MXPA97006016A - Composicion que contiene acidos nucleicos, preparacion y utilizacion - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a una composición farmacéuticaútil para la transfección de unácido nucleico, caracterizada porque contiene además de dichoácido nucleico, al menos un agente de transfección y un compuesto que interviene al nivel de la condensación de dichoácido nucleico, dicho compuesto derivado todo o en parte de una histona, de una nucleolina, de una protamina y/o de uno de sus derivados. Se reporta además la utilización de dicha composición para la transferencia in vitro, ex vivo y/o in vivo deácidos nucleicos.

Description

COMPOSICIÓN QUE CONTIENE ÁCIDOS NUCLEICOS. PREPARACIÓN Y UTILIZACIÓN La presente invención se aplica al campo de la terapia génica y se aplica particularmente a la transferencia in vitro, ex vivo y/o in vivo del material genético. Propone en particular una nueva composición farmacéutica útil para transfectar eficazmente las células. Se informa igualmente los usos de esta composición. Las deficiencias y/o anomalías cromosómicas (mutación, expresión aberrante, etc) son el origen de numerosas enfermedades, en carácter hereditario o no. Durante mucno tiempo, la medicina convencional permaneció impotente en sus conceptos . Ahora, con el desarrollo de la terapia génica, se espera poder en adelante corregir o prevenir este tipo de aberración cromosómica. Esta nueva medicación consiste en introducir información genética, en la célula o el órgano afectado, con objeto de corregir esta deficiencia o anomalía o aún, de expresar ahí una proteína de interés terapéutico. El mayor obstáculo en la penetración de una ácido nucleico en una célula o en un órgano blanco, reside en el tamaño y la naturaleza polianiónica de este ácido nucleico que se opone a su paso a través de las membranas celulares .

Para salvar esta dificultad, ahora se proponen diversas técnicas donde particularmente la transfección de ADN desnudo a través de la membrana plásmica in vivo (WO90/11092) y la REF: 25073 transfección de ADN vía un vector de transfección. En lo que respecta, la transfección de ADN desnudo, su eficacia disminuye aún muy delgado. Los ácidos nucleicos desnudos poseen una vida media plasmática corta en razón de su degradación por las enzimas y de su eliminación por las vías urinarias . Para la segunda técnica, se propone principalmente dos estrategias: La primera emplea los vectores de transfección naturales que son los virus. Propone así utilizar los adenovirus, los virus herpes, los retrovirus y recientemente los virus adeno asociados. Estos vectores se muestra que actúan en el plan de la transfección pero por desgracia no se puede excluir totalmente de sus conceptos ciertos riesgos de patogenicidad, replicación y/o inmunogenicidad, inherentes a su naturaleza viral . La segunda estrategia consiste ventajosamente en utilizar los agentes no virales capaces de promover la transferencia y la expresión de ADN dentro de las células eucariotas. El objetivo de la presente invención se inscribe particularmente en esta segunda estrategia. Los vectores químicos o bioquímicos representan una alternativa ventajosa a los virus naturales, en particular por esta ausencia de respuesta inmunológica y/o recombinación viral. No poseen poder patógeno, el riesgo de multiplicación del ADN dentro de estos vectores es nulo y no están fijados a ningún límite teórico en cuanto al tamaño del ADN a transfectar. Estos vectores sintéticos tienen dos funciones principales, condensar el ADN a transfectar y promover su fijación celular así como su paso a través de la membrana plásmica y, si llega el caso, las dos membranas nucleares. De parte de su naturaleza polianiónica, el ADN no tiene naturalmente ninguna afinidad por la membrana plásmica de las células igualmente polianiónicas. Para paliar este inconveniente, los vectores no virales poseen generalmente todas las cargas policatiónicas . Entre los vectores sintéticos desarrollados, los polímeros catiónicos de tipo polilisina y DEAE dextrán o aun los lípidos catiónicos o lipofectantes son los mas ventajosos. Poseen la propiedad de condensar el ADN y de promover su asociación con la membrana celular. Recientemente, fue desarrollado el concepto de la transfección dirigida, mediado por un receptor. Esta técnica pone a beneficio el principio de condensar el ADN, gracias a un polímero catiónico, todo dirigido a la fijación del a la membrana con la ayuda de un acoplador químico entre el polímero catiónico y el ligando de un receptor membranal, presente en la superficie del tipo celular que se quiere injertar. Las direcciones del receptor de la transferrina, de la insulina o del receptor de las asialoglicoproteínas de hepatocitos así fueron descritas. De todas formas, los vectores sintéticos propuestos ahora están aun lejos de ser tan activos como los vectores virales. Esto podría ser la consecuencia de una condensación insuficiente del ADN a transfectar y/o de dificultades encontradas por el ADN transfectado para salir del endosoma y penetrar en el núcleo celular. En fin, otros inconvenientes están directamente asociados a la naturaleza de los polímeros catiónicos de los lipofectantes utilizados. La presente invención tiene precisamente por objetivo proponer una solución ventajosa a estos problemas. Precisamente, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica útil para la tranfección de un ácido nucleico caracterizado porque contiene además de dicho ácido nucleico, al menos un agente de transfección un compuesto que interviene al nivel de la condensación de dicho ácido nucleico, dicho compuesto se derivado todo o parte de él una histona, de una nucleolina, de una protamina y/o de uno de sus derivados . De manera inesperada, la solicitante demostró que la presencia de tal compuesto, dentro de una composición transfectante a base de un agente de transfección clásica, permitía disminuir considerablemente la cantidad de este agente, con las consecuencias benéficas que resultan en el plano toxicológico, sin producir un perjuicio cualquiera a la actividad transfectante de dicha composición. Al contrario, esta posee ventajosamente un nivel de transfección superior. En el sentido de la invención, un compuesto que interviene al nivel de la condensación del ácido nucleico, cubre todo compuesto compactante, directamente o no, el ácido nucleico. Precisamente, este compuesto puede ya actuar directamente al nivel del ácido nucleico a transfectar o ya intervenir al nivel de un compuesto anexo que está directamente implicado en la condensación de este ácido nucleico. Según una forma de realización particular de la invención, el compuesto que interviene al nivel de la condensación del ácido nucleico está constituido, en todo o parte, de motivos peptídicos (KTPKKAKKP) SED ID N°l y/o (ATPAKKAA) SED ID N°2 o uno de sus derivados, el número de motivos puede variar entre 2 y 10. Dentro de la estructura del compuesto de acuerdo a la invención, estos motivos pueden estar repetidos de manera continua o no. Es así que pueden ser separados por las ligaduras de naturaleza bioquímica, por ejemplo uno o varios aminoácidos, o de naturaleza química.

La elección particular a título de compuesto según la invención, de un péptido o pseudopéptido que posee una mayoría de aminoácidos de carácter básico como la lisina, la histidina o la arginina es particularmente ventajoso dentro del marco de la presente invención. Este compuesto puede además poseer una estructura conformacional hoja b. Los aminoácidos básicos son en efecto específicamente implicados en las ligaduras péptido-ácido nucleico. Participan en el establecimiento de las ligaduras de puente de hidrógeno entre las dos entidades que favorecen así la condensación del ácido nucleico. En cuanto a la estructura hoja ß, se caracteriza por una mayor accesibilidad de la mayoría de los enlaces, carbonilos y de los átomos de hidrógeno que parte de sus caracteres aceptor y donador respectivos privilegian igualmente la formación de enlaces con el ácido nucleico a compactar. Se trata preferencialmente, de toda o parte de una histona, de una nucleolina, de la protamina y/o de sus derivados . Las histonas y las protaminas son las proteínas catiónicas que compactan naturalmente el ADN. Así son responsables in vivo de la condensación del ADN no transcrito, del ADN de ciertos virus. A título de histonas que pueden ser empleadas dentro del marco de la presente invención, se puede citar particularmente las histonas Hl, H2a, H3 y H4. En lo que respecta a la nucleolina, se trata de una proteína nucleolar qµe parece poseer un efecto sinérgico en presencia de la histona Hl cuando esta hace la condensación del ADN. Dentro del marco de la presente invención, el compuesto puede ser ventajosamente representado por una secuencia peptídica derivada de la parte N terminal de la nucleolina, y precisamente correspondiente a la secuencia (KTPKKAKKP)2 (COOH) . (SED ID N°4) A título ilustrativo de esta familia de compuestos según la invención se puede igualmente citar los siguientes oligopéptidos : ATPKKSAKKTPKKAKKP(COOH) . (SED ID N°5) y KKAKSPKKAKAAKPKKAPKSPAKAKA(COOH) . (SED ID N°6) . En lo que concierne particularmente las secuencias que derivan de la protamina pueden ser igualmente empleadas dentro del cuadro de la presente invención, se puede en particular proponer los siguientes oligopéptidos: SRSRYYRQRQRSRRRRRR(COOH) . (SED ID N°7) y RRRLHRIHRRQHRSCRRRKRR(COOH) . (SED ID N°8) . En el sentido de la presente invención, el término derivado designa todo péptido, pseudopéptido (péptido que incorpora elementos no bioquímicos) o proteína diferente de la proteína o péptido considerado, obtenido por una o varias modificaciones de naturaleza genética y/o química. Por modificación de naturaleza genética y/o química, se puede entender toda mutación, sustitución, corte, adición y/o modificación de uno o varios residuos de la proteína considerada. Precisamente, por modificación química, se entiende toda modificación del péptido o proteína por reacción química o por inserción química de molécula (s) bioquímica (s) o no, sobre un número cualquiera de residuos de la proteína. Por modificación genética, se entiende toda secuencia peptídica donde el ADN híbrido con estas secuencias o fragmentos de estas y donde el producto posee la actividad indicada. Tales derivados pueden ser generados en los diferentes objetivos, tales como en particular el de aumentar la afinidad del polipéptido correspondiente para su(s) ligando(s), el de mejorar sus niveles de producción, el de aumentar su resistencia a las proteasas, el de aumentar y/o modificar su actividad, o el de conferir nuevas propiedades farmacocinéticas y/o biológicas. Entre los derivados que resultan de una adición, se puede citar por ejemplo las secuencias peptídicas quimeras que incluyen una parte heteróloga suplementaria ligada a una extremidad. El término derivado comprende igualmente las secuencias proteicas homologas a la secuencia considerada, salidas de otras fuentes celulares y especialmente de células de origen humano, o de otros organismos, y que poseen una actividad del mismo tipo. Tales secuencias homologas pueden ser obtenidas por experimentos de hibridación del ADN correspondiente. Las hibridaciones pueden ser realizadas a partir de bancos de ácidos nucleicos, utilizando como sonda la secuencia nativa o un fragmento de ésta, dentro de las condiciones de estringencia convencionales (Maniatis et al.), (Cf técnicas generales de biología molecular) , o, de preferencia, dentro de las condiciones de estringencia elevadas . En una forma de realización particularmente ventajosa, las composiciones de la presente invención comprenden además un elemento de dirección que permite orientar la transferencia del ácido nucleico. Este elemento de dirección puede ser un elemento de dirección extracelular, que permite orientar la transferencia del ácido nucleico hacia ciertos tipos celulares o ciertos tejidos deseados (células tumorales, células hepáticas, células hematopoiéticas, etc) . Puede igualmente tratarse de un elemento de dirección intracelular, que permite orientar la transferencia del ácido nucleico hacia ciertos compartimientos celulares privilegiados (mitocondrias, núcleo, etc) . Preferencialmente, el elemento de dirección está ligado, de manera covalente o no covalente, al compuesto de acuerdo a la invención. El elemento de dirección puede igualmente estar ligado al ácido nucleico. De acuerdo a una forma privilegiada de la invención, dicho compuesto está asociado, vía una parte heteróloga suplementaria ligada a una de sus extremidades. Tales partes pueden ser en particular péptidos de tipo fusógeno para favorecer la transfección celular es decir privilegiar el paso de la composición transfectante o de sus diversos elementos a través de las membranas, ayudar a la salida de los endosomas o aún para atravesar la membrana nuclear. Puede tratarse igualmente de un ligando de receptor celular presente en la superficie del tipo celular como por ejemplo un azúcar, la transferrina, la insulina o la proteína asialo-orosomucoide. Se puede tratar igualmente de un ligando de tipo intracelular como una secuencia señal de locación nuclear, nls, privilegia la acumulación del ADN transfectado al seno del núcleo. Entre los elementos de dirección utilizables dentro del marco de la invención, se puede citar los azúcares, los péptidos, las hormonas, las vitaminas, las citocinas, los oligonucleótidos, los lípidos o las secuencias o fracciones provenientes de estos elementos y que permiten una unión específica con los receptores correspondientes . Preferencialmente, se trata de azúcares y/o péptidos tales como anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, ligandos de receptores celulares o fragmentos de estos, receptores o fragmentos de receptores, etc. En particular, puede tratarse de ligandos de receptores de factores de crecimiento, de receptores de citocinas, de receptores de lectinas celulares o de receptores de proteínas de adhesión. Se puede citar igualmente el receptor de la transferrina, los HDL y los LDL. El elemento de dirección puede ser igualmente un azúcar que permite dirigir las lectinas tales como los receptores asialoglicoprotéicos, o aun un fragmento Fab de anticuerpos que permite dirigir el receptor del fragmento Fc de las inmunoglobulinas . A título ilustrativo de este tipo de asociación, se puede emplear especialmente dentro del cuadro de la presente invención, un compuesto de tipo H^nls y preferencialmente un péptido que posee la secuencia PKKKRKV-bAla- (KTPKAKKP)2(COOH) (SED ID N°9). Ventajosamente, el compuesto de acuerdo a la invención y particularmente todo derivado de histona, de proteamina o de nucleolina puede ser además poliglicosilado, sulfonado y/o fosforilado y/o insertado a los azúcares complejos o a un compuesto lipófilo como por ejemplo una cadena policarbonada o un derivado del colesterol . La composición de acuerdo a la invención puede por supuesto contener varios compuestos que compactan el ácido nucleico, de naturaleza diferente. Así se puede asociar un compuesto de tipo histona a un compuesto de tipo nucleolina.

La composición de acuerdo a la invención se presenta en cantidad suficiente para compactar el ácido nucleico según la invención. Es así que la relación compuesto/ácido nucleico (expresada en peso) puede estar comprendida entre 1,0 y 10 y preferencialmente entre 0,3 y 3. En lo que respecta al agente de transfección presente en la composición según la invención, se escoge preferencialmente entre los polímeros catiónicos y los lipofectantes . De acuerdo a la invención, el polímero catiónico es de preferencia un compuesto de fórmula general I, r N-(CH2)n I R (I) en la que - R puede ser un átomo de hidrógeno o un grupo de fórmula - n es un número entero comprendido entre 2 y 10; - p y q son números enteros, se entiende que la suma p+q es tal que el peso molecular promedio del polímero está comprendido entre 100 y l07Da. Se entiende que, en la fórmula (I) el valor de n puede variar entre los diferentes motivos p. Así, la fórmula (I) reagrupa a la vez los homopolímeros y los heteropolímeros. Preferencialmente, en la fórmula (I) , n está comprendido entre 2 y 5. En particular, los polímeros de polietilén imina (PEÍ) y polipropilén imina (PPI) presentan propiedades totalmente ventajosas. Los. polímeros preferidos para el empleo de la presente invención aquellos en los que los pesos leculares están comprendidos entre 103 y 5.10ß. A título de ejemplo, se puede citar la polietilén imina de peso molecular medio de 50 000 Da (PEI50K) o la polietilén imina de peso molecular medio de 800 000 Da (PEI800K) . La PEI50K o la PEI800K son accesibles comercialmente. En cuanto a los otros polímeros representados por la fórmula general I, pueden ser preparados de acuerdo al procedimiento descrito en la solicitud de patente FR 94 08735. Para obtener un efecto óptimo de las composiciones de la invención, las proporciones respectivas del polímero y del ácido nucleico se determinan de preferencia de modo que la relación molar R = aminas del polímero / fosfatos del ácido nucleico este comprendida entre 0,5 y 50, preferencialmente entre 5 y 30. Todos los resultados particularmente ventajosos son obtenidos utilizando de 5 a 25 equivalentes de aminas de polímero por carga de ácido nucleico. En lo que respecta particularmente a los lipofectantes, se quiere cubrir en el sentido de la invención, bajo esta denominación, todo compuesto con carácter lipídico y ya propuesto a título de agente activo con respecto a la transfección celular de ácidos nucleicos. De manera general, se trata de moléculas anfifilas que comprenden al menos una región lipófila asociada a una región hidrófila. A título representativo de la primera familia de compuestos, se puede proponer especialmente los lípidos susceptibles de formar los liposomas como los POPC, fosfatidilserina, fosfatidilcolina, colesterol , maleimidofenilbutirilfosfatidiletanolamina, lactosilceramida en presencia o no de polietilén glicol para formar los liposomas furtivos o, con o sin anticuerpos o ligandos, para formar los inmunoliposomas o los liposomas blancos . De acuerdo a una forma particular de la invención, el agente lipídico empleado posee una región catiónica. Esta región catiónica, preferencialmente poliamina, cargada catiónicamente, es capaz de asociarse de manera reversible con el ácido nucleico, cargado negativamente. Esta interacción ompacta fuertemente al ácido nucleico. La región lipófila expresa esta interacción iónica inaccesible en el medio acuoso externo, recubriendo la partícula nucleolipídica formada de una película lipídica. Se dice así que un lípido catiónico cargado positivamente, el cloruro de N- [1- (2, 3-dioleiloxi) propil] -N,N,N-trimetilamonio (DOTMA) , interfiere, bajo la forma de liposomas o de pequeñas vesículas, espontáneamente con el ADN, que está cargado negativamente, para formar los complejos lípidos-ADN, capaces de fusionar con las membranas celulares, y permitir así la entrega intracelular del ADN. Después del DOTMA, otros lípidos catiónicos se proponen bajo este modelo de estructura: grupo lipófilo asociado a un agrupamiento amino vía una ramificación denominada "espaciador". Entre estos, se pueden citar particularmente los que contienen a título de grupo lipófilo dos ácidos grasos o un derivado del colesterol, y que portan, además, si llega el caso, a título de grupo amino, una agrupación de amonio cuaternario. Los DOTAP, DOBT o el ChOTB pueden ser citados en particular a título representativos de esta categoría de lípidos catiónicos. Otros compuestos, como los DOSC y ChOSC, se caracterizan por la presencia de un grupo colina en lugar del grupo de amonio cuaternario. Otra categoría de lípidos catiónicos, las lipopoliaminas, son igualmente descritas. En este tipo de compuestos, el grupo catiónico está representado por el radical L-5carboxiespermina que contiene 4 grupos de amonio, dos primarios y dos secundarios . Los DOGS y DPPES especialmente forman parte de este tipo. Estas lipopoliaminas son todas particularmente eficaces para la transfección de células endocrinas primarias . Ventajosamente, los lipofectantes convenientes a la invención pueden igualmente ser escogidos entre las lipopoliaminas donde la región poliamina responde a la fórmula general (II) H2-N( - (CH) m-NH-) n-H ( II) en la que m es un número entero superior o igual a 1 y n es un número entero superior o igual a 1, m puede variar entre los diferentes grupos de carbono comprendidos entre dos aminas. Preferencialmente, m está comprendido entre 2 y 6 inclusive y n está comprendido entre 1 y 5 inclusive. De nuevo preferencialmente, la región poliamina está representada por la espermina, la termina o uno de sus análogos que hayan conservado las propiedades de unión al ADN. En cuanto a la región lipófila, es representada por al menos una cadena hidrocarbonada, saturada o no, de colesterol, un lípido natural o un lípido sintético capaz de formar las fases lamelares o hexagonales, ligado de manera covalente a la región hidrófila. La solicitud de patente EP 394 lll describe otras lipopoliaminas de fórmula general III susceptibles de ser empleadas dentro del marco de la presente invención.

H2N-(-(CH)m-NH-)n-H R en la que R representa esencialmente un radical de fórmula general (R^,) N-CO-CH-NH-CO- . A título representativo de estas lipopoliaminas se puede citar particularmente la dioctaclecilamidoglicil espermina (DOGS) y la 5 -carboxiespermilamida de la palmitoilfosfatidiletanolamina (DPPES) . Las lipopoliaminas descritas en la solicitud de patente FR 94 14596 pueden igualmente ser utilizadas con ventaja a título de agente de transfección de acuerdo a la invención. Estas son representadas por la fórmula general IV de arriba en la que R representa con - X y X' representan, independientemente uno del otro, un átomo de oxígeno, un grupo metileno -(CHj),- con q igual a 0 , 1 , 2 o 3 , o un grupo amino -NH- o -NR'- con R' que representa un grupo alquilo de CL a Ct, _ y y yi representan independientemente uno del otro un grupo metileno, un grupo carbonilo o un grupo C=S, - R3, R, yR¡ representan independientemente uno del otro un átomo de hidrógeno o un radical alquilo, sustituido o no, de Cj. a C«, pudiendo variar p entre 0 y 5, - R6 representa un derivado del colesterol o un grupo alquilo con Rj. y R2 representando independientemente uno del otro un radical alifático, saturado o no, lineal o ramificado de C12 a C22. A título representativo de estas lipopoliaminas se puede citar particularmente la (Dioctadecil-carbamoilmetoxi) -acetato de 1, 3-bis- (3-amino-propi] ¿mino) -2 propil denominada como lipopoliamina A. Las solicitudes de patente EP 394 111 y FR 94 145 96 describen igualmente un procedimiento útil para la preparación de las lipopoliaminas correspondientes. En fin recientemente, nuevas lipopoliaminas, valoradas igualmente dentro del marco de la invención, han sido descritas en la solicitud de patente FR 95/134 90. A título representativo de estas lipopoliaminas se puede mencionar particularmente las siguientes: - lipopoliamina B: {H2N(CH2)3}2N(CH2)4N{ (CH2)3NH2} (CH2 ) 3NHCH2COGlyN [ (CH2 ) 17-CH3] 2 (RP120525) - lipopoliamina C: H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGlyN[ (CH2)lß]2 (RP120535) - lipopoliamina D: H2N (CH2 ) 3NH (CH2 ) 4NH (CH2 ) 3NHCH2COArgN [ (CH2 ) 18] (RP120531) De manera particularmente ventajosa, se puede utilizar dentro del marco de la invención la dioctadecilamidoglicil espermina (DOGS) la 5-carboxiespermilamida de la palmitoilfosfatidiletanolamina (DPPES) , el (Dioctadecil-carbamoilmetoxi ) -acetato de 2 - 5 -bis- ( 3 -araino-propilamino) pentilo, el (Dioctadecil-carbamoilmetoxi) -acetato de 1, 3-bis- (3-amino-propilamino) -2 propilo, la {H2N(CH2)3}2N(CH2)4N{ (CH2) 3NH2 } (CH2 ) 3NHCH2COGlyN [ (CH2) 17-CH3] 2 • ,1a H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGlyN[ (CH2) lß] 2 o la H2N (CH2 ) 3NH (CH2 ) 4NH (CH2 ) 3NHCH2COArgN [ (CH2 ) lß] . Para obtener un efecto óptimo de las composiciones de la invención, las proporciones respectivas de la poliamina y del ácido nucleico son de preferencia determinadas de modo que la relación R cargas positivas del agente de transfección/ cargas negativas del ácido nucleico está comprendida entre 0,1 y 10 y preferencialmente entre 0,5 y 6. La presencia de un compuesto de acuerdo a la invención en el seno de una composición transfectante permite con ventaja disminuir considerablemente la cantidad de agente de transfección. Seguido de una toxicidad netamente disminuida que se expresa posible en adelante por ejemplo la transfección de células sensibles al origen del agente de transfección como por ejemplo las células hematopoiéticas con las lipopoliaminas. En fin, como se demuestra en los ejemplos posteriores, el poder transfectante de las composiciones de acuerdo a la invención es superior al obtenido con las composiciones transfectantes clásicas . En las composiciones de la presente invención, el ácido nucleico puede ser tanto un ácido desoxirribonucleico como un ácido ribonucleico. Se puede tratar de secuencias de origen natural o artificial, y en particular de ADN genómico, de ADNc, de ARNm, de ARNt, de ARNr, de secuencias híbridas o de secuencias sintéticas o semi-sintéticas. Estos ácidos nucleicos pueden ser de origen humano, animal, vegeta!, bacteriano, viral, etc. Pueden obtenerse por toda técnica conocida por el hombre de ciencia, y especialmente por cribado de bancos, por síntesis química o aún por los métodos mixtos que incluyen la modificación química o enzimática de secuencias obtenidas por cribado de bancos. Pueden además ser incorporados en vectores, tales como vectores plasmídicos.

Particularmente en lo que concierne a los ácidos nucleicos, pueden ser de simple o doble hebra. Estos ácidos desoxirribonucleicos pueden codificar para genes terapéuticos, secuencias reguladoras de la transcripción o de la replicación, secuencias antisentido, regiones de unión a otros compuestos celulares, etc. En el sentido de la invención, se entiende por gen terapéutico en particular todo gen que codifica para un producto proteico que tenga un efecto terapéutico. El producto proteico así codificado puede ser una proteína, un péptido, etc. Este producto proteico puede ser homólogo frente a la célula blanco (es decir un producto que normalmente es expresado dentro de la célula blanco cuando ésta no presenta ninguna patología) . En este caso, la expresión de una proteína permite por ejemplo paliar una expresión insuficiente en la célula o la expresión de una proteína inactiva o débilmente activa en razón de una modificación, o aún de subexpresar dicha proteína. El gen terapéutico puede así codificar para un mutante de una proteína celular, que tenga una estabilidad engañosa, una actividad modificada, etc. El producto proteico puede igualmente ser heterólogo frente a la célula blanco. En este caso una proteína expresada puede por ejemplo completar o aportar una actividad deficiente en la célula, permitiéndole luchar contra una patología, o estimular una respuesta inmunológica. Entre los productos terapéuticos en el sentido de la presente invención, se puede citar particularmente las enzimas, los derivados sanguíneos, las hormonas, las linfocinas: interleucinas, interferones, TNF, etc (FR 9203120) , los factores de crecimiento los neurotransmisores o sus precursores o enzimas de síntesis, los factores tróficos: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, VEGF, NT3 , NT5, HARP/pleiotrofina, los genes correspondientes a las proteínas implicadas en el metabolismo de lípidos, de tipo apolipoproteína escogida entre las apolipoproteínas A-I, A-II, A-IV, B, C-I, C-II, C-III, D, E, F, G, H, Jyapo(a), las enzimas del metabolismo como por ejemplo la lipoprobeína lipasa, la lipasa hepática, la lecitina colesterol aciltransferasa, la 7 alfa colesterol hidroxilasa, la fosfatídica ácido fosfatasa, o aún las proteínas de transferencia de lípidos como la proteína de transferencia de esteres de colesterol y la proteína de transferencia de fosfolí idos, una proteína de enlace de los HDL o aún un receptor escogido por ejemplo entre los receptores LDL, receptores de quilomicroñes-remanentes y los receptores útiles, la distrofina o una minidistrofina (FR 9111947) , la proteína GAX, la proteína CFTR asociada a la mucoviscidosis, los genes supresores de tumores: p53, Rb, RaplA, DCC, -rev, etc (FR 93 04745) , los ^nes codificantes para los factores implicados en la coagulación: Factores VII, VIII, IX, los genes que intervienen en la reparación del ADN, los genes suicidas (timidina cinasa, citosina desaminasa) , etc. El gen terapéutico puede ser igualmente un gen o una secuencia antisentido, en el que la expresión dentro de la célula blanco permite controlar la expresión de genes o la expresión de ARNm celulares. Tales secuencias pueden, por ejemplo, ser transcritas dentro de la célula blanco en ARN complementarios de ARNm celulares y bloquear así su traducción en proteína, de acuerdo a la técnica descrita en la patente EP 140308. Los antisentidos comprenden igualmente las secuencias codificantes para ribozimas, que son capaces de destruir selectivamente los ARN blancos (EP 321 201) . Como se indicó antes, el ácido nucleico puede igualmente contener uno o varios genes codificantes para un péptido antigénico, capaz de generar en el hombre o el animal una respuesta inmunológica. En esta forma particular de empleo, la invención permite así pues la realización ya sea de vacunas o ya sea de tratamientos inmunoterapéuticos aplicados al hombre o al animal, en particular contra los microorganismos, los virus o los cánceres. Puede tratarse especialmente de péptidos antigénicos específicos del virus de Epstein Barr, del virus HIV, del virus de la hepatitis B (EP 185573) , del virus de la pseudo-rabia, o aún específicos de tumores (EP 259 212) . Preferencialmente, el ácido nucleico comprende igualmente las secuencias que permiten la expresión del gen terapéutico y/o del gen codificante para el péptido antigénico dentro de la célula o del órgano deseado. Puede tratarse de secuencias que son naturalmente responsables de la expresión del gen considerado cuando estas secuencias son susceptibles de funcionar en la célula infectada. Puede igualmente tratarse de secuencias de origen diferente (responsables de la expresión de otras proteínas, o incluso sintéticas) . Particularmente, puede tratarse de secuencias promotoras de genes eucariotas o virales. Por ejemplo, puede tratarse de secuencias promotoras provenientes del genoma de la célula que se desea infectar. También puede tratarse de secuencias promotoras provenientes del genoma de un virus. Al respecto, se puede citar por ejemplo los promotores de los genes E1A, MLP, CMV, RSV, etc. Además, estas secuencias de expresión pueden ser modificadas por adición de secuencias de activación, de regulación, etc. Por otro lado, el ácido nucleico puede contener igualmente, en particular un gen terapéutico mas alto que, una secuencia señal dirigida al producto terapéutico sintetizado en las vías de secreción de la célula blanco. Esta secuencia señal puede ser la secuencia señal natural del producto terapéutico, pero puede tratarse igualmente de toda otra señal funcional, o de una secuencia señal artificial.

Preferencialmente, las composiciones de la invención contienen además, uno o varios lípidos neutros. Tales composiciones son particularmente ventajosas, en particular cuando la relación R es débil. La solicitante ha mostrado en efecto que la adición de un lípido neutro permite mejorar la formación de partículas nucleolipídicas y, de manera sorprendente, favorecer la penetración de la partícula en la célula desestabilizando su membrana. Preferencialmente, los lípidos neutros utilizados dentro del marco de la presente invención son los lípidos a 2 cadenas grasas . De manera particularmente ventajosa, se utilizan los lípidos naturales o sintéticos, z itteriónicos o desprovistos de carga iónica en las condiciones fisiológicas. Pueden ser escogidos particularmente entre la dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE) , la oleoil-palmitoilfos-fatidiletanolamina (POPE) , la di-estearoil, -palmitoil, -miristoil fosfatidiletanolamina así como sus derivados N-metilados 1 a 3 veces; los fosfatidilgliceroles, los diacilgliceroles, los glicosildiacilgliceroles, los cerebrósidos (tales como en particular los galactocerebrósidos) , los esfingolípidos (tales como particularmente las esfingomielinas) o aún los asialogangliósidos (en especial tales como los asialoGMl y GM2) . Estos diferentes lípidos pueden ser obtenidos ya sea por síntesis, ya sea por extracción a partir de órganos (por ejemplo: el cerebro) o de huevos, por las técnicas clásicas bien conocidas por los científicos. En particular, la extracción de lípidos naturales puede ser realizada por medio de solventes orgánicos (ver igualmente Lehninger, Biochemistry) . Preferencialmente, las composiciones de la invención, emplean a título de agente de transfección un lipofectante, contiene de 0,1 a 20 equivalentes de lípido neutro por un equivalente de lipopoliamina, y, preferencialmente, de l a 5. En el caso donde el agente de transfección es un polímero catiónico, las composiciones de la composición contienen, además del polímero catiónico en las relaciones citadas antes, de 0,1 a 20 equivalentes molares de lípido neutro por un equivalente molar de fosfato del ácido nucleico, y, preferencialmente, de 1 a 5. Las composiciones de acuerdo a la invención pueden ser formuladas en vista de administraciones por vía tópica, cutánea, oral, rectal, vaginal, parenteral, intranasal, intravenosa, intramuscular, sub-cutánea, intraocular, transdérmica, etc... De preferencia, las composiciones farmacéuticas de la invención contienen un vehículo farmacéuticamente aceptable para una formulación inyectable, en especial para una inyección directa al nivel del órgano deseado, o para una administración por vía tópica (en piel y/o mucosa) . Puede tratarse en particular de soluciones estériles, isotónicas, o de composiciones secas, en particular liofilizadas, que, por adición según el caso de agua esterilizada o de suero fisiológico, permiten la constitución de solutos inyectables. Las dosis de ácido nucleico utilizadas para la inyección así como el número de administraciones pueden ser adaptados en función de diferentes parámetros, y particularmente del modo de administración utilizado, de la patología concerniente, del gen a expresar, o aún de la duración del tratamiento investigado. Esta,s pueden ser ventajosamente utilizadas para transfectar una gran variedad de tipo celular como por ejemplo las células hematopoiéticas, los linfocitos, los hepatocitos, las células endoteliales, las células de melonomae, de carcinomas y de sarcomas, las células musculares lisas, las neuronas y los astrocitos. La presente invención suministra así un método particularmente ventajoso para el tratamiento de enfermedades utilizando la transfección in vitro, ex vivo o in vivo de un ácido nucleico apto para corregir dicha enfermedad en asociación con un agente de transfección tipo polímero catiónico o lipofectante, y un compuesto como el definido antes. Particularmente, este método es aplicable a las enfermedades resultantes de una deficiencia en un producto proteico o nucleico y el ácido nucleico administrado codifica para dicho producto proteico o contiene la secuencia correspondiente a dicho producto nucleico. Las composiciones de acuerdo a la invención son particularmente por su biodisponibilidad y su alto nivel de transfección. La presente invención se refiere igualmente a toda utilización de un compuesto constituido todo o parte, de motivos peptídicos (KTPKKAKKP) y/o (ATPAKKAA) con el número de estos motivos que puede variar entre 2 y 10, para, cuando son acoplados a un ligando receptor celular, un anticuerpo o derivado de anticuerpo, dirige un ácido nucleico hacia las células que expresan los receptores o anti-genes correspondientes. En esta perspectiva, un ligando, anticuerpo o derivado de anticuerpo potencial es acoplado a dicho compuesto y se aprecia el poder de transfección de esta molécula quimera comparativamente al compuesto solo. La presente invención cubre igualmente toda utilización de un oligopéptido seleccionado entre: (ATPAKKAA), (COOH) , (KTPKKAKKP) 2 (COOH) , ATPKKSAKKTPKKAKKP(COOH) , KKAKSPKKAKAAKPKKAPKSPAKAKA(COOH) , SRSRYYRQRQRSRRRRRR (COOH) y RRRLHRIHRRQHRSCRRRKRR(COOH) . para efectuar la transferencia in vitro, ex vivo y/o in vivo de al menos un ácido nucleico, dicho oligonucleótido está asociado o no a un elemento de dirección. La presente invención será completamente descrita con la ayuda de los siguientes ejemplos, que deben ser considerados como ilustrativos y no limitativos.

Material y Métodos: 1. Plásmidos utilizados para la transferencia de genes in vivo Las construcciones utilizadas para poner en evidencia la actividad de las composiciones de la invención son de los plásmidos que contienen el gen codificante para la luciferasa (Luc) Se trata en particular de plásmidos pCMV luc, pXL 2621, pXL 2622, que todos contienen el gen codificante para la luciferasa (sacado del vector pGL2, Promega) en aval del promotor del citomegalovirus (CMV) extraído de pCDNA3 (Invitrogen) . pCMV luc y pXL2622 derivan de un vector pGL2, pXL 2621 de un vector pGL2 control, y en todos estos vectores el promotor SV40 ha sido reemplazado por el promotor CMV. De manera general los plásmidos son obtenidos por la técnica de precipitación PEG (Ausubel) , y almacenado en Tris lOmM EDTA lmM pH 8 a 4 °C a una concentración del medio de 10 µg de ADN por µl . 2. Compuestos utilizados de acuerdo a la invención: H KTPKKAKKPKTPKKAKKP (COOH) 18AA NATPAKKAAATPAKKAA(COOH) 16AA nlSJ -PKKKRKV-bAla-KTPKKAKKPKTKKAKKPÍCOOH) 26 AA £R1_RRRLHRIHRRQHRSCRRRKRR 21AA £E2_SRSRYYRQRQRSRRRRRR Son preparados como sigue: 2 , 1 N;ATPAKKA TPAKKAA ( QQH) Este oligopéptido ha sido sintetizado bajo forma de sal de ácido trifluoroacético por medio de un sintetizador de péptidos Applied Biosystem 431A, sobre una resina HMP (Applied Biosystem) y de acuerdo a una estrategia FMOC.

Después de la síntesis, el péptido fue liberado de la resina por tratamiento 90 minutos en presencia de una solución agua/TFA 1/19. Después de la filtración, la solución se concentró en un evaporador rotativo, enseguida el péptido se precipito 2 veces por adición de éter tertiobutilmetílico a partir de la solución en el TFA. El precipitado final es lavado por el éter tertiobutilmetílico y después secado. El péptido es solubilizado en 5 mi de agua, filtrado y purificado por HPLC fase inversa en columna C18100 A (Biorad RSL) . El péptido es purificado por la adición de un gradiente de 0 a 25 % de acetonitrilo, 0,07 % TFAen el agua 0,07 % TFA. La pureza del péptido obtenido es superior al 95 % y su solubilidad en el agua de 100 mg/ml. 2.2 nls; PKKKRKV Este oligopéptido ha sido sintetizado bajo forma de sal de ácido trifluoroacético de acuerdo al protocolo descrito arriba usando para el corte una solución agua/TFA/fenol/etanoditiol/tioanisol 2/40/3/1/2 (v/v) . La pureza del péptido obtenido es superior a 95 % y su solubilidad en agua de 100 mg/ml a pH 2,1. 2.3 H: KTPKKAKKPKTKKAKKP(COOH) y nis-H: PKKKRKV-bAla-KTPKKAKKPKTKKAKKP (COOH) Estos oligopéptidos son sintetizados bajo forma de sal de ácido trifluoroacético de acuerdo al protocolo descrito arriba. Para hacer esto, se divide la resina en dos lotes. Un primer lote destinado a la síntesis de H es tratado para el corte con una solución TFA/fenol/etanoditiol/tioanisol/agua 40/3/1/2/2 (v/v) . La pureza del péptido obtenido es superior a 90 % y su solubilidad en el agua de 10 mg/ml a pH 2,1. En el segundo lote de resina es proseguida de forma de obtener nls-bAla-H. La solución de corte usada es idéntica a la precedente. La pureza del péptido obtenido es superior a 95 % y su solubilidad en el agua de 10 mg/ml. 2.4. PR1 SRSRYYRORORSRRRRRR y PR2 RRRLHRIHRROHRSCRRRKRR Estos oligopéptidos son reunidos en varias etapas, en síntesis fase sólida de acuerdo a la técnica BocBenzyle. La resina de partida es una resina Boc-L-Arg(Tos) Pam (0,48 meq/g) . El procedimiento de desprotección y acoplamiento es el siguiente: l.- 55 % TFA dentro del diclorometano (DCM) 1 x 2 mn 2.- 55 % TFA dentro del diclorometano 1 x 30 mn 3. - DCM 2 x 1 mn 4.- DMF 3 x 1 mn . - Acoplamiento 6. - DMF 2 x 1 mn 7.- DCM 2 x 1 mn Para cada etapa, se utiliza 10 mi de solvente por gramo de resina de péptido empleado. El acoplamiento de todos los aminoácidos (en triple exceso) es efectuado en el DMF en presencia de BOP, Hobt y DIEA. Cada etapa de acoplamiento es controlada por la prueba de nihidrida. El péptido final es recuperado de la resina y enteramente desprotegido con ácido fluorhídrico líquido. Se utiliza 10 mi de HF por gramo de péptido resina a 0°C durante 45 minutos en presencia de para-cresol y de etanoditiol. Después de la evaporación del ácido fluorhídrico la mezcla reaccionante bruta es lavada con el éter, disuelto en el ácido trifluoroacético, precipitado al éter y secado. 3. Agentes lipofectantes empleados Lipopoliamina A: (Dioctadecil-carbamoilmetoxi) -acetato dl,3-bis- (3-amino-propilamino) -2 propilo (RP115335) Lipopoliamina B: {H2N (CH2 ) j }2N (CH2 ) 4N{ (CH2 ) 3NH2 } (CH2 ) 3NHCH2COGlyN [ (CH2 ) l7-CH3] 2 (RP120525) Lipopoliamina C: H2N (CH2 ) 3NH (CH2) 4NH (CH2) 3NHCH2COGlyN [ (CH2) ?a] 2 (RP120535) Lipopoliamina D: H2N(CH2) 3NH (CH2 ) 4NH (CH2 ) 3NHCH2COArgN [ (CH2 ) lß] 2 (RP120531) EJEMPLO 1: Transferencia de ácido nucleico in vitro en las células NIH 3T3 Este ejemplo describe la transferencia de ácidos nucleicos in vitro (en cultivos celulares) por medio de una composición de acuerdo a la invención que contiene el ácido nucleico, un compuesto de acuerdo a la invención, y una lipopoliamina en diferentes condiciones de pH y tampón. 1. Se prepara una mezcla de 10 µl compuesta como sigue: - 0,5 µg de ADN plasmídico pCMV-luc, 0,25 µg de un compuesto de acuerdo a la invención, de una solución tampón tal como se identifica - del dioctadecilamidoglicil espermina (DOGS) 40mM en las relaciones de cargas X tal como se indica en cada ensayo. 2. 5.104 células de cepas NIH3T3 son incubadas con la mezcla precedente a 37°C, bajo una atmósfera de C02 al 5 % durante 4 horas . Las células son enseguida lavadas y vueltas a poner en cultivo durante 48 horas en un medio que contiene 10 % de suero (DMEM 10 % SVF) . El tapiz celular es lisado enseguida en 50 µl de tampón lisis (Promega) , recuperado y después centrifugado a 20 OOOg durante 5 minutos . La actividad luciferasa es medida en 4 µl de sobrenadante añadiendo 20 µl de sustrato (Promega) . La lectura se hace en luminómetro LKB acumulando los RLU (unidades relativas de luz) durante 20 segundo. Los resultados se presentan en las tablas 1 y 2 mas adelante. 3. Compactación en NaCl 15QmM, HEPES' C N-(2-hidroxietil)piperazina-N' - (ácido2-etil-sulfónica) lOmM a pH .LJ.

TABLA 1 4. Compactación en D-slucosa 5 %. NaCl 150mM. con HEPES lOmM (pH de la solución de compactación: 7.2) TABLA 2 En conjunto los ensayos, se observan los resultados superiores cuando la composición compactante se asocia a DOGS un compuesto de acuerdo a la invención. Se prueba la posibilidad de disminuir de manera importante la cantidad en DOGS sin perjudicar la capacidad de transfección de la composición correspondiente.

EJEMPLO 2: Pruebas de transfección en presencia de un lípido neutro Se prepara una mezcla de 10 µl compuesta como sigue: - 0,5 µg de ADN plasmídico pCMV-luc, 0,25 µg de un compuesto de acuerdo a la intervención, en una solución tampón de NaCl 150mM, tampón de fosfato lOmM pH 7,4, - 40mM de dioctadecilamidoglicil espermina (DOGS) en las relaciones de cargas X tal como se indican en cada uno de los ensayos en presencia de dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE) con DOGS/DOPE igual a 1/2. En este caso particular, una solución etanólica de DOGS a 40mM se mezcla con un volumen igual de una solución de dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE) a 80mM, preparada en una mezcla cloroformo etanol (1/5) . Así para un equivalente de DOGS la composición contiene dos equivalentes de DOPE. 10s células de cepas NIH3T3 se incuban con esta mezcla en las condiciones descritas en el ejemplo precedente. Al salir de la incubación, estas células son tratadas de acuerdo al protocolo de este mismo ejemplo. Los resultados se presentan en la tabla siguiente.

TABLA 3 Estos resultados confirman los observados en el ejemplo 1. En presencia de un compuesto básico de acuerdo a la invención y particularmente de H, es posible reducir a medias la cantidad de lipofectante.

EJEMPLO 3: Variación de la relación compuesta de acuerdo a la invención/ADN en el seno de una composición transfectante de acuerdo a la invención. 3.1: En presencia de una composición DOGS 1. Se prepara una mezcla de 10 µl compuesta de: - 0,75 µg de ADN plasmídico pCMV-luc, y de un compuesto de acuerdo a la invención en la relación indicada, en una solución tampón D-glucosa 5 %, NaCl 150mM, con HEPES lOmM (pH de la solución de compactación: 7,2), - dioctadecilamidoglicil espermina (DOGS) 40mM en una relación de carga 1,8X- 2.- 4.105 células de cepas NIH3T3 son incubadas con la mezcla precedente a 37°C, bajo una atmósfera de C02 a 5 % durante 4 horas . Las células son enseguida lavadas y vueltas a poner en cultivo durante 48 horas en un medio que contiene 10 % de suero (DMEM 10 % SVF) . El tapiz celular es enseguida lisado, 45 horas después la transfección, en 100 µl de tampón lisis (Promega) , recuperada y después centrifugada a 20000g durante 5 minutos. La actividad luciferasa es medida en 5 µl de sobrenadante adicionando 25 µl de sustrato (Promega) . La lectura se hace en luminómetro LKB acumulando las RLU (unidades relativas de luz) durante 20 segundos. Los resultados se muestran en la tabla 4 a continuación.

TABLA 4 3.2: En presencia de DOGS/DOPE 1.8X Se procede de acuerdo al protocolo descrito anteriormente en 3.1 pero usando a título de agente de transfección una solución de 40mM de dioctadecilamidoglicil espermina (DOGS) 1,8X en presencia de dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE) con DOGS/DOPE igual a 1/2, preparada de acuerdo a la forma de operación presentada en el ejemplo 2. La tabla 5 muestra los resultados observados.

TABLA 5 EJEMPLO 4: Variación de la relación compuesta de acuerdo a la invención/ADN en el seno de una composición transfectante de acuerdo a la invención utilizando un agente de transfección diferente al DOGS. 3,1; En presencia d. (Dioctadecil-carbamoilmetoxi) -acet to d_g 1.3 -bis - (3-amino-propilamino) - 2propil (lipopoliamina A) 1. Se prepara una mezcla de 10 µl compuesta de: - 0,55 µg de ADN plasmídico pCMV-luc, y de un compuesto de acuerdo a la invención en la relación indicada, en una solución tampón NaCl 150mM, - (Dioctadecil-carbamoilmetoxi) -acetato de l,3-bis-(3-amino-propilamino) -2propil en las relaciones de carga indicada . 2.- 5.10* células de cepas NIH3T3 son incubadas con la mezcla precedente a 37°C, bajo una atmósfera de C02 a 5 % durante 4 horas . Las células son enseguida lavadas y vueltas a poner en cultivo durante 48 horas en un medio que contiene 10 % de suero (DMEM 10 % SVF) . El tapiz celular es enseguida lisado, 45 horas después la transfección, en 100 µl de tampón lisis (Promega) , recuperada y después centrifugada a 20000g durante 5 minutos. La actividad luciferasa es medida en 10 µl de sobrenadante adicionando 50 µl de sustrato (Promega) . La lectura se hace en luminómetro Berthold lumat 9501" acumulando las RLU (unidades relativas de luz) durante 10 segundos . Los resultados se muestran en la tabla 6 a continuación.

TABLA 6 4.2: En presencia de PEÍ 800K 1. Se procede de acuerdo al protocolo descrito en 4.1 y en un medio igual, utilizando a título de lipofectante el PEÍ 800K. Los resultados se presentan en la tabla 7 a continuación.

TABLA 7 EJEMPLO 5 Transferencia in vivo dentro de células de músculos Los ensayos correspondientes son realizados empleando los materiales y protocolos siguientes : Modelo: La inyección se practica en el músculo tibial craneal de ratones C57 bl6 o OFl adultos (con edad de mas de 8 semanas) Protocolo: El ADN se diluye a 0,5 mg/ml en una solución que contendrá al final NaCl 150mM, D-Glucosa 5 % . En ciertos grupos, antes de la inyección, el péptido en solución a 1 mg/ml en agua es adicionado al ADN en cantidad suficiente para alcanzar las relaciones peso/peso indicadas. Una incubación de al menos 20 minutos a temperatura ambiente es realizada antes de proceder a la inyección. Determinación de los resultados: Dos días después de la inyección, el músculo es sacado, picado en 750 µl de tampón lisis (Promega E153A) , adicionado de aprotinina (Sigma) . El músculo sacado en un molino (Heidolf) , y 10 µl sirven para medir la actividad luciferasa. Esta medida es efectuada con un luminómetro Lumat 9501 (Berthold) , totalizando la emisión durante 10 segundos después de la adición de 50 µl de sustrato luciferasa (Promega) en los 10 µl de la muestra. El ruido de fondo medido antes de la adición de sustrato es restado a este total, y la actividad es expresada en RLU (unidades relativas de luz) totales (relacionadas a los 750 mi de tampón de lisis) . Para hacer esto, son inyectados 40 µl (20 µg de ADN) , en presencia de HEPES a pH 7,45mM final en la solución, después adicionar la lipopoliamina C(RPR 120 535) en una relación 0,01 nmol/µl de ADN 20 minutos antes de la inyección: TABLA 8 Estos resultados confirman el efecto benéfico de la asociación de una lipopoliamina a un agente compactante de acuerdo a la invención en la transfección in vivo dentro del músculo de un ácido nucleico.

EJEMPLO 6 Transferencia in vivo de composiciones reivindicadas en las células tumorales Los ensayos correspondientes son efectuados en los ratones C57/BL 6 adultos (>8 semanas) hembras que presentan tumores de tipo 3LL (carcinoma Lewis Lung) obtenido por paso de fragmentos de tumor de animal a animal, implantados bajo la piel al nivel del seno. En lo referente a las soluciones inyectadas son preparadas como sigue: primero el ADN es solubilizado en el tampón, entonces el péptido es eventualmente añadido, y después de 20 minutos se añade una solución de lípidos catiónicos de concentración fuerte (20 o 40 mM) . Después de agregar todos los productos, la mezcla contiene, además del ADN, el péptido y el lípido catiónico, NaCl 150 mM, D-Glucosa 5 % y MES 5mM pH 6,2. En el caso de las dos últimas series con la lipopoliamina C (RPR 120 535) , el vehículo de inyección es NaCl 75 mM y NaCl 150mM, D-Glucosa 5 %, respectivamente. La inyección es realizada 20 a 30 minutos después de la preparación de la solución. Se realiza la inyección de cada composición transfectante (ver tabla 9 y 10 para sus especificidades respectivas) en el tumor 7 días después de la implantación, la ratona es anestesiada con una mezcla de Cetamina 130 mg/kg+Xilazina (4 mg/mg) . Dos días después de la inyección, se saca el tejido tumoral que es pesado y después picado y molido en 500 µl tampón lisis (Promega Cell Lysis Buffer E153 A) . Después de la centrifugación (20000 g durante 10 minutos) , se sacan 10 µl que sirven para la evaluación de la actividad luciferasa por medición de la emisión luminosa total obtenida después de mezclar con 50 µl de reactivo (Promega Luciferase Assay Substrate) en un luminómetro Lumat LB 9501 (Berthold) , integración en 10 segundos . La actividad resultante es expresada en RLU (Unidades relativas de luz) estimadas en la totalidad del sobrenadante de lisis tumoral, o en RLU por µg de ADN inyectado. La tabla 9 muestra los resultados obtenidos en presencia de diversas lipopoliaminas A, B, C o D y la tabla 10 en presencia de PEÍ .

TABLA 9 TABLA 10 EJEMPLO 7 Transferencia de ácido nucleico in vitro en las células Este ejemplo describe la transferencia de ácidos nucleicos in vitro (en cultivos celulares) por medio de una composición de acuerdo a la invención que comprende al ácido nucleico, un compuesto de acuerdo a la invención elegido entre los derivados de protaminas y una lipopoliamina en una solución 75 mM final. Se prepara una mezcla de 10 µl compuesta como sigue: - 0,5 µg de ADN plasmídico pCMV-luc, 0,5 µg de PR1 o PR2, un compuesto de acuerdo a la invención, en una solución de NaCl 75 mM final - lipopoliamina C (RPR 120535) en las relaciones de carga que se indican en cada uno de los ensayos listados en la tabla 11 posterior. 1.105 células 3LL (en 250 µl de medio de cultivo DMEM con 10 % de suero de feto de ternero) son incubadas con la mezcla precedente a 37°C bajo una atmósfera de C02 a 5 % durante 4 horas. 500 µl de medio de cultivo son adicionados y se vuelven a poner en cultivo. El día siguiente, las células son lavadas y vueltas a poner en cultivo durante 24 horas en el mismo medio que contiene 10 % de suero de ternero fetal . El tapiz celular es enseguida lisado en 100 µl de tampón de lisis (Promega) . La actividad luciferasa es medida adicionando 50 µl de sustrato (Promega) . La lectura se hace en el luminómetro LB acumulando las RLU (unidades relativas de luz) durante 10 segundos. Las tablas 11 y 12 muestran los resultados respectivamente de los ensayos con RPl y RP2.

TABLA 11 TABLA 12 EJEMPLO 8: Inyecciones in vivo de péptidos compactantes de acuerdo a la invención sin lipofectantes dentro de los tumores Modelo: - ratones de tipo S iss/desnudo hembras adultas tumores experimentales inducidos después de la inyección de 107 células 3T3 HER2 por vía subcutánea al nivel del seno . - inyección de la mezcla de transfección 7 a 12 días después de la inyección de células . La solución de ADN compactado o no con el péptido es inyectada directamente en el tumor con una jeringa de tipo Hamilton. - dos días después de la inyección, se saca el tejido tumoral, que es pesado y después picado y homogenizado en 750 µl tampón de lisis (Promega Cell Lysis Buffer El53 A) . Después de la centrifugación (20 000 g durante 10 minutos) , se sacan 10 µl que sirven para la evaluación de la actividad luciferasa medida por la emisión luminosa total obtenida después de mezclar con 50 µl de reactivo (Promega Luciferase Assay Substrate) en un luminómetro Lumat LB 9501 {Berthold) , integración durante 10 segundos . La actividad resultante es expresada en RLU (unidades relativas de luz) estimadas en la totalidad del sobrenadante de lisis tumoral. Protocolo: El ADN se diluye hasta 0,5 mg/ml en una solución que contendrá al final las sales, el tampón y la glucosa en cantidad final tal como se menciona en la tabla de resultados. En ciertos grupos, antes de la inyección, el péptido en solución de 1 mg/ml en agua es añadido al ADN en cantidad suficiente para alcanzar las relaciones peso/peso indicadas. Es realizada una incubación de al menos 20 minutos a temperatura ambiente.Los ratones reciben una inyección de 20 µl, siendo 10 µg de ADN el total por tumor.

TABLA 13 ratones adormecidos durante la inyección, por narco-neuroleptanalgésico con una mezcla Imalgéne+Rompun (Cetamina 130 mg/kg, Xilasina 4 mg/kg, vía intraperitoneal) .

Estos resultados muestran que, en los tumores susceptibles de poder ser transfectados por el ADN desnudo, la adición de péptidos con relaciones bajas péptido/ADN, sin asociación de lípidos catiónicos, permite aumentar la expresión del gen exógeno por relación al ADN desnudo solo.

LISTA DE SECUENCIAS (1) INFORMACIONES GENERALES: (i) SOLICITANTE: (A) NOMBRE: RHONE POULENC RORER S.A., (B) CALLE: 20, Avenue Raymond Aron (C) CIUDAD: ANTONY (E) PAÍS: FRANCIA (F) CÓDIGO POSTAL: 92165 (G) TELEFONO: 40.91.69.22 (H) FACSÍMIL: (1) 40.91.72.96 (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: COMPOSICIÓN QUE CONTIENE ÁCIDOS NUCLEICOS, PREPARACIÓN Y UTILIZACIÓN (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 9 (iv) FORMA DESCIFRABLE POR COMPUTADORA: (A) TIPO DE SOPORTE: Cinta (B) COMPUTADORA: IBM PC Compatible (C) PROGRAMAS ESTÁNDAR: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMAS PARA TRATAMIENTO DE INFORMACIÓN: PatentIn Reléase #1.0, Versión #1.30 (OEB) (2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LARGO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) CONFIGURACIÓN: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1 Lys Thr Pro Lys Lys Ala Lys Lys Pro 5 (2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LARGO: 8 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) CONFIGURACIÓN: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 2 Ala Thr Pro Ala Lys Lys Ala Ala 5 (2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO : 3 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LARGO: 16 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) CONFIGURACIÓN: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 3: Ala Thr Pro Ala Lys Lys Ala Ala Ala Thr Pro Ala Lys Lys Ala Ala 5 10 15 (2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LARGO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) CONFIGURACIÓN: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 4: Lys Thr Pro Lys Lys Ala Lys Lys Pro Lys Thr Pro Lys Lys Ala Lys 5 10 15 Lys Pro (2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LARGO: 17 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) CONFIGURACIÓN: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5: Ala Thr Pro Lys Lys Ser Ala Lys Lys Thr Pro Lys Lys Ala Lys Lys 5 10 15 Pro (2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LARGO: 26 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) CONFIGURACIÓN: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6: Lys Lys Ala Lys Ser Pro Lys Lys Ala Lys Ala Ala Lys Pro Lys Lys 5 10 15 Ala Pro Lys Ser Pro Ala Lys Ala Lys Ala 20 25 (2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LARGO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) CONFIGURACIÓN: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7: Ser Arg Ser Arg Tyr Tyr Arg Gln Arg Gln Arg Ser Arg Arg Arg Arg 5 10 15 Arg Arg (2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO : 8: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LARGO: 21 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) CONFIGURACIÓN: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8: Arg Arg Arg Leu His Arg lie His Arg Arg Gln His Arg Ser Cys Arg 5 10 15 Arg Arg Lys Arg Arg 20 (2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO : 9: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LARGO: 26 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) CONFIGURACIÓN: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9: Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Ala Lys Thr Pro Lys Lys Ala Lys Lys 5 10 15 Pro Lys Thr Pro Lys Lys Ala Lys Lys Pro 20 25

Claims (38)

1. REIVINDICACIONES 1. Composición farmacéutica útil para la transfección de un ácido nucleico, caracterizado porque contiene además de dicho ácido nucleico, al menos un agente de transfección y un compuesto que interviene al nivel de la condensación de dicho ácido nucleico, dicho compuesto se deriva todo o parte de una histona, de una nucleolina, de una protamina y/o de uno de sus derivados .
2. 2. Composición farmacéutica útil para la transfección de un ácido nucleico que contiene además de dicho ácido nucleico, un agente de transfección y al menos un compuesto que interviene al nivel de la condensación de dicho ácido nucleico, caracterizado porque dicho compuesto está constituido todo o en parte, de motivos peptídicos (KTPKKAKKP) y/o (ATPAKKAA) repetidos de manera continua o no, el número de motivos puede variar entre 2 y 10.
3. 3. Composición farmacéutica de acuerdo a la reivindicación 2, caracterizada porque los motivos peptídicos pueden estar separados entre ellos por dos ligandos de naturaleza bioquímica de tipo aminoácidos y/o de naturaleza química.
4. 4. Composición farmacéutica de acuerdo a la reivindicación 3, caracterizada porque se trata de ligandos constituidos de uno o varios aminoácidos.
5. 5. Composición farmacéutica de acuerdo a la reivindicación 1 a 4, caracterizado porque el compuesto desvía la histona Hl.
6. 6. Composición farmacéutica de acuerdo a la reivindicación 5, caracterizada porque el compuesto desvía el dominio C-terminal de la histona Hl.
7. 7. Composición farmacéutica de acuerdo a la reivindicación 5 o 6, caracterizada porque se trata de preferencia de un oligopéptido escogido entre (KTPKKAKKP), (COOH) , ATPKKSAKKTPKKAKKP(COOH) , y KKAKSPKKAKAAKPKKAPKSPAKAKA(COOH) .
8. 8. Composición farmacéutica de acuerdo a la reivindicación 1 a 4, caracterizada porque el compuesto desvía el dominio N-terminal de la nucleolina.
9. 9. Composición farmacéutica de acuerdo a la reivindicación 8, caracterizada porque se trata del péptido (ATPAKKAA) 2 (COOH) .
10. 10. Composición farmacéutica de acuerdo a la reivindicación 1, caracterizada porque el compuesto desvía la protamina.
11. 11. Composición farmacéutica de acuerdo a la reivindicación 10, caracterizada porque se trata de un oligopéptido escogido entre SRSRYYRQRQRSRRRRRR (COOH) y RRRLHRIHRRQHRSCRRRKRR (COOH) .
12. 12. Composición farmacéutica de acuerdo a una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque dicho compuesto posee una estructura de hoja ß.
13. 13. Composición farmacéutica de acuerdo a una de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizada porque dicho compuesto está además asociado a un ligando receptor celular.
14. 14. Composición farmacéutica de acuerdo a la reivindicación 13, caracterizada porque se trata de toda o parte de la histona Hl asociada a una secuencia señal de localización nuclear.
15. 15. Composición farmacéutica de acuerdo a 14, caracterizada porque se trata del péptido PKKKRKV-bAla- (KTPKKAKKP)2(C00H) .
16. 16. Composición farmacéutica de acuerdo a una de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizada porque dicho compuesto está además asociado a un péptido de tipo fusógeno favoreciendo la transfección celular de dicha composición.
17. 17. Composición farmacéutica de acuerdo a una de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizada porque dicho compuesto está además poliglicosilado, sulfonado, fosforilado y/o insertado a azúcares complejos o a un agente lipófilo.
18. 18. Composición farmacéutica de acuerdo a una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque el agente de transfección es un polímero catiónico o un lipofectante.
19. 19. Composición farmacéutica de acuerdo a la reivindicación 18, caracterizada porque el lipofectante es un lípido susceptible de formar liposomas furtivos, inmunoliposomas o liposomas blancos.
20. 20. Composición farmacéutica de acuerdo a la reivindicación 18, caracterizada porque el polímero catiónico es de preferencia un compuesto de fórmula general (I) :

    en la que - R puede ser un átomo de hidrógeno o un grupo de fórmula

    - n es un número entero comprendido entre 2 y 10; - p y q son dos números enteros, con la suma p+q siendo tal que los pesos moleculares promedio del polímero están comprendidos entre 100 y 107.
21. 21. Composición farmacéutica de acuerdo a la reivindicación 18, caracterizada porque el polímero catiónico es escogido entre la polietilén imina (PEÍ) y la propilén imina (PPI) .
22. 22. Composición farmacéutica de acuerdo a 21, caracterizada porque el polímero es escogido entre la polietilén imina de peso molecular promedio de 50 000 (PEI50K) y la polietilén imina de peso molecular promedio de 800 000 (PEI800K) .
23. 23. Composición farmacéutica de acuerdo a la reivindicación 18, caracterizada porgue el lipofectante contiene al menos una región poliamina de fórmula general (ID H2-N( - ( CH) m-NH-) n-H (II)
24. en la que m es un número entero superior o igual a 2 y n es un número entero superior o igual a 1, m puede variar entre los diferentes grupos de carbono comprendidos entre dos aminas asociados de manera covalente a una región lipófila de tipo cadena hidrocarbonada, saturada o no, de colesterol, o un lípido natural o sintético capaz de formar dos fases lamelares o hexagonales . 22. Composición farmacéutica de acuerdo a 23 o 24, caracterizada porque la región poliamina está representada por la espermina, la termina o uno de sus análogos conservando sus propiedades de unión al ácido nucleico.
25. 25. Composición farmacéutica de acuerdo a la reivindicación 23, caracterizada porque el lipofectante contiene al menos una región lipófila representada por la fórmula general (IV)

    con - X y X' representan, independientemente uno del otro, un átomo de oxígeno, un grupo metileno -(CH-),- con q igual a 0 , 1 , 2 o 3 , o un grupo amino -NH- o -NR'- con R1 que representa un grupo alquilo de

    - Y y Y' representan independientemente uno del otro un grupo metileno, un grupo carbonilo o un grupo C=S, - R3, R4 y R5 representan independientemente uno del otro un átomo de hidrógeno o un radical alquilo, sustituido o no, de d a C„ , pudiendo variar p entre 0 y 5 , - Rß representa un derivado del colesterol o un grupo alquilo amino-NRiRj con Rx y R2 representando independientemente uno del otro un radical alifático, saturado o no, lineal o ramificado de C12 a C22.
26. 26. Composición farmacéutica de acuerdo a ls reivindicación 23, caracterizada porque se trata de preferencia de una lipopoliamina escogida entre la dioctadecilamidoglicil espermina (DOGS) la 5-carboxiespermilamida de la palmitoilfosfatidiletanolamina (DPPES) , el (Dioctadecil-carbamoilmetoxi) -acetato de 2 -5-bis-(3-amino-propilamino) -pentilo o el (Dioctadecil-carbamoilmetoxi) -acetato de 1, 3-bis- (3-amino-propilamino) -2 p r o p i l o , l a {H2N(CH2)3}2N(CH2)4N{(CH2)3NH2}(CH2)3NHCH2COGlyN[(CH2)17-CH3]2, la

    H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGlyN[ (CH2) lß]2 o la

    H2N ( CH2 ) 3NH ( CH- ) 4NH ( CH2 ) 3NHCH2 COArgN [ ( CH2 ) 18 ] .
27. 27. Composición farmacéutica de acuerdo a cualquiera de una de las reivindicaciones 1 a 18 y 23 a 26, caracterizada porque el agente de transfección es la dioctadecilamidoglicil espermina (DOGS) .
28. 28. Composición farmacéutica de acuerdo a una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque el ácido nucleico es un ácido desoxirribonucleico.
29. 29. Composición farmacéutica de acuerdo a una de las reivindicaciones 1 a 27, caracterizada porque el ácido nucleico es un ácido ribonucleico.
30. 30. Composición farmacéutica de acuerdo a las reivindicaciones 28 o 29, caracterizada porque el ácido nucleico está modificado químicamente.
31. 31. Composición farmacéutica de acuerdo a la reivindicación 28, 29 o 30, caracterizada porque el ácido nucleico es un antisentido.
32. 32. Composición farmacéutica de acuerdo a una de las reivindicaciones 28 a 30, caracterizada porque el ácido nucleico tiene un gen terapéutico.
33. 33. Composición farmacéutica de acuerdo a una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque contiene además uno o varios lípidos neutros.
34. 34. Composición farmacéutica de acuerdo a 33, caracterizada porque el o los lípidos neutros son escogidos entre los lípidos sintéticos o naturales, zwitteriónicos o desprovistos de carga iónica en las condiciones fisiológicas.
35. 35. Composición farmacéutica de acuerdo a la reivindicación 33 o 34 caracterizada porque los lípidos neutros son escogidos entre la dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE) , la oleoil-palmitoilfos-fatidiletanolamina (POPE) , la diestearoil, -palmitoil, -miristoil fosfatidiletanolamina así como sus derivados N-metilados 1 a 3 veces; los fosfatidilgliceroles, los diacilgliceroles, los glicosildiacilgliceroles, los cerebrósidos (tales como en particular los galactocerebrósidos) , los esfingolípidos (tales como particularmente las esfingomielinas) y los asialogangliósidos (en especial tales como los asialoGMl y GM2) .
36. 36. Utilización de una composición farmacéutica de acuerdo a una de las reivindicaciones 1 a 35 para la transferencia in vitro, ex vivo y/o in vivo de ácidos nucleicos .
37. 37. Utilización de un compuesto constituido todo o en parte, de motivos peptídicos (KTPKKAKKP) y/o (ATPAKKAA) con el número de estos motivos que puede variar entre 2 y 10, para, cuando está acoplado a un ligando receptor celular, un anticuerpo o derivado de anticuerpo, dirige, in vitro, ex vivo y/o in vivo, un ácido nucleico hacia las células que expresan los receptores o antigenes correspondientes .
38. 38. Utilización de un oligopéptido seleccionado entre: (ATPAKKAA), (COOH) , (KTPKKAKKP) 2 (COOH) , ATPKKSAKKTPKKAKKP (COOH) , KKAKSPKKAKAAKPKKAPKSPAKAKA(COOH) , SRSRYYRQRQRSRRRRRR (COOH) , y RRRLHRIHRRQHRSCRRRKRR(COOH) . para efectuar la transferencia in vitro, ex vivo y/o in vivo de al menos un ácido nucleico, dicho oligonucleótido está asociado o no a un elemento de dirección.