DE60030754T2 - Potenzierung der wirksamkeit von sn-38-prodrogen - Google Patents
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Description
- Die Erfindung betrifft die therapeutische Verwendung von Pro-Pharmaka. Spezifischer betrifft die Erfindung Verfahren zum Potenzieren der Wirksamkeit von Pro-Pharmaka.
- Viele potentielle pharmazeutische Mittel versagen aufgrund einer übermäßigen Toxizität oder beschränkten Bioverfügbarkeit verwendet zu werden. In einigen Fällen können diese beschränkenden Faktoren durch Modifizieren des pharmazeutischen Wirkstoffs verbessert werden, um ein Pro-Pharmakon zu erzeugen. Das Pro-Pharmakon wird dann durch den Körper in eine pharmazeutisch-aktive Substanz umgewandelt.
- Die Internationale Anmeldungsnummer WO98/07734 offenbart die Herstellung von Oligonukleotid-Pro-Pharmaka mit Ester oder Amid-Modifikationen, die einen Nicht-Brücken-Sauerstoff der Phosphodiester-Bindung bedecken. Kuhn, Oncology, Supplement No. 6, 39–42 (1998) offenbart, dass CPT-11 (Camptosar) ein antineoplastisches Pro-Pharmakon ist, welches durch die Carboxylesterase-Aktivität in der Leber und anderen Geweben in den aktiven Wirkstoff SN-38 umgewandelt wird. Cerosimo, The Annals of Pharmacotherapy 32: 1324–1333 (1998) lehrt, dass die Stammverbindung von CPT-11, Camptothecin, nicht in der Lage war, als ein Pharmazeutikum aufgrund der schweren Toxizität entwickelt zu werden.
- Aufgrund der Gegenwart von Carboxylesterasen und Amidasen in der Leber und anderen Geweben, ist die Fähigkeit Pro-Pharmaka herzustellen, die hinzugefügte Ester oder Amidgruppen aufweisen, ein Verallgemeinertes Phänomen. Diese Verbindungen behalten jedoch aufgrund der schnellen Hydrolyse des Pro-Pharmakons im Allgemeinen zumindest etwas der Toxizität der Stammverbindung, Kuhn, supra, offenbart, dass SN-38, der aktive Metabolit von CPT-11, welches die Grenztoxizität der Stammverbindung, Camptothecin, ist, nach wie vor Diarrhöe hervorruft.
- Es gibt somit ein Bedarf an Verfahren, um Pro-Pharmaka auf eine Weise zu verabreichen, die ihre Wirksamkeit maximiert, während eine signifikante Toxizität vermieden wird. Idealerweise sollten solche Verfahren die Weise, in welcher der Körper Pro-Pharmaka verarbeitet, beeinflussen und würde somit für eine großen Auswahl von Pro-Pharmaka anwendbar.
- In einem ersten Aspekt bietet die Erfindung ein oder mehrere Produkt(e), die ein Oligonukleotidphosphorothioat oder Phosphorodithioat und ein SN-38 Pro- Pharmakon als eine kombinierte Zubereitung für die gleichzeitige, getrennte oder sequentielle Verwendung enthalten, für das statistisch-signifikante Potenzieren der Aktivität des SN-38 Pro-Pharmakons ohne das Erzeugen von signifikanten Nebenwirkungen, wobei das Oligonukleotidphosphorothioat oder Phosphorodithioat kein Oligonukleotid mit zwei 5' und vier 3'2'-O-Methylribonukleoside ist und die Sequenz 5'-UGACACCTGTTCTCACUCAC-3' aufweist.
- In einem zweiten Aspekt bietet die Erfindung ein oder mehrere Produkt(e), die ein Oligonukleotid-Phosphorothioat oder Phosphorodithioat und ein SN-38-Pro-Pharmakon als eine kombinierte Zubereitung enthalten, für die simultane, getrennte oder sequentielle Verwendung für die statistisch signifikante Wirksammachung der Aktivität des SN-38-Pro-Pharmakons ohne signifikante Nebenwirkung zu erzeugen, wobei das Oligonukleotid-Phosphorothioat oder Phosphorodithioat für die Verabreichung vor dem Pro-Pharmakon ist.
- In einem dritten Aspekt bietet die Erfindung ein oder mehrere Produkt(e), die ein Oligonukleotid-Phosphorothioat oder Phosphorodithioat und ein SN-38-Pro-Pharmakon als eine kombinierte Zubereitung enthalten, für die simultane, getrennte oder sequentielle Verwendung für die statistisch signifikante Wirksammachung der Aktivität eines SN-38-Pro-Pharmakons ohne signifikante Nebenwirkung zu erzeugen, wobei das SN-38-Pro-Pharmakon in einer Menge vorhanden ist, die in der Abwesenheit von dem einen oder mehreren Produkten therapeutisch nicht wirksam sein würde.
- In einem vierten Aspekt bietet die Erfindung die Verwendung eines Oligonukleotid-Phosphorothioats oder Phosphorodithioats zum Herstellen eines Medikamentes für die statistisch signifikante Wirksammachung der Aktivität eines SN-38-Pro-Pharmakons ohne signifikante Nebenwirkung zu erzeugen, wobei das Oligonukleotid-Phosphorothioat oder Phosphorodithioat kein Oligonukleotid mit zwei 5' und vier 3'2'-O-Methylribonukleoside ist und die Sequenz 5'-UGACACCTGTTCTCACUCAC-3' aufweist.
- In einem fünften Aspekt bietet die Erfindung die Verwendung eines Oligonukleotid-Phosphorothioats oder Phosphorodithioats zum Herstellen eines Medikamentes für die statistisch signifikante Wirksammachung der Aktivität eines SN- 38-Pro-Pharmakons ohne signifikante Nebenwirkung zu erzeugen, wobei das Oligonukleotid-Phosphorothioat oder Phosphorodithioat für die Verabreichung vor dem Pro-Pharmakon ist.
- In einem sechsten Aspekt bietet die Erfindung die Verwendung eines Oligonukleotid-Phosphorothioats oder Phosphorodithioats zum Herstellen eines Medikamentes für die statistisch signifikante Wirksammachung der Aktivität eines SN-38-Pro-Pharmakons ohne signifikante Nebenwirkung zu erzeugen, wobei das SN-38-Pro-Pharmakon in einer Menge vorhanden ist, die in der Abwesenheit des Oligonukleotid-Phosphorothioat oder Phosphorodithioat therapeutisch nicht wirksam sein würde.
- In der vorliegenden Erfindung kann das Pro-Pharmakon ein Ester oder ein Amid einer aktiven Verbindung sein. Die aktive Verbindung kann ein Anti-Krebs-Arzneimittel sein, welches Camptosar sein kann. Das Oligonukleotid kann ein 2'-O-substituiertes Ribonukleosid aufweisen. Das 2'-O-substituierte Ribonukleosid kann aus 2'-O-Methylribonukleosiden und 2'-O-Methoxyethoxy-Ribonukleosiden ausgewählt sein.
- Der dritte und sechste Aspekt der Erfindung sind besonders nützlich, wo die Toxizitiät des Pro-Pharmakons oder des aktiven Wirkstoffs Dosis-limitierend ist. Somit können der dritte und sechste Aspekt der Erfindung den therapeutischen Index des Pro-Pharmakons erhöhen.
- Die Erfindung sieht die Verabreichung von SN-38 Pro-Pharmaka auf eine Weise vor, die ihre Wirksamkeit maximiert, und somit ermöglicht, dass geringere, weniger toxische Dosierungen verwendet werden können. Die Erfindung wirkt durch eine Vielzahl von Mechanismen, die die Fähigkeit des Körpers, das Pro-Pharmakon zu der aktiven Verbindung zu bearbeiten, modulieren und seiner Fähigkeit, entweder das Pro-Pharmakon oder den aktiven Wirkstoff zu klären, und sind somit für einen große Auswahl von SN-38 Pro-Pharmaka anwendbar.
- Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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1 zeigt die Überlebensraten für Mäuse in der HCT116-Studie unter Verwendung von Oligo 1. -
2 zeigt die Überlebensraten für Mäuse in der HCT116-Studie unter Verwendung von Oligo 2. -
3 zeigt ein Kaplan-Meier-Überlebensdiagramm für Mäuse in der HCT118 Studie unter Verwendung von Oligo 1. -
4 zeigt ein Kaplan-Meier-Überlebensdiagramm für Mäuse in der HCT116 Studie unter Verwendung von Oligo 2. -
5 zeigt die Zeit der Verabreicherung der Oligonukleotid-Wirkung auf die Überlebenszeiten für Mäuse. -
6 zeigt die Wirksamkeit der oralen Verabreicherung von Oligonukleotiden die in den Überlebenszeiten für Mäuse widergespiegelt ist. - Die Erfindung betrifft die therapeutische Verwendung von SN-38 Pro-Pharmaka. Spezifischer betrifft die Erfindung das Potenzieren der Wirksamkeit von SN-38 Pro-Pharmaka.
- So wie hierin verwendet, ist ein „Pro-Pharmakon" eine Verbindung, welche einen aktiven Wirkstoff aufweist, der durch eine spaltbare Bindung kovalent an einen anderen Anteil gebunden ist, wobei die pharmakologische Aktivität der aktiven Verbindung größer ist, als die pharmakologische Aktivität des Pro-Pharmakons, und wobei die aktive Verbindung im Körper durch Spalten der spaltbaren Bindung erzeugt wird. Eine „aktive Verbindung" ist ein Molekül mit einer pharmakologischen Aktivität. Eine „pharmakologische Aktivität" ist eine Aktivität, die bei der Behandlung von einer oder mehreren Krankheiten oder Krankheitssymptomen nützlich ist. Ein „Anteil" ist eine chemische Gruppe oder Struktur. Eine „spaltbare Bindung" ist eine kovalente Bindung, die durch eine enzymatische Aktivität in dem Körper gespalten werden kann. Der Ausdruck „ohne Erzeugen von signifikanten Nebenwirkungen" bedeutet, dass jede Zeichen oder Symptome von Toxizität, die in der Gegenwart des Oligonukleotid-Phosphorothioats oder -Phosphorodithioats beobachtet werden, nicht größer sind, als jene, die in der Abwesenheit des Oligonukleotidphosphorothioats oder -Phosphorodithioats zu einem Ausmaß beobachtet werden, das die Kombination des Pro-Pharmakons und Oligonukleotid-Phosphorothioats oder -Phosphorodithioats, vom Erhalten der behördlichen Genehmigung ausschließen würde. Der Begriff „Co-Verabreichung" ist beabsichtigt, Behandlungsschemata zu beinhalten, in welchen entweder das Pro-Pharmakon oder das Oligonukleotid-Phosphorothioat oder Phosphorodithioat nach dem Einstellen des anderen Wirkstoffs fortgesetzt wird.
- Zu bevorzugten SN-38 Pro-Pharmaka zählen Amide und Ester der aktiven Wirkstoffe. Zu solchen aktiven Wirkstoffen zählen, ohne Einschränkung, Antikrebs Chemotherapeutika, antiinflammatorische Wirkstoffe, antiinfektiöse Wirkstoffe, antivirale Wirkstoffe und kardiovaskuläre Arzneimittel. Zahlreiche Pro-Pharmaka sind im Stand der Technik bekannt (siehe, z.B. Singh et al., J. Sci. Ind. Res. 55: 497–510 (1996)). Zu spezifischen nicht-einschränkenden Beispielen von bevorzugten Pro-Pharmaka zählen Camptosar ((7-Ethyl-10-(-4-piperidinol)-1-piperidnocarbonyloxy-camptothecin; CPT-11) und Camptosar-Analoga und Foscarnat. Der Anteil, der von dem Pro-Pharmakon abgespalten wird, kann vorzugsweise aus Estern, und Alpha-Acyloxyalkylester (für Carboxy-Funktionalitäten); Amide, Ester, Carbonatester, Phosphatester, Ether und Alpha-Acyloxyalkylethers (für Hydroxyl-Funktionalitäten); Thioesters, Alpha-Acyloxyalkylthioesters und Disulfide (für Sylfhydryl-Funktionalitäten); Ketale, Imine, Enolester, Oxazoladine, und Thiazolidine (für Carbonyl-Funktionalitäten); Amide, Carbamate, Imine, Enamine, N-Mannich-Basen, und N-Acyloxyalkoxycarbonyl-Derivate (für Amino-Funktionalitäten); N-Acyloxyalkyl-Derivate (für quarternäre Amino-Funktionalitäten); N-Sulphonyl-Imidate (für Ester oder Sulfonamido-Funktionalitäten); N-Mannich-Basen (für NH-saure Funktionalitäten); und N-Acyloxyalkyl-Derivate (für heterozyklische Amino-Funktionalitäten) ausgewählt sein.
- Für die Zwecke der Erfindung zählen zu dem Begriff „Oligonukleotide" zählen Polymere von zwei oder mehreren Deoxyribonukleotiden, oder jedes modifizierte Nukleosid, einschließlich 2'-Halo-Nukleoside, 2'-O-substituierte Ribonukleoside, 3'-O-substituierte Nukleotide, Deazanukleoside oder jede Kombination davon. Solche Monomere können durch jede einer Vielzahl von bekannten Internukleosid-Bindungen aneinander gekoppelt werden. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen können diese Internukleosid-Bindungen Phosphodiester, Phosphotriester, Phosphorothioat, oder Phosphoamidat-Bindungen, oder Kombinationen davon sein. Die Bindungen können in jeder Konfiguration sein, einschließlich, ohne Einschränkung, 5'-3', 5'-2', 5'-5', 3'-3', 3'-5', 2'-5' oder jede Kombination davon. Der Begriff „Oligonukleotid" umfasst ebenfalls solche Polymere mit chemisch modifizierten Basen oder Zuckern und/oder mit zusätzlichen Substituenten, einschließlich, ohne Einschränkung, lipophile Gruppen, Cholesterol, Folsäure, interkalierende Agenzien, Diamine und Adamantan. Oligonukleotide können ebenfalls, z.B. in Cyclodextrinen und/oder Ciposomen formuliert werden. Für Zwecke der Erfindung bedeutet der Begriff „2'-O-substituiert" bzw. "3'-O-substituiert", die Substitution der 2' oder 3' Position des Pentose-Anteils mit einem Halogen (vorzugsweise Cl, Br, oder F), oder einer O-niederen Alkylgruppe, die 1–6 gesättigte oder ungesättigte Kohlenstoffatome enthält, oder mit einer -O-Aryl oder Allyl-Gruppe mit 2–6 Kohlenstoffatomen, wobei eine solche Alkyl, Aryl oder Allyl-Gruppe unsubstituiert oder substituiert sein kann, z.B. mit Halogen, Hydroxy, Trifluormethyl, Cyano, Nitco, Acyl, Acyloxy, Alkoxy, Carboxyl, Carbalkoxyl, oder Aminogruppen; oder eine solche 2'-Substitution kann mit einer Hydroxy-Gruppe (um ein Ribonukleosid zu erzeugen), einer Amino oder einer Halogen-Gruppe, jedoch nicht mit einer 2'H-Gruppe sein. In bevorzugten Ausführungsformen ist das 2'-O-substituierte Ribonukleosid aus 2'-O-Methylribonukleosid und 2'-O-Methoxyethoxy-Ribonukleosid ausgewählt. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist das 3'-O-substituierte Ribonukleosid aus 3'-O-Methylribonukleosiden und 3'-O-Methoxyethoxy-Ribonukleosiden ausgewählt. In bestimmten Ausführungsformen können alle Nukleoside 2'-O-substituiert sein, vorzugsweise 2'-O-Alkyl. Zu den in der Erfindung verwendeten Oligonukleotiden zählen auch doppelsträngige Oligonukleotide, einschließlich Haarnadel-Oligonukleotiden, sowie zyklische Oligonukleotide.
- In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen kann ein Oligonukleotid für die Verwendung in der Erfindung zu einer endogen oder exogenen Nukleinsäure-Sequenz, vorzugsweise einer Nukleinsäure, die in eine Krankheit eingebunden ist, komplementär sein. Der Begriff „komplementär" bedeutet, die Fähigkeit aufzuweisen, an eine genomische Region, ein Gen oder ein RNA Transkript davon unter physiologischen Bedingungen zu hybridisieren. Eine solche Hybridisierung ist für gewöhnlich das Ergebnis einer Basen-spezifischen Wasserstoffbindung zwischen komplementären Strängen, vorzugsweise, um Watson-Crick oder Hoogsteen Basenpaaren zu bilden, obwohl andere Arten von Wasserstoffbindungen, so wie Basen-Stapelung ebenfalls zu der Hybridisierung führen können. Praktischerweise kann eine solche Hybridisierung aus der Beobachtung der spezifischen Genexpressions-Inhibierung abgeleitet werden. Die Nukleinsäure-Sequenz, zu welcher die modifizierte Oligonukleotid-Sequenz komplementär ist, wird von der biologischen Wirkung abhängen, die modifiziert werden möchte. In bestimmten besonders bevorzugten Ausführungsformen ist das Oligonukleotid zu einem Gen komplementär, welches ausgewählt ist aus mdm-2, PKA, PKC, raf-Kinase, bcl-2, H-ras, c-myc, DNA Methyltransferase, Histon-Deacetylase und VEGF. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen des zweiten, dritten, fünften und sechsten Aspekts der Erfindung hat ein solches Oligonukleotid die Sequenz 5'-UGACACCTGTTCTCACUCAC-3'. Jedoch sind in dem ersten und vierten Aspekt, Oligonukleotde mit dieser Sequenz spezifisch ausgeschlossen, und in einigen bevorzugten Ausführungsformen sind Oligonukleotide, die zu dem mdm-2-Gen komplementär sind, spezifisch ausgeschlossen. In bestimmten Ausführungsformen, sind Antisense-Olgonukleotide spezifisch ausgenommen, da die Oligonukleotide, die in der Erfindung verwendet werden, in der Lage sind, die Aktivität von Pro-Pharmaka in einer Sequenz-unabhängigen Art und Weise zu potenzieren.
- Oligonukleotide in Antisense-Ausführungsformen weisen vorzugsweise eine Länge von etwa 13 bis etwa 100 Nukleotide, mehr bevorzugt von etwa 15 bis etwa 50 und am meisten bevorzugt von etwa 15 bis etwa 35 auf. Oligonukleotide in nicht-Antisense Ausführungsformen können innerhalb dieser Bereiche sein, können vorzugsweise aber auch eine Länge von etwa 5 bis etwa 15 Nukleotide aufweisen. Vorzugsweise enthalten die in der Erfindung verwendeten Oligonukleotide eine oder mehrere modifizierte Internukleosid-Bindungen und können gegebenenfalls entweder Deoxyribonukleoside, Ribonukleoside oder 2'-O-substituierte Ribonukleoside, oder jede Kombination davon enthalten. Besonders bevorzugte Antisense-Oligonukleotide gemäß diesem Aspekt der Erfindung beinhalten gemischte Rückgrat-Oligonukleotide, einschließlich chimäre Oligonukleotide und Hybridoligonukleotide.
- Für die Zwecke der Erfindung ist ein „gemischtes Rückgrat-Oligonukleotid" ein Oligonukleotid mit mehr als einer Art von Rückgrat-Substituent, z.B. Unterschiede in dem Zucker- und/oder Internukleosid-Bindungen unter den verschiedenen Nukleosiden, welche das Oligonukleotid enthalten.
- Für Zwecke der Erfindung bezieht sich ein „chimäres Oligonukleotid" auf ein Oligonukleotid mit mehr als einer Art von Internukleosid-Bindung. Eine bevorzuge Ausführungsform eines solchen chimären Oligonukleotids ist ein chimäres Oligonukleotid, welches ein Phosphorothioat, Phosphodiester, oder Phosphorodithioat-Region aufweist, welche vorzugsweise von etwa 2 bis etwa 12 Nukleotide aufweist, und ein nicht-ionische Region, vorzugsweise eine Alkylphosphonat oder Alkylphosphonothioat-Region. Vorzugsweise enthalten chimäre Oligonukleotide zumindest drei aufeinanderfolgende Internukleosid-Bindungen, die aus Phosphodiester und Phosphorothioat-Bindungen, oder Kombinationen davon ausgewählt sind.
- Für den Zweck der Erfindung bezieht sich ein „Hybrid-Oligonukleotid" auf ein Oligonukleotid mit mehr als einer Art von Nukleosid. Eine bevorzugte Ausführungsform eines solchen Hybrid-Oligonukleotids weist ein Ribonukleotid oder eine 2'-O-substituierte Ribonukleotidregion, welche vorzugsweise von etwa 2 bis etwa 12 2'-O-substituierte Nukleotide aufweist und eine Deoxyribonukleotid-Region auf. Vorzugsweise wird ein solches Hybrid-Oligonukleotid zumindest drei aufeinanderfolgende Deoxyribonukleoside enthalten und wird ebenfalls Ribonukleoside, 2'-O-substituierte Ribonukleoside, oder Kombinationen enthalten. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Deoxynukleotid-Region auf beiden Seiten durch eine 2'-O-substituierte Region flankiert. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die 2'-O-substituierten Regionen 2'-O-Methylregionen, am meisten bevorzugt mit vier 2'-O-Methylnukleosiden. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist das gesamte Rückgrat des Oligonukleotids ein Phosphorothioat-Rückgrat. Besonders bevorzugte Hybrid-Oligonukleotide weisen ein oder mehrere 2'-O-Methylribonukleoside oder 2'-O- Methoxyethoxyribonukleoside auf.
- Die Synthese von Oligonukleotiden kann nun routinemäßig erreicht werden. Siehe z.B., Methods in Molecular Biology, Vol. 20: Protocols for Oligonucleotides and Analogs S. 165–189 (S. Agrawal, Ed., Humana Press, 1993); Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, S. 87–108 (F. Eckstein, Ed., 1991); und Uhlmann and Peyman, supra. Agrawal und Iyer, Curr. Op. in Biotech. 6: 12 (1995); und Antisense Research and Applications (Crooke and Lebleu, Hrsg., CRC Press, Boca Raton, 1993).
- Ohne gewünscht zu werden, an eine Theorie gebunden zu sein, wird vermutet, dass die Potenzierung des Pro-Pharmakons einen oder mehrere der folgenden Mechanismen einschließt:
- • Modulation der Retentionszeit des Pro-Pharmakons in der Leber und anderen Geweben, einschließlich Tumorgeweben.
- • Kompetition mit Spaltungsenzymen oder anderen hepatischen Enzymen z.B. Carboxylesterasen, Amidasen oder anderen Esterasen
- • Kompetition mit Transportfaktoren von der Leber, z.B. cMOAT für CPT-11
- • Kompetition für die Bindung von Serumproteinen
- • Kompetition mit Bindung von Endothelzellwänden
- • Kompetition für die kovalente Modifikation, z.B. Glucouronidierung
- • Verlangsamen der Hydrolyse des Pro-Pharmakons, so dass der aktive Metabolit fortlaufend in die Blutzirkulation freigesetzt wird.
- • Stabilisierung der aktiven Form des Arzneimittels, z.B. Lacton-Bildung für CPT-11.
- Jeder dieser Mechanismen kann von der Sättigung des Systems mit dem Oligonukleotidphosphorthioat oder Phosphorodithioat vor der Verabreichung des Pro-Pharmakons profitieren.
- Die folgenden Beispiele sind beabsichtigt, bestimmte, besonders bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung weiters zu illustrieren und sind nicht beabsichtigt, den Umfang der Erfindung einzuschränken. Oligo 1 fällt nicht in den Umfang des ersten und vierten Aspekts der Erfindung.
- Beispiel 1
- Behandlung von Kolonkrebs-Tumor-tragenden Mäusen
- Weibliche NCr-Nacktmäuse, 6–8 Wochen alt, wurden nach Belieben mit Wasser (Umkehrosomse, 0,17% Cl) und einer autoklavierten Standard-Nagetierkost (NIH31) von 18% Protein; 5% Fett, 5% Ballaststofffe, 8% Asche und 3% Mineralien gefüttert. Die Mäuse wurde in Mikroisolatoren bei einem 12 Stunden Lichtzyklus bei 22°C bei einer Luftfeuchtigkeit von 40–60% gehalten. Den Mäusen wurde in die Flanke subkutan 1 mm3 HCT-116 menschliche Kolonkarzinom-Fragmente in die Flanke implantiert. Die Tumore wurden anfänglich zweimal in der Woche, dann, wenn die Tumore ein Gewicht von ungefähr 100 mg erreichten, täglich überwacht. Wenn die Tumore ein Gewicht zwischen 40–221 mg (berechnetes Gewicht) erreichten, wurden die Tiere paarweise auf die verschieden Behandlungsgruppen abgestimmt. Das geschätzte Tumorgewicht wurde gemäß der Gleichung bestimmt:wobei w = Querschnitt und 1 = Länge in mm eines HCt-116 Tumors ist. Phosphorothioat-Oligonukleotide mit 2'-O-Methylribonukleosiden an den 2 terminalen 5'-Positonen und 4 terminalen 3'-Positionen (Oligo 1), oder den 4 terminalen 5' und 3' Positionen (Oligo 2) wurden gemäß Standardverfahren hergestellt und in neutraler gepufferter Salzlösung aufgelöst. Oligo 1 hatte die Sequenz 5'-UGACACCTGTTCTCACUCAC-3' (komplementär zu mdm-2) und die Sequenz von Oligo 2 war 5'-UCGCACCCATCTCTCTCCUUC-3' (komplementär zu dem HIV-1 gag-Gen). Camptosar wurde von Phramacia & Upjohn gekauft.
- Die Tiere wurden am Tag 1 paarweise auf 12 Gruppen mit 9 Mäusen pro Gruppe abgestimmt. Oligo oder Oligo 2 wurde i.p. bei 10 mg/kg Dosen gemäß einem 5/2/5/2/5/2/5 Plan verabreicht (d.h. fünf Tage Dosierung, zwei Tage Ruhe, Wiederholung). Camptosar wurde i.v. bei Dosen von 25 oder 50 mg/kg, einmal pro Woche, für 3 Wochen verabreicht. Für die kombinierten Behandlungen wurden 5 oder 10 mg/kg Oligo 1 i.p. mit Camptosar bei 25 mg/kg oder 10 mg/kg verabreicht. Oligo 1 wurde i.p. mit 50 mg/kg Camptosar verabreicht. Oligo 2 wurde bei einer Dosis von 10 mg/kg i.p. mit 25 oder 50 mg/kg Camptosar verabreicht. Die Kontrolltiere wurde mit Vehikel i.p gemäß einem 5/2/5/2/5/2/5 Zeitplan behandelt. Die Studie wurde am Tag 56 beendet.
- Die Ergebnisse wurden unter Verwendung des Tumorwachstums Verzögerungs(TGD)-Endpunktverfahrens bestimmt. Jede Maus wurde euthanisiert, wenn ihr HCT-116 Tumor ein Gewicht von 1,5 g erreichte; dies wurde als ein Krebstod genommen. Der mittlere Tag des Überlebens (MDS: Mean Day of Survival) wurde für jede Gruppe berechnet, basierend auf dem berechneten Todestags:wobei die Zeit, um den Endpunkt zu überschreiten (beobachtet), die Anzahl von Tagen ist, die jeder Tumor braucht, um über das Endpunkt (Ausschlussgrenz)-Gewicht zu wachsen (Maus wird euthanasiert), D2 ist der Tag, an dem die Maus euthanasiert wird, D1 ist der letzte Tag der Messschieber-Messung bevor der Tumor den Endpunkt erreicht; Wt2 ist das Tumorgewicht (mg) bei D2, Wt1 ist das Tumorgewicht (mg) bei D1, und das Endpunktgewicht ist das vorherbestimmte „Ausschlussgrenzen"-Tumorgewicht für das verwendete Model. Für die statistische Analyse wurde der ungepaarte t-Test und Mann-Whitney U-Test (das Analysieren von Mittelwerten bzw. Medianen) verwendet, um die statistische Signifikanz von Unterschieden in Überlebenszeiten zwischen den Gruppen zu bestimmen. Diese Analysen wurden bei einem p-Niveau von 0,05 (zwei-seitig) unter Verwendung von Prism (GraphPad) Version 3.0 durchgeführt.
- Von den 9 Vehikel-Kontrollmäusen, hatten 8 Tumore, die den 1,5 g Endpunkt erreichten, mit einem MDS Wert von 21,5 Tagen. Ein Tumor entwickelte sich vollständig zurück, vermutlich aufgrund einer schlechten Tumoraufnahme. Camptosar bei 25 mg/kg erzeugte einen MDS Wert von 31,1 Tagen und bei 50 mg/kg, 42,6 Tagen. Weder Oligo 1 noch Oligo 2 erzeugten allein eine Prolongation von MDS. Die Verabreicherung von 10 mg/kg Oligo 1 mit 25 mg/kg Camptosar verlängerte jedoch den MDS über die Vehikelkontrolle um 24,4 Tage, und über die mit 25 mg/kg Camptosar allein behandelten Mäuse um 14,8 Tage. Jede dieser Extensionen ist statistisch signifikant (p < 0,0001; ungepaarter t-Test). Mäuse, die mit 5 mg/kg Oligo 1 und 25 mg/kg behandelt wurden, erreichten einen MDS Wert von 37,4 Tagen, welches über die Vehikel-Kontrollen (p < 0,0005, ungepaarter t-Test) und über Mäuse, die mit 25 mg/kg Camptosar allein (p < 0,046; ungepaarter t-Test) statistisch signifikant war. Die Verabreicherung von 10 mg/kg Oligo 2 i.p. mit 25 mg/kg Camptosar erzeugte einen MDS Wert von 39,7 Tagen, welches über die Vehikel-Kontrollen (p < 0,0001, ungepaarter t-Test) und über Mäuse, die mit 25 mg/kg Camptosar allein (p < 0,0009; ungepaarter t-Test) statistisch signifikant war. Die Verabreicherung von 10 mg/kg Oligo 2 i.p. mit 50 mg/kg Camptosar erzeugte einen MDS Wert von 42,6 Tagen, welches in Richtung einer statistischen Signifikanz über Mäuse, die mit 50 mg/kg Camptosar behandelt wurden allein (p < 0,08; ungepaarter t-Test), tendiert. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass sowohl Oligo 1 und Oligo 2 die Aktivität der Camptosar-Wirksamkeit in einer statistischen Signifikanz und Dosis-abhängigen Art und Weise potenzieren können, und dass zumindest ein Teil dieser Wirkung unabhängig von der Oligonukleotid-Sequenz ist. Die Ergebnisse von diesen Studien sind in
1 –4 zusammengefasst. - Der Vergleich der Potenzierung der Camptosar-Wirksamkeit durch Oligo 1 mit der Potenzierung der Camptosar-Wirksamkeit durch Oligo 2 zeigt, dass es einen statistisch-signifikanten Unterschied zu Gunsten von Oligo 1 (p < 0,0074; ungepaarter t-Test) gibt. Es wird vermutet, dass dieser Unterschied von einer Antisense-Wirkung von Oligo 1 auf die Expression des mdm-1 Oncogens, zu welchem es komplementär ist, entsteht.
- Beispiel 2
- Behandlung von Bauchspeicheldrüsenkrebs-Tumor-tragenden Mäusen
- Um zu testen, ob die Differenzen zwischen Oligo 1 und Oligo 2 von einer Antisense-Wirkung durch Oligo 1 resultiert, wurden ähnliche Studien in einem Mausmodell für Bauchspeicheldrüsenkrebs ausgeführt (Panc 1 Tumor). Der Panc 1 Tumor hat ein mutantes (nicht-funktionelles) p53-Gen. Da angenommen wird, dass Antisense-Wirkungen gegen mdm-1, hauptsächlich durch Hinaufregulieren der p53 Expression arbeiten, sollte Oligo 1 keine Antisense-spezifische Wirkung in diesem Modell hervorrufen. Es ist jedoch möglich, dass auf mdm-2 gezielte Oligonukleotide in p53 mutanten Zelllinien durch einen von p53 unabhängigen Mechanismus arbeiten.
- Die Studie wurde wie in Beispiel 1 beschrieben ausgeführt, mit Ausnahme, dass Panc-1 Tumor verwendet wurde, 4 Gruppen von jeweils 10 Mäusen verwendet wurden, Oligo 1 und Oligo 2 (in diesem Fall, 5'-UCCCACCTATTCTTACUCCC-3', mit zwei 5' terminalen 2'-O-Methylribonukleosiden und vier 3'-terminalen 2'-O-Methylribonukleosiden) bei Dosen von 20 mg/kg gegeben wurden, Camptosar bei 100 mg/kg gegeben wurde, die Tumor-„Ausschlussgrenze" 1,2 g war, und die Studie am Tag 67 beendet wurde.
- Sowohl Oligo 1 als auch Oligo 2 zeigten eine statistisch-signifikante Potenzierung der Camptosar-Wirksamkeit (p < 0,05; ungepaarter t-Test). Die potenzierende Wirkung von Oligo 1 und Oligo 2, miteinander verglichen, waren statistisch nicht unterscheidbar. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass Oligonukleotide eine statistisch-signifikante potenzierende Wirkung auf Camptosar erzeugen, die unabhängig von der Sequenz des Oligonukleotids ist. Außerdem war in diesen Studien die Behandlung mit Camptosar allein nicht statistisch-signifikant besser als die Behandlung mit Vehikel. Somit demonstrieren diese Ergebnisse, dass Oligonukleotide die Wirksamkeit von Camptosar potenzieren können, so dass eine andererseits sub-therapeutische Dosierung von Camptosar therapeutisch wirksam wird.
- Beispiel 3
- Wirkung der zeitlichen Steuerung und des Weges der Oligonukleotid-Verabreicherung.
- Die Studie von Beispiel 1 wurde wiederholt, jedoch wurde das Oligonukleotid anfänglich am Tag 1 verabreicht und Camptosar wurde anfänglich bis zum Tag 3 nicht verabreicht. Erstaunlicherweise war dieser Zeitplan der Verabreicherung sogar noch wirksamer (siehe
5 ). Die Studie von Beispiel 1 wurde auch wiederholt, jedoch wurde das Oligonukleotid oral verabreicht. Dieser Verabreichungsweg war gleich wirksam (siehe6 ).
Claims (16)
- Ein oder mehrere Produkt(e), die ein Oligonukleotid-Phosphorothioat oder Phosphorodithioat und ein SN-38-Pro-Pharmakon als eine kombinierte Zubereitung enhalten, für die simultane, getrennte oder sequentielle Verwendung für die statistisch signifikante Wirksammachung der Aktivität des SN-38-Pro-Pharmakon ohne signifikante Nebenwirkung zu erzeugen, wobei das Oligonukleotid-Phosphorothioat oder Phosphorodithioat kein Oligonukleotid ist, das zwei 5' und vier 3'2'-O-Methylribonukleoside und die Sequenz 5'-UGACACCTGTTCTCACUCAC-3'.
- Ein oder mehrere Produkt(e), die ein Oligonukleotid-Phosphorothioat oder Phosphorodithioat und ein SN-38-Pro-Pharmakon als eine kombinierte Zubereitung enhalten, für die simultane, getrennte oder sequentielle Verwendung für die statistisch signifikante Wirksammachung der Aktivität des SN-38-Pro-Pharmakon ohne signifikante Nebenwirkung zu erzeugen, wobei das Oligonukleotid-Phosphorothioat oder Phosphorodithioat für die Verabreichung vor dem Pro-Pharmakon ist.
- Ein oder mehrere Produkt(e), die ein Oligonukleotid-Phosphorothioat oder Phosphorodithioat und ein SN-38-Pro-Pharmakon als eine kombinierte Zubereitung enhalten, für die simultane, getrennte oder sequentielle Verwendung für die statistisch signifikante Wirksammachung der Aktivität des SN-38-Pro-Pharmakon ohne signifikante Nebenwirkung zu erzeugen, wobei das SN-38-Pro-Pharmakon in einer Menge vorhanden ist, die in der Abwesenheit von dem einen oder mehreren Produkten therapeutisch nicht wirksam sein würde.
- Produkte nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei das SN-38-Pro-Pharmakon ein Ester oder ein Amid des Wirkstoffes ist.
- Produkte nach Anspruch 4, wobei der Wirkstoff ein Antikrebs-Arzneimittel ist.
- Produkte nach Anspruch 5, wobei das SN-38-Pro-Pharmakon Camptosar ist.
- Produkte nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Oligonukleotid ein 2'-O-substitutiertes Ribonukleosid aufweist.
- Produkte nach Anspruch 7, wobei das 2'-O-substitutierte Ribonukleosid aus 2'O-Methylribonukleosiden und 2'-O-Methoxyethoxyriobnukleosiden ausgewählt ist.
- Verwendung eines Oligonukleotid-Phosphorothioats oder Phosphorodithioats zum Herstellen eines Medikamentes für die statistisch signifikante Wirksammachung der Aktivität des SN-38-Pro-Pharmakon ohne signifikante Nebenwirkung zu erzeugen, wobei das Oligonukleotid-Phosphorothioat oder Phosphorodithioat kein Oligonukleotid ist, das zwei 5' und vier 3'2'-O-Methylribonukleoside und die Sequenz 5'-UGACACCTGTTCTCACUCAC-3'.
- Verwendung eines Oligonukleotid-Phosphorothioats oder Phosphorodithioats zum Herstellen eines Medikamentes für die statistisch signifikante Wirksammachung der Aktivität des SN-38-Pro-Pharmakon ohne signifikante Nebenwirkung zu erzeugen, wobei das Oligonukleotid-Phosphorothioat oder Phosphorodithioat für die Verabreichung vor dem Pro-Pharmakon ist.
- Verwendung eines Oligonukleotid-Phosphorothioats oder Phosphorodithioats zum Herstellen eines Medikamentes für die statistisch signifikante Wirksammachung der Aktivität des SN-38-Pro-Pharmakon ohne signifikante Nebenwirkung zu erzeugen, wobei das SN-38-Pro-Pharmakon in einer Menge vorhanden ist, die in der Abwesenheit von dem einen oder mehreren Produkten therapeutisch nicht wirksam sein würde.
- Verwendung nach Anspruch 9, 10, oder 11, wobei das SN-38-Pro-Pharmakon ein Ester oder ein Amid des Wirkstoffes ist.
- Produkte nach Anspruch 12, wobei der Wirkstoff ein Antikrebs-Arzneimittel ist.
- Produkte nach Anspruch 13, wobei das SN-38-Pro-Pharmakon Camptosar ist.
- Verwendung nach einem der Ansprüche 9 bis 14, wobei das Oligonukleotid ein 2'-O-substitutiertes Ribonukleosid aufweist.
- Verwendung nach Anspruch 15, wobei das 2'-O-substitutierte Ribonukleosid aus 2'O-Methylribonukleosiden und 2'-O-Methoxyethoxyriobnukleosiden ausgewählt ist.
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