KR102020579B1 - 에너지 프로세싱 손상 장애 및 미토콘드리아 결함 - Google Patents

에너지 프로세싱 손상 장애 및 미토콘드리아 결함 Download PDF

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Abstract

본 발명의 일부 측면들은, 반응성 산소종(ROS)에 의한 산화적 손상을 저하하고 및/또는 반응성 산물과 독성 화합물의 생성 속도를 억제하기 위해 특정 위치에서 변형된, 고도불포화된 지방산(polyunsaturated fatty acid)을 사용하여, 에너지 프로세싱 손상 장애(Impaired Energy Processing Disorder) 및 미토콘드리아 결함(Mitochodrial Deficiency)을 치료하는 방법을 제공한다.

Description

에너지 프로세싱 손상 장애 및 미토콘드리아 결함{IMPAIRED ENERGY PROCESSING DISORDERS AND MITOCHONDRIAL DEFICIENCY}
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2011년 4월 26일에 출원된 미국 가출원 제61/479,288 호를 우선권으로 주장하며; 이는 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
기술분야
본 발명은 특정 질환들, 특히 에너지 프로세싱 손상 장애(impaired energy processing disorder) 및 미토콘드리아 결함(mitochondrial deficiency)을 치료하기 위한, 동위원소로 변형된 고도불포화된 지방산(polyunsaturated fatty acid, "PUFA") 및 다른 변형된 PUFA에 관한 것이다.
산화적 스트레스는 미토콘드리아 질환, 신경퇴행성 질환, 선천성 대사 이상(inborn error's of metabolism), 당뇨병, 안 질환(disease of the eye), 신장 질환, 간 질환, 및 심장 질환과 같은 매우 다양한 질환과 관련되어 있다. 구체적으로는, 이러한 질환은 에너지 프로세싱 손상 장애 및 미토콘드리아 결함을 포함하나, 이로 한정되지 않는다.
산화적 스트레스와 관련된 질환은 그 수가 많고 다양하지만, 산화적 스트레스가 세포 내에서의 정상적인 산화환원 상태의 교란(disturbance)에 의해 야기된다는 것은 잘 확립되어 있다. 퍼옥사이드 및 유리 라디칼과 같은 반응성 산소종("ROS")의 일상적 생산과 해독 사이의 불균형으로 인해, 세포 구조 및 시스템(machinery)에 산화적 손상이 발생할 수 있다. 정상적인 조건에서는, 호기성 유기체에서 잠재적으로 중요한 ROS의 소스는 정상적인 산소 호흡이 이루어지는 미토콘드리아로부터 누출되는 활성화된 산소이다. 부가적으로는, 대식세포 및 효소 반응도 세포 내에서의 ROS 발생에 기여하는 것으로 알려져 있다. 세포와 이의 내부 소기관은 지질막-결합된 상태이기 때문에, ROS는 용이하게 막 구성분과 접촉하여 지질 산화를 야기할 수 있다. 결국, 이러한 산화적 손상은 활성화된 산소, 산화된 막 구성분, 또는 다른 산화된 세포 구성분과의 직접 및 간접적인 접촉을 통해 DNA 및 단백질과 같은 상기 세포 내의 다른 생체 분자들에게 전달될 수 있다. 따라서, 어떻게 산화적 손상이 세포 전체로 확산되어 내부 구성분의 이동성 및 세포 경로의 상관성(interconnectedness)에 영향을 미칠 수 있는지를 쉽게 생각해 볼 수 있다.
지질-형성 지방산은 살아 있는 세포의 주요 구성분들 중 하나로서 잘 알려져 있다. 이와 같이, 이들은 수많은 대사 경로에 참여하며, 다양한 건강 이상(pathologies)에서 중요한 역할을 한다. 고도불포화된 지방산("PUFA")은 지방산의 중요한 서브클래스(subclass)이다. 필수 영양소는 직접적으로 또는 전환을 통해 필수적인 생물학적 기능을 제공하는 식품 구성분으로서, 내부적으로 생산되지 않거나 또는 수요를 충족할 정도로 충분히 많은 양으로 생성되지 않는다. 항온 동물의 경우, 2가지의 상당히 필수적인 PUFA는, 과거 비타민 F로 알려진 리놀레산 (cis,cis-9,12-옥타데카다이엔산; (9Z,12Z)-9,12-옥타데카다이엔산; "LA"; 18:2;n-6) 및 알파-리놀렌산 (cis,cis,cis-9,12,15-옥타데카트리엔산; (9Z,12Z,15Z)-9,12,15-옥타데카트리엔산; "ALA"; 18:3;n-3)이다 (Cunnane SC. Progress in Lipid Research 2003; 42:544-568). LA는 추가적인 효소적 탈포화 및 신장에 의해 아라키돈산 (AA; 20:4;n-6)과 같은 고차의 n-6 PUFA로 전환되며; 반면, ALA는 에이코사펜타엔산 (EPA; 20:5;n-3) 및 도코사헥사엔산 (DHA; 22:6;n-3)을 포함하나 이로 한정되지 않는 고차의 n-3 시리즈를 생성한다 (Goyens PL. et al. Am . J. Clin . Nutr. 2006; 54:44-53). 특정 PUFA 또는 PUFA 전구체의 본질적인 속성 때문에, 이들의 결핍 사례들이 다수 알려져 있으며, 이러한 결핍들은 종종 의학적 상태와 연관되어 있다. 아울러, 많은 PUFA 보충제들이 처방전 없이 이용가능하며, 특정 질병들에 대해 효능이 입증되었다 (예를 들어, 미국 특허 제7,271,315 호 및 미국 특허 제7,381,558 호를 참조함).
PUFA는 최적의 산화적 인산화 성능에 필요한 적절한 유동성을 미토콘드리아 막에 부여한다. PUFA는 또한, 산화적 스트레스의 개시 및 확산에 중요한 역할을 한다. PUFA는 근원적인 현상을 증폭시키는 연쇄 반응을 통해 ROS와 반응한다 (Sun M, Salomon RG, J. Am . Chem . Soc . 2004; 726:5699-5708). 그러나, 고농도의 지질 하이드로퍼옥사이드가 비-효소적으로 생성되면 몇몇 유해한 변화가 발생하는 것으로 알려져 있다. 실제로, 코엔자임 Q10은 PUFA 과산화를 통한 PUFA 독성의 증가 및 생성되는 산물의 독성과 관련이 있다 (Do TQ et al, PNAS USA 1996; :7534-7539). 이러한 산화된 산물은 이들의 막의 유동성 및 침투성에 악영향을 미치며; 막 단백질의 산화를 초래하고; 다수의 고 반응성인 카르보닐 화합물로 전환될 수 있다. 후자로는, 아크롤레인(acrolein), 말로닉 다이알데하이드(malonic dialdehyde), 글라이옥살(glyoxal), 메틸글라이옥살 등과 같은 반응성 화학종(species)을 포함한다 (Negre-Salvayre A, et al. Brit . J. Pharmacol . 2008; 755:6-20). 그러나, PUFA 산화의 가장 주요한 산물은 알파, 베타-불포화된 알데하이드, 예컨대 4-하이드록시논-2-에날 (4-HNE; LA 또는 AA와 같은 n-6 PUFA로부터 형성됨), 4-하이드록시헥스-2-에날 (4-HHE; ALA 또는 DHA와 같은 n-3 PUFA로부터 형성됨), 및 상응하는 케토알데하이드이다 (Esterfbauer H, et al. Free Rad . Biol. Med . 1991; 77:81-128; Long EK, Picklo MJ. Free Rad . Biol . Med . 2010; 4P:1-8). 이들 반응성 카르보닐은 마이클 첨가(Michael addition) 또는 쉬프 염기(Schiff base) 형성 경로를 통해 (생체)분자와 가교되며, 다수의 (전술한 바와 같은) 병리학적 과정, 연령-관련 및 산화적 스트레스-관련 병태, 및 노화와 연루되어 있다. 중요하게는, 일부 경우에, 1,4-다이엔 시스템 (비스-알릴릭 위치)의 메틸렌 기가 실질적으로 ROS, 및 사이클로게나제 및 리폭시게나제와 같은 효소에 대한 안정성이 알릴릭 메틸렌보다 낮기 때문에, PUFA는 특정 위치에서 산화되는 것으로 보인다.
이에, 본 발명자들은, 산화 저항성 PUFA, PUFA 모방체, PUFA 프로드럭, 및/또는 산화 저항성 PUFA 및 PUFA 모방체를 함유하는 지방이 에너지 프로세싱 손상 장애 및 미토콘드리아 결함을 경감 및/또는 치료하는 데 유용하다는 것을 발견하였다.
일부 실시 양태들은 에너지 프로세싱 손상 장애 또는 미토콘드리아 결함을 가지며 치료가 필요한 환자에게 고도불포화된 성분을 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 에너지 프로세싱 손상 장애 또는 미토콘드리아 결함의 진행을 치료 또는 저해하는 방법을 제공하며, 상기 고도불포화된 성분은 하나 이상의 결합이 산화되지 않고 안정화되도록 화학적으로 변형되며, 상기 하나 이상의 안정화된 결합을 포함하는 고도불포화된 성분 또는 이의 고도불포화된 대사산물은, 투여된 후, 상기 환자의 신체로 병합(incorporation)된다.
일부 실시 양태에서, 고도불포화된 성분은 영양소이다. 다른 실시 양태에서, 상기 영양소는 지방산, 지방산 모방체, 및/또는 지방산 프로드럭이다. 다른 실시 양태에서, 상기 영양소는 지방산, 지방산 모방체, 및/또는 지방산 프로드럭을 포함하는 트리글리세라이드, 다이글리세라이드, 및/또는 모노글리세라이드이다. 일부 실시 양태에서, 상기 지방산, 지방산 모방체, 또는 지방산 프로드럭은 하나 이상의 비스-알릴릭 위치에서 안정화된다. 다른 실시 양태에서, 상기 안정화는 비스-알릴릭 위치에 하나 이상의 13C 원자 또는 하나 이상의 중수소 원자를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 상기 안정화는 하나 이상의 비스-알릴릭 위치에 2개 이상의 중수소 원자를 포함한다. 다른 실시 양태에서, 상기 안정화는 동위원소를 자연적인 함유 수준(naturally-occuring abundance level)을 초과하는 양으로 이용한다. 일부 실시 양태에서, 상기 안정화는 동위원소를 상기 동위원소의 자연적인 함유 수준을 훨씬 초과하는 양으로 이용한다.
일부 실시 양태에서, 지방산, 지방산 모방체, 또는 지방산 프로드럭의 동위원소 순도는 약 20% 내지 약 99%이다. 다른 실시 양태에서, 동위원소로 안정화된 지방산, 지방산 모방체, 또는 지방산 프로드럭은 비-안정화된 지방산, 지방산 모방체, 또는 지방산 프로드럭과 함께 환자에게 투여한다. 일부 실시 양태에서, 동위원소로 안정화된 상기 지방산, 지방산 모방체, 또는 지방산 프로드럭은 환자에게 투여하는 지방산, 지방산 모방체, 또는 지방산 프로드럭의 총 함량 중 약 1% 내지 100%, 약 5% 내지 75%, 약 10% 내지 30%, 또는 약 20% 이상을 이룬다. 일부 실시 양태에서, 상기 환자는 상기 지방산, 지방산 모방체, 또는 지방산 프로드럭을 흡수한다. 일부 실시 양태에서, 상기 환자의 세포 또는 조직은, 상기 지방산, 지방산 모방체, 지방산 프로드럭, 트리글리세라이드, 다이글리세라이드, 및/또는 모노글리세라이드를, 천연적인 고도불포화된 지방산, 모방체, 또는 에스테르 프로드럭의 자가산화를 방지하기에 충분한 농도로 유지한다. 일부 실시 양태에서, 안정화는 동위원소를 상기 동위원소의 자연적인 함유 수준을 훨씬 초과하는 양으로 이용한다.
일부 실시 양태에서, 상기 방법은 오메가-3 지방산 및/또는 오메가-6 지방산인 지방산, 지방산 모방체, 또는 지방산 프로드럭을 이용한다. 다른 실시 양태에서, 상기 지방산은 11,11-D2-리놀렌산, 14,14-D2-리놀렌산, 11,11,14,14-D4-리놀렌산, 11,11-D2-리놀레산, 14.14-D2-리놀레산, 11,11,14,14-D4-리놀레산, 11-D-리놀렌산, 14-D-리놀렌산, 11,14-D2-리놀렌산, 11-D-리놀레산, 14-D-리놀레산, 및 11,14-D2-리놀레산으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 실시 양태에서, 상기 지방산은 프로-비스-알릴릭 위치에서 추가로 안정화된다. 일부 실시 양태에서, 상기 지방산은 알파 리놀렌산, 리놀레산, 감마 리놀렌산, 다이호모 감마 리놀렌산, 아라키돈산, 및/또는 도코사테트라엔산(docosatetraenoic acid)이다. 일부 실시 양태에서, 상기 지방산은 미토콘드리아 막으로 병합된다. 다른 실시 양태에서, 상기 지방산 프로드럭은 에스테르이다. 일부 실시 양태에서, 상기 에스테르는 트리글리세라이드, 다이글리세라이드, 또는 모노글리세라이드이다.
일부 실시 양태는 항산화제를 공동-투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 양태에서, 상기 항산화제는 코엔자임 Q, 이데베논, 미토퀴논, 또는 미토퀴놀이다. 다른 실시 양태에서, 상기 항산화제는 미토콘드리아-표적화된 항산화제이다. 일부 실시 양태에서, 상기 항산화제는 비타민, 비타민 모방체, 또는 비타민 프로드럭이다. 다른 실시 양태에서, 상기 항산화제는 비타민 E, 비타민 E 모방체, 비타민 E 프로드럭, 비타민 C, 비타민 C 모방체, 및/또는 비타민 C 프로드럭이다.
도 1A 및 1B. (1A) PUFA의 ROS에 의한 산화; (1B) 독성 카르보닐 화합물의 형성.
도 2A 및 2B. 실시예 1 내지 4에 기술된 중수소화된 PUFA의 1H-NMR 및 13C-NMR 분석.
도 3. 리놀렌산 처리에 대한 coq null 돌연변이체(null mutant)의 감수성은 동위원소-보강에 의해 없어진다. 효모 coq3, coq7 및 coq9 널 돌연변이체를 W303 효모 유전적 배경(yeast genetic background) (WT)에서 제조하였다. 효모 균주를 YPD 배지 (1% 박토-효모(Baco-yeast) 추출물, 2% 박토-펩톤, 2% 덱스트로스)에서 배양하고, 대수 증식기 성장(log phase growth) (OD600nm=0.1-1.0) 중인 것들을 회수하였다. 세포를 멸균수로 2회 세정하고, 포스페이트 완충액 (0.10 M 소듐 포스페이트, pH 6.2, 0.2% 덱스트로스)에서 OD600nm=0.2로 재현탁하였다. 샘플을 취하여, 0.20 OD/㎖에서 시작하여 1:5의 단계식 희석물들을 YPD 플레이트 배지에 평판배양하여, 0시간 미처리 대조군을 제공하였다 (상부 좌측 패널에 나타냄). 지정된 지방산을 200 μM의 최종 농도로, 포스페이트 완충액 중 효모 20 ㎖에 첨가하였다. 2시간, 4시간, 및 16시간째에 샘플을 취하고, 1:5 단계식 희석물들을 제조하고, YPD 플레이트 배지에 스포팅(spotting)하였다. 30℃에서 2일간 배양한 후, 사진촬영을 하였다. 이 패널은 서로 다른 날짜에 수행한, 2개의 독립적인 분석법의 대표예이다.
도 4. 동위원소-보강된 D4-리놀렌산으로 처리된 효모 coq 돌연변이체는 PUFA-매개의 세포 사멸에 대해 내성을 나타낸다. 100 ㎕ 분취물을 1시간, 2시간, 및 4시간째에 취하고, 희석 후 YPD 플레이트에 도말(spreading)하는 점을 제외하고는, 지방산 감수성 분석법을 도 3에서 기술한 바와 같이 수행하였다. 2일 내지 2.5일 후에 사진촬영을 하고, 콜로니의 수를 계수하였다. 효모 균주는 야생형 (원형), atp2 (삼각형), 또는 coq3 (사각형)를 포함한다. 지방산 처리는 올레산 C18:1 (실선), 리놀렌산, C18:3, n-3 (파선) 또는 11,11,14,14-D4-리놀렌산, C18:3, n-3 (점선)을 포함한다.
도 5. GC-MS에 의한 지방산 메틸 에스테르 (FAME) 표준의 분리 및 검출. FAME를 기술한 바와 같이 제조하였으며 (Moss CW, Lambert MA, Merwin WH. Appl . Microbiol. 1974; 1, 80-85), 지시된 양의 유리 지방산 및 200 ㎍의 C17:0 (내부 표준)을 메틸화 및 추출 처리하였다. 샘플 분석은 DB-왁스 컬럼 (0.25 mm X 30 m X 0.25-m 필름 두께) (Agilent, catalog 122-7031)이 구비된 Agilent 6890-6975 GC-MS에서 수행하였다.
도 6. 효모에 의한, 외부 공급된 지방산의 섭취. WT (W303) 효모를 대수 증식기에서 회수하고, 200 μM의 지정된 지방산의 존재 하에 0시간 또는 4시간 동안 인큐베이션하였다. 기술한 바와 같이, 효모 세포를 회수하고, 멸균수로 2회 세정한 다음, 알칼리 메타노라이시스(methanolysis) 및 사포닌화 처리를 하고, 지질을 추출하였다 (Moss CW, Lambert MA, Merwin WH. Appl . Microbiol . 1974; 1, 80-85; (Shaw , 1953 Shaw, W. H. C; Jefferies, J. P. Determination of ergosterol in Yeast. Anal Chem 25: 1130; 1953). 각각의 지정된 지방산은 OD600 ㎚ 효모 당 ㎍으로 제공되며, C17:0 내부 표준의 회복에 대해 보정하였다.
도 7. 02 소비의 카이네틱스(kinetics)는 37℃에서 40 mM AMVN에 의해 개시된 클로로벤젠에서의 0.71 M LA (플롯 1 및 2) 및 0.71 M D2-LA (플롯 3)의 산화를 동반하였다. 플롯 2 - 0.23 mM HPMC를 0.71 M LA에 첨가하였다.
도 8. 혼합 조성에 대한 클로로벤젠 용액 중 LA 및 D2-LA 혼합물의 산화 속도 의존성. 조건: [LA] + [11,11-d2-LA] = 0.775 M; [AMVN] = 0.0217 M; 37℃. RIN = (1.10±0.08) x 10-7 M/sec.
도 9. 고도불포화된 지방산의 비스-알릴릭 위치에서의 동위원소 보강은 지질의 자가산화를 저하한다. 야생형, 효모 Q-less coq3, 또는 호흡 결함성 cor1 널 돌연변이체를 서로 다른 비율의 PUFA에서 200 μM의 LA 및 D2-LA의 존재 하에 인큐베이션하였다. 0.2 OD/㎖에서 시작한 단계식 희석물 (1:5)을 YPD 고형 플레이트 배지에 스포팅하였다. 0시간 미처리 대조군을 상부 좌측에 나타낸다. 30℃에서 배양.
도 10. 고도불포화된 지방산의 비스-알릴릭 위치에서 동위원소 보강은 지질 자가산화를 저하한다. 야생형, 효모 Q-less coq3, 또는 호흡 결함 cor1 널 돌연변이체를 서로 다른 비율의 PUFA에서 200 μM의 ALA 및 D4-LA의 존재 하에 인큐베이션하였다. 0.2 OD/㎖에서 시작한 단계식 희석물 (1:5)을 YPD 고형 플레이트 배지에 스포팅하였다. 30℃에서 배양.
도 11. GC-MS 분석한 효모 추출물의 크로마토그램. 서로 다른 선(trace)은 각각 0시간 및 4시간째를 나타낸다. 각각의 FAME (C18:1, C18:3 및 D4-리놀렌)의 피크 영역을 C17:0 표준의 피크 영역으로 나누고, 보정 곡선으로 정량화하였다. 내인성 16:0 및 16:1은 거의 변하지 않는 한편, 외부에서 첨가한 지방산은 크게 증가하였다.
도 12. H-PUFA 및 D-PUFA 처리한 MVEC 세포의, 파라콰트(paraquat)에 의한 급성 중독 후의 생존율. 시험한 세포 유형 모두에 대해, D-PUFA는 대조군과 비교해 보호 효과를 가졌으며, 이는 MVEC 세포에 대한 도면에 나타난 것과 유사하였다.
도 13. 조직의 중수소 농화를 보여주는, 1:1 D2-LA/D4-ALA의 동물 투여량 연구.
도 14. 지방 분포의 변화를 비교한, 1:1 D2-LA/D4-ALA의 동물 투여량 연구.
도 15. 조직의 중수소 농화를 보여주는 1:1 D2-LA/ALA의 동물 투여량 연구.
도 16. 90-일 동물 투여량 연구 후의 대조군의 간 지방 프로파일.
도 17. 간 지방 프로파일 및 중수소 농화를 보여주는, 1:1 D2-LA/D4-ALA의 동물 투여량 연구.
도 18. D2-LA를 이용한 90-일 동물 투여량 연구 후, 간 지방 프로파일.
도 19. 뇌 지방 프로파일 및 중수소 농화를 보여주는, 1:1 D2-LA/D4-ALA의 동물 투여량 연구.
도 20. 뇌 지방 프로파일 및 중수소 농화를 보여주는, 1:1 D2-LA/ALA의 동물 투여량 연구.
도 21. 90-일 동물 투약 연구 후, 대조군의 뇌 지방 프로파일.
도 22. 인간 프라탁신 (I154F)의 돌연변이된 형태를 가진 m-섬유아세포에서 LA (H v. D)의 용량 반응.
도 23. 인간 프라탁신 (I154F)의 돌연변이된 형태를 가진 m-섬유아세포에서, D-PUFA, 이데베논, 및 이들의 조합의 용량 반응.
도 24. 인간 프라탁신 (I154F)의 돌연변이된 형태를 가진 m-섬유아세포에 대한, D-PUFA 전처리 용량 반응.
본원에서 사용하는 바와 같이, 약어는 하기와 같이 정의한다:
αLnn 알파-리놀렌산
4-HHE 또는 HHE 4-하이드록시헥스-2-에날
4-HNE 또는 HNE 4-하이드록시논-2-에날
AA 아라키돈산
AcOH 아세트산
ALA 알파-리놀렌산
AMVN 2,2'-아조비스(2,4-다이메틸발레로니트릴)
BD 양극성 장애
D 중수소화된
D1 모노-중수소화된
D2 다이-중수소화된
D2-LA 다이-중수소화된 리놀레산
D3 트리-중수소화된
D4 테트라-중수소화된
D5 펜타-중수소화된
D6 헥사-중수소화된
DAD 진성 당뇨병 및 난청(deafness)
DHA 도코사헥사엔산 (22:6; n-3)
DMF 다이메틸포름아미드
DS 다운증후군
EPA 에이코사펜타엔산 (20:5; n-3)
EtOAc 에틸 아세테이트
EtOH 에탄올
FA 프리드리히 운동실조(Friedreich's ataxia)
FAME 지방산 메틸 에스테르
HPMC 6-하이드록시-2,2,5,7,8-펜타메틸벤조크로만
H-PUFA 비-중수소화된 고도불포화된 지방산
IP 복강내
IR 적외선
KIE 카이네틱 동위원소 효과
LA 리놀레산
LDL 저밀도 지질단백질
LHON 레버 유전성 시신경 병증
MELAS 미토콘드리아 근질환, 뇌병증, 유산 산증, 및 뇌졸중 증후군(mitochondrial myopathy, encephalopathy, lactic acidosis, and stroke syndrome)
MERRF 불균일 적색근섬유 증후군과 연관된 근간대성 간질 (Myoclonus Epilepsy Associated with Ragged-Red Fibers syndrome)
MIDD 모계 유전성 당뇨병 및 난청(Maternally inherited diabetes and deafness)
MNGIE 미토콘드리아 신경위장관 뇌근육병증(mitochondrial neurogastrointestinal encephalomyopathy)
MVEC 미세혈관 내피 세포(Microvascular endothelial cell)
NARP 신경병증, 운동실조, 색소망막염 및 안검하수(neuropathy, ataxia, retinitis pigmentosa, and ptosis)
NINCDS 신경학적 및 의사소통적 장애 및 뇌졸중 (Neurological and Communicative disorder and stroke)
Ox-Phos 산화적 인산화
PUFA(s) 고도불포화된 지방산(들)
RIN 개시 속도
ROS 반응성 산소종
Rox 산화 속도
RPE 망막 색소 상피(Retinal pigment epithelium)
SNOMED 임상코드시스템(Systematized Nomenclature of Medicine)
TDMS 독성 시험 자료 관리 시스템(Toxicology Data Management System)
TH 티로신 하이드록실라제
THF 테트라하이드로푸란
TLC 박층 크로마토그래피
V-SMOW 빈 표준 평균 바닷물(Vienna standard mean ocean water)
WT 야생형
X-ALD X-연관성 부신백질형성장애(X-linked Adrenoleukodystrophy)
YPD 1% 박토-효모 추출물, 2% 박토-펩톤, 2% 덱스트로스를 포함하는 배지
에너지 프로세싱 손상 장애 및 미토콘드리아 결함
미토콘드리아 장애는 (미토콘드리아 DNA 및 핵 DNA 모두에서의) 유전자 돌연변이 뿐만 아니라 환경적 인자들에 의해 야기될 수 있다. 미토콘드리아 결함 또는 미토콘드리아 호흡 결함 질환은 미토콘드리아 막에서 발생하는 미토콘드리아 호흡 결함과 같이 미토콘드리아 막 구성원의 산화에 의해 야기되는 질환 및 장애이다. 막의 기능성은 전반적인 미토콘드리아 기능에 중요하다. 산화적 인산화 (Ox-Phos) 경로는 리놀레산-함유 인지질 카디오리핀이 풍부한 미토콘드리아 내막에 풍부하게 위치한다. 따라서, ROS 처리에서의 임의의 불균형이 이러한 막의 PUFA 및 다른 막의 PUFA의 자가산화를 증가시켜서, 반응성 카르보닐 화합물의 농도를 높일 수 있다. 이들 중 일부는 언커플링 단백질-2 (UCP-2)의 활성화/탈활성화, 세포자살 등과 같은 많은 과정들을 개시, 상향조절, 및 하향조절할 수 있다. 상당수의 질환이 미토콘드리아 기능이상과 연관되어 있다. 이들 질환으로는, 코엔자임 Q 결핍; 진성 당뇨병 및 난청(DAD), 및 모계 유전성 당뇨병 및 난청(MIDD); 프리드리히 운동실조(FA); 레버 선천성 흑암시(Leber's congenital amaurosis); 레버 유전성 시신경 병증(LHON); 리증후군(Leigh syndrome); 미토콘드리아 근질환, 뇌병증, 유산 산증, 및 뇌졸중(MELAS) 증후군; 미토콘드리아 신경위장관 뇌근육병증 (MNGIE); 불균일 적색근섬유와 연관된 근간대성 간질(MERRF) 증후군; 근육신경학적 위장관 뇌병증(Myoneurogenetic gastrointestinal encephalopathy, MNGIE) 및 신경병증; 신경병증, 운동실조(ataxia), 색소망막염, 및 안검하수(NARP); 시신경병증(optic neuropathies) 및 눈근육마비(opthalmoplegias); 월프-파킨슨-화이트 증후군(Wolff-Parkinson-White syndrome) 및 다른 심근병증(cardiomyopathy); X-연관성 부신백질형성장애(X-ALD), 뿐만 아니라 근골격계 질환 (지질 근육병증, 만성 피로, 섬유근통 증후군); 신장 질환 (판코니 증후군(Fanconi's syndrome) 및 사구체성신증(glomerulonephropathy)); 혈액 질환 (피어슨 증후군(Pearson's syndrome)), 및 뇌질환 (편두통, 발작, 및 뇌졸중)을 포함하나, 이로 한정되지 않는다. Santos et al. Antioxidants & Redox Signaling (2010), 13:5, 651-690; Meier et al. J. Neurol. (2011) PMID: 21779958; Marobbio et al. Mitochondrion (2011) PMID: 21782979; Orsucci et al. Curr . Med . Chem . (2011) 18:26, 4053-64; Lynch et al. Arch. Neurol . (2010) 67:8, 941-947; Schultz et al. J. Neurol . (2009) 256 Suppl. 1 :42-5; Drinkard et al. Arch . Phys . Med . Rehabil . (2010) 91 :7, 1044-1050; Berger et al. Brain Pathol. (2010) 20:4, 845-856; Singh et al. Brain Pathol. (2010) 20:4, 838-844; Lopez-Erauskin et al. Ann Neurol . (2011) 70, 84-92를 참조한다. 이들 및 다른 미토콘드리아 질환들은 ROS 농도를 증가시키고, 지질과 같은 세포 구성분의 손상을 필연적이면서도 지속적으로 증가시킨다 (McKenzie M et al, Neurochem Res 2004;2 :589-600). 예를 들어, 척수 및 다른 조직들의 초기 산화적 손상이 X-ALD에서 신경퇴화의 기저가 되는 지질 및 아미노산 과산화 바이오마커를 사용해 관찰된 바 있다 (Fourcade S. et al, Human Mol Genetics 2008; 77: 1762-1773).
보다 구체적으로는, 코엔자임 Q 결핍은 신경계 질환 (운동장애(dyskinesia), 운동실조); 근골격계 질환 (근육 약화, 신경근 질환); 대사 질환 등을 비롯하여 많은 질환들과 관련되어 있다. Q10은 산화적 스트레스를 조절하는 데 중요한 역할을 한다. Q10은 PUFA 과산화 및 형성된 산물의 독성을 통한 PUFA 독성 증가와 연관 있는 것으로 보인다 (Do TQ et al, PNAS USA 1996; 3:7534-7539). 코엔자임 Q10 결핍을 가진 대상을 동정하기 위한 여러 가지 많은 진단 테스트들이 당해 기술분야에 알려져 있다. FA에서, 미토콘드리아 단백질인 프라탁신(frataxin)의 결핍은 하버-바이스-펜톤-형 공정(Haber-Weiss-Fenton-type processes) 및 호흡 사슬의 고장 둘 다를 통해 미토콘드리아 내 철 축적과 결과적으로 산화적 스트레스의 증가를 초래한다 (Bradley JL et al, Hum. Mol. Genet. 2000; :275-282). 지질 과산화는 FA에서 증가하며, 이러한 과산화의 수준을 감소시키는 것은 강한 보호 효과를 가진다 (Navarro JA et al, Hum. Mol. Genet. 2010;7P:2828-2840). DAD 및 MIDD는 상당히 상승된 산화적 스트레스 수준을 특징으로 한다 (Aladaq I et al, J. Laryngol. Otol. 2009;725:957-963). 이들, 및 많은 다른 미토콘드리아 질환은 종종 미토콘드리아 및 지질 방울 모두의 축적을 특징으로 하며, 이는 지질 과산화를 증가시킨다 (Narbonne H et al, Diabetes Metab. 2004;50:61-66). LHON 및 레버 증후군과 같은 병태들은 미토콘드리아 NADH 탈수소화효소의 서브유닛을 암호화하는 유전자의 돌연변이로 인한 것으로서, 복합체 I의 성능을 손상시키고 ROS 발생의 증가를 초래한다 (Wallace DC Science 1999,283: 1482-1488). MERRF는 산화적 스트레스 수준의 상승 및 비정상적인 지질 저장 모두와 관련이 있다 (Wu SB et al, Mol. Neurobiol. 2010;47 :256-266). MNGIE 및 NARP는 다른 2가지 유사한 예들이다 (Wallace DC Science 1999,283: 1482-1488). 로렌조 오일 및 저지방 식이요법의 조합으로 진행을 늦출 수 있는 X-ALD는 ROS 과다생성 및 ROS 제거(ROS scavenging)의 결함 모두와 연관이 있다 (Al-Omar MA. J. Herb. Pharmacother. 2006;6: 125-134).
산화적 스트레스와 관련된 정신적 장애
다운 증후군 ( DS )
DS (21번 염색체의 3염색체성)는 조로, 및 알츠하이머 질환과 유사한 정신 지체와 관련이 있다. 자가면역 질환 및 백내장의 발생이 또한 증가하며, 이는 DS 환자에서 산화적 스트레스의 증가를 나타낸다 (Jovanovic SV, et al. Free Rad . Biol. Med. 1998; 25: 1044-1048). 21번 염색체는 Cu/Zn SOD 및 아밀로이드 베타-펩타이드를 암호화하며, 그래서, DS는 이들 유전자 산물 및 대사물질의 초과, 특히 과량의 H202를 수반하는, 카탈라제에 대한 SOD의 비율 증가를 특징으로 한다 (Sinet PM. Ann . NY Acad . Sci. 1982; 396:83-94). DS 환자에서, 단백질 및 지질 산화 (MDA, HNE 등)의 마커와, 진행된 당화 및 지질산화 최종산물이 상당히 증가한다 (Busciglio J, Yankner BA. Nature 1995; 378:116-119; Odetti P, et al. Biochem . Biophys. Res . Comm. 1998; 243:849-851). 미토콘드리아 기능이상은 또한, 다운증후군 치매의 병인론(etiology)과 관련이 있다 (Coskun et al. Journal of Alzheimer 's Diseases (2010) 20, S293-S310). DS에서 산화적 스트레스의 중요성은 항산화제를 이용함으로써 산화의 부작용을 저하하려는 광범위한 시도를 이끌었지만; 근래의 랜덤화된 시도들은 항산화제 보충제의 효능에 대한 아무런 증거도 밝혀내지 못하였다 (Ellis JM, et al. Brit . Med . J. 2008; 55(5:594-597). 다운 증후군 환자는 표준 염색체 테스트에 의해 동정할 수 있다.
정신분열증 및 양극성 장애( BD )
PUFA는 신경발달, 및 정신분열증과 같은 일부 정신 질환에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. DHA, 에이코사펜타엔산(EPA) 및 AA는 특히, 이러한 면에서 중요하다. 정신분열증에서, EPA 보충과 일부 증후군의 개선 간에 양의 상관관계가 존재한다 (Luzon-Toro B, et al. Neurol . Psychiatr . Brain Res . 2004; 77: 149-160). 정신분열증 및 BD 모두에서 산화적 스트레스 및 HNE 수준이 상당히 증가한다 (Wang JF, et al. Bipolar Disorders 2009; 77:523-529). 시냅스 기능이상은 AD, ALS, PD 등과 같은 신경병증에서 초기 병원성 현상(pathogenic event)인 것으로 알려져 있다 (LoPachin RM et al Neurotoxicol. 2008; 2 :871-882). 이러한 시냅스독성의 분자 메커니즘은 알려져 있지 않지만, 공개된 증거는, 이들 질환이 산화적 스트레스, PUFA 과산화 (도 1), 및 아크롤레인(acrolein)과 4-HNE와 같은 α,β-불포화된 카르보닐 유도체의 후속적인 방출(liberation)을 수반하는 보편적인 병리생리학적 케스케이드를 특징으로 함을 제안한다.
자폐증
자폐증은 원인 불명의 발달 장애의 한 유형의 패밀리(family)이다. 상기 장애는 행동, 발달, 신경병리학적 및 감각의 비정상을 특징으로 하며, 통상 2세 내지 10세 사이에 진단되며, 최고 유병률은 5세 내지 8세의 어린이에서 관찰된다. 산화적 스트레스에 대적하는 불능화(inability)가 자폐증 질환 상태의 촉진제로서 제안된 바 있다 (Bowers et al. "Glutathione pathway gene variation and risk of autism spectrum disorders"; J. Neurodev. Disord.; 2011; March 5th e-pub.) 실제로, 산화적 스트레스에 대한 취약성의 증가는 상기 장애의 하나의 일관된 개념으로 간주되었다 (Ratajczak. "Theoretical Aspectes of Autism: Biomarkers - A Review" J. Immunotoxicol. 2011; 8(1):80-94). 더욱이, 비정상적인 미토콘드리아 대사가 또한 상기 장애의 일반적인 분자적 토대(underpinning)로서 규정된 바 있다 (Lintas et al. "Genome-wide expression study in autism spectrum disorder, Rett syndrome, and Down syndrome" Neurobiol Dis. 2010 Dec. 2 e-pub). 연구들에서 또한, 자폐증 환자가 연령-매칭된 대조군과 비교해 PUFA 수준을 비롯한 지방산 수준을 매우 상이하게 가지는 것으로 나타났다 (El-Ansary et al. "Plasma fatty acids as diagnostic markers in autistic patients from Saudi Arabia." Lipids in Health and Disease 2011, 10:62, published online 21 April 2011).
헌팅턴 질환
헌팅턴 질환(HD)은, 행동 장애, 정신, 및 인지 장애로 인한 점진적 불능(progressive disability)을 초래하는, 선택적인 신경 퇴행을 특징으로 하는 신경퇴행성 질환이다. HD는 헌팅틴 유전자(huntingtin gene)에서 시토신-아데닌-구아닌 (CAG) 반복 확장으로 인해, 뉴런의 기능이상, 및 전사 손상(transcriptional impairment), 흥분성 독성(excitotoxicity), 산화적 손상, 염증, 세포자살, 및 미토콘드리아 기능이상에 영향을 줌으로써 결국엔 세포 사멸을 야기하는 돌연변이 단백질을 초래한다. 산화적 스트레스-관련 손상은 단백질 및 데옥시리보핵산(DNA)과 함께 지질에 발생한다. 퍼옥시좀 증폭제-활성화된 수용체 감마 공동활성화제-1α (PGC-1α)의 발현 및 기능 손상 또한, 상기 질환과 연관이 있다. PGC-1α의 결핍은 산화적 스트레스에 대한 취약성 뿐만 아니라 스트리아탈 퇴행(striatal degeneration)을 증가시킨다. 항산화제는 HD의 유전자도입 마우스 모델에서 질환의 진행을 늦추는 데 효과적이며, 상기 질환에서 산화적 스트레스의 중요성을 더욱 뒷받침해준다. 더욱이, ROS 및 이러한 화학종에 의한 손상은 HD에서 뉴런 소실에 대한 주 기여요인으로 인지된다. Johri et al, Biocehmica et Biophysica Acta (2011), doi: 10.1016/j/bbadis.2011.11.014; Patten et al., Journal of Alzheimer's Disease (2010) 20: S357-S367을 참조한다.
본 발명의 일부 측면들은, (1) 필수 PUFA가 지질 막, 특히 미토콘드리아 막의 적절한 기능에 필수적이지만, 이들의 고유 문제, 즉, ROS에 의해 산화되어 유해한 결과를 초래하는 경향이 에너지 프로세싱 손상 장애 및 미토콘드리아 결함과 연관이 있음을 이해함으로써; (2) 항산화제 처리에 대한 PUFA 과산화 산물 (반응성 카르보닐)의 진행 및 안정성의 확률적인 특성(stochastic nature)으로 인해 항산화제가 PUFA 과산화를 방지할 수 없음을 이해함으로써, 및 (3) ROS에 의한 PUFA 내 산화-취약 부위의 손상은, 이들의 유익한 물리적 특성 중 어느 것에도 해를 입히지 않으면서 이들이 이러한 산화에 덜 취약하도록 만드는 방법을 이용함으로써 극복될 수 있음을 이해함으로써 비롯된다. 본 발명의 일부 측면들은 산화에 가장 문제가 되는 필수 PUFA 및 PUFA 전구체의 부위들에서만 이를 달성하기 위해 동위원소 효과를 이용하는 것을 기술하고 있지만, 다른 측면들은 산화에 가장 문제가 되는 부위들 외에도 다른 부위들도 고려한다.
동위원소로 표지된 실시 양태들은 중요한 생물학적 과정에는 미미한 영향을 미치거나 또는 영향을 미치지 않아야 한다. 예를 들어, 생물학적 기질에 존재하는 동위원소의 자연적인 존재비는, 낮은 농도의, 동위원소로 표지된 화합물이 생물학적 과정에 무시할 만한 수준의 영향력을 가져야 함을 내포한다. 부가적으로는, 수소 원자는 물로부터 생물학적 기질로 병합되며, D20 또는 중수(heavy water)의 소비는 인간의 건강에 위협이 되지 않는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, "Physiological effect of heavy water." Elements and isotopes : formation , transformation , distribution. Dordrecht: Kluwer Acad. Publ. (2003) pp. 111-112 (70 kg의 사람은 심각한 결과 없이 4.8 ℓ의 중수를 마실 수 있음을 나타냄)를 참조한다. 더욱이, 동위원소로 표지된 많은 화합물은 진단 및 치료 목적을 위해 미국 식품 의약국의 승인을 받았다.
당해 기술분야의 당업자는, 다른 화학적 방법을 이용해 PUFA 내 산화-취약 부위를 보호함으로써 동일한 효과를 달성할 수 있음을 알 것이다. 소정의 PUFA 모방체는 천연 PUFA와 구조적 유사성을 가지는 한편, 구조적 보강으로 인해 ROS-에 의한 산화에 안정할 것이다.
조성물:
일부 실시 양태에서, 동위원소로 변형된 고도불포화된 지방산 또는 모방체는 하나 이상의 동위원소, 예를 들어 13C 및/또는 중수소로 보강되거나 또는 화학적으로 안정화된, 천연적인 PUFA와 구조적 유사성을 가진 화합물을 지칭한다. 일반적으로, 중수소가 보강에 사용되는 경우, 메틸렌 기의 1개의 수소 또는 2개 수소 모두가 보강될 수 있다.
본 발명의 일부 측면들은 1개, 수개, 또는 모든 비스-알릴릭 위치에서 중동위원소(heavy isotope)로 치환된, 필수 PUFA의 유사체인 화합물을 제공한다. 일부 실시 양태에서, 효소 전환 시 PUFA에서 비스-알릴릭 위치에 있게 될 CH2 기는 1개 또는 2개의 중동위원소로 치환된다. 이러한 화합물은 PUFA 산화가 질환 진행의 인자이거나 또는 이에 기여할 수 있는 질환의 예방 또는 치료에 유용하다.
비스-알릴릭 위치는 일반적으로 1,4-다이엔 시스템의 메틸렌 기에 상응하는 고도불포화된 지방산 또는 이의 모방체의 위치를 지칭한다. 프로-비스-알릴릭 위치는 효소적 탈포화 시, 비스-알릴릭 위치가 되는 메틸렌 기를 지칭한다.
일부 실시 양태에서, PUFA의 화학적 아이덴터티(chemical identity), 즉, 동위원소 치환, 또는 동위원소 치환을 모방하는 치환과는 상관없이 화학적 구조는 흡수 시 동일하게 존재한다. 예를 들어, 필수 PUFA, 즉 인간과 같은 포유류가 일반적으로 합성하지 못하는 PUFA의 화학적 아이덴터티는 흡수 시 동일하게 남아 있을 수 있다. 그러나, 일부 경우에, PUFA는 포유류에서 더 연장/탈포화되어, 흡수 시 화학적 아이덴터티가 바뀔 수 있다. 모방체와 유사하게, 화학적 아이덴터티는 변하지 않은 채 있을 수 있거나 또는 유사한 연장/탈포화가 진행될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 연장되고 선택적으로는 탈포화된 PUFA는 흡수 및 추가적인 대사 시, 고도의 호모로그(homolog)로 지칭될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 자연적인 함유 수준은, 자연 상태의 동위원소의 자연적인 존재비에 대해, PUFA에 혼입될 수 있는 13C 및/또는 중수소와 같은 동위원소의 농도를 지칭한다. 예를 들어, 13C는 총 탄소 원자에서 13C 원자의 자연적인 존재비는 대략 1%이다. 따라서, PUFA에서의 자연적인 13C 함유 수준보다 높은 상대적인 탄소 백분율은, 각각의 PUFA 분자에서 하나 이상의 탄소 원자에 대해, 2%, 바람직하게는 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 13C와 같이, 총 탄소 원자에서 13C로 보강된 수준이 대략 1%인 자연적인 함유 수준보다 높을 수 있다. 다른 실시 양태에서, 총 탄소 원자의 13C 보강율은 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%이다.
수소에 관해, 일부 실시 양태에서, 중수소의 자연적인 존재비는 지구 해양의 전체 천연 수소의 대략 0.0156%이다. 따라서, 자연적인 존재비보다 중수소 함유율이 높은 PUFA는, 각각의 PUFA 분자에서 하나 이상의 수소 원자에 대해, 중수소 비율이 0.02%, 바람직하게는 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%와 같이, 수소 원자에서 중수소 보강 수준이 대략 0.0156%인 자연적인 함유 수준보다 높을 수 있다. 다른 실시 양태에서, 총 수소 원자의 중수소 보강율은 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%이다.
일부 측면에서, PUFA의 조성물은 동위원소로 변형된 PUFA 및 동위원소로 비변형된 PUFA를 둘 다 포함한다. 동위원소 순도는, a) 동위원소로 변형된 PUFA의 분자의 상대적인 수와 b) 동위원소로 변형된 PUFA와 중원자가 없는 PUFA 둘 다로 이루어진 총 분자를 비교한 것이다. 일부 실시 양태에서, 상기 동위원소 순도는 중원자를 제외하고는 모두 동일한 PUFA를 지칭한다.
일부 실시 양태에서, 동위원소 순도는, 동위원소로 변형된 PUFA + 중원자가 없는 PUFA 분자의 총 수에 대한, 조성물 내 동위원소로 변형된 PUFA 분자의 백분율을 지칭한다. 예를 들어, 동위원소 순도는, 동위원소로 변형된 PUFA + 중원자가 없는 PUFA로 이루어진 모든 총 분자수에 대한, 동위원소로 변형된 PUFA 분자의 비율로서, 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%일 수 있다. 다른 실시 양태에서, 상기 동위원소 순도는, 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%이다. 일부 실시 양태에서, PUFA의 동위원소 순도는 조성물 내 PUFA의 분자의 총 수의 약 10%-100%, 10%-95%, 10%-90%, 10%-85%, 10%-80%, 10%-75%, 10%-70%, 10%-65%, 10%-60%, 10%-55%, 10%-50%, 10%-45%, 10%-40%, 10%-35%, 10%-30%, 10%-25%, 또는 10%-20%일 수 있다. 다른 실시 양태에서, PUFA의 동위원소 순도는 조성물 내 PUFA의 분자의 총 수의 약 15%- 100%, 15%-95%, 15%-90%, 15%-85%, 15%-80%, 15%-75%, 15%-70%, 15%-65%, 15%-60%, 15%-55%, 15%-50%, 15%-45%, 15%-40%, 15%-35%, 15%-30%, 15%-25%, 또는 15%-20%일 수 있다. 일부 실시 양태에서, PUFA의 동위원소 순도는 조성물 내 PUFA의 분자의 총 수의 약 20%-100%, 20%-95%, 20%-90%, 20%-85%, 20%-80%, 20%-75%, 20%-70%, 20%-65%, 20%-60%, 20%-55%, 20%-50%, 20%-45%, 20%-40%, 20%-35%, 20%-30%, 또는 20%-25%일 수 있다. 동위원소로 변형된 PUFA + 중원자가 없는 PUFA의 총 분자수 100개에서, 동위원소로 변형된 PUFA 분자가 2개일 경우, 2개의 동위원소로 변형된 분자에 포함된 중원자의 수와는 상관없이, 동위원소 순도는 2%일 것이다.
일부 측면에서, 동위원소로 변형된 PUFA 분자는, 메틸렌 기의 2개의 수소 중 하나가 중수소로 치환되는 경우와 같이 하나의 중수소 원자를 포함할 수 있으며, 이는 "D1" PUFA로 지칭될 수 있다. 유사하게는, 동위원소로 변형된 PUFA 분자는, 메틸렌 기의 2개의 수소가 모두 중수소로 치환되는 경우와 같이 2개의 중수소 원자를 포함할 수 있으며, 이는 "D2" PUFA로 지칭될 수 있다. 마찬가지로, 동위원소로 변형된 PUFA 분자는 3개의 중수소 원자를 포함할 수 있으며, "D3" PUFA로 지칭될 수 있다. 유사하게는, 동위원소로 변형된 PUFA 분자는 4개의 중수소 원자를 포함할 수 있으며, "D4" PUFA로 지칭될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 동위원소로 변형된 PUFA 분자는 5개의 중수소 원자 또는 6개의 중수소 원자를 포함할 수 있으며, 각각 "D5" 또는 "D6" PUFA로 지칭될 수 있다.
분자 내 중원자의 수, 또는 동위원소 하중(isotope load)은 다양할 수 있다. 예를 들어, 동위원소 하중이 상대적으로 낮은 분자는 약 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 중수소 원자를 포함할 수 있다. 동위원소 하중이 적당한 분자는 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 중수소 원자를 포함할 수 있다. 하중이 매우 높은 분자는, 모든 수소가 중수소로 치환될 수 있다. 따라서, 동위원소 하중은 각각의 PUFA 분자 내 중원자의 백분율을 지칭한다. 예를 들어, 상기 동위원소 하중은, 동일한 유형의 중원자가 없는 PUFA와 비교해, 동일한 유형의 원자 수의 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%를 차지할 수 있다 (예를 들어, 수소는 중수소와 "동일한 유형"일 것임). 일부 실시 양태에서, 상기 동위원소 하중은 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%일 것이다. PUFA 조성물의 동위원소 순도는 높지만 해당 분자 내 동위원소 하중이 낮을 경우에, 의도치 않은 부작용이 줄어들 것으로 예상된다. 예를 들어, 대사 경로는 동위원소 순도는 높지만 동위원소 하중은 낮은 PUFA 조성물을 사용함으로써 영향을 적게 받게 될 것이다.
당업자는 메틸렌 기의 2개의 수소 중 하나가 중수소 원자로 치환된 경우, 생성되는 화합물이 입체중심을 가질 수 있음을 쉽게 알게 될 것이다. 일부 실시 양태에서, 라세믹 화합물을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 다른 실시 양태에서, 거울상이성질체적으로 순수한 화합물을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 부가적인 실시 양태에서, 부분입체이성질체적으로 순수한 화합물을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%의 거울상이성질체성 과잉 및/또는 부분입체이성질체성 과잉을 가진 화합물의 혼합물을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 다른 실시 양태에서, 상기 거울상이성질체성 과잉 및/또는 상기 부분입체이성질체성 과잉은 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%이다. 일부 실시 양태에서, 키랄 분자와의 접촉이 산화적 손상을 약화시키기 위한 표적이 되는 경우와 같이, 실시 양태의 입체화학적으로 순수한 거울상이성질체 및/또는 부분입체이성질체를 이용하는 것이 바람직할 수 있다. 그러나, 많은 경우, 비-키랄 분자가 산화적 손상을 약화시키기 위한 표적이 된다. 이러한 경우, 실시 양태는 이들의 입체화학적 순도에 관한 염려 없이 이용될 수 있다. 아울러, 일부 실시 양태에서, 거울상이성질체와 부분입체이성질체의 혼합물은, 상기 화합물들이 산화적 손상을 약화시키기 위해 키랄 분자를 표적으로 하는 경우에도 사용할 수 있다.
일부 측면에서, 동위원소로 변형된 PUFA는 특정 조직에 상당량의 중원자를 부여한다. 따라서, 일부 측면에서, 중분자(heavy molecule)의 양은 조직 내 동일한 유형의 분자에 대한 일정 백분율일 것이다. 예를 들어, 중분자의 수는 동일한 유형의 분자의 총량의 약 1% 내지 100%일 수 있다. 일부 측면에서, 10% 내지 50%의 분자가 동일한 유형의 중분자로 치환된다.
일부 실시 양태에서, 필수 PUFA와 동일한 화학적 결합 구조를 가지지만 특정 위치에서 동위원소 조성이 상이한 화합물은 비치환 화합물과 상당히 그리고 유용하게 상이한 화학적 특성을 가질 것이다. ROS에 의한 산화를 비롯해 산화에 관한 특정 위치들은 도 1에 나타낸 바와 같이 필수 고도불포화된 지방산 및 이들의 유도체의 비스-알릴릭 위치를 포함한다. 하기 나타낸 비스-알릴릭 위치에서 동위원소로 보강된 필수 PUFA는 산화에 보다 안정할 것이다. 이에, 본 발명의 일부 측면들은 화학식 (1)의 화합물 또는 이의 염을 사용하는 특정 방법을 제공하며, 위치들은 탄소-13으로 추가로 보강될 수 있다. R1 = 알킬, H, 또는 양이온; m = 1-10; n = 1-5이며, 각각의 비스-알릴릭 위치에서, 하나 또는 2개의 Y 원자는 중수소 원자이며, 예를 들어,
Figure 112013107101794-pct00001
11,11-다이듀테로-cis,cis-9,12-옥타데카다이엔산 (11,11-다이듀테로-(9Z,12Z)-9,12-옥타데카다이엔산; D2-LA); 및 11,11,14,14-테트라듀테로-cis,cis,cis-9,12,15-옥타데카트리엔산 (11,11,14,14-테트라듀테로-(9Z,12Z,15Z)-9,12,15-옥타데카트리엔산; D4-ALA)이다. 일부 실시 양태에서, 중수소화 외에도 상기 위치들은 자연적인 함유 수준이 넘는 동위원소 존재비의 수준에서 각각 탄소-13에 의해 추가로 보강될 수 있다. PUFA 분자에서 모든 다른 탄소-수소 결합은 선택적으로는 중수소 및/또는 탄소-13을 자연적인 함유 수준 또는 그 이상으로 포함할 수 있다.
필수 PUFA는 탈포화 및 신장에 의해 고차 호모로그로 생화학적으로 전환된다. 따라서, 전구체 PUFA에서 비스-알릴릭이 아닌 일부 위치들은 생화학적 변환 시 비스-알릴릭으로 될 것이다. 그런 다음, 이러한 위치들은 ROS에 의한 산화를 비롯하여 산화에 민감하게 된다. 다른 실시 양태에서, 기존의 비스-알릴릭 위치 이외에 이러한 프로-비스-알릴릭 위치는 하기 나타낸 바와 같이 동위원소 치환에 의해 보강된다. 이에, 본 발명의 이러한 측면은 화학식 (2)의 화합물 또는 이의 염의 용도를 제공하며, 각각의 비스-알릴릭 위치와 각각의 프로-비스-알릴릭 위치에서, X 또는 Y 원자 중 하나 이상은 중수소 원자일 수 있다. R1 = 알킬, 양이온, 또는 H; m = 1-10; n = 1-5; p = 1-10.
Figure 112013107101794-pct00002
중수소화 외에도 상기 위치들은 자연적인 함유 수준보다 높은 동위원소 함유 수준으로 각각 탄소-13에 의해 추가로 보강될 수 있다. PUFA 분자에서 모든 다른 탄소-수소 결합은 선택적으로는 중수소 및/또는 탄소-13을 자연적인 함유 수준 또는 그 이상으로 포함할 수 있다.
서로 다른 비스-알릴릭 위치에서 PUFA의 산화는 서로 다른 세트의 산화 산물을 제공한다. 예를 들어, 4-HNE는 n-6 PUFA로부터 형성되는 반면, 4-HHE는 n-3 PUFA로부터 형성된다 (Negre-Salvayre A, et al. Brit. J. Pharmacol. 2008; 755:6-20). 이러한 산화의 산물은 서로 다른 조절, 독성, 신호전달 특성 등을 가진다. 따라서, 이러한 산화의 상대적인 범위를 조절하는 것이 바람직하다. 이에, 본 발명의 일부 측면들은, PUFA의 비스-알릴릭 또는 프로-비스-알릴릭 위치에서 Y1-Yn 및/또는 X1-Xm의 쌍(pair) 중 어느 한 쌍이 중수소 원자를 포함할 수 있도록, 하기 나타낸 바와 같이 서로 다른 위치에서 산화의 상대적인 수율을 조절하기 위해, 선택된 비스-알릴릭 또는 프로-비스-알릴릭 위치에서 무거운 안정한 동위원소로 차별적으로 보강된 화학식 (3)의 화합물 또는 이의 염의 용도를 제공한다. R1 = 알킬, 양이온, 또는 H; m = 1-10; n = 1-6; p = 1-10.
Figure 112013107101794-pct00003
중수소 외에도 상기 위치들은 탄소-13에 의해 추가로 보강될 수 있다. PUFA 분자 내 모든 다른 탄소-수소 결합은 중수소를 자연적인 함유 수준으로 또는 이보다 높게 포함할 수 있다. 전술한 구조에서 파선은 다양한 수의 이중 결합, 다양한 총 탄소 수, 및 비스-알릴릭 및 프로-비스-알릴릭 위치에서 보강된 동위원소의 다양한 조합을 가진 PUFA를 나타낸다.
전술한 화합물의 정확한 구조는 하기에 나타나 있으며, 동위원소가 보강된 n-3 (오메가-3) 및 n-6 (오메가-6) 필수 고도불포화된 지방산 둘 다를 제공하며, PUFA는 이들로부터 탈포화/신장에 의해 생화학적으로 만들어진다. 이들 화합물 중 어느 하나는 산화를 늦추는 데 사용될 수 있다. 하기 화합물에서, PUFA는 산화 감수성 위치, 및/또는 생화학적 탈포화/신장 시 산화에 민감하게 될 수 있는 위치에서 동위원소로 보강된다. R1은 H, 알킬, 또는 양이온일 수 있으며; R2는 H 또는 D일 수 있으며; *는 12C 또는 13C를 나타낸다.
D-리놀레산은 하기를 포함한다:
Figure 112013107101794-pct00004
.
하기 과-중수소화된 리놀레산은 예를 들어, 중수소 및/또는 탄소-13을 포함하는 배지에서 배양함으로써, 미생물학적 방법에 의해 생성될 수 있다.
Figure 112013107101794-pct00005
D-아라키돈산은 하기를 포함한다:
Figure 112013107101794-pct00006
.
하기 과-중수소화된 아라키돈산은 예를 들어, 중수소 및/또는 탄소-13을 포함하는 배지에서 배양함으로써, 미생물학적 방법에 의해 생성될 수 있다.
Figure 112013107101794-pct00007
D-리놀렌산은 하기를 포함한다:
Figure 112013107101794-pct00008
Figure 112013107101794-pct00009
.
하기 과-중수소화된 리놀렌산은 예를 들어, 중수소 및/또는 탄소-13을 포함하는 배지에서 배양함으로써, 미생물학적 방법에 의해 생성될 수 있다.
Figure 112013107101794-pct00010
본 발명의 일부 측면에서, 필수 또는 비필수든지 간에, 식이요법으로 흡수되어 체내에서 사용될 수 있는 임의의 PUFA를 이용할 수 있다. 필수 또는 비-필수 PUFA 또는 전구체의 경우, 보충되는 안정화된 물질은 다른 식이요법 흡수 및 생물제조와 경쟁하여, 질환을 야기하는 화학종의 이용가능한 농도를 감소시킬 수 있다.
본 발명의 일부 측면에서, 상기 구조들로 기술한 바와 같이 산화 민감성 위치에서 동위원소로 보강된 PUFA는 적절한 동위원소, 중수소 및/또는 탄소-13의 자연적인 존재비와 비교해 상기 위치에서 농축된 중동위원소이다.
일부 실시 양태에서, 개시 화합물은 동위원소 순도가 99% 이상까지 농축된다. 일부 실시 양태에서, 상기 위치들에서 중동위원소 농축은 50% 내지 99%의 중수소 및/또는 탄소-13이다.
일부 실시 양태에서, 약물 또는 보충제로서 식이요법을 통해 복용되는 경우, 변형된 지방산은, 에틸 에스테르 또는 글리세릴 에스테르와 같이 모 지방산 또는 모방체의 비-독성이면서 약제학적으로 적합한 에스테르를 포함하나 이로 한정되지 않는 프로드럭으로서 복용될 수 있다. 이러한 에스테르는 장에서 약물의 관용성(tolerance)과 소화에 일조하며, 에스테르 프로드럭을 흡수되는 약물의 활성 산 형태로 탈에스테르화하기 위해 장 내 고농도의 에스터라제에 의존한다. 그래서, 일부 실시 양태에서, 본 발명은 본원의 변형된 지방산의 프로드럭 에스테르를 포함한다. 시장, 영양학, 및 임상적 산업상 문헌에서 이러한 유형의 약물의 예로는, Glaxo 's Lovaza, (오메가 3 지방산 에스테르, EPA, DHA, 및 알파-리놀렌산의 혼합물), Abbott's Omacor (오메가-3-지방산 에스테르), 및 대부분의 어유 보충제(fish oil supplement) (DHA 및 EPA 에스테르)를 포함한다. 일부 측면에서, 에스테르 프로드럭을 조직 또는 세포에 혼입하는 것은 신체 구성분으로서 사용될 변형된 모 PUFA의 혼입을 지칭한다.
일부 실시 양태에서, 안정화된 조성물은 이들의 원소 조성을 바꾸지 않으면서 천연적인 지방산을 모방한다. 예를 들어, 치환기는 화학적 원자가 껍질을 유지할 수 있다. 일부 실시 양태는 천연적인 지방산, 모방체, 및 이들의 에스테르 프로드럭을 포함하며, 이들은 특정 질환의 메커니즘을 예방하는 데 효과적이도록 화학적으로 변형되지만 물질의 원소적 조성을 바꾸지 않는 방식 (예컨대 동위원소 치환)으로 변형된다. 예를 들어, 중수소는 동일한 원소 수소의 형태이다. 일부 측면에서, 이들 화합물은 원소의 조성을 유지하며, 산화되지 않게 안정화된다. 산화되지 않게 안정화된 일부 화합물들은 산화 민감성 유전자좌(loci)에서 안정화된다. 일부 화합물들은 비스-알릴릭 탄소 수소 결합 등에서 중동위원소 치환을 통해 산화되지 않게 안정화된다.
다른 실시 양태에서, PUFA의 산화-취약성 비스-알릴릭 위치는 비스-알릴릭 수소-활성화 이중 결합을 보다 멀리 이동시켜서, 비스-알릴릭 위치를 제거하면서 하기 나타낸 바와 같이 소정의 PUFA 유동성은 유지함으로써, 수소 분리(hydrogen abstraction)에 대해 보호될 수 있다. 이들 PUFA 모방체는 비스-알릴릭 위치를 가지지 않는다.
Figure 112013107101794-pct00011
다른 실시 양태에서, PUFA의 산화-취약성 비스-알릴릭 위치는 원자가가 II인 헤테로원자를 사용하여, 하기 나타낸 바와 같이 비스-알릴릭 수소를 제거함으로써, 수소 분리에 대해 보호될 수 있다. 이들 PUFA 모방체 또한, 비스-알릴릭 수소를 가지지 않는다.
Figure 112013107101794-pct00012
다른 실시 양태에서, PUFA 모방체, 즉, 천연 PUFA와 구조적으로 유사하지만 구조적 차이로 인해 산화될 수 없는 화합물을 전술한 목적에 사용할 수 있다. PUFA의 산화-취약성 비스-알릴릭 위치는 하기 나타낸 바와 같이, 다이-메틸화 또는 할로겐화에 의해 수소 분리에 대해 보호될 수 있다. 메틸기에 있는 수소 원자는 선택적으로는 불소와 같은 할로겐, 또는 중수소일 수 있다. 이들 PUFA 모방체는 비스-알릴릭 위치에서 다이메틸화된다.
Figure 112013107101794-pct00013
다른 실시 양태에서, PUFA의 산화-취약성 비스-알릴릭 위치는 하기에 나타내는 바와 같이 알킬화에 의해 수소 분리에 대해 보호될 수 있다. 이들 PUFA는 비스-알릴릭 위치에서 다이알킬화된다.
Figure 112013107101794-pct00014
다른 실시 양태에서, 사이클로프로필 기가 이중 결합 대신에 사용되어, 하기에 나타내는 바와 같이 비스-알릴릭 위치를 제거하면서 산이 소정의 유동성을 가지게 할 수 있다. 이들 PUFA 모방체는 이중 결합 대신에 사이클로프로필 기를 가진다.
Figure 112013107101794-pct00015
다른 실시 양태에서, 적절한 형태의 1,2-치환 사이클로부틸 기가 이중 결합 대신에 사용되어, 하기에 나타내는 바와 같이 비스-알릴릭 위치를 제거하면서 산이 소정의 유동성을 가지게 할 수 있다. 이들 PUFA 모방체는 이중 결합 대신에 1,2-사이클로부틸 기를 가진다.
Figure 112013107101794-pct00016
이중 결합 대신에 1,2-사이클로부틸 기를 가진 모방체에 관한 전술한 실시 양태의 변형에서, 적절한 형태의 1,3-치환된 사이클로부틸 기가 이중 결합 대신에 사용되어, 비스-알릴릭 위치를 제거하면서 산이 소정의 유동성을 가지게 할 수 있다. 이들 PUFA 모방체는 이중 결합 대신에 1,3-사이클부틸 기를 가진다.
Figure 112013107101794-pct00017
특정 작용기는 소정의 다른 작용기와 등입체성(isosteric) 및/또는 생등입체성(bioisosteric)이라는 것은 의료 화학에서 잘 알려진 원리이다. 생동배체(bioisostere)는 화학적 화합물과 광범위하게 유사한 생물학적 특성을 생성하는 유사한 물리적 또는 화학적 특성을 가진 치환기 또는 기(group)이다. 예를 들어, 수소의 잘 알려진 동배체 및/또는 생동배체는 불소와 같은 할로겐을 포함하며; 알켄의 동배체 및/또는 생동배체는 알카인, 페닐 고리, 사이클로프로필 고리, 사이클로부틸 고리, 사이클로펜틸 고리, 사이클로헥실 고리, 티오에테르 등을 포함하며; 카르보닐의 동배체 및/또는 생동배체는 설폭사이드, 설폰, 티오카르보닐 등을 포함하며; 에스테르의 동배체 및/또는 생동배체는 아미드, 설폰산 에스테르, 설폰아미드, 설피닐산 에스테르, 설피닐아미드 등을 포함한다.
결과적으로는, PUFA 모방체는 또한, 등입체성 및/또는 생등입체성 작용기를 가진 화합물을 포함한다.
본 발명에 사용하기 위한 프로드럭으로서 PUFA 및/또는 PUFA 모방체를 제형하는 것이 유용할 수 있는 것으로 사료된다. 프로드럭은 약리학적 성분이며, 그 자체가 생물학적 활성을 가질 수 있지만, 투여 시, 상기 프로드럭은 생물학적 활성을 또한 발휘하는 형태로 대사된다. 서로 다른 유형의 프로드럭이 많이 알려져 있으며, 이들은 대사 시 이들의 세포 위치를 토대로 2가지 주 유형으로 분류할 수 있다. I형 프로드럭은 세포내에서 대사되는 것들이며, 한편 II형은 세포외에서 대사되는 것들이다. 카르복실산은 에스테르, 및 다양한 다른 작용기로 전환되어, 흡수, 분포, 대사, 및 분비와 같은 약리역학을 증대시킬 수 있는 것으로 잘 알려져 있다. 에스테르는 알코올 (또는 이의 화학적 등가물)과 카르복실산 (또는 이의 화학적 등가물)의 축합에 의해 형성되는, 카르복실산의 잘 알려진 프로드럭 형태이다. 일부 실시 양태에서, PUFA의 프로드로그로의 혼입을 위한 알코올 (또는 이들의 화학적 등가물)로는, 약제학적으로 허용가능한 알코올, 또는 대사 시 약제학적으로 허용가능한 알코올을 제공하는 화학물질을 포함한다. 이러한 알코올로는, 프로필렌 글리콜, 에탄올, 아이소프로판올, 2-(2-에톡시에톡시)에탄올 (Transcutol®, Gattefosse, Westwood, N.J. 07675), 벤질 알코올, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜 200, 폴리에틸렌 글리콜 300, 또는 폴리에틸렌 글리콜 400; 폴리옥시에틸렌 피마자유 유도체 (예를 들어, 폴리옥시에틸렌글리세롤트리리신올레에이트 또는 폴리옥실 35 피마자유 (Cremophor®EL, BASF Corp.), 폴리옥시에틸렌글리세롤 옥시스테아레이트 (Cremophor®RH 40 (폴리에틸렌글리콜 40 수소화된 피마자유) 또는 Cremophor®RH 60 (폴리에틸렌글리콜 60 수소화된 피마자유), BASF Corp.)); 포화된 폴리글리콜화된 글리세라이드 (예를 들어, Westwood, N.J. 07675 소재의 Gattefosse 사로부터 입수가능한 Gelucire® 35/10, Gelucire® 44/14, Gelucire® 46/07, Gelucire® 50/13 또는 Gelucire® 53/10); 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르 (예를 들어, 세토마크로골(cetomacrogol) 1000); 폴리옥시에틸렌 스테아레이트 (예를 들어, PEG-6 스테아레이트, PEG-8 스테아레이트, 폴리옥실 40 스테아레이트 NF, 폴리옥시에틸 50 스테아레이트 NF, PEG-12 스테아레이트, PEG-20 스테아레이트, PEG-100 스테아레이트, PEG-12 다이스테아레이트, PEG-32 다이스테아레이트, 또는 PEG-150 다이스테아레이트); 에틸 올레에이트, 아이소프로필 팔미테이트, 아이소프로필 미리스테이트; 다이메틸 아이소소바이드; N-메틸피롤리디논; 파라핀; 콜레스테롤; 레시틴; 좌제 기제(suppository base); 약제학적으로 허용가능한 왁스 (예를 들어, 카르나우바 왁스(carnauba wax), 황납(yellow wax), 백랍(white wax), 미세결정질 왁스, 또는 유화제 왁스(emulsifying wax)); 약제학적으로 허용가능한 규소 유체; (소르비탄 라우레이트, 소르비탄 올레에이트, 소르비탄 팔미테이트, 또는 소르비탄 스테아레이트를 포함한) 소르비탄 지방산 에스테르; 약제학적으로 허용가능한 포화된 지방 또는 약제학적으로 허용가능한 포화된 오일 (예를 들어, 수소화된 피마자유 (글리세릴-트리스-12-하이드록시 스테아레이트), 세틸 에스테르 왁스 (용융점이 약 43℃ 내지 47℃인 C14-C18 포화된 지방산의 주로 C14-C18 포화된 에스테르의 혼합물), 또는 글리세릴 모노스테아레이트)을 포함하나, 이로 한정되지 않는다.
일부 실시 양태에서, 지방산 프로드럭은 에스테르 P-B (여기서, 라디칼 P는 PUFA이고, 라디칼 B는 생물학적으로 허용가능한 분자임)로 표시된다. 그래서, 에스테르 P-B의 절단은 PUFA 및 생물학적으로 허용가능한 분자를 제공한다. 이러한 절단은 산, 염기, 산화제, 및/또는 환원제에 의해 도입할 수 있다. 생물학적으로 허용가능한 분자의 예로는, 영양 물질, 펩타이드, 아미노산, 단백질, (단당류, 이당류, 다당류, 글리코스아미노글리칸, 및 올리고당류를 포함한) 탄수화물, 뉴클레오타이드, 뉴클레오사이드, (모노-치환, 다이-치환 및 트리-치환 글리세롤, 글리세로인지질, 스핑고지질, 및 스테로이드를 포함한) 지질을 포함하나, 이로 한정되지 않는다.
일부 실시 양태에서, PUFA의 프로드럭으로 혼입하기 위한 알코올 (또는 이들의 화학적 등가물)로는, 탄소수 1 내지 50의 알코올 ("C1 -50 알코올"), C1 -45 알코올, C1-40 알코올, C1 -35 알코올, C1 -30 알코올, C1 -25 알코올, C1 -20 알코올, C1 -15 알코올, C1 -10 알코올, C1 -6 알코올을 포함한다 (본원에서 언제 나타나든지 간에, "1-50"과 같은 수치의 범위는 주어진 범위의 각각의 정수를 지칭하며; 예를 들어, "탄소수 1 내지 50"은 알킬기가 1개의 탄소 원자, 2개의 탄소 원자, 3개의 탄소 원자 등, 50개를 포함해 50개 이하의 탄소 원자로 이루어질 수 있음을 의미하며, 그렇지만 본 정의는 수치가 지정되지 않은 용어 "알킬"의 경우도 포함함). 이러한 알코올은 분지형, 비분지형, 포화된, 불포화된, 고도불포화될 수 있으며, 및/또는 질소, 산소, 황, 인, 붕소, 실리콘, 불소, 염소, 브롬, 또는 요오드와 같은 하나 이상의 헤테로원자를 포함한다. 예시적인 알코올로는, 메틸, 에틸, 프로필, 아이소-프로필, n-부틸, 아이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, 펜틸, 헥실, 퍼플루오로메틸, 퍼클로로메틸, 퍼플루오로-tert-부틸, 퍼클로로-tert-부틸, 및 벤질 알코올, 뿐만 아니라 폴리에틸렌 글리콜과 같은 에테르 알코올을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 알코올은 하전된 화학종을 포함한다. 이러한 화학종은 음이온성 또는 양이온성일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 상기 화학종은 양으로 하전된 인 원자이다. 다른 실시 양태에서, 상기 양으로 하전된 인 원자는 포스포늄 양이온이다. 다른 실시 양태에서, 하전된 화학종은 1차, 2차, 3차, 또는 4차 암모늄 양이온이다.
일부 실시 양태에서, PUFA의 프로드럭으로 혼입하기 위한 알코올 (또는 이들의 화학적 등가물)로는, 다이올, 트리올, 테트라올, 펜타올 등과 같은 폴리알코올을 포함한다. 폴리알코올의 예로는, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 메틸프로판다이올, 에톡시다이글리콜, 헥실렌 글리콜, 다이프로필렌 글리콜 글리세롤, 및 탄수화물을 포함한다. 폴리알코올과 PUFA로부터 형성된 에스테르는 모노-에스테르, 다이-에스테르, 트리-에스테르 등일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 다중 에스테르화된 폴리알코올은 동일한 PUFA로 에스테르화된다. 다른 실시 양태에서, 다중 에스테르화된 폴리알코올은 서로 다른 PUFA로 에스테르화된다. 일부 실시 양태에서, 서로 다른 PUFA는 동일한 방식으로 안정화된다. 다른 실시 양태에서, 서로 다른 PUFA는 서로 다른 방식 (예컨대 하나의 PUFA에서는 중수소 치환되고 또 다른 PUFA에서는 13C 치환됨)으로 안정화된다. 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 PUFA는 오메가-3 지방산이며,하나 이상의 PUFA는 오메가-6 지방산이다.
또한, 본 발명에 사용하기 위한 염으로서 PUFA 및/또는 PUFA 모방체 및/또는 PUFA 프로드럭을 제형하는 것이 유용할 수 있는 것으로 사료된다. 예를 들어, 약학 화합물의 특성을 조정하는 수단으로 염 형성을 이용하는 것이 잘 알려져 있다. Stahl et al., Handbook of pharmaceutical salts: Properties, selection and use (2002) Weinheim/Zurich: Wiley-VCH/VHCA; Gould, Salt selection for basic drugs, Int. J. Pharm. (1986), 33 :201-217을 참조한다. 염 형성을 이용해, 약품의 용해도를 증가 또는 감소시키고, 안정성 또는 독성을 개선하고, 흡습성을 감소시킬 수 있다.
염으로서 PUFA 및/또는 PUFA 모방체 및/또는 PUFA 프로드럭을 제형하는 것은, 염기성 무기 염 형성 제제, 염기성 유기 염 형성 제제, 및 산성과 염기성 작용기 둘 다를 포함하는 염 형성 제제의 사용을 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 염 형성에 유용한 여러 가지 무기 염기로는, 리튬, 나트륨, 칼륨, 루비듐, 세슘, 및 프란슘의 염과 같은 알칼리 금속 염, 베릴륨, 마그네슘, 칼슘, 스트론튬, 바륨, 및 라듐의 염과 같은 알칼리 토금속 염, 및 알루미늄과 같은 금속을 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 이들 무기 염기는 카르보네이트, 하이드로겐 카르보네이트, 설페이트, 하이드로겐 설페이트, 설파이트, 하이드로겐 설파이트, 포스페이트, 하이드로겐 포스페이트, 다이하이드로겐 포스페이트, 포스파이트, 하이드로겐 포스파이트, 하이드록사이드, 옥사이드, 설파이드, 알콕사이드 예컨대 메톡사이드, 에톡사이드, 및 t-부톡사이드 등과 같은 반대이온을 추가로 포함할 수 있다. 염 형성에 유용한 여러 가지 유기 염기로는, 아미노산, 아르기닌, 라이신, 오르니틴 등과 같은 염기성 아미노산, 암모니아, 메틸아민, 에틸아민, 다이메틸아민, 다이에틸아민, 트리메틸아민, 트리에틸아민 등과 같은 알킬아민, 피리딘, 피콜린 등과 같은 헤테로사이클릭 아민, 에탄올아민, 다이에탄올아민, 트리에탄올아민 등과 같은 알칸올아민, 다이에틸아미노에탄올, 다이메틸아미노에탄올, N-메틸글루카민, 다이사이클로헥실아민, N,N'-다이벤질에틸렌다이아민, 에틸렌다이아민, 피페라진, 콜린, 트롤아민, 이미다졸, 다이올아민, 베타인, 트로메타민, 메글루민, 클로로프로카인, 프로카인 등을 포함하나, 이로 한정되지 않는다.
PUFA 및/또는 PUFA 모방체 및/또는 PUFA 프로드럭의 염 제형으로는, 약제학적으로 허용가능한 염기성 무기 염, 염기성 유기 염, 및/또는 산성 및 염기성 작용기를 둘 다 가지는 유기 화합물을 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 약제학적으로 허용가능한 염은 당해 기술분야에 잘 알려져 있으며, 전술한 무기 및 유기 염기의 다수를 포함한다. 약제학적으로 허용가능한 염은 추가로, 식품 의약국 및 외부 규제 에이전시(foreign regulatory agency)에 의해 승인을 받은 약물에서 발견되는 염 및 염-형성 제제를 포함한다. 혼입에 약제학적으로 허용가능한 유기 양이온으로는, 벤자틴, 클로로프로카인, 콜린, 다이에탄올아민, 에틸렌다이아민, 메글루민, 프로카인, 베네타민, 클레미졸, 다이에틸아민, 피페라진, 및 트로메타민을 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 혼입에 약제학적으로 허용가능한 금속성 양이온으로는, 알루미늄, 칼슘, 리튬, 마그네슘, 칼륨, 나트륨, 아연, 바륨, 및 비쓰무스를 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 부가적인 염-형성 제제로는, 아르기닌, 베타인, 카르니틴, 다이에틸아민, L-글루타민, 2-(4-이미다졸릴)에틸아민, 아이소부탄올아민, 라이신, N-메틸피페라진, 모르폴린, 및 테오브로민을 포함하나, 이로 한정되지 않는다.
더욱이, 약제학적으로 승인을 받은 반대이온에 대한 수 개의 리스트가 존재한다. Bighley et al, Salt forms of drugs and absorption. 1996 In: Swarbrick J. et al. eds. Encyclopaedia of pharmaceutical technology, Vol. 13 New York: Marcel Dekker, Inc. pp 453-499; Gould, P.L., Int. J. Pharm. 1986, 33, 201-217; Berge, J. Pharm. Sci. 1977, 66, 1-19; Heinrich Stahl P., Wermuch C.G. (editors), Handbook of Pharmaceutical Salts, IUPAC, 2002; Stahl et al., Handbook of Pharmaceutical salt: Properties, selection and use (2002) Weinheim/Zurich: Wiley-VCH/VHCA를 참조하며, 이들은 모두 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
비-중수소화된 PUFA와 같은 동위원소로 비변형된 PUFA를 모두, 중수소화된 PUFA와 같이 동위원소로 변형된 PUFA로 치환하는 것은 불필요할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 막에 D-PUFA와 같이 동위원소로 변형된 PUFA가 충분히 존재하여, H-PUFA와 같은 비변형된 PUFA가 자가산화의 연쇄 반응을 유지시키지 못하게 하는 것이 바람직하다. 자가산화 동안에, 하나의 PUFA가 산화되는 경우, 근접한 곳에 비-산화된 PUFA가 존재하며, 비-산화된 PUFA는 산화된 PUFA에 의해 산화될 수 있다. 이 또한, 자가산화라고 지칭할 수 있다. 일부 경우에, D-PUFA가 있는 막에 저농도의, 예를 들어 "희석된" H-PUFA가 존재하는 경우, 이러한 산화 사이클은 H-PUFA를 분리하고 있는 거리로 인해 망가질 수 있다. 일부 실시 양태에서, 동위원소로 변형된 PUFA의 농도는 자가산화 연쇄 반응을 유지하기에 충분한 양으로 존재한다. 상기 자가산화 연쇄 반응을 망가뜨리기 위해, 예를 들어, 동일한 유형의 총 분자 중 1-60%, 5-50%, 또는 15-35%가 상기 막에 존재한다. 이는 IRMS (동위원소비 질량분석기)로 측정할 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 활성 화합물의 식이요법, 보충, 또는 약학 조성물을 제공한다. 일부 실시 양태에서, 상기 식이요법, 보충, 또는 약학 조성물은 상기 활성 화합물의 염을 포함할 수 있다.
염 형성에 유용한 여러 가지 무기 염기로는, 리튬, 나트륨, 칼륨, 루비듐, 세슘, 및 프란슘의 염과 같은 알칼리 금속 염, 및 베릴륨, 마그네슘, 칼슘, 스트론튬, 바륨, 및 라듐의 염과 같은 알칼리 토금속 염, 및 알루미늄과 같은 금속을 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 이들 무기 염기는 카르보네이트, 하이드로겐 카르보네이트, 설페이트, 하이드로겐 설페이트, 설파이트, 하이드로겐 설파이트, 포스페이트, 하이드로겐 포스페이트, 다이하이드로겐 포스페이트, 포스파이트, 하이드로겐 포스파이트, 하이드록사이드, 옥사이드, 설파이드, 메톡사이드, 에톡사이드, 및 t-부톡사이드와 같은 알콕사이드 등과 같은 반대이온을 추가로 포함할 수 있다.
염 형성에 유용한 여러 가지 유기 염기로는, 아미노산; 아르기닌, 라이신, 오르니틴 등과 같은 염기성 아미노산; 암모니아; 암모늄 하이드록사이드; 메틸아민, 에틸아민, 다이메틸아민, 다이에틸아민, 트리메틸아민, 트리에틸아민 등과 같은 알킬아민; 피리딘, 피콜린 등과 같은 헤테로사이클릭 아민; 에탄올아민, 다이에탄올아민, 트리에탄올아민 등과 같은 알칸올아민; 다이에틸아미노에탄올, 다이메틸아미노에탄올; N-메틸글루카민; 다이사이클로헥실아민; Ν,Ν'-다이벤질에틸렌다이아민; 에틸렌다이아민; 피페라진; 콜린; 트롤아민; 이미다졸; 다이올아민; 베타인; 트로메타민; 메글루민; 클로로프로카인; 프로카인 등을 포함하나, 이로 한정되지 않는다.
활성 화합물의 염으로는, 약제학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있으나, 이로 한정되지 않는다. 약제학적으로 허용가능한 염은 당해 기술분야에 잘 알려져 있으며, 전술한 염-형성 제제 중 많은 것들을 포함한다. 약제학적으로 허용가능한 염은 식품 의약국 및 외부 규제 기관에 의해 승인된 약물들에 존재하는 유형의 염 및 염-형성 제제를 추가로 포함한다.
활성 화합물의 염에 혼입하기 위한 약제학적으로 허용가능한 유기 양이온으로는, 벤자틴, 클로로프로카인, 콜린, 다이에탄올아민, 에틸렌다이아민, 메글루민, 프로카인, 베네타민, 클레미졸, 다이에틸아민, 피페라진, 및 트로메타민을 포함하나, 이로 한정되지 않는다.
활성 화합물의 염에 혼입하기 위한 약제학적으로 허용가능한 금속성 양이온으로는, 알루미늄, 칼슘, 리튬, 마그네슘, 칼륨, 나트륨, 아연, 바륨, 및 비쓰무스를 포함하나, 이로 한정되지 않는다.
염을 형성하는 잠재적인 유용성을 가진 부가적인 염-형성 제제로는, 아세틸아미노아세트산, N-아세틸-1-아스파라긴, N-아세틸시스틴, 아르기닌, 베타인, 카르니틴, L-글루타민, 2-(4-이미다졸릴)에틸아민, 아이소부탄올아민, 라이신, N-메틸피페라진, 및 모르폴린을 포함하나, 이로 한정되지 않는다.
아울러, 약제학적으로 승인된 반대이온에 대한 수 개의 리스트가 존재한다. Bighley et al, Salt forms of drugs and absorption. 1996 In: Swarbrick J. et al. eds. Encyclopaedia of pharmaceutical technology, Vol. 13 New York: Marcel Dekker, Inc. pp 453-499; Gould, P.L., Int. J. Pharm. 1986, 33, 201-217; Berge, J. Pharm. Sci. 1977, 66, 1-19; Heinrich Stahl P., Wermuch C.G. (editors), Handbook of Pharmaceutical Salts, IUPAC, 2002; Stahl et al., Handbook of pharmaceutical salts: Properties, selection and use (2002) Weinheim/Zurich: Wiley-VCH/VHCA를 참조하며, 이들은 모두 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
공동-투여
일부 실시 양태에서, 본원에서 개시한 화합물은 조합해서 투여한다. 예를 들어, 일부 실시 양태에서, 2, 3, 4, 및/또는 5가지 이상의 안정화된 화합물을 함께 투여한다. 일부 실시 양태에서, 안정화된 화합물을 대략 유사한 양으로 투여한다. 다른 실시 양태에서, 안정화된 화합물을 서로 다른 양으로 투여한다. 예를 들어, 혼합물 중 2가지 이상의 화합물 중 어느 하나는 혼합물 중 약 1% 내지 약 99%, 약 5% 내지 약 95%, 약 10% 내지 약 90%, 약 15% 내지 약 85%, 약 20% 내지 약 80%, 약 25% 내지 약 75%, 약 30% 내지 약 70%, 약 35% 내지 약 65%, 약 40% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 60%, 약 45% 내지 약 55%, 및/또는 약 50%일 수 있다. 다른 실시 양태에서, 혼합물 중 2가지 이상의 화합물 중 어느 하나는 혼합물 중 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%일 수 있다.
항산화제가, 공정의 확률적인 특성 및 PUFA 과산화 산물 (반응성 카르보닐)의 항산화제 처리에 대한 안정성으로 인해, PUFA 과산화의 악영향을 없애지 못하더라도, 본원에서 기술한 것들과 같은 산화에 내성인 조성물과 항산화제를 공동-투여하면, 산화적 스트레스-관련 장애를 치료하는 데 유익함을 증명할 수 있다.
공동-투여에 유용한 것으로 사료되는 소정의 항산화제로는, 비타민 C 및 비타민 E와 같은 비타민; 글루타티온, 리포산, 요산, 카로텐, 리코펜, 루테인, 안토시아닌, 옥살산, 피트산(phytic acid), 탄닌, 코엔자임 Q, 멜라토닌, 토코페롤, 토코트리엔올, 레스베라트롤(resveratrol)을 비롯한 폴리페놀, 플라보노이드, 셀레늄, 유게놀, 이데베논, 미토퀴논, 미토퀴놀, 유비퀴논, 제토-쉴러(Szeto-Schiller) 펩타이드, 및 미토콘드리아-표적화된 항산화제를 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 명백하게 언급하지 않는 경우, 전술한 항산화제의 퀴논 유도체가 또한, 공동-투여에 유용한 것으로 사료된다.
일부 실시 양태에서, 안정화된 화합물은 항산화제 유전자를 상향조절하는 화합물과 함께 투여된다. 다른 실시 양태에서, 안정화된 화합물은 Keap1/Nrf2/ARE 신호전달 경로와 같은 신호전달 경로에 영향을 미쳐 헴 옥시게나제-1 (HO-1)과 같은 항염증성 및/또는 항산화제 단백질을 생성하는 화합물과 함께 투여된다. 일부 실시 양태에서, 안정화된 화합물은 항산화제 염증 조정제와 함께 투여된다. 항산화제 염증 조정제는 프로-항산화제 및/또는 프로-염증성 전사 인자를 억제한다. 일부 실시 양태에서, 항산화제 염증 조정제는 전사 인자 Nrf2의 활성화제이다. Nrf2 활성화는 항산화제, 해독, 및 항염증성 유전자 상향조절을 촉진한다. 다른 실시 양태에서, 항산화제 염증 조정제는 NF-κΒ를 억제한다. 일부 실시 양태에서, 항산화제 염증 조정제는 STAT3를 억제한다. 다른 실시 양태에서, 안정화된 화합물은 히스톤 디아세틸라제 활성에 영향을 미치는 화합물과 함께 투여된다. 일부 실시 양태에서, 안정화된 화합물은 항산화제 반응 구성원(antioxidant response element, ARE)에 결합하는 화합물과 함께 투여된다. 다른 실시 양태에서, 안정화된 화합물은 항산화제 염증 조정제인 바르독솔론 메틸 (2-시아노-3,12-다이옥소올레아네-1,9(11)-다이엔-28-오익산 메틸 에스테르)와 함께 투여된다. 일부 실시 양태에서, 상기 항산화제 염증 조정제는 2-시아노-3,12-다이옥소올레아네-1,9(11)-다이엔-28-오익산, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 에스테르이다. 다른 실시 양태에서, 상기 항산화제 염증 조정제는 2-시아노-3,12-다이옥소올레아네-1,9(11)-다이엔-28-오익산의 아미드이다. 일부 실시 양태에서, 상기 항산화제 염증 조정제는 트리테르페노이드이다. 다른 실시 양태에서, 상기 항산화제 염증 조정제는 하기 화합물로부터 선택된다:
Figure 112013107101794-pct00018
공동-투여 치료법에 유용한 것으로 생각되는 부가적인 항산화제로는, 미국 특허 6,331,532; 7,179,928; 7,232,809; 7,888,334; 7,888,335; 7,432,305; 7,470,798; 및 7,514,461; 미국 특허 출원 20020052342; 20030069208; 20040106579; 20050043553; 20050245487; 20060229278; 20070238709; 20070270381; 20080161267; 20080275005; 20090258841; 20100029706; 및 20110046219에 개시한 화합물들을 포함하며; 이들 특허 및 특허 출원에서 개시한 화합물은 원용에 의해 포함된다. 이들 화합물은 미토콘드리아-표적화된 화합물이며, 하기를 포함하나, 이로 한정되지 않는다:
화학식 I 또는 II의 화합물
Figure 112013107101794-pct00019
(상기 식에서, R1 및 R2는 독립적으로 -C1-C4 알킬, -C1-C4 할로알킬, -CN, -F, -CI, -Br, 및 -I로부터 선택되며; R3는 -C1-C4 알킬, -C1-C4 할로알킬, -CN, -F, -CI, 및 -I로부터 선택되며, R20는 독립적으로 -C1-C20 알킬, -C1-C20 알케닐, -C1-C20 알키닐, 및 하나 이상의 이중 결합 및 하나 이상의 삼중 결합을 포함하는 -C1-C20으로부터 선택됨).
3-(6-하이드록시-2-메틸-3,4,7,8,9,10-헥사하이드로-7,10-메타노-2H-벤조[h]크로멘-2-일)-프로피온산 메틸 에스테르; 3-(6-하이드록시-2-메틸-3,4,7,8,9,10-헥사하이드로-7,10-메타노-2H-벤조[h]크로만-2-일)-프로피온산; 2,2,-다이메틸-3,4,7,8,9,10-헥사하이드로-7,10-메타노-2H-벤조[h]크로멘-6-올; 3-(6-하이드록시-2-메틸-3,4,7,8,9,10-헥사하이드로-7,10-프로파노-2H-벤조[h]크로멘-2-일)-프로피온산 메틸 에스테르; 2-메틸-2-[3-(티아졸-2-일설파닐)-프로필]-3,4,7,8,9,10-헥사하이드로-7,10-메타노-2H-벤조[h]크로멘-6-올; [3-(6-하이드록시-2-메틸-3,4,7,8,9,10-헥사하이드로-7,10-메타노-2H-벤조[h]크로멘-2-일)-프로필]-포스폰산 다이메틸 에스테르; [3-(6-하이드록시-2-메틸-3,4,7,8,9,10-헥사하이드로-7,10-메타노-2H-벤조[h]크로멘-2-일)-프로필]-포스폰산; 3-(6-하이드록시-2-메틸-3,4,7,8,9,10-헥사하이드로-7,10-메타노-2H-벤조[h]크로멘-2-일)-프로피온산 메틸 에스테르; 4-(6-하이드록시-2-메틸-3,4,7,8,9,10-헥사하이드로-7,10-메타노-2H-벤조[h]크로멘-2-일)-부탄-1-설폰산 다이메틸아미드; 2-(3-하이드록시-프로필)-2-메틸-3,4,7,8,9,10-헥사하이드로-7,10-메타노-2H-벤조[h]크로멘-6-올; 2-(3-클로로-프로필)-2-메틸-3,4,7,8,9,10-헥사하이드로-7,10-메타노-2H-벤조[h]크로멘-6-올; 2,2-다이메틸-3,4,7,8,9,10-헥사하이드로-7,10-메타노-2H-벤조[h]크로멘-6-올; -(2-클로로-에틸)-2-메틸-3,4,7,8,9,10-헥사하이드로-7,10-메타노-2H-벤조[h]크로멘-6-올; 2-메틸-2-티아졸-2-일-3,4,7,8,9,10-헥사하이드로-7,10-메타노-2H-벤조[h]크로멘-6-올; 2,2-다이메틸-3,4,7,8,9,10-헥사하이드로-7,10-에타노-2H-벤조[h]크로멘-6-올; 3-(6-하이드록시-2-메틸-3,4,7,8,9,10-헥사하이드로-7,10-에타노-2H-벤조[h]크로멘-2-일)-프로피온산; 2-(3-클로로-프로필)-2-메틸-3,4,7,8,9,10-헥사하이드로-7,10-에타노-2H-벤조[h]크로멘-6-올; 4-(6-하이드록시-2,2-다이메틸-3,4,7,8,9,10-헥사하이드로-7,10-메타노-2H-벤조[h]크로멘-5-일메틸렌)-2-메틸-5-프로필-2,4-다이하이드로-피라졸-3-온과 같은 화합물.
2,2,7,8-테트라메틸-5-페닐-크로만-6-올; 4-(6-하이드록시-2,2,7,8-테트라메틸-크로만-5-일)-벤조산 메틸 에스테르; 4-(6-하이드록시-2,2,7,8-테트라메틸-크로만-5-일)-벤조산; 2,2,7,8-테트라메틸-5-피리딘-4-일-크로만-6-올; 2,2,7,8-테트라메틸-5-피리딘-3-일-크로만-6-올; 5-(4-메탄설포닐-페닐)-2,2,7,8-테트라메틸-크로만-6-올; 5-(4-다이메틸아미노-페닐)-2,2,7,8-테트라메틸-크로만-6-올; 5-(4-클로로-페닐)-2,2,7,8-테트라메틸-크로만-6-올; 4-(6-하이드록시-2,2,7,8-테트라메틸-크로만-5-일)-벤젠설폰아미드; 5-(4-메톡시-페닐)-2,2,7,8-테트라메틸-크로만-6-올; (6-하이드록시-2,2,7,8-테트라메틸-크로만-5-일메틸)-1-하이드록시우레아; 2,2,7,8-테트라메틸-5-(3-니트로-페닐)-크로만-6-올; 2,2,7,8-테트라메틸-5-(4-트리플루오로메틸-페닐)-크로만-6-올; 5-(4-tert-부틸-페닐)-2,2,7,8-테트라메틸-크로만-6-올; 2,2,7,8-테트라메틸-5-(3,4,5-트리메톡시-페닐)-크로만-6-올; 4-(6-하이드록시-2,2,7,8-테트라메틸-크로만-5-일)-벤조니트릴; 5-(2,5-다이메톡시-3,4-다이메틸-페닐)-2,2,7,8-테트라메틸-크로만-6-올; 5-(6-하이드록시-2,2,7,8-테트라메틸-크로만-5-일)-벤젠-1,2,3-트리올; 5-(6-하이드록시-2,2,7,8-테트라메틸-크로만-5-일)-2,3-다이메틸-벤젠-1,4-다이올; 5-(2-클로로-페닐)-2,2,7,8-테트라메틸-크로만-6-올; 5-푸란-2-일-2,2,7,8-테트라메틸-크로만-6-올; 5-알릴설파닐메틸-2,2,8-트리메틸-7-(3-메틸-부틸)-크로만-6-올; 5-사이클로펜틸설파닐메틸-2,2,7,8-테트라메틸-크로만-6-올; 5-헥실설파닐메틸-2,2,7,8-테트라메틸-크로만-6-올; 5-알릴설파닐메틸-2,2,7,8-테트라메틸-크로만-6-올; 5-(4,6-다이메틸-피리미딘-2-일설파닐메틸)-2,2,7,8-테트라메틸-크로만-6-올; 1-[3-(6-하이드록시-2,2,7,8-테트라메틸-크로만-5-일-메틸설파닐)-2-메틸-프로피오닐]-피롤리딘-2-카르복실산; 4-(6-하이드록시-2,2,7,8-테트라메틸-크로만-5-일메틸렌)-5-메틸-2-페닐-2,4-다이하이드로-피라졸-3-온; 4-(6-하이드록시-2,2,7,8-테트라메틸-크로만-5-일-메틸렌)-3-페닐-4H-아이속사졸-5-온; 4-[4-(6-하이드록시-2,2,7,8-테트라메틸-크로만-5-일-메틸렌)-3-메틸-5-옥소-4,5-다이하이드로-피라졸-1-일]-벤조산; 4-(6-하이드록시-2,2,7,8-테트라메틸-크로만-5-일-메틸렌)-2-메틸-5-프로필-2,4-다이하이드로-피라졸-3-온; 5-하이드록시-3-(6-하이드록시-2,2,7,8-테트라메틸-크로만-5-일-메틸렌)-3H-벤조푸란-2-온; 2,5,7,8-테트라메틸-2-티오펜-2-일-크로만-6-올; 2-(2,5-다이메틸-티오펜-3-일)-2,5,7,8-테트라메틸-크로만-6-올; 2-(2,5-다이메틸-티오펜-3-일)-2,7,8-트리메틸-크로만-6-올; 8-클로로-2-(2,5-다이메틸-티오펜-3-일)-2,5,7-트리메틸-크로만-6-올; 5-클로로-2,7,8-트리메틸-2-티오펜-2-일-크로만-6-올; 5-[3-(6-메톡시메톡시-2,7,8-트리메틸-크로만-2-일)-프로필리덴]-티아졸리딘-2,4-다이온; 5-[3-(6-하이드록시-2,7,8-트리메틸-크로만-2-일)-프로필리덴]-티아졸리딘-2,4-다이온; 3-[6-하이드록시-2,7,8-트리메틸-2-(4,8,12-트리메틸-트리데실)-크로만-5-일-메틸설파닐]-2-메틸-프로피온산; 2,7,8-트리메틸-5-(5-메틸-1H-벤조이미다졸-2-일-설파닐메틸)-2-(4,8,12-트리메틸-트리데실)-크로만-6-올; 2-[6-하이드록시-2,7,8-트리메틸-2-(4,8,12-트리메틸-트리데실)-크로만-5-일메틸설파닐-에탄설폰산; 5-(4,6-다이메틸-피리미딘-2-일설파닐메틸)-2,7,8-트리메틸-2-(4,8,12-트리메틸-트리데실)-크로만-6-올; 4-[2-(4,8-다이메틸-트리데실)-6-하이드록시-2,7,8-트리메틸-크로만-5-일메틸설파닐]-벤조산; 1-{3-[6-하이드록시-2,7,8-트리메틸-2-(4,8,12-트리메틸-트리데실)-크로만-5-일메틸설파닐]-2-메틸-프로피오닐}-피롤리딘-2-카르복실산; 2-(2,2-다이클로로-비닐)-2,5,7,8-테트라메틸-크로만-6-올; 2-(2,2-다이브로모-비닐)-2,5,7,8-테트라메틸-크로만-6-올; 5-(5-클로로-3-메틸-펜트-2-에닐)-2,2,7,8-테트라메틸-크로만-6-올; 5-클로로-2-(2,5-다이메틸-티오펜-3-일)-2,7,8-트리메틸-크로만-6-올; 2-(3-클로로-프로필)-5,7-다이메틸-2-티오펜-2-일-크로만-6-올; 5-클로로-2-(2,5-다이메틸-티아졸-4-일)-2,7,8-트리메틸-크로만-6-올; 5-클로로-2-(2,5-다이메틸-티아졸-4-일)-2,7,8-트리메틸-2H-크로멘-6-올; 및 5-클로로-2-(2,5-다이메틸-티아졸-4-일)-2,7,8-트리메틸-크로만-6-올과 같은 화합물.
다이메볼린 (2,8-다이메틸-5-(2-(6-메틸피리딘-3-일)에틸)-2,3,4,5-테트라하이드로-1H-피리도[4,3-b]인돌), 8-클로로-2-메틸-5-(2-(6-메틸피리딘-3-일)에틸)-2,3,4,5-테트라하이드로-1H-피리도[4,3-b]인돌, 메브하이드롤린 (5-벤질-2-메틸-2,3,4,5-테트라하이드로-1H-피리도[4,3-b]인돌), 2,8-다이메틸-1,3,4,4a,5,9b-헥사하이드로-1H-피리도[4,3-b]인돌, 8-플루오로-2-(3-(피리딘-3-일)프로필)-2,3,4,5-테트라하이드로-1H-피리도[4,3-b]인돌, 및 8-메틸-1,3,4,4a,5,9b-테트라하이드로-1H-피리도[4,3-b]인돌과 같은 화합물.
2-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-3,5-다이메틸-6-(4-(트리플루오로메틸)페닐)사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-6-(4-메톡시페닐)-3,5-다이메틸사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 4-(5-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-2,4-다이메틸-3,6-다이옥소사이클로헥사-1,4-다이에닐)벤조니트릴; 2-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-3,5-다이메틸-6-(나프탈렌-2-일)사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(3,4-다이플루오로페닐)-6-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-3,5-다이메틸사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(4-플루오로페닐)-6-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-3,5-다이메틸사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(4-클로로페닐)-6-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-3,5-다이메틸사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(2,3-다이하이드로벤조푸란-2-일)-6-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-3,5-다이메틸사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸-3-페네틸사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸-3-페닐사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-벤질-3-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸-3-(3-페닐프로필)사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(1-하이드록시-2-페닐에틸)-3-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-3-(4-메톡시페닐)-5,6-다이메틸-사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸-3-(4-(트리플루오로메틸)-페닐)사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸-3-(나프탈렌-2-일)사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(벤조푸란-2-일)-3-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(4-클로로페닐)-3-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(4-에틸페닐)-3-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸-3-(3-(트리플루오로메틸)페닐)-사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(4-tert-부틸페닐)-3-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸-사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(4-플루오로페닐)-3-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(3-플루오로페닐)-3-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 4-(2-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-4,5-다이메틸-3,6-다이옥소사이클로헥사-1,4-다이에닐)벤조니트릴; 2-(3,4-다이플루오로페닐)-3-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸-사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(2-플루오로페닐)-3-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-3-(3-메톡시페닐)-5,6-다이메틸-사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(4-플루오로-2-메톡시페닐)-3-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(벤조[d][1,3]다이옥솔-5-일)-3-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(2,4-다이플루오로페닐)-3-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-3-(4-메톡시페닐)-5,6-다이메틸사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-3-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(4-클로로페닐)-6-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-3,5-다이메틸사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸-3-(2-(티아졸-2-일)에틸)사이클로헥사-2,5-다이엔-1.4-다이온; 2-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸-3-(2-(티아졸-5-일)에틸)사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸-3-(2-(피리딘-2-일)에틸)사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸-3-(2-(피리다진-4-일)에틸)사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸-3-(2-(티오펜-2-일)에틸)사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸-3-(2-(티오펜-3-일)에틸)사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(2-(푸란-2-일)에틸)-3-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(2-(푸란-3-일)에틸)-3-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(2-(1H-피라졸-5-일)에틸)-3-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(2-(1H-피라졸-4-일)에틸)-3-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(2-(1H-피라졸-1-일)에틸)-3-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(2-(1H-이미다졸-5-일)에틸)-3-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(2-(1H-이미다졸-2-일)에틸)-3-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸-3-(2-(옥사졸-5-일)에틸)사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸-3-(2-(옥사졸-2-일)에틸)사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 2-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸-3-(2-(옥사졸-4-일)에틸)사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온; 및 2-(2-(1H-인돌-3-일)에틸)-3-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-5,6-다이메틸사이클로헥사-2,5-다이엔-1,4-다이온과 같은 화합물.
하기와 같은 화합물:
Figure 112013107101794-pct00020
(상기 식에서, m은 -C1-C20 알킬, -C1-C20 알케닐, -C1-C20 알키닐, 또는 하나 이상의 이중 결합 및 하나 이상의 삼중 결합을 포함하는 -C1-C20이며, 반대이온은 약제학적으로 허용가능한 음이온임).
3-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이옥소-1,4-사이클로헥사다이엔-1-일)프로필 트리페닐포스포늄 염; 4-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이옥소-1,4-사이클로헥사다이엔-1-일)부틸 트리페닐포스포늄 염; 5-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이옥소-1,4-사이클로헥사다이엔-1-일)펜틸 트리페닐포스포늄 염; 6-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이옥소-1,4-사이클로헥사다이엔-1-일)헥실 트리페닐포스포늄 염; 7-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이옥소-1,4-사이클로헥사다이엔-1-일)헵틸 트리페닐포스포늄 염; 8-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이옥소-1,4-사이클로헥사다이엔-1-일)옥틸 트리페닐포스포늄 염; 9-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이옥소-1,4-사이클로헥사다이엔-1-일)노닐 트리페닐포스포늄 염; 10-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이옥소-1,4-사이클로헥사다이엔-1-일)데실 트리페닐포스포늄 염; 11-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이옥소-1,4-사이클로헥사다이엔-1-일)운데실 트리페닐포스포늄 염; 12-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이옥소-1,4-사이클로헥사다이엔-1-일)도데실 트리페닐포스포늄 염; 13-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이옥소-1,4-사이클로헥사다이엔-1-일)프로필데실 트리페닐포스포늄 염; 14-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이옥소-1,4-사이클로헥사다이엔-1-일)부틸데실 트리페닐포스포늄 염; 15-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이옥소-1,4-사이클로헥사다이엔-1-일)펜타데실 트리페닐포스포늄 염; 16-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이옥소-1,4-사이클로헥사다이엔-1-일)헥사데실 트리페닐포스포늄 염; 17-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이옥소-1,4-사이클로헥사다이엔-1-일)헵타데실 트리페닐포스포늄 염; 18-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이옥소-1,4-사이클로헥사다이엔-1-일)옥타데실 트리페닐포스포늄 염; 19-(4, 5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이옥소-1,4-사이클로헥사다이엔-1-일)노나데실 트리페닐포스포늄 염; 20-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이옥소-1,4-사이클로헥사다이엔- 1 -일)이코실 트리페닐포스포늄 염; 3-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이하이드록시페닐)프로필 트리페닐포스포늄 염; 4-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이하이드록시페닐)부틸 트리페닐포스포늄 염; 5-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이하이드록시페닐)펜틸 트리페닐포스포늄 염; 6-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이하이드록시페닐)헥실 트리페닐포스포늄 염; 7-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이하이드록시페닐)헵틸 트리페닐포스포늄 염; 8-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이하이드록시페닐)옥틸 트리페닐포스포늄 염; 9-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이하이드록시페닐)노닐 트리페닐포스포늄 염; 10-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이하이드록시페닐)데실 트리페닐포스포늄 염; 11-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이하이드록시페닐)운데실 트리페닐포스포늄 염; 12-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이하이드록시페닐)도데실 트리페닐포스포늄 염; 13-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이하이드록시벤질)프로필데실 트리페닐포스포늄 염; 14-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이하이드록시페닐)부틸데실 트리페닐포스포늄 염; 15-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이하이드록시페닐)펜타데실 트리페닐포스포늄 염; 16-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이하이드록시페닐)헥사데실 트리페닐포스포늄 염; 17-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이하이드록시페닐)헵타데실 트리페닐포스포늄 염; 18-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이하이드록시페닐)옥타데실 트리페닐포스포늄 염; 19-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이하이드록시페닐)노나데실 트리페닐포스포늄 염; 20-(4,5-다이메톡시-2-메틸-3,6-다이하이드록시페닐)이코실 트리페닐포스포늄 염과 같은 화합물; 여기서, 상기 염의 반대이온은 브로마이드, 메탄설포네이트, 에탄설포네이트, 프로판설포네이트, 벤젠설포네이트, p-톨루엔설포네이트, 또는 2-나프틸렌 설포네이트와 같은 약제학적으로 허용가능한 음이온이다.
부가적으로는, 항산화제의 공동-투여는 유익한 항산화제의 수준을 증가시키는 것으로 알려진 식품을 소비하는 형태를 취할 수 있는 것으로 사료된다. 이러한 식품은 정규 식품, 및 항산화제를 포함하는 "슈퍼푸드"를 둘 다 포함한다. 이들 식품으로는, 과일, 채소, 및 딸기, 블랙커런트, 블랙베리, 오렌지, 블루베리, 석류, 차, 커피, 올리브유, 초콜렛, 시나몬, 허브, 레드와인, 곡물 시리얼, 달걀, 육류, 레귐(legume), 너트, 시금치, 순무, 대황(rhubarb), 코카오 빈(cocao bean), 옥수수, 콩, 양배추 등과 같은 다른 식재료를 포함한다.
전달 및 부가적인 제형:
트리글리세라이드는 식물유 및 동물 지방의 주 구성분으로 잘 알려져 있다. 또한, 트리글리세라이드는 글리세롤과 3개의 지방산으로부터 유도되는 에스테르 화합물인 것으로 잘 알려져 있다. 트리글리세라이드는 에스테르 결합을 가수분해하는 리파제와 같은 효소에 의해 대사되어, 지방산과 글리세롤을 방출한다. 실제로, 이러한 대사는 지방산을 방출하며, 이 지방산은 지방산 수송체 단백질을 통해 세포에 의해 흡수될 수 있다. 여러 가지 질환의 치료에 유용한 PUFA 및 PUFA 모방체는 환자에게 투여하기 위해 트리글리세라이드, 다이글리세라이드, 및/또는 모노글리세라이드와 같은 지방으로 혼입될 수 있는 것으로 사료된다.
PUFA, PUFA 모방체, PUFA 프로드럭, 및 PUFA 및/또는 PUFA 모방체를 함유하는 트리글리세라이드의 전달은 변형된 식이요법을 통해 이루어질 수 있다. 다른 예로, PUFA, PUFA 모방체, PUFA 프로드럭, 및 PUFA 및/또는 PUFA 모방체를 함유하는 트리글리세라이드는 이 자체로, 또는 알부민과의 복합체를 포함하나 이로 한정되지 않는 '담체'와의 복합체로서, 식품 또는 식품 보조제로서 투여될 수 있다.
약물 전달 및 의약제 전달에 전형적으로 사용되는 방법과 같이, 보강된 PUFA 또는 이들의 전구체를 전달하는 방법을 또한 적용할 수 있다. 이들 방법은, 경구 전달, 국소 전달, 비내 전달과 같은 경점막 전달, 사상판(cribriform plate)을 통한 비내 전달, 정맥내 전달, 피하 전달, 흡입, 또는 점안액을 통한 전달을 포함하나, 이로 한정되지 않는다.
리포좀 전달 방법을 포함하나 이로 한정되지 않는, 표적화된 전달 방법 및 서방성 방출 방법을 또한, 적용할 수 있다.
본원에서 기술한 동위원소로 변형된 화합물은 시간 경과에 따라 투여할 수 있으며, 이때, 대상의 세포 및 조직은 화합물이 투여되는 기간 동안에 동위원소로 변형된 화합물의 수준을 증가시키는 것을 포함할 것으로 사료된다.
활성 성분을 포함하는 조성물은 정제, 트로키, 론제지, 수성 또는 유성 현탁액, 수-중-유 에멀젼, 분산성 분말 또는 과립, 에멀젼, 경질 또는 연질 캡슐, 또는 시럽 또는 엘릭셔와 같이 경구용으로 적합한 형태로 존재할 수 있다. 이러한 조성물은 벌킹제, 가용화제, 맛가림제, 안정화제, 착색제, 방부제, 및 약학 제형의 기술분야의 당업자에게 알려진 다른 제제들과 같은 부형제를 포함할 수 있다. 또한, 경구 형태는 본원에서 기술한 화합물을 포함하는 식품 또는 식품 보조제를 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 보조제는 맞춤-제조될 수 있어서, 오메가-3 또는 오메가-6 지방산과 같은 일 유형의 PUFA가 식품에 첨가되거나, 또는 식품이나 대상의 식이요법이 포함하는 주 지방에 따라 보조제로서 사용될 수 있다. 아울러, 조성물은 치료될 질환에 따라 맞춤형으로 제조될 수 있다. 예를 들어, LDL 관련 증상은, 리놀레산으로 제조되는 카디오리핀이 산화되기 때문에, 더 많은 양의 D-리놀레산을 필요로 할 수 있다. 다른 실시 양태에서, 망막 질환 및 신경학적/CNS 증상은, D-오메가-3 지방산이 이들 질환을 치료하는 데 보다 적절하기 때문에, D-리놀렌산과 같은 오메가-3 지방산을 더 많이 필요로 할 수 있다. 일부 측면에서, 질환이 HNE와 관련 있는 경우 D-오메가-6 지방산을 처방해야 하며, 반면, HHE와 관련 있는 경우에는 D-오메가-3 지방산을 처방해야 한다.
조성물은 또한, 스프레이, 크림, 연고, 로션으로서, 또는 패치, 붕대 또는 상처 드레싱에 대한 구성분 또는 첨가제로서, 국소 적용에 의한 전달에 적합할 수 있다. 이외에도, 화합물은 기계적인 수단에 의해 질환 부위에 전달하거나, 또는 정상적인 조직에는 거의 없거나 또는 존재하지 않으며 병에 걸린 조직의 양상에 대해 친화성을 가진 리포좀 (병에 걸린 조직에 대한 친화성을 제공하는 화학적 변형을 수반 또는 수반하지 않음), 항체, 앱타머(aptamer), 렉틴, 또는 알부민과 같은 화학적 리간드와 같이 전신 표적형 기술을 이용해 질환 부위로 표적화할 수 있다. 일부 측면에서, 화장품의 국소 적용은 패치와 같이 피부를 통해 전달하기 위한, 본원에서 기술한 동위원소로 변형된 화합물 또는 모방체인 담체의 용도를 포함할 수 있다. 안 장애(eye disorder)는 점안액으로 치료할 수 있다.
약학 조성물은 또한, 주사로 투여하기에 적합한 형태일 수 있다. 이러한 조성물은 용액, 현탁액 또는 에멀젼 형태로 존재할 수 있다. 이러한 조성물은 안정화제, 항균제, 또는 의약제의 기능을 개선하는 다른 물질들을 포함할 수 있다. 본 발명의 일부 측면들은 또한, 주사에 의한 투여 또는 경구나 국소 용도에 적합한 용액, 현탁액 또는 에멀젼으로 용이하게 형성 또는 재구성될 수 있는, 건조된 또는 말린(desiccated) 형태의 화합물을 포함한다. 주사에 의한 전달은 전신 전달, 및 눈과 관련된 장애를 치료하기 위해 눈에 주사하는 것과 같은 국소 전달에 적합할 수 있다.
투여량
일부 실시 양태에서, 화합물은 약 0.01 mg/kg 내지 약 1000 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 100 mg/kg, 및/또는 약 1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg으로 투여된다. 다른 실시 양태에서, 화합물은 약 0.01, 0.1, 1.0, 5.0, 10, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 및/또는 1000 mg/kg으로 투여된다.
실시예
실험: MALDI-TOF 질량 스펙트럼을 PE-ABI Voyager Elite 딜레이드(delayed) 추출 장비에서 기록하였다. 양이온 모드에서 25 KV의 가속 전압과 100 ms의 딜레이(dealy)에서 스펙트럼을 수득하였다. 다르게 명시되지 않는 한, 1H NMR 스펙트럼을 Varian Gemini 200 MHz 분광광도계에서 기록하였다. HPLC를 Waters 시스템에서 수행하였다. 화학물질은 Sigma-Aldrich Chemical Company (USA), Avocado research chemicals (UK), Lancaster Synthesis Ltd (UK), 및 Acros Organics (Fisher Scientific, UK)에서 입수하였다. 실리카 겔, TLC 플레이트 및 용매는 BDH/Merck 사 제품이었다. IR 스펙트럼은 Vertex 70 분광광도계로 기록하였다. 1H 및 13C NMR 스펙트럼은 CHCl3 (내부 표준으로서 1H의 경우, δ = 0.00에서 TMS 또는 δ = 7.26에서 CHCl3, 및 13C의 경우, δ = 77.0에서 CHCl3)에서 각각 400 MHz 및 100 MHz에서 Bruker AC 400 장비로 수득하였다.
당해 기술분야의 당업자는, 부가적인 산화-내성 화합물을 제조하기 위해, 후술하는 합성방법들을 용이하게 변형할 수 있음을 알 것이다. 예를 들어, 당업자는, 안정화된 화합물의 일 유형의 에스테르를 절단하여, 상응하는 카르복실산을 수득할 수 있음을 알 것이다. 마찬가지로, 카르복실산을 에스테르와 같은 부가적인 유도체로 쉽게 전환할 수 있다. 부가적으로는, 당업자는, 동위원소로 표지된 출발 물질의 아이덴터티에 변화를 줌으로써, 후술하는 화합물의 동위원소 변이체를 제조할 수 있음을 알 것이다. 후술하는 합성방법들에서, 후술하는 화합물의 동위원소 변이체를 제조할 수 있다. 후술하는 합성방법들에서, 파라포름알데하이드-d2를 동위원소로 표지된 출발 물질로 사용한다. 당업자는, 전술한 화합물의 파라포름알데하이드-d1, 포름알데하이드-d1, 파라포름알데하이드-d2, 포름알데하이드-d2, 및 탄소-13 표지된 변이체를 이용해 동일한 합성적 변환을 할 수 있음을 쉽게 알 것이다. 포름알데하이드-d1은 잘-특징화된 화합물로서, 일반적으로 알려지고 이해되는 합성 변환을 이용해, 포름산-d1, 포름산-d2, 및/또는 다이클로로메탄-d1과 같은 공지된 공급원으로부터 쉽게 이용가능하다. 더욱이, 본원에서 기술하는 화합물의 방사능 유사체는 트리튬-함유 출발 물질을 이용해 제조할 수 있다. 이들 화합물은 동물의 세포 및 조직에의 혼입을 측정하는 데 유용할 것이다.
실시예 1. 11,11- D2 - 리놀레산의 합성
Figure 112013107101794-pct00021
1,1- 다이듀테로 - 옥트 -2-아인-1-올 (2) 건조 THF (800 ㎖) 중 브로모에탄 (100 ㎖), 1,2-다이브로모에탄 (1 ㎖) 및 마그네슘 조각 (31.2 g)으로부터 제조한 에틸마그네슘 브로마이드의 용액에, 햅타인-1 ((1); 170 ㎖)을 아르곤 하에 30분 내지 60분 동안 적가하였다. 반응 혼합물을 1시간 동안 교반한 다음, 듀테로파라포름 (30 g)을 한번에 조심스럽게 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 2시간 동안 부드럽게 환류하고, -10℃로 냉각시킨 다음, 물 5-7 ㎖을 서서히 첨가하였다. 상기 혼합물을 쇄빙 0.5 kg 슬러리 및 진한 황산 40 ㎖에 붓고, 헥산 0.5 L로 세정하였다. 유기상을 분리하고, 잔여의 수성상을 5: 1 헥산: 에틸 아세테이트 (3 x 300 ㎖)로 추출하였다. 조합된 유기 분획을 sat. NaCl (1 x 50 ㎖), sat. NaHC03 (1 x 50 ㎖)로 세정하고, 및 Na2S04로 건조하였다. 용매를 진공 내에서 증발시켜, 무색 오일 119.3 g (99%)을 수득하였으며, 이를 추가의 정제 없이 사용하였다. HRMS, C8H12D2O에 대해 계산한 m/z: 128.1168; 측정값: 128.1173. 1H NMR (CDCl3, δ): 2.18 (t, J = 7.0, 2H), 1.57 (s, 1H), 1.47 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 1.31 (m, 4H), 0.87 (t, J = 7.0 Hz, 3H).
1,1- 다이듀테로 -1- 브로모 - 옥트 -2-아인 (3) 건조 다이에틸 에테르 (300 ㎖) 중 (2) (3.48 g; 27.2 mmol) 및 피리딘 (19 ㎖)의 용액에, 다이에틸 에테르 35 ㎖ 중 PBr3 36 ㎖을 아르곤 하에 -15℃에서 30분 동안 교반하면서 적가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 서서히 가온한 다음, 교반하면서 3시간, 교반하지 않으면서 1시간 환류하였다. 그런 다음, 상기 반응 혼합물을 -10℃로 냉각시키고, 냉수 500 ㎖을 첨가하였다. 잔여물이 용해되었을 때, 포화 NaCl (250 ㎖) 및 헥산 (250 ㎖)을 첨가하고, 유기층을 분리하였다. 수성 분획을 헥산 (2 x 100 ㎖)으로 세정하고, 조합된 유기 분획을 NaCl (2 x 100 ㎖)로 세정하고, 미량의 하이드로퀴논 및 트리에틸아민의 존재 하에 Na2SO4로 건조하였다. 용매를 증류로 대기압에서 제거하고, 이어서 회전 증발하였다. 잔여물을 진공 증류 (3 mm Hg)로 분획화하여, 담황색 오일 147.4 g (듀테로-파라포름 당 82% 카운팅)을 수득하였다. B.p. 75℃. HRMS, C8H11D2Br에 대해 계산한 m/z: 190.0324; 측정값: 189.0301, 191.0321. 1H NMR (CDCl3, δ): 2.23 (t, J = 7.0 Hz, 2H, CH2), 1.50 (m, 2H, CH2), 1.33 (m, 4H, CH2), 0.89 (t, J = 6.9 Hz, 3H, CH3),
11,11- 다이듀테로 - 옥타데카 -9,12- 다이아이노산 메틸 에스테르 (5) CuI (133 g)를 (CaH2로 새로 증류한) DMF 400 ㎖에 빠르게 첨가하고, 이어서 건조 NaI (106 g), K2CO3 (143 g)를 첨가하였다. 그런 다음, 데스-9-아이노산 메틸 에스테르 ((4); 65 g)를 한번에 첨가하고, 이어서 브로마이드 (3) (67 g)를 첨가하였다. 부가적인 DMF 250 ㎖을 사용해 플라스크 벽의 시약을 반응 혼합물 벌크로 헹궈낸 다음, 이를 12시간 동안 교반하였다. 그런 다음, 포화 수성 NH4Cl 500 ㎖을 교반하면서 첨가하고, 수 분 이내에 포화 수성 NaCl과, 헥산:EtOAc의 5:1 혼합물 (300 ㎖)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 15분 동안 더 교반한 다음, 미세 메쉬 스코트 글래스 필터(fine mesh Schott glass filter)를 통해 여과하였다. 잔여물을 헥산:EtOAc 혼합물로 수 회 세정하였다. 유기 분획을 분리하고, 수성상을 부가적으로 추출하였다 (3 x 200 ㎖). 조합된 유기 분획을 건조하고 (Na2SO4), 미량의 하이드로퀴논 및 다이페닐아민을 첨가하고, 용매를 진공 내에서 증발시켰다. 잔여물을 즉시 1 mm Hg에서 증류하여, 165-175℃ 비등 분획 79 g (77%)을 수득하였다. HRMS, C19H28D2O2에 대해 계산한 m/z: 292.2369; 측정값: 292.2365. 1H NMR (CDCl3, δ): 3.67(s,3H, OCH3),2.3 (t,J = 7.5 Hz, 2H, CH2),2.14 (t, J = 7.0 Hz, 4H, CH2), 1.63 (m, 2H, CH2), 1.47 (m, 4H, CH2), 1.3 (m, 10H, CH2), 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 3H, CH3).
11,11- 다이듀테로 - cis , cis - 옥타데카 -9,12- 다이엔산 메틸 에스테르 (6) 96% EtOH (400 ㎖) 중 니켈 아세테이트 테트라하이드레이트 (31.5 g)의 현탁액을, 염이 용해될 때까지 약 50-60℃로 교반하면서 가열하였다. 플라스크를 수소로 플러싱한 다음, (EtOH (170 ㎖) 중 NaBH4 현탁액 (7.2 g)을 15분 동안 교반한 다음 여과하여 제조한) NaBH4 용액 130 ㎖을 20-30분 동안 교반하면서 적가하였다. 15-20분 내에, 에틸렌다이아민 (39 ㎖)을 한번에 첨가하고, 이어서 5분 내에 EtOH (200 ㎖) 중 (5) (75 g)를 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 수소 (1 atm) 하에 매우 격렬히 교반하였다. 수소의 흡수는 약 2시간 내에 중단되었다. 상기 반응 혼합물에, 헥산 900 ㎖ 및 빙냉 AcOH 55 ㎖을 첨가하고, 물 (15 ㎖)을 첨가하였다. 헥산 (400 ㎖)을 첨가하고, 상기 혼합물이 분리되게 방치하였다. 수성 분획을 헥산:EtOAc 5:1 혼합물로 추출하였다. 추출의 완료는 TLC로 모니터링하였다. 조합된 유기상을 H2SO4 희석액으로 세정하고, 포화 NaHCO3 및 포화 NaCl로 세정한 다음, Na2SO4로 건조하였다. 용매를 감압 하에 제거하였다. 실리카 겔 (실리카 겔 60, Merck; 162 g)을 무수 MeCN (360 ㎖) 중 질산은 (43 g) 용액에 첨가하고, 용매를 회전증발로 제거하였다. 수득한 함침된 실리카 겔을 50℃ (흡입 펌프)에서 3시간 동안 건조한 다음, 오일 펌프에서 8시간 동안 건조하였다. 이 실리카는 산물 g 당 30 g으로 사용하였다. 상기 반응 혼합물을 소량의 헥산으로 용해시키고, 은-개질된 실리카 겔에 적용하고, 1-3% 구배의 EtOAc로 예비-세정하였다. 비극성 오염원을 세정하는 경우 (TLC에 의한 대조군), 산물을 10% EtOAc로 용출하고, 용매를 진공 증발시켜, 표제 에스테르 (6) 52 g을 무색 액체로서 수득하였다. HRMS, C19H32D2O2에 대해 계산한 m/z: 296.2682; 측정값: 296.2676. IR (CCl4):
Figure 112013107101794-pct00022
1740 cm-1. 1H NMR (CDCl3, δ): 5.32 (m, 4H), 3.66 (s, 3H, OCH3), 2.29 (t, J = 7.5 Hz, 2H, CH2), 2.02 (m, 4H, CH2), 1.60 (m, 2H, CH2), 1.30 (m, 14H, CH2), 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 3H, CH3).
11,11- 다이듀테로 - cis , cis - 옥타데카 -9,12- 다이엔산 (7) 수 (115 ㎖) 중 KOH (46 g)의 용액을 MeOH (60 ㎖) 중 에스테르 (6) (46 g)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 40-50℃에서 2시간 동안 교반한 다음 (TLC에 의한 대조군), 물 200 ㎖로 희석하였다. 용매의 2/3를 제거하였다 (회전증발). 희석된 황산을 잔여물에 pH 2가 되도록 첨가하고, 이어서 소량의 펜탄과 함께 다이에틸 에테르를 첨가하였다. 유기층을 분리하고, 수성층을 소량의 펜탄과 함께 다이에틸 에테르로 세정하였다. 조합된 유기 분획을 포화 수성 NaCl로 세정한 다음, Na2SO4로 건조하였다. 용매를 증발시켜, (7) (99%) 43 g을 수득하였다. IR (CCl4):
Figure 112013107101794-pct00023
　1741, 1711 cm-1.
실시예 2. 11,11,14,14- D4 -리놀렌산의 합성
Figure 112013107101794-pct00024
1,1- 다이듀테로 - 펜트 -2-아인-1-올 (9) 부트-1-아인 (8)을, 조(bath) (-5℃)에서 건조 THF (800 ㎖) 중 브로모에탄 (100 ㎖) 및 마그네슘 조각 (31.3 g)으로부터 제조한 에틸마그네슘 브로마이드의 용액을 통해 서서히 버블링하였다. 때때로, 상기 버블링을 중단하고, 부트-1-아인이 든 실린더를 칭량하여, 소비 속도를 측정하였다. 알카인의 공급은 상당량의 침전물이 형성된 직후, 중단하였다 (소비된 알카인의 측정된 질량이 125 g임). 반응 혼합물을 실온으로 30분 동안 가온한 다음, 15분 동안 교반하였다. 그런 다음, 상기 혼합물을 30℃ 이하로 가열하고, 이 온도에서 침전물이 용해되었고, 이후 다시 실온에서 30분 동안 교반하였다. 듀테로파라포름 (28 g)을 한번에 첨가하고, 상기 혼합물을 3시간 동안 환류하여, 투명한 용액을 형성하였다. 이를 실온으로 냉각시키고, 쇄빙 (800 g) 및 50 ㎖ 농축 H2SO4의 혼합물에 부었다. 헥산 (400 ㎖)을 첨가하고, 유기층을 분리하였다. 수성상을 NaCl로 포화시키고, 헥산:EtOAc 4:1 혼합물 (1 L)로 추출하였다. 추출 과정의 완료는 TLC로 모니터링하였다. 조합된 유기상을 포화 NaCl, NaHCO3로 세정하고 다시 NaCl로 세정하고, Na2SO4로 건조하였다. 용매를 대기압에서 (최대 수증기 온도 105℃) 증류로 제거하였다. 잔여물을 (70.5 g; 94%)을 추가의 정제 없이 사용하였다. HRMS, C5H6D2O에 대해 계산한 m/z: 86.0699; 측정값: 86.0751. 1H NMR (CDCl3, δ): 2.21 (q, J = 7.5 Hz, 2H, CH2), 1.93 (br s, 1H, OH), 1.12 (t, J = 7.5 Hz, 3H, CH3). 13C NMR (CDCl3, δ): 87.7, 77.6, 13.7, 12.3 (CD2의 신호는 부재).
1,1- 다이듀테로 -1- 브로모 - 펜트 -2-아인 (10) 건조 다이에틸 에테르 (280 ㎖) 중 (9) (70.5 g) 및 피리딘 (16.5 ㎖)의 용액에, 50 ㎖ 다이에틸 에테르 중 PBr3 32.3 ㎖을 아르곤 하에 -10℃에서 30분 동안 교반하면서 적가하였다. 반응 혼합물을 1시간 동안 실온으로 서서히 가온하였다. 소량의 하이드로퀴논을 첨가한 다음, 상기 혼합물을 4.5시간 동안 환류하였다. 그런 다음, 상기 반응 혼합물을 -10℃로 냉각시키고, 냉수 350 ㎖을 첨가하였다. 잔여물이 용해되었을 때, 포화 NaCl (350 ㎖) 및 헥산 (300 ㎖)을 첨가하고, 유기층을 분리하였다. 수성 분획을 다이에틸 에테르 (2 x 150 ㎖)로 세정하고, 조합된 유기 분획을 NaCl (2 x 50 ㎖)로 세정하고, 미량의 하이드로퀴논 및 트리에틸아민의 존재 하에 Na2SO4로 건조하였다. 용매를 대기압에서 제거한 다음, 147-155℃ 비등 분획을 증류시켰다. 다른 예로, 100℃에 도달하였을 때, 대기압에서 증류를 중단하고, 산물을 77-84℃ (25 mm Hg)에서 증류시켰다. 수율: 투명한 액체 107 g. HRMS, C5H5D2Br에 대해 계산한 m/z: 147.9855; 측정값: 146.9814, 148.9835. IR (CCl4):
Figure 112013107101794-pct00025
　2251 cm-1. 1H NMR (CDCl3, δ): 2.23 (q, J = 7.5 Hz, 2H, CH2), 1.11 (t, J = 7.5 Hz, 3H, CH3). 13C NMR (CDCl3, δ): 89.3, 74.5, 13.4, 12.6 (CD2의 신호는 부재).
1,1,4,4- 테트라듀테로 -옥 타 -2,5-다이아인-1-올 (12) 건조 THF 400 ㎖ 중 에틸 브로마이드 (53 ㎖) 및 마그네슘 조각 (15.8 g)으로부터 제조한 에틸마그네슘 브로마이드를, 이 혼합물을 통한 아세틸렌 버블링 (약 25 L/h 속도로)과 동시에 격렬히 교반하면서 건조 THF 350 ㎖에 조금씩 첨가하였다. 그리나드 시약(Grignard reagent) 용액을 2-5분 당 약 10 ㎖로 상기 혼합물에 공급하였다. 에틸마그네슘 브로마이드를 모두 첨가하였을 때 (약 2.5시간 후), 다시 15분 동안 상기 시스템을 통해 아세틸렌을 버블링하였다. 듀테로파라포름 (17.3 g) 및 CuCl (0.2 g)을 아르곤 하에 첨가하고, 반응 혼합물을 듀테로파라포름이 용해될 때까지 교반 없이 2.5시간 동안 환류하여, (11)의 용액을 수득하였다. 건조 THF 250 ㎖ 중 14.8 g 마그네슘 및 50 ㎖ 에틸 브로마이드로부터 제조한 에틸마그네슘 브로마이드 용액을 상기 반응 혼합물에 20분 동안 적가하였다. 가스 방출(gas emanation)이 중단되었을 때, 축합기를 부착하고, 용매 250 ㎖을 증류시켰다. 그런 다음, 상기 반응 혼합물을 30℃로 냉각시키고, CuCl (1.4 g)을 첨가한 후, 브로마이드 (10) (69 g)를 15분 동안 적가하였다. 그런 다음, 상기 반응 혼합물을 5시간 동안 환류하고, 약간 냉각시키고 (너무 빨리 냉각시키면 침전물이 형성될 것임), 쇄빙 슬러리 (1-1.2 kg) 및 진한 H2SO4 40 ㎖에 부었다. 상기 혼합물을 헥산 (600 ㎖)으로 세정하였다. 유기 분획을 분리하고, 수성 분획을 부가적으로 5:1 헥산:EtOAc (2 x 400 ㎖)로 추출하였다. 조합된 유기 분획을 포화 NaCl으로 세정한 후, 포화 NaHCO3 및 NaCl로 세정하였다. 용매의 벌크를 미량의 하이드로퀴논 및 트리에틸아민의 존재 하에 대기압에서 제거하였다. 잔여물을 실리카 겔 (용출액: 7:1 헥산:EtOAc) 100 ㎖을 통해 플러싱(flushing)하였다. 용매의 벌크를 대기압에서 제거한 다음, 잔여물을 회전증발하였다. 수득한 표제 화합물 49.5 g (85%)을 추가의 정제 없이 사용하였다. HRMS, C8H6D4O에 대해 계산한 m/z: 126.0979; 측정값: 126.0899. IR(CCl4):
Figure 112013107101794-pct00026
3622 cm-1. 1H NMR(CDCl3,δ):2.16(q,J=7.5Hz,2H, CH2), 1.85 (br s, 1 H, OH), 1.11 (t, J = 7.5 Hz, 3H, CH3). 13C NMR (CDCl3, δ): 82.3, 80.4, 78.3, 72.6, 13.7, 12.2
1,1,4,4- 테트라듀테로 -1- 브로모 -옥 타 -2,5- 다이아인 (13)을 브로마이드 (3)에 대해 기술한 바와 같이 합성하였으며; 피리딘 2 ㎖, PBr3 14 ㎖ 및 다이에틸 에테르250 ㎖을 알코올 (12) 54.2 g에 사용하였다. 산물을 4 mm Hg에서 증류로 정제하였다. 수율: (13) 53 g (65%); b.p. 100-110℃. HRMS, C8H5D4Br에 대해 계산한 m/z: 188.0135; 측정값: 187.0136, 189.0143. IR (CCl4):
Figure 112013107101794-pct00027
2255 cm-1. 1H NMR (CDCl3, δ): 2.13 (q, J = 7.5 Hz, 2H, CH2); 1.07 (t, J = 7.5 Hz, 3H, CH3). 13C NMR (CDCl3, δ): 82.5, 81.8, 75.0, 72.0, 13.6, 12.2.
11,11,14,14- 테트라듀테로 - 옥타데카 -8,12,15- 트리아이노익산 메틸 에스테르 (15)를 11,11-다이듀테로-옥타데카-9,12-다이아이노산 메틸 에스테르 (5)에 대해 기술한 것과 유사한 방식으로 합성하였다. CuI (97 g)를 (CaH2로 새로 증류한) DMF 400 ㎖에 빠르게 첨가한 후, 건조 NaI (77.5 g), K2CO3 (104.5 g)를 첨가하였다. 그런 다음, 데스-9-아이노산 메틸 에스테르 ((14); 47.5 g)를 한번에 첨가하고, 브로마이드 (13) (48.5 g)를 첨가하였다. 부가적인 DMF 250 ㎖을 사용해 플라스크 벽의 시약을 반응 혼합물 벌크로 헹궈낸 다음, 이를 12시간 동안 교반하였다. 그런 다음, 포화 수성 NH4Cl 500 ㎖을 교반하면서 첨가하고, 수 분 이내에 포화 수성 NaCl (300 ㎖)과, 헥산:EtOAc의 5:1 혼합물 (300 ㎖)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 15분 동안 더 교반한 다음, 미세 메쉬 스코트 글래스 필터를 통해 여과하였다. 잔여물을 헥산:EtOAc 혼합물로 수 회 세정하였다. 유기 분획을 분리하고, 수성상을 부가적으로 추출하였다 (3 x 200 ㎖). 조합된 유기 분획을 건조하고 (Na2SO4), 미량의 하이드로퀴논 및 다이페닐아민을 첨가하고, 용매를 진공 내에서 증발시켰다. 잔여물을 즉시 1 mm Hg에서 증류하여, 173-180℃ 비등 분획 45.8 g (62%)을 수득하였다. 부가적인 결정화는 하기와 같이 수행하였다. 에스테르 (15)를 헥산 (500 ㎖)에 용해시키고, -50℃로 냉각시켰다. 형성된 결정을 냉각 헥산으로 세정하였다. 이 단계의 수율은 80%이다. HRMS, C19H22D4O2에 대해 계산한 m/z: 290.2180; 측정값: 290.2200. 1H NMR (CDCl3, δ): 3.66 (s, 3H, ℃H3), 2.29 (t, J = 7.5 Hz, 2H, CH2), 2.15 (m, 4H, CH2), 1.61 (m, 2H, CH2), 1.47 (m, 2H, CH2), 1.30 (m, 6H, CH2), 1.11 (t, J = 7.5 Hz, 3H, CH3). 13C NMR (CDCl3, δ): 174.1, 82.0, 80.6, 74.7, 74.6, 73.7, 73.0, 51.3, 33.9, 28.9, 28.6, 28.52, 28.49, 24.8, 18.5, 13.7, 12.2.
11,11,14,14- 테트라듀테로 - cis , cis , cis - 옥타데카 -8,12,15-트리엔산 메 틸 에스테르 (16)을 11,11-다이듀테로-cis,cis-옥타데카-9,12-다이엔산 메틸 에스테르 ('6')에 대해 기술한 것과 유사한 방식으로 합성하였다 . 96% EtOH (400 ㎖) 중 니켈 아세테이트 테트라하이드레이트 (42 g)의 현탁액을, 염이 용해될 때까지 약 50-60℃로 교반하면서 가열하였다. 플라스크를 수소로 플러싱한 다음, (EtOH (170 ㎖) 중 NaBH4 현탁액 (7.2 g)을 15분 동안 교반한 다음 여과하여 제조한) NaBH4 용액 130 ㎖을 20-30분 동안 교반하면서 적가하였다. 15-20분 내에, 에틸렌다이아민 (52 ㎖)을 한번에 첨가하고, 이어서 5분 내에 EtOH (200 ㎖) 중 (15) (73 g)를 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 수소 (1 atm) 하에 매우 격렬히 교반하였다. 수소의 흡수는 약 2시간 내에 중단되었다. 상기 반응 혼합물에, 헥산 900 ㎖ 및 빙냉 AcOH 55 ㎖을 첨가하고, 물 (15 ㎖)을 첨가하였다. 헥산 (400 ㎖)을 첨가하고, 상기 혼합물이 분리되게 방치하였다. 수성 분획을 헥산:EtOAc 5:1 혼합물로 추출하였다. 추출의 완료는 TLC로 모니터링하였다. 조합된 유기상을 H2SO4 희석액으로 세정하고, 포화 NaHCO3 및 포화 NaCl로 세정한 다음, Na2SO4로 건조하였다. 용매를 감압 하에 제거하였다. 정제용 실리카 겔은 (6)에서 기술한 바와 같이 제조하였다. 이 실리카는 산물 g 당 30 g으로 사용하였다. 상기 반응 혼합물을 소량의 헥산으로 용해시키고, 은-개질된 실리카 겔에 적용하고, 1-5% 구배의 EtOAc로 예비-세정하였다. 비극성 오염원을 세정하는 경우 (TLC에 의한 대조군), 산물을 10% EtOAc로 용출하고, 용매를 진공 증발시켜, 표제 에스테르 (16) 42 g을 무색 액체로서 수득하였다. HRMS, m/z C19H28D4O2에 대해 계산한 m/z: 296.2649; 측정값: 296.2652. IR (CCl4):
Figure 112013107101794-pct00028
1740 cm-1. 1H NMR (CDCl3, δ): 5.4 (m, 6H, CH-이중 결합), 3.68 (s, 3H, OCH3), 2.33 (t, J = 7.5 Hz, 2H, CH2), 2.09 (m, 4H, CH2), 1.62 (m, 2H, CH2), 1.33 (m, 8H, CH2), 0.97 (t, J = 7.5 Hz, 3H, CH3). 13C NMR (CDCl3, δ): 174.1, 131.9, 130.2, 128.2, 128.1, 127.7, 126.9, 51.3, 34.0, 29.5, 29.04, 29.02, 27.1, 25.5, 24.9, 20.5, 14.2.
11,11,14,14- 테트라듀테로 - cis , cis , cis - 옥타데카 -8,12,15- 트리엔산 (17) 수 (2.6 ㎖) 중 KOH (1.5 g, 27 mmol)의 용액을 MeOH (15 ㎖) 중 에스테르 (16) (1.00 g, 3.4 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 40-50℃에서 2시간 동안 교반한 다음 (TLC에 의한 대조군), 물 200 ㎖로 희석하였다. 용매의 2/3를 제거하였다 (회전증발). 희석된 황산을 잔여물에 pH 2가 되도록 첨가하고, 이어서 소량의 펜탄 (50 ㎖)과 함께 다이에틸 에테르를 첨가하였다. 유기층을 분리하고, 수성층을 소량의 펜탄 (3 x 30 ㎖)과 함께 다이에틸 에테르로 세정하였다. 조합된 유기 분획을 포화 수성 NaCl로 세정한 다음, Na2SO4로 건조하였다. 용매를 증발시켜, (17) (100%) 0.95 g을 수득하였다. IR (CCl4):
Figure 112013107101794-pct00029
1741, 1711 cm-1.
실시예 3. 14,14- D2 -리놀렌산의 합성
Figure 112013107101794-pct00030
4,4- 다이듀테로 - 옥타 -2,5- 다이아인 -1-올 (19) 얼음조에서 건조 THF 40 ㎖ 중 에틸 브로마이드 (9.2 ㎖, 123.4 mmol) 및 마그네슘 조각 (2.74 g, 112.8 mmol)에서 제조한 에틸마그네슘 브로마이드의 용액에, THF (5 ㎖) 중 프로파길 알코올 (3.16 g, 56.4 mmol)을 10분 내지 15분 동안 교반하면서 적가하였다. 반응 혼합물이 실온으로 가온되도록 방치한 후, 40℃로 때때로 가온하면서 다시 2시간 동안 교반하였다. 이렇게 생성된 2가 음이온에, CuCl 0.13 g을 첨가하고, THF (20 ㎖) 중 브로마이드 (10) (6.9 g)를 서서히 (15분 동안) 첨가하였다. 그런 다음, 상기 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하고, 5시간 동안 환류하였다. 그런 다음, 상기 반응 혼합물을 5시간 동안 환류하고, 약간 냉각시키고 (너무 빨리 냉각되면 침전물이 형성될 것임), 쇄빙 슬러리 및 진한 H2SO4 2.5 ㎖에 부었다. 상기 혼합물을 헥산 (600 ㎖)으로 세정하였다. 유기 분획을 분리하고, 수성 분획을 부가적으로 5:1 헥산:EtOAc로 추출하였다. 조합된 유기 분획을 포화 NaCl으로 세정한 후, 포화 NaHCO3 및 NaCl로 세정하고, Na2SO4로 건조하였다. 용매의 벌크를 미량의 하이드로퀴논 및 트리에틸아민의 존재 하에 대기압에서 제거하였다. 잔여물을 CC (헥산:EtOAc = 15:1)로 정제하여, 산물 19를 3.45 g (59%) 수득하였다. HRMS, C8H8D2O에 대해 계산한 m/z: 124.0855; 측정값: 124.0849. IR (CCl4):
Figure 112013107101794-pct00031
3622 cm-1. 1H NMR (CDCl3, δ): 4.21 (m, 2H, CH2), 2.4 (m, 1H, OH), 2.16 (q, J = 7.5 Hz, 2H, CH2), 1.11 (t, J = 7.5 Hz, 3H, CH3). 13C NMR (CDCl3, δ): 82.3, 80.4, 78.3, 72.6, 51.0, 13.7, 12.2.
4,4- 다이듀테로 -1- 브로모 - 옥타 -2,5- 다이아인 (20)은, 모든 용매를 회전증발로 제거하는 점을 제외하고는, (3)에 기술한 바대로 합성하였다. (19) 3.4 g (27 mmol)으로부터, 브로마이드 (20) 3.9 g (75%)을 수득하고, 이를 추가의 정제 없이 사용하였다 HRMS, C8H7D2Br에 대해 계산한 m/z: 186.0011; 측정값: 185.0019, 187.0012. IR (CCl4):
Figure 112013107101794-pct00032
2255 cm-1. 1H NMR (CDCl3, δ): 3.88 (br s, 2H, CH2), 2.13 (q, J = 7.5 Hz, 2H, CH2), 1.07 (t, J = 7.5 Hz, 3H, CH3). 13C NMR (CDCl3, δ): 82.5, 81.8, 75.0, 72.0, 14.8, 13.6, 12.2.
14,14- 다이듀테로 - 옥타데카 -8,12,15- 트리아이노익산 메틸 에스테르 (21)를 (5)에 기술한 바대로 합성하였다. 9.7 g CuI, 7.8 g NaI, 10.5 g K2CO3, 4.85 g의 브로마이드 (20), 4.75 g의 메틸 에스테르 (14) 및 무수 DMF 40 ㎖로부터 수득한 산물을 CC (25:1 헥산:EtOAc)로 정제하여, 표제 화합물 4.5 g (60%)을 수득하였다. HRMS, C19H24D2O2에 대해 계산한 m/z: 288.2056; 측정값: 288.2046. 1H NMR (CDCl3, δ): 3.66 (s, 3H, OCH3), 3.12 (m, 2H, CH2), 2.29 (t, J = 7.5 Hz, 2H, CH2), 2.15 (m, 4H, CH2), 1.61 (m, 2H, CH2), 1.47 (m, 2H, CH2), 1.30 (m, 6H, CH2), 1.11 (t, J = 7.5 Hz, 3H, CH3). 13C NMR (CDCl3, δ): 174.1, 82.0, 80.6, 74.7, 74.6, 73.7, 73.0, 51.3, 33.9, 28.9, 28.6, 28.52, 28.49, 24.8, 18.5, 13.7, 12.2, 9.7.
14,14- 다이듀테로 - cis , cis , cis - 옥타데카 -8,12,15- 트리엔산 메틸 에스테르 (22)를 리놀레산 유도체 (6)에 기술한 바대로 합성하였다. (21) 4.5 g의 환원을 위해, 니켈 아세테이트 테트라하이드레이트 2.6 g 및 에틸렌다이아민 3.2 ㎖을 사용하였다. 산물을 (6)에 기술한 바대로 AgNO3-함침된 실리카 겔에서 정제하였다. HRMS, C19H30D2O2에 대해 계산한 m/z: 294.2526; 측정값: 294.2529. IR (CCl4):
Figure 112013107101794-pct00033
1740 cm-1. 1H NMR (CDCl3, δ): 5.37 (m, 6H, CH-이중 결합), 3.68 (s, 3H, OCH3), 2.82 (m, 2H, CH2), 2.33 (t, J = 7.5 Hz, 2H, CH2), 2.09 (m, 4H, CH2), 1.62 (m, 2H, CH2), 1.33 (m, 8H, CH2), 0.97 (t, J = 7.5 Hz, 3H, CH3). 13C NMR (CDCl3, δ): 174.1, 131.9, 130.2, 128.2, 128.1, 127.7, 126.9, 51.3, 34.0, 29.5, 29.1, 29.04, 29.02, 27.1, 25.5, 24.9, 20.5, 14.2.
14,14- 다이듀테로 - cis , cis , cis - 옥타데카 -8,12,15- 트리엔산 (23) MeOH (15 ㎖) 중 (22) (1 g, 3.4 mmol)의 용액에, 수 (2.6 ㎖) 중 KOH (1.5 g, 27 mmol)의 용액을 한번에 첨가하였다. 그런 다음, 상기 반응 혼합물을 (7)에 기술한 바대로 처리하여, 표제 산 0.94 g (99%)을 수득하였다. IR (CCl4):
Figure 112013107101794-pct00034
1741, 1711 cm-1.
실시예 4. 11,11- D2 -리놀렌산의 합성
Figure 112013107101794-pct00035
펜트 -2-아인-1-올 (24) 부타인-1 ((8); 10.4 g)을 THF (100 ㎖) 중 브로모에탄 (11.2 ㎖) 및 마그네슘 조각 (3.6 g)으로부터 제조한 빙냉 용액을 통해 버블링하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온되게 방치한 다음, 15분 동안 교반하였다. 그런 다음, 상기 혼합물을 30℃로 가열하고, 이 온도에서 침전물은 모두 용해되었다. 가열을 제거하고, 혼합물을 다시 30분 동안 교반한 후, 파라포름 (3 g)을 한번에 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 3시간 동안 (파라포름이 모두 용해될 때까지) 환류한 다음, 실온으로 냉각시키고, 쇄빙 (80 g) 및 농축 H2SO4 8 ㎖의 혼합물에 붓고, 다이에틸 에테르로 추출하였다. 유기상을 포화 NaHCO3 및 NaCl으로 세정하고, Na2SO4로 건조하였다. 용매를 회전증발로 제거하고, 잔여물을 (7.56 g; 90%)을 추가의 정제 없이 사용하였다. HRMS, C5H8O에 대해 계산한 m/z: 84.0575; 측정값: 84.0583.
1- 브로모 - 펜트 -2-아인 (25) 건조 다이에틸 에테르 (34 ㎖) 중 (24) (11.7 g) 및 피리딘 (2.66 ㎖)의 용액에, 다이에틸 에테르 5 ㎖ 중 PBr3 5.2 ㎖을 아르곤 하에 -10℃에서 30분 동안 교반하면서 적가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 1시간 동안 서서히 가온하였다. 하이드로퀴논 촉매량을 첨가한 다음, 상기 혼합물을 4.5시간 동안 환류하였다. 그런 다음, 상기 반응 혼합물을 -10℃로 냉각시키고, 냉수 35 ㎖을 첨가하였다. 잔여물이 용해되었을 때, 포화 NaCl (35 ㎖) 및 다이에틸 에테르 (30 ㎖)를 첨가하고, 유기층을 분리하였다. 수성 분획을 다이에틸 에테르 (2 x 15 ㎖)로 세정하고, 조합된 유기 분획을 NaCl (2 x 400 ㎖) 로 세정하고, MgSO4로 건조하였다. 용매를 대기압과, 이어서 감압 (25 mm Hg) 하에 제거하고, 60-90℃ 분획을 회수하였다. 수율: 11.1 g (84%). HRMS, C5H7Br에 대해 계산한 m/z: 145.9731; 측정값: 144.9750, 146.9757.
1,1- 다이듀테로 - 옥타 -2,5- 다이아인 -1-올 (26)을 (12)에 기술한 바대로 합성하였으며, 수율은 87%였다. HRMS, C8H8D2O에 대해 계산한 m/z: 124.0855;측정값:124.0868. IR (CCl4):
Figure 112013107101794-pct00036
3622 cm-1. 1H NMR (CDCl3, δ): 2.65 (m, 2H, CH2), 2.4 (m, 1H, OH), 2.1 (q, 2H, CH2), 1.09 (t, 3H, CH3).
1,1- 다이듀테로 -1- 브로모 - 옥타 -2,5- 다이아인 (27)을 모든 용매를 회전증발로 제거하는 점을 제외하고는, (3)에 기술한 바대로 합성하였다. 산물을 감압에서 증류로 정제하였다. 수율: 86% (4 mm Hg에서 b.p. 100-105℃). HRMS, C8H7D2Br에 대해 계산한 m/z: 186.0011; 측정값: 184.9948, 187.9999. IR (CCl4):
Figure 112013107101794-pct00037
2255 cm-1. 1H NMR (CDCl3, δ): 2.66 (m, 2H, CH2), 2.1 (q, 2H, CH2), 1.09 (t, 3H, CH3).
11,11- 다이듀테로 - 옥타데카 -8,12,15- 트리아이노익산 메틸 에스테르 (28)를 (5)에 기술한 바대로 합성하였다. CuI 7.1 g, NaI 5.66 g, K2CO3 7.65 g, 브로마이드 (27) 3.55 g, 메틸 에스테르 (14) 3.47 g 및 무수 DMF 30 ㎖로부터 수득한 산물을 CC (25:1 헥산:EtOAc)로 정제하여, 표제 화합물 3.7 g을 수득하였다. HRMS, C19H24D2O2에 대해 계산한 m/z: 288.2056; 측정값: 288.2069. 1H NMR (CDCl3, δ): 3.7 (s, 3H, OCH3), 3.15 (br. s, 2H, CH2), 2.35 (m, 2H, CH2), 2.17 (m, 4H, CH2), 1.61 (m, 2H, CH2), 1.48 (m, 2H, CH2), 1.35 (m, 6H, CH2), 1.11 (t, 3H, CH3).
11,11- 다이듀테로 - cis , cis , cis - 옥타데카 -8,12,15- 트리엔산 메틸 에스테르 (29)를 리놀레산 유도체 (6)에 기술한 바대로 합성하였다. (28) 3.7 g의 환원을 위해, 니켈 아세테이트 테트라하이드레이트 2.16 g 및 에틸렌다이아민 2.62 ㎖을 사용하였다. 산물을 (6)에 기술한 바대로 AgNO3-함침된 실리카 겔에서 정제하여, 1.5 g을 수득하였다. HRMS, C19H30D2O2에 대해 계산한 m/z: 294.2526; 측정값: 294.2402. IR (CCl4):
Figure 112013107101794-pct00038
1740 cm-1. 1H NMR (CDCl3, δ): 5.37 (m, 6H, CH-이중 결합), 3.6 (s, 3H, OCH3), 2.82 (m, 2H, CH2), 2.33 (t, = 7.5 Hz, 2H, CH2), 2.09 (m 4H, CH2), 1.62 (m, 2H, CH2), 1.33 (m, 8H, CH2), 0.97 (t, J = 7.5 Hz, 3H, CH3). 13C NMR (CDCl3, δ): 174.1, 131.9, 130.2, 128.2, 128.1, 127.7, 126.9, 51.3, 34.0, 29.5, 29.1, 29.04, 29.02, 27.1, 25.5, 24.9, 20.5, 14.2.
11,11- 다이듀테로 - cis , cis , cis - 옥타데카 -8,12,15- 트리엔산 (30) MeOH (7.5 ㎖) 중 (29) (1.5 g, 5.1 mmol)의 용액에, 수 (3 ㎖) 중 KOH (1.5 g, 27 mmol)의 용액을 한번에 첨가하였다. 그런 다음, 상기 반응 혼합물을 (17)에 기술한 바대로 처리하여, 표제 산 0.9 g을 수득하였다. IR (CCl4):
Figure 112013107101794-pct00039
1741, 1711 cm-1. 1H NMR (CDCl3, δ): 11.2 (br s, 1 H, COOH), 5.37 (m, 6H, CH-이중 결합), 2.83 (m, 2H, CH2), 2.35 (t, J = 7.5 Hz, 2H, CH2), 2.06 (m 4H, CH2), 1.63 (m, 2H, CH2), 1.32 (m, 8H, CH2), 0.97 (t, J = 7.5 Hz, 3H, CH3). 13C NMR (CDCl3, δ): 180.4, 131.9, 130.2, 128.3, 128.1, 127.6, 127.1, 34.1, 29.5, 29.1, 29.03, 28.98, 27.2, 25.5, 24.6, 20.5, 14.2.
실시예 5. 8,8- D 2 - 리놀레산 메틸 에스테르의 합성
Figure 112013107101794-pct00040
8- 하이드록시옥탄산 (502). DMF (200 ㎖) 중 8-브로모카프릴산 (501, 37.5 g, 168 mmol), 무수 소듐 아세테이트 (60.0 g, 732 mmol) 및 소듐 요오다이드 (1.0 g, 6.7 mmol)의 용액을 110-120℃에서 8시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 수 (150 ㎖) 중 수산화칼륨 (28 g, 0.5 mol)의 용액을 첨가하고, 상기 혼합물을 100℃에서 1시간 더 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 얼음 슬러리 및 진한 황산 (45 ㎖)에 부었다. 수득한 용액을 NaCl로 포화시키고, EtOAc 및 페트로레움 에테르 (1:1) (9 x 150 ㎖)의 혼합물로 추출하였다. 조합된 유기 분획을 포화 NaCl로 2회 세정하고, Na2SO4로 건조하였다. 용매를 증발시켜, 산물 26.5 g (98%)을 수득하고, 이를 추가의 정제 없이 사용하였다. 소량의 산물을 실리카 상 CC (용출액: 페트로레움 에테르:EtOAc = 2:1)로 정제하고, 특징화하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.27-1.39 (m, 6H), 1.50-1.68 (m, 4H), 2.32 (t, 2H, J= 7.5 Hz), 3.62 (t, 2H, J= 6.5 Hz), 6.87 (br. s., 2H).
메틸 8-( 테트라하이드로 -2 H -피란-2- 일옥시 ) 옥타노에이트 (503). 8-하이드록시옥탄산 (502; 26.3 g, 164 mmol)을 아세틸 클로라이드 (3.5 ㎖)를 포함하는 메탄올 (500 ㎖)에 용해시켰다. 반응 혼합물을 5시간 동안 환류하고, 용매를 진공 내에서 제거하였다. CH2Cl2 (200 ㎖)에서 용해시킨 잔여물에, 3,4-다이하이드로-2H-피란 (29 ㎖, 318 mmol)을 첨가하고, 상기 반응 혼합물을 20분 동안 환류하였다. 트리에틸아민 5 ㎖의 첨가 시, 용매를 진공 내에서 제거하고, 잔여물을 페트로레움 에테르 (100 ㎖)에 용해시키고, 물로 세정하였다. 유기층을 작은 실리카 컬럼 (실리카, 100 ㎖; 용출액: 페트로레움 에테르 → 페트로레움 에테르:EtOAc = 20:1)에서 플러시-정제하였다. 후속작업을 하여, 산물 38.2 g (90%)을 수득하고, 이를 추가의 정제 없이 사용하였다. 소량의 산물을 실리카 (용출액: 페트로레움 에테르: EtOAc = 15:1)에서 CC로 추가로 정제하고, 특징화하였다. IR (CCl4):
Figure 112013107101794-pct00041
1741 cm-1. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.20-1.36 (m, 6H), 1.40-1.82 (m, 10H), 2.23 (t, 2H, J= 7.5 Hz), 3.30 (dt, 1 H, J = 9.5 Hz, 6.5 Hz), 3.39-3.46 (m, 1H), 3.59 (s, 3H), 3.65 (dt, 1 H, J = 9.5 Hz, 7.0 Hz), 3.76-3.83 (m, 1H), 4.47-4.52 (m, 1H).
[1,1- D 2 ]-8-( 테트라하이드로 -2 H -피란-2- 일옥시 )옥탄-1-올 (504). 얼음 조에서 다이에틸 에테르 (100 ㎖) 중 에스테르 (503) (37.5 g, 145 mmol)의 교반된 용액에, 다이에틸 에테르 (300 ㎖) 중 LiAlD4 (4.0 g, 95 mmol)의 현탁액을 1시간 동안 적가하였다. 냉각 반응 혼합물에, 물 (4 ㎖), 15% NaOH (4 ㎖) 및 물 (12 ㎖)을 교반하면서 첨가하였다. 침전물을 여과하고, 에틸 에테르로 세정하였다. 진공 내에서 증발시켜, 산물 33.5 g (99%)을 수득하였다. 소량의 산물을 실리카 (용출액: 페트로레움 에테르: EtOAc = 10:1)에서 CC로 추가로 정제하여, 특징화하였다. IR (CCl4):
Figure 112013107101794-pct00042
3638, 3499 cm-1. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.22-1.33 (m, 8H), 1.42-1.56 (m, 8H), 1.61-1.69 (m, 1H), 1.71-1.80 (m, 1H), 2.38 (br. s., 1H), 3.31 (dt, 1 H, J = 9.5 Hz, 6.5 Hz), 3.40-3.46 (m, 1H), 3.66 (dt, 1 H, J = 9.5 Hz, 7.0 Hz), 3.76-3.84 (m, 1H), 4.49-4.53 (m, 1H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 19.5, 25.3, 25.5, 26.0, 29.2, 29.3, 29.5, 30.6, 32.4, 62.1, 67.5, 98.7.
[1,1- D 2 ]-8-( 테트라하이드로 -2 H -피란-2- 일옥시 ) 옥틸 메탄설포네이트 (505). 0℃에서 다이에틸 에테르 (300 ㎖) 중 알코올 (504) (33.4 g, 144 mmol) 및 트리에틸아민 (45 ㎖, 323 mmol)의 용액에, 다이에틸 에테르 (100 ㎖) 중 MsCl (14.2 ㎖, 183 mmol)의 용액을 1시간 동안 교반하면서 적가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하고, 물로 처리하였다. Et2O로 세정(2 x 50 ㎖)한 수성상과 조합된 유기상을 포화 NaCl로 2회 세정하고, Na2SO4로 건조하고, 경사분리하였다. 이를 작은 실리카 컬럼 (실리카, 100 ㎖; 페트로레움 에테르:EtOAc = 10:1)에서 플러시-정제하였다. 후속작업을 하여, 메탄설포네이트 (505) 43.7 g (98%)을 수득하였다. IR　(CCl4):
Figure 112013107101794-pct00043
1739 cm-1. 1H　NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.26-1.41 (m, 8H), 1.44-1.59 (m, 6H), 1.63-1.84 (m, 4H), 2.97 (s, 3H), 3.32 (dt, 1 H, J = 9.5 Hz, 6.5 Hz), 3.42-3.50 (m,1H), 3.69 (dt, 1 H, J = 9.5 Hz, 7.0 Hz) 3.78-3.86 (m, 1H), 4.52-4.56 (m, 1H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 19.6, 25.2, 25.4, 26.0, 28.7, 28.8, 29.1, 29.5, 30.7, 37.2, 62.3, 67.4, 98.8.
2-([8,8- D 2 ]- 데스 -9-아인-1- 일옥시 ) 테트라하이드로 -2 H -피란 (506). DMSO (100 ㎖) 중 메탄설포네이트 (505) (43.5 g, 140 mmol)를 DMSO (200 ㎖) 중 에틸렌다이아민 - 리튬 아세틸렌이드 복합체 (70 g, 0.76 mol)의 현탁액에 1시간 동안 교반하면서 적가한 다음, 혼합물을 90분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 얼음에 붓고, 추출하고 (Et2O, 3 x 150 ㎖), Na2SO4로 건조하고, 증발시켰다. 이를 작은 실리카 컬럼 (실리카, 100 ㎖; 페트로레움 에테르)에서 플러시-정제하였다. 용매를 제거하여 (회전증발), 산물 25.3 g (75%)을 수득하였다. 소량의 산물을 실리카 (용출액: 페트로레움 에테르: EtOAc = 25:1)에서 CC로 추가로 정제하고, 특징화하였다. IR (CCl4):
Figure 112013107101794-pct00044
3314 cm-1. 1H　NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.21-1.38 (m, 8H), 1.42-1.57 (m, 8H), 1.62-1.70 (m, 1H), 1.73-1.83 (m, 1H), 1.89 (s, 1H), 3.32 (d.t., 1 H, J = 9.5 Hz, 6.5 Hz), 3.42-3.50 (m, 1H), 3.68 (d.t., 1 H, J = 9.5 Hz, 7.0 Hz) 3.78-3.86 (m, 1H), 4.51-4.54 (m, 1H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 19.6, 25.4, 26.1, 28.1, 28.5, 28.9, 29.2, 29.6, 30.6, 30.7, 62.1, 67.5, 68.0, 98.7.
[8,8- D 2 ]- 데스 -9-아인-1-올 (507). 에테르 (506) (25 g, 104 mmol)를 피리디늄 para-톨루엔설포네이트 (0.2 g)를 포함하는 메탄올 (300 ㎖)에 용해시켰다. 반응 혼합물을 3시간 동안 환류하고, Et3N (1 ㎖)으로 퀀칭하고, 용매를 진공 내에서 제거하고, 잔여물을 페트로레움 에테르에 용해시키고, 소량의 실리카 겔을 통해 여과하였다. 용매를 증발시켜, 산물 15.4 g (95%)을 수득하였다. 소량의 산물을 실리카 (용출액: 페트로레움 에테르: EtOAc = 15:1)에서 CC로 추가로 정제하고, 특징화하였다. IR (CCl4):
Figure 112013107101794-pct00045
3638, 3508, 3314 cm-1. 1H　NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.22-1.40 (m, 8H), 1.42-1.56 (m, 4H), 1.91 (s, 1H), 2.29 (br. s., 1H), 3.59 (t, J= 6.5 Hz, 2H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 25.6, 28.1, 28.5, 29.0, 29.2, 32.6, 62.8, 68.1, 84.6.
[8,8- D 2 ]- 메틸 데스 -9- 이노에이트 (508). 30℃에서 교반 중인 수조 위의 2-구 둥근 바닥 플라스크에 든 수 (100 ㎖) 중 크로뮴 트리옥사이드 (24 g, 0.24 mol) 및 진한 황산 (21 ㎖)의 용액에, 아세톤 (150 ㎖) 중 알코올 (507) (15.5 g, 99 mmol)의 용액을 90분 동안 적가하였다. 첨가 시, 반응 혼합물을 15분 더 교반하고, 과량의 산화제를 이소프로필 알코올로 퀀칭하였다. 상기 혼합물을 냉수에 붓고, 다이에틸 에테르 (5 x 50 ㎖)로 추출하였다. 조합된 유기 분획을 포화 NaCl로 세정하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하고, 용매를 진공 내에서 제거하였다. 잔여물을 메탄올 (200 ㎖)에 용해시키고, 진한 황산 (1 ㎖)의 첨가 시, 90분 동안 환류하였다. 상기 산을 트리에틸아민 (6.5 ㎖, 47 mmol)으로 퀀칭하고, 용매를 진공 내에서 제거하고, 잔여물을 실리카 (용출액: 페트로레움 에테르: EtOAc = 50:1)에서 CC로 정제하여, 에스테르 (508) 12.6 g (알코올 (507) 당 69% 카운팅)을 수득하고, 특징화하였다. IR (CCl4):
Figure 112013107101794-pct00046
3314, 1740 cm-1. 1H　NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.19-1.38 (m, 6H), 1.41-1.48 (m, 2H), 1.51-1.61 (m, 2H), 1.88 (s, 1H), 2.25 (t, J= 7.5 Hz, 2H), 3.60 (s, 3H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 24.7, 28.0, 28.3, 28.6, 28.8, 33.9, 51.3, 68.1, 84.4, 174.0.
[8,8- D 2 ]- 메틸 옥타데카 -9,12- 다이이노에이트 (510). DMF (20 ㎖)에 CuI (3.9 g, 20 mmol)와, 이어서 NaI (3.1 g, 21 mmol), K2CO3 (4.2 g, 30 mmol), 에스테르 (508) (1.9 g, 10.3 mmol), 및 브로마이드 (509) (2.04 g, 10.8 mmol, [2]에서 기술한 바대로 합성함)를 교반하면서 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 포화 수성 염화암모늄 (20 ㎖)을 상기 혼합물에 첨가하고, 포화 NaCl (15 ㎖)을 첨가하였다. 침전물 및 수성상을 페트로레움 에테르로 세정하였다. 조합된 유기 분획을 포화 염화나트륨으로 세정하고, Na2SO4로 건조하고, 진공 내에서 증발시켰다. 잔여물을 실리카 (용출액: 페트로레움 에테르: EtOAc = 50:1)에서 CC로 정제하여, 산물 2.47 g (82%)을 수득하였다. 1H　NMR (400 MHz, CDCl3) δ 0.86 (t, J= 7.0 Hz, 3H), 1.22-1.36 (m, 10H), 1.40-1.50 (m, 4H), 1.55-1.64 (m, 2H), 2.09-2.15 (m, 2H), 2.28 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 3.09 (t, J=2.5 Hz, 2H), 3.64 (s, 3H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 9.6, 13.9, 18.6, 22.1, 24.8, 28.3, 28.4, 28.5, 28.7, 28.9, 31.0, 34.0, 51.4, 74.4, 74.5, 80.2, 80.4, 174.2.
[8,8- D 2 ]- 옥타데카 -9,12- 디에노에이트 (511). 96% 에탄올 (25 ㎖) 중 미분된 Ni(Ac)2 x 4H2O (0.8 g, 3.2 mmol)의 현탁액을, 염이 완전히 용해될 때까지 50-60℃로 교반하면서 가열하였다. 시스템을 수소로 플러싱한 다음, NaBH4 (3.4 ㎖; 에탄올 (12 ㎖) 중 NaBH4 현탁액 (0.53 g, 14 mmol)을 15분 동안 교반한 후, 미세 필터를 통해 여과하여 수득함)의 용액을 10분 동안 첨가하였다. 수소의 발생을 관찰하였다. 15분 내지 20분 내에, 에틸렌다이아민 (1.65 ㎖, 25 mmol)을 상기 반응 혼합물에 교반하면서 한번에 첨가하고, 에탄올 (10 ㎖) 중 (510) (2.4 g, 8.2 mmol)의 용액을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을, 수소의 흡수가 더이상 존재하지 않을 때까지, 수소 하에 격렬히 교반한 다음, 아세트산 (2.3 ㎖), 수 (10 ㎖)로 처리하고, 페트로레움 에테르:EtOAc (5:1)로 추출하였다. 조합된 유기 분획을 10% 황산 (10 ㎖)으로 세정한 다음, 포화 염화나트륨으로 세정하고, Na2SO4로 건조하고, 용매를 진공 내에서 증발시켰다. 잔여물을 실리카 (용출액: 페트로레움 에테르: EtOAc = 50:1)에서 CC로 정제하여, 2.33 g (96%)을 수득하였다. 그런 다음, 산물을 20% AgNO3 (용출액: 페트로레움 에테르 → 페트로레움 에테르: EtOAc = 2:1)가 함침된 실리카에서 CC로 다시 정제하였다. 산물 1.75 g (72%)을 수득하였다 (CG에 의해 97% 순도). 1H　NMR (400 MHz, CDCl3) δ 0.88 (t, J= 7.0 Hz, 3H), 1.20-1.40 (m, 14H), 1.55-1.66 (m, 2H), 1.97-2.09 (m, 2H), 2.29 (t, J= 7.5 Hz, 2H), 2.72-2.79 (m, 2H), 3.66 (s, 3H), 5.28-5.41 (m, 4H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 14.0, 22.5, 24.9, 25.6, 27.2, 29.00, 29.08, 29.13, 29.3, 29.4, 31.5, 34.1, 51.4, 127.9, 128.0, 129.9, 130.2, 174.2.
실시예 6. 11-D- 리놀레산의 합성
Figure 112013107101794-pct00047
옥트 -2-아인-1-올 (13). 0℃로 냉각시킨 에탄올 (15 ㎖) 중 옥트-2-이날 [See Corey, E.J.; Schmidt, G. Tetrahedron Lett . 1979, 20, 399; Meyer, M. P.; Klinman, J. P. Tetrahedron Lett . 2008, 49, 3600] ((612); 1.00 g, 8.1　mmol))의 용액에, NaBD4 0.11 g (2.6 mmol)을 5분 동안 나누어서 첨가하였다. 첨가 시, 상기 용액을 30분 동안 더 교반하고, 물 (100 ㎖)로 희석한 다음, Et2O (4 x 20 ㎖)로 추출하였다. 조합된 유기 분획을 포화 NaCl로 세정하고 , 건조하고 (Na2SO4), 용매를 감압 하에 제거하였다. 알코올 613 (0.85 g, 83%)을 컬럼 크로마토그래피 (실리카 겔, 페트로레움 에테르:EtOAc (15:1))로 정제하였다. 1H　NMR (400 MHz, CDCl3) δ 0.88 (t, J　=　7.0 Hz, 3H, CH3), 1.32 (m, 4H, CH2), 1.49 (quint, J　=　7.0 Hz, 2H, CH2), 1.81 (br s, 1H, OH), 2.19 (td, J　=　7.0 Hz, 2.0 Hz, 2H, CH2), 4.22 (m, 1H, CHD).
1- 브로모옥트 -2-아인 (614)을 기술한 바대로 합성하였다 [Hill, Sh.; Hirano, K.; Shmanai, V. V.; Marbois, B. N.; Vidovic, D.; Bekish, A. V.; Kay, B.; Tse, V.; Fine, J.; Clarke, C. F.; Shchepinov, M. S. Free Radic . Biol . Med ., 2011, 50 (1), 130-138. 참조]. 1H　NMR (400 MHz, CDCl3) δ 0.89 (t, J　=　7.0 Hz, 3H, CH3), 1.32 (m, 4H, CH2), 1.50 (quint, J　=　7.0 Hz, 2H, CH2), 2.22 (td, J　=　7.0 Hz, 2.0 Hz, 2H, CH2), 3.91 (m, 1H, CHD).
[11- 2 H]-에틸 옥타데카 -9,12- 다이이노에이트 (615)를 기술한 바대로 합성하였다 [Meyer, M. P.; Klinman, J. P. Tetrahedron Lett . 2008, 49, 3600; Hill, Sh.; Hirano, K.; Shmanai, V. V.; Marbois, B. N.; Vidovic, D.; Bekish, A. V.; Kay, B.; Tse, V.; Fine, J.; Clarke, C. F.; Shchepinov, M. S. Free Radic . Biol . Med., 2011, 50 (1), 130-138 참조]. CuI (2 g, 10.5 mmol), NaI (1.58 g, 10.5 mmol), K2CO3 (2.1 g, 15 mmol), 에틸 데스-9-이노에이트 (1.02 g, 5.2 mmol) 및 브로마이드 614 (1.03 g, 5.4 mmol)를 DMF (10 ㎖)에 교반하면서 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반한 다음, NH4Cl (10 ㎖) 및 NaCl (8 ㎖)을 첨가하고, 5분 더 교반을 계속하였다. 침전물을 분리하고, 페트로레움 에테르로 세정하였다. 유기층을 분리하고, 수성층을 페트로레움 에테르로 추출하였다. 조합된 유기 분획을 포화 NaCl 로 세정하고, 건조하고 (Na2SO4), 용매를 감압 하에 제거하였다. 컬럼 크로마토그래피 (실리카 겔, 페트로레움 에테르:EtOAc (15:1))를 하여, 산물 1.29 g (81%)을 수득하였다. 1H　NMR (400 MHz, CDCl3) δ 0.89 (t, J= 7.0 Hz, 3H, CH3), 1.25 (t, J　=　7.0 Hz, 3H, CH 3 CH2O), 1.31 (m, 10H, CH2), 1.49 (m, 4H, CH2), 1.61 (m, 2H, CH2), 2.15 (td, J　=　7.0　Hz, 2.0　Hz, 2H, CH2 프로파길 위치에서), 2.28 (t, J = 7.5 Hz, 2H, CH 2 COOEt), 3.10 (m, 1H, CHD), 4.12 (q, J　=　7.0 Hz, 2H, OCH 2 CH3). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 9.6 (t, J　=　19.0 Hz), 13.9, 14.1, 18.56, 18.57, 22.1, 24.8, 28.4, 28.6, 28.7, 28.9, 28.9, 31.0, 34.2, 60.0, 74.3, 74.5, 80.2, 80.3, 173.7.
[11- 2 H]- 리놀레산 (616) 96% 에탄올 (12 ㎖) 중 트리튜레이티드(triturated) 니켈 아세테이트 테트라하이드레이트 (0.4 g, 1.6 mmol)의 현탁액을 염이 완전히 용해될 때까지 50-60℃에서 교반하면서 가열하였다. 시스템을 수소로 플러싱한 다음, NaBH4 (에탄올 (6 ㎖) 중 NaBH4 현탁액 (0.27 g, 14 mmol)을 15분 동안 교반한 후, 미세 필터를 통해 여과하여 수득함) 1.7 ㎖을 10분 동안 첨가하며, 일부 가스 방울이 발생하였다. 15분 내지 20분 내에, 에틸렌다이아민 (0.8 ㎖, 12 mmol)을 교반하면서 한번에 첨가하고, 5분 이내에 에탄올 (5 ㎖) 중 다이아인 615 (1.2 g, 3.9 mmol)의 용액을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을, 수소의 흡수가 더이상 존재하지 않을 때까지, 격렬히 교반한 다음, 아세트산 (1.2 ㎖), 물 (10 ㎖)로 처리하고, 페트로레움 에테르 및 EtOAc의 혼합물 (5:1)로 추출하였다. 조합된 유기 분획을 10% 황산 (5 ㎖)으로 세정한 다음, 포화 NaCl로 세정하고, 건조하고 (Na2SO4), 용매를 감압하에 제거하였다. 컬럼 크로마토그래피 (실리카 겔 (페트로레움 에테르: EtOAc (50:1))를 하여, 산물 1.14 g (94%)을 수득하였다. 산물을, 용출액으로서 페트로레움 에테르:EtOAc (2:1)를 이용하여 질산은-함침된 실리카 (20% AgNO3)에서 CC로 추가로 정제하여 [3], 리놀레산 에틸 에스테르 0.73 g (60%) (GC에 의한 순도 > 96%; GC-MS: MW 309 (GC-MS, 대조군의 경우, 비-중수소화된 리놀레산 에틸 에스테르: MW 308)을 수득하였다. 1H　NMR (400 MHz, CDCl3) δ 0.89 (t, J= 7.0 Hz, 3H, CH3), 1.25 (t, J　=　7.0 Hz, 3H, CH 3 CH2O), 1.30 (m, 14H, CH2), 1.61 (m, 2H, CH2), 2.04 (m, 2H), 2.28 (t, J= 7.5 Hz, 2H, CH 2 COOEt), 2.74 (m, 1H, CHD), 4.12 (q, J　=　7.0 Hz, 2H, OCH 2 CH3), 5.34 (m, 4H, CH=CH). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 14.1, 14.2, 22.6, 25.0, 25.3 (t, J　=　19.5 Hz), 27.17, 27.19, 29.08, 29.09, 29.14, 29.3, 29.6, 31.5, 34.4, 60.1, 127.8, 128.0, 130.0, 130.2, 173.9.
유리 [11-2H]-리놀레산 (616)을 수득하기 위해, 에탄올 (10 ㎖) 중 리놀레산 에틸 에스테르 (0.704 g, 2.3 mmol)의 용액에, 수 (0.8 ㎖) 중 KOH (0.4 g, 7.1 mmol)의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 50℃에서 10분 동안 교반한 다음, 물 (20 ㎖)로 희석하고, 10% 황산 용액 (5 ㎖)으로 처리하고, Et2O (4 x 20 ㎖)로 추출하였다. 조합된 유기 분획을 포화 NaCl 로 세정하고, Na2SO4로 건조하고, 용매를 감압 하에 제거하였다. 잔여물을 소량의 실리카 겔 (2 ㎖; 용출액: 페트로레움 에테르:EtOAc (2:1))을 통해 플러싱하고, 용매를 진공 내에서 제거하여, 표시된 산 616 0.629 g (98%)을 수득하였다. 1H　NMR (400 MHz, CDCl3) δ 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 3H, CH3), 1.30 (m, 14H, CH2), 1.60 (m, 2H, CH2), 2.03 (m, 4H, CH2), 2.33 (t, J = 7.5 Hz, 2H, CH 2 COOEt), 2.74 (m, 1H, CHD), 5.32 (m, 4H, CH=CH), 11.6 (br s, 1H, COOH). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 14.1, 22.6, 24.6, 25.3　(t, J　=　19.0 Hz), 27.16, 27.18, 29.00, 29.05, 29.12, 29.3, 29.6, 31.5, 34.0, 127.8, 128.0, 130.0, 130.2, 180.1.
실시예 7. [11- 13 C]- 리놀레산의 합성
Figure 112013107101794-pct00048
[1- 13 C]- 옥트 -2-아인-1-올 (717). 표제 화합물을 13C-파라포름을 사용해 전술한 프로토콜에 따라 합성하고 (Hill, Sh.; Hirano, K.; Shmanai, V. V.; Marbois, B. N.; Vidovic, D.; Bekish, A. V.; Kay, B.; Tse, V.; Fine, J.; Clarke, C. F.; Shchepinov, M. S. Free Radic . Biol . Med ., 2011, 50 (1), 130-138), 추가의 정제 없이 사용하였다. 1H NMR (CDCl3, δ): 4.22 (Д, J = 148 Hz, 2H), 2.18 (td, J1 = 7.0, J2 = 1 Hz, 2H), 1.91 (br s, 1H), 1.47 (quint, J = 7.0 Hz, 2H), 1.31 (m, 4H), 0.87 (t, J = 7.0 Hz, 3H).
[1- 13 C]-1- 브로모옥트 -2-아인 (718)을 기술한 바대로 합성하였다 (Hill, Sh.; Hirano, K.; Shmanai, V. V.; Marbois, B. N.; Vidovic, D.; Bekish, A. V.; Kay, B.; Tse, V.; Fine, J.; Clarke, C. F.; Shchepinov, M. S. Free Radic . Biol . Med., 2011, 50 (1), 130-138). 수율: 13C-파라포름에서 출발하여 82% (2개 공정 당). 1H NMR (CDCl3, δ): 3.93 (dt, J1 = 158 Hz, J2 = 2Hz, 2.23 (m, 2H), 1.50 (m, 2H), 1.33 (m, 4H), 0.89 (t, J = 7 Hz, 3H).
[11- 13 C]-에틸 옥타데카 -9,12- 다이이노에이트 (719)를 전술한 바대로 합성하였다 (Meyer, M. P.; Klinman, J. P. Tetrahedron Lett . 2008, 49, 3600; Hill, Sh.; Hirano, K.; Shmanai, V. V.; Marbois, B. N.; Vidovic, D.; Bekish, A. V.; Kay, B.; Tse, V.; Fine, J.; Clarke, C. F.; Shchepinov, M. S. Free Radic . Biol. Med ., 2011, 50 (1), 130-138 참조). 수율: 93%. 1H NMR (CDCl3, δ): 4.10 (q, J = 7 Hz, 2H), 3.1 (dm, J = 134 Hz, 2H), 2.27 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.13 (m, 4H), 1.60 (m, 2H), 1.47 (m, 4H), 1.3 (m, 10H), 1.24 (t, J = 7 Hz, 3H), 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 3H).
[11- 13 C]- 리놀레산 에틸 에스테르 (720)를 전술한 바대로 합성하였다 (Meyer, M. P.; Klinman, J. P. Tetrahedron Lett . 2008, 49, 3600; Hill, Sh.; Hirano, K.; Shmanai, V. V.; Marbois, B. N.; Vidovic, D.; Bekish, A. V.; Kay, B.; Tse, V.; Fine, J.; Clarke, C. F.; Shchepinov, M. S. Free Radic . Biol . Med ., 2011, 50 (1), 130-138 참조). 수율: 56%. 1H NMR (CDCl3, δ): 5.34 (m, 4H), 4.12 (q, J = 7 Hz, 2H), 2.77 (dm, J = 126 Hz, 2H), 2.28 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.04 (m, 4H), 1.61 (m, 2H), 1.30 (m, 14H), 1.25 (t, J = 7 Hz, 3H), 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 3H).
[11- 13 C]- 리놀레산 (721)을 전술한 바대로 합성하였다 (Meyer, M. P.; Klinman, J. P. Tetrahedron Lett . 2008, 49, 3600; Hill, Sh.; Hirano, K.; Shmanai, V. V.; Marbois, B. N.; Vidovic, D.; Bekish, A. V.; Kay, B.; Tse, V.; Fine, J.; Clarke, C. F.; Shchepinov, M. S. Free Radic . Biol . Med ., 2011, 50 (1), 130-138 참조); 수율 98%. 1H NMR (CDCl3, δ): 10.5 (br s, 1H), 5.34 (m, 4H), 2.77 (dm, J = 126 Hz), 2.33 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.03 (m, 4H), 1.60 (m, 2H), 1.30 (m, 14H), 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 3H).
실시예 8. 에스테르 A 내지 D의 일반적인 제조
Figure 112013107101794-pct00049
화합물 A에 대한 일반적인 절차. 티오닐 클로라이드 (2 당량)를 CHCl3 중 PUFA (1 당량)의 용액에 서서히 첨가한다. 반응 혼합물을 1시간 동안 가열 환류한 다음, 실온으로 냉각되게 방치하고, 용매를 감압 하에 증발시켜, PUFA의 카르복실산 클로라이드 유도체를 수득한다. 그런 다음, 상기 카르복실산 클로라이드 유도체를 무수 피리딘에 용해시키고, 피리딘에 용해된 알코올 (1 당량)을 서서히 첨가한다 (알코올이 다가알코올인 경우, 첨가 순서는 반대로 하는 것을 주지함). 첨가 완료 시, 상기 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반되게 방치한다. 그런 다음, 용매를 감압 하에 제거하고, 조 산물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여, 화합물 A를 수득한다.
11,11-다이듀테로-cis,cis,cis-옥타데카-8,12,15-트리엔산 (30); 14,14-다이듀테로-cis,cis,cis-옥타데카-8,12,15-트리엔산 (23); 11,11,14,14-테트라듀테로-cis,cis,cis-옥타데카-8,12,15-트리엔산 (17); 및 11,11-다이듀테로-cis,cis-옥타데카-9,12-다이엔산 (7)을 각각, 하기 알코올인 에탄올, 글리세롤, 프로필렌 글리콜; 포도당; 2-(2-에톡시에톡시)에탄올; 및 에스트라디올을 이용해 전술한 절차에 처리하여, 화합물 A의 일반 화학식에 따른 산물을 수득한다.
화합물 B에 대한 일반적인 절차. 티오닐 클로라이드 (2 당량)를 CHCl3 중 PUFA (1 당량)의 용액에 서서히 첨가한다. 반응 혼합물을 1시간 동안 가열 환류한 다음, 실온으로 냉각되게 방치하고, 용매를 감압 하에 증발시켜, PUFA의 카르복실산 클로라이드 유도체를 수득한다. 그런 다음, 상기 카르복실산 클로라이드 유도체를 무수 피리딘에 용해시키고, 피리딘에 용해된 알코올 (화합물 A, 1 당량)을 서서히 첨가한다. 첨가 완료 시, 상기 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반되게 방치한다. 그런 다음, 용매를 감압 하에 제거하고, 조 산물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여, 화합물 B를 수득한다.
11,11-다이듀테로-cis,cis,cis-옥타데카-8,12,15-트리엔산 (30); 14,14-다이듀테로-cis,cis,cis-옥타데카-8,12,15-트리엔산 (23); 11,11,14,14-테트라듀테로-cis,cis,cis-옥타데카-8,12,15-트리엔산 (17); 및 11,11-다이듀테로-cis,cis-옥타데카-9,12-다이엔산 (7)과 글리세롤, 프로필렌 글리콜; 포도당; 및 에스트라디올의 축합으로 형성되는 화합물 A 산물은 11,11-다이듀테로-cis,cis,cis-옥타데카-8,12,15-트리엔산 (30); 14,14-다이듀테로-cis,cis,cis-옥타데카-8,12,15-트리엔산 (23); 11,11,14,14-테트라듀테로-cis,cis,cis-옥타데카-8,12,15-트리엔산 (17); 및 11,11-다이듀테로-cis,cis-옥타데카-9,12-다이엔산 (7)을 PUFA로서 이용하여 전술한 일반 절차에 따라 처리하여, 화합물 B의 일반 화학식에 상응하는 산물을 수득한다.
화합물 C에 대한 일반적인 절차. 티오닐 클로라이드 (2 당량)를 CHCl3 중 PUFA (1 당량)의 용액에 서서히 첨가한다. 반응 혼합물을 1시간 동안 가열 환류한 다음, 실온으로 냉각되게 방치하고, 용매를 감압 하에 증발시켜, PUFA의 카르복실산 클로라이드 유도체를 수득한다. 그런 다음, 상기 카르복실산 클로라이드 유도체를 무수 피리딘에 용해시키고, 피리딘에 용해된 알코올 (화합물 B, 1 당량)을 서서히 첨가한다. 첨가 완료 시, 상기 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반되게 방치한다. 그런 다음, 용매를 감압 하에 제거하고, 조 산물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여, 화합물 C를 수득한다.
화합물 A 산물과 글리세롤 및 포도당의 축합으로 형성되는 화합물 B 산물은 11,11-다이듀테로-cis,cis,cis-옥타데카-8,12,15-트리엔산 (30); 14,14-다이듀테로-cis,cis,cis-옥타데카-8,12,15-트리엔산 (23); 11,11,14,14-테트라듀테로-cis,cis,cis-옥타데카-8,12,15-트리엔산 (17); 및 11,11-다이듀테로-cis,cis-옥타데카-9,12-다이엔산 (7)을 PUFA로서 이용하여 전술한 일반 절차에 따라 처리하여, 화합물 C의 일반 화학식에 상응하는 산물을 수득한다.
화합물 D에 대한 일반적인 절차. 티오닐 클로라이드 (2 당량)를 CHCl3 중 PUFA (1 당량)의 용액에 서서히 첨가한다. 반응 혼합물을 1시간 동안 가열 환류한 다음, 실온으로 냉각되게 방치하고, 용매를 감압 하에 증발시켜, PUFA의 카르복실산 클로라이드 유도체를 수득한다. 그런 다음, 상기 카르복실산 클로라이드 유도체 (4 당량)를 무수 피리딘에 용해시키고, 피리딘에 용해된 알코올 (1 당량)을 서서히 첨가한다. 첨가 완료 시, 상기 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반되게 방치한다. 그런 다음, 용매를 감압 하에 제거하고, 조 산물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여, 화합물 D를 수득한다.
화합물 B 산물과 포도당의 축합으로 형성되는 화합물 C 산물은 11,11-다이듀테로-cis,cis,cis-옥타데카-8,12,15-트리엔산 (30); 14,14-다이듀테로-cis,cis,cis-옥타데카-8,12,15-트리엔산 (23); 11,11,14,14-테트라듀테로-cis,cis,cis-옥타데카-8,12,15-트리엔산 및 11,11-다이듀테로-cis,cis-옥타데카-9,12-다이엔산 (7)을 PUFA로서 이용하여 전술한 일반 절차에 따라 처리하여, 화합물 D의 일반 화학식에 상응하는 산물을 수득한다.
실시예 9. 실시예 1 내지 4에서 기술한 중수소화된 PUFA 의 1 H- 및 13 C- NMR 분석 (도 2).
1H 및 13C 스펙트럼의 특징적인 영역 (모든 값은 ppm으로 표시함) (패널 A). 11번째 위치에서 Lin 산의 중수소화를 1H 및 13C NMR 스펙트럼에서 피크의 소멸로 확인한다. δH 2.764에서의 피크의 소멸은 H 원자의 부재로 인한 것으로 예상된다 (1H NMR). δC 25.5에서의 피크의 소멸은 핵 오버하우저 효과(Nuclear Overhauser Effect)와, Lin acid의 중수소화된 형태에서 2개의 D 원자에 의해 퀸테트(quintet)에 이 특정한 탄소 원자가 스플링팅(splitting)된 것의 조합으로 인한 것이다 (패널 B). 1H NMR 스펙트럼은, 위치-특이적으로 중수소화된 αLnn의 C11 및 C14 위치에서 H 원자가 일치하며(coincide), 그래서 어떤 위치에서의 중수소화 (11,11-H2, 14,14-D2 또는 11,11-D2, 14,14-H2)는 이 피크의 병합을 50% 감소시키며, 한편 두 위치 모두에서의 중수소화 (11,11,14,14-D4)는 δH 2.801에서의 피크를 완전한 소멸시키는 것을 보여준다. 그러나, C11 및 C14 위치에 대해 관찰된 피크들은 작지만 검출가능할 차이로 분리되어 있기 때문에, 13C NMR 실험은 3개의 중수소화된 형태들을 명백하게 구별할 수 있다. 따라서, C11 또는 C14 위치에서의 중수소화는 각각 δC 25.68 또는 δC 25.60에서 피크의 소멸을 초래하며, 한편 두 개 위치 모두에서의 중수소화는 2개의 상응하는 피크의 소멸을 초래한다.
실시예 10. 동위원소 보강은 PUFA 과산화를 방지할 수 있다.
Q-less 효모 (coq 돌연변이체)는 지방산의 생체내 자가산화를 평가하는 이상적인 시스템을 제공한다. 코엔자임 Q (유비퀴논 또는 Q)는 작은 친지성 항산화제 뿐만 아니라 미토콘드리아 내막의 호흡 사슬에서 전자 운반체로서 작용한다. 10가지의 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 유전자 (COQ1-COQ10)가 코엔자임 Q 생합성 및 기능에 필요하며, 어느 것이라도 결핍되면 호흡 결함을 초래한다 (Tran UC, Clarke CF. Mitochondrion 2007;7S,S62). coq 효모 돌연변이체는 PUFA의 자가산화 산물에 정교하게 민감성인 것으로 나타나 있다 (Do TQ et al, PNAS USA 1996;93:7534-7539; Poon WW, Do TQ, Marbois BN, Clarke CF. Mol . Aspects Med . 1997;18,s121). 에스. 세레비시애는 PUFA를 생성하지 못하지만 (Paltauf F, Daum G. Meth . Enzymol. 1992;209:514-522), 이들은 외인성으로 제공되는 PUFA를 이용하여, 이들의 함량이 조정되게 할 수 있다 (Paltauf F, Daum G. Meth . Enzymol . 1992;209:514-522). 리놀렌산으로 4시간 처리한 후, Q-less (coq2, coq3, 및 coq5) 효모 돌연변이체는 1% 미만이 생존가능하다 (Do TQ et al, PNAS USA 1996;93:7534-7539; Poon WW, Do TQ, Marbois BN, Clarke CF. Mol . Aspects Med . 1997;18,s121). 대조적으로, 이러한 처리를 받은 야생형 (부모의 유전적 배경이 W303-1B 균주임) 세포 중 70%가 생존해 있다. Q-less 효모는 또한, 쉽게 자가산화되는 다른 PUFA (예컨대 아라키돈산)에 과민성이지만, 모노불포화된 올레산을 이용한 처리에는 야생형 부모 균주와 동일하게 거동한다 (Do TQ et al, PNAS USA 1996;93:7534-7539). Q-less 효모 돌연변이체의 과민성은 호흡 불능의 2차 효과가 아닌데, 왜냐하면 cor1 또는 atp2 돌연변이체 효모 (각각 bc1 복합체 또는 ATP 합성효소 중 하나가 결여)는 PUFA 처리에 야생형의 내성을 나타내기 때문이다 (Do TQ et al, PNAS USA 1996;93:7534-7539; Poon WW, Do TQ, Marbois BN, Clarke CF. Mol . Aspects Med . 1997;18,s121).
플레이트 희석 분석법을 이용해, PUFA 감수성을 평가할 수 있다. 이 분석법은 분취물의 단계적인 5-배 희석물을 YPD 플레이트 배지에 스포팅함으로써 수행할 수 있다 (Fig .　3). 각각의 스폿에서 세포의 밀도를 시각적으로 조사함으로써, 서로 다른 균주의 감수성을 관찰할 수 있다.
리놀렌산으로 처리하면, coq null 돌연변이체의 생존율을 급격하게 상실시킨다. 엄격하게 대조적으로, D4-리놀렌산으로 처리한 coq 돌연변이체는 사멸되지 않았으며, 올레산으로 처리한 효모와 유사한 생존력을 유지하였다. 정량적인 콜로니 계수로써, 올레산 및 D4-리놀렌산으로 처리한 세포의 생존율이 유사한 것으로 나타났으며 (도　4), 한편, 표준 리놀렌산으로 4시간 동안 처리한 후 coq 돌연변이체의 생존율은 100-배 이상 감소하였다. 이들 결과는, 과민성 coq 돌연변이체의 세포 살해에 대한 내성을 증거로, 동위원소-보강된 리놀렌산은 표준 리놀렌산보다 자가산화에 대해 훨씬 더 내성임을 나타내었다.
실시예 11. GC - MS 는 효모 세포에서 지방산 및 PUFA 를 검출할 수 있다.
효모는 PUFA를 합성하지 않지만, 이들은 외인성으로 공급된 리놀레산 및 리놀렌산을 혼입한다 (Avery SV, et al. Applied Environ . Microbiol. 1996; 62,3960; Howlett NG, et al. Applied Environ . Microbiol . 1997; 63,2971). 따라서, 효모는 외인성으로 공급된 D4-리놀렌산도 병합할 것으로 생각된다. 그러나, 리놀렌산 및 D4-리놀렌산에 대한 차별적인 감수성은 자가산화보다는 세포로의 혼입의 차이에 의한 것일 가능성이 존재한다. 이런 경우인지 시험하기 위해, 이 지방산의 흡수 범위를 모니터링하였다. 우선, (내부 표준으로서 사용되는) C18:1, C18:3, D4-18:3 및 C17:0의 지방산 메틸 에스테르(FAME)의 분리 조건을 측정하였다. 도 5에서 나타낸 GC-MS 크로마토그램은, 이들 지방산 메틸 에스테르 표준의 검출의 분리 및 감수성 모두를 확립한다.
지방산 감수성 분석법에서 기술한 바대로, 대수 증식기 성장 중인 야생형 효모를 회수하고, 인산염 완충액 + 0.20% 덱스트로스의 존재 하에, 외인성으로 첨가된 지방산의 존재 하에 (0시간 또는 4시간 동안) 인큐베이션하였다. 세포를 회수하고, 10 ㎖ 멸균수로 2회 세정한 다음, 효모 세포 펠렛을 전술한 바대로 알칼리 메타노라이시스 처리를 하였다. 내부 표준으로서 첨가한 C17:0을 이용한 GC-MS 후에, 지방산은 메틸에스테르(FAME)인 것으로 검출된다 (도　6). 4시간 동안 인큐베이션한 후 검출된 18:3 및 D4의 양을 보정 곡선으로부터 외삽(extrapolation)하였다. 이들 결과는, 4시간 인큐베이션하는 중에, 효모가 리놀렌산 및 D4-리놀렌산 둘 다를 열심히 혼입한다고 나타낸다. 이들 결과를 토대로, D4-C18:3으로 처리한 coq 돌연변이체 효모의 내성 증가는 흡수의 결여로 인한 것이 아님이 명백해졌다.
D2-리놀렌산, 11,11-D2-리놀렌산 및 14,14-D2-리놀렌산을 또한 이 효모 모델에 사용하였으며, 상당한 보호를 제공하였다.
실시예 12. 사슬 반응 포맷에서 D2 - LA 의 비- 효소적 산화에서 카이네틱 동위원소 효과.
LA 및 D2-LA의 산화 동안의 산소 소비의 카이네틱스를 유리 모세관 마이크로불류미터(microvolumeter)를 이용해 연구하였다 (도 7). 산화 속도인 ROX를 [O2] 추적의 경사로서 측정하였다. 개시 속도인 RIN을 대조군 저해제로서 HPMC ("6-하이드록시-2,2,5,7,8-펜타메틸벤조크로만")를 이용하는 저해제 방법으로 측정하였다. RIN을 저해된 산화의 유도 기간으로부터 계산하였다. tIND: RIN = 2·[HPMC]/tIND. 0.71 M LA (도 7)의 산화 속도는 6.1x10-6 M/s인 것으로 측정되었다. 상기 공정을 0.23 mM 사슬-절단 항산화제인 HPMC로 저해하는 경우, 유도 기간인 tIND은 약 48분이었으며, RIN 값은 약 0.16x10-6 M/s였다. 이들 데이터로부터 계산한 카이네틱 사슬의 길이는 v = ROX/RIN = 38 ± 3이었다. 이 데이터를 토대로, LA의 계산된 산화성은 0.0215 ± 0.008 M-0.5s-0.5 (n = 5)이었다 [Cosgrave J.P, et. al. Lipids, 1987, 22, 299-304]. D2-LA의 경우, ROX가 0.18x10-6 M/s로 감소한 것을 관찰하였다 (도 7). LA와는 대조적으로, HPMC의 첨가는 ROX의 감소 및 임의의 검출가능한 유도 기간의 출현을 초래하지 못하였다 (데이터는 나타내지 않음). 유도 기간의 출현은 RIN의 직접적인 측정을 방해한다. D2-LA 산화에 대한 RIN 값은 LA의 경우와 유사하여, D2-LA 산화는 사슬 공정이 아니었다 (n = 0.18x10-6/0.16x10-6
Figure 112013107101794-pct00050
1.1). 측정한 카이네틱 동위원소 효과 ("KIE")는 LA 및 D2-LA에 대한 ROX를 비교한 것으로서, 대략 6.1x10-6/0.18x10-6
Figure 112013107101794-pct00051
35이었다. 유사한 KIE는, Triton X-100 수성 미셀에서 LA 및 11,11-d2-LA의 산화 동안에 측정하였다 (데이터는 나타내지 않음). 비교를 위해, 이론적 KIE는 25℃에서 6.9이다. Carpenter, "Determination of Organic Reaction Mechanisms" (John Wiley & Sons, 1984), p. 89를 참조한다.
실시예 13. 소량의 D2 - LA 는 과산화에 대해 LA 를 보호한다.
유사한 생체내 상황을 모방하기 위해, D2-LA 및 LA의 혼합물의 산화의 카이네틱스를 조사하였다 (도 8). 실험에서, LA + 11,11-d2-LA의 농도는 0.775 M이고; AMVN의 농도는 0.0217 M이었으며; 반응은 37℃에서 수행하였다. 그 결과, RIN은 1.10±0.08x10-7 M/sec이었다. 부가적으로, 혼합물의 산화 속도는 비-상가적인 것으로 나타났으며, 개별 화합물에 대한 ROX의 상가 값보다 훨씬 더 낮았다. 놀랍게도, D2-LA는 자가산화에 대해 비-중수소화된 LA를 실질적으로 '보호한다'. 정량적으로 유사한 효과를 11,11-D2-LA와 비-중수소화된 메틸 리놀레이트의 혼합물의 산화 동안에 관찰하였다 (데이터는 나타내지 않음). 이들 결과는, 비-중수소화된 LA를 D2-LA로 부분적으로 치환해도 PUFA 과산화를 상당히 늦출 수 있음을 제시한다.
실시예 14. 소량의 D2 - LA 는 생체내 과산화에 대해 LA 를 보호한다.
실시예 13의 결과를, Q-less coq3 효모 균주를 사용하고 D2-LA에 대한 LA의 서로 다른 비율을 이용해 생체내에서 재현하였다 (도 9). 야생형, 효모 Q-less coq3, 또는 호흡 결핍성 cor1 null 돌연변이체를 도 9에 나타낸 바와 같이, 서로 다른 비율의 PUFA에서 200 μM의 LA 및 D2-LA의 존재 하에 인큐베이션하였다. 0.2 OD/㎖에서 시작한 단계 희석액 (1:5)을 YPD 고형 플레이트 배지에 스포팅하였다. 부가적으로, 0시간 미처리 대조군을 이용하고, 그 결과를 도 9의 상부 좌측에 나타낸다. 30℃에서 배양한다. 그 결과, D2-LA 중 대략 10% 내지 15%가 LA의 독성을 취소하기 위한, 충분히 최소인 양으로 나타났다. 모노-중수소화된 PUFA와 유사하게 인큐베이션하면, 11,11-D,H-LA는 3시간 처리 후, 세포 생존율의 소실을 검출가능할 정도로 나타내지 않았다 (데이터는 나타내지 않음). 이들 결과는, D2-LA 및 11,11-D,H-LA는 둘 다 지질 과산화에 대해 내성이었음을 제안한다.
야생형 효모 세포는, 효모를 200 μM의 표시한 지방산으로 2시간 동안 처리하고 멸균수로 세정하고, 실온에서 미처리 (삼각형) 또는 50 μM CuSO4로 처리 (사각형)하는 점을 제외하고는, 전술한 바대로 처리하였다. 세포를 구리로 처리한 지 60분 후에, 이를 실온에서 8 μM C11-Bodipy 581/591로 30분 동안 처리하였다. 100 ㎕ 분취물 4개를 96-웰 플레이트에 평판배양하고, 형광을 측정하였다. PUFA의 부재 또는 존재 하에 구리로 처리한 야생형 효모 세포는 구리로 처리하지 않은 효모와 비교해 유의하게 더 높은 수준의 지질 과산화를 나타내었다. 그러나, 11,11-D2-LA로 처리한 구리-스트레스성 야생형 효모 세포는 PUFA로 처리하지 않은 효모와 유사하게 더 낮은 수준의 지질 과산화를 나타낸다. 모노-중수소화된 11,11-D,H-LA는 유사한 보호를 제공하였다.
실시예 15. 소량의 D4 - ALA 는 생체내 과산화에 대해 ALA 를 보호한다.
실시예 14에 기술한 실험 프로토콜을 Q-less coq3 효모 균주 (도 10) 및 D4-ALA에 대한 ALA의 서로 다른 비율을 이용해 생체내에서 재현하였다. 도 10에 나타낸 바와 같이, 야생형, 효모 Q-less coq3 , 또는 호흡 결핍성 cor1 null 돌연변이체를 서로 다른 비율의 PUFA에서 200 μM의 ALA 및 D4-Lnn (리놀렌산)의 존재 하에 인큐베이션하였다. 0.2 OD/㎖에서 시작한 단계 희석액 (1:5)을 YPD 고형 플레이트 배지에 스포팅하였다. 30℃에서 배양한다. 그 결과, D2-Lnn 중 대략 10% 내지 15%가 ALA의 독성을 취소하기 위한, 충분히 최소인 양인 것으로 나타났다. 더욱이, 결과는, 효모 세포에 의해 흡수된 PUFA의 함량이 첨가된 비율을 대략적으로 반영하며, 효모 세포는 제공된 PUFA를 구별하지 않음을 나타낸다.
실시예 16. D- PUFA 는 산화적 스트레스를 경감시키고, AMD 및 당뇨병성 망막변성 병증에 관여하는 망막 세포에서 생존율을 증가시킨다.
미세혈관 상피 (microvascular endothelium, MVEC), 망막 색소 상피 (retinal pigment epithelium, RPE) 및 막망 신경 (망막 강글리온 세포)을 비롯하여 여러 가지 세포 유형에서, 세포 배양 중 생존율을 시험하였다. 세포를 수소화된 (대조군) 또는 중수소화된 D2-리놀레산 (ω-6; LA) 및 D4-리놀렌산 (ω-3; ALA) (20 μM; ω-6 : ω-3의 비율은 1:1 또는 2:1)을 포함하는 배지에 72시간 동안 두었다. PUFA가 세포에 혼입되는 것을 GC로 모니터링하였다 (도 11). PUFA는 PUFA의 MVEC로의 혼입을 보여주는 표 1에 따라 세포에 의해 쉽게 흡수되는 것으로 나타났다.
Figure 112013107101794-pct00052
그런 다음, 세포를 보편적인 산화적 스트레스-발생 화합물인 파라쿼트(paraquat) (PQ; 500 μM)로 처리하였다. 생존율 측정을 위해, 세포를 혈구계수기 및 트립판 블루 제외 방법(trypan blue exclusion method)을 이용해 계수하였다. 도 12는 H-PUFA 및 D-PUFA를 처리한 MVEC 세포의, 파라쿼트에 의한 급성 중독 후의 생존율을 보여준다. 시험한 세포 유형 모두에 대해, D-PUFA는 대조군에 비해 보호 효과를 가졌으며, 이는 MVEC 세포에 대해 도 8에서 나타낸 것과 유사하였다.
실시예 17. D- PUFA 를 보충한 마우스의 독성학 연구에 주요 혈중 바이오마커에 이상현상이 나타나지 않는다.
보다 연기된 투여량 파라다임 (즉, 3주의 식이요법 대체)을 이용하면, H-PUFA- 및 D-PUFA-보충된 마우스의 혈중 혈청의 화학적 분석 (UV Davis에서 수행함)은, H-PUFA/D-PUFA 식염수 처리 마우스에서 신장 기능, 간 기능, 혈중 지질 등의 주요 바이오마커의 차이가 없음을 나타내었다. 이 실시예에서, D-PUFA는 D2-리놀레산: D4-리놀렌산의 2:1 혼합물이다.
시험한 파라미터는 트리글리세라이드; 총 단백질; 총 빌리루빈; 인; 유리 지방산; HDL; 포도당; 크레아틴; 콜레스테롤; 칼슘; 혈중 요소 질소; 알칼리 포스파타제; 알부민; 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제; 및 표 2의 다른 것들을 포함한다.
Figure 112013107101794-pct00053
실시예 18. 조직병리학적 연구
현미경적 변화는 매우 특이적인 토포그래픽 및 형태적 진단에 의해 코딩(coding)하였으며, 임상코드시스템(SNOMED) 및 국가 독성학 프로그램의 독성학 데이터 관리 시스템(National Toxicology Program's Toxicology Data Management System (TDMS)) 용어 매뉴얼을 가이드라인으로서 사용하였다. 데이터는 Labcat® Histopathology module 4.30에서 기록하였다. 4-단계 등급 시스템 (최소, 경미, 중간, 및 강함)을 이용하여 등급별의 변화를 규정하였다.
1일 내지 14일간의 연구 중에, 식이요법과 함께 PUFA를 C57BL6 수컷 마우스에 경구 투여하고, 연구한 지 15일째에 검시하였다. 1군은 4마리의 마우스로 이루어졌으며, 수소화된 PUFA를 투여하였다. 2군은 5마리의 마우스로 이루어졌으며, 중수소화된 PUFA (D2-LA 및 D4-ALA)를 투여하였으며, 8일째에 모든 마우스에 식염수를 복강내(IP) 투여하였다. 처리한 마우스 모두의 프로토콜-특이적 조직 [간 (3 내지 7개 섹션), 기관지를 포함한 폐 (2 내지 5개 로브(lobe)), 비장, 심장, 및 신장]의 완벽한 세트를 조직병리학적으로 검사하였다. H-PUFA와 D-PUFA 군 간에는 차이가 관찰되지 않았다.
실시예 19. 조직-특이적 중수소화의 조사
야생형 마우스는 케이지 당 12마리씩 (수컷과 암컷은 분리) 넣고, AIN 93 식이요법에서 펠렛으로서 90일 동안 마음대로 (전형적으로, 5-6 g/day) 영양 공급을 하게 하였으며, 총 지방은 6%였다. 총 지방 중 약 10%는 D2-LA/D4-ALA의 1:1 혼합물 (1군), D2-LA/ALA (2군), 또는 LA/ALA (대조군)이었다. 동물을 안락사시키고, 장기를 회수하고, 방부제를 사용하지 않은 채 분석 전에 저온에 보관하였다. 지질 분획을 분리하고, 전처리한 후, 대조군으로서 LA, D2-LA, ALA 및 D4-ALA를 사용해 표준 프로토콜에 따라 LC-MS로 분석하였다.
1:1 D2-LA/D4-ALA의 투여량 연구는, 조직들에 중수소가 매우 풍부해지고, 총 지방 중 약 40%는 중수소화됨을 나타내었다 (도 13). 더욱이, 이들 연구는, 지방 분포가 시험한 투여량에 의해 상대적으로 변하지 않은 채로 있음을 나타내었다 (도 14). 1:1 D2-LA/ALA의 투여량 연구 후, 총 지방 중 약 27% 가 중수소화된 것으로 측정되었다 (도 15).
간 및 뇌와 같은 특정 장기들을 또한 평가하였다 (도 16 내지 21). 간은 이전에 연구한 조직과 서로 다른 지방 프로파일을 가진 한편 (도 16), D2-LA/D4-ALA를 이용한 90일간의 투여량 연구는 조직들에 중수소가 매우 풍부해지고, 총 지방 중 약 40%가 중수소화됨을 나타내었다 (도 17). 더욱이, 간 연구는, 지방 분포가 시험한 투여량에 의해 상대적으로 변하지 않은 채로 있음을 나타내었다 (도 16-17). 부가적으로, D2-LA를 이용한 90일간의 투여량 연구에서만, 선행 연구와 유사한 지방 프로파일이 나타났으며, 총 지방 중 약 32%가 중수소화되었다 (도 18). 결과적으로, 간에서 지방 프로파일 및 중수소화 프로파일은 투여되는 중수소화된 성분과는 상관없이 유지되었다. 간과 마찬가지로, 뇌 또한, 선행 연구의 조직과 서로 다른 지방 프로파일을 나타내었다 (도 19 내지 21). D2-LA/D4-ALA를 이용한 90일간의 투여량 연구는 조직들에 중수소가 매우 풍부해지고, 총 지방 중 약 30%가 중수소화됨을 나타내었다 (도 19). 더욱이, 뇌 연구는, 지방 분포가 시험한 투여량에 의해 상대적으로 변하지 않은 채로 있음을 나타내었다 (도 19 내지 21). 부가적으로, D2-LA/ALA를 이용한 90일간의 투여량 연구에서, 선행 연구와 유사한 지방 프로파일이 나타났으며, 총 지방 중 약 23%가 중수소화되었다 (도 20). 결과적으로, 뇌에서 지방 프로파일 및 중수소화 프로파일은 투여되는 중수소화된 성분과는 상관없이 유지되었다.
실시예 20: 에너지 프로세싱 손상 장애 및 미토콘드리아 결함에 대한 효능 검사
여러 가지 쉽게 측정가능한 임상 마커들은 미토콘드리아 장애 환자의 대사 상태를 평가하는 데 유용하다. 이들 마커는 또한, 마커의 농도가 병리학적 상태의 값으로부터 건강한 상태의 값으로 이동되기 때문에, 해당 치료법의 효능에 대한 지표로서 사용할 수 있다. 이들 임상 마커로는, 하나 이상의 에너지 바이오마커, 예컨대 전혈, 혈장, 뇌척수액, 또는 뇌실액(cerebral ventricular fluid) 중 젖산 (락테이트) 농도; 전혈, 혈장, 뇌척수액, 또는 뇌실액 중 피루브산 (피루베이트) 농도; 전혈, 혈장, 뇌척수액, 또는 뇌실액 중 락테이트/피루베이트 비율; 포스포크레아틴 농도, NADH(NADH+H+) 또는 NADPH(NADPH+H+) 농도; NAD 또는 NADP 농도; ATP 농도; 무산소 역치(anaerobic threshold); 환원된 코엔자임 Q (CoQred) 농도; 산화된 코엔자임 Q (CoQox) 농도; 총 코엔자임 Q (CoQtot) 농도; 산화된 시토크롬 C 농도; 환원된 시토크롬 C 농도; 산화된 시토크롬 C/환원된 시토크롬 C 비율; 아세토아세테이트 농도, β-하이드록시 부티레이트 농도, 아세토아세테이트/β-하이드록시 부티레이트 비율, 8-하이드록시-2'-데옥시구아노신 (8-OHdG) 농도; 반응성 산소종의 농도; 및 산소 소비의 수준 (VO2), 이산화탄소 방출 (VCO2)의 수준, 및 호흡률(respiratory quotient) (VCO2/VO2)을 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 이들 임상 마커 중 몇몇은 정확한 생리학적 실험실에서 일상적으로 측정할 수 있으며, 대상의 대사 상태에 대한 간편한 평가를 제공한다.
몇몇 대사성 바이오마커를 이미 사용하여 코엔자임 Q10의 효능을 평가하였으며, 이들 대사성 바이오마커는 본원에서 개시한 방법에 사용하기 위한 에너지 바이오마커로서 모니터링할 수 있다. 포도당의 혐기성 대사의 산물인 피루베이트는 혐기성 환경에서 젖산으로의 환원에 의해, 또는 기능적인 미토콘드리아의 호흡 사슬에 의존하는 산화성 대사에 의해 제거된다. 호흡 사슬의 기능이상으로 인해, 순환 중의 락테이트 및 피루베이트의 제거가 부적절할 수 있으며, 미토콘드리아 세포병증에서 락테이트/피루베이트 비율의 상승이 관찰된다 (Scriver C R, The metabolic and molecular bases of inherited disease, 7th ed., New York: McGraw-Hill, Health Professions Division, 1995; and Munnich et al., J. Inherit. Metab. Dis. 15(4):448-55 (1992)를 참조). 따라서, 혈중 락테이트/피루베이트 비율 (Chariot et al., Arch. Pathol. Lab. Med. 118(7):695-7 (1994))은 미토콘드리아 세포병증 (Scriver C R, The metabolic and molecular bases of inherited disease, 7th ed., New York: McGraw-Hill, Health Professions Division, 1995; and Munnich et al., J. Inherit. Metab. Dis. 15(4):448-55 (1992)를 참조) 및 독성 미토콘드리아 근육병증 (Chariot et al., Arthritis Rheum. 37(4):583-6 (1994))의 검출을 위한 비침습성 시험으로서 널리 사용된다. 동맥의 케톤체 비율 (아세토아세테이트/3-하이드록시부티레이트: AKBR)을 측정함으로써, 간 미토콘드리아의 산화환원 상태의 변화를 조사할 수 있다 (Ueda et al., J. Cardiol. 29(2):95-102 (1997)). 8-하이드록시-2'-데옥시구아노신 (8-OHdG)의 뇨중 배출(urinary excretion)은 종종, 임상적 및 직업적 설정 모두에서 ROS-유도성 DNA 손상의 복구 범위를 평가하기 위한 바이오마커로서 이용되어 왔다 (Erhola et al., FEBS Lett. 409(2):287-91 (1997); Honda et al., Leuk. Res. 24(6):461-8 (2000); Pilger et al., Free Radic. Res. 35(3):273-80 (2001); Kim et al. Environ Health Perspect 112(6):666-71 (2004)).
자기 공명 분광학(MRS)은 양성자 MRS (1H-MRS)를 이용해 뇌척수액(CSF) 및 피질의 백질에서 락테이트의 증가를 알아봄으로써, 미토콘드리아 세포병증의 진단에 유용하였다 (Kaufmann et al., Neurology 62(8):1297-302 (2004)). 인 MRS (31P-MRS)는 저농도의 피질 포스포크레아틴 (PCr) (Matthews et al., Ann. Neurol. 29(4):435-8 (1991)), 및 골격근에서 운동 후 PCr 회복 속도의 지연 (Matthews et al., Ann. Neurol. 29(4):435-8 (1991); Barbiroli et al., J. Neurol. 242(7):472-7 (1995); Fabrizi et al., J. Neurol. Sci. 137(1):20-7 (1996))을 알아보는 데 이용되어 왔다. 골격근 PCr의 저농도는 또한, 직접적인 생화학적 측정에 의해 미토콘드리아 세포병증 환자에서 확인되어 왔다.
운동 검사는 미토콘드리아 근육병증에서 평가 및 스크리닝 툴로서 특히 유용하다. 미토콘드리아 근육병증의 특별한 특징들 중 하나는 최대 전신 산소 소비 (VO2max)의 감소이다 (Taivassalo et al., Brain 126(Pt 2):413-23 (2003)). VO2max가 심박출량 (Qc) 및 말초 산소 추출 (동맥-정맥 총 산소량) 차이에 의해 결정되더라도, 일부 미토콘드리아 세포병증은 전달이 변경될 수 있는 심장 기능에 영향을 미치지만; 대부분의 미토콘드리아 근육병증은 말초 산소 추출의 특징적인 결핍 (A-VO2 차이) 및 산소 전달 증대 (과운동성 순환(hyperkinetic circulation))를 나타낸다 (Taivassalo et al., Brain 126(Pt 2):413-23 (2003)). 이는, 직접적인 AV 균형 측정을 이용한, 정맥혈의 운동-유도성 탈산소화의 부족 (Taivassalo et al., Ann. Neurol. 51(1):38-44 (2002)) 및 근적외선 분광학에 의해 비-침습적으로 (Lynch et al., Muscle Nerve 25(5):664-73 (2002); van Beekvelt et al., Ann. Neurol. 46(4):667-70 (1999)) 알아볼 수 있다.
젖산 (락테이트) 농도: 미토콘드리아 기능이상은 전형적으로, 피루베이트 농도가 증가하고 피루베이트가 락테이트로 전환되어 해당작용 능력을 유지함에 따라, 비정상적인 젖산 농도를 초래한다. 미토콘드리아 기능이상은 또한, 환원된 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오타이드가 호흡 사슬에 의해 효율적으로 처리되지 않기 때문에, 비정상적인 NADH+H+, NADPH+H+, NAD, 또는 NADP 농도를 초래할 수 있다. 락테이트 농도는 전혈, 혈장, 또는 뇌척수액과 같은 적절한 체액 샘플을 채취함으로써 측정할 수 있다. 자기 영동을 이용해, 락테이트 농도를 뇌를 포함하나 이로 한정되지 않는 원하는 신체 용적에서 사실상 측정할 수 있다.
MELAS 환자에서 자기 영동을 이용한 뇌 젖산 산증(cerebral lactose acidosis)의 측정은 Kaufmann et al., Neurology 62(8):1297 (2004)에 기술되어 있다. 뇌의 측뇌실에서 젖산 농도값은 MELAS, A3243G 및 A8344G를 초래하는 2가지 돌연변이를 나타낸다. 전혈, 혈장, 및 뇌척수액 락테이트 농도는 YSI 2300 STAT Plus Glucose & Lactate Analyzer (YSI Life Sciences, Ohio)와 같은 시중에서 입수가능한 장비로 측정할 수 있다.
NAD, NADP, NADH 및 NADPH 농도: NAD, NADP, NADH(NADH+H+) 또는 NADPH(NADPH+H+)의 측정은 US 2005/0067303 (원용에 의해 본원에 포함됨)에서 기술한 전기화학적 분석법과 같은 여러 가지 다양한 형광, 효소, 또는 전기화학적 기술을 이용해 측정할 수 있다.
산소 소비 (vO2 또는 VO2), 이산화탄소 방출 (vCO2 또는 VCO2), 및 호흡률 (VCO2/VO2): vO2는 통상 휴지기 중에 (휴지기 vO2) 또는 최대 운동 강도에서 (vO2 max) 측정할 수 있다. 최적으로는, 두 값 모두 측정할 것이다. 그러나, 중증 장애 환자의 경우, vO2 max의 측정은 실현불가능할 수 있다. 두 가지 형태의 vO2의 측정은 Korr Medical Technologies, Inc. (Salt Lake City, Utah)와 같은 다양한 판매 회사의 표준 장비를 이용해 쉽게 수행한다. VCO2 또한, 쉽게 측정할 수 있으며, 동일한 조건 하에 VO2에 대한 VCO2의 비율 (휴지기 상태 또는 최대 운동 강도에서 VCO2/VO2)은 호흡률 (RQ)을 제공한다.
산화된 시토크롬 C, 환원된 시토크롬 C, 환원된 시토크롬 C에 대한 산화된 시토크롬 C의 비율: 시토크롬 C 파라미터, 예컨대 산화된 시토크롬 C 농도 (Cyt Cox), 환원된 시토크롬 C 농도 (Cyt Cred), 및 산화된 시토크롬 C 비율/환원된 시토크롬 C 비율 (Cyt Cox)/(Cyt Cred)은 생체내 근적외선 분광계로 측정할 수 있다. 예를 들어, Rolfe, P., "In vivo near-infrared spectroscopy" Ann. Rev. Biomed. Eng. 2:715-54 (2000) and Strangman et al., "Ion-invasive neuroimaging using near-infrared light" Biol. Psychiatry 52:679-93 (2002)를 참조한다.
운동 부하/운동 비부하(Exercise intolerance): 운동 비부하는 "호흡곤란 또는 피로의 증상으로 인해, 대(large) 골격근의 역동적 움직임을 수반하는 활동을 수행하는 능력의 저하" (Pina et al., Circulation 107:1210 (2003))로서 정의된다. 운동 비부하는 종종 근육 조직의 쇠퇴와, 후속하여 소변 중 근육 마이오글로빈의 분비로 인한 마이오글로빈뇨증(myoglobinuria)을 수반한다. 탈진(exhaustion) 전 런닝머신 위에서 걷거나 뛰는 데 소요된 시간, 탈진 전 운동기구 자전거 (고정형 자전거)에서 소요된 시간 등과 같이, 운동 비부하를 측정하는 여러 가지 방법을 이용할 수 있다. 본 발명의 화합물 또는 방법을 처리하면, 운동 부하가 약 10% 이상 (예를 들어, 탈진까지 걸리는 시간이 10분 내지 11분과 같이 약 10% 이상 연장됨), 운동 부하가 약 20% 이상, 운동 부하가 약 30% 이상, 운동 부하가 약 40% 이상, 운동 부하가 약 50% 이상, 운동 부하가 약 75% 이상, 또는 운동 부하가 약 100% 이상 개선될 수 있다. 운동 부하는 엄격히 말하자면 에너지 바이오마커가 아니지만, 본 발명의 목적을 위해, 에너지 바이오마커의 조정, 정상화, 또는 증대는 운동 부하의 조정, 정상화, 또는 증대를 포함한다.
유사하게는, 피루브산 (피루베이트) 농도, 락테이트/피루베이트 비율, ATP 농도, 무산소 역치, 환원된 코엔자임 Q (CoQred) 농도, 산화된 코엔자임 Q (CoQox) 농도, 총 코엔자임 Q (CoQtot) 농도, 산화된 시토크롬 C 농도, 환원된 시토크롬 C 농도, 산화된 시토크롬 C/환원된 시토크롬 C 비율, 아세토아세테이트 농도, β-하이드록시 부티레이트 농도, 아세토아세테이트/β-하이드록시 부티레이트 비율, 8-하이드록시-2'-데옥시구아노신 (8-OHdG) 농도, 및 반응성 산소종의 농도의 정상값 및 비정상값에 대한 시험은 당해 기술분야에 알려져 있으며, 이를 이용해 본 발명의 화합물 및 방법의 효능을 평가할 수 있다.
본원에서 기술한 에너지 바이오마커 중 어느 하나 또는 임의의 조합은 치료 또는 억제 요법의 효능을 가늠하기 위한, 편리하게 측정가능한 벤치마크를 제공한다. 부가적으로, 다른 에너지 바이오마커가 당해 기술분야의 당업자에게 알려져 있으며, 이를 모니터링하여 치료 또는 억제 요법의 효능을 평가할 수 있다.
예를 들어, 대상은, 코엔자임 Q 결핍; 복합체 I-V 결핍, 진성 당뇨병 및 난청(DAD), 및 모계 유전 당뇨병 및 난청(MIDD)); 프리드리히 운동실조(FA); 레버 선천성 흑암시; 레버 유전성 시신경 병증(LHON); 리증후군; 미토콘드리아 근질환, 뇌병증, 유산 산증, 및 뇌졸중(MELAS) 증후군; 미토콘드리아 신경위장관 뇌근육병증 (MNGIE); 불균일 적색근섬유와 연관된 근간대성 간질(MERRF) 증후군; 근육신경학적 위장관 뇌병증(MNGIE) 및 신경병증; 신경병증, 운동실조, 색소망막염, 및 안검하수 (NARP); 시신경병증(optic neuropathies) 및 눈근육마비(opthalmoplegias); 월프-파킨슨-화이트 증후군 및 다른 심근병증(cardiomyopathy); X-연관성 부신백질형성장애(X-ALD), 뿐만 아니라 근골격계 질환 (지질 근육병증, 만성 피로, 섬유근통 증후군); 신장 질환 (판코니 증후군 및 사구체성신증); 혈액 질환 (피어슨 증후군), 및 뇌질환 (편두통, 발작, 및 뇌졸중)에 대해 유전적 검사 또는 설문지로 스크리닝한다. 하나 이상의 유전적 결함 (또는 이러한 결함을 가진 모계 친척이 있는 것)에 대해 검사 결과가 양성이며 및/또는 기술한 증상 중 하나가 있는 것으로 진단받은 대상에서, 젖산 (락테이트) 농도; 피루브산 (피루베이트) 농도; 락테이트/피루베이트 비율; 포스포크레아틴 농도; NADH (NADH+H+) 농도; NADPH (NADPH+H+) 농도; NAD 농도; NADP 농도; ATP 농도; 환원된 코엔자임 Q (CoQ red) 농도; 산화된 코엔자임 Q (CoQ ox) 농도; 총 코엔자임 Q (CoQ tot) 농도; 산화된 시토크롬 C 농도; 환원된 시토크롬 C 농도; 산화된 시토크롬 C/환원된 시토크롬 C 비율; 아세토아세테이트 농도; β-하이드록시 부티레이트 농도; 아세토아세테이트/β-하이드록시 부티레이트 비율, 8-하이드록시-2'-데옥시구아노신 (8-OHdG) 농도; 반응성 산소종의 농도; 산소 소비의 수준 (VO2); 또는 이산화탄소 방출의 수준 (VCO2)과 같은 하나 이상의 에너지 바이오마커의 수준을 시험한다. 부가적으로, 하기 측정법에 의해 에너지 바이오마커에 대해 대상을 시험한다: 호흡률 (VCO2/VO2); 운동 부하; 또는 무산소 역치. 유전적 결함에는 양성반응이지만 (또는 이러한 결함을 가진 모계 친척이 있지만), 비정상적인 에너지 바이오마커 (또는 이의 농도)에는 음성반응인 대상에게 D-PUFA (0.01, 0.1, 1.0, 10.0, 및 100 mg/kg의 D2-LA, D4-ALA, 및 D2-LA와 D4-ALA 둘 다의 1:1 조합)를 6개월 동안 매일 처리한다. 하나 이상의 유전적 결함에 양성반응이면서 (또는 이러한 결함을 가진 모계 친척이 있으면서) 비정상적인 에너지 바이오마커 농도에 양성반응인 대상에게 D-PUFA (0.01, 0.1, 1.0, 10.0, 및 100 mg/kg의 D2-LA, D4-ALA, 및 D2-LA와 D4-ALA 둘 다의 1:1 조합)를 6개월 동안 매일 처리한다. 전술한 에너지 바이오마커 중 하나 이상을 매주 모니터링한다. D2-LA 및 D4-ALA는 대상의 에너지 바이오마커 농도를 개선하는 것으로 예상된다. 유사하게는,
본원 개시 화합물을 또한, CoQ10 결핍 환자의 세포에서 스크리닝하고, 스크리닝 결과를 이용해 화합물의 효능을 측정한다. 예를 들어, 초기 스크린은 6개월 동안 매일 투여한 D-PUFA (0.01, 0.1, 1.0, 10.0, 및 100 μM의 D2-LA, D4-ALA, 및 D2-LA와 D4-ALA 둘 다의 1:1 조합)를 이용해 수행하여, 산화환원 장애를 완화하는 효능을 동정한다. 시험 화합물, 하나 이상의 대조군 화합물 (예를 들어, 이데베논, 데실유비퀴논, 트로록스(Trolox) 및 α-토코페롤 아세테이트), 및 적절한 대조군 H-PUFA (0.01, 0.1, 1.0, 10.0, 및 100 μM의 LA, ALA, 및 LA와 ALA 둘 다의 1:1 조합)은, Jauslin et al., Hum. Mol . Genet. 11(24):3055 (2002), Jauslin et al., FASEB J. 17:1972-4 (2003), 및 국제 특허 출원 WO 2004/003565 (원용에 의해 본원에 포함됨)에서 기술한 절차의 변형으로서, L-부티오닌-(S,R)-설폭시민 (BSO)의 첨가에 의해 스트레스를 받은 FRDA 섬유아세포를 구제하는 능력에 대해 시험한다. CoQ10 결핍 환자의 세포는, GSH 합성효소의 특정 저해제인 L-부티오닌-(S,R)-설폭시민 (BSO)을 이용한, 글루타티온 (GSH)의 드노보(de novo) 합성의 저해에 대해 과민성인 것으로 예상된다 (Jauslin et al., Hum . Mol . Genet. 11(24):3055 (2002)). 이러한 특이적인 BSO-매개의 세포 사멸은 α-토코페롤, 셀레늄, 또는 소분자 글루타티온 퍼옥시다제 모방체와 같이 항산화제 경로에 관여하는 분자 또는 항산화제의 투여에 의해 방지되는 것으로 예상된다. 그러나, 항산화제는 이들의 잠재능력, 즉, 이들이 CoQ10 환자의 BSO-스트레스성 세포를 구제할 수 있는 농도가 다른 경향이 있을 것이다. D2-LA 및 D4-ALA는 CoQ10 환자의 BSO-스트레스성 세포를 LA 또는 ALA보다 보다 크게 구제하는 것으로 예상된다. 유사하게는, 화합물은 전술한 바와 같이 LHON 환자 및 FA 환자의 인간 섬유아세포에 대해 스크리닝할 수 있다. D2-LA 및 D4-ALA는 전술한 방법과 유사한 결과를 제공하는 것으로 예상된다.
화합물의 효능을 더 측정하기 위해, 하기 방법론을 이용할 수 있다: X-ALD 환자 및 X-ALD 마우스의 세포주를, 태아 소 혈청 (10%), 페니실린 (100 U/㎖), 스트렙토마이신 (100 U/㎖) 및 글루타민 (2 mM)을 보충한 MEM (섬유아세포) 또는 RPMI (림포블라스토이드 세포(lymphoblastoid cell))에서 배양한다. 0일째에, 세포를 개별의 조직 배양 플라스크에 분리해두고, D-PUFA (0.01, 0.1, 1.0, 10.0, 및 100 μM의 D2-LA, D4-ALA, 및 D2-LA와 D4-ALA 둘 다의 1:1 조합) 또는 H-PUFA (0.01, 0.1, 1.0, 10.0, 및 100 μM의 LA, ALA, 및 LA와 ALA 둘 다의 1:1 조합)를 첨가한다. 24, 48, 및 72시간 후, 세포를 회수하고, 멸균수로 2회 세정한 다음, 기술한 바와 같이 알칼리 메타노라이시스, 사포닌화 처리, 및 지질 추출 처리를 한다 (Moss CW, Lambert MA, Merwin WH. Appl . Microbiol. 1974; 1, 80-85; ( Shaw , 1953 Shaw, W. H. C.; Jefferies, J. P. Determination of ergosterol in yeast. Anal Chem 25:1130; 1953). 총 지질을 추출하고, 메틸 에스테르로 전환시키고, TLC로 정제하고, 모세관 GC 분석을 한다. 유사한 절차에 따라, [1-14C]-C24:0 지방산을 수용성 산물로 분해하는 이들의 능력을 측정함으로써, 인간 및 마우스의 섬유아세포 및 인간 림포블라스토이드 세포의 C24:0 β-산화 활성을 측정한다. 또한, 피탄산(phytanic acid) 산화는, 세포를 [2,3-3 H]-피탄산으로 24시간 동안 인큐베이션하고 3H-H2O의 수성 배지로의 방출을 모니터링한 후, 측정한다. 원용에 의해 본원에 포함된 미국 특허 제6,355677 호를 참조한다. D2-LA 및 D4-ALA는 이들 분석법에서 검출되는 산화된 지방산의 양을 감소시키는 것으로 예상된다.
실시예 21: 세포로의 혼입 검사를 위한 모델
동위원소비 질량분석기를 이용해, 여러 가지 조직의 인지질 막에 D-PUFA가 혼입되는지 확인할 수 있다. 식이요법적인 보충을 통해 D2-LA 및 D4-ALA를 전달하는 경우, 동물 조직으로의 혼입은, 지질 막에서 중수소 조성물의 총 증가를 측정하는 동위원소비 질량분석기를 이용하여 모니터링해서, 이들 화합물로부터 유래되는 D2-LA, D4-ALA, 및 다른 PUFA의 혼입을 보고할 수 있다. 이 방법을 이용해, D-PUFA가 동물 조직으로 실질적으로 섭취되는 것을 검출할 수 있다. 예를 들어, 6일 동안 유일한 PUFA 공급원으로서 D-PUFA (0.01, 0.1, 1.0, 10.0, 및 100 mg/kg의 D2-LA, D4-ALA, 및 D2-LA와 D4-ALA 둘 다의 1:1 조합) 또는 H-PUFA (0.01, 0.1, 1.0, 10.0, 및 100 mg/kg의 LA, ALA, 및 LA와 ALA 둘 다의 1:1 조합)를 마우스에 보충시키고, 공지된 산화제 또는 식염수 비히클에 급성 노출시키고 추가로 6일 동안 동일한 식이요법을 수행하였다. 뇌, 간, 심장, 및 폐 조직을 적출하고, 대조군 마우스와 시험 화합물을 처리한 마우스의 균질물 샘플을 이용해 상기 실시예 7에서 기술한 대로 중수소 함량을 분석한다. D2-LA 및 D4-ALA는 분석한 조직 및 세포에서 발견되는 것으로 예상된다.
실시예 22: 자폐증 및 관련 장애들에 대한 효능 검사
D-PUFA (0.01, 0.1, 1.0, 10.0, 및 100 mg/kg의 D2-LA, D4-ALA, 및 D2-LA와 D4-ALA 둘 다의 1:1 조합) 또는 H-PUFA (0.01, 0.1, 1.0, 10.0, 및 100 mg/kg의 LA, ALA, 및 LA와 ALA 둘 다의 1:1 조합)를, Jauslin et al., Hum. Mol. Genet. 11(24):3055 (2002), Jauslin et al., FASEB J. 17:1972-4 (2003), 및 국제 특허 출원 WO 2004/003565 (원용에 의해 본원에 포함됨)에서 기술한 바와 같이, L-부티오닌-(S,R)-설폭시민 (BSO)의 첨가에 의해 스트레스를 받은 자폐증 증후군 장애(ASD) 섬유아세포를 구제하는 능력에 대해 스크리닝한다. ASD 섬유아세포는 글루타티온 (GSH)의 드노보(de novo) 합성을 GSH 합성효소의 특정 저해제인 L-부티오닌-(S,R)-설폭시민 (BSO)으로 저해하는 것에 대해 과민성인 경향이 있다 (Jauslin et al., Hum. Mol. Genet. 11(24):3055 (2002)). BSO-매개의 세포 사멸은 D-PUFA의 투여에 의해 방지 및/또는 경감되어야 한다.
실시예 23: 정신분열증 및 양극성 장애에 대한 효능 검사
연구를 위해, 정신분열증이 있으면서 항정신병 의약제를 복용하지 않는 환자를 선별한다. 식이요법의 PUFA 공급원을 조절하면서, D-PUFA (0.01, 0.1, 1.0, 10.0, 및 100 mg/kg의 D2-LA, D4-ALA, 및 D2-LA와 D4-ALA 둘 다의 1:1 조합) 또는 H-PUFA (0.01, 0.1, 1.0, 10.0, 및 100 mg/kg의 LA, ALA, 및 LA와 ALA 둘 다의 1:1 조합)를 6개월에 걸쳐 매일 투여한다. 매주, 정신분열 발생의 빈도 및 기간에 대해 환자를 조사한다. 부가적으로는, 매주 혈액 샘플을 취하여, 전술한 바이오마커와 같은 산화적 스트레스의 바이오마커를 측정한다. D2-LA 및 D4-ALA는 정신분열 발생의 빈도 및/또는 기간을 줄이며, 산화적 스트레스와 관련된 바이오마커의 수준을 감소시키는 것으로 예상된다.
양극성 장애 환자에서 유사한 연구를 수행할 수 있다. D2-LA 및 D4-ALA는 우울증 및 조증과 같은 기분 변화의 빈도 및/또는 기간을 줄이며, 산화적 스트레스와 관련된 바이오마커의 수준을 감소시키는 것으로 예상된다.
헌팅턴 질환 환자에서 유사한 연구를 수행할 수 있다. D2-LA 및 D4-ALA는 신경 세포 사멸을 줄이며, 산화적 스트레스와 관련된 바이오마커의 수준을 감소시키는 것으로 예상된다.
실시예 24: 다운 증후군 모델에서 효능 검사
다운 증후군 피질 뉴런 배양물은 당해 기술분야에 알려져 있다. D-PUFA (0.01, 0.1, 1.0, 10.0, 및 100 μM의 D2-LA, D4-ALA, 및 D2-LA와 D4-ALA 둘 다의 1:1 조합) 또는 H-PUFA (0.01, 0.1, 1.0, 10.0, 및 100 μM의 LA, ALA, 및 LA와 ALA 둘 다의 1:1 조합)를 DS 피질 배양물에 투여하고, 공지된 방법을 이용해 24, 48, 및 72시간째에 세포-생존율을 측정한다. D2-LA 및 D4-ALA는 DS 피질 뉴런의 생존율을 증대시키는 것으로 예상된다.
실시예 25: 프리드라이히 운동실조 모델에서 효능 검사
m-섬유아세포 (Frda L3 /L-; h- I54F)는 프라탁신 대립유전자가 결실되고, 질병과 관련된 인간 프라탁신 (I154F)의 돌연변이된 형태를 과다발현한다. 세포를 FAC (철 암모늄 시트레이트) 및 BSO (부티오닌 설폭시민- 글루타티온 합성의 저해제)로 처리하면, 세포 생존율이 상실되었다. 세포를 48-웰 플레이트에 평판배양하고, FAC 및 BSO로 각각 48시간 및 24시간 동안 처리하였다. BSO 처리 후 2시간째에, H/D-PUFA를 첨가하였다. 실험 종료 시, 세포 생존율을 Promega Cell-Glow 키트로 평가하고, 아비트러리 발광 유닛(Arbitrary Luminescence Units, ALU)에서 측정하였으며, 생존%로서 표현하였다 (도 22). 도 22에서, NT는 미처리를 나타내며; F는 철 암모늄 시트레이트를 나타내며; B는 부티오닌 설폭시민을 나타내며; CC는 분석법에서 최종 농도를 0.5%로 만드는 데 사용된 담체 대조군 DMSO (다이메틸설폭사이드)를 나타내고; IDB는 이데베논을 나타낸다. 결과는 D-LA의 투여에 의한 생존력의 투여량-의존성 구제(rescue)를 나타내었다. 또한, D-ALA를 사용하고 전술한 실험 프로토콜을 이용해, 유사한 결과 (나타내지 않음)를 수득하였다.
마찬가지로, 이데베논을 D-PUFA와 공동-투여하는 효과를 측정하기 위해 조사하였다 (도 23). 전술한 실험 프로토콜을 이용한 결과, 이데베논을 D-LA 또는 D-ALA와 공동-투여하면, 이데베논, D-LA, 또는 D-ALA의 개별 투여와 비교해 세포 생존율이 증가한 것으로 나타났다.
D-PUFA 활성에 대한 전-처리의 효과를 알아보기 위해, 유사한 실험 프로토콜을 이용하였으며, 이 프로토콜에 따라 세포를 FAC 및 H/D-PUFA로 48시간 동안 처리한 다음, 24시간 후에 BSO를 첨가하고, 다시 24시간 후에 세포 생존율을 측정하였다 (도 24). 그 결과, 세포를 D-PUFA로 전-처리함으로써 세포 생존율에 대해 투여량-의존성 효과가 나타났다.
부가적인 실험을 또한 수행하여, 서로 다른 D-PUFA를 공동-투여한 효과를 연구하였다 (데이터는 나타내지 않음). I154F 세포를 100% D-LA, 75% D-LA/25% D-ALA, 50% D-LA/50% D-ALA, 및 100% D-ALA로 처리하였다. 그 결과, 서로 다른 양의 D-PUFA를 혼합하여 공동-투여하는 것은 상대적인 세포 생존율에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.
결론
본 발명이 이의 구체적인 실시 양태를 들어 기술되었지만, 당해 기술분야의 당업자는, 본 발명의 본래의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 여러 가지 변화를 줄 수 있으며, 등가물을 대체할 수 있음을 이해해야 한다. 이는 본원에서 나타낸 이점 및 특징 모두를 제공하지 않는 실시 양태들을 포함한다. 또한, 특정 상황, 재료, 물질의 조성, 공정, 공정 단계 또는 단계들을 본 발명의 목적, 사상 및 범위에 맞게 조정하기 위해 여러 가지 변형을 줄 수 있다. 이러한 변형은 모두 본원에 첨부된 청구항의 범위 내에 속하는 것으로 의도된다. 이에, 본 발명의 범위는 첨부된 청구항만을 참조로 하여 정의된다.

Claims (15)

  1. 고도불포화된 지방산 또는 지방산 에스테르를 포함하는,
    에너지 프로세싱 손상 장애(impaired energy processing disorder) 또는 미토콘드리아 결함(mitochondrial deficiency)의 치료 또는 저해용 약학 조성물로서,
    상기 고도불포화된 지방산 또는 지방산 에스테르는 비스-알릴릭 위치(bis-allylic position)에서 하나 이상의 13C 원자 또는 하나 이상의 중수소 원자를 포함하도록 변형되고,
    상기 에스테르가 트리글리세라이드, 다이글리세라이드, 모노글리세라이드, 또는 알킬 에스테르이고,
    상기 변형된 고도불포화된 지방산 또는 지방산 에스테르는 환자에게 투여 후 환자의 신체로 병합(incorporation)되고,
    상기 변형된 고도불포화된 지방산 또는 지방산 에스테르의 양이, 환자에게 투여되는 지방산 또는 지방산 에스테르의 총 함량 중 5중량% 내지 75중량%이고,
    상기 에너지 프로세싱 손상 장애 또는 미토콘드리아 결함이,
    코엔자임 Q 결핍; 진성 당뇨병 및 난청(DAD), 및 모계 유전성 당뇨병 및 난청(MIDD); 프리드리히 운동실조(FA); 레버 선천성 흑암시(Leber's congenital amaurosis); 레버 유전성 시신경 병증(LHON); 리증후군(Leigh syndrome); 미토콘드리아 근질환, 뇌병증, 유산 산증, 및 뇌졸중(MELAS) 증후군; 미토콘드리아 신경위장관 뇌근육병증 (MNGIE); 불균일 적색근섬유와 연관된 근간대성 간질(MERRF) 증후군; 근육신경학적 위장관 뇌병증(Myoneurogenetic gastrointestinal encephalopathy, MNGIE); 신경병증, 운동실조(ataxia), 색소망막염, 및 안검하수(NARP); 시신경병증(optic neuropathies) 및 눈근육마비(opthalmoplegias); 월프-파킨슨-화이트 증후군(Wolff-Parkinson-White syndrome); 심근병증(cardiomyopathy); X-연관성 부신백질형성장애(X-ALD); 지질 근육병증; 만성 피로; 섬유근통 증후군; 판코니 증후군(Fanconi's syndrome); 사구체성신증(glomerulonephropathy); 피어슨 증후군(Pearson's syndrome); 편두통; 발작; 및 뇌졸중으로 이루어진 군에서 선택되는 것인,
    약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 변형된 고도불포화된 지방산 또는 지방산 에스테르의 양이, 환자에게 투여되는 지방산 또는 지방산 에스테르의 총 함량 중 10중량% 내지 50중량%인 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 변형된 고도불포화된 지방산 또는 지방산 에스테르의 양이, 환자에게 투여되는 고도불포화된 지방산 또는 지방산 에스테르의 총 함량 중 10중량% 내지 30중량%인 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 변형된 고도불포화된 지방산 또는 지방산 에스테르의 양이, 환자에게 투여되는 고도불포화된 지방산 또는 지방산 에스테르의 총 함량 중 20중량% 이상인 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 환자의 세포 또는 조직이, 천연적인 고도불포화된 지방산 또는 지방산 에스테르의 자가산화를 방지하기 위하여 상기 변형된 지방산 또는 지방산 에스테르를 유지하는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 변형된 고도불포화된 지방산 또는 지방산 에스테르가 오메가-3 지방산, 오메가-3 지방산 에스테르, 오메가-6 지방산, 또는 오메가-6 지방산 에스테르인 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 변형된 고도불포화된 지방산 또는 지방산 에스테르가 11,11-D2-리놀렌산, 14,14-D2-리놀렌산, 11,11,14,14-D4-리놀렌산, 11,11-D2-리놀레산, 14,14-D2-리놀레산, 11,11,14,14-D4-리놀레산, 11-D-리놀렌산, 14-D-리놀렌산, 11,14-D2-리놀렌산, 11-D-리놀레산, 14-D-리놀레산, 11,14-D2-리놀레산 및 이들의 에스테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 변형된 고도불포화된 지방산 또는 지방산 에스테르가 프로-비스-알릴릭(pro-bis-allylic) 위치에서 하나 이상의 13C 원자 또는 하나 이상의 중수소 원자를 포함하도록 추가로 변형된 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 변형된 고도불포화된 지방산 또는 지방산 에스테르가 아라키돈산, 에이코사펜타엔산, 도코사헥사엔산 또는 이들의 에스테르인 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 조성물이 하나 이상의 항산화제와 함께 투여되는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 항산화제가 코엔자임 Q, 이데베논(idebenone), 미토퀴논(mitoquinone), 미토퀴놀(mitoquinol), 비타민 C, 또는 비타민 E인 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
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