KR102110200B1 - 산화성 망막 질환 - Google Patents

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Abstract

본 발명의 일부 측면들은, 반응성 산소종(ROS)에 의한 산화적 손상을 저하하고 및/또는 반응성 산물과 독성 화합물의 생성 속도를 억제하기 위해 특정 위치에서 변형된, 고도불포화된 지방산(polyunsaturated fatty acid)을 사용하여, 습식 및 건식 연령-관련 황반 변성(Wet and Dry Age-related Macular Degeneration, AMD); 망막색소변성증(Retinitis Pigmentosa, RP); 당뇨병성 망막증(Diabetic Retinopathy, DR); 백내장(Cataract); 및 스타르가르트 질환(Stargardt Disease, SD)을 치료하는 방법을 제공한다.

Description

산화성 망막 질환{OXIDATIVE RETINAL DISEASES}
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2011년 4월 26일에 출원된 미국 가출원 제61/479,281 호를 우선권으로 주장하며; 이는 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
기술분야
본 발명은 특정 질환들, 특히 습식 및 건식 연령-관련 황반 변성(Wet and Dry Age-related Macular Degeneration, AMD); 망막색소변성증(Retinitis Pigmentosa, RP); 당뇨병성 망막증(Diabetic Retinopathy, DR); 백내장(Cataract); 및 스타르가르트 질환(Stargardt Disease, SD)을 치료하기 위한, 동위원소로 변형된 고도불포화된 지방산(polyunsaturated fatty acid, "PUFA") 및 다른 변형된 PUFA에 관한 것이다.
산화적 스트레스는 미토콘드리아 질환, 신경퇴행성 질환, 선천성 대사 이상(inborn error's of metabolism), 당뇨병, 안 질환(disease of the eye), 신장 질환, 간 질환, 및 심장 질환과 같은 매우 다양한 질환과 관련되어 있다. 구체적으로는, 이러한 질환은 습식 및 건식 연령-관련 황반 변성(AMD); 망막색소변성증(RP); 당뇨병성 망막증(DR); 백내장; 및 스타르가르트 질환(SD)을 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 예를 들어, 미국 특허 출원 제20110046219 호 및 제20080275005 호와 상기 출원들에서 언급된 참조문헌을 참조한다.
산화적 스트레스와 관련된 질환은 그 수가 많고 다양하지만, 산화적 스트레스가 세포 내에서의 정상적인 산화환원 상태의 교란(disturbance)에 의해 야기된다는 것은 잘 확립되어 있다. 퍼옥사이드 및 유리 라디칼과 같은 반응성 산소종("ROS")의 일상적 생산과 해독 사이의 불균형으로 인해, 세포 구조 및 시스템(machinery)에 산화적 손상이 발생할 수 있다. 정상적인 조건에서는, 호기성 유기체에서 잠재적으로 중요한 ROS의 소스는 정상적인 산소 호흡이 이루어지는 미토콘드리아로부터 누출되는 활성화된 산소이다. 부가적으로는, 대식세포 및 효소 반응도 세포 내에서의 ROS 발생에 기여하는 것으로 알려져 있다. 세포와 이의 내부 소기관은 지질막-결합된 상태이기 때문에, ROS는 용이하게 막 구성분과 접촉하여 지질 산화를 야기할 수 있다. 결국, 이러한 산화적 손상은 활성화된 산소, 산화된 막 구성분, 또는 다른 산화된 세포 구성분과의 직접 및 간접적인 접촉을 통해 DNA 및 단백질과 같은 상기 세포 내의 다른 생체 분자들에게 전달될 수 있다. 따라서, 어떻게 산화적 손상이 세포 전체로 확산되어 내부 구성분의 이동성 및 세포 경로의 상관성(interconnectedness)에 영향을 미칠 수 있는지를 쉽게 생각해 볼 수 있다.
지질-형성 지방산은 살아 있는 세포의 주요 구성분들 중 하나로서 잘 알려져 있다. 이와 같이, 이들은 수많은 대사 경로에 참여하며, 다양한 건강 이상(pathologies)에서 중요한 역할을 한다. 고도불포화된 지방산("PUFA")은 지방산의 중요한 서브클래스(subclass)이다. 필수 영양소는 직접적으로 또는 전환을 통해 필수적인 생물학적 기능을 제공하는 식품 구성분으로서, 내부적으로 생산되지 않거나 또는 수요를 충족할 정도로 충분히 많은 양으로 생성되지 않는다. 항온 동물의 경우, 2가지의 상당히 필수적인 PUFA는, 과거 비타민 F로 알려진 리놀레산 (cis,cis-9,12-옥타데카다이엔산; (9Z,12Z)-9,12-옥타데카다이엔산; "LA"; 18:2;n-6) 및 알파-리놀렌산 (cis,cis,cis-9,12,15-옥타데카트리엔산; (9Z,12Z,15Z)-9,12,15-옥타데카트리엔산; "ALA"; 18:3;n-3)이다 (Cunnane SC. Progress in Lipid Research 2003; 42:544-568). LA는 추가적인 효소적 탈포화 및 신장에 의해 아라키돈산 (AA; 20:4;n-6)과 같은 고차의 n-6 PUFA로 전환되며; 반면, ALA는 에이코사펜타엔산 (EPA; 20:5;n-3) 및 도코사헥사엔산 (DHA; 22:6;n-3)을 포함하나 이로 한정되지 않는 고차의 n-3 시리즈를 생성한다 (Goyens PL. et al. Am. J. Clin. Nutr. 2006; 54:44-53). 특정 PUFA 또는 PUFA 전구체의 본질적인 속성 때문에, 이들의 결핍 사례들이 다수 알려져 있으며, 이러한 결핍들은 종종 의학적 상태와 연관되어 있다. 아울러, 많은 PUFA 보충제들이 처방전 없이 이용가능하며, 특정 질병들에 대해 효능이 입증되었다 (예를 들어, 미국 특허 제7,271,315 호 및 미국 특허 제7,381,558 호를 참조함).
PUFA는 최적의 산화적 인산화 성능에 필요한 적절한 유동성을 미토콘드리아 막에 부여한다. PUFA는 또한, 산화적 스트레스의 개시 및 확산에 중요한 역할을 한다. PUFA는 근원적인 현상을 증폭시키는 연쇄 반응을 통해 ROS와 반응한다 (Sun M, Salomon RG, J. Am. Chem. Soc. 2004; 726:5699-5708). 그러나, 고농도의 지질 하이드로퍼옥사이드가 비-효소적으로 생성되면 몇몇 유해한 변화가 발생하는 것으로 알려져 있다. 실제로, 코엔자임 Q10은 PUFA 과산화를 통한 PUFA 독성의 증가 및 생성되는 산물의 독성과 관련이 있다 (Do TQ et al, PNAS USA 1996; :7534-7539). 이러한 산화된 산물은 이들의 막의 유동성 및 침투성에 악영향을 미치며; 막 단백질의 산화를 초래하고; 다수의 고 반응성인 카르보닐 화합물로 전환될 수 있다. 후자로는, 아크롤레인(acrolein), 말로닉 다이알데하이드(malonic dialdehyde), 글라이옥살(glyoxal), 메틸글라이옥살 등과 같은 반응성 화학종(species)을 포함한다 (Negre-Salvayre A, et al. Brit. J. Pharmacol. 2008; 755:6-20). 그러나, PUFA 산화의 가장 주요한 산물은 알파, 베타-불포화된 알데하이드, 예컨대 4-하이드록시논-2-에날 (4-HNE; LA 또는 AA와 같은 n-6 PUFA로부터 형성됨), 4-하이드록시헥스-2-에날 (4-HHE; ALA 또는 DHA와 같은 n-3 PUFA로부터 형성됨), 및 상응하는 케토알데하이드이다 (Esterfbauer H, et al. Free Rad. Biol. Med. 1991; 77:81-128; Long EK, Picklo MJ. Free Rad. Biol. Med. 2010; 4P:1-8). 이들 반응성 카르보닐은 마이클 첨가(Michael addition) 또는 쉬프 염기(Schiff base) 형성 경로를 통해 (생체)분자와 가교되며, 다수의 (전술한 바와 같은) 병리학적 과정, 연령-관련 및 산화적 스트레스-관련 병태, 및 노화와 연루되어 있다. 중요하게는, 일부 경우에, 1,4-다이엔 시스템 (비스-알릴릭 위치)의 메틸렌 기가 실질적으로 ROS, 및 사이클로게나제 및 리폭시게나제와 같은 효소에 대한 안정성이 알릴릭 메틸렌보다 낮기 때문에, PUFA는 특정 위치에서 산화되는 것으로 보인다.
이에, 본 발명자들은, 산화 저항성 PUFA, PUFA 모방체, PUFA 프로드럭, 및/또는 산화 저항성 PUFA 및 PUFA 모방체를 함유하는 지방이 산화성 망막 질환을 경감 및/또는 치료하는 데 유용하다는 것을 발견하였다.
일부 실시 양태들은 치료가 필요한 습식 및 건식 연령-관련 황반 변성(AMD), 망막색소변성증(RP), 당뇨병성 망막증(DR), 백내장, 또는 스타르가르트 질환(SD) 환자에게 고도불포화된 성분을 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 산화성 망막 질환의 진행을 치료 또는 저해하는 방법을 제공하며, 상기 고도불포화된 성분은 하나 이상의 결합이 산화되지 않게 안정화되도록 화학적으로 변형되며, 상기 하나 이상의 안정화된 결합을 포함하는 고도불포화된 성분 또는 이의 고도불포화된 대사산물은, 투여된 후, 상기 환자의 신체로 병합(incorporation)된다.
일부 실시 양태에서, 고도불포화된 성분은 영양소이다. 다른 실시 양태에서, 상기 영양소는 지방산, 지방산 모방체, 및/또는 지방산 프로드럭이다. 다른 실시 양태에서, 상기 영양소는 지방산, 지방산 모방체, 및/또는 지방산 프로드럭을 포함하는 트리글리세라이드, 다이글리세라이드, 및/또는 모노글리세라이드이다. 일부 실시 양태에서, 상기 지방산, 지방산 모방체, 또는 지방산 프로드럭은 하나 이상의 비스-알릴릭 위치에서 안정화된다. 다른 실시 양태에서, 상기 안정화는 비스-알릴릭 위치에 하나 이상의 13C 원자 또는 하나 이상의 중수소 원자를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 상기 안정화는 하나 이상의 비스-알릴릭 위치에 2개 이상의 중수소 원자를 포함한다. 다른 실시 양태에서, 상기 안정화는 동위원소를 자연적인 함유 수준(naturally-occuring abundance level)을 초과하는 양으로 이용한다. 일부 실시 양태에서, 상기 안정화는 동위원소를 상기 동위원소의 자연적인 함유 수준을 훨씬 넘는 양으로 이용한다.
일부 실시 양태에서, 지방산, 지방산 모방체, 또는 지방산 프로드럭의 동위원소 순도는 약 20% 내지 약 99%이다. 다른 실시 양태에서, 동위원소로 안정화된 지방산, 지방산 모방체, 또는 지방산 프로드럭은 비-안정화된 지방산, 지방산 모방체, 또는 지방산 프로드럭과 함께 환자에게 투여한다. 일부 실시 양태에서, 동위원소로 안정화된 상기 지방산, 지방산 모방체, 또는 지방산 프로드럭은 환자에게 투여하는 지방산, 지방산 모방체, 또는 지방산 프로드럭의 총 함량 중 약 1% 내지 100%, 약 5% 내지 75%, 약 10% 내지 30%, 또는 약 20% 이상을 이룬다. 일부 실시 양태에서, 상기 환자는 상기 지방산, 지방산 모방체, 또는 지방산 프로드럭을 흡수한다. 일부 실시 양태에서, 상기 환자의 세포 또는 조직은, 상기 지방산, 지방산 모방체, 지방산 프로드럭, 트리글리세라이드, 다이글리세라이드, 및/또는 모노글리세라이드를, 천연적인 고도불포화된 지방산, 모방체, 또는 에스테르 프로드럭의 자가산화를 방지하기에 충분한 농도로 유지한다. 일부 실시 양태에서, 안정화는 동위원소를 상기 동위원소의 자연적인 함유 수준을 훨씬 초과하는 양으로 이용한다.
일부 실시 양태에서, 상기 방법은 오메가-3 지방산 및/또는 오메가-6 지방산인 지방산, 지방산 모방체, 또는 지방산 프로드럭을 이용한다. 다른 실시 양태에서, 상기 지방산은 11,11-D2-리놀렌산, 14,14-D2-리놀렌산, 11,11,14,14-D4-리놀렌산, 11,11-D2-리놀레산, 14.14-D2-리놀레산, 11,11,14,14-D4-리놀레산, 11-D-리놀렌산, 14-D-리놀렌산, 11,14-D2-리놀렌산, 11-D-리놀레산, 14-D-리놀레산, 및 11,14-D2-리놀레산으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 실시 양태에서, 상기 지방산은 프로-비스-알릴릭 위치에서 추가로 안정화된다. 일부 실시 양태에서, 상기 지방산은 알파 리놀렌산, 리놀레산, 감마 리놀렌산, 다이호모 감마 리놀렌산, 아라키돈산, 및/또는 도코사테트라엔산(docosatetraenoic acid)이다. 일부 실시 양태에서, 상기 지방산은 미토콘드리아 막으로 병합된다. 다른 실시 양태에서, 상기 지방산 프로드럭은 에스테르이다. 일부 실시 양태에서, 상기 에스테르는 트리글리세라이드, 다이글리세라이드, 또는 모노글리세라이드이다.
일부 실시 양태는 항산화제를 공동-투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 양태에서, 상기 항산화제는 코엔자임 Q, 이데베논, 미토퀴논, 또는 미토퀴놀이다. 다른 실시 양태에서, 상기 항산화제는 미토콘드리아-표적화된 항산화제이다. 일부 실시 양태에서, 상기 항산화제는 비타민, 비타민 모방체, 또는 비타민 프로드럭이다. 다른 실시 양태에서, 상기 항산화제는 비타민 E, 비타민 E 모방체, 비타민 E 프로드럭, 비타민 C, 비타민 C 모방체, 및/또는 비타민 C 프로드럭이다.
도 1A 및 1B. (1A) PUFA의 ROS에 의한 산화; (1B) 독성 카르보닐 화합물의 형성.
도 2A 및 2B. 실시예 1 내지 4에 기술된 중수소화된 PUFA의 1H-NMR 및 13C-NMR 분석.
도 3. 리놀렌산 처리에 대한 coq null 돌연변이체(null mutant)의 감수성은 동위원소-보강에 의해 없어진다. 효모 coq3, coq7 및 coq9 널 돌연변이체를 W303 효모 유전적 배경(yeast genetic background) (WT)에서 제조하였다. 효모 균주를 YPD 배지 (1% 박토-효모(Baco-yeast) 추출물, 2% 박토-펩톤, 2% 덱스트로스)에서 배양하고, 대수 증식기 성장(log phase growth) (OD600nm=0.1-1.0) 중인 것들을 회수하였다. 세포를 멸균수로 2회 세정하고, 포스페이트 완충액 (0.10 M 소듐 포스페이트, pH 6.2, 0.2% 덱스트로스)에서 OD600nm=0.2로 재현탁하였다. 샘플을 취하여, 0.20 OD/㎖에서 시작하여 1:5의 단계식 희석물들을 YPD 플레이트 배지에 평판배양하여, 0시간 미처리 대조군을 제공하였다 (상부 좌측 패널에 나타냄). 지정된 지방산을 200 μM의 최종 농도로, 포스페이트 완충액 중 효모 20 ㎖에 첨가하였다. 2시간, 4시간, 및 16시간째에 샘플을 취하고, 1:5 단계식 희석물들을 제조하고, YPD 플레이트 배지에 스포팅(spotting)하였다. 30℃에서 2일간 배양한 후, 사진촬영을 하였다. 이 패널은 서로 다른 날짜에 수행한, 2개의 독립적인 분석법의 대표예이다.
도 4. 동위원소-보강된 D4-리놀렌산으로 처리된 효모 coq 돌연변이체는 PUFA-매개의 세포 사멸에 대해 내성을 나타낸다. 100 ㎕ 분취물을 1시간, 2시간, 및 4시간째에 취하고, 희석 후 YPD 플레이트에 도말(spreading)하는 점을 제외하고는, 지방산 감수성 분석법을 도 6-1에서 기술한 바와 같이 수행하였다. 2일 내지 2.5일 후에 사진촬영을 하고, 콜로니의 수를 계수하였다. 효모 균주는 야생형 (원형), atp2 (삼각형), 또는 coq3 (사각형)를 포함하며; 지방산 처리는 올레산 C18:1 (실선), 리놀렌산, C18:3, n-3 (파선) 또는 11,11,14,14-D4-리놀렌산, C18:3, n-3 (점선)을 포함한다.
도 5. GC-MS에 의한 지방산 메틸 에스테르 (FAME) 표준의 분리 및 검출. FAME를 기술한 바와 같이 제조하였으며 (Moss CW, Lambert MA, Merwin WH. Appl. Microbiol. 1974; 1, 80-85), 지시된 양의 유리 지방산 및 200 ㎍의 C17:0 (내부 표준)을 메틸화 및 추출 처리하였다. 샘플 분석은 DB-왁스 컬럼 (0.25 mm X 30 m X 0.25-m 필름 두께) (Agilent, catalog 122-7031)이 구비된 Agilent 6890-6975 GC-MS에서 수행하였다.
도 6. 효모에 의한, 외부 공급된 지방산의 섭취. WT (W303) 효모를 대수 증식기에서 회수하고, 200 μM의 지정된 지방산의 존재 하에 0시간 또는 4시간 동안 인큐베이션하였다. 기술한 바와 같이, 효모 세포를 회수하고, 멸균수로 2회 세정한 다음, 알칼리 메타노라이시스(methanolysis) 및 사포닌화 처리를 하고, 지질을 추출하였다 (Moss CW, Lambert MA, Merwin WH. Appl. Microbiol. 1974; 1, 80-85; (Shaw, 1953 Shaw, W. H. C; Jefferies, J. P. Determination of ergosterol in Yeast. Anal Chem 25: 1130; 1953). 각각의 지정된 지방산은 OD600㎚ 효모 당 ㎍으로 제공되며, C17:0 내부 표준의 회복에 대해 보정하였다.
도 7. 02 소비의 카이네틱스(kinetics)는 37℃에서 40 mM AMVN에 의해 개시된 클로로벤젠에서의 0.71 M LA (플롯 1 및 2) 및 0.71 M D2-LA (플롯 3)의 산화를 동반하였다. 플롯 2 - 0.23 mM HPMC를 0.71 M LA에 첨가하였다.
도 8. 혼합 조성에 대한 클로로벤젠 용액 중 LA 및 D2-LA 혼합물의 산화 속도 의존성. 조건: [LA] + [11,11-d2-LA] = 0.775 M; [AMVN] = 0.0217 M; 37℃. RIN = (1.10±0.08) x 10-7 M/sec.
도 9. 고도불포화된 지방산의 비스-알릴릭 위치에서의 동위원소 보강은 지질의 자가산화를 저하한다. 야생형, 효모 Q-less coq3, 또는 호흡 결함성 cor1 널 돌연변이체를 서로 다른 비율의 PUFA에서 200 μM의 LA 및 D2-LA의 존재 하에 인큐베이션하였다. 0.2 OD/㎖에서 시작한 단계식 희석물 (1:5)을 YPD 고형 플레이트 배지에 스포팅하였다. 0시간 미처리 대조군을 상부 좌측에 나타낸다. 30℃에서 배양.
도 10. 고도불포화된 지방산의 비스-알릴릭 위치에서 동위원소 보강은 지질 자가산화를 저하한다. 야생형, 효모 Q-less coq3, 또는 호흡 결함 cor1 널 돌연변이체를 서로 다른 비율의 PUFA에서 200 μM의 ALA 및 D4-LA의 존재 하에 인큐베이션하였다. 0.2 OD/㎖에서 시작한 단계식 희석물 (1:5)을 YPD 고형 플레이트 배지에 스포팅하였다. 30℃에서 배양.
도 11. GC-MS 분석한 효모 추출물의 크로마토그램. 서로 다른 선(trace)은 각각 0시간 및 4시간째를 나타낸다. 각각의 FAME (C18:1, C18:3 및 D4-리놀렌)의 피크 영역을 C17:0 표준의 피크 영역으로 나누고, 보정 곡선으로 정량화하였다. 내인성 16:0 및 16:1은 거의 변하지 않는 한편, 외부에서 첨가한 지방산은 크게 증가하였다.
도 12. H-PUFA 및 D-PUFA 처리한 MVEC 세포의, 파라콰트(paraquat)에 의한 급성 중독 후의 생존율. 시험한 세포 유형 모두에 대해, D-PUFA는 대조군과 비교해 보호 효과를 가졌으며, 이는 MVEC 세포에 대한 도면에 나타난 것과 유사하였다.
도 13. 조직의 중수소 농화를 보여주는, 1:1 D2-LA/D4-ALA의 동물 투여량 연구.
도 14. 지방 분포의 변화를 비교한, 1:1 D2-LA/D4-ALA의 동물 투여량 연구.
도 15. 조직의 중수소 농화를 보여주는 1:1 D2-LA/ALA의 동물 투여량 연구.
도 16. 90-일 동물 투여량 연구 후의 대조군의 간 지방 프로파일.
도 17. 간 지방 프로파일 및 중수소 농화를 보여주는, 1:1 D2-LA/D4-ALA의 동물 투여량 연구.
도 18. D2-LA를 이용한 90-일 동물 투여량 연구 후, 간 지방 프로파일.
도 19. 뇌 지방 프로파일 및 중수소 농화를 보여주는, 1:1 D2-LA/D4-ALA의 동물 투여량 연구.
도 20. 뇌 지방 프로파일 및 중수소 농화를 보여주는, 1:1 D2-LA/ALA의 동물 투여량 연구.
도 21. 90-일 동물 투약 연구 후, 대조군의 뇌 지방 프로파일.
본원에서 사용하는 바와 같이, 약어는 하기와 같이 정의한다:
αLnn 알파-리놀렌산
4-HHE 또는 HHE 4-하이드록시헥스-2-에날
4-HNE 4-하이드록시노느-2-에날 (4-HNE; LA 또는 AA와 같은 n-6 PUFA로부터 형성)
AA 아라키돈산 (AA; 20:4;n-6)
AcOH 아세트산
ALA 알파-리놀렌산
AMD 연령-관련 황반 변성
AMVN 2,2'-아조비스(2,4-다이메틸발레로니트릴)
D 중수소화된
D1 모노-중수소화된
D2 다이-중수소화된
D2-LA 다이-중수소화된 리놀레산
D3 트리-중수소화된
D4 테트라-중수소화된
D5 펜타-중수소화된
D6 헥사-중수소화된
DHA 도코사헥사엔산 (22:6; n-3)
DMF 다이메틸포름아미드
DR 당뇨병성 망막증
EPA 에이코사펜타엔산 (20:5; n-3)
EtOAc 에틸 아세테이트
EtOH 에탄올
FAME 지방산 메틸 에스테르
HPMC 6-하이드록시-2,2,5,7,8-펜타메틸벤조크로만
H-PUFA 비-중수소화된 고도불포화된 지방산
IP 복강내
IR 적외선
KIE 카이네틱 동위원소 효과
LA 리놀레산
LDL 저밀도 지질단백질
MDA 말론다이알데하이드
MPTP 1-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘
MVEC 미세혈관 내피(Microvascular endothelium)
NINCDS 신경학적 및 의사소통적 장애 및 뇌졸중 (Neurological and Communicative disorder and stroke)
PUFA(s) 고도불포화된 지방산(들)
RIN 개시 속도
ROS 반응성 산소종
Rox 산화 속도
RP 망막색소변성증
RPE 망막 색소 상피(Retinal pigment epithelium)
SD 스타르가르트 질환
SNOMED 임상코드시스템(Systematized Nomenclature of Medicine)
SOD 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase)
TDMS 독성 시험 자료 관리 시스템(Toxicology Data Management System)
TH 티로신 하이드록실라제
THF 테트라하이드로푸란
TLC 박층 크로마토그래피
V-SMOW 빈 표준 평균 바닷물(Vienna standard mean ocean water)
WT 야생형
YPD 1% 박토-효모 추출물, 2% 박토-펩톤, 2% 덱스트로스를 포함하는 배지
습식 및 건식 연령-관련 황반 변성(AMD); 망막색소변성증(RP); 당뇨병성 망막증(DR); 백내; 및 스타르가르트 질환(SD)
산화성 스트레스가 많은 망막 퇴행성 질환에 주 역할을 하는 것으로 오랫동안 여겨져 왔다 (Winkler BS et al, Molecular Vision 1999;5:32). 산소 농도의 증가, 광노출, 및 고농도 PUFA로 인해, 안 조직에서 PUFA 과산화가 증가한다. 선진국에서 노인 인구들에서 실명(blindness)의 주 원인인 AMD는 망막 색소 상피세포(RPE)의 퇴행을 수반한다. 흡연, 죽상동맥경화증, 유전적 인자들, 및 피브리노겐이 이 질환의 발병에 관여하지만, AMD의 정확한 원인은 알려져 있지 않다 (Baskol G. Et al. Ophthalmol. 2006;220:12-16). 산화성 스트레스는 AMD의 발병에 주 역할을 한다 (Beatty S, et al. Survey Ophtalm. 2000; 45:115-134). 망막 색소상피(RPE)는 레티노이드 재순환 및 광수용체의 식균작용에 필수적이다. 비교 프로테오노믹스(comparative proteomic)의 방법을 적용해, RPE의 산화 스트레스-유도성 퇴행을 매개하는 RPE 단백질의 전반적인 변화를 밝힌 바 있다 (Arnouk H et al, J. Proteom. 2011;74:254-261). HNE 및 HHE (Long EK, et al. Free Rad. Biol. Med. 2010; 49:1-8) 뿐만 아니라 MDA (Singh SB et al, J. Clin. Diagnostic Res. 2010;4:2768-2769)와 같은 PUFA 과산화 산물의 농도 증가가 망막에서 보고되어 있으며, 한편, 광수용체 및 RPE에서 산화된 인지질의 농도 증가는 노화 및 AMD와 관련이 있다 (Suzuki M et al, Molec. Vision 2007;13:772-778). PUFA 과산화 산물은 망막 색소상피(RPE) 리포퓨신의 형성에 주 역할을 하며, 이 자체가, 그리고 대부분 이의 A2E 구성분을 통해, 가시광선으로의 조사 시 ROS를 생성할 수 있으며, AMD의 병인론에서 주 역할을 한다 (Katz ML, Arch. Gerontol. Geriatr. 2002; 34:359-370). 스타르가르트 질환(SD)에서, 광수용체 외부 세그먼트 및 RPE에서의 리포퓨신 함량이 ABCA4 돌연변이로 인해 증가한다 (Weng J et al, PNAS 2000;97:7154-7159). MDA를 비롯한 PUFA 과산화 산물은 백내장의 형성을 포함해 렌즈 병리학에서 이러한 큰 역할을 하며, PUFA 과산화는 인간의 백내장 발병에서 초기 단계인 것으로 명시되었다 (Borchman D. et al, J. Lipid Res. 2010; 51:2473-2488). 익상편(pterygium) 및 원추각막(keratoconus)을 포함해 인간의 각막 질환의 병리생리학에서 PUFA 과산화 산물의 역할이 동일하게 중요하다 (Shoham A, et al. Free Rad. Biol. Med. 2008; 45:1047-1055). 당뇨병성 망막증 또한, 산화성 스트레스 및 PUFA 과산화와 관련있다 (Baynes JW, Thorpe SR. Diabetes 1999; 48:1-9). 리놀레산, 및 LDL을 이루는 기타 PUFA의 과산화는 삼출성 AMD(exudative AMD)에 영향을 미치는 것으로 나타나 있다 (Javadzadeh a et al, Molec. Vision 2010;16:275-276).
산화성 스트레스가 이들 퇴행성 질환에서 수행하는 중요한 역할에도 불구하고, 항산화제 치료법의 성공은 아직까지 한정되어 있다. 이는 여러 가지 이유로 인한 것일 수 있다: (a) 항산화제는 통상 세포에서 고농도로 (사실상 포화상태로) 존재하며, 부가적인 보충은 단지 약간의 증가를 초래할 뿐이다 (Zimniak P Ageing Res. Rev. 2008;7:281-300). 따라서, ROS에 의한 손상의 확률적인(stochastic) 특성은 항산화제 치료법에 대한 감수성이지 않다는 것이다; (b) ROS 자체는 보호성 메커니즘의 호르메틱(hormetic) (어댑티브(adaptive)) 상향조절을 위한 저농도의 ROS의 필요성을 비롯하여 세포의 신호전달 및 다른 과정들에 중요하다; (c) 일부 항산화제들 (예컨대 비타민 E)은 그 자체가 강력한 항산화제가 될 수 있어서, PUFA 자가산화를 개시할 수 있다 (Bowry VW et al, JACS 1993　;115　:6029-6044). 더욱이, 비타민 A는 RPE-관련 리포퓨신 플루오로포어 A2E 및 이의 유도체들의 형성에 주 역할을 하며, 이들은 자외선에의 노출 시, ROS를 생성할 수 있다 (Sparrow JR et al, Investigative Ophthalm. Vis. Sci. 1999;40:2988-2995); 및 (d) HNE 및 HHE는 일단 형성되고 나면, 유리 라디칼 메커니즘과 비교해 서로 다른 방식으로 반응하여, 전형적인 항산화제에 의해 퀀칭될 수 없기 때문에, 항산화제는 HNE 및 HHE와 같은 카르보닐 화합물을 중화시키는 데 비효과적이다.
일부 측면에서, AMD, RP, DR, 백내장 및/또는 SD에 걸려 있거나 또는 이에 취약한 대상의 동정은, 형광안저혈관조영술(fluorescein angiography)과 같이 당해 기술분야에 공지된 진단 테스트에 의해, 또는 혈관 과정 중의 비정상을 동정함으로써, 결정할 수 있다. 또한, 광간섭 단층 영상(Optial Coherence Tomography) 진단학을 이용해, 이러한 대상들을 동정할 수 있다.
본 발명의 일부 측면들은, (1) 필수 PUFA가 지질 막, 특히 미토콘드리아 막의 적절한 기능에 필수적이지만, 이들의 고유 문제, 즉, ROS에 의해 산화되어 유해한 결과를 초래하는 경향이 습식 및 건식 연령-관련 황반 변성(AMD); 망막색소변성증(RP); 당뇨병성 망막증(DR); 백내장; 및 스타르가르트 질환(SD)과 연관이 있음을 이해함으로써; (2) 항산화제 처리에 대한 PUFA 과산화 산물 (반응성 카르보닐)의 진행 및 안정성의 확률적인 특성(stochastic nature)으로 인해 항산화제가 PUFA 과산화를 방지할 수 없음을 이해함으로써, 및 (3) ROS에 의한 PUFA 내 산화-취약 부위의 손상은, 이들의 유익한 물리적 특성 중 어느 것에도 해를 입히지 않으면서 이들이 이러한 산화에 덜 취약하도록 만드는 방법을 이용함으로써 극복될 수 있음을 이해함으로써 비롯된다. 본 발명의 일부 측면들은 산화에 가장 문제가 되는 필수 PUFA 및 PUFA 전구체의 부위들에서만 이를 달성하기 위해 동위원소 효과를 이용하는 것을 기술하고 있지만, 다른 측면들은 산화에 가장 문제가 되는 부위들 외에도 다른 부위들도 고려한다.
동위원소로 표지된 실시 양태들은 중요한 생물학적 과정에는 미미한 영향을 미치거나 또는 영향을 미치지 않아야 한다. 예를 들어, 생물학적 기질에 존재하는 동위원소의 자연적인 존재비는, 낮은 농도의, 동위원소로 표지된 화합물이 생물학적 과정에 무시할 만한 수준의 영향력을 가져야 함을 내포한다. 부가적으로는, 수소 원자는 물로부터 생물학적 기질로 병합되고, D20 또는 중수(heavy water)의 소비는 인간의 건강에 위협이 되지 않는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, "Physiological effect of heavy water." Elements and isotopes : formation, transformation, distribution. Dordrecht: Kluwer Acad. Publ. (2003) pp. 111-112 (70 kg의 사람은 심각한 결과 없이 4.8 ℓ의 중수를 마실 수 있음을 나타냄)를 참조한다. 더욱이, 동위원소로 표지된 많은 화합물은 진단 및 치료 목적을 위해 미국 식품 의약국의 승인을 받았다.
당해 기술분야의 당업자는, 다른 화학적 방법을 이용해 PUFA 내 산화-취약 부위를 보호함으로써 동일한 효과를 달성할 수 있음을 알 것이다. 소정의 PUFA 모방체는 천연 PUFA와 구조적 유사성을 가지는 한편, 구조적 보강으로 인해 ROS-에 의한 산화에 안정할 것이다.
조성물:
일부 실시 양태에서, 동위원소로 변형된 고도불포화된 지방산 또는 모방체는 하나 이상의 동위원소, 예를 들어 13C 및/또는 중수소로 보강되거나 또는 화학적으로 안정화된, 천연적인 PUFA와 구조적 유사성을 가진 화합물을 지칭한다. 일반적으로, 중수소가 보강에 사용되는 경우, 메틸렌 기의 1개의 수소 또는 2개 수소 모두가 보강될 수 있다.
본 발명의 일부 측면들은 1개, 수개, 또는 모든 비스-알릴릭 위치에서 중동위원소(heavy isotope)로 치환된, 필수 PUFA의 유사체인 화합물을 제공한다. 일부 실시 양태에서, 효소 전환 시 PUFA에서 비스-알릴릭 위치에 있게 될 CH2 기는 1개 또는 2개의 중동위원소로 치환된다. 이러한 화합물은 PUFA 산화가 질환 진행의 인자이거나 또는 이에 기여할 수 있는 질환의 예방 또는 치료에 유용하다.
비스-알릴릭 위치는 일반적으로 1,4-다이엔 시스템의 메틸렌 기에 상응하는 고도불포화된 지방산 또는 이의 모방체의 위치를 지칭한다. 프로-비스-알릴릭 위치는 효소적 탈포화 시, 비스-알릴릭 위치가 되는 메틸렌 기를 지칭한다.
일부 실시 양태에서, PUFA의 화학적 아이덴터티(chemical identity), 즉, 동위원소 치환, 또는 동위원소 치환을 모방하는 치환과는 상관없이 화학적 구조는 흡수 시 동일하게 존재한다. 예를 들어, 필수 PUFA, 즉 인간과 같은 포유류가 일반적으로 합성하지 못하는 PUFA의 화학적 아이덴터티는 흡수 시 동일하게 남아 있을 수 있다. 그러나, 일부 경우에, PUFA는 포유류에서 더 연장/탈포화되어, 흡수 시 화학적 아이덴터티가 바뀔 수 있다. 모방체와 유사하게, 화학적 아이덴터티는 변하지 않은 채 있을 수 있거나 또는 유사한 연장/탈포화가 진행될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 연장되고 선택적으로는 탈포화된 PUFA는 흡수 및 추가적인 대사 시, 고도의 호모로그(homolog)로 지칭될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 자연적인 함유 수준은, 자연 상태의 동위원소의 자연적인 존재비에 대해, PUFA에 혼입될 수 있는 13C 및/또는 중수소와 같은 동위원소의 농도를 지칭한다. 예를 들어, 13C는 총 탄소 원자에서 13C 원자의 자연적인 존재비는 대략 1%이다. 따라서, PUFA에서의 자연적인 13C 함유 수준보다 높은 상대적인 탄소 백분율은, 각각의 PUFA 분자에서 하나 이상의 탄소 원자에 대해, 2%, 바람직하게는 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 13C와 같이, 총 탄소 원자에서 13C로 보강된 수준이 대략 1%인 자연적인 함유 수준보다 높을 수 있다. 다른 실시 양태에서, 총 탄소 원자의 13C 보강율은 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%이다.
수소에 관해, 일부 실시 양태에서, 중수소의 자연적인 존재비는 지구 해양의 전체 천연 수소의 대략 0.0156%이다. 따라서, 자연적인 존재비보다 중수소 함유율이 높은 PUFA는, 각각의 PUFA 분자에서 하나 이상의 수소 원자에 대해, 중수소 비율이 0.02%, 바람직하게는 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%와 같이, 수소 원자에서 중수소 보강 수준이 대략 0.0156%인 자연적인 함유 수준보다 높을 수 있다. 다른 실시 양태에서, 총 수소 원자의 중수소 보강율은 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%이다.
일부 측면에서, PUFA의 조성물은 동위원소로 변형된 PUFA 및 동위원소로 비변형된 PUFA를 둘 다 포함한다. 동위원소 순도는, a) 동위원소로 변형된 PUFA의 분자의 상대적인 수와 b) 동위원소로 변형된 PUFA와 중원자가 없는 PUFA 둘 다로 이루어진 총 분자를 비교한 것이다. 일부 실시 양태에서, 상기 동위원소 순도는 중원자를 제외하고는 모두 동일한 PUFA를 지칭한다.
일부 실시 양태에서, 동위원소 순도는, 동위원소로 변형된 PUFA + 중원자가 없는 PUFA 분자의 총 수에 대한, 조성물 내 동위원소로 변형된 PUFA 분자의 백분율을 지칭한다. 예를 들어, 동위원소 순도는, 동위원소로 변형된 PUFA + 중원자가 없는 PUFA로 이루어진 모든 총 분자수에 대한, 동위원소로 변형된 PUFA 분자의 비율로서, 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%일 수 있다. 다른 실시 양태에서, 상기 동위원소 순도는, 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%이다. 일부 실시 양태에서, PUFA의 동위원소 순도는 조성물 내 PUFA의 분자의 총 수의 약 10%-100%, 10%-95%, 10%-90%, 10%-85%, 10%-80%, 10%-75%, 10%-70%, 10%-65%, 10%-60%, 10%-55%, 10%-50%, 10%-45%, 10%-40%, 10%-35%, 10%-30%, 10%-25%, 또는 10%-20%일 수 있다. 다른 실시 양태에서, PUFA의 동위원소 순도는 조성물 내 PUFA의 분자의 총 수의 약 15%- 100%, 15%-95%, 15%-90%, 15%-85%, 15%-80%, 15%-75%, 15%-70%, 15%-65%, 15%-60%, 15%-55%, 15%-50%, 15%-45%, 15%-40%, 15%-35%, 15%-30%, 15%-25%, 또는 15%-20%일 수 있다. 일부 실시 양태에서, PUFA의 동위원소 순도는 조성물 내 PUFA의 분자의 총 수의 약 20%-100%, 20%-95%, 20%-90%, 20%-85%, 20%-80%, 20%-75%, 20%-70%, 20%-65%, 20%-60%, 20%-55%, 20%-50%, 20%-45%, 20%-40%, 20%-35%, 20%-30%, 또는 20%-25%일 수 있다. 동위원소로 변형된 PUFA + 중원자가 없는 PUFA의 총 분자수 100개에서, 동위원소로 변형된 PUFA 분자가 2개일 경우, 2개의 동위원소로 변형된 분자에 포함된 중원자의 수와는 상관없이, 동위원소 순도는 2%일 것이다.
일부 측면에서, 동위원소로 변형된 PUFA 분자는, 메틸렌 기의 2개의 수소 중 하나가 중수소로 치환되는 경우와 같이 하나의 중수소 원자를 포함할 수 있으며, 이는 "D1" PUFA로 지칭될 수 있다. 유사하게는, 동위원소로 변형된 PUFA 분자는, 메틸렌 기의 2개의 수소가 모두 중수소로 치환되는 경우와 같이 2개의 중수소 원자를 포함할 수 있으며, 이는 "D2" PUFA로 지칭될 수 있다. 마찬가지로, 동위원소로 변형된 PUFA 분자는 3개의 중수소 원자를 포함할 수 있으며, "D3" PUFA로 지칭될 수 있다. 유사하게는, 동위원소로 변형된 PUFA 분자는 4개의 중수소 원자를 포함할 수 있으며, "D4" PUFA로 지칭될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 동위원소로 변형된 PUFA 분자는 5개의 중수소 원자 또는 6개의 중수소 원자를 포함할 수 있으며, 각각 "D5" 또는 "D6" PUFA로 지칭될 수 있다.
분자 내 중원자의 수, 또는 동위원소 하중(isotope load)은 다양할 수 있다. 예를 들어, 동위원소 하중이 상대적으로 낮은 분자는 약 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 중수소 원자를 포함할 수 있다. 동위원소 하중이 적당한 분자는 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 중수소 원자를 포함할 수 있다. 하중이 매우 높은 분자는, 모든 수소가 중수소로 치환될 수 있다. 따라서, 동위원소 하중은 각각의 PUFA 분자 내 중원자의 백분율을 지칭한다. 예를 들어, 상기 동위원소 하중은, 동일한 유형의 중원자가 없는 PUFA와 비교해, 동일한 유형의 원자 수의 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%를 차지할 수 있다 (예를 들어, 수소는 중수소와 "동일한 유형"일 것임). 일부 실시 양태에서, 상기 동위원소 하중은 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%일 것이다. PUFA 조성물의 동위원소 순도는 높지만 해당 분자 내 동위원소 하중이 낮을 경우에, 의도치 않은 부작용이 줄어들 것으로 예상된다. 예를 들어, 대사 경로는 동위원소 순도는 높지만 동위원소 하중은 낮은 PUFA 조성물을 사용함으로써 영향을 적게 받게 될 것이다.
당업자는 메틸렌 기의 2개의 수소 중 하나가 중수소 원자로 치환된 경우, 생성되는 화합물이 입체중심을 가질 수 있음을 쉽게 알게 될 것이다. 일부 실시 양태에서, 라세믹 화합물을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 다른 실시 양태에서, 거울상이성질체적으로 순수한 화합물을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 부가적인 실시 양태에서, 부분입체이성질체적으로 순수한 화합물을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%의 거울상이성질체성 과잉 및/또는 부분입체이성질체성 과잉을 가진 화합물의 혼합물을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 다른 실시 양태에서, 상기 거울상이성질체성 과잉 및/또는 상기 부분입체이성질체성 과잉은 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%이다. 일부 실시 양태에서, 키랄 분자와의 접촉이 산화적 손상을 약화시키기 위한 표적이 되는 경우와 같이, 실시 양태의 입체화학적으로 순수한 거울상이성질체 및/또는 부분입체이성질체를 이용하는 것이 바람직할 수 있다. 그러나, 많은 경우, 비-키랄 분자가 산화적 손상을 약화시키기 위한 표적이 된다. 이러한 경우, 실시 양태는 이들의 입체화학적 순도에 관한 염려 없이 이용될 수 있다. 아울러, 일부 실시 양태에서, 거울상이성질체와 부분입체이성질체의 혼합물은, 상기 화합물들이 산화적 손상을 약화시키기 위해 키랄 분자를 표적으로 하는 경우에도 사용할 수 있다.
일부 측면에서, 동위원소로 변형된 PUFA는 특정 조직에 상당량의 중원자를 부여한다. 따라서, 일부 측면에서, 중분자(heavy molecule)의 양은 조직 내 동일한 유형의 분자에 대한 일정 백분율일 것이다. 예를 들어, 중분자의 수는 동일한 유형의 분자의 총량의 약 1% 내지 100%일 수 있다. 일부 측면에서, 10% 내지 50%의 분자가 동일한 유형의 중분자로 치환된다.
일부 실시 양태에서, 필수 PUFA와 동일한 화학적 결합 구조를 가지지만 특정 위치에서 동위원소 조성이 상이한 화합물은 비치환 화합물과 상당히 그리고 유용하게 상이한 화학적 특성을 가질 것이다. ROS에 의한 산화를 비롯해 산화에 관한 특정 위치들은 도 1에 나타낸 바와 같이 필수 고도불포화된 지방산 및 이들의 유도체의 비스-알릴릭 위치를 포함한다. 하기 나타낸 비스-알릴릭 위치에서 동위원소로 보강된 필수 PUFA는 산화에 보다 안정할 것이다. 이에, 본 발명의 일부 측면들은 화학식 (1)의 화합물 또는 이의 염을 사용하는 특정 방법을 제공하며, 위치들은 탄소-13으로 추가로 보강될 수 있다. R1 = 알킬, H, 또는 양이온; m = 1-10; n = 1-5이며, 각각의 비스-알릴릭 위치에서, 하나 또는 2개의 Y 원자는 중수소 원자이며, 예를 들어,
Figure 112019085571088-pat00001
11,11-다이듀테로-cis,cis-9,12-옥타데카다이엔산 (11,11-다이듀테로-(9Z,12Z)-9,12-옥타데카다이엔산; D2-LA); 및 11,11,14,14-테트라듀테로-cis,cis,cis-9,12,15-옥타데카트리엔산 (11,11,14,14-테트라듀테로-(9Z,12Z,15Z)-9,12,15-옥타데카트리엔산; D4-ALA)이다. 일부 실시 양태에서, 중수소화 외에도 상기 위치들은 자연적인 함유 수준이 넘는 동위원소 존재비의 수준에서 각각 탄소-13에 의해 추가로 보강될 수 있다. PUFA 분자에서 모든 다른 탄소-수소 결합은 선택적으로는 중수소 및/또는 탄소-13을 자연적인 함유 수준 또는 그 이상으로 포함할 수 있다.
필수 PUFA는 탈포화 및 신장에 의해 고차 호모로그로 생화학적으로 전환된다. 따라서, 전구체 PUFA에서 비스-알릴릭이 아닌 일부 위치들은 생화학적 변환 시 비스-알릴릭으로 될 것이다. 그런 다음, 이러한 위치들은 ROS에 의한 산화를 비롯하여 산화에 민감하게 된다. 다른 실시 양태에서, 기존의 비스-알릴릭 위치 이외에 이러한 프로-비스-알릴릭 위치는 하기 나타낸 바와 같이 동위원소 치환에 의해 보강된다. 이에, 본 발명의 이러한 측면은 화학식 (2)의 화합물 또는 이의 염의 용도를 제공하며, 각각의 비스-알릴릭 위치와 각각의 프로-비스-알릴릭 위치에서, X 또는 Y 원자 중 하나 이상은 중수소 원자일 수 있다. R1 = 알킬, 양이온, 또는 H; m = 1-10; n = 1-5; p = 1-10.
Figure 112019085571088-pat00002
중수소화 외에도 상기 위치들은 자연적인 함유 수준보다 높은 동위원소 함유 수준으로 각각 탄소-13에 의해 추가로 보강될 수 있다. PUFA 분자에서 모든 다른 탄소-수소 결합은 선택적으로는 중수소 및/또는 탄소-13을 자연적인 함유 수준 또는 그 이상으로 포함할 수 있다.
서로 다른 비스-알릴릭 위치에서 PUFA의 산화는 서로 다른 세트의 산화 산물을 제공한다. 예를 들어, 4-HNE는 n-6 PUFA로부터 형성되는 반면, 4-HHE는 n-3 PUFA로부터 형성된다 (Negre-Salvayre A, et al. Brit. J. Pharmacol. 2008; 755:6-20). 이러한 산화의 산물은 서로 다른 조절, 독성, 신호전달 특성 등을 가진다. 따라서, 이러한 산화의 상대적인 범위를 조절하는 것이 바람직하다. 이에, 본 발명의 일부 측면들은, PUFA의 비스-알릴릭 또는 프로-비스-알릴릭 위치에서 Y1-Yn 및/또는 X1-Xm의 쌍(pair) 중 어느 한 쌍이 중수소 원자를 포함할 수 있도록, 하기 나타낸 바와 같이 서로 다른 위치에서 산화의 상대적인 수율을 조절하기 위해, 선택된 비스-알릴릭 또는 프로-비스-알릴릭 위치에서 무거운 안정한 동위원소로 차별적으로 보강된 화학식 (3)의 화합물 또는 이의 염의 용도를 제공한다. R1 = 알킬, 양이온, 또는 H; m = 1-10; n = 1-6; p = 1-10.
Figure 112019085571088-pat00003
중수소 외에도 상기 위치들은 탄소-13에 의해 추가로 보강될 수 있다. PUFA 분자 내 모든 다른 탄소-수소 결합은 중수소를 자연적인 함유 수준으로 또는 이보다 높게 포함할 수 있다. 전술한 구조에서 파선은 다양한 수의 이중 결합, 다양한 총 탄소 수, 및 비스-알릴릭 및 프로-비스-알릴릭 위치에서 보강된 동위원소의 다양한 조합을 가진 PUFA를 나타낸다.
전술한 화합물의 정확한 구조는 하기에 나타나 있으며, 동위원소가 보강된 n-3 (오메가-3) 및 n-6 (오메가-6) 필수 고도불포화된 지방산 둘 다를 제공하며, PUFA는 이들로부터 탈포화/신장에 의해 생화학적으로 만들어진다. 이들 화합물 중 어느 하나는 산화를 늦추는 데 사용될 수 있다. 하기 화합물에서, PUFA는 산화 감수성 위치, 및/또는 생화학적 탈포화/신장 시 산화에 민감하게 될 수 있는 위치에서 동위원소로 보강된다. R1은 H, 알킬, 또는 양이온일 수 있으며; R2는 H 또는 D일 수 있으며; *는 12C 또는 13C를 나타낸다.
D-리놀레산은 하기를 포함한다:
Figure 112019085571088-pat00004
.
하기 과-중수소화된 리놀레산은 예를 들어, 중수소 및/또는 탄소-13을 포함하는 배지에서 배양함으로써, 미생물학적 방법에 의해 생성될 수 있다.
Figure 112019085571088-pat00005
D-아라키돈산은 하기를 포함한다:
Figure 112019085571088-pat00006
.
하기 과-중수소화된 아라키돈산은 예를 들어, 중수소 및/또는 탄소-13을 포함하는 배지에서 배양함으로써, 미생물학적 방법에 의해 생성될 수 있다.
Figure 112019085571088-pat00007
D-리놀렌산은 하기를 포함한다:
Figure 112019085571088-pat00008
Figure 112019085571088-pat00009
.
하기 과-중수소화된 리놀렌산은 예를 들어, 중수소 및/또는 탄소-13을 포함하는 배지에서 배양함으로써, 미생물학적 방법에 의해 생성될 수 있다.
Figure 112019085571088-pat00010
본 발명의 일부 측면에서, 필수 또는 비필수든지 간에, 식이요법으로 흡수되어 체내에서 사용될 수 있는 임의의 PUFA를 이용할 수 있다. 필수 또는 비-필수 PUFA 또는 전구체의 경우, 보충되는 안정화된 물질은 다른 식이요법 흡수 및 생물제조와 경쟁하여, 질환을 야기하는 화학종의 이용가능한 농도를 감소시킬 수 있다.
본 발명의 일부 측면에서, 상기 구조들로 기술한 바와 같이 산화 민감성 위치에서 동위원소로 보강된 PUFA는 적절한 동위원소, 중수소 및/또는 탄소-13의 자연적인 존재비와 비교해 상기 위치에서 농축된 중동위원소이다.
일부 실시 양태에서, 개시 화합물은 동위원소 순도가 99% 이상까지 농축된다. 일부 실시 양태에서, 상기 위치들에서 중동위원소 농축은 50% 내지 99%의 중수소 및/또는 탄소-13이다.
일부 실시 양태에서, 약물 또는 보충제로서 식이요법을 통해 복용되는 경우, 변형된 지방산은, 에틸 에스테르 또는 글리세릴 에스테르와 같이 모 지방산 또는 모방체의 비-독성이면서 약제학적으로 적합한 에스테르를 포함하나 이로 한정되지 않는 프로드럭으로서 복용될 수 있다. 이러한 에스테르는 장에서 약물의 관용성(tolerance)과 소화에 일조하며, 에스테르 프로드럭을 흡수되는 약물의 활성 산 형태로 탈에스테르화하기 위해 장 내 고농도의 에스터라제에 의존한다. 그래서, 일부 실시 양태에서, 본 발명은 본원의 변형된 지방산의 프로드럭 에스테르를 포함한다. 시장, 영양학, 및 임상적 산업상 문헌에서 이러한 유형의 약물의 예로는, Glaxo 's Lovaza, (오메가 3 지방산 에스테르, EPA, DHA, 및 알파-리놀렌산의 혼합물), Abbott's Omacor (오메가-3-지방산 에스테르), 및 대부분의 어유 보충제(fish oil supplement) (DHA 및 EPA 에스테르)를 포함한다. 일부 측면에서, 에스테르 프로드럭을 조직 또는 세포에 혼입하는 것은 신체 구성분으로서 사용될 변형된 모 PUFA의 혼입을 지칭한다.
일부 실시 양태에서, 안정화된 조성물은 이들의 원소 조성을 바꾸지 않으면서 천연적인 지방산을 모방한다. 예를 들어, 치환기는 화학적 원자가 껍질을 유지할 수 있다. 일부 실시 양태는 천연적인 지방산, 모방체, 및 이들의 에스테르 프로드럭을 포함하며, 이들은 특정 질환의 메커니즘을 예방하는 데 효과적이도록 화학적으로 변형되지만 물질의 원소적 조성을 바꾸지 않는 방식 (예컨대 동위원소 치환)으로 변형된다. 예를 들어, 중수소는 동일한 원소 수소의 형태이다. 일부 측면에서, 이들 화합물은 원소의 조성을 유지하며, 산화에 대해 안정화된다. 산화에 대해 안정화된 일부 화합물들은 산화 민감성 유전자좌(loci)에서 안정화된다. 일부 화합물들은 비스-알릴릭 탄소 수소 결합 등에서 중동위원소 치환을 통해 산화에 대해 안정화된다.
다른 실시 양태에서, PUFA의 산화-취약성 비스-알릴릭 위치는 비스-알릴릭 수소-활성화 이중 결합을 보다 멀리 이동시켜서, 비스-알릴릭 위치를 제거하면서 하기 나타낸 바와 같이 소정의 PUFA 유동성은 유지함으로써, 수소 분리(hydrogen abstraction)에 대해 보호될 수 있다. 이들 PUFA 모방체는 비스-알릴릭 위치를 가지지 않는다.
Figure 112019085571088-pat00011
다른 실시 양태에서, PUFA의 산화-취약성 비스-알릴릭 위치는 원자가가 II인 헤테로원자를 사용하여, 하기 나타낸 바와 같이 비스-알릴릭 수소를 제거함으로써, 수소 분리에 대해 보호될 수 있다. 이들 PUFA 모방체 또한, 비스-알릴릭 수소를 가지지 않는다.
Figure 112019085571088-pat00012
다른 실시 양태에서, PUFA 모방체, 즉, 천연 PUFA와 구조적으로 유사하지만 구조적 차이로 인해 산화될 수 없는 화합물을 전술한 목적에 사용할 수 있다. PUFA의 산화-취약성 비스-알릴릭 위치는 하기 나타낸 바와 같이, 다이-메틸화 또는 할로겐화에 의해 수소 분리에 대해 보호될 수 있다. 메틸기에 있는 수소 원자는 선택적으로는 불소와 같은 할로겐, 또는 중수소일 수 있다. 이들 PUFA 모방체는 비스-알릴릭 위치에서 다이메틸화된다.
Figure 112019085571088-pat00013
다른 실시 양태에서, PUFA의 산화-취약성 비스-알릴릭 위치는 하기에 나타내는 바와 같이 알킬화에 의해 수소 분리에 대해 보호될 수 있다. 이들 PUFA는 비스-알릴릭 위치에서 다이알킬화된다.
Figure 112019085571088-pat00014
다른 실시 양태에서, 사이클로프로필 기가 이중 결합 대신에 사용되어, 하기에 나타내는 바와 같이 비스-알릴릭 위치를 제거하면서 산이 소정의 유동성을 가지게 할 수 있다. 이들 PUFA 모방체는 이중 결합 대신에 사이클로프로필 기를 가진다.
Figure 112019085571088-pat00015
다른 실시 양태에서, 적절한 형태의 1,2-치환 사이클로부틸 기가 이중 결합 대신에 사용되어, 하기에 나타내는 바와 같이 비스-알릴릭 위치를 제거하면서 산이 소정의 유동성을 가지게 할 수 있다. 이들 PUFA 모방체는 이중 결합 대신에 1,2-사이클로부틸 기를 가진다.
Figure 112019085571088-pat00016
이중 결합 대신에 1,2-사이클로부틸 기를 가진 모방체에 관한 전술한 실시 양태의 변형에서, 적절한 형태의 1,3-치환된 사이클로부틸 기가 이중 결합 대신에 사용되어, 비스-알릴릭 위치를 제거하면서 산이 소정의 유동성을 가지게 할 수 있다. 이들 PUFA 모방체는 이중 결합 대신에 1,3-사이클부틸 기를 가진다.
Figure 112019085571088-pat00017
특정 작용기는 소정의 다른 작용기와 등입체성(isosteric) 및/또는 생등입체성(bioisosteric)이라는 것은 의료 화학에서 잘 알려진 원리이다. 생동배체(bioisostere)는 화학적 화합물과 광범위하게 유사한 생물학적 특성을 생성하는 유사한 물리적 또는 화학적 특성을 가진 치환기 또는 기(group)이다. 예를 들어, 수소의 잘 알려진 동배체 및/또는 생동배체는 불소와 같은 할로겐을 포함하며; 알켄의 동배체 및/또는 생동배체는 알카인, 페닐 고리, 사이클로프로필 고리, 사이클로부틸 고리, 사이클로펜틸 고리, 사이클로헥실 고리, 티오에테르 등을 포함하며; 카르보닐의 동배체 및/또는 생동배체는 설폭사이드, 설폰, 티오카르보닐 등을 포함하며; 에스테르의 동배체 및/또는 생동배체는 아미드, 설폰산 에스테르, 설폰아미드, 설피닐산 에스테르, 설피닐아미드 등을 포함한다.
결과적으로는, PUFA 모방체는 또한, 등입체성 및/또는 생등입체성 작용기를 가진 화합물을 포함한다.
본 발명에 사용하기 위한 프로드럭으로서 PUFA 및/또는 PUFA 모방체를 제형하는 것이 유용할 수 있는 것으로 사료된다. 프로드럭은 약리학적 성분이며, 그 자체가 생물학적 활성을 가질 수 있지만, 투여 시, 상기 프로드럭은 생물학적 활성을 또한 발휘하는 형태로 대사된다. 서로 다른 유형의 프로드럭이 많이 알려져 있으며, 이들은 대사 시 이들의 세포 위치를 토대로 2가지 주 유형으로 분류할 수 있다. I형 프로드럭은 세포내에서 대사되는 것들이며, 한편 II형은 세포외에서 대사되는 것들이다. 카르복실산은 에스테르, 및 다양한 다른 작용기로 전환되어, 흡수, 분포, 대사, 및 분비와 같은 약리역학을 증대시킬 수 있는 것으로 잘 알려져 있다. 에스테르는 알코올 (또는 이의 화학적 등가물)과 카르복실산 (또는 이의 화학적 등가물)의 축합에 의해 형성되는, 카르복실산의 잘 알려진 프로드럭 형태이다. 일부 실시 양태에서, PUFA의 프로드럭으로의 혼입을 위한 알코올 (또는 이들의 화학적 등가물)로는, 약제학적으로 허용가능한 알코올, 또는 대사 시 약제학적으로 허용가능한 알코올을 제공하는 화학물질을 포함한다. 이러한 알코올로는, 프로필렌 글리콜, 에탄올, 아이소프로판올, 2-(2-에톡시에톡시)에탄올 (Transcutol®, Gattefosse, Westwood, N.J. 07675), 벤질 알코올, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜 200, 폴리에틸렌 글리콜 300, 또는 폴리에틸렌 글리콜 400; 폴리옥시에틸렌 피마자유 유도체 (예를 들어, 폴리옥시에틸렌글리세롤트리리신올레에이트 또는 폴리옥실 35 피마자유 (Cremophor®EL, BASF Corp.), 폴리옥시에틸렌글리세롤 옥시스테아레이트 (Cremophor®RH 40 (폴리에틸렌글리콜 40 수소화된 피마자유) 또는 Cremophor®RH 60 (폴리에틸렌글리콜 60 수소화된 피마자유), BASF Corp.)); 포화된 폴리글리콜화된 글리세라이드 (예를 들어, Westwood, N.J. 07675 소재의 Gattefosse 사로부터 입수가능한 Gelucire® 35/10, Gelucire® 44/14, Gelucire® 46/07, Gelucire® 50/13 또는 Gelucire® 53/10); 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르 (예를 들어, 세토마크로골(cetomacrogol) 1000); 폴리옥시에틸렌 스테아레이트 (예를 들어, PEG-6 스테아레이트, PEG-8 스테아레이트, 폴리옥실 40 스테아레이트 NF, 폴리옥시에틸 50 스테아레이트 NF, PEG-12 스테아레이트, PEG-20 스테아레이트, PEG-100 스테아레이트, PEG-12 다이스테아레이트, PEG-32 다이스테아레이트, 또는 PEG-150 다이스테아레이트); 에틸 올레에이트, 아이소프로필 팔미테이트, 아이소프로필 미리스테이트; 다이메틸 아이소소바이드; N-메틸피롤리디논; 파라핀; 콜레스테롤; 레시틴; 좌제 기제(suppository base); 약제학적으로 허용가능한 왁스 (예를 들어, 카르나우바 왁스(carnauba wax), 황납(yellow wax), 백랍(white wax), 미세결정질 왁스, 또는 유화제 왁스(emulsifying wax)); 약제학적으로 허용가능한 규소 유체; (소르비탄 라우레이트, 소르비탄 올레에이트, 소르비탄 팔미테이트, 또는 소르비탄 스테아레이트를 포함한) 소르비탄 지방산 에스테르; 약제학적으로 허용가능한 포화된 지방 또는 약제학적으로 허용가능한 포화된 오일 (예를 들어, 수소화된 피마자유 (글리세릴-트리스-12-하이드록시 스테아레이트), 세틸 에스테르 왁스 (용융점이 약 43℃ 내지 47℃인 C14-C18 포화된 지방산의 주로 C14-C18 포화된 에스테르의 혼합물), 또는 글리세릴 모노스테아레이트)을 포함하나, 이로 한정되지 않는다.
일부 실시 양태에서, 지방산 프로드럭은 에스테르 P-B (여기서, 라디칼 P는 PUFA이고, 라디칼 B는 생물학적으로 허용가능한 분자임)로 표시된다. 그래서, 에스테르 P-B의 절단은 PUFA 및 생물학적으로 허용가능한 분자를 제공한다. 이러한 절단은 산, 염기, 산화제, 및/또는 환원제에 의해 도입할 수 있다. 생물학적으로 허용가능한 분자의 예로는, 영양 물질, 펩타이드, 아미노산, 단백질, (단당류, 이당류, 다당류, 글리코스아미노글리칸, 및 올리고당류를 포함한) 탄수화물, 뉴클레오타이드, 뉴클레오사이드, (모노-치환, 다이-치환 및 트리-치환 글리세롤, 글리세로인지질, 스핑고지질, 및 스테로이드를 포함한) 지질을 포함하나, 이로 한정되지 않는다.
일부 실시 양태에서, PUFA의 프로드럭으로 혼입하기 위한 알코올 (또는 이들의 화학적 등가물)로는, 탄소수 1 내지 50의 알코올 ("C1-50 알코올"), C1-45 알코올, C1-40 알코올, C1-35 알코올, C1-30 알코올, C1-25 알코올, C1-20 알코올, C1-15 알코올, C1-10 알코올, C1-6 알코올을 포함한다 (본원에서 언제 나타나든지 간에, "1-50"과 같은 수치의 범위는 주어진 범위의 각각의 정수를 지칭하며; 예를 들어, "탄소수 1 내지 50"은 알킬기가 1개의 탄소 원자, 2개의 탄소 원자, 3개의 탄소 원자 등, 50개를 포함해 50개 이하의 탄소 원자로 이루어질 수 있음을 의미하며, 그렇지만 본 정의는 수치가 지정되지 않은 용어 "알킬"의 경우도 포함함). 이러한 알코올은 분지형, 비분지형, 포화된, 불포화된, 고도불포화될 수 있으며, 및/또는 질소, 산소, 황, 인, 붕소, 실리콘, 불소, 염소, 브롬, 또는 요오드와 같은 하나 이상의 헤테로원자를 포함한다. 예시적인 알코올로는, 메틸, 에틸, 프로필, 아이소-프로필, n-부틸, 아이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, 펜틸, 헥실, 퍼플루오로메틸, 퍼클로로메틸, 퍼플루오로-tert-부틸, 퍼클로로-tert-부틸, 및 벤질 알코올, 뿐만 아니라 폴리에틸렌 글리콜과 같은 에테르 알코올을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 알코올은 하전된 화학종을 포함한다. 이러한 화학종은 음이온성 또는 양이온성일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 상기 화학종은 양으로 하전된 인 원자이다. 다른 실시 양태에서, 상기 양으로 하전된 인 원자는 포스포늄 양이온이다. 다른 실시 양태에서, 하전된 화학종은 1차, 2차, 3차, 또는 4차 암모늄 양이온이다.
일부 실시 양태에서, PUFA의 프로드럭으로 혼입하기 위한 알코올 (또는 이들의 화학적 등가물)로는, 다이올, 트리올, 테트라올, 펜타올 등과 같은 폴리알코올을 포함한다. 폴리알코올의 예로는, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 메틸프로판다이올, 에톡시다이글리콜, 헥실렌 글리콜, 다이프로필렌 글리콜 글리세롤, 및 탄수화물을 포함한다. 폴리알코올과 PUFA로부터 형성된 에스테르는 모노-에스테르, 다이-에스테르, 트리-에스테르 등일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 다중 에스테르화된 폴리알코올은 동일한 PUFA로 에스테르화된다. 다른 실시 양태에서, 다중 에스테르화된 폴리알코올은 서로 다른 PUFA로 에스테르화된다. 일부 실시 양태에서, 서로 다른 PUFA는 동일한 방식으로 안정화된다. 다른 실시 양태에서, 서로 다른 PUFA는 서로 다른 방식 (예컨대 하나의 PUFA에서는 중수소 치환되고 또 다른 PUFA에서는 13C 치환됨)으로 안정화된다. 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 PUFA는 오메가-3 지방산이며,하나 이상의 PUFA는 오메가-6 지방산이다.
또한, 본 발명에 사용하기 위한 염으로서 PUFA 및/또는 PUFA 모방체 및/또는 PUFA 프로드럭을 제형하는 것이 유용할 수 있는 것으로 사료된다. 예를 들어, 약학 화합물의 특성을 조정하는 수단으로 염 형성을 이용하는 것이 잘 알려져 있다. Stahl et al., Handbook of pharmaceutical salts: Properties, selection and use (2002) Weinheim/Zurich: Wiley-VCH/VHCA; Gould, Salt selection for basic drugs, Int. J. Pharm. (1986), 33 :201-217을 참조한다. 염 형성을 이용해, 약품의 용해도를 증가 또는 감소시키고, 안정성 또는 독성을 개선하고, 흡습성을 감소시킬 수 있다.
염으로서 PUFA 및/또는 PUFA 모방체 및/또는 PUFA 프로드럭을 제형하는 것은, 염기성 무기 염 형성 제제, 염기성 유기 염 형성 제제, 및 산성과 염기성 작용기 둘 다를 포함하는 염 형성 제제의 사용을 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 염 형성에 유용한 여러 가지 무기 염기로는, 리튬, 나트륨, 칼륨, 루비듐, 세슘, 및 프란슘의 염과 같은 알칼리 금속 염, 베릴륨, 마그네슘, 칼슘, 스트론튬, 바륨, 및 라듐의 염과 같은 알칼리 토금속 염, 및 알루미늄과 같은 금속을 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 이들 무기 염기는 카르보네이트, 하이드로겐 카르보네이트, 설페이트, 하이드로겐 설페이트, 설파이트, 하이드로겐 설파이트, 포스페이트, 하이드로겐 포스페이트, 다이하이드로겐 포스페이트, 포스파이트, 하이드로겐 포스파이트, 하이드록사이드, 옥사이드, 설파이드, 알콕사이드 예컨대 메톡사이드, 에톡사이드, 및 t-부톡사이드 등과 같은 반대이온을 추가로 포함할 수 있다. 염 형성에 유용한 여러 가지 유기 염기로는, 아미노산, 아르기닌, 라이신, 오르니틴 등과 같은 염기성 아미노산, 암모니아, 메틸아민, 에틸아민, 다이메틸아민, 다이에틸아민, 트리메틸아민, 트리에틸아민 등과 같은 알킬아민, 피리딘, 피콜린 등과 같은 헤테로사이클릭 아민, 에탄올아민, 다이에탄올아민, 트리에탄올아민 등과 같은 알칸올아민, 다이에틸아미노에탄올, 다이메틸아미노에탄올, N-메틸글루카민, 다이사이클로헥실아민, N,N'-다이벤질에틸렌다이아민, 에틸렌다이아민, 피페라진, 콜린, 트롤아민, 이미다졸, 다이올아민, 베타인, 트로메타민, 메글루민, 클로로프로카인, 프로카인 등을 포함하나, 이로 한정되지 않는다.
PUFA 및/또는 PUFA 모방체 및/또는 PUFA 프로드럭의 염 제형으로는, 약제학적으로 허용가능한 염기성 무기 염, 염기성 유기 염, 및/또는 산성 및 염기성 작용기를 둘 다 가지는 유기 화합물을 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 약제학적으로 허용가능한 염은 당해 기술분야에 잘 알려져 있으며, 전술한 무기 및 유기 염기의 다수를 포함한다. 약제학적으로 허용가능한 염은 추가로, 식품 의약국 및 외부 규제 에이전시(foreign regulatory agency)에 의해 승인을 받은 약물에서 발견되는 염 및 염-형성 제제를 포함한다. 혼입에 약제학적으로 허용가능한 유기 양이온으로는, 벤자틴, 클로로프로카인, 콜린, 다이에탄올아민, 에틸렌다이아민, 메글루민, 프로카인, 베네타민, 클레미졸, 다이에틸아민, 피페라진, 및 트로메타민을 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 혼입에 약제학적으로 허용가능한 금속성 양이온으로는, 알루미늄, 칼슘, 리튬, 마그네슘, 칼륨, 나트륨, 아연, 바륨, 및 비쓰무스를 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 부가적인 염-형성 제제로는, 아르기닌, 베타인, 카르니틴, 다이에틸아민, L-글루타민, 2-(4-이미다졸릴)에틸아민, 아이소부탄올아민, 라이신, N-메틸피페라진, 모르폴린, 및 테오브로민을 포함하나, 이로 한정되지 않는다.
더욱이, 약제학적으로 승인을 받은 반대이온에 대한 수 개의 리스트가 존재한다. Bighley et al, Salt forms of drugs and absorption. 1996 In: Swarbrick J. et al. eds. Encyclopaedia of pharmaceutical technology, Vol. 13 New York: Marcel Dekker, Inc. pp 453-499; Gould, P.L., Int. J. Pharm. 1986, 33, 201-217; Berge, J. Pharm. Sci. 1977, 66, 1-19; Heinrich Stahl P., Wermuch C.G. (editors), Handbook of Pharmaceutical Salts, IUPAC, 2002; Stahl et al., Handbook of Pharmaceutical salt: Properties, selection and use (2002) Weinheim/Zurich: Wiley-VCH/VHCA를 참조하며, 이들은 모두 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
비-중수소화된 PUFA와 같은 동위원소로 비변형된 PUFA를 모두, 중수소화된 PUFA와 같이 동위원소로 변형된 PUFA로 치환하는 것은 불필요할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 막에 D-PUFA와 같이 동위원소로 변형된 PUFA가 충분히 존재하여, H-PUFA와 같은 비변형된 PUFA가 자가산화의 연쇄 반응을 유지시키지 못하게 하는 것이 바람직하다. 자가산화 동안에, 하나의 PUFA가 산화되는 경우, 근접한 곳에 비-산화된 PUFA가 존재하며, 비-산화된 PUFA는 산화된 PUFA에 의해 산화될 수 있다. 이 또한, 자가산화라고 지칭할 수 있다. 일부 경우에, D-PUFA가 있는 막에 저농도의, 예를 들어 "희석된" H-PUFA가 존재하는 경우, 이러한 산화 사이클은 H-PUFA를 분리하고 있는 거리로 인해 망가질 수 있다. 일부 실시 양태에서, 동위원소로 변형된 PUFA의 농도는 자가산화 연쇄 반응을 유지하기에 충분한 양으로 존재한다. 상기 자가산화 연쇄 반응을 망가뜨리기 위해, 예를 들어, 동일한 유형의 총 분자 중 1-60%, 5-50%, 또는 15-35%가 상기 막에 존재한다. 이는 IRMS (동위원소비 질량분석기)로 측정할 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 활성 화합물의 식이요법, 보충, 또는 약학 조성물을 제공한다. 일부 실시 양태에서, 상기 식이요법, 보충, 또는 약학 조성물은 상기 활성 화합물의 염을 포함할 수 있다.
염 형성에 유용한 여러 가지 무기 염기로는, 리튬, 나트륨, 칼륨, 루비듐, 세슘, 및 프란슘의 염과 같은 알칼리 금속 염, 및 베릴륨, 마그네슘, 칼슘, 스트론튬, 바륨, 및 라듐의 염과 같은 알칼리 토금속 염, 및 알루미늄과 같은 금속을 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 이들 무기 염기는 카르보네이트, 하이드로겐 카르보네이트, 설페이트, 하이드로겐 설페이트, 설파이트, 하이드로겐 설파이트, 포스페이트, 하이드로겐 포스페이트, 다이하이드로겐 포스페이트, 포스파이트, 하이드로겐 포스파이트, 하이드록사이드, 옥사이드, 설파이드, 메톡사이드, 에톡사이드, 및 t-부톡사이드와 같은 알콕사이드 등과 같은 반대이온을 추가로 포함할 수 있다.
염 형성에 유용한 여러 가지 유기 염기로는, 아미노산; 아르기닌, 라이신, 오르니틴 등과 같은 염기성 아미노산; 암모니아; 암모늄 하이드록사이드; 메틸아민, 에틸아민, 다이메틸아민, 다이에틸아민, 트리메틸아민, 트리에틸아민 등과 같은 알킬아민; 피리딘, 피콜린 등과 같은 헤테로사이클릭 아민; 에탄올아민, 다이에탄올아민, 트리에탄올아민 등과 같은 알칸올아민; 다이에틸아미노에탄올, 다이메틸아미노에탄올; N-메틸글루카민; 다이사이클로헥실아민; Ν,Ν'-다이벤질에틸렌다이아민; 에틸렌다이아민; 피페라진; 콜린; 트롤아민; 이미다졸; 다이올아민; 베타인; 트로메타민; 메글루민; 클로로프로카인; 프로카인 등을 포함하나, 이로 한정되지 않는다.
활성 화합물의 염으로는, 약제학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있으나, 이로 한정되지 않는다. 약제학적으로 허용가능한 염은 당해 기술분야에 잘 알려져 있으며, 전술한 염-형성 제제 중 많은 것들을 포함한다. 약제학적으로 허용가능한 염은 식품 의약국 및 외부 규제 기관에 의해 승인된 약물들에 존재하는 유형의 염 및 염-형성 제제를 추가로 포함한다.
활성 화합물의 염에 혼입하기 위한 약제학적으로 허용가능한 유기 양이온으로는, 벤자틴, 클로로프로카인, 콜린, 다이에탄올아민, 에틸렌다이아민, 메글루민, 프로카인, 베네타민, 클레미졸, 다이에틸아민, 피페라진, 및 트로메타민을 포함하나, 이로 한정되지 않는다.
활성 화합물의 염에 혼입하기 위한 약제학적으로 허용가능한 금속성 양이온으로는, 알루미늄, 칼슘, 리튬, 마그네슘, 칼륨, 나트륨, 아연, 바륨, 및 비쓰무스를 포함하나, 이로 한정되지 않는다.
염을 형성하는 잠재적인 유용성을 가진 부가적인 염-형성 제제로는, 아세틸아미노아세트산, N-아세틸-1-아스파라긴, N-아세틸시스틴, 아르기닌, 베타인, 카르니틴, L-글루타민, 2-(4-이미다졸릴)에틸아민, 아이소부탄올아민, 라이신, N-메틸피페라진, 및 모르폴린을 포함하나, 이로 한정되지 않는다.
아울러, 약제학적으로 승인된 반대이온에 대한 수 개의 리스트가 존재한다. Bighley et al, Salt forms of drugs and absorption. 1996 In: Swarbrick J. et al. eds. Encyclopaedia of pharmaceutical technology, Vol. 13 New York: Marcel Dekker, Inc. pp 453-499; Gould, P.L., Int. J. Pharm. 1986, 33, 201-217; Berge, J. Pharm. Sci. 1977, 66, 1-19; Heinrich Stahl P., Wermuch C.G. (editors), Handbook of Pharmaceutical Salts, IUPAC, 2002; Stahl et al., Handbook of pharmaceutical salts: Properties, selection and use (2002) Weinheim/Zurich: Wiley-VCH/VHCA를 참조하며, 이들은 모두 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
공동-투여
일부 실시 양태에서, 본원에서 개시한 화합물은 조합해서 투여한다. 예를 들어, 일부 실시 양태에서, 2, 3, 4, 및/또는 5가지 이상의 안정화된 화합물을 함께 투여한다. 일부 실시 양태에서, 안정화된 화합물을 대략 유사한 양으로 투여한다. 다른 실시 양태에서, 안정화된 화합물을 서로 다른 양으로 투여한다. 예를 들어, 혼합물 중 2가지 이상의 화합물 중 어느 하나는 혼합물 중 약 1% 내지 약 99%, 약 5% 내지 약 95%, 약 10% 내지 약 90%, 약 15% 내지 약 85%, 약 20% 내지 약 80%, 약 25% 내지 약 75%, 약 30% 내지 약 70%, 약 35% 내지 약 65%, 약 40% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 60%, 약 45% 내지 약 55%, 및/또는 약 50%일 수 있다. 다른 실시 양태에서, 혼합물 중 2가지 이상의 화합물 중 어느 하나는 혼합물 중 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%일 수 있다.
항산화제가, 공정의 확률적인 특성 및 PUFA 과산화 산물 (반응성 카르보닐)의 항산화제 처리에 대한 안정성으로 인해, PUFA 과산화의 악영향을 없애지 못하더라도, 본원에서 기술한 것들과 같은 산화에 내성인 조성물과 항산화제를 공동-투여하면, 산화적 스트레스-관련 장애를 치료하는 데 유익함을 증명할 수 있다.
공동-투여에 유용한 것으로 사료되는 소정의 항산화제로는, 비타민 C 및 비타민 E와 같은 비타민; 글루타티온, 리포산, 요산, 카로텐, 리코펜, 루테인, 안토시아닌, 옥살산, 피트산(phytic acid), 탄닌, 코엔자임 Q, 멜라토닌, 토코페롤, 토코트리엔올, 레스베라트롤(resveratrol)을 비롯한 폴리페놀, 플라보노이드, 셀레늄, 유게놀, 이데베논, 미토퀴논, 미토퀴놀, 유비퀴논, 제토-쉴러(Szeto-Schiller) 펩타이드, 및 미토콘드리아-표적화된 항산화제를 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 명백하게 언급하지 않는 경우, 전술한 항산화제의 퀴논 유도체가 또한, 공동-투여에 유용한 것으로 사료된다.
일부 실시 양태에서, 안정화된 화합물은 항산화제 유전자를 상향조절하는 화합물과 함께 투여된다. 다른 실시 양태에서, 안정화된 화합물은 Keap1/Nrf2/ARE 신호전달 경로와 같은 신호전달 경로에 영향을 미쳐 헴 옥시게나제-1 (HO-1)과 같은 항염증성 및/또는 항산화제 단백질을 생성하는 화합물과 함께 투여된다. 일부 실시 양태에서, 안정화된 화합물은 항산화제 염증 조정제와 함께 투여된다. 항산화제 염증 조정제는 프로-항산화제 및/또는 프로-염증성 전사 인자를 억제한다. 일부 실시 양태에서, 항산화제 염증 조정제는 전사 인자 Nrf2의 활성화제이다. Nrf2 활성화는 항산화제, 해독, 및 항염증성 유전자 상향조절을 촉진한다. 다른 실시 양태에서, 항산화제 염증 조정제는 NF-κΒ를 억제한다. 일부 실시 양태에서, 항산화제 염증 조정제는 STAT3를 억제한다. 다른 실시 양태에서, 안정화된 화합물은 히스톤 디아세틸라제 활성에 영향을 미치는 화합물과 함께 투여된다. 일부 실시 양태에서, 안정화된 화합물은 항산화제 반응 구성원(antioxidant response element, ARE)에 결합하는 화합물과 함께 투여된다. 다른 실시 양태에서, 안정화된 화합물은 항산화제 염증 조정제인 바르독솔론 메틸 (2-시아노-3,12-다이옥소올레아네-1,9(11)-다이엔-28-오익산 메틸 에스테르)와 함께 투여된다. 일부 실시 양태에서, 상기 항산화제 염증 조정제는 2-시아노-3,12-다이옥소올레아네-1,9(11)-다이엔-28-오익산, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 에스테르이다. 다른 실시 양태에서, 상기 항산화제 염증 조정제는 2-시아노-3,12-다이옥소올레아네-1,9(11)-다이엔-28-오익산의 아미드이다. 일부 실시 양태에서, 상기 항산화제 염증 조정제는 트리테르페노이드이다. 다른 실시 양태에서, 상기 항산화제 염증 조정제는 하기 화합물로부터 선택된다:
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공동-투여 치료법에 유용한 것으로 생각되는 부가적인 항산화제로는, 미국 특허 6,331,532; 7,179,928; 7,232,809; 7,888,334; 7,888,335; 7,432,305; 7,470,798; 및 7,514,461; 미국 특허 출원 20020052342; 20030069208; 20040106579; 20050043553; 20050245487; 20060229278; 20070238709; 20070270381; 20080161267; 20080275005; 20090258841; 20100029706; 및 20110046219에 개시한 화합물들을 포함하며; 이들 특허 및 특허 출원에서 개시한 화합물은 원용에 의해 포함된다. 이들 화합물은 미토콘드리아-표적화된 화합물이며, 하기를 포함하나, 이로 한정되지 않는다:
화학식 I 또는 II의 화합물
Figure 112019085571088-pat00019
(상기 식에서, R1 및 R2는 독립적으로 -C1-C4 알킬, -C1-C4 할로알킬, -CN, -F, -CI, -Br, 및 -I로부터 선택되며; R3는 -C1-C4 알킬, -C1-C4 할로알킬, -CN, -F, -CI, 및 -I로부터 선택되며, R20는 독립적으로 -C1-C20 알킬, -C1-C20 알케닐, -C1-C20 알키닐, 및 하나 이상의 이중 결합 및 하나 이상의 삼중 결합을 포함하는 -C1-C20으로부터 선택됨).
3-(6-하이드록시-2-메틸-3,4,7,8,9,10-헥사하이드로-7,10-메타노-2H-벤조[h]크로멘-2-일)-프로피온산 메틸 에스테르; 3-(6-하이드록시-2-메틸-3,4,7,8,9,10-헥사하이드로-7,10-메타노-2H-벤조[h]크로만-2-일)-프로피온산; 2,2,-다이메틸-3,4,7,8,9,10-헥사하이드로-7,10-메타노-2H-벤조[h]크로멘-6-올; 3-(6-하이드록시-2-메틸-3,4,7,8,9,10-헥사하이드로-7,10-프로파노-2H-벤조[h]크로멘-2-일)-프로피온산 메틸 에스테르; 2-메틸-2-[3-(티아졸-2-일설파닐)-프로필]-3,4,7,8,9,10-헥사하이드로-7,10-메타노-2H-벤조[h]크로멘-6-올; [3-(6-하이드록시-2-메틸-3,4,7,8,9,10-헥사하이드로-7,10-메타노-2H-벤조[h]크로멘-2-일)-프로필]-포스폰산 다이메틸 에스테르; [3-(6-하이드록시-2-메틸-3,4,7,8,9,10-헥사하이드로-7,10-메타노-2H-벤조[h]크로멘-2-일)-프로필]-포스폰산; 3-(6-하이드록시-2-메틸-3,4,7,8,9,10-헥사하이드로-7,10-메타노-2H-벤조[h]크로멘-2-일)-프로피온산 메틸 에스테르; 4-(6-하이드록시-2-메틸-3,4,7,8,9,10-헥사하이드로-7,10-메타노-2H-벤조[h]크로멘-2-일)-부탄-1-설폰산 다이메틸아미드; 2-(3-하이드록시-프로필)-2-메틸-3,4,7,8,9,10-헥사하이드로-7,10-메타노-2H-벤조[h]크로멘-6-올; 2-(3-클로로-프로필)-2-메틸-3,4,7,8,9,10-헥사하이드로-7,10-메타노-2H-벤조[h]크로멘-6-올; 2,2-다이메틸-3,4,7,8,9,10-헥사하이드로-7,10-메타노-2H-벤조[h]크로멘-6-올; -(2-클로로-에틸)-2-메틸-3,4,7,8,9,10-헥사하이드로-7,10-메타노-2H-벤조[h]크로멘-6-올; 2-메틸-2-티아졸-2-일-3,4,7,8,9,10-헥사하이드로-7,10-메타노-2H-벤조[h]크로멘-6-올; 2,2-다이메틸-3,4,7,8,9,10-헥사하이드로-7,10-에타노-2H-벤조[h]크로멘-6-올; 3-(6-하이드록시-2-메틸-3,4,7,8,9,10-헥사하이드로-7,10-에타노-2H-벤조[h]크로멘-2-일)-프로피온산; 2-(3-클로로-프로필)-2-메틸-3,4,7,8,9,10-헥사하이드로-7,10-에타노-2H-벤조[h]크로멘-6-올; 4-(6-하이드록시-2,2-다이메틸-3,4,7,8,9,10-헥사하이드로-7,10-메타노-2H-벤조[h]크로멘-5-일메틸렌)-2-메틸-5-프로필-2,4-다이하이드로-피라졸-3-온과 같은 화합물.
2,2,7,8-테트라메틸-5-페닐-크로만-6-올; 4-(6-하이드록시-2,2,7,8-테트라메틸-크로만-5-일)-벤조산 메틸 에스테르; 4-(6-하이드록시-2,2,7,8-테트라메틸-크로만-5-일)-벤조산; 2,2,7,8-테트라메틸-5-피리딘-4-일-크로만-6-올; 2,2,7,8-테트라메틸-5-피리딘-3-일-크로만-6-올; 5-(4-메탄설포닐-페닐)-2,2,7,8-테트라메틸-크로만-6-올; 5-(4-다이메틸아미노-페닐)-2,2,7,8-테트라메틸-크로만-6-올; 5-(4-클로로-페닐)-2,2,7,8-테트라메틸-크로만-6-올; 4-(6-하이드록시-2,2,7,8-테트라메틸-크로만-5-일)-벤젠설폰아미드; 5-(4-메톡시-페닐)-2,2,7,8-테트라메틸-크로만-6-올; (6-하이드록시-2,2,7,8-테트라메틸-크로만-5-일메틸)-1-하이드록시우레아; 2,2,7,8-테트라메틸-5-(3-니트로-페닐)-크로만-6-올; 2,2,7,8-테트라메틸-5-(4-트리플루오로메틸-페닐)-크로만-6-올; 5-(4-tert-부틸-페닐)-2,2,7,8-테트라메틸-크로만-6-올; 2,2,7,8-테트라메틸-5-(3,4,5-트리메톡시-페닐)-크로만-6-올; 4-(6-하이드록시-2,2,7,8-테트라메틸-크로만-5-일)-벤조니트릴; 5-(2,5-다이메톡시-3,4-다이메틸-페닐)-2,2,7,8-테트라메틸-크로만-6-올; 5-(6-하이드록시-2,2,7,8-테트라메틸-크로만-5-일)-벤젠-1,2,3-트리올; 5-(6-하이드록시-2,2,7,8-테트라메틸-크로만-5-일)-2,3-다이메틸-벤젠-1,4-다이올; 5-(2-클로로-페닐)-2,2,7,8-테트라메틸-크로만-6-올; 5-푸란-2-일-2,2,7,8-테트라메틸-크로만-6-올; 5-알릴설파닐메틸-2,2,8-트리메틸-7-(3-메틸-부틸)-크로만-6-올; 5-사이클로펜틸설파닐메틸-2,2,7,8-테트라메틸-크로만-6-올; 5-헥실설파닐메틸-2,2,7,8-테트라메틸-크로만-6-올; 5-알릴설파닐메틸-2,2,7,8-테트라메틸-크로만-6-올; 5-(4,6-다이메틸-피리미딘-2-일설파닐메틸)-2,2,7,8-테트라메틸-크로만-6-올; 1-[3-(6-하이드록시-2,2,7,8-테트라메틸-크로만-5-일-메틸설파닐)-2-메틸-프로피오닐]-피롤리딘-2-카르복실산; 4-(6-하이드록시-2,2,7,8-테트라메틸-크로만-5-일메틸렌)-5-메틸-2-페닐-2,4-다이하이드로-피라졸-3-온; 4-(6-하이드록시-2,2,7,8-테트라메틸-크로만-5-일-메틸렌)-3-페닐-4H-아이속사졸-5-온; 4-[4-(6-하이드록시-2,2,7,8-테트라메틸-크로만-5-일-메틸렌)-3-메틸-5-옥소-4,5-다이하이드로-피라졸-1-일]-벤조산; 4-(6-하이드록시-2,2,7,8-테트라메틸-크로만-5-일-메틸렌)-2-메틸-5-프로필-2,4-다이하이드로-피라졸-3-온; 5-하이드록시-3-(6-하이드록시-2,2,7,8-테트라메틸-크로만-5-일-메틸렌)-3H-벤조푸란-2-온; 2,5,7,8-테트라메틸-2-티오펜-2-일-크로만-6-올; 2-(2,5-다이메틸-티오펜-3-일)-2,5,7,8-테트라메틸-크로만-6-올; 2-(2,5-다이메틸-티오펜-3-일)-2,7,8-트리메틸-크로만-6-올; 8-클로로-2-(2,5-다이메틸-티오펜-3-일)-2,5,7-트리메틸-크로만-6-올; 5-클로로-2,7,8-트리메틸-2-티오펜-2-일-크로만-6-올; 5-[3-(6-메톡시메톡시-2,7,8-트리메틸-크로만-2-일)-프로필리덴]-티아졸리딘-2,4-다이온; 5-[3-(6-하이드록시-2,7,8-트리메틸-크로만-2-일)-프로필리덴]-티아졸리딘-2,4-다이온; 3-[6-하이드록시-2,7,8-트리메틸-2-(4,8,12-트리메틸-트리데실)-크로만-5-일-메틸설파닐]-2-메틸-프로피온산; 2,7,8-트리메틸-5-(5-메틸-1H-벤조이미다졸-2-일-설파닐메틸)-2-(4,8,12-트리메틸-트리데실)-크로만-6-올; 2-[6-하이드록시-2,7,8-트리메틸-2-(4,8,12-트리메틸-트리데실)-크로만-5-일메틸설파닐-에탄설폰산; 5-(4,6-다이메틸-피리미딘-2-일설파닐메틸)-2,7,8-트리메틸-2-(4,8,12-트리메틸-트리데실)-크로만-6-올; 4-[2-(4,8-다이메틸-트리데실)-6-하이드록시-2,7,8-트리메틸-크로만-5-일메틸설파닐]-벤조산; 1-{3-[6-하이드록시-2,7,8-트리메틸-2-(4,8,12-트리메틸-트리데실)-크로만-5-일메틸설파닐]-2-메틸-프로피오닐}-피롤리딘-2-카르복실산; 2-(2,2-다이클로로-비닐)-2,5,7,8-테트라메틸-크로만-6-올; 2-(2,2-다이브로모-비닐)-2,5,7,8-테트라메틸-크로만-6-올; 5-(5-클로로-3-메틸-펜트-2-에닐)-2,2,7,8-테트라메틸-크로만-6-올; 5-클로로-2-(2,5-다이메틸-티오펜-3-일)-2,7,8-트리메틸-크로만-6-올; 2-(3-클로로-프로필)-5,7-다이메틸-2-티오펜-2-일-크로만-6-올; 5-클로로-2-(2,5-다이메틸-티아졸-4-일)-2,7,8-트리메틸-크로만-6-올; 5-클로로-2-(2,5-다이메틸-티아졸-4-일)-2,7,8-트리메틸-2H-크로멘-6-올; 및 5-클로로-2-(2,5-다이메틸-티아졸-4-일)-2,7,8-트리메틸-크로만-6-올과 같은 화합물.
다이메볼린 (2,8-다이메틸-5-(2-(6-메틸피리딘-3-일)에틸)-2,3,4,5-테트라하이드로-1H-피리도[4,3-b]인돌), 8-클로로-2-메틸-5-(2-(6-메틸피리딘-3-일)에틸)-2,3,4,5-테트라하이드로-1H-피리도[4,3-b]인돌, 메브하이드롤린 (5-벤질-2-메틸-2,3,4,5-테트라하이드로-1H-피리도[4,3-b]인돌), 2,8-다이메틸-1,3,4,4a,5,9b-헥사하이드로-1H-피리도[4,3-b]인돌, 8-플루오로-2-(3-(피리딘-3-일)프로필)-2,3,4,5-테트라하이드로-1H-피리도[4,3-b]인돌, 및 8-메틸-1,3,4,4a,5,9b-테트라하이드로-1H-피리도[4,3-b]인돌과 같은 화합물.
2-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-3,5-다이메틸-6-(4-(트리플루오로메틸)페닐)사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-6-(4-메톡시페닐)-3,5-다이메틸사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 4-(5-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-2,4-다이메틸-3,6-다이옥소사이클로헥사-1,4-다이에닐)벤조니트릴; 2-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-3,5-다이메틸-6-(나프탈렌-2-일)사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(3,4-다이플루오로페닐)-6-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-3,5-다이메틸사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(4-플루오로페닐)-6-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-3,5-다이메틸사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(4-클로로페닐)-6-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-3,5-다이메틸사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(2,3-다이하이드로벤조푸란-2-일)-6-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-3,5-다이메틸사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸-3-페네틸사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸-3-페닐사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-벤질-3-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸-3-(3-페닐프로필)사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(1-하이드록시-2-페닐에틸)-3-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-3-(4-메톡시페닐)-5,6-다이메틸-사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸-3-(4-(트리플루오로메틸)-페닐)사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸-3-(나프탈렌-2-일)사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(벤조푸란-2-일)-3-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(4-클로로페닐)-3-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(4-에틸페닐)-3-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸-3-(3-(트리플루오로메틸)페닐)-사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(4-tert-부틸페닐)-3-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸-사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(4-플루오로페닐)-3-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(3-플루오로페닐)-3-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 4-(2-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-4,5-다이메틸-3,6-다이옥소사이클로헥사-1,4-다이에닐)벤조니트릴; 2-(3,4-다이플루오로페닐)-3-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸-사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(2-플루오로페닐)-3-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-3-(3-메톡시페닐)-5,6-다이메틸-사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(4-플루오로-2-메톡시페닐)-3-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(벤조[d][1,3]다이옥솔-5-일)-3-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(2,4-다이플루오로페닐)-3-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-3-(4-메톡시페닐)-5,6-다이메틸사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-3-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(4-클로로페닐)-6-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-3,5-다이메틸사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸-3-(2-(티아졸-2-일)에틸)사이클로헥사-2,5-다이엔-1.4-다이온; 2-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸-3-(2-(티아졸-5-일)에틸)사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸-3-(2-(피리딘-2-일)에틸)사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸-3-(2-(피리다진-4-일)에틸)사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸-3-(2-(티오펜-2-일)에틸)사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸-3-(2-(티오펜-3-일)에틸)사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(2-(푸란-2-일)에틸)-3-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(2-(푸란-3-일)에틸)-3-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(2-(1H-피라졸-5-일)에틸)-3-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(2-(1H-피라졸-4-일)에틸)-3-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(2-(1H-피라졸-1-일)에틸)-3-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(2-(1H-이미다졸-5-일)에틸)-3-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(2-(1H-이미다졸-2-일)에틸)-3-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸-3-(2-(옥사졸-5-일)에틸)사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸-3-(2-(옥사졸-2-일)에틸)사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸-3-(2-(옥사졸-4-일)에틸)사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 및 2-(2-(1H-인돌-3-일)에틸)-3-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온과 같은 화합물.
하기와 같은 화합물:
Figure 112019085571088-pat00020
(상기 식에서, m은 -C1-C20 알킬, -C1-C20 알케닐, -C1-C20 알키닐, 또는 하나 이상의 이중 결합 및 하나 이상의 삼중 결합을 포함하는 -C1-C20이며, 반대이온은 약제학적으로 허용가능한 음이온임).
3-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이옥소-1,4-사이클로헥사다이엔-1-일)프로필 트리페닐포스포늄 염; 4-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이옥소-1,4-사이클로헥사다이엔-1-일)부틸 트리페닐포스포늄 염; 5-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이옥소-1,4-사이클로헥사다이엔-1-일)펜틸 트리페닐포스포늄 염; 6-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이옥소-1,4-사이클로헥사다이엔-1-일)헥실 트리페닐포스포늄 염; 7-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이옥소-1,4-사이클로헥사다이엔-1-일)헵틸 트리페닐포스포늄 염; 8-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이옥소-1,4-사이클로헥사다이엔-1-일)옥틸 트리페닐포스포늄 염; 9-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이옥소-1,4-사이클로헥사다이엔-1-일)노닐 트리페닐포스포늄 염; 10-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이옥소-1,4-사이클로헥사다이엔-1-일)데실 트리페닐포스포늄 염; 11-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이옥소-1,4-사이클로헥사다이엔-1-일)운데실 트리페닐포스포늄 염; 12-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이옥소-1,4-사이클로헥사다이엔-1-일)도데실 트리페닐포스포늄 염; 13-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이옥소-1,4-사이클로헥사다이엔-1-일)프로필데실 트리페닐포스포늄 염; 14-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이옥소-1,4-사이클로헥사다이엔-1-일)부틸데실 트리페닐포스포늄 염; 15-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이옥소-1,4-사이클로헥사다이엔-1-일)펜타데실 트리페닐포스포늄 염; 16-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이옥소-1,4-사이클로헥사다이엔-1-일)헥사데실 트리페닐포스포늄 염; 17-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이옥소-1,4-사이클로헥사다이엔-1-일)헵타데실 트리페닐포스포늄 염; 18-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이옥소-1,4-사이클로헥사다이엔-1-일)옥타데실 트리페닐포스포늄 염; 19-(4, 5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이옥소-1,4-사이클로헥사다이엔-1-일)노나데실 트리페닐포스포늄 염; 20-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이옥소-1,4-사이클로헥사다이엔- 1 -일)이코실 트리페닐포스포늄 염; 3-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이하이드록시페닐)프로필 트리페닐포스포늄 염; 4-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이하이드록시페닐)부틸 트리페닐포스포늄 염; 5-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이하이드록시페닐)펜틸 트리페닐포스포늄 염; 6-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이하이드록시페닐)헥실 트리페닐포스포늄 염; 7-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이하이드록시페닐)헵틸 트리페닐포스포늄 염; 8-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이하이드록시페닐)옥틸 트리페닐포스포늄 염; 9-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이하이드록시페닐)노닐 트리페닐포스포늄 염; 10-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이하이드록시페닐)데실 트리페닐포스포늄 염; 11-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이하이드록시페닐)운데실 트리페닐포스포늄 염; 12-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이하이드록시페닐)도데실 트리페닐포스포늄 염; 13-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이하이드록시벤질)프로필데실 트리페닐포스포늄 염; 14-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이하이드록시페닐)부틸데실 트리페닐포스포늄 염; 15-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이하이드록시페닐)펜타데실 트리페닐포스포늄 염; 16-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이하이드록시페닐)헥사데실 트리페닐포스포늄 염; 17-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이하이드록시페닐)헵타데실 트리페닐포스포늄 염; 18-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이하이드록시페닐)옥타데실 트리페닐포스포늄 염; 19-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이하이드록시페닐)노나데실 트리페닐포스포늄 염; 20-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이하이드록시페닐)이코실 트리페닐포스포늄 염과 같은 화합물; 여기서, 상기 염의 반대이온은 브로마이드, 메탄설포네이트, 에탄설포네이트, 프로판설포네이트, 벤젠설포네이트, p-톨루엔설포네이트, 또는 2-나프틸렌 설포네이트와 같은 약제학적으로 허용가능한 음이온이다.
부가적으로는, 항산화제의 공동-투여는 유익한 항산화제의 수준을 증가시키는 것으로 알려진 식품을 소비하는 형태를 취할 수 있는 것으로 사료된다. 이러한 식품은 정규 식품, 및 항산화제를 포함하는 "슈퍼푸드"를 둘 다 포함한다. 이들 식품으로는, 과일, 채소, 및 딸기, 블랙커런트, 블랙베리, 오렌지, 블루베리, 석류, 차, 커피, 올리브유, 초콜렛, 시나몬, 허브, 레드와인, 곡물 시리얼, 달걀, 육류, 레귐(legume), 너트, 시금치, 순무, 대황(rhubarb), 코카오 빈(cocao bean), 옥수수, 콩, 양배추 등과 같은 다른 식재료를 포함한다.
전달 및 부가적인 제형:
트리글리세라이드는 식물유 및 동물 지방의 주 구성분으로 잘 알려져 있다. 또한, 트리글리세라이드는 글리세롤과 3개의 지방산으로부터 유도되는 에스테르 화합물인 것으로 잘 알려져 있다. 트리글리세라이드는 에스테르 결합을 가수분해하는 리파제와 같은 효소에 의해 대사되어, 지방산과 글리세롤을 방출한다. 실제로, 이러한 대사는 지방산을 방출하며, 이 지방산은 지방산 수송체 단백질을 통해 세포에 의해 흡수될 수 있다. 여러 가지 질환의 치료에 유용한 PUFA 및 PUFA 모방체는 환자에게 투여하기 위해 트리글리세라이드, 다이글리세라이드, 및/또는 모노글리세라이드와 같은 지방으로 혼입될 수 있는 것으로 사료된다.
PUFA, PUFA 모방체, PUFA 프로드럭, 및 PUFA 및/또는 PUFA 모방체를 함유하는 트리글리세라이드의 전달은 변형된 식이요법을 통해 이루어질 수 있다. 다른 예로, PUFA, PUFA 모방체, PUFA 프로드럭, 및 PUFA 및/또는 PUFA 모방체를 함유하는 트리글리세라이드는 이 자체로, 또는 알부민과의 복합체를 포함하나 이로 한정되지 않는 '담체'와의 복합체로서, 식품 또는 식품 보조제로서 투여될 수 있다.
약물 전달 및 의약제 전달에 전형적으로 사용되는 방법과 같이, 보강된 PUFA 또는 이들의 전구체를 전달하는 방법을 또한 적용할 수 있다. 이들 방법은, 경구 전달, 국소 전달, 비내 전달과 같은 경점막 전달, 사상판(cribriform plate)을 통한 비내 전달, 정맥내 전달, 피하 전달, 흡입, 또는 점안액을 통한 전달을 포함하나, 이로 한정되지 않는다.
리포좀 전달 방법을 포함하나 이로 한정되지 않는, 표적화된 전달 방법 및 서방성 방출 방법을 또한, 적용할 수 있다.
본원에서 기술한 동위원소로 변형된 화합물은 시간 경과에 따라 투여할 수 있으며, 이때, 대상의 세포 및 조직은 화합물이 투여되는 기간 동안에 동위원소로 변형된 화합물의 수준을 증가시키는 것을 포함할 것으로 사료된다.
활성 성분을 포함하는 조성물은 정제, 트로키, 론제지, 수성 또는 유성 현탁액, 수-중-유 에멀젼, 분산성 분말 또는 과립, 에멀젼, 경질 또는 연질 캡슐, 또는 시럽 또는 엘릭셔와 같이 경구용으로 적합한 형태로 존재할 수 있다. 이러한 조성물은 벌킹제, 가용화제, 맛가림제, 안정화제, 착색제, 방부제, 및 약학 제형의 기술분야의 당업자에게 알려진 다른 제제들과 같은 부형제를 포함할 수 있다. 또한, 경구 형태는 본원에서 기술한 화합물을 포함하는 식품 또는 식품 보조제를 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 보조제는 맞춤-제조될 수 있어서, 오메가-3 또는 오메가-6 지방산과 같은 일 유형의 PUFA가 식품에 첨가되거나, 또는 식품이나 대상의 식이요법이 포함하는 주 지방에 따라 보조제로서 사용될 수 있다. 아울러, 조성물은 치료될 질환에 따라 맞춤형으로 제조될 수 있다. 예를 들어, LDL 관련 증상은, 리놀레산으로 제조되는 카디오리핀이 산화되기 때문에, 더 많은 양의 D-리놀레산을 필요로 할 수 있다. 다른 실시 양태에서, 망막 질환 및 신경학적/CNS 증상은, D-오메가-3 지방산이 이들 질환을 치료하는 데 보다 적절하기 때문에, D-리놀렌산과 같은 오메가-3 지방산을 더 많이 필요로 할 수 있다. 일부 측면에서, 질환이 HNE와 관련 있는 경우 D-오메가-6 지방산을 처방해야 하며, 반면, HHE와 관련 있는 경우에는 D-오메가-3 지방산을 처방해야 한다.
조성물은 또한, 스프레이, 크림, 연고, 로션으로서, 또는 패치, 붕대 또는 상처 드레싱에 대한 구성분 또는 첨가제로서, 국소 적용에 의한 전달에 적합할 수 있다. 이외에도, 화합물은 기계적인 수단에 의해 질환 부위에 전달하거나, 또는 정상적인 조직에는 거의 없거나 또는 존재하지 않으며 병에 걸린 조직의 양상에 대해 친화성을 가진 리포좀 (병에 걸린 조직에 대한 친화성을 제공하는 화학적 변형을 수반 또는 수반하지 않음), 항체, 앱타머(aptamer), 렉틴, 또는 알부민과 같은 화학적 리간드와 같이 전신 표적형 기술을 이용해 질환 부위로 표적화할 수 있다. 일부 측면에서, 화장품의 국소 적용은 패치와 같이 피부를 통해 전달하기 위한, 본원에서 기술한 동위원소로 변형된 화합물 또는 모방체인 담체의 용도를 포함할 수 있다. 안 장애(eye disorder)는 점안액으로 치료할 수 있다.
약학 조성물은 또한, 주사로 투여하기에 적합한 형태일 수 있다. 이러한 조성물은 용액, 현탁액 또는 에멀젼 형태로 존재할 수 있다. 이러한 조성물은 안정화제, 항균제, 또는 의약제의 기능을 개선하는 다른 물질들을 포함할 수 있다. 본 발명의 일부 측면들은 또한, 주사에 의한 투여 또는 경구나 국소 용도에 적합한 용액, 현탁액 또는 에멀젼으로 용이하게 형성 또는 재구성될 수 있는, 건조된 또는 말린(desiccated) 형태의 화합물을 포함한다. 주사에 의한 전달은 전신 전달, 및 눈과 관련된 장애를 치료하기 위해 눈에 주사하는 것과 같은 국소 전달에 적합할 수 있다.
투여량
일부 실시 양태에서, 화합물은 약 0.01 mg/kg 내지 약 1000 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 100 mg/kg, 및/또는 약 1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg으로 투여된다. 다른 실시 양태에서, 화합물은 약 0.01, 0.1, 1.0, 5.0, 10, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 및/또는 1000 mg/kg으로 투여된다.
실시예
실험: MALDI-TOF 질량 스펙트럼을 PE-ABI Voyager Elite 딜레이드(delayed) 추출 장비에서 기록하였다. 양이온 모드에서 25 KV의 가속 전압과 100 ms의 딜레이(dealy)에서 스펙트럼을 수득하였다. 다르게 명시되지 않는 한, 1H NMR 스펙트럼을 Varian Gemini 200 MHz 분광광도계에서 기록하였다. HPLC를 Waters 시스템에서 수행하였다. 화학물질은 Sigma-Aldrich Chemical Company (USA), Avocado research chemicals (UK), Lancaster Synthesis Ltd (UK), 및 Acros Organics (Fisher Scientific, UK)에서 입수하였다. 실리카 겔, TLC 플레이트 및 용매는 BDH/Merck 사 제품이었다. IR 스펙트럼은 Vertex 70 분광광도계로 기록하였다. 1H 및 13C NMR 스펙트럼은 CHCl3 (내부 표준으로서 1H의 경우, δ = 0.00에서 TMS 또는 δ = 7.26에서 CHCl3, 및 13C의 경우, δ = 77.0에서 CHCl3)에서 각각 400 MHz 및 100 MHz에서 Bruker AC 400 장비로 수득하였다.
당해 기술분야의 당업자는, 부가적인 산화-내성 화합물을 제조하기 위해, 후술하는 합성방법들을 용이하게 변형할 수 있음을 알 것이다. 예를 들어, 당업자는, 안정화된 화합물의 일 유형의 에스테르를 절단하여, 상응하는 카르복실산을 수득할 수 있음을 알 것이다. 마찬가지로, 카르복실산을 에스테르와 같은 부가적인 유도체로 쉽게 전환할 수 있다. 부가적으로는, 당업자는, 동위원소로 표지된 출발 물질의 아이덴터티에 변화를 줌으로써, 후술하는 화합물의 동위원소 변이체를 제조할 수 있음을 알 것이다. 후술하는 합성방법들에서, 후술하는 화합물의 동위원소 변이체를 제조할 수 있다. 후술하는 합성방법들에서, 파라포름알데하이드-d2를 동위원소로 표지된 출발 물질로 사용한다. 당업자는, 전술한 화합물의 파라포름알데하이드-d1, 포름알데하이드-d1, 파라포름알데하이드-d2, 포름알데하이드-d2, 및 탄소-13 표지된 변이체를 이용해 동일한 합성적 변환을 할 수 있음을 쉽게 알 것이다. 포름알데하이드-d1은 잘-특징화된 화합물로서, 일반적으로 알려지고 이해되는 합성 변환을 이용해, 포름산-d1, 포름산-d2, 및/또는 다이클로로메탄-d1과 같은 공지된 공급원으로부터 쉽게 이용가능하다. 더욱이, 본원에서 기술하는 화합물의 방사능 유사체는 트리튬-함유 출발 물질을 이용해 제조할 수 있다. 이들 화합물은 동물의 세포 및 조직에의 혼입을 측정하는 데 유용할 것이다.
실시예 1. 11,11-D2-리놀레산의 합성
Figure 112019085571088-pat00021
1,1-다이듀테로-옥트-2-아인-1-올 (2) 건조 THF (800 ㎖) 중 브로모에탄 (100 ㎖), 1,2-다이브로모에탄 (1 ㎖) 및 마그네슘 조각 (31.2 g)으로부터 제조한 에틸마그네슘 브로마이드의 용액에, 햅타인-1 ((1); 170 ㎖)을 아르곤 하에 30분 내지 60분 동안 적가하였다. 반응 혼합물을 1시간 동안 교반한 다음, 듀테로파라포름 (30 g)을 한번에 조심스럽게 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 2시간 동안 부드럽게 환류하고, -10℃로 냉각시킨 다음, 물 5-7 ㎖을 서서히 첨가하였다. 상기 혼합물을 쇄빙 0.5 kg 슬러리 및 진한 황산 40 ㎖에 붓고, 헥산 0.5 L로 세정하였다. 유기상을 분리하고, 잔여의 수성상을 5: 1 헥산: 에틸 아세테이트 (3 x 300 ㎖)로 추출하였다. 조합된 유기 분획을 sat. NaCl (1 x 50 ㎖), sat. NaHC03 (1 x 50 ㎖)로 세정하고, 및 Na2S04로 건조하였다. 용매를 진공 내에서 증발시켜, 무색 오일 119.3 g (99%)을 수득하였으며, 이를 추가의 정제 없이 사용하였다. HRMS, C8H12D2O에 대해 계산한 m/z: 128.1168; 측정값: 128.1173. 1H NMR (CDCl3, δ): 2.18 (t, J = 7.0, 2H), 1.57 (s, 1H), 1.47 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 1.31 (m, 4H), 0.87 (t, J = 7.0 Hz, 3H).
1,1-다이듀테로-1-브로모-옥트-2-아인 (3) 건조 다이에틸 에테르 (300 ㎖) 중 (2) (3.48 g; 27.2 mmol) 및 피리딘 (19 ㎖)의 용액에, 다이에틸 에테르 35 ㎖ 중 PBr3 36 ㎖을 아르곤 하에 -15℃에서 30분 동안 교반하면서 적가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 서서히 가온한 다음, 교반하면서 3시간, 교반하지 않으면서 1시간 환류하였다. 그런 다음, 상기 반응 혼합물을 -10℃로 냉각시키고, 냉수 500 ㎖을 첨가하였다. 잔여물이 용해되었을 때, 포화 NaCl (250 ㎖) 및 헥산 (250 ㎖)을 첨가하고, 유기층을 분리하였다. 수성 분획을 헥산 (2 x 100 ㎖)으로 세정하고, 조합된 유기 분획을 NaCl (2 x 100 ㎖)로 세정하고, 미량의 하이드로퀴논 및 트리에틸아민의 존재 하에 Na2SO4로 건조하였다. 용매를 증류로 대기압에서 제거하고, 이어서 회전 증발하였다. 잔여물을 진공 증류 (3 mm Hg)로 분획화하여, 담황색 오일 147.4 g (듀테로-파라포름 당 82% 카운팅)을 수득하였다. B.p. 75℃. HRMS, C8H11D2Br에 대해 계산한 m/z: 190.0324; 측정값: 189.0301, 191.0321. 1H NMR (CDCl3, δ): 2.23 (t, J = 7.0 Hz, 2H, CH2), 1.50 (m, 2H, CH2), 1.33 (m, 4H, CH2), 0.89 (t, J = 6.9 Hz, 3H, CH3),
11,11-다이듀테로-옥타데카-9,12-다이아이노산 메틸 에스테르 (5) CuI (133 g)를 (CaH2로 새로 증류한) DMF 400 ㎖에 빠르게 첨가하고, 이어서 건조 NaI (106 g), K2CO3 (143 g)를 첨가하였다. 그런 다음, 데스-9-아이노산 메틸 에스테르 ((4); 65 g)를 한번에 첨가하고, 이어서 브로마이드 (3) (67 g)를 첨가하였다. 부가적인 DMF 250 ㎖을 사용해 플라스크 벽의 시약을 반응 혼합물 벌크로 헹궈낸 다음, 이를 12시간 동안 교반하였다. 그런 다음, 포화 수성 NH4Cl 500 ㎖을 교반하면서 첨가하고, 수 분 이내에 포화 수성 NaCl과, 헥산:EtOAc의 5:1 혼합물 (300 ㎖)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 15분 동안 더 교반한 다음, 미세 메쉬 스코트 글래스 필터(fine mesh Schott glass filter)를 통해 여과하였다. 잔여물을 헥산:EtOAc 혼합물로 수 회 세정하였다. 유기 분획을 분리하고, 수성상을 부가적으로 추출하였다 (3 x 200 ㎖). 조합된 유기 분획을 건조하고 (Na2SO4), 미량의 하이드로퀴논 및 다이페닐아민을 첨가하고, 용매를 진공 내에서 증발시켰다. 잔여물을 즉시 1 mm Hg에서 증류하여, 165-175℃ 비등 분획 79 g (77%)을 수득하였다. HRMS, C19H28D2O2에 대해 계산한 m/z: 292.2369; 측정값: 292.2365. 1H NMR (CDCl3, δ): 3.67(s,3H, OCH3),2.3 (t,J = 7.5 Hz, 2H, CH2),2.14 (t, J = 7.0 Hz, 4H, CH2), 1.63 (m, 2H, CH2), 1.47 (m, 4H, CH2), 1.3 (m, 10H, CH2), 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 3H, CH3).
11,11-다이듀테로-cis,cis-옥타데카-9,12-다이엔산 메틸 에스테르 (6) 96% EtOH (400 ㎖) 중 니켈 아세테이트 테트라하이드레이트 (31.5 g)의 현탁액을, 염이 용해될 때까지 약 50-60℃로 교반하면서 가열하였다. 플라스크를 수소로 플러싱한 다음, (EtOH (170 ㎖) 중 NaBH4 현탁액 (7.2 g)을 15분 동안 교반한 다음 여과하여 제조한) NaBH4 용액 130 ㎖을 20-30분 동안 교반하면서 적가하였다. 15-20분 내에, 에틸렌다이아민 (39 ㎖)을 한번에 첨가하고, 이어서 5분 내에 EtOH (200 ㎖) 중 (5) (75 g)를 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 수소 (1 atm) 하에 매우 격렬히 교반하였다. 수소의 흡수는 약 2시간 내에 중단되었다. 상기 반응 혼합물에, 헥산 900 ㎖ 및 빙냉 AcOH 55 ㎖을 첨가하고, 물 (15 ㎖)을 첨가하였다. 헥산 (400 ㎖)을 첨가하고, 상기 혼합물이 분리되게 방치하였다. 수성 분획을 헥산:EtOAc 5:1 혼합물로 추출하였다. 추출의 완료는 TLC로 모니터링하였다. 조합된 유기상을 H2SO4 희석액으로 세정하고, 포화 NaHCO3 및 포화 NaCl로 세정한 다음, Na2SO4로 건조하였다. 용매를 감압 하에 제거하였다. 실리카 겔 (실리카 겔 60, Merck; 162 g)을 무수 MeCN (360 ㎖) 중 질산은 (43 g) 용액에 첨가하고, 용매를 회전증발로 제거하였다. 수득한 함침된 실리카 겔을 50℃ (흡입 펌프)에서 3시간 동안 건조한 다음, 오일 펌프에서 8시간 동안 건조하였다. 이 실리카는 산물 g 당 30 g으로 사용하였다. 상기 반응 혼합물을 소량의 헥산으로 용해시키고, 은-개질된 실리카 겔에 적용하고, 1-3% 구배의 EtOAc로 예비-세정하였다. 비극성 오염원을 세정하는 경우 (TLC에 의한 대조군), 산물을 10% EtOAc로 용출하고, 용매를 진공 증발시켜, 표제 에스테르 (6) 52 g을 무색 액체로서 수득하였다. HRMS, C19H32D2O2에 대해 계산한 m/z: 296.2682; 측정값: 296.2676. IR (CCl4):
Figure 112019085571088-pat00022
1740 cm-1. 1H NMR (CDCl3, δ): 5.32 (m, 4H), 3.66 (s, 3H, OCH3), 2.29 (t, J = 7.5 Hz, 2H, CH2), 2.02 (m, 4H, CH2), 1.60 (m, 2H, CH2), 1.30 (m, 14H, CH2), 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 3H, CH3).
11,11-다이듀테로-cis,cis-옥타데카-9,12-다이엔산 (7) 수 (115 ㎖) 중 KOH (46 g)의 용액을 MeOH (60 ㎖) 중 에스테르 (6) (46 g)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 40-50℃에서 2시간 동안 교반한 다음 (TLC에 의한 대조군), 물 200 ㎖로 희석하였다. 용매의 2/3를 제거하였다 (회전증발). 희석된 황산을 잔여물에 pH 2가 되도록 첨가하고, 이어서 소량의 펜탄과 함께 다이에틸 에테르를 첨가하였다. 유기층을 분리하고, 수성층을 소량의 펜탄과 함께 다이에틸 에테르로 세정하였다. 조합된 유기 분획을 포화 수성 NaCl로 세정한 다음, Na2SO4로 건조하였다. 용매를 증발시켜, (7) (99%) 43 g을 수득하였다. IR (CCl4):
Figure 112019085571088-pat00023
　1741, 1711 cm-1.
실시예 2. 11,11,14,14-D4-리놀렌산의 합성
Figure 112019085571088-pat00024
1,1-다이듀테로-펜트-2-아인-1-올 (9) 부트-1-아인 (8)을, 조(bath) (-5℃)에서 건조 THF (800 ㎖) 중 브로모에탄 (100 ㎖) 및 마그네슘 조각 (31.3 g)으로부터 제조한 에틸마그네슘 브로마이드의 용액을 통해 서서히 버블링하였다. 때때로, 상기 버블링을 중단하고, 부트-1-아인이 든 실린더를 칭량하여, 소비 속도를 측정하였다. 알카인의 공급은 상당량의 침전물이 형성된 직후, 중단하였다 (소비된 알카인의 측정된 질량이 125 g임). 반응 혼합물을 실온으로 30분 동안 가온한 다음, 15분 동안 교반하였다. 그런 다음, 상기 혼합물을 30℃ 이하로 가열하고, 이 온도에서 침전물이 용해되었고, 이후 다시 실온에서 30분 동안 교반하였다. 듀테로파라포름 (28 g)을 한번에 첨가하고, 상기 혼합물을 3시간 동안 환류하여, 투명한 용액을 형성하였다. 이를 실온으로 냉각시키고, 쇄빙 (800 g) 및 50 ㎖ 농축 H2SO4의 혼합물에 부었다. 헥산 (400 ㎖)을 첨가하고, 유기층을 분리하였다. 수성상을 NaCl로 포화시키고, 헥산:EtOAc 4:1 혼합물 (1 L)로 추출하였다. 추출 과정의 완료는 TLC로 모니터링하였다. 조합된 유기상을 포화 NaCl, NaHCO3로 세정하고 다시 NaCl로 세정하고, Na2SO4로 건조하였다. 용매를 대기압에서 (최대 수증기 온도 105℃) 증류로 제거하였다. 잔여물을 (70.5 g; 94%)을 추가의 정제 없이 사용하였다. HRMS, C5H6D2O에 대해 계산한 m/z: 86.0699; 측정값: 86.0751. 1H NMR (CDCl3, δ): 2.21 (q, J = 7.5 Hz, 2H, CH2), 1.93 (br s, 1H, OH), 1.12 (t, J = 7.5 Hz, 3H, CH3). 13C NMR (CDCl3, δ): 87.7, 77.6, 13.7, 12.3 (CD2의 신호는 부재).
1,1-다이듀테로-1-브로모-펜트-2-아인 (10) 건조 다이에틸 에테르 (280 ㎖) 중 (9) (70.5 g) 및 피리딘 (16.5 ㎖)의 용액에, 50 ㎖ 다이에틸 에테르 중 PBr3 32.3 ㎖을 아르곤 하에 -10℃에서 30분 동안 교반하면서 적가하였다. 반응 혼합물을 1시간 동안 실온으로 서서히 가온하였다. 소량의 하이드로퀴논을 첨가한 다음, 상기 혼합물을 4.5시간 동안 환류하였다. 그런 다음, 상기 반응 혼합물을 -10℃로 냉각시키고, 냉수 350 ㎖을 첨가하였다. 잔여물이 용해되었을 때, 포화 NaCl (350 ㎖) 및 헥산 (300 ㎖)을 첨가하고, 유기층을 분리하였다. 수성 분획을 다이에틸 에테르 (2 x 150 ㎖)로 세정하고, 조합된 유기 분획을 NaCl (2 x 50 ㎖)로 세정하고, 미량의 하이드로퀴논 및 트리에틸아민의 존재 하에 Na2SO4로 건조하였다. 용매를 대기압에서 제거한 다음, 147-155℃ 비등 분획을 증류시켰다. 다른 예로, 100℃에 도달하였을 때, 대기압에서 증류를 중단하고, 산물을 77-84℃ (25 mm Hg)에서 증류시켰다. 수율: 투명한 액체 107 g. HRMS, C5H5D2Br에 대해 계산한 m/z: 147.9855; 측정값: 146.9814, 148.9835. IR (CCl4):
Figure 112019085571088-pat00025
　2251 cm-1. 1H NMR (CDCl3, δ): 2.23 (q, J = 7.5 Hz, 2H, CH2), 1.11 (t, J = 7.5 Hz, 3H, CH3). 13C NMR (CDCl3, δ): 89.3, 74.5, 13.4, 12.6 (CD2의 신호는 부재).
1,1,4,4-테트라듀테로-옥타-2,5-다이아인-1-올 (12) 건조 THF 400 ㎖ 중 에틸 브로마이드 (53 ㎖) 및 마그네슘 조각 (15.8 g)으로부터 제조한 에틸마그네슘 브로마이드를, 이 혼합물을 통한 아세틸렌 버블링 (약 25 L/h 속도로)과 동시에 격렬히 교반하면서 건조 THF 350 ㎖에 조금씩 첨가하였다. 그리나드 시약(Grignard reagent) 용액을 2-5분 당 약 10 ㎖로 상기 혼합물에 공급하였다. 에틸마그네슘 브로마이드를 모두 첨가하였을 때 (약 2.5시간 후), 다시 15분 동안 상기 시스템을 통해 아세틸렌을 버블링하였다. 듀테로파라포름 (17.3 g) 및 CuCl (0.2 g)을 아르곤 하에 첨가하고, 반응 혼합물을 듀테로파라포름이 용해될 때까지 교반 없이 2.5시간 동안 환류하여, (11)의 용액을 수득하였다. 건조 THF 250 ㎖ 중 14.8 g 마그네슘 및 50 ㎖ 에틸 브로마이드로부터 제조한 에틸마그네슘 브로마이드 용액을 상기 반응 혼합물에 20분 동안 적가하였다. 가스 방출(gas emanation)이 중단되었을 때, 축합기를 부착하고, 용매 250 ㎖을 증류시켰다. 그런 다음, 상기 반응 혼합물을 30℃로 냉각시키고, CuCl (1.4 g)을 첨가한 후, 브로마이드 (10) (69 g)를 15분 동안 적가하였다. 그런 다음, 상기 반응 혼합물을 5시간 동안 환류하고, 약간 냉각시키고 (너무 빨리 냉각시키면 침전물이 형성될 것임), 쇄빙 슬러리 (1-1.2 kg) 및 진한 H2SO4 40 ㎖에 부었다. 상기 혼합물을 헥산 (600 ㎖)으로 세정하였다. 유기 분획을 분리하고, 수성 분획을 부가적으로 5:1 헥산:EtOAc (2 x 400 ㎖)로 추출하였다. 조합된 유기 분획을 포화 NaCl으로 세정한 후, 포화 NaHCO3 및 NaCl로 세정하였다. 용매의 벌크를 미량의 하이드로퀴논 및 트리에틸아민의 존재 하에 대기압에서 제거하였다. 잔여물을 실리카 겔 (용출액: 7:1 헥산:EtOAc) 100 ㎖을 통해 플러싱(flushing)하였다. 용매의 벌크를 대기압에서 제거한 다음, 잔여물을 회전증발하였다. 수득한 표제 화합물 49.5 g (85%)을 추가의 정제 없이 사용하였다. HRMS, C8H6D4O에 대해 계산한 m/z: 126.0979; 측정값: 126.0899. IR(CCl4):
Figure 112019085571088-pat00026
3622 cm-1. 1H NMR(CDCl3,δ):2.16(q,J=7.5Hz,2H, CH2), 1.85 (br s, 1 H, OH), 1.11 (t, J = 7.5 Hz, 3H, CH3). 13C NMR (CDCl3, δ): 82.3, 80.4, 78.3, 72.6, 13.7, 12.2
1,1,4,4-테트라듀테로-1-브로모-옥타-2,5-다이아인 (13)을 브로마이드 (3)에 대해 기술한 바와 같이 합성하였으며; 피리딘 2 ㎖, PBr3 14 ㎖ 및 다이에틸 에테르250 ㎖을 알코올 (12) 54.2 g에 사용하였다. 산물을 4 mm Hg에서 증류로 정제하였다. 수율: (13) 53 g (65%); b.p. 100-110℃. HRMS, C8H5D4Br에 대해 계산한 m/z: 188.0135; 측정값: 187.0136, 189.0143. IR (CCl4):
Figure 112019085571088-pat00027
2255 cm-1. 1H NMR (CDCl3, δ): 2.13 (q, J = 7.5 Hz, 2H, CH2); 1.07 (t, J = 7.5 Hz, 3H, CH3). 13C NMR (CDCl3, δ): 82.5, 81.8, 75.0, 72.0, 13.6, 12.2.
11,11,14,14-테트라듀테로-옥타데카-8,12,15-트리아이노익산 메틸 에스테르 (15)를 11,11-다이듀테로-옥타데카-9,12-다이아이노산 메틸 에스테르 (5)에 대해 기술한 것과 유사한 방식으로 합성하였다. CuI (97 g)를 (CaH2로 새로 증류한) DMF 400 ㎖에 빠르게 첨가한 후, 건조 NaI (77.5 g), K2CO3 (104.5 g)를 첨가하였다. 그런 다음, 데스-9-아이노산 메틸 에스테르 ((14); 47.5 g)를 한번에 첨가하고, 브로마이드 (13) (48.5 g)를 첨가하였다. 부가적인 DMF 250 ㎖을 사용해 플라스크 벽의 시약을 반응 혼합물 벌크로 헹궈낸 다음, 이를 12시간 동안 교반하였다. 그런 다음, 포화 수성 NH4Cl 500 ㎖을 교반하면서 첨가하고, 수 분 이내에 포화 수성 NaCl (300 ㎖)과, 헥산:EtOAc의 5:1 혼합물 (300 ㎖)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 15분 동안 더 교반한 다음, 미세 메쉬 스코트 글래스 필터를 통해 여과하였다. 잔여물을 헥산:EtOAc 혼합물로 수 회 세정하였다. 유기 분획을 분리하고, 수성상을 부가적으로 추출하였다 (3 x 200 ㎖). 조합된 유기 분획을 건조하고 (Na2SO4), 미량의 하이드로퀴논 및 다이페닐아민을 첨가하고, 용매를 진공 내에서 증발시켰다. 잔여물을 즉시 1 mm Hg에서 증류하여, 173-180℃ 비등 분획 45.8 g (62%)을 수득하였다. 부가적인 결정화는 하기와 같이 수행하였다. 에스테르 (15)를 헥산 (500 ㎖)에 용해시키고, -50℃로 냉각시켰다. 형성된 결정을 냉각 헥산으로 세정하였다. 이 단계의 수율은 80%이다. HRMS, C19H22D4O2에 대해 계산한 m/z: 290.2180; 측정값: 290.2200. 1H NMR (CDCl3, δ): 3.66 (s, 3H, ℃H3), 2.29 (t, J = 7.5 Hz, 2H, CH2), 2.15 (m, 4H, CH2), 1.61 (m, 2H, CH2), 1.47 (m, 2H, CH2), 1.30 (m, 6H, CH2), 1.11 (t, J = 7.5 Hz, 3H, CH3). 13C NMR (CDCl3, δ): 174.1, 82.0, 80.6, 74.7, 74.6, 73.7, 73.0, 51.3, 33.9, 28.9, 28.6, 28.52, 28.49, 24.8, 18.5, 13.7, 12.2.
11,11,14,14-테트라듀테로-cis,cis,cis-옥타데카-8,12,15-트리엔산 메틸 에스테르 (16)을 11,11-다이듀테로-cis,cis-옥타데카-9,12-다이엔산 메틸 에스테르 ('6')에 대해 기술한 것과 유사한 방식으로 합성하였다 . 96% EtOH (400 ㎖) 중 니켈 아세테이트 테트라하이드레이트 (42 g)의 현탁액을, 염이 용해될 때까지 약 50-60℃로 교반하면서 가열하였다. 플라스크를 수소로 플러싱한 다음, (EtOH (170 ㎖) 중 NaBH4 현탁액 (7.2 g)을 15분 동안 교반한 다음 여과하여 제조한) NaBH4 용액 130 ㎖을 20-30분 동안 교반하면서 적가하였다. 15-20분 내에, 에틸렌다이아민 (52 ㎖)을 한번에 첨가하고, 이어서 5분 내에 EtOH (200 ㎖) 중 (15) (73 g)를 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 수소 (1 atm) 하에 매우 격렬히 교반하였다. 수소의 흡수는 약 2시간 내에 중단되었다. 상기 반응 혼합물에, 헥산 900 ㎖ 및 빙냉 AcOH 55 ㎖을 첨가하고, 물 (15 ㎖)을 첨가하였다. 헥산 (400 ㎖)을 첨가하고, 상기 혼합물이 분리되게 방치하였다. 수성 분획을 헥산:EtOAc 5:1 혼합물로 추출하였다. 추출의 완료는 TLC로 모니터링하였다. 조합된 유기상을 H2SO4 희석액으로 세정하고, 포화 NaHCO3 및 포화 NaCl로 세정한 다음, Na2SO4로 건조하였다. 용매를 감압 하에 제거하였다. 정제용 실리카 겔은 (6)에서 기술한 바와 같이 제조하였다. 이 실리카는 산물 g 당 30 g으로 사용하였다. 상기 반응 혼합물을 소량의 헥산으로 용해시키고, 은-개질된 실리카 겔에 적용하고, 1-5% 구배의 EtOAc로 예비-세정하였다. 비극성 오염원을 세정하는 경우 (TLC에 의한 대조군), 산물을 10% EtOAc로 용출하고, 용매를 진공 증발시켜, 표제 에스테르 (16) 42 g을 무색 액체로서 수득하였다. HRMS, m/z C19H28D4O2에 대해 계산한 m/z: 296.2649; 측정값: 296.2652. IR (CCl4):
Figure 112019085571088-pat00028
1740 cm-1. 1H NMR (CDCl3, δ): 5.4 (m, 6H, CH-이중 결합), 3.68 (s, 3H, OCH3), 2.33 (t, J = 7.5 Hz, 2H, CH2), 2.09 (m, 4H, CH2), 1.62 (m, 2H, CH2), 1.33 (m, 8H, CH2), 0.97 (t, J = 7.5 Hz, 3H, CH3). 13C NMR (CDCl3, δ): 174.1, 131.9, 130.2, 128.2, 128.1, 127.7, 126.9, 51.3, 34.0, 29.5, 29.04, 29.02, 27.1, 25.5, 24.9, 20.5, 14.2.
11,11,14,14-테트라듀테로-cis,cis,cis-옥타데카-8,12,15-트리엔산 (17) 수 (2.6 ㎖) 중 KOH (1.5 g, 27 mmol)의 용액을 MeOH (15 ㎖) 중 에스테르 (16) (1.00 g, 3.4 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 40-50℃에서 2시간 동안 교반한 다음 (TLC에 의한 대조군), 물 200 ㎖로 희석하였다. 용매의 2/3를 제거하였다 (회전증발). 희석된 황산을 잔여물에 pH 2가 되도록 첨가하고, 이어서 소량의 펜탄 (50 ㎖)과 함께 다이에틸 에테르를 첨가하였다. 유기층을 분리하고, 수성층을 소량의 펜탄 (3 x 30 ㎖)과 함께 다이에틸 에테르로 세정하였다. 조합된 유기 분획을 포화 수성 NaCl로 세정한 다음, Na2SO4로 건조하였다. 용매를 증발시켜, (17) (100%) 0.95 g을 수득하였다. IR (CCl4):
Figure 112019085571088-pat00029
1741, 1711 cm-1.
실시예 3. 14,14-D2-리놀렌산의 합성
Figure 112019085571088-pat00030
4,4-다이듀테로-옥타-2,5-다이아인-1-올 (19) 얼음조에서 건조 THF 40 ㎖ 중 에틸 브로마이드 (9.2 ㎖, 123.4 mmol) 및 마그네슘 조각 (2.74 g, 112.8 mmol)에서 제조한 에틸마그네슘 브로마이드의 용액에, THF (5 ㎖) 중 프로파길 알코올 (3.16 g, 56.4 mmol)을 10분 내지 15분 동안 교반하면서 적가하였다. 반응 혼합물이 실온으로 가온되도록 방치한 후, 40℃로 때때로 가온하면서 다시 2시간 동안 교반하였다. 이렇게 생성된 2가 음이온에, CuCl 0.13 g을 첨가하고, THF (20 ㎖) 중 브로마이드 (10) (6.9 g)를 서서히 (15분 동안) 첨가하였다. 그런 다음, 상기 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하고, 5시간 동안 환류하였다. 그런 다음, 상기 반응 혼합물을 5시간 동안 환류하고, 약간 냉각시키고 (너무 빨리 냉각되면 침전물이 형성될 것임), 쇄빙 슬러리 및 진한 H2SO4 2.5 ㎖에 부었다. 상기 혼합물을 헥산 (600 ㎖)으로 세정하였다. 유기 분획을 분리하고, 수성 분획을 부가적으로 5:1 헥산:EtOAc로 추출하였다. 조합된 유기 분획을 포화 NaCl으로 세정한 후, 포화 NaHCO3 및 NaCl로 세정하고, Na2SO4로 건조하였다. 용매의 벌크를 미량의 하이드로퀴논 및 트리에틸아민의 존재 하에 대기압에서 제거하였다. 잔여물을 CC (헥산:EtOAc = 15:1)로 정제하여, 산물 19를 3.45 g (59%) 수득하였다. HRMS, C8H8D2O에 대해 계산한 m/z: 124.0855; 측정값: 124.0849. IR (CCl4):
Figure 112019085571088-pat00031
3622 cm-1. 1H NMR (CDCl3, δ): 4.21 (m, 2H, CH2), 2.4 (m, 1H, OH), 2.16 (q, J = 7.5 Hz, 2H, CH2), 1.11 (t, J = 7.5 Hz, 3H, CH3). 13C NMR (CDCl3, δ): 82.3, 80.4, 78.3, 72.6, 51.0, 13.7, 12.2.
4,4-다이듀테로-1-브로모-옥타-2,5-다이아인 (20)은, 모든 용매를 회전증발로 제거하는 점을 제외하고는, (3)에 기술한 바대로 합성하였다. (19) 3.4 g (27 mmol)으로부터, 브로마이드 (20) 3.9 g (75%)을 수득하고, 이를 추가의 정제 없이 사용하였다 HRMS, C8H7D2Br에 대해 계산한 m/z: 186.0011; 측정값: 185.0019, 187.0012. IR (CCl4):
Figure 112019085571088-pat00032
2255 cm-1. 1H NMR (CDCl3, δ): 3.88 (br s, 2H, CH2), 2.13 (q, J = 7.5 Hz, 2H, CH2), 1.07 (t, J = 7.5 Hz, 3H, CH3). 13C NMR (CDCl3, δ): 82.5, 81.8, 75.0, 72.0, 14.8, 13.6, 12.2.
14,14-다이듀테로-옥타데카-8,12,15-트리아이노익산 메틸 에스테르 (21)를 (5)에 기술한 바대로 합성하였다. 9.7 g CuI, 7.8 g NaI, 10.5 g K2CO3, 4.85 g의 브로마이드 (20), 4.75 g의 메틸 에스테르 (14) 및 무수 DMF 40 ㎖로부터 수득한 산물을 CC (25:1 헥산:EtOAc)로 정제하여, 표제 화합물 4.5 g (60%)을 수득하였다. HRMS, C19H24D2O2에 대해 계산한 m/z: 288.2056; 측정값: 288.2046. 1H NMR (CDCl3, δ): 3.66 (s, 3H, OCH3), 3.12 (m, 2H, CH2), 2.29 (t, J = 7.5 Hz, 2H, CH2), 2.15 (m, 4H, CH2), 1.61 (m, 2H, CH2), 1.47 (m, 2H, CH2), 1.30 (m, 6H, CH2), 1.11 (t, J = 7.5 Hz, 3H, CH3). 13C NMR (CDCl3, δ): 174.1, 82.0, 80.6, 74.7, 74.6, 73.7, 73.0, 51.3, 33.9, 28.9, 28.6, 28.52, 28.49, 24.8, 18.5, 13.7, 12.2, 9.7.
14,14-다이듀테로-cis,cis,cis-옥타데카-8,12,15-트리엔산 메틸 에스테르 (22)를 리놀레산 유도체 (6)에 기술한 바대로 합성하였다. (21) 4.5 g의 환원을 위해, 니켈 아세테이트 테트라하이드레이트 2.6 g 및 에틸렌다이아민 3.2 ㎖을 사용하였다. 산물을 (6)에 기술한 바대로 AgNO3-함침된 실리카 겔에서 정제하였다. HRMS, C19H30D2O2에 대해 계산한 m/z: 294.2526; 측정값: 294.2529. IR (CCl4):
Figure 112019085571088-pat00033
1740 cm-1. 1H NMR (CDCl3, δ): 5.37 (m, 6H, CH-이중 결합), 3.68 (s, 3H, OCH3), 2.82 (m, 2H, CH2), 2.33 (t, J = 7.5 Hz, 2H, CH2), 2.09 (m, 4H, CH2), 1.62 (m, 2H, CH2), 1.33 (m, 8H, CH2), 0.97 (t, J = 7.5 Hz, 3H, CH3). 13C NMR (CDCl3, δ): 174.1, 131.9, 130.2, 128.2, 128.1, 127.7, 126.9, 51.3, 34.0, 29.5, 29.1, 29.04, 29.02, 27.1, 25.5, 24.9, 20.5, 14.2.
14,14-다이듀테로-cis,cis,cis-옥타데카-8,12,15-트리엔산 (23) MeOH (15 ㎖) 중 (22) (1 g, 3.4 mmol)의 용액에, 수 (2.6 ㎖) 중 KOH (1.5 g, 27 mmol)의 용액을 한번에 첨가하였다. 그런 다음, 상기 반응 혼합물을 (7)에 기술한 바대로 처리하여, 표제 산 0.94 g (99%)을 수득하였다. IR (CCl4):
Figure 112019085571088-pat00034
1741, 1711 cm-1.
실시예 4. 11,11-D2-리놀렌산의 합성
Figure 112019085571088-pat00035
펜트-2-아인-1-올 (24) 부타인-1 ((8); 10.4 g)을 THF (100 ㎖) 중 브로모에탄 (11.2 ㎖) 및 마그네슘 조각 (3.6 g)으로부터 제조한 빙냉 용액을 통해 버블링하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온되게 방치한 다음, 15분 동안 교반하였다. 그런 다음, 상기 혼합물을 30℃로 가열하고, 이 온도에서 침전물은 모두 용해되었다. 가열을 제거하고, 혼합물을 다시 30분 동안 교반한 후, 파라포름 (3 g)을 한번에 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 3시간 동안 (파라포름이 모두 용해될 때까지) 환류한 다음, 실온으로 냉각시키고, 쇄빙 (80 g) 및 농축 H2SO4 8 ㎖의 혼합물에 붓고, 다이에틸 에테르로 추출하였다. 유기상을 포화 NaHCO3 및 NaCl으로 세정하고, Na2SO4로 건조하였다. 용매를 회전증발로 제거하고, 잔여물을 (7.56 g; 90%)을 추가의 정제 없이 사용하였다. HRMS, C5H8O에 대해 계산한 m/z: 84.0575; 측정값: 84.0583.
1-브로모-펜트-2-아인 (25) 건조 다이에틸 에테르 (34 ㎖) 중 (24) (11.7 g) 및 피리딘 (2.66 ㎖)의 용액에, 다이에틸 에테르 5 ㎖ 중 PBr3 5.2 ㎖을 아르곤 하에 -10℃에서 30분 동안 교반하면서 적가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 1시간 동안 서서히 가온하였다. 하이드로퀴논 촉매량을 첨가한 다음, 상기 혼합물을 4.5시간 동안 환류하였다. 그런 다음, 상기 반응 혼합물을 -10℃로 냉각시키고, 냉수 35 ㎖을 첨가하였다. 잔여물이 용해되었을 때, 포화 NaCl (35 ㎖) 및 다이에틸 에테르 (30 ㎖)를 첨가하고, 유기층을 분리하였다. 수성 분획을 다이에틸 에테르 (2 x 15 ㎖)로 세정하고, 조합된 유기 분획을 NaCl (2 x 400 ㎖) 로 세정하고, MgSO4로 건조하였다. 용매를 대기압과, 이어서 감압 (25 mm Hg) 하에 제거하고, 60-90℃ 분획을 회수하였다. 수율: 11.1 g (84%). HRMS, C5H7Br에 대해 계산한 m/z: 145.9731; 측정값: 144.9750, 146.9757.
1,1-다이듀테로-옥타-2,5-다이아인-1-올 (26)을 (12)에 기술한 바대로 합성하였으며, 수율은 87%였다. HRMS, C8H8D2O에 대해 계산한 m/z: 124.0855;측정값:124.0868. IR (CCl4):
Figure 112019085571088-pat00036
3622 cm-1. 1H NMR (CDCl3, δ): 2.65 (m, 2H, CH2), 2.4 (m, 1H, OH), 2.1 (q, 2H, CH2), 1.09 (t, 3H, CH3).
1,1-다이듀테로-1-브로모-옥타-2,5-다이아인 (27)을 모든 용매를 회전증발로 제거하는 점을 제외하고는, (3)에 기술한 바대로 합성하였다. 산물을 감압에서 증류로 정제하였다. 수율: 86% (4 mm Hg에서 b.p. 100-105℃). HRMS, C8H7D2Br에 대해 계산한 m/z: 186.0011; 측정값: 184.9948, 187.9999. IR (CCl4):
Figure 112019085571088-pat00037
2255 cm-1. 1H NMR (CDCl3, δ): 2.66 (m, 2H, CH2), 2.1 (q, 2H, CH2), 1.09 (t, 3H, CH3).
11,11-다이듀테로-옥타데카-8,12,15-트리아이노익산 메틸 에스테르 (28)를 (5)에 기술한 바대로 합성하였다. CuI 7.1 g, NaI 5.66 g, K2CO3 7.65 g, 브로마이드 (27) 3.55 g, 메틸 에스테르 (14) 3.47 g 및 무수 DMF 30 ㎖로부터 수득한 산물을 CC (25:1 헥산:EtOAc)로 정제하여, 표제 화합물 3.7 g을 수득하였다. HRMS, C19H24D2O2에 대해 계산한 m/z: 288.2056; 측정값: 288.2069. 1H NMR (CDCl3, δ): 3.7 (s, 3H, OCH3), 3.15 (br. s, 2H, CH2), 2.35 (m, 2H, CH2), 2.17 (m, 4H, CH2), 1.61 (m, 2H, CH2), 1.48 (m, 2H, CH2), 1.35 (m, 6H, CH2), 1.11 (t, 3H, CH3).
11,11-다이듀테로-cis,cis,cis-옥타데카-8,12,15-트리엔산 메틸 에스테르 (29)를 리놀레산 유도체 (6)에 기술한 바대로 합성하였다. (28) 3.7 g의 환원을 위해, 니켈 아세테이트 테트라하이드레이트 2.16 g 및 에틸렌다이아민 2.62 ㎖을 사용하였다. 산물을 (6)에 기술한 바대로 AgNO3-함침된 실리카 겔에서 정제하여, 1.5 g을 수득하였다. HRMS, C19H30D2O2에 대해 계산한 m/z: 294.2526; 측정값: 294.2402. IR (CCl4):
Figure 112019085571088-pat00038
1740 cm-1. 1H NMR (CDCl3, δ): 5.37 (m, 6H, CH-이중 결합), 3.6 (s, 3H, OCH3), 2.82 (m, 2H, CH2), 2.33 (t, = 7.5 Hz, 2H, CH2), 2.09 (m 4H, CH2), 1.62 (m, 2H, CH2), 1.33 (m, 8H, CH2), 0.97 (t, J = 7.5 Hz, 3H, CH3). 13C NMR (CDCl3, δ): 174.1, 131.9, 130.2, 128.2, 128.1, 127.7, 126.9, 51.3, 34.0, 29.5, 29.1, 29.04, 29.02, 27.1, 25.5, 24.9, 20.5, 14.2.
11,11-다이듀테로-cis,cis,cis-옥타데카-8,12,15-트리엔산 (30) MeOH (7.5 ㎖) 중 (29) (1.5 g, 5.1 mmol)의 용액에, 수 (3 ㎖) 중 KOH (1.5 g, 27 mmol)의 용액을 한번에 첨가하였다. 그런 다음, 상기 반응 혼합물을 (17)에 기술한 바대로 처리하여, 표제 산 0.9 g을 수득하였다. IR (CCl4):
Figure 112019085571088-pat00039
1741, 1711 cm-1. 1H NMR (CDCl3, δ): 11.2 (br s, 1 H, COOH), 5.37 (m, 6H, CH-이중 결합), 2.83 (m, 2H, CH2), 2.35 (t, J = 7.5 Hz, 2H, CH2), 2.06 (m 4H, CH2), 1.63 (m, 2H, CH2), 1.32 (m, 8H, CH2), 0.97 (t, J = 7.5 Hz, 3H, CH3). 13C NMR (CDCl3, δ): 180.4, 131.9, 130.2, 128.3, 128.1, 127.6, 127.1, 34.1, 29.5, 29.1, 29.03, 28.98, 27.2, 25.5, 24.6, 20.5, 14.2.
실시예 5. 8,8-D 2 -리놀레산 메틸 에스테르의 합성
Figure 112019085571088-pat00040
8-하이드록시옥탄산 (502). DMF (200 ㎖) 중 8-브로모카프릴산 (501, 37.5 g, 168 mmol), 무수 소듐 아세테이트 (60.0 g, 732 mmol) 및 소듐 요오다이드 (1.0 g, 6.7 mmol)의 용액을 110-120℃에서 8시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 수 (150 ㎖) 중 수산화칼륨 (28 g, 0.5 mol)의 용액을 첨가하고, 상기 혼합물을 100℃에서 1시간 더 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 얼음 슬러리 및 진한 황산 (45 ㎖)에 부었다. 수득한 용액을 NaCl로 포화시키고, EtOAc 및 페트로레움 에테르 (1:1) (9 x 150 ㎖)의 혼합물로 추출하였다. 조합된 유기 분획을 포화 NaCl로 2회 세정하고, Na2SO4로 건조하였다. 용매를 증발시켜, 산물 26.5 g (98%)을 수득하고, 이를 추가의 정제 없이 사용하였다. 소량의 산물을 실리카 상 CC (용출액: 페트로레움 에테르:EtOAc = 2:1)로 정제하고, 특징화하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.27-1.39 (m, 6H), 1.50-1.68 (m, 4H), 2.32 (t, 2H, J= 7.5 Hz), 3.62 (t, 2H, J= 6.5 Hz), 6.87 (br. s., 2H).
메틸 8-(테트라하이드로-2 H -피란-2-일옥시)옥타노에이트 (503). 8-하이드록시옥탄산 (502; 26.3 g, 164 mmol)을 아세틸 클로라이드 (3.5 ㎖)를 포함하는 메탄올 (500 ㎖)에 용해시켰다. 반응 혼합물을 5시간 동안 환류하고, 용매를 진공 내에서 제거하였다. CH2Cl2 (200 ㎖)에서 용해시킨 잔여물에, 3,4-다이하이드로-2H-피란 (29 ㎖, 318 mmol)을 첨가하고, 상기 반응 혼합물을 20분 동안 환류하였다. 트리에틸아민 5 ㎖의 첨가 시, 용매를 진공 내에서 제거하고, 잔여물을 페트로레움 에테르 (100 ㎖)에 용해시키고, 물로 세정하였다. 유기층을 작은 실리카 컬럼 (실리카, 100 ㎖; 용출액: 페트로레움 에테르 → 페트로레움 에테르:EtOAc = 20:1)에서 플러시-정제하였다. 후속작업을 하여, 산물 38.2 g (90%)을 수득하고, 이를 추가의 정제 없이 사용하였다. 소량의 산물을 실리카 (용출액: 페트로레움 에테르: EtOAc = 15:1)에서 CC로 추가로 정제하고, 특징화하였다. IR (CCl4):
Figure 112019085571088-pat00041
1741 cm-1. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.20-1.36 (m, 6H), 1.40-1.82 (m, 10H), 2.23 (t, 2H, J= 7.5 Hz), 3.30 (dt, 1 H, J = 9.5 Hz, 6.5 Hz), 3.39-3.46 (m, 1H), 3.59 (s, 3H), 3.65 (dt, 1 H, J = 9.5 Hz, 7.0 Hz), 3.76-3.83 (m, 1H), 4.47-4.52 (m, 1H).
[1,1-D 2 ]-8-(테트라하이드로-2 H -피란-2-일옥시)옥탄-1-올 (504). 얼음 조에서 다이에틸 에테르 (100 ㎖) 중 에스테르 (503) (37.5 g, 145 mmol)의 교반된 용액에, 다이에틸 에테르 (300 ㎖) 중 LiAlD4 (4.0 g, 95 mmol)의 현탁액을 1시간 동안 적가하였다. 냉각 반응 혼합물에, 물 (4 ㎖), 15% NaOH (4 ㎖) 및 물 (12 ㎖)을 교반하면서 첨가하였다. 침전물을 여과하고, 에틸 에테르로 세정하였다. 진공 내에서 증발시켜, 산물 33.5 g (99%)을 수득하였다. 소량의 산물을 실리카 (용출액: 페트로레움 에테르: EtOAc = 10:1)에서 CC로 추가로 정제하여, 특징화하였다. IR (CCl4):
Figure 112019085571088-pat00042
3638, 3499 cm-1. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.22-1.33 (m, 8H), 1.42-1.56 (m, 8H), 1.61-1.69 (m, 1H), 1.71-1.80 (m, 1H), 2.38 (br. s., 1H), 3.31 (dt, 1 H, J = 9.5 Hz, 6.5 Hz), 3.40-3.46 (m, 1H), 3.66 (dt, 1 H, J = 9.5 Hz, 7.0 Hz), 3.76-3.84 (m, 1H), 4.49-4.53 (m, 1H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 19.5, 25.3, 25.5, 26.0, 29.2, 29.3, 29.5, 30.6, 32.4, 62.1, 67.5, 98.7.
[1,1-D 2 ]-8-(테트라하이드로-2 H -피란-2-일옥시)옥틸 메탄설포네이트 (505). 0℃에서 다이에틸 에테르 (300 ㎖) 중 알코올 (504) (33.4 g, 144 mmol) 및 트리에틸아민 (45 ㎖, 323 mmol)의 용액에, 다이에틸 에테르 (100 ㎖) 중 MsCl (14.2 ㎖, 183 mmol)의 용액을 1시간 동안 교반하면서 적가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하고, 물로 처리하였다. Et2O로 세정(2 x 50 ㎖)한 수성상과 조합된 유기상을 포화 NaCl로 2회 세정하고, Na2SO4로 건조하고, 경사분리하였다. 이를 작은 실리카 컬럼 (실리카, 100 ㎖; 페트로레움 에테르:EtOAc = 10:1)에서 플러시-정제하였다. 후속작업을 하여, 메탄설포네이트 (505) 43.7 g (98%)을 수득하였다. IR　(CCl4):
Figure 112019085571088-pat00043
1739 cm-1. 1H　NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.26-1.41 (m, 8H), 1.44-1.59 (m, 6H), 1.63-1.84 (m, 4H), 2.97 (s, 3H), 3.32 (dt, 1 H, J = 9.5 Hz, 6.5 Hz), 3.42-3.50 (m,1H), 3.69 (dt, 1 H, J = 9.5 Hz, 7.0 Hz) 3.78-3.86 (m, 1H), 4.52-4.56 (m, 1H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 19.6, 25.2, 25.4, 26.0, 28.7, 28.8, 29.1, 29.5, 30.7, 37.2, 62.3, 67.4, 98.8.
2-([8,8-D 2 ]-데스-9-아인-1-일옥시)테트라하이드로-2 H -피란 (506). DMSO (100 ㎖) 중 메탄설포네이트 (505) (43.5 g, 140 mmol)를 DMSO (200 ㎖) 중 에틸렌다이아민 - 리튬 아세틸렌이드 복합체 (70 g, 0.76 mol)의 현탁액에 1시간 동안 교반하면서 적가한 다음, 혼합물을 90분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 얼음에 붓고, 추출하고 (Et2O, 3 x 150 ㎖), Na2SO4로 건조하고, 증발시켰다. 이를 작은 실리카 컬럼 (실리카, 100 ㎖; 페트로레움 에테르)에서 플러시-정제하였다. 용매를 제거하여 (회전증발), 산물 25.3 g (75%)을 수득하였다. 소량의 산물을 실리카 (용출액: 페트로레움 에테르: EtOAc = 25:1)에서 CC로 추가로 정제하고, 특징화하였다. IR (CCl4):
Figure 112019085571088-pat00044
3314 cm-1. 1H　NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.21-1.38 (m, 8H), 1.42-1.57 (m, 8H), 1.62-1.70 (m, 1H), 1.73-1.83 (m, 1H), 1.89 (s, 1H), 3.32 (d.t., 1 H, J = 9.5 Hz, 6.5 Hz), 3.42-3.50 (m, 1H), 3.68 (d.t., 1 H, J = 9.5 Hz, 7.0 Hz) 3.78-3.86 (m, 1H), 4.51-4.54 (m, 1H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 19.6, 25.4, 26.1, 28.1, 28.5, 28.9, 29.2, 29.6, 30.6, 30.7, 62.1, 67.5, 68.0, 98.7.
[8,8-D 2 ]-데스-9-아인-1-올 (507). 에테르 (506) (25 g, 104 mmol)를 피리디늄 para-톨루엔설포네이트 (0.2 g)를 포함하는 메탄올 (300 ㎖)에 용해시켰다. 반응 혼합물을 3시간 동안 환류하고, Et3N (1 ㎖)으로 퀀칭하고, 용매를 진공 내에서 제거하고, 잔여물을 페트로레움 에테르에 용해시키고, 소량의 실리카 겔을 통해 여과하였다. 용매를 증발시켜, 산물 15.4 g (95%)을 수득하였다. 소량의 산물을 실리카 (용출액: 페트로레움 에테르: EtOAc = 15:1)에서 CC로 추가로 정제하고, 특징화하였다. IR (CCl4):
Figure 112019085571088-pat00045
3638, 3508, 3314 cm-1. 1H　NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.22-1.40 (m, 8H), 1.42-1.56 (m, 4H), 1.91 (s, 1H), 2.29 (br. s., 1H), 3.59 (t, J= 6.5 Hz, 2H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 25.6, 28.1, 28.5, 29.0, 29.2, 32.6, 62.8, 68.1, 84.6.
[8,8-D 2 ]-메틸 데스-9-이노에이트 (508). 30℃에서 교반 중인 수조 위의 2-구 둥근 바닥 플라스크에 든 수 (100 ㎖) 중 크로뮴 트리옥사이드 (24 g, 0.24 mol) 및 진한 황산 (21 ㎖)의 용액에, 아세톤 (150 ㎖) 중 알코올 (507) (15.5 g, 99 mmol)의 용액을 90분 동안 적가하였다. 첨가 시, 반응 혼합물을 15분 더 교반하고, 과량의 산화제를 이소프로필 알코올로 퀀칭하였다. 상기 혼합물을 냉수에 붓고, 다이에틸 에테르 (5 x 50 ㎖)로 추출하였다. 조합된 유기 분획을 포화 NaCl로 세정하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하고, 용매를 진공 내에서 제거하였다. 잔여물을 메탄올 (200 ㎖)에 용해시키고, 진한 황산 (1 ㎖)의 첨가 시, 90분 동안 환류하였다. 상기 산을 트리에틸아민 (6.5 ㎖, 47 mmol)으로 퀀칭하고, 용매를 진공 내에서 제거하고, 잔여물을 실리카 (용출액: 페트로레움 에테르: EtOAc = 50:1)에서 CC로 정제하여, 에스테르 (508) 12.6 g (알코올 (507) 당 69% 카운팅)을 수득하고, 특징화하였다. IR (CCl4):
Figure 112019085571088-pat00046
3314, 1740 cm-1. 1H　NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.19-1.38 (m, 6H), 1.41-1.48 (m, 2H), 1.51-1.61 (m, 2H), 1.88 (s, 1H), 2.25 (t, J= 7.5 Hz, 2H), 3.60 (s, 3H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 24.7, 28.0, 28.3, 28.6, 28.8, 33.9, 51.3, 68.1, 84.4, 174.0.
[8,8-D 2 ]-메틸 옥타데카-9,12-다이이노에이트 (510). DMF (20 ㎖)에 CuI (3.9 g, 20 mmol)와, 이어서 NaI (3.1 g, 21 mmol), K2CO3 (4.2 g, 30 mmol), 에스테르 (508) (1.9 g, 10.3 mmol), 및 브로마이드 (509) (2.04 g, 10.8 mmol, [2]에서 기술한 바대로 합성함)를 교반하면서 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 포화 수성 염화암모늄 (20 ㎖)을 상기 혼합물에 첨가하고, 포화 NaCl (15 ㎖)을 첨가하였다. 침전물 및 수성상을 페트로레움 에테르로 세정하였다. 조합된 유기 분획을 포화 염화나트륨으로 세정하고, Na2SO4로 건조하고, 진공 내에서 증발시켰다. 잔여물을 실리카 (용출액: 페트로레움 에테르: EtOAc = 50:1)에서 CC로 정제하여, 산물 2.47 g (82%)을 수득하였다. 1H　NMR (400 MHz, CDCl3) δ 0.86 (t, J= 7.0 Hz, 3H), 1.22-1.36 (m, 10H), 1.40-1.50 (m, 4H), 1.55-1.64 (m, 2H), 2.09-2.15 (m, 2H), 2.28 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 3.09 (t, J=2.5 Hz, 2H), 3.64 (s, 3H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 9.6, 13.9, 18.6, 22.1, 24.8, 28.3, 28.4, 28.5, 28.7, 28.9, 31.0, 34.0, 51.4, 74.4, 74.5, 80.2, 80.4, 174.2.
[8,8-D 2 ]-옥타데카-9,12-디에노에이트 (511). 96% 에탄올 (25 ㎖) 중 미분된 Ni(Ac)2 x 4H2O (0.8 g, 3.2 mmol)의 현탁액을, 염이 완전히 용해될 때까지 50-60℃로 교반하면서 가열하였다. 시스템을 수소로 플러싱한 다음, NaBH4 (3.4 ㎖; 에탄올 (12 ㎖) 중 NaBH4 현탁액 (0.53 g, 14 mmol)을 15분 동안 교반한 후, 미세 필터를 통해 여과하여 수득함)의 용액을 10분 동안 첨가하였다. 수소의 발생을 관찰하였다. 15분 내지 20분 내에, 에틸렌다이아민 (1.65 ㎖, 25 mmol)을 상기 반응 혼합물에 교반하면서 한번에 첨가하고, 에탄올 (10 ㎖) 중 (510) (2.4 g, 8.2 mmol)의 용액을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을, 수소의 흡수가 더이상 존재하지 않을 때까지, 수소 하에 격렬히 교반한 다음, 아세트산 (2.3 ㎖), 수 (10 ㎖)로 처리하고, 페트로레움 에테르:EtOAc (5:1)로 추출하였다. 조합된 유기 분획을 10% 황산 (10 ㎖)으로 세정한 다음, 포화 염화나트륨으로 세정하고, Na2SO4로 건조하고, 용매를 진공 내에서 증발시켰다. 잔여물을 실리카 (용출액: 페트로레움 에테르: EtOAc = 50:1)에서 CC로 정제하여, 2.33 g (96%)을 수득하였다. 그런 다음, 산물을 20% AgNO3 (용출액: 페트로레움 에테르 → 페트로레움 에테르: EtOAc = 2:1)가 함침된 실리카에서 CC로 다시 정제하였다. 산물 1.75 g (72%)을 수득하였다 (CG에 의해 97% 순도). 1H　NMR (400 MHz, CDCl3) δ 0.88 (t, J= 7.0 Hz, 3H), 1.20-1.40 (m, 14H), 1.55-1.66 (m, 2H), 1.97-2.09 (m, 2H), 2.29 (t, J= 7.5 Hz, 2H), 2.72-2.79 (m, 2H), 3.66 (s, 3H), 5.28-5.41 (m, 4H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 14.0, 22.5, 24.9, 25.6, 27.2, 29.00, 29.08, 29.13, 29.3, 29.4, 31.5, 34.1, 51.4, 127.9, 128.0, 129.9, 130.2, 174.2.
실시예 6. 11-D-리놀레산의 합성
Figure 112019085571088-pat00047
옥트-2-아인-1-올 (13). 0℃로 냉각시킨 에탄올 (15 ㎖) 중 옥트-2-이날 [See Corey, E.J.; Schmidt, G. Tetrahedron Lett. 1979, 20, 399; Meyer, M. P.; Klinman, J. P. Tetrahedron Lett. 2008, 49, 3600] ((612); 1.00 g, 8.1　mmol))의 용액에, NaBD4 0.11 g (2.6 mmol)을 5분 동안 나누어서 첨가하였다. 첨가 시, 상기 용액을 30분 동안 더 교반하고, 물 (100 ㎖)로 희석한 다음, Et2O (4 x 20 ㎖)로 추출하였다. 조합된 유기 분획을 포화 NaCl로 세정하고 , 건조하고 (Na2SO4), 용매를 감압 하에 제거하였다. 알코올 613 (0.85 g, 83%)을 컬럼 크로마토그래피 (실리카 겔, 페트로레움 에테르:EtOAc (15:1))로 정제하였다. 1H　NMR (400 MHz, CDCl3) δ 0.88 (t, J　=　7.0 Hz, 3H, CH3), 1.32 (m, 4H, CH2), 1.49 (quint, J　=　7.0 Hz, 2H, CH2), 1.81 (br s, 1H, OH), 2.19 (td, J　=　7.0 Hz, 2.0 Hz, 2H, CH2), 4.22 (m, 1H, CHD).
1-브로모옥트-2-아인 (614)을 기술한 바대로 합성하였다 [Hill, Sh.; Hirano, K.; Shmanai, V. V.; Marbois, B. N.; Vidovic, D.; Bekish, A. V.; Kay, B.; Tse, V.; Fine, J.; Clarke, C. F.; Shchepinov, M. S. Free Radic. Biol. Med., 2011, 50 (1), 130-138. 참조]. 1H　NMR (400 MHz, CDCl3) δ 0.89 (t, J　=　7.0 Hz, 3H, CH3), 1.32 (m, 4H, CH2), 1.50 (quint, J　=　7.0 Hz, 2H, CH2), 2.22 (td, J　=　7.0 Hz, 2.0 Hz, 2H, CH2), 3.91 (m, 1H, CHD).
[11- 2 H]-에틸 옥타데카-9,12-다이이노에이트 (615)를 기술한 바대로 합성하였다 [Meyer, M. P.; Klinman, J. P. Tetrahedron Lett. 2008, 49, 3600; Hill, Sh.; Hirano, K.; Shmanai, V. V.; Marbois, B. N.; Vidovic, D.; Bekish, A. V.; Kay, B.; Tse, V.; Fine, J.; Clarke, C. F.; Shchepinov, M. S. Free Radic. Biol. Med., 2011, 50 (1), 130-138 참조]. CuI (2 g, 10.5 mmol), NaI (1.58 g, 10.5 mmol), K2CO3 (2.1 g, 15 mmol), 에틸 데스-9-이노에이트 (1.02 g, 5.2 mmol) 및 브로마이드 614 (1.03 g, 5.4 mmol)를 DMF (10 ㎖)에 교반하면서 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반한 다음, NH4Cl (10 ㎖) 및 NaCl (8 ㎖)을 첨가하고, 5분 더 교반을 계속하였다. 침전물을 분리하고, 페트로레움 에테르로 세정하였다. 유기층을 분리하고, 수성층을 페트로레움 에테르로 추출하였다. 조합된 유기 분획을 포화 NaCl 로 세정하고, 건조하고 (Na2SO4), 용매를 감압 하에 제거하였다. 컬럼 크로마토그래피 (실리카 겔, 페트로레움 에테르:EtOAc (15:1))를 하여, 산물 1.29 g (81%)을 수득하였다. 1H　NMR (400 MHz, CDCl3) δ 0.89 (t, J= 7.0 Hz, 3H, CH3), 1.25 (t, J　=　7.0 Hz, 3H, CH 3 CH2O), 1.31 (m, 10H, CH2), 1.49 (m, 4H, CH2), 1.61 (m, 2H, CH2), 2.15 (td, J　=　7.0　Hz, 2.0　Hz, 2H, CH2 프로파길 위치에서), 2.28 (t, J = 7.5 Hz, 2H, CH 2 COOEt), 3.10 (m, 1H, CHD), 4.12 (q, J　=　7.0 Hz, 2H, OCH 2 CH3). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 9.6 (t, J　=　19.0 Hz), 13.9, 14.1, 18.56, 18.57, 22.1, 24.8, 28.4, 28.6, 28.7, 28.9, 28.9, 31.0, 34.2, 60.0, 74.3, 74.5, 80.2, 80.3, 173.7.
[11- 2 H]-리놀레산 (616) 96% 에탄올 (12 ㎖) 중 트리튜레이티드(triturated) 니켈 아세테이트 테트라하이드레이트 (0.4 g, 1.6 mmol)의 현탁액을 염이 완전히 용해될 때까지 50-60℃에서 교반하면서 가열하였다. 시스템을 수소로 플러싱한 다음, NaBH4 (에탄올 (6 ㎖) 중 NaBH4 현탁액 (0.27 g, 14 mmol)을 15분 동안 교반한 후, 미세 필터를 통해 여과하여 수득함) 1.7 ㎖을 10분 동안 첨가하며, 일부 가스 방울이 발생하였다. 15분 내지 20분 내에, 에틸렌다이아민 (0.8 ㎖, 12 mmol)을 교반하면서 한번에 첨가하고, 5분 이내에 에탄올 (5 ㎖) 중 다이아인 615 (1.2 g, 3.9 mmol)의 용액을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을, 수소의 흡수가 더이상 존재하지 않을 때까지, 격렬히 교반한 다음, 아세트산 (1.2 ㎖), 물 (10 ㎖)로 처리하고, 페트로레움 에테르 및 EtOAc의 혼합물 (5:1)로 추출하였다. 조합된 유기 분획을 10% 황산 (5 ㎖)으로 세정한 다음, 포화 NaCl로 세정하고, 건조하고 (Na2SO4), 용매를 감압하에 제거하였다. 컬럼 크로마토그래피 (실리카 겔 (페트로레움 에테르: EtOAc (50:1))를 하여, 산물 1.14 g (94%)을 수득하였다. 산물을, 용출액으로서 페트로레움 에테르:EtOAc (2:1)를 이용하여 질산은-함침된 실리카 (20% AgNO3)에서 CC로 추가로 정제하여 [3], 리놀레산 에틸 에스테르 0.73 g (60%) (GC에 의한 순도 > 96%; GC-MS: MW 309 (GC-MS, 대조군의 경우, 비-중수소화된 리놀레산 에틸 에스테르: MW 308)을 수득하였다. 1H　NMR (400 MHz, CDCl3) δ 0.89 (t, J= 7.0 Hz, 3H, CH3), 1.25 (t, J　=　7.0 Hz, 3H, CH 3 CH2O), 1.30 (m, 14H, CH2), 1.61 (m, 2H, CH2), 2.04 (m, 2H), 2.28 (t, J= 7.5 Hz, 2H, CH 2 COOEt), 2.74 (m, 1H, CHD), 4.12 (q, J　=　7.0 Hz, 2H, OCH 2 CH3), 5.34 (m, 4H, CH=CH). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 14.1, 14.2, 22.6, 25.0, 25.3 (t, J　=　19.5 Hz), 27.17, 27.19, 29.08, 29.09, 29.14, 29.3, 29.6, 31.5, 34.4, 60.1, 127.8, 128.0, 130.0, 130.2, 173.9.
유리 [11-2H]-리놀레산 (616)을 수득하기 위해, 에탄올 (10 ㎖) 중 리놀레산 에틸 에스테르 (0.704 g, 2.3 mmol)의 용액에, 수 (0.8 ㎖) 중 KOH (0.4 g, 7.1 mmol)의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 50℃에서 10분 동안 교반한 다음, 물 (20 ㎖)로 희석하고, 10% 황산 용액 (5 ㎖)으로 처리하고, Et2O (4 x 20 ㎖)로 추출하였다. 조합된 유기 분획을 포화 NaCl 로 세정하고, Na2SO4로 건조하고, 용매를 감압 하에 제거하였다. 잔여물을 소량의 실리카 겔 (2 ㎖; 용출액: 페트로레움 에테르:EtOAc (2:1))을 통해 플러싱하고, 용매를 진공 내에서 제거하여, 표시된 산 616 0.629 g (98%)을 수득하였다. 1H　NMR (400 MHz, CDCl3) δ 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 3H, CH3), 1.30 (m, 14H, CH2), 1.60 (m, 2H, CH2), 2.03 (m, 4H, CH2), 2.33 (t, J = 7.5 Hz, 2H, CH 2 COOEt), 2.74 (m, 1H, CHD), 5.32 (m, 4H, CH=CH), 11.6 (br s, 1H, COOH). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 14.1, 22.6, 24.6, 25.3　(t, J　=　19.0 Hz), 27.16, 27.18, 29.00, 29.05, 29.12, 29.3, 29.6, 31.5, 34.0, 127.8, 128.0, 130.0, 130.2, 180.1.
실시예 7. [11- 13 C]-리놀레산의 합성
Figure 112019085571088-pat00048
[1- 13 C]-옥트-2-아인-1-올 (717). 표제 화합물을 13C-파라포름을 사용해 전술한 프로토콜에 따라 합성하고 (Hill, Sh.; Hirano, K.; Shmanai, V. V.; Marbois, B. N.; Vidovic, D.; Bekish, A. V.; Kay, B.; Tse, V.; Fine, J.; Clarke, C. F.; Shchepinov, M. S. Free Radic. Biol. Med., 2011, 50 (1), 130-138), 추가의 정제 없이 사용하였다. 1H NMR (CDCl3, δ): 4.22 (Д, J = 148 Hz, 2H), 2.18 (td, J1 = 7.0, J2 = 1 Hz, 2H), 1.91 (br s, 1H), 1.47 (quint, J = 7.0 Hz, 2H), 1.31 (m, 4H), 0.87 (t, J = 7.0 Hz, 3H).
[1- 13 C]-1-브로모옥트-2-아인 (718)을 기술한 바대로 합성하였다 (Hill, Sh.; Hirano, K.; Shmanai, V. V.; Marbois, B. N.; Vidovic, D.; Bekish, A. V.; Kay, B.; Tse, V.; Fine, J.; Clarke, C. F.; Shchepinov, M. S. Free Radic. Biol. Med., 2011, 50 (1), 130-138). 수율: 13C-파라포름에서 출발하여 82% (2개 공정 당). 1H NMR (CDCl3, δ): 3.93 (dt, J1 = 158 Hz, J2 = 2Hz, 2.23 (m, 2H), 1.50 (m, 2H), 1.33 (m, 4H), 0.89 (t, J = 7 Hz, 3H).
[11- 13 C]-에틸 옥타데카-9,12-다이이노에이트 (719)를 전술한 바대로 합성하였다 (Meyer, M. P.; Klinman, J. P. Tetrahedron Lett. 2008, 49, 3600; Hill, Sh.; Hirano, K.; Shmanai, V. V.; Marbois, B. N.; Vidovic, D.; Bekish, A. V.; Kay, B.; Tse, V.; Fine, J.; Clarke, C. F.; Shchepinov, M. S. Free Radic. Biol. Med., 2011, 50 (1), 130-138 참조). 수율: 93%. 1H NMR (CDCl3, δ): 4.10 (q, J = 7 Hz, 2H), 3.1 (dm, J = 134 Hz, 2H), 2.27 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.13 (m, 4H), 1.60 (m, 2H), 1.47 (m, 4H), 1.3 (m, 10H), 1.24 (t, J = 7 Hz, 3H), 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 3H).
[11- 13 C]-리놀레산 에틸 에스테르 (720)를 전술한 바대로 합성하였다 (Meyer, M. P.; Klinman, J. P. Tetrahedron Lett. 2008, 49, 3600; Hill, Sh.; Hirano, K.; Shmanai, V. V.; Marbois, B. N.; Vidovic, D.; Bekish, A. V.; Kay, B.; Tse, V.; Fine, J.; Clarke, C. F.; Shchepinov, M. S. Free Radic. Biol. Med., 2011, 50 (1), 130-138 참조). 수율: 56%. 1H NMR (CDCl3, δ): 5.34 (m, 4H), 4.12 (q, J = 7 Hz, 2H), 2.77 (dm, J = 126 Hz, 2H), 2.28 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.04 (m, 4H), 1.61 (m, 2H), 1.30 (m, 14H), 1.25 (t, J = 7 Hz, 3H), 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 3H).
[11- 13 C]-리놀레산 (721)을 전술한 바대로 합성하였다 (Meyer, M. P.; Klinman, J. P. Tetrahedron Lett. 2008, 49, 3600; Hill, Sh.; Hirano, K.; Shmanai, V. V.; Marbois, B. N.; Vidovic, D.; Bekish, A. V.; Kay, B.; Tse, V.; Fine, J.; Clarke, C. F.; Shchepinov, M. S. Free Radic. Biol. Med., 2011, 50 (1), 130-138 참조); 수율 98%. 1H NMR (CDCl3, δ): 10.5 (br s, 1H), 5.34 (m, 4H), 2.77 (dm, J = 126 Hz), 2.33 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.03 (m, 4H), 1.60 (m, 2H), 1.30 (m, 14H), 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 3H).
실시예 8. 에스테르 A 내지 D의 일반적인 제조
Figure 112019085571088-pat00049
화합물 A에 대한 일반적인 절차. 티오닐 클로라이드 (2 당량)를 CHCl3 중 PUFA (1 당량)의 용액에 서서히 첨가한다. 반응 혼합물을 1시간 동안 가열 환류한 다음, 실온으로 냉각되게 방치하고, 용매를 감압 하에 증발시켜, PUFA의 카르복실산 클로라이드 유도체를 수득한다. 그런 다음, 상기 카르복실산 클로라이드 유도체를 무수 피리딘에 용해시키고, 피리딘에 용해된 알코올 (1 당량)을 서서히 첨가한다 (알코올이 다가알코올인 경우, 첨가 순서는 반대로 하는 것을 주지함). 첨가 완료 시, 상기 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반되게 방치한다. 그런 다음, 용매를 감압 하에 제거하고, 조 산물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여, 화합물 A를 수득한다.
11,11-다이듀테로-cis,cis,cis-옥타데카-8,12,15-트리엔산 (30); 14,14-다이듀테로-cis,cis,cis-옥타데카-8,12,15-트리엔산 (23); 11,11,14,14-테트라듀테로-cis,cis,cis-옥타데카-8,12,15-트리엔산 (17); 및 11,11-다이듀테로-cis,cis-옥타데카-9,12-다이엔산 (7)을 각각, 하기 알코올인 에탄올, 글리세롤, 프로필렌 글리콜; 포도당; 2-(2-에톡시에톡시)에탄올; 및 에스트라디올을 이용해 전술한 절차에 처리하여, 화합물 A의 일반 화학식에 따른 산물을 수득한다.
화합물 B에 대한 일반적인 절차. 티오닐 클로라이드 (2 당량)를 CHCl3 중 PUFA (1 당량)의 용액에 서서히 첨가한다. 반응 혼합물을 1시간 동안 가열 환류한 다음, 실온으로 냉각되게 방치하고, 용매를 감압 하에 증발시켜, PUFA의 카르복실산 클로라이드 유도체를 수득한다. 그런 다음, 상기 카르복실산 클로라이드 유도체를 무수 피리딘에 용해시키고, 피리딘에 용해된 알코올 (화합물 A, 1 당량)을 서서히 첨가한다. 첨가 완료 시, 상기 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반되게 방치한다. 그런 다음, 용매를 감압 하에 제거하고, 조 산물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여, 화합물 B를 수득한다.
11,11-다이듀테로-cis,cis,cis-옥타데카-8,12,15-트리엔산 (30); 14,14-다이듀테로-cis,cis,cis-옥타데카-8,12,15-트리엔산 (23); 11,11,14,14-테트라듀테로-cis,cis,cis-옥타데카-8,12,15-트리엔산 (17); 및 11,11-다이듀테로-cis,cis-옥타데카-9,12-다이엔산 (7)과 글리세롤, 프로필렌 글리콜; 포도당; 및 에스트라디올의 축합으로 형성되는 화합물 A 산물은 11,11-다이듀테로-cis,cis,cis-옥타데카-8,12,15-트리엔산 (30); 14,14-다이듀테로-cis,cis,cis-옥타데카-8,12,15-트리엔산 (23); 11,11,14,14-테트라듀테로-cis,cis,cis-옥타데카-8,12,15-트리엔산 (17); 및 11,11-다이듀테로-cis,cis-옥타데카-9,12-다이엔산 (7)을 PUFA로서 이용하여 전술한 일반 절차에 따라 처리하여, 화합물 B의 일반 화학식에 상응하는 산물을 수득한다.
화합물 C에 대한 일반적인 절차. 티오닐 클로라이드 (2 당량)를 CHCl3 중 PUFA (1 당량)의 용액에 서서히 첨가한다. 반응 혼합물을 1시간 동안 가열 환류한 다음, 실온으로 냉각되게 방치하고, 용매를 감압 하에 증발시켜, PUFA의 카르복실산 클로라이드 유도체를 수득한다. 그런 다음, 상기 카르복실산 클로라이드 유도체를 무수 피리딘에 용해시키고, 피리딘에 용해된 알코올 (화합물 B, 1 당량)을 서서히 첨가한다. 첨가 완료 시, 상기 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반되게 방치한다. 그런 다음, 용매를 감압 하에 제거하고, 조 산물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여, 화합물 C를 수득한다.
화합물 A 산물과 글리세롤 및 포도당의 축합으로 형성되는 화합물 B 산물은 11,11-다이듀테로-cis,cis,cis-옥타데카-8,12,15-트리엔산 (30); 14,14-다이듀테로-cis,cis,cis-옥타데카-8,12,15-트리엔산 (23); 11,11,14,14-테트라듀테로-cis,cis,cis-옥타데카-8,12,15-트리엔산 (17); 및 11,11-다이듀테로-cis,cis-옥타데카-9,12-다이엔산 (7)을 PUFA로서 이용하여 전술한 일반 절차에 따라 처리하여, 화합물 C의 일반 화학식에 상응하는 산물을 수득한다.
화합물 D에 대한 일반적인 절차. 티오닐 클로라이드 (2 당량)를 CHCl3 중 PUFA (1 당량)의 용액에 서서히 첨가한다. 반응 혼합물을 1시간 동안 가열 환류한 다음, 실온으로 냉각되게 방치하고, 용매를 감압 하에 증발시켜, PUFA의 카르복실산 클로라이드 유도체를 수득한다. 그런 다음, 상기 카르복실산 클로라이드 유도체 (4 당량)를 무수 피리딘에 용해시키고, 피리딘에 용해된 알코올 (1 당량)을 서서히 첨가한다. 첨가 완료 시, 상기 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반되게 방치한다. 그런 다음, 용매를 감압 하에 제거하고, 조 산물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여, 화합물 D를 수득한다.
화합물 B 산물과 포도당의 축합으로 형성되는 화합물 C 산물은 11,11-다이듀테로-cis,cis,cis-옥타데카-8,12,15-트리엔산 (30); 14,14-다이듀테로-cis,cis,cis-옥타데카-8,12,15-트리엔산 (23); 11,11,14,14-테트라듀테로-cis,cis,cis-옥타데카-8,12,15-트리엔산 및 11,11-다이듀테로-cis,cis-옥타데카-9,12-다이엔산 (7)을 PUFA로서 이용하여 전술한 일반 절차에 따라 처리하여, 화합물 D의 일반 화학식에 상응하는 산물을 수득한다.
실시예 9. 실시예 1 내지 4에서 기술한 중수소화된 PUFA의 1 H- 및 13 C-NMR 분석 (도 2).
1H 및 13C 스펙트럼의 특징적인 영역 (모든 값은 ppm으로 표시함) (패널 A). 11번째 위치에서 Lin 산의 중수소화를 1H 및 13C NMR 스펙트럼에서 피크의 소멸로 확인한다. δH 2.764에서의 피크의 소멸은 H 원자의 부재로 인한 것으로 예상된다 (1H NMR). δC 25.5에서의 피크의 소멸은 핵 오버하우저 효과(Nuclear Overhauser Effect)와, Lin acid의 중수소화된 형태에서 2개의 D 원자에 의해 퀸테트(quintet)에 이 특정한 탄소 원자가 스플링팅(splitting)된 것의 조합으로 인한 것이다 (패널 B). 1H NMR 스펙트럼은, 위치-특이적으로 중수소화된 αLnn의 C11 및 C14 위치에서 H 원자가 일치하며(coincide), 그래서 어떤 위치에서의 중수소화 (11,11-H2, 14,14-D2 또는 11,11-D2, 14,14-H2)는 이 피크의 병합을 50% 감소시키며, 한편 두 위치 모두에서의 중수소화 (11,11,14,14-D4)는 δH 2.801에서의 피크를 완전한 소멸시키는 것을 보여준다. 그러나, C11 및 C14 위치에 대해 관찰된 피크들은 작지만 검출가능할 차이로 분리되어 있기 때문에, 13C NMR 실험은 3개의 중수소화된 형태들을 명백하게 구별할 수 있다. 따라서, C11 또는 C14 위치에서의 중수소화는 각각 δC 25.68 또는 δC 25.60에서 피크의 소멸을 초래하며, 한편 두 개 위치 모두에서의 중수소화는 2개의 상응하는 피크의 소멸을 초래한다.
실시예 10. 동위원소 보강은 PUFA 과산화를 방지할 수 있다.
Q-less 효모 (coq 돌연변이체)는 지방산의 생체내 자가산화를 평가하는 이상적인 시스템을 제공한다. 코엔자임 Q (유비퀴논 또는 Q)는 작은 친지성 항산화제 뿐만 아니라 미토콘드리아 내막의 호흡 사슬에서 전자 운반체로서 작용한다. 10가지의 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 유전자 (COQ1-COQ10)가 코엔자임 Q 생합성 및 기능에 필요하며, 어느 것이라도 결핍되면 호흡 결함을 초래한다 (Tran UC, Clarke CF. Mitochondrion 2007;7S,S62). coq 효모 돌연변이체는 PUFA의 자가산화 산물에 정교하게 민감성인 것으로 나타나 있다 (Do TQ et al, PNAS USA 1996;93:7534-7539; Poon WW, Do TQ, Marbois BN, Clarke CF. Mol. Aspects Med. 1997;18,s121). 에스. 세레비시애는 PUFA를 생성하지 못하지만 (Paltauf F, Daum G. Meth. Enzymol. 1992;209:514-522), 이들은 외인성으로 제공되는 PUFA를 이용하여, 이들의 함량이 조정되게 할 수 있다 (Paltauf F, Daum G. Meth. Enzymol. 1992;209:514-522). 리놀렌산으로 4시간 처리한 후, Q-less (coq2, coq3, 및 coq5) 효모 돌연변이체는 1% 미만이 생존가능하다 (Do TQ et al, PNAS USA 1996;93:7534-7539; Poon WW, Do TQ, Marbois BN, Clarke CF. Mol. Aspects Med. 1997;18,s121). 대조적으로, 이러한 처리를 받은 야생형 (부모의 유전적 배경이 W303-1B 균주임) 세포 중 70%가 생존해 있다. Q-less 효모는 또한, 쉽게 자가산화되는 다른 PUFA (예컨대 아라키돈산)에 과민성이지만, 모노불포화된 올레산을 이용한 처리에는 야생형 부모 균주와 동일하게 거동한다 (Do TQ et al, PNAS USA 1996;93:7534-7539). Q-less 효모 돌연변이체의 과민성은 호흡 불능의 2차 효과가 아닌데, 왜냐하면 cor1 또는 atp2 돌연변이체 효모 (각각 bc1 복합체 또는 ATP 합성효소 중 하나가 결여)는 PUFA 처리에 야생형의 내성을 나타내기 때문이다 (Do TQ et al, PNAS USA 1996;93:7534-7539; Poon WW, Do TQ, Marbois BN, Clarke CF. Mol. Aspects Med. 1997;18,s121).
플레이트 희석 분석법을 이용해, PUFA 감수성을 평가할 수 있다. 이 분석법은 분취물의 단계적인 5-배 희석물을 YPD 플레이트 배지에 스포팅함으로써 수행할 수 있다 (Fig.　3). 각각의 스폿에서 세포의 밀도를 시각적으로 조사함으로써, 서로 다른 균주의 감수성을 관찰할 수 있다.
리놀렌산으로 처리하면, coq null 돌연변이체의 생존율을 급격하게 상실시킨다. 엄격하게 대조적으로, D4-리놀렌산으로 처리한 coq 돌연변이체는 사멸되지 않았으며, 올레산으로 처리한 효모와 유사한 생존력을 유지하였다. 정량적인 콜로니 계수로써, 올레산 및 D4-리놀렌산으로 처리한 세포의 생존율이 유사한 것으로 나타났으며 (도　4), 한편, 표준 리놀렌산으로 4시간 동안 처리한 후 coq 돌연변이체의 생존율은 100-배 이상 감소하였다. 이들 결과는, 과민성 coq 돌연변이체의 세포 살해에 대한 내성을 증거로, 동위원소-보강된 리놀렌산은 표준 리놀렌산보다 자가산화에 대해 훨씬 더 내성임을 나타낸다.
실시예 11. GC-MS는 효모 세포에서 지방산 및 PUFA를 검출할 수 있다.
효모는 PUFA를 합성하지 않지만, 이들은 외인성으로 공급된 리놀레산 및 리놀렌산을 혼입한다 (Avery SV, et al. Applied Environ. Microbiol. 1996; 62,3960; Howlett NG, et al. Applied Environ. Microbiol. 1997; 63,2971). 따라서, 효모는 외인성으로 공급된 D4-리놀렌산도 병합할 것으로 생각된다. 그러나, 리놀렌산 및 D4-리놀렌산에 대한 차별적인 감수성은 자가산화보다는 세포로의 혼입의 차이에 의한 것일 가능성이 존재한다. 이런 경우인지 시험하기 위해, 이 지방산의 흡수 범위를 모니터링하였다. 우선, (내부 표준으로서 사용되는) C18:1, C18:3, D4-18:3 및 C17:0의 지방산 메틸 에스테르(FAME)의 분리 조건을 측정하였다. 도 5에서 나타낸 GC-MS 크로마토그램은, 이들 지방산 메틸 에스테르 표준의 검출의 분리 및 감수성 모두를 확립한다.
지방산 감수성 분석법에서 기술한 바대로, 대수 증식기 성장 중인 야생형 효모를 회수하고, 인산염 완충액 + 0.20% 덱스트로스의 존재 하에, 외인성으로 첨가된 지방산의 존재 하에 (0시간 또는 4시간 동안) 인큐베이션하였다. 세포를 회수하고, 10 ㎖ 멸균수로 2회 세정한 다음, 효모 세포 펠렛을 전술한 바대로 알칼리 메타노라이시스 처리를 하였다. 내부 표준으로서 첨가한 C17:0을 이용한 GC-MS 후에, 지방산은 메틸에스테르(FAME)인 것으로 검출된다 (도　6). 4시간 동안 인큐베이션한 후 검출된 18:3 및 D4의 양을 보정 곡선으로부터 외삽(extrapolation)하였다. 이들 결과는, 4시간 인큐베이션하는 중에, 효모가 리놀렌산 및 D4-리놀렌산 둘 다를 열심히 혼입한다고 나타낸다. 이들 결과를 토대로, D4-C18:3으로 처리한 coq 돌연변이체 효모의 내성 증가는 흡수의 결여로 인한 것이 아님이 명백해졌다.
D2-리놀렌산, 11,11-D2-리놀렌산 및 14,14-D2-리놀렌산을 또한 이 효모 모델에 사용하였으며, 상당한 보호를 제공하였다.
실시예 12. 사슬 반응 포맷에서 D2-LA의 비-효소적 산화에서 카이네틱 동위원소 효과.
LA 및 D2-LA의 산화 동안의 산소 소비의 카이네틱스를 유리 모세관 마이크로불류미터(microvolumeter)를 이용해 연구하였다 (도 7). 산화 속도인 ROX를 [O2] 추적의 경사로서 측정하였다. 개시 속도인 RIN을 대조군 저해제로서 HPMC ("6-하이드록시-2,2,5,7,8-펜타메틸벤조크로만")를 이용하는 저해제 방법으로 측정하였다. RIN을 저해된 산화의 유도 기간으로부터 계산하였다. tIND: RIN = 2·[HPMC]/tIND. 0.71 M LA (도 7)의 산화 속도는 6.1x10-6 M/s인 것으로 측정되었다. 상기 공정을 0.23 mM 사슬-절단 항산화제인 HPMC로 저해하는 경우, 유도 기간인 tIND은 약 48분이었으며, RIN 값은 약 0.16x10-6 M/s였다. 이들 데이터로부터 계산한 카이네틱 사슬의 길이는 v = ROX/RIN = 38 ± 3이었다. 이 데이터를 토대로, LA의 계산된 산화성은 0.0215 ± 0.008 M-0.5s-0.5 (n = 5)이었다 [Cosgrave J.P, et. al. Lipids, 1987, 22, 299-304]. D2-LA의 경우, ROX가 0.18x10-6 M/s로 감소한 것을 관찰하였다 (도 7). LA와는 대조적으로, HPMC의 첨가는 ROX의 감소 및 임의의 검출가능한 유도 기간의 출현을 초래하지 못하였다 (데이터는 나타내지 않음). 유도 기간의 출현은 RIN의 직접적인 측정을 방해한다. D2-LA 산화에 대한 RIN 값은 LA의 경우와 유사하여, D2-LA 산화는 사슬 공정이 아니었다 (n = 0.18x10-6/0.16x10-6
Figure 112019085571088-pat00050
1.1). 측정한 카이네틱 동위원소 효과 ("KIE")는 LA 및 D2-LA에 대한 ROX를 비교한 것으로서, 대략 6.1x10-6/0.18x10-6
Figure 112019085571088-pat00051
35이었다. 유사한 KIE는, Triton X-100 수성 미셀에서 LA 및 11,11-d2-LA의 산화 동안에 측정하였다 (데이터는 나타내지 않음). 비교를 위해, 이론적 KIE는 25℃에서 6.9이다. Carpenter, "Determination of Organic Reaction Mechanisms" (John Wiley & Sons, 1984), p. 89를 참조한다.
실시예 13. 소량의 D2-LA는 과산화에 대해 LA를 보호한다.
유사한 생체내 상황을 모방하기 위해, D2-LA 및 LA의 혼합물의 산화의 카이네틱스를 조사하였다 (도 8). 실험에서, LA + 11,11-d2-LA의 농도는 0.775 M이고; AMVN의 농도는 0.0217 M이었으며; 반응은 37℃에서 수행하였다. 그 결과, RIN은 1.10±0.08x10-7 M/sec이었다. 부가적으로, 혼합물의 산화 속도는 비-상가적인 것으로 나타났으며, 개별 화합물에 대한 ROX의 상가 값보다 훨씬 더 낮았다. 놀랍게도, D2-LA는 자가산화에 대해 비-중수소화된 LA를 실질적으로 '보호한다'. 정량적으로 유사한 효과를 11,11-D2-LA와 비-중수소화된 메틸 리놀레이트의 혼합물의 산화 동안에 관찰하였다 (데이터는 나타내지 않음). 이들 결과는, 비-중수소화된 LA를 D2-LA로 부분적으로 치환해도 PUFA 과산화를 상당히 늦출 수 있음을 제시한다.
실시예 14. 소량의 D2-LA는 생체내 과산화에 대해 LA를 보호한다.
실시예 13의 결과를, Q-less coq3 효모 균주를 사용하고 D2-LA에 대한 LA의 서로 다른 비율을 이용해 생체내에서 재현하였다 (도 9). 야생형, 효모 Q-less coq3, 또는 호흡 결핍성 cor1 null 돌연변이체를 도 9에 나타낸 바와 같이, 서로 다른 비율의 PUFA에서 200 μM의 LA 및 D2-LA의 존재 하에 인큐베이션하였다. 0.2 OD/㎖에서 시작한 단계 희석액 (1:5)을 YPD 고형 플레이트 배지에 스포팅하였다. 부가적으로, 0시간 미처리 대조군을 이용하고, 그 결과를 도 9의 상부 좌측에 나타낸다. 30℃에서 배양한다. 그 결과, D2-LA 중 대략 10% 내지 15%가 LA의 독성을 취소하기 위한, 충분히 최소인 양으로 나타났다. 모노-중수소화된 PUFA와 유사하게 인큐베이션하면, 11,11-D,H-LA는 3시간 처리 후, 세포 생존율의 소실을 검출가능할 정도로 나타내지 않았다 (데이터는 나타내지 않음). 이들 결과는, D2-LA 및 11,11-D,H-LA는 둘 다 지질 과산화에 대해 내성이었음을 제안한다.
야생형 효모 세포는, 효모를 200 μM의 표시한 지방산으로 2시간 동안 처리하고 멸균수로 세정하고, 실온에서 미처리 (삼각형) 또는 50 μM CuSO4로 처리 (사각형)하는 점을 제외하고는, 전술한 바대로 처리하였다. 세포를 구리로 처리한 지 60분 후에, 이를 실온에서 8 μM C11-Bodipy 581/591로 30분 동안 처리하였다. 100 ㎕ 분취물 4개를 96-웰 플레이트에 평판배양하고, 형광을 측정하였다. PUFA의 부재 또는 존재 하에 구리로 처리한 야생형 효모 세포는 구리로 처리하지 않은 효모와 비교해 유의하게 더 높은 수준의 지질 과산화를 나타내었다. 그러나, 11,11-D2-LA로 처리한 구리-스트레스성 야생형 효모 세포는 PUFA로 처리하지 않은 효모와 유사하게 더 낮은 수준의 지질 과산화를 나타낸다. 모노-중수소화된 11,11-D,H-LA는 유사한 보호를 제공하였다.
실시예 15. 소량의 D4-ALA는 생체내 과산화에 대해 ALA를 보호한다.
실시예 14에 기술한 실험 프로토콜을 Q-less coq3 효모 균주 (도 10) 및 D4-ALA에 대한 ALA의 서로 다른 비율을 이용해 생체내에서 재현하였다. 도 10에 나타낸 바와 같이, 야생형, 효모 Q-less coq3, 또는 호흡 결핍성 cor1 null 돌연변이체를 서로 다른 비율의 PUFA에서 200 μM의 ALA 및 D4-Lnn (리놀렌산)의 존재 하에 인큐베이션하였다. 0.2 OD/㎖에서 시작한 단계 희석액 (1:5)을 YPD 고형 플레이트 배지에 스포팅하였다. 30℃에서 배양한다. 그 결과, D2-Lnn 중 대략 10% 내지 15%가 ALA의 독성을 취소하기 위한, 충분히 최소인 양인 것으로 나타났다. 더욱이, 결과는, 효모 세포에 의해 흡수된 PUFA의 함량이 첨가된 비율을 대략적으로 반영하며, 효모 세포는 제공된 PUFA를 구별하지 않음을 나타낸다.
실시예 16. D-PUFA는 산화성 스트레스를 경감시키고, AMD 및 당뇨병성 망막변성 병증에 관여하는 망막 세포에서 생존율을 증가시킨다.
미세혈관 상피 (microvascular endothelium, MVEC), 망막 색소 상피 (retinal pigment epithelium, RPE) 및 막망 신경 (망막 강글리온 세포)을 비롯하여 여러 가지 세포 유형에서, 세포 배양 중 생존율을 시험하였다. 세포를 수소화된 (대조군) 또는 중수소화된 D2-리놀레산 (ω-6; LA) 및 D4-리놀렌산 (ω-3; ALA) (20 μM; ω-6 : ω-3의 비율은 1:1 또는 2:1)을 포함하는 배지에 72시간 동안 두었다. PUFA가 세포에 혼입되는 것을 GC로 모니터링하였다 (도 11). PUFA는 PUFA의 MVEC로의 혼입을 보여주는 표 1에 따라 세포에 의해 쉽게 흡수되는 것으로 나타났다.
Figure 112019085571088-pat00052
그런 다음, 세포를 보편적인 산화성 스트레스-발생 화합물인 파라쿼트(paraquat) (PQ; 500 μM)로 처리하였다. 생존율 측정을 위해, 세포를 혈구계수기 및 트립판 블루 제외 방법(trypan blue exclusion method)을 이용해 계수하였다. 도 12는 H-PUFA 및 D-PUFA를 처리한 MVEC 세포의, 파라쿼트에 의한 급성 중독 후의 생존율을 보여준다. 시험한 세포 유형 모두에 대해, D-PUFA는 대조군에 비해 보호 효과를 가졌으며, 이는 MVEC 세포에 대해 도 8에서 나타낸 것과 유사하였다.
실시예 17. D-PUFA를 보충한 마우스의 독성학 연구에 주요 혈중 바이오마커에 이상현상이 나타나지 않는다.
보다 연기된 투여량 파라다임 (즉, 3주의 식이요법 대체)을 이용하면, H-PUFA- 및 D-PUFA-보충된 마우스의 혈중 혈청의 화학적 분석 (UV Davis에서 수행함)은, H-PUFA/D-PUFA 식염수 처리 마우스에서 신장 기능, 간 기능, 혈중 지질 등의 주요 바이오마커의 차이가 없음을 나타내었다. 이 실시예에서, D-PUFA는 D2-리놀레산: D4-리놀렌산의 2:1 혼합물이다.
시험한 파라미터는 트리글리세라이드; 총 단백질; 총 빌리루빈; 인; 유리 지방산; HDL; 포도당; 크레아틴; 콜레스테롤; 칼슘; 혈중 요소 질소; 알칼리 포스파타제; 알부민; 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제; 및 표 2의 다른 것들을 포함한다.
Figure 112019085571088-pat00053
실시예 18. 조직병리학적 연구
현미경적 변화는 매우 특이적인 토포그래픽 및 형태적 진단에 의해 코딩(coding)하였으며, 임상코드시스템(SNOMED) 및 국가 독성학 프로그램의 독성학 데이터 관리 시스템(National Toxicology Program's Toxicology Data Management System (TDMS)) 용어 매뉴얼을 가이드라인으로서 사용하였다. 데이터는 Labcat® Histopathology module 4.30에서 기록하였다. 4-단계 등급 시스템 (최소, 경미, 중간, 및 강함)을 이용하여 등급별의 변화를 규정하였다.
1일 내지 14일간의 연구 중에, 식이요법과 함께 PUFA를 C57BL6 수컷 마우스에 경구 투여하고, 연구한 지 15일째에 검시하였다. 1군은 4마리의 마우스로 이루어졌으며, 수소화된 PUFA를 투여하였다. 2군은 5마리의 마우스로 이루어졌으며, 중수소화된 PUFA (D2-LA 및 D4-ALA)를 투여하였으며, 8일째에 모든 마우스에 식염수를 복강내(IP) 투여하였다. 처리한 마우스 모두의 프로토콜-특이적 조직 [간 (3 내지 7개 섹션), 기관지를 포함한 폐 (2 내지 5개 로브(lobe)), 비장, 심장, 및 신장]의 완벽한 세트를 조직병리학적으로 검사하였다. H-PUFA와 D-PUFA 군 간에는 차이가 관찰되지 않았다.
실시예 19. 조직-특이적 중수소화의 조사
야생형 마우스는 케이지 당 12마리씩 (수컷과 암컷은 분리) 넣고, AIN 93 식이요법에서 펠렛으로서 90일 동안 마음대로 (전형적으로, 5-6 g/day) 영양 공급을 하게 하였으며, 총 지방은 6%였다. 총 지방 중 약 10%는 D2-LA/D4-ALA의 1:1 혼합물 (1군), D2-LA/ALA (2군), 또는 LA/ALA (대조군)이었다. 동물을 안락사시키고, 장기를 회수하고, 방부제를 사용하지 않은 채 분석 전에 저온에 보관하였다. 지질 분획을 분리하고, 전처리한 후, 대조군으로서 LA, D2-LA, ALA 및 D4-ALA를 사용해 표준 프로토콜에 따라 LC-MS로 분석하였다.
1:1 D2-LA/D4-ALA의 투여량 연구는, 조직들에 중수소가 매우 풍부해지고, 총 지방 중 약 40%는 중수소화됨을 나타내었다 (도 13). 더욱이, 이들 연구는, 지방 분포가 시험한 투여량에 의해 상대적으로 변하지 않은 채로 있음을 나타내었다 (도 14). 1:1 D2-LA/ALA의 투여량 연구 후, 총 지방 중 약 27% 가 중수소화된 것으로 측정되었다 (도 15).
간 및 뇌와 같은 특정 장기들을 또한 평가하였다 (도 16 내지 21). 간은 이전에 연구한 조직과 서로 다른 지방 프로파일을 가진 한편 (도 16), D2-LA/D4-ALA를 이용한 90일간의 투여량 연구는 조직들에 중수소가 매우 풍부해지고, 총 지방 중 약 40%가 중수소화됨을 나타내었다 (도 17). 더욱이, 간 연구는, 지방 분포가 시험한 투여량에 의해 상대적으로 변하지 않은 채로 있음을 나타내었다 (도 16-17). 부가적으로, D2-LA를 이용한 90일간의 투여량 연구에서만, 선행 연구와 유사한 지방 프로파일이 나타났으며, 총 지방 중 약 32%가 중수소화되었다 (도 18). 결과적으로, 간에서 지방 프로파일 및 중수소화 프로파일은 투여되는 중수소화된 성분과는 상관없이 유지되었다. 간과 마찬가지로, 뇌 또한, 선행 연구의 조직과 서로 다른 지방 프로파일을 나타내었다 (도 19 내지 21). D2-LA/D4-ALA를 이용한 90일간의 투여량 연구는 조직들에 중수소가 매우 풍부해지고, 총 지방 중 약 30%가 중수소화됨을 나타내었다 (도 19). 더욱이, 뇌 연구는, 지방 분포가 시험한 투여량에 의해 상대적으로 변하지 않은 채로 있음을 나타내었다 (도 19 내지 21). 부가적으로, D2-LA/ALA를 이용한 90일간의 투여량 연구에서, 선행 연구와 유사한 지방 프로파일이 나타났으며, 총 지방 중 약 23%가 중수소화되었다 (도 20). 결과적으로, 뇌에서 지방 프로파일 및 중수소화 프로파일은 투여되는 중수소화된 성분과는 상관없이 유지되었다.
실시예 20: PUFA가 안(eye) 조직 및 세포에 혼입되는지에 대한 검사
동위원소비 질량분석기를 이용해, 안 조직의 인지질 막에 D-PUFA가 혼입되는지 확인할 수 있다. 식이요법적인 보충을 통해 D2-LA 및 D4-ALA를 전달하는 경우, 동물 조직으로의 혼입은, 지질 막에서 중수소 조성물의 총 증가를 측정하는 동위원소비 질량분석기를 이용하여 모니터링해서, 이들 화합물로부터 유래되는 D2-LA, D4-ALA, 및 다른 PUFA의 혼입을 보고할 수 있다. 이 방법을 이용해, D-PUFA가 마우스의 안 조직으로 실질적으로 섭취되는 것을 검출할 수 있다. 예를 들어, 6일 동안 유일한 PUFA 공급원으로서 D-PUFA (0.01, 0.1, 1.0, 10.0, 및 100 mg/kg의 D2-LA, D4-ALA, 및 D2-LA와 D4-ALA 둘 다의 1:1 조합) 또는 H-PUFA (0.01, 0.1, 1.0, 10.0, 및 100 mg/kg의 LA, ALA, 및 LA와 ALA 둘 다의 1:1 조합)를 마우스에 보충시키고, 공지된 산화제 또는 식염수 비히클에 급성 노출시키고 추가로 6일 동안 동일한 식이요법을 수행하였다. 안 조직을 적출 및 절개해서, 식염수를 처리한 마우스와 시험 화합물을 처리한 마우스의 균질물 샘플을 이용해 상기 실시예 7에서 기술한 대로 중수소 함량을 분석한다. D2-LA 및 D4-ALA는 분석한 조직 및 세포에서 발견되는 것으로 예상된다.
실시예 21: 연령-관련 황반 변성에 대한 효능 검사
인간 공여자의 안구로부터의 망막색소상피(retinal pigment epithelium, RPE) 세포를 공지된 방법에 따라 배양하고, D-PUFA (0.01, 0.1, 1.0, 10.0, 100, 및 1000 μM의 D2-LA, D4-ALA, 및 D2-LA와 D4-ALA 둘 다의 1:1 조합) 또는 H-PUFA (0.01, 0.1, 1.0, 10.0, 100, 및 1000 μM의 LA, ALA, 및 LA와 ALA 둘 다의 1:1 조합)에 노출시킨다. 여러 시간대에서 (24, 48, 및 72시간째에서), 디지털 영상촬영을 하고, 공지된 방법에 따라 리포퓨신(lipofuscin) 및 색소침착(pigmentation)에 대해 분석한다.
또한, PRE 세포의 중요한 기능인 식균작용(phagocytose)의 치료-의존성 능력을 조사할 수 있다. 인간 공여자의 안구로부터의 망막색소상피(RPE) 세포를 공지된 방법에 따라 배양하고, D-PUFA (0.01, 0.1, 1.0, 10.0, 100, 및 1000 μM의 D2-LA, D4-ALA, 및 D2-LA와 D4-ALA 둘 다의 1:1 조합) 또는 H-PUFA (0.01, 0.1, 1.0, 10.0, 100, 및 1000 μM의 LA, ALA, 및 LA와 ALA 둘 다의 1:1 조합)에 노출시킨다. 대략 3주 후, 형광 라텍스 비드를 상기 세포 배양물에 약 4시간 동안 첨가한다. 상기 세포를 세정하여 비-포식작용된 비드를 제거하고, 고정한다. 상기 세포의 형광 이미지를 촬영하고, 리포퓨신 함량 및 포식작용된 비드의 수를 분석한다. D2-LA 및 D4-ALA는, 세포가 포식작용하는 능력을 유지하게 할 수 있는 리포퓨신의 형성을 방지할 것으로 예상된다.
생체내, 즉, 실험 래트의 살아있는 눈에서 상기 화합물의 유리체내(intravitreal) 주입 후, 리포퓨신의 효과를 또한 조사할 수 있다. D-PUFA (0.01, 0.1, 1.0, 10.0, 및 100 mg/kg의 D2-LA, D4-ALA, 및 D2-LA와 D4-ALA 둘 다의 1:1 조합) 또는 H-PUFA (0.01, 0.1, 1.0, 10.0, 및 100 mg/kg의 LA, ALA, 및 LA와 ALA 둘 다의 1:1 조합)를 6개월령의 Wistar 래트에게 유리체내로 주입한다. 그런 다음, 상기 래트를, 기능성 검사를 위한 망막전위도검사(electroretinography)를 이용하고, 리포퓨신 입자를 계수하여 평가한다. D2-LA 및 D4-ALA는 리포퓨신 함량을 감소시킬 것으로 예상된다.
건식 AMD의 동물 모델 (Justilien V, Pang, J P, et al, SOD2 Knockdown Mouse Model of Early AMD, Invest Opthalmol V is Sci, 2007, 48 (10), 4407-4420 참조)은, 망막 아래에 주사한 보호성 효소인 망간 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(MnSOD)를 표적으로 하는 리보자임을 가졌던 마우스를 이용하는 것으로 알려져 있다. 리보자임 (AAV-Rz 432) 방법은 정상 어덜트 조직에서 SOD2 발현의 부위 특이적 소마틱 넉다운(site specific somatic knockdown)을 허용하므로, 병변이 주입을 받은 눈에서만 존재하며, 신체의 다른 부분들은 영향을 받지 않는다. 따라서, 상기 동물의 다른 눈은 대조군으로서 기능할 수 있다. 이 프로토콜은, 리보자임의 단일 주사 후 상기 마우스의 눈에서 AMD 환자의 눈에서 관찰되는 비정상들 중 많은 것을 유도하는 것으로 나타나 있으며, 가장 심각한 변화는 주입 후 120일째에 나타난다. 반응성 산소종 및 반응성 질소종으로부터의 보호에 대한 대리 마커(surrogate marker)는, 망막전위도검사(ERG) 및 형태계측(morphometry)으로 조사할 수 있다.
예를 들어, 전체 ERG(full field ERG) 분석을 이용해, 암적응 및 광적응 마우스에서 a-파 및 b-파 크기를 측정해서, 간상세포 및 원추세포의 기능의 상실을 평가할 수 있다. 디지털 푼두스 영상(Digital fundus imaging)을 이용해, 망막 색소상피(RPE)에서 아트로피 변화(atrophic change)를 모니터링할 수 있다. 부가적으로는, 광학현미경을 사용해, 광수용체 및 RPE에 가해진 손상을 정량적으로 평가하고, 맥락막 혈관형성(choroidal neovascularization)의 증거를 찾고, 부르크 막(Bruch's membrane)의 두께 변화를 측정할 수 있다. 망막 변성은, 간상세포 외부 세그먼트 및 외부 핵층의 두께를 측정함으로써, 형태계측적으로 측정할 수 있다 (Goto Y, Peachey N S, Ripps H, Naash M I. Functional abnormalities in transgenic mice expressing a mutant rhodopsin gene, Invest Opthalmol Vis Sci 1995, 36, 62-71; Faktorovich E G, Steinberg R H, Yasumura D, Matthes M T, LaVail M M. Photoreceptor degeneration in inherited dystrophy delayed by the basic fibroblast growth factor, Nature 1990, 347, 83-86 참조).
이에, D-PUFA (0.01, 0.1, 1.0, 10.0, 및 100 mg/kg의 D2-LA, D4-ALA, 및 D2-LA와 D4-ALA 둘 다의 1:1 조합) 또는 H-PUFA (0.01, 0.1, 1.0, 10.0, 및 100 mg/kg의 LA, ALA, 및 LA와 ALA 둘 다의 1:1 조합)를 Justilien V, Pang, J P, et al, SOD2 Knockdown Mouse Model of Early AMD, Invest Opthalmol V is Sci, 2007, 48 (10), 4407-4420)에서 기술한 건식 AMD의 마우스 모델에 투여한다. 반응성 산소종 및 반응성 질소종으로부터의 보호에 대한 대리 마커는, 망막전위도검사(ERG) 및 형태계측으로 조사할 수 있다. D2-LA 및 D4-ALA는 반응성 산소종 및 반응성 질소종에 의한 손상에 대해 보호할 것으로 예상된다.
전술한 바와 같이, 새로운 혈관 성장 및 리키지(leakage)는 습식 AMD 질환의 진행을 촉진하는 것으로 생각된다. 대표적인 모델로서, 인공 각막 화상(artificial corneal burn)을 래트의 눈에서 유도하여, 비히클 용액, 비-안정화된 시험 화합물, 또는 여러 가지 농도의 시험 화합물이 각막 혈관신생에 미치는 영향을 측정할 수 있다. 보다 구체적으로는, 비히클 용액, 비-안정화된 시험 화합물, 또는 여러 가지 농도의 시험 화합물의 국소 투여를, 질산은 (70%) 및/또는 질산칼륨 (30%)의 적용에 의해 각막 화상을 인공적으로 유도하였던 래트에게 1일 2회로 수행할 수 있다.
이에, D-PUFA (0.01, 0.1, 1.0, 10.0, 및 100 mg/kg의 D2-LA, D4-ALA, 및 D2-LA와 D4-ALA 둘 다의 1:1 조합) 또는 H-PUFA (0.01, 0.1, 1.0, 10.0, 및 100 mg/kg의 LA, ALA, 및 LA와 ALA 둘 다의 1:1 조합)를 인공 각막 화상을 가진 래트에게 매일 투여한다. 3주 동안, 상기 래트를 신생 혈관 성장 및 리키지에 대해 조사한다. 실험 종료 시, 상기 래트를 안락사시키고, 이들의 눈을 적출하고, 혈관 성장 및 리키지를 추가로 조사한다. D2-LA 및 D4-ALA는 신규 혈관 성장 및 리키지의 양을 감소시킬 것으로 예상된다.
실시예 22: 당뇨병성 망막증에 대한 효능 검사
진성당뇨병은 약 20주령의 자발적인 당뇨병 토리이(spontaneously diabetic Torii, SDT)에서 발생한다. 이에, 혈중 포도당 농도는 약 25주령에서 확인할 수 있으며, 혈중 포도당 농도 (적어도 300 mg/dl)의 증가를 나타내는 래트를 당뇨병성 망막증을 예방 및/또는 경감시키는 화합물의 효능을 측정하기 위한 모델로서 이용할 수 있다. 예를 들어, 진성당뇨병이 발병하는 수컷 SDT 래트는 2종류의 군, 즉 1) 대조군 및 2) 시험 화합물 처리군으로 나눈다. D-PUFA (0.01, 0.1, 1.0, 10.0, 및 100 mg/kg의 D2-LA, D4-ALA, 및 D2-LA와 D4-ALA 둘 다의 1:1 조합) 또는 H-PUFA (0.01, 0.1, 1.0, 10.0, 및 100 mg/kg의 LA, ALA, 및 LA와 ALA 둘 다의 1:1 조합)는, LA 및 ALA에 대해 조절된 래트의 통상적인 먹이와 함께 혼합하고 매일 공급한다. 36주령 및 52주령 내지 58주령에서, 상기 래트를 마취시키고, 이들의 안구를 적출하여 조직병리학적 검사에 사용한다.
조직병리학적 검사는 하기 방식으로 수행한다. 상기 래트를 에테르로, 그리고 넴부탈(Nembutal)의 복강내 투여에 의해 마취시킨 다음, 안구를 적출한다. 적출한 안구를, 4% 글루타르알데하이드, 10% 중성 포르말린 및 포스페이트 완충액 (pH 7.2, 0.3 mol/l)으로 이루어진 혼합액 (1:1:2)에 둔다. 60분 후, 상기 안구를 실체현미경(stereoscopic microscope) 하에서 절반으로 자른 다음, 4℃에서 밤새 보관한다. 다음날 아침, 상기 안구를 통상적인 방식으로 파라핀에 포매하여, 시신경 번들(bundle)을 함유하는 횡단형 섹션을 만든다. 그런 다음, 상기 섹션을 공지된 방법에 따라 헤마톡실린-에오신으로 염색하고 분석한다. D2-LA 및 D4-ALA는 망막증의 발병을 예방할 것으로 예상된다.
동일한 마취 하에 래트의 흉부를 개복하고, 형광 덱스트란 (Sigma, 50 mg/1 ml PBS)을 심장에 주입하고, 5분 후 안구를 절개함으로써, 형광안저혈관조영술(fluorescein fundus angiography)을 또한 수행한다. 그런 다음, 망막을 절개한 상기 안구로부터 분리하고, 슬라이드 글라스 위에 펼쳐놓아 상기 망막의 편평하게 마운팅된 표본을 만들고, 실체 형광 현미경으로 관찰하고, 사진촬영을 하여 망막증을 조사한다.
시신경 유두(optic nerve head) 주변의 망막의 비후화(thickening)를 수반하는 망막 주름(retinal fold) (망막 박리(retinal detachment))이 병리학적 검사에서 인지되는 경우, 또는 시신경 유두 주변의 구경 변화(caliber variation) 및/또는 망막 혈관 주행변화(retinal vascular tortuosity)를 수반하는 형광 염료 리키지(fluorescence dye leakage)가 형광안저촬영(fluorescein fundus photography)에서 인지되는 경우, 중증의 망막증이 상기 SDT 래트에서 발생한 것으로 추정된다.
실시예 23: 스타르가르트 질환에 대한 효능 검사
ABCR-/- 마우스는 인간의 열성 스타르가르트(human recessive Stargardt's Disease)의 동물 모델이다. 열성 스타르가르트 질환 환자에서와 같이, ABCR-/- 마우스는 이들의 눈의 RPE 세포에 리포퓨신 침적물이 대량 축적되며, 결국 지연성 암순응(delayed dark adaptation)을 경험한다. 이 마우스 모델에서 관찰된 리포퓨신 축적 및 시력 상실 또한, 연령-관련 황반 변성(AMD) 및 기타 황반 이영양증(macular dystrophy)과 관련이 있는 것으로 생각된다.
ABCR-/- 마우스를 D-PUFA (0.01, 0.1, 1.0, 10.0, 및 100 mg/kg의 D2-LA, D4-ALA, 및 D2-LA와 D4-ALA 둘 다의 1:1 조합) 또는 H-PUFA (0.01, 0.1, 1.0, 10.0, 및 100 mg/kg의 LA, ALA, 및 LA와 ALA 둘 다의 1:1 조합)의 식이요법으로 사육한다. 1, 3, 5, 및 7주째에, 마우스를 안락사시키고, 이들의 눈을 적출하고, 망막 및 세안컵(eyecup)을 풀링(pooling)하고 에탄올로 균질화한다. 상기 균질물을 원심분리하고, 상층액을 회수하여, 상기 상층액을 HPLC로 A2E-리포퓨신에 대해 분석한다. D2-LA 및 D4-ALA는 리포퓨신 형성을 지연시킬 것으로 예상된다.
실시예 24: 망막색소 변성증에 대한 효능 검사
RP-환자에서 α-포스포다이에스터라제-관련 돌연변이가 변성에 중요한 역할을 하기 때문에, rd-1 마우스는 본원 개시 화합물의 효능을 측정하는 관련성이 있으면서 사용가능한 모델이다. 미처리 rd-1 마우스에서, 상기 돌연변이는 생후 약 10일째 (PN 10)에 시작하는 간상체 수용기 세포(rod receptor cell)의 세포자살을 유도하며, 결국 약 PN18에 야맹증을 초래한다. PN18에, 원뿔체 광수용기 세포(cone photoreceptor cell)만이 남아 있으며, 이 또한 결국 사멸할 것이다. 비교를 위해, 유전적으로 상기 rd-1 마우스와 동일한 정상적인 야생형을 사용할 수 있었다.
시험 동물을 유럽 커뮤너티 가이드라인(European Community guideline) (86/609/EEC)에 따라 처리할 수 있었다. CH3 라인 및 호모자이거스 망막 변성 1(homozygous retinal degeneration 1) (rd1/rd1)의 마우스를 사용한다. 생후 3일째에 (PN3), 시험 동물을 D-PUFA (0.01, 0.1, 1.0, 10.0, 및 100 mg/kg의 D2-LA, D4-ALA, 및 D2-LA와 D4-ALA 둘 다의 1:1 조합) 또는 H-PUFA (0.01, 0.1, 1.0, 10.0, 및 100 mg/kg의 LA, ALA, 및 LA와 ALA 둘 다의 1:1 조합)로 2주 동안 처리한다. 처리 기간이 종료한 지 하루 뒤에 동물을 안락사시키고, 이후 이들의 눈을 적출하고, 소위 "말단 dUTP 닉-엔드 라벨링-분석법(Terminal dUTP nick-end labelling-assay (TUNEL)"으로 시신경의 각 면에서 광수용체의 수를 분석한다. 시판의 세포 사멸 검출 키트를 사용해, 상기 분석법을 정량화한다. D2-LA 및 D4-ALA는 광수용체 세포가 사멸하지 않도록 보호할 것으로 예상된다.
Caffe A R, Ahuja P, Holmqvist B, Azadi S, Forsell J, Holmqvist I, Soderpalm A K, van Veen T (2001) "Mouse retina explants after long-term culture in serum-free medium.", J Chem Neuroanat 22: 263-273 (원용에 의해 본원에 포함됨)에서 기술한 바와 같이, 혈청-무함유 조건 하에 rd-1 마우스와 대조군 마우스로부터 망막 외식편(retina explant)의 장기 배양(organ culture)에서도 실험을 수행한다. D2-LA 및 D4-ALA는 세포가 사멸하지 않도록 보호할 것으로 예상된다.
결론
본 발명이 이의 구체적인 실시 양태를 들어 기술되었지만, 당해 기술분야의 당업자는, 본 발명의 본래의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 여러 가지 변화를 줄 수 있으며, 등가물을 대체할 수 있음을 이해해야 한다. 이는 본원에서 나타낸 이점 및 특징 모두를 제공하지 않는 실시 양태들을 포함한다. 또한, 특정 상황, 재료, 물질의 조성, 공정, 공정 단계 또는 단계들을 본 발명의 목적, 사상 및 범위에 맞게 조정하기 위해 여러 가지 변형을 줄 수 있다. 이러한 변형은 모두 본원에 첨부된 청구항의 범위 내에 속하는 것으로 의도된다. 이에, 본 발명의 범위는 첨부된 청구항만을 참조로 하여 정의된다.

Claims (15)

  1. 변형된 고도불포화된 지방산 또는 지방산 에스테르를 포함하는,
    습식 및 건식 연령-관련 황반 변성(Wet and Dry Age-related Macular Degeneration, AMD), 망막색소변성증(Retinitis Pigmentosa, RP), 당뇨병성 망막증(Diabetic Retinopathy, DR), 백내장(Cataract), 또는 스타르가르트 질환(Stargardt Disease, SD)의 치료 또는 예방용 약학 조성물로서,
    상기 변형된 고도불포화된 지방산 또는 지방산 에스테르는 비스-알릴릭 위치(bis-allylic position)에서 하나 이상의 중수소 원자, 하나 이상의 13C 원자 또는 하나 이상의 플루오로 원자를 포함하고,
    상기 지방산 에스테르가 트리글리세라이드, 다이글리세라이드, 모노글리세라이드, 또는 알킬 에스테르이고,
    상기 변형된 고도불포화된 지방산 또는 지방산 에스테르는 환자에게 투여되거나 흡수된 고도불포화된 지방산 또는 지방산 에스테르의 총 함량의 5중량% 이상인,
    약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 변형된 고도불포화된 지방산 또는 지방산 에스테르가 환자에게 투여되거나 흡수된 고도불포화된 지방산 또는 지방산 에스테르의 총 함량의 10중량% 내지 50중량%인, 약학 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 변형된 고도불포화된 지방산 또는 지방산 에스테르가 환자에게 투여되거나 흡수된 고도불포화된 지방산 또는 지방산 에스테르의 총 함량의 10중량% 내지 30중량%인, 약학 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 환자의 세포 또는 조직이, 천연적인 고도불포화된 지방산 또는 지방산 에스테르의 자가산화를 방지하기 위하여 상기 변형된 지방산 또는 지방산 에스테르를 유지하는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 변형된 고도불포화된 지방산 또는 지방산 에스테르가 오메가-3 지방산, 오메가-3 지방산 에스테르, 오메가-6 지방산, 또는 오메가-6 지방산 에스테르인 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 변형된 고도불포화된 지방산 또는 지방산 에스테르가 11,11-D2-리놀렌산, 14,14-D2-리놀렌산, 11,11,14,14-D4-리놀렌산, 11,11-D2-리놀레산, 14,14-D2-리놀레산, 11,11,14,14-D4-리놀레산, 11-D-리놀렌산, 14-D-리놀렌산, 11,14-D2-리놀렌산, 11-D-리놀레산, 14-D-리놀레산, 11,14-D2-리놀레산, 또는 이들의 에스테르인 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 변형된 고도불포화된 지방산 또는 지방산 에스테르가 아라키돈산, 에이코사펜타엔산, 도코사헥사엔산 또는 이들의 에스테르인 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 변형된 고도불포화된 지방산 또는 지방산 에스테르가 하기 화학식의 화합물인, 약학 조성물:
    Figure 112019128043710-pat00077

    상기에서,
    R은 H 또는 C3H7 이고,
    R1은 H 또는 알킬이고,
    Y1-Yn 은 독립적으로 H 또는 D 이고, Y1-Yn 의 하나 이상은 D 이고,
    X1-Xm 은 독립적으로 H 또는 D이고,
    m 은 1 내지 10이고,
    n 은 1 내지 6이고, 및
    p 는 1 내지 10임; 또는
    Figure 112019128043710-pat00078

    상기에서,
    R은 H 또는 C3H7 이고,
    R1은 H 또는 알킬이고,
    각 Y는 독립적으로 H 또는 D 이고, 하나 이상의 Y는 D이고,
    m 은 1 내지 10이고, 및
    n 은 1 내지 5임; 또는
    Figure 112019128043710-pat00079

    상기에서,
    R은 H 또는 C3H7 이고,
    R1은 H 또는 알킬이고,
    각 Y 및 X는 독립적으로 H 또는 D 이고, 하나 이상의 Y는 D이고,
    m 은 1 내지 10이고,
    n 은 1 내지 5이고, 및
    p는 1 내지 10임; 또는
    Figure 112019128043710-pat00080

    상기에서,
    R은 H 또는 C3H7 이고,
    R1은 H 또는 알킬이고,
    각 X는 F 이고,
    m 은 1 내지 12이고, 및
    n 은 1 내지 5임.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 지방산 에스테르가 에틸 에스테르인 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 변형된 고도불포화된 지방산 또는 지방산 에스테르가 프로-비스-알릴릭(pro-bis-allylic) 위치에서 하나 이상의 중수소 원자, 하나 이상의 13C 원자 또는 하나 이상의 플루오로 원자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약학 조성물이 하나 이상의 항산화제와 함께 투여되는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 항산화제가 코엔자임 Q, 이데베논(idebenone), 미토퀴논(mitoquinone), 미토퀴놀(mitoquinol), 비타민 C, 또는 비타민 E인 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
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