CN112126651B

CN112126651B - 一种增加植物花青素含量的拟南芥AtGLK1基因序列及其应用

Info

Publication number: CN112126651B
Application number: CN202010926504.1A
Authority: CN
Inventors: 刘栋; 郑雨轩; 曾勇军; 赵东鸣; 马利霞
Original assignee: Jiangxi Agricultural University
Current assignee: Jiangxi Agricultural University
Priority date: 2020-09-07
Filing date: 2020-09-07
Publication date: 2022-08-26
Anticipated expiration: 2040-09-07
Also published as: CN112126651A

Abstract

本发明公开了一种增加植物花青素含量的拟南芥AtGLK1基因，并公开了其应用。该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明同时还提供了重组载体的构建和转基因的方法以应用上述基因，可培育花青素含量增加的植物新品种，具有广泛的应用价值。

Description

一种增加植物花青素含量的拟南芥AtGLK1基因序列及其应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种增加植物花青素含量的拟南芥AtGLK1基因序列及其应用。

背景技术

花青素是自然界中广泛存在于植物细胞内的一种水溶性类黄酮色素，其颜色随细胞pH的变化而呈现不同的颜色，植物的组织器官如叶片、花瓣和果实等因含有花青素呈现五颜六色的颜色，花青素对于植物正常的生长、发育和繁殖具有重要的作用(Grotewold,2006；Tanaka et al.,2008,Rowan et al.,2009)。如花青素能够减轻植物在强光、紫外线、干旱和病虫害等逆境条件下遭受的损伤，也能增强植物在其它非生物或生物逆境胁迫下的抗性(Steyn,2002)。同时，由于花青素的存在使植物的花器官呈现鲜艳的颜色，因而可以吸引昆虫在异花植物之间完成传粉(Winkel-Shirley,2001)。不仅如此，花青素因其在食品、染料、医药、化妆和保健品等方面所表现出来的重要价值，正被越来越多的人关注和应用，如花青素作为抗氧化剂能够清除细胞中过量的自由基，对人体的健康具有重要的保护作用(钟兰兰等,2013)。

植物细胞中花青素的生物合成是植物类黄酮物质合成代谢途径的一部分，大致可以分为三个阶段。第一阶段是由花青素及其他类黄酮类物质的前体物质苯丙氨酸经过解氨、羟化和香豆酰辅酶A连接酶的催化作用下合成香豆酰辅酶A；第二阶段是花青素生物合成的关键阶段，该阶段利用香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A在查尔酮合成酶、查尔酮异构酶以及三种不同的黄烷酮羟化酶的作用下生成花青素合成的直接前体，即二氢黄酮醇；第三阶段是多种花青素的合成阶段，由第二阶段生成的二氢黄酮醇首先被还原为无色的花色素，再由花青素合成酶和无色花青素双加氧酶催化生成有色但性质不稳定的花青素，最终连接上糖基形成稳定的花青素(侯泽豪等,2017)。

植物花青素的合成受很多编码花青素合成的关键酶基因和转录因子调控。根据合成酶在参与花青素合成途径中的上下游位置，可将其分为花青素合成早期关键基因和晚期关键基因。其中，早期关键基因包括：如查尔酮合酶基因(CHS)、查尔酮异构酶基因(CHI)和类黄酮3'羟化酶基因(F3'H)等，晚期合成的关键基因包括二氢黄酮醇4-还原酶基因(DFR)、花色素酶基因(LDOX)、花色素还原酶基因(ANR)和UDP-葡糖基转移酶基因(UF3GT)等(Pelletier et al.,1997)。近些年的研究表明，许多转录因子在调控植物花青素合成的过程中具有重要的作用，如拟南芥PAP1基因编码MYB家族的转录因子，过表达该基因使转基因拟南芥花青素的含量显著增加，其叶片的颜色呈现紫色，表明PAP1是拟南芥花青素合成的正调控因子(Teng et al.,2005)。MYBL2是调控拟南芥花青素合成重要的负调控转录因子，过表达该基因的转基因拟南芥植株花青素含量降低，而在功能缺失的mybl2突变体中，花青素的含量显著增加(Dubos et al.,2008；Matsui et al.,2008)。

由于花青素对于植物的生长发育以及与人类的日常生活息息相关，通过基因工程手段，提高植物体内的花青素的含量对于研究植物生长发育的规律、增强植物在逆境胁迫的适应能力以及在次生代谢物质的生产中提高花青素的生产能力具有重要的理论和现实意义。

发明内容

本发明所要解决的问题是：提供一种增加植物花青素含量的拟南芥AtGLK1基因序列及其应用，可培育花青素含量增加的植物新品种，具有广泛的应用价值。

本发明为解决上述问题所提供的技术方案为：一种增加植物花青素含量的拟南芥AtGLK1基因序列，所述拟南芥AtGLK1基因序列的核酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。

本发明还提供了一种增加植物花青素含量的拟南芥AtGLK1基因的克隆方法，所述方法包括以下步骤，

(1)提取拟南芥植株的总RNA并反转录成cDNA；

(2)以cDNA为模板，用PCR方法扩增AtGLK1基因的CDS序列；

(3)回收PCR扩增产物。

本发明还提供了一种增加植物花青素含量的拟南芥AtGLK1基因的应用，其特征在于：利用上述的克隆方法得到的AtGLK1基因的CDS序列，构建“CaMV 35S-AtGLK1”融合基因，并进行植物转化，从而获得在拟南芥中组成型表达AtGLK1目的基因的转基因植物。

优选的，所述融合基因中的目的基因可以是任何针对基础研究、转化技术、花卉或者草本植物花青素含量增加等性状改良需要的目的基因。

本发明还提供了一种“CaMV 35S-AtGLK1”融合基因的构建及其在转基因拟南芥中增加花青素含量的应用，具体操作过程如下：

(1)用Xba I/Sac I双酶切通过PCR扩增的AtGLK1基因的CDS序列片段；

(2)用Xba I/Sac I双酶切PBI 121表达载体的质粒，回收载体大片段；

(3)混合上述第一步得到的AtGLK1基因的CDS序列片段和第二步得到的PBI121载体大片段，在连接酶催化下进行连接反应，完成在PBI121载体上的“CaMV 35S-AtGLK1”融合基因的构建。

优选的，所设计的AtGLK1基因的CDS序列的PCR扩增引物如下，其中上游引物引入了Xba I酶切位点，下游引物引入了Sac I酶切位点：

上游引物：5’-GCTCTAGAATGTTAGCTCTGTCTCCG-3’，引入Xba I酶切位点；

下游引物：5’-GCGAGCTCTCAGGCACAAGACGCGGTC-3’，引入Sac I酶切位点。

优选的，应用中的“CaMV 35S-AtGLK1”融合基因的构建在转基因拟南芥中组成型表达，操作过程如下：采用农杆菌介导的Floraldip的方法，收获的种子经过50mgl^-1的卡那霉素进行抗性筛选，将生长正常的抗性植株转土培养扩繁，利用50mgl^-1的卡那霉素对其扩繁的种子再进行抗性筛选并获得转化AtGLK1基因的纯合转基因拟南芥株系，最后通过测定其花青素的含量，确定转化“CaMV 35S-AtGLK1”融合基因构建的转基因拟南芥株系的花青素含量显著升高。

与现有技术相比，本发明的优点是：本发明在模式植物拟南芥中克隆了AtGLK1基因，通过构建重组表达载体，将该基因转化并获得AtGLK1基因过量表达的转基因拟南芥植株，本发明的试验结果表明，将克隆的AtGLK1转化模式植物拟南芥，可以显著提高转基因植株中花青素的含量。本发明的融合基因构建“CaMV 35S-AtGLK1”可作为基因资源在农业生产上应用或选育转基因植物以提高花青素的含量，具有广泛的应用价值。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1是转化“CaMV 35S-AtGLK1”融合基因的拟南芥抗性株系中外源基因整合的PCR分子鉴定图，M：DL2000，1、2和3分别代表以H₂O和转化AtGLK1的两个抗性株系的DNA为模板的PCR扩增图。

图2是对转化“CaMV 35S-AtGLK1”融合基因的转基因拟南芥株系中目的基因AtGLK1基因的表达分析，Col、OEGLK1-1和OEGLK1-2分别代表野生型拟南芥和转化AtGLK1基因的两个独立转基因株系，*P﹤0.05。

图3A是野生型拟南芥(Col)和转化“CaMV 35S-AtGLK1”融合基因的转基因拟南芥(OEGLK1-1和OEGLK1-2)的表型图，B是野生型拟南芥(Col)和转化“CaMV 35S-AtGLK1”融合基因的转基因拟南芥(OEGLK1-1和OEGLK1-2)花青素含量的定量测定图，*P﹤0.05。

具体实施方式

以下将配合附图及实施例来详细说明本发明的实施方式，借此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

实施例1：拟南芥AtGLK1基因的克隆

(1)利用异硫酸腈胍-酚法提取拟南芥植株的总RNA，药品的使用、配制以及具体操作步骤参考黄培堂等(2002)的方法。

(2)根据已知的拟南芥AtLGLK1基因的CDS序列设计特异引物，在上游引物中引入Xba I酶切位点，下游引物中引入Sac I酶切位点。

上游引物：5’-GCTCTAGAATGTTAGCTCTGTCTCCG-3’(引入Xba I酶切位点)

下游引物：5’-GCGAGCTCTCAGGCACAAGACGCGGTC-3’(引入Sac I酶切位点)

(3)取1μgRNA作反转录的模板，以P₂₈₅₃为引物利用Promega的反转录酶ImProm-II^TM进行反转录，P₂₈₅₃引物序列、反转录程序和反转录体系如下。

P₂₈₅₃引物序列：5'-GCGAATTCTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'

反转录程序：

72℃5min；25℃5min；42℃60min；80℃20min；4℃保温。

反转录体系：

(4)以反转录的cDNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增，获得AtGLK1基因的CDS片段。

PCR反应程序：94℃3min；94℃30s，56℃30s，72℃2min，30个循环；72℃10min；4℃保温。

PCR反应体系：

(5)通过琼脂糖凝胶电泳回收目的DNA片段。

(6)将回收后的PCR产物进行DNA测序，其核酸序列如序列表1所示。

实施例2：利用PBI 121表达载体构建“CaMV 35S-AtGLK1”融合基因

(1)从大肠杆菌中提取载体PBI 121质粒，用Xba I/Sac I双酶切后回收载体的大片段。

(2)对实施例1所回收的AtGLK1基因的CDS片段用Xba I/Sac I双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳回收酶切后的片段。

(3)将上述回收的两个片段在连接酶催化下于16℃连接24h，完成PBI 121表达载体上的“CaMV 35S-AtGLK1”融合基因构建。

连接体系：

(4)将连接混合物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，具体方法如下：

按常规的CaCl₂诱导和转化方法，制备大肠杆菌DH5α感受态细胞，用10μl连接产物转化感受态细胞，然后将其均匀涂布到含有Amp、X-gal和IPTG的平板上，37℃倒置培养12h。

(5)以质粒为模板进行PCR反应，鉴定质粒中的“CaMV 35S-AtGLK1”融合基因，扩增片段的大小是1558bp。所用引物如下：

上游引物：5'-CATCATTGCGATAAAGGAAAGG-3'

下游引物：5’-GCGAGCTCTCAGGCACAAGACGCGGTC-3’

(6)从阳性克隆中提取质粒，用常规方法转化农杆菌GV3101，获得工程化农杆菌，用于植物转化。

实施例3：转基因拟南芥植株的制备

将实施例2中构建的“CaMV 35S-AtGLK1”融合基因转化拟南芥，具体转化方法采用农杆菌介导花苞浸染的方法(Clough and Bent,1998)，获得的种子经过50mgl^-1卡那霉素抗性筛选，将具备卡那霉素的抗性植株提取DNA，DNA的提取方法参考Dellaporta等(1983)的方法，通过PCR的方法鉴定外源AtGLK1片段整合到拟南芥的基因组中，扩增片段的大小是1558bp，所用引物如下：

上游引物：5'-CATCATTGCGATAAAGGAAAGG-3'

下游引物：5’-GCGAGCTCTCAGGCACAAGACGCGGTC-3’

PCR反应体系如下：

PCR检测结果如图1所示，在两个被检测的抗性苗株系(2和3泳道)的基因组中，能够扩增出目的条带，表明外源AtGLK1片段已经整合到拟南芥基因组中。

(2)转基因植株的实时定量RT-PCR检测：将经过PCR鉴定的转基因拟南芥扩繁，经过50mgl^-1卡那霉素抗性筛选获得T₃代纯合的转基因株系，按照实施例1的方法提取转基因拟南芥株系的总RNA并反转录成cDNA，利用下列引物、PCR反应程序和反应体系进行实时定量RT-PCR检测AtGLK1的表达水平：

AtGLK1基因的检测引物：

上游引物：5’-TATGACGGTGACAGTGACCGG-3’

下游引物：5’-AACTGTTCCACTGCCTCCACG-3’

ACTIN2内标基因的检测引物：

上游引物：5’-CAAACGAGGGCTGGAACAAGACT-3’

下游引物：5’-CTGTTGACTACGAGCAGGAGATGG-3’

PCR反应程序：

95℃：2min；95℃：10s，60℃：30s，40个循环。

PCR反应体系如下：

实时定量RT-PCR结果如图2所示，AtGLK1基因在两个转基因拟南芥株系(OEGLK1-1和OEGLK1-2)的表达量较野生型拟南芥(Col)显著升高，表明OEGLK1-1和OEGLK1-2是AtGLK1基因过表达的两个转基因拟南芥株系。

实施例4：过表达AtGLK1基因的转基因拟南芥株系花青素含量的定量测定

(1)将拟南芥的种子用1％的次氯酸钠消毒10min，然后无菌水冲洗10次；

(2)配制1/2MS培养基并高温高压灭菌(培养基蔗糖浓度为2％)，1/2MS培养基的配置方法参考王玉英(1983)的方法。将消毒后的拟南芥种子置于1/2MS培养基萌发生长，培养条件：温度为22℃、光照强度为100μEm^-2s^-1、光周期为16h光照/8h黑暗。

(3)将在1/2MS培养基萌发生长5天的拟南芥幼苗取材，然后提取花青素并测定含量。花青素提取的步骤：将拟南芥幼苗用天平称取鲜重，记为W，浸于含有600μL的甲醇—盐酸(体积比：99：1)的提取液中，浸提24h后，分别加入300μL的氯仿和300μL的无菌水，震荡混匀，常温下离心(离心速度：12000rpm，离心时间：10min)。离心后，分别测定上清液在530nm和675nm波长下的吸光值，记为A530和A657，最后通过公式计算样品中花青素的含量，计算公式：(A530-0.25A657)/W，测定结果如图3所示。

上述的实施例结果表明并且确证，本发明所提供的拟南芥AtGLK1基因与植物花青素的含量呈正相关，在植物中过表达该基因可以显著提高转基因植物花青素的含量。因此，本发明的融合基因构建“CaMV 35S-AtGLK1”可作为基因资源在农业生产上应用或选育花青素含量增加的植物新品种，具有广泛的应用价值。

以上仅就本发明的最佳实施例作了说明，但不能理解为是对权利要求的限制。本发明不仅局限于以上实施例，其具体结构允许有变化。凡在本发明独立权利要求的保护范围内所作的各种变化均在本发明保护范围内。

序列表

<110> 江西农业大学

<120> 一种增加植物花青素含量的拟南芥AtGLK1基因及其应用

<130> 2020

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1311

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 1

atgttagctc tgtctccggc gacaagagat ggttgcgacg gagcgtcaga gtttcttgat 60

acgtcgtgtg gattcacgat tataaacccg gaggaggagg aggagtttcc ggatttcgct 120

gaccacggtg atcttcttga catcattgac ttcgacgata tattcggtgt ggccggagat 180

gtgcttcctg acttggagat cgaccctgag atcttatccg gggatttctc caatcacatg 240

aacgcttctt caacgattac tacgacgtcg gataagactg atagtcaagg ggagactact 300

aagggtagtt cggggaaagg tgaagaagtc gtaagcaaaa gagacgatgt tgcggcggag 360

acggtgactt atgacggtga cagtgaccgg aaaaggaagt attcctcttc agcttcttcc 420

aagaacaatc ggatcagtaa caacgaaggg aagagaaagg tgaagactcg attaaatgaa 480

caggtctata atggattcgt atttttttta aaagtggatt ggacaccaga gctacacagg 540

agattcgtgg aggcagtgga acagttagga gtggacaaag ctgttccttc tcgaattctg 600

gagcttatgg gagtccattg tctcactcgt cacaacgttg ctagtcacct ccaaaaatat 660

aggtctcatc ggaaacattt gctagctcgt gaggccgaag cggctaattg gacacgcaaa 720

aggcatatct atggagtaga caccggtgct aatcttaatg gtcggactaa aaatggatgg 780

cttgcaccgg cacccactct cgggtttcca ccaccaccac ccgtggctgt tgcaccgcca 840

cctgtccacc accatcattt taggcccctg catgtgtggg gacatcccac ggttgatcag 900

tccattatgc cgcatgtgtg gcccaaacac ttacctccgc cttctaccgc catgcctaat 960

ccgccgtttt gggtctccga ttctccctat tggcatccaa tgcataacgg gacgactccg 1020

tatttaccga ccgtagctac gagatttaga gcaccgccag ttgccggaat cccgcatgct 1080

ctgccgccgc atcacacgat gtacaaacca aatcttggat ttggtggtgc tcgtcctccg 1140

gtagacttac atccgtcaaa agagagcgtg gatgcagcca taggagatgt attgacgagg 1200

ccatggctgc cacttccgtt gggattaaat ccgccggctg ttgacggtgt tatgacagag 1260

cttcaccgtc acggtgtctc tgaggttcct ccgaccgcgt cttgtgcctg a 1311

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gctctagaat gttagctctg tctccg 26

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcgagctctc aggcacaaga cgcggtc 27

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcgaattctt tttttttttt ttttt 25

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

catcattgcg ataaaggaaa gg 22

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcgacctctc aggcacaaga cgcggtc 27

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tatgacggtg acagtgaccg g 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aactgttcca ctgcctccac g 21

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

caaacgaggg ctggaacaag act 23

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ctgttgacta cgagcaggag atgg 24

Claims

1.一种拟南芥AtGLK1基因在增加拟南芥花青素含量上的应用，其特征在于，构建CaMV35S-AtGLK1融合基因，将其转化拟南芥，获得花青素含量增加的转基因拟南芥，其中拟南芥AtGLK1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。