CN108034654A - 与水稻苗期根长相关的snp分子标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物分子标记领域，具体公开了与水稻苗期根长相关的SNP分子标记及其应用。所述SNP分子标记来自LOC_Os08g31580基因，该SNP分子标记位于水稻第8染色体19,547,859bp位置，碱基为C或T。所述SNP分子标记与水稻苗期根长状显著相关，位点基因型为T/T的水稻品种的苗期根长显著长于位点基因型为C/C的水稻品种。同时依据此SNP位点设计了PCR引物，引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。利用本发明的SNP分子标记可用于水稻根系改良和抗旱育种，加速水稻抗旱新种质的创制和水稻抗旱分子育种的进程。

Description

与水稻苗期根长相关的SNP分子标记及其应用
技术领域
本发明涉及生物分子标记领域，具体地说，涉及与水稻苗期根 长相关的SNP分子标记及其应用。
背景技术
水稻是世界上最重要的三大粮食作物之一，是世界2/3人口的主 要食物来源。随着人口与经济的快速增长，粮食生产面临着巨大的发 展压力，而水稻安全生产对于中国的可持续发展至关重要。近年来， 我国气候变化异常，极端天气频发，其中干旱胁迫已成为威胁水稻生 产的重要障碍因素之一，对我国水稻生产带来了严重威胁。其中根部 性状与抗旱性密切相关，包括根长、根粗、根重、根数、根冠比和深 体积等。如何有效解决水稻生产用水需求与干旱缺水之间日益尖锐的 矛盾是我国粮食安全面临的最严峻挑战。生产实践证明，培育和种植 节水抗旱水稻品种是减少干旱损失最经济有效的措施。发达的根系是 水稻抗旱的重要保证。发掘水稻根系性状相关基因，开发与根系性状 紧密相关的分子标记，通过分子标记辅助选择利用新基因或与已知优 良基因进行聚合对于培育抗旱水稻品种具有重要意义。
根系是植物吸收养分、水分以及感知土壤状况的重要器官，强壮 发达的根系(特别是深根系)有利于提高水稻吸水能力，降低干旱对 生长及最终产量的不利影响。利用DNA分子标记对水稻根部性状的分 子定位研究发现，水稻根部性状是受数量性状位点(Quantitative Trait Loci，QTL)控制的复杂性状。水稻根部性状(根长、根粗、根重等) 相关QTLs的分子定位已相继报道，其中根长相关的QTL qRL7精细 定位到在7号染色体的657.35kb区间范围内。但在水稻根部性状相关 QTLs/基因的克隆方面，到目前为止，只有少数几个水稻根部性状相 关的QTLs被克隆。
单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms,SNP)主要是 指由于单个核苷酸的变异而引起基因组水平上的DNA序列多态性，包 括单碱基的转换、颠换、缺失和插入等形式。SNP在水稻基因组中 的分布相当广泛，随着高通量测序技术的进步，SNP已经成为了新一 代的分子标记。根据SNP在基因组中分布的位置可以分为基因编码区 SNP(cSNP)、基因间SNP(iSNP)和基因周边SNP(pSNP)，其中cSNP (功能标记)是根据功能基因内部引起表型性状变异的多态性基序开 发出来的一种新型分子标记。由于来自基因内的功能性基序，此类标 记不需要进一步验证就可以在不同的遗传背景下或者不同的水稻种 质资源中确定目标等位基因的有无。
LOC_Os08g31580编码一个DREBs类转录因子，该类转录因子在 植物的冷、干旱、高盐、过氧化物等胁迫应答途径以及生长发育过程 中具有重要的作用，参与不依赖于ABA的胁迫应答反应。DREBs转录 因子通过结合下游基因启动子区的干旱及生长发育应答顺式作用元 件而调控下游基因的表达。通过超量表达LOC_Os08g31580基因可以 来提高水稻的抗旱性。以上研究结果表明LOC_Os08g31580基因在植 物生长发育及抵御外界非生物胁迫方面起着重要的作用。因此 LOC_Os08g31580基因的功能标记的开发和应用对分子标记辅助选择 和水稻品种鉴定具有重要的理论和现实意义。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种与 水稻苗期根长相关的SNP分子标记及其应用。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供一种与水稻苗期根长相关的SNP分子标 记，所述分子标记来自LOC_Os08g31580基因，位于水稻第8染色体 19,547,859bp位置，碱基为C或T。研究发现，当此处碱基为T的水稻 品种苗期的根长显著长于碱基为C的水稻品种的根长。
进一步地，所述SNP分子标记及其两端的侧翼序列组成的核苷 酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述SNP分子标记在SEQ ID NO.1所 示核苷酸序列的第456bp处存在C/T突变。
进一步地，本发明提供用于检测所述SNP分子标记的特异性引 物，其特征在于，包括：
正向引物：5’-AAGCCCTAATCACCCAGAC-3’；
反向引物：5’-TGTAGTGGAACCCGTGGACT-3’。
需要说明的是，含有所述特异性引物的试剂或试剂盒也属于本发 明的保护范围。
第二方面，本发明提供了所述SNP分子标记在鉴定水稻苗期根 长水平中的应用，包括以下步骤：
1)提取待测水稻样品的基因组DNA；
2)以待测水稻样品的基因组DNA为模板，利用前述特异性引物 进行PCR扩增反应，获得扩增产物片段；
3)检测PCR扩增产物片段的第456bp处的碱基种类，判断样品 的苗期根长，位点基因型为T/T的水稻品种的苗期根长显著长于位点 基因型为C/C的水稻品种。
进一步地，步骤2)中PCR反应使用的扩增体系以20μL计为：
PCR反应的条件为：
①95℃预变性2分钟；
②98℃变性10秒，53℃退火15秒，68℃延伸30秒，共33个 循环；
③68℃保温5分钟。
进一步地，本发明还提供了所述SNP分子标记在水稻苗期根长 状改良及分子育种中的应用。
本发明的有益效果在于：
利用本发明所提供的SNP分子标记能够对水稻苗期的根长进行 鉴定，该SNP位点与水稻的根长显著相关。该SNP位点可以作为功能 性分子标记，筛选根系性状优良的水稻资源和品种，在水稻根系相关 育种中发挥重要作用。
附图说明
图1为七月籼(a)和白壳旱禾(b)品种的苗期根系图。
图2为本发明的SNP分子标记引物对在部分种质资源中基因组 DNA的扩增结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。需要理解的是以 下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范 围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况 下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方 法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商 业途径得到。
实施例1 与根长相关SNP位点的鉴定和LOC_Os08g31580基因功能 标记的开发
从Rice Genome Annotation Project下载水稻LOC_Os08g31580基 因序列，依据此序设计引物用于扩增LOC_Os08g31580的编码区，CDS 编码区全长为843bp。用设计好的引物克隆陆稻材料白壳旱禾(根长 14cm-图1b)和水稻材料七月籼(根长11.8cm-图1a)的CDS区，1％的 琼脂糖凝胶电泳检测，然后对PCR产物进行测序分析。把测序所得到 的序列在DNAMAN中进行比对，鉴定具有白壳旱禾(较长根系)和 七月籼(较短根系)之间的SNP位点。检测第8号染色体上的19,547,859 bp位置SNP位点的基因型存在差异，白壳旱禾此位点基因型为T/T， 七月籼此位点的基因型为C/C。
针对此SNP位点设计了引物，如表1所示。
表1 引物序列
引物名称 引物序列(5’-3’)
正向引物 5’-AAGCCCTAATCACCCAGAC-3’
反向引物 5’-TGTAGTGGAACCCGTGGACT-3’
检测水稻根长相关SNP位点(第8号染色体上的19,547,859bp位 置)基因型的方法：提取水稻基因组DNA，以基因组DNA为模板， 采用正向引物和反向引物进行PCR扩展，将PCR扩展产物进行测序， 检测水稻根长相关SNP位点(第8号染色体上的19,547,859bp位置)基 因型为T/T还是C/C。
其中，PCR反应体系为：
PCR反应程序为：
①95℃预变性2分钟；
②98℃变性10秒，53℃退火15秒，68℃延伸30秒，共33个 循环；
③68℃保温5分钟。
实施例2 水稻种质资源苗期根长的测定
本实施例选取30份水稻种质资源为材料，将水稻种子在50℃烘箱 中烘3天打破休眠，用0.5％次氯酸钠(NaClO)溶液浸泡30分钟进行 表面消毒，在37℃培育箱下浸种、催芽至露白。选发芽一致的种子播 于底部带有尼龙网的泡沫板孔中，置于盛有20L水的塑料盆中，每个 材料播种约20个单株，三次生物学重复。用pH为5.5的蒸馏水培养三 天，之后用Yoshida营养液继续培养，期间每天调pH至5.5左右，每周 换一次营养液、播种21天之后，测量根基部到根尖端的长度(根长)。 结果见表2，30份材料中20份材料的根长小于12cm，根系较短；10份 材料的根长大于13.5cm，根系较长。
表2 30份水稻种质资源株高数据及SNP基因型统计
实施例3 水稻根长相关SNP分子标记在鉴定水稻根系长度中的应用
待测样本为：实施例2表2中的水稻材料。
提取待测水稻的基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用正向 引物和反向引物进行PCR扩展，PCR反应产物用1％的琼脂糖凝胶进行 检测(图2)。按照实施例1中所述的方法检测待测水稻基因组DNA中 与水稻苗期根长相关的SNP分子标记，即第8染色体19,547,859bp位置 的基因型。测序结果表明，30个水稻材料中有20个材料在该SNP位点 的基因型为C/C，10个材料在该SNP位点的基因型为T/T，同时发现该 SNP位点基因型为C/C的材料的平均根长为11.65cm，基因型为T/T的 材料的平均根长为14.76cm，该SNP位点基因型为T/T的水稻材料的根 长显著的大于基因型为C/C的水稻品种。通过该SNP标记对30份具有 不同根长的水稻品种进行检测，发现该标记能够明确的鉴定出哪些种 质资源具有较长的根系，该SNP位点可以作为功能性分子标记，筛选 根系性状优良的水稻资源和品种，在水稻根系相关育种中发挥重要作 用。
应当理解的是，对上述实施例所用试剂或原料的用量进行等比例 扩大或者缩小后的技术方案，与上述实施例的实质相同。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详 尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本 领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础 上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业科学院作物科学研究所
中国农业科学院深圳生物育种创新研究院
<120> 与水稻苗期根长相关的SNP分子标记及其应用
<141> 2018-01-15
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 572
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa)
<400> 1
aagccctaat cacccagact ccatctctgt gaggtttgag agaggtaggt gagccgtaga 60
tctgagcgag ttcttgggtc ttccagcagg tagatcactt catctgagga tcaatctttt 120
tttttttcct ttgtttttga gcttctgttg gtgtacagga cagagagttc cagagccttt 180
tagtttctgg tgttctgatc tgttcttggt gtaagattat tggtctgatt tggtagccaa 240
gagggttaat tttttccaca cctccttgtg ctagttagct tagcttatac cccccttgta 300
aagtgattag tagatctaga acttctcttt tcgtctgcca gttcttggat tttggaaaga 360
acaggtggtt tgttattcag atttttaggt tagaaaaaat ccacaaaaaa aaagatattc 420
gatggcagct gctatagaag gaaatctgat gcgggcgctg ggagaggctc cgtcgccgca 480
gatgcagaag atcgcgccgc cgccgtttca tcccggcttg ccgccggcgc cggcgaactt 540
ctcctcggcc ggagtccacg ggttccacta ca 572
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aagccctaat cacccagac 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgtagtggaa cccgtggact 20

Claims (10)

1.与水稻苗期根长相关的SNP分子标记，其特征在于，所述分子标记来自LOC_Os08g31580基因，位于水稻第8染色体19,547,859bp位置，碱基为C或T。
2.根据权利要求1所述的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记及其两端的侧翼序列组成的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述SNP分子标记在SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第456bp处存在C/T突变。
3.用于检测权利要求1或2所述SNP分子标记的特异性引物，其特征在于，包括：
正向引物：5’-AAGCCCTAATCACCCAGAC-3’；
反向引物：5’-TGTAGTGGAACCCGTGGACT-3’。
4.含有权利要求3所述特异性引物的试剂。
5.含有权利要求3所述特异性引物的试剂盒。
6.权利要求5所述的试剂盒在辅助鉴定水稻苗期根长方面的应用。
7.权利要求1或2所述的SNP分子标记在鉴定水稻苗期根长水平中的应用，包括以下步骤：
1)提取待测水稻样品的基因组DNA；
2)以待测水稻样品的基因组DNA为模板，利用权利要求3所述的特异性引物进行PCR扩增反应，获得扩增产物片段；
3)检测PCR扩增产物片段的第456bp处的碱基种类，判断样品的苗期根长，位点基因型为T/T的水稻品种的苗期根长显著长于位点基因型为C/C的水稻品种。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤2)中PCR反应使用的扩增体系以20μL计为：
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤2)中PCR反应的条件为：
①95℃预变性2分钟；
②98℃变性10秒，53℃退火15秒，68℃延伸30秒，共33个循环；
③68℃保温5分钟。
10.权利要求1或2所述的SNP分子标记在水稻苗期根长状改良及分子育种中的应用。
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