention, de l'ADN a été évalué dans un échantillon de plasma dans lequel avait été ajoutée une quantité connue d'ADN. La valeur trouvée a été comparée à celle obtenue pour le plasma seul (c'est-à-dire sans addi¬ tion d'ADN) et à la valeur obtenue pour un échantillon d'ADN traité de façon analogue.
Le Tableau I ci-dessous fait apparaître les résultats suivants :
TABLEAU I
Dosage d'ADN dans des -échantillons de plasma (D
(3) Résultats calculés à partir de 4 prélèvements, exprimés comme étant la moyenne + une déviation standard de cpm du H dCTP incorporé. Ces résultats sont corrigés pour la fixation non spécifique du H dCTP libre sur des filtres DE81 (411 + 37) .
(4) Nanogrammes d'ADN trouvés dans les échantillons trai¬ tés (moyenne + une déviation standard de 4 prélève¬ ments) calculés à partir de l'activité spécifique
(9003 + 212 cpm/ng) obtenue sur un échantillon stan- dard de 1 ng d'ADN marqué par "Nick translation" en
présence de gélatine.
Les résultats réunis dans le Tableau I ci- dessus font apparaître que : 1. L'ADN peut être détecté dans le plasma, 2. La quantité d'ADN trouvée dans les échantillons pré¬ parés par addition d'ADN froid à un plasma, est con¬ forme aux valeurs trouvées dans le plasma seul et dans les échantillons d'ADN seul. A noter que : le pourcentage de récupération d'ADN radiomarqué (68 ± 8 ; n ≈ 8) et le pourcentage de récupération de l'ADN marqué par "Nick Translation" après traitement par le phénol et précipitation par l'éthanol (67 ± 9 ; n = 8j sont simi¬ laires. Le pourcentage de récuparation de l'ADN radio- marqué, est identique pour tous les échantillons, qu'ils aient été traités en présence ou en l'absence de-plasma.
Il "ressort des exemples d'application qui pré¬ cèdent que le procédé qui fait l'objet de la présente invent -permet.de doser- quantitativement. l'ADN dans le plasma et constitue un procédé facile à mettre en oeuvre,"pouvant être exécuté à l'aide d'un kit de "Nick Translation"disponible dans le commerce et ne requérant qu'un appareillage pour le comptage d'échantillons radioactifs. Le procédé conforme à la présente invention est reproductible, suffisamment sensible pour détecter de l'ADN dans des échantillons de
10 yl à des concentrations comprises entre 12 et 800 ng/ l, encore qu'il puisse détecter des concentrations d'ADN moindres, aussi basses que 1,5 ng/ml, avec cependant une reproductibilité des résultats d'un échantillon à l'autre moins bonne que des concentrations inférieures à 12 ng/ml.
Le procédé conforme à la présente invention semble présenter une spécificité très grande à l'égard de l'ADN : l'incorporation de dCTP tritié dans des échan-
4 tillons de ARN est 10 inférieure à ce qu'elle est dans les échantillons d'ADN, ceci étant probablement lié à une
contamination des préparations d'ARN par de l'ADN.
Le procédé conforme à l'invention permet de récupérer pratiquement la totalité de l'ADN contenu dans le plasma, qui. est intégralement marqué par "Nick Translation En outre, le procédé conforme à la présente invention est plus rapide que les procédés proposés dans l'Art antérieur et permet de marquer l'ADN extrait du plasma, par Nick Translation, en moins de 4 heures.
Le procédé conforme à la présente invention devrait, en raison des avantages qu'il présente, dont cer¬ tains ont été précisés dans ce qui précède, permettre une meilleure compréhension de la signification pathophysiolo¬ gique de l'augmentation des taux d'ADN plasmatique chez l'homme aussi bien que dans des conditions expérimentales et devrait être un outil de grande valeur pour l'étude des maladies du type lupus dans le développement desquelles sont-impliqués des complexes ADN-anti-ADN et plus gé¬ néralement pour l'établissement notamment, de diagnostics d'affections bactériologiques, ^irologiques, parasitolό- giques, génétiquement transmises, cancéreuses ou vasculaire
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, 1""invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennen d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.
Claims
REVENDICATIONS 1. Procédé de récupération et de dosage de microquantités d'ADN dans un liquide biologique acellulaire, en particulier le plasma sanguin, caractérisé en ce qu'il 5 comprend les étapes successives suivantes :
- une première étape d'élimination des protéines présentes dans le liquide biologique acellulaire dans lequel on veut doser l'ADN, qui consiste à extraire un mélange dudit liquide biologique et d'acide éthylènediamine tétraacétique
10 (EDTA) par du phénol saturé par du Tris-hydroxyaminométhane (pH 8 environ) , pour obtenir une phase aqueuse pratiquement dépourvue de protéines et contenant sensiblement la tota¬ lité de l'ADN ;
- une deuxième étape de récupération de l'ADN de ladite solu- 15 tion aqueuse, qui consiste à précipiter l'ADN par adjonctio à ladite solution d'un agent coprécipitant approprié et d'un, agent de précipitation avantageusement- constitué par." un alcool inférieur, en présence d'un tampon approprié tel que le tampon Tris-hydroxyaminométhane ou analogue ;
20 " - une troisième étape, de" marquage par "Nick Translation", de l'ADN récupéré, qui consiste à incuber l'ADN avec un ou plu¬
/" sieurs désoxynucléotides-triphosphates marqués et avec de l'ADN polymérase I et de la désoxyribonucléase I, dans un milieu réactionnel qui comprend le Tris-hydroxyaminométhane,
25 le chlorure de magnésium, la sérumalbumine bovine, le 5- merceptoéthanol et le glycérol ;
- une quatrième étape de dosage de l'ADN qui consiste à doser l'ADN par toute méthode appropriée révélant le marqueur in¬ corporé à l'ADN.
30 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le marquage par "Nick Translation" de l'ADN récu¬ péré est réalisé, au cours de la troisième étape du procédé, à l'aide d'au moins un désoxynucléotide-triphosphate marqué par un isotope radioactif, auquel cas la quatrième étape du
35 procédé qui comprend le dosage de l'ADN, consiste à compter
la radioactivité présente sur un filtre papier sur le¬ quel a été déposé l'ADN marqué et qui a subi des lava¬ ges par des agents de lavage appropriés, puis a été sé¬ ché, par comptage direct ou après immersion dans un li- quide scintillant, en fonction de la nature du radio- isotope de marquage.
3. Procédé selon la revendication 1, caracté¬ risé en ce que le marquage par "Nick Translation" de l'ADN récupéré au cours de la deuxième étape, est réali- se au cours de la troisième étape à l'aide d'au moins un désoxynucléotide triphosphate marqué chimiquement par une substance pouvant être révélée à l'aide d'une réaction enzymatique, auquel cas la quatrième étape du procédé qui comprend le dosage de l'ADN consiste à révé- 1er l'ADN après fixation du composé enzymatique appro¬ prié, en présence d'un substrat chromogène.
4.". Procédé selon la revendication 1 et l'une quelconque des revendications 2 ou 3, caractérisé en_ ce que le liquide biologique acellulaire tel que le plasma humain, dans lequel- on cherche à doser l'ADN, est mélangé à raison de quelques microlitres, au cours de la première étape du procédé, avec de l'acide éthylènediamine tétra-acétique (EDTA) pour obtenir une concentration final d'EDTA de l'ordre de 10 à 20 mM (pH 8 environ) et la solut obtenue est extraite par du phénol saturé d'un tampon ap¬ proprié tel que Tris-hydroxyaminométhane 0,1 M, pH 8 envi¬ ron, notamment.
5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'agent de coprecipitation introduit au cours de la deuxième étape du procédé, est pris dans le groupe qui comprend la gélatine, les diamines telles que la sper idin les acides ribonucléiques, des polynucléotides de synthèse les protéines comportant des groupes réactifs possédant de charges positives telles qu'albumines méthylées et toute substance présentant une affinité particulière pour l'ADN
et n'inhibant pas la réaction de "Nick Translation".
6. Procédé selon l'une quelconque des reven¬ dications 1 à 5, caractérisé en ce que l'agent de préci¬ pitation mis.en oeuvre au -cours de la deuxième étape du procédé, est de l'éthanol.
7. Procédé selon l'une quelconque des reven¬ dications 1 à 6, caractérisé en ce que l'éthanol ou autre alcool inférieur utilisé comme agent de précipitation, est ajouté quelles que soient la température d'incubation et la température de centrifugation, en quantité appropriée pour obtenir une concentration finale en éthanol égale ou supérieure à 66 %.
8_ Procédé selon l'une quelconque des revendi¬ cations 1 à 7, caractérisé en ce que la phase aqueuse conte nant l'ADN, un agent de précipitation et un agent de copre¬ cipitation, est centrifugée pour provoquer la précipitation "de- l'ADN. ' .-'-
3. Procédé selon la revendication 8, caractéris î en ce que le précipité est lavé par de l'éthanol ou autre. agent de précipitation analogue, puis la solution obtenue est à nouveau centrifugée et le précipité, essentiellement constitué par de l'ADN, est récupéré.
10. Procédé selon la revendication 9 ou la reven dication 9, caractérisé en ce que l'ADN précipité est récu péré par addition d-'eau.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendi¬ cations 1 à 10,caractérisé en ce que le marquage par" ick Translation"est effectué, au cours de la troisième étape du procédé, par incubation de l'ADN récupéré, avec 2 à 50 pic moles d'un ou de plusieurs désoxynucléotides-triphosphates marqués, éventuellement environ 80-120 picomoles de désoxyn cléotides-triphosphates non marqués, environ 0,25 Unité d'ADN-polymérase I et environ 5 picogrammes de désoxyribo- nucléase-I, en présence d'un tampon tel que Tris-hydroxy- aminométhane (5-12 mM) , de chlorure de magnésium (2-5 mM) ,
de B-mercapto-éthanol (7-15 mM) , d'albumine bovine (20-60 microgrammes/ml) et de glycérol (environ 0,5 % poids/volume) .
12. Procédé selon la revendication 11, carac- térisé en ce que l'incubation est réalisée à une tempé¬ rature comprise entre 15 et 37°C environ, pendant une durée de 1 à 3 heures.
13. Procédé selon l'une quelconque des reven¬ dications 1 à 12 caractérisée en ce qu'au cours de la quatrième étape du procédé, le filtre sur lequel est dé¬ posé l'ADN est lavé, de préférence sous agitation, par une solution de forte molarité permettant d'éliminer les nucléotides marqués non-incorporés à l'ADN tout en conservant sur le filtre la totalité de l'ADN marqué.
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