CN102395265A - 氢过氧化物裂合酶基因和植物对非生物胁迫的耐受性 - Google Patents

Abstract

本发明提供了制备耐受非生物胁迫如干旱或盐的植物的新方法。本发明还提供了耐受非生物胁迫的转基因植物和转基因种子。本发明所述方法包括将含有编码氢过氧化物裂合酶的氢过氧化物裂合酶多核苷酸的重组表达盒引入植物，并选择耐受非生物胁迫的植物。根据本发明所述方法产生的转基因植物和种子相应包含重组表达盒，其含有编码HPL酶的HPL多核苷酸。

Description

氢过氧化物裂合酶基因和植物对非生物胁迫的耐受性

联邦资助的研究与开发下作出发明的权利声明

本发明是在国家科学基金会(National Science Foundation)授与的基金号0543904的政府资助下完成的。政府对本发明拥有某些权利。

发明背景

在动物和植物界，羟脂途径协调多种生物过程以响应发育和环境刺激。羟脂途径的产物源自脂肪酸氧化，并被称作羟脂。在植物中，这些化合物主要源自α-亚麻酸(α-LeA：18:3)和亚油酸(LA：18:2)的氧化。

通过脂肪酶对复合膜脂的作用启动羟脂的生物合成从而释放未酯化脂肪酸。随后，脂肪氧合酶(亚油酸氧氧化还原酶，LOX)将分子氧引入18:2与18:3的9或13位，使之转化成相应的9-或13-氢过氧脂肪酸[9/13-氢过氧十八碳三烯酸(9/13-HPOT)和9/13-氢过氧十八碳二烯酸(9/13-HPOD)](Dhondt，S.等，Plant J.23：431-440，2000；Vick，B.A.，见Moore，T.S.的Lipidmetabolism in plants(植物中的脂质代谢)，佛罗里达的CRC出版公司，167-191页，1993；Brash，A.R.，J.Biol.Chem.274：23679-23682，1999；Narvaez-Vasquez，J.等，Plant Cell 11：2249-2260，1999)。这些氢过氧化物成为4个主要代谢途径后续作用的底物，这些途径是：过氧酶(POX)、二乙烯基醚合酶(DES)、丙二烯氧合酶(AOS)和氢过氧化物裂合酶(HPL)途径(Feussner，I.和Wasternack，C.，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.53：275-297，2002)。认为这些途径中AOS-和HPL-分支是两个主要的关键植物胁迫响应途径。它们竞争相同底物并负责生成脂基信号转导化合物、抗菌和抗真菌化合物以及芳香化合物(Feussner，I.和Wasternack，C.，同上；Howe，G.和Schilmiller，A.L.，Curr.Opin.Plant Bio.5：230-236，2002)。13-LOX的AOS分支转化13-HPOT成茉莉酸家族化合物，其包括茉莉酸(JA)、甲基茉莉酸(MeJA)及其代谢前体，12-氧代-植物二烯酸(12OPDA)(Howe，G.和Schilmiller，A.L，同上)。

尽管拟南芥(Arabidopsis thaliana)具有一种HPL，很多植物品种具有一个以上基因编码HPL酶。例如，有报道截形苜蓿(Medicago truncatula)有两种HPL，而苜蓿和大米各有三种HPL(Noordermeer，M.A.等，Eur.J.Biochem.267：2473-2482，2000；Chehab，E.W.等，Plant Physiol.141：121-134，2006)。植物品种间基因数量的这种变化可反映该途径的差异调节以及最终反映各品种应答不同刺激的多样性。

HPL酶催化9/13-氢过氧化物的切割并产生多种代谢产物。HPL对9-HPOT/HPOD的作用引起参与果实和叶片气味与芳香的杀菌性C9醛和酮酸的升高(Vick，B.A.，见Moore，T.S.，Lipid metabolism in plants(植物的脂质代谢)，佛罗里达的CRC出版公司，167-191页，1993；Brash，A.R.，J.Biol.Chem.274：23679-23682，1999；Matsui，K.，Curr.Opin.Plant Biol.9(3)：274-280，2006；Cho，M.J.等，J.Food Prot.67：1014-1016，2004)。HPL对13-HPOT/HPOD的活性导致生成绿叶挥发物(GLV)，包括Z-3-己烯醛和正己醛，以及其分别通过醇脱氢酶(ADH)产生的相应醇以及酯(Matsui，K.，Curr.Opin.Plant Biol.9(3)：274-280，2006)。酰基转移酶(CHAT)转化Z-3-己烯醇成乙酸Z-3-己烯酯(d′Auria，J.C.等，Plant J.49：194-207，2006)。此外，Z-3-己烯醛异构化从而产生E-2-己烯醛。

已显示三种大米HPL基因(HPL1，HPL2和HPL3)存在的水平和表达方式都不同(Chehab，E.W.等，Plant Physiol.141(1)：121-34，2006)。体外酶试验测得三种对应编码酶的底物特异性，联同其在哥伦比亚-0生态型(Col-0)背景中产生的转基因拟南芥中各关联代谢物情况也不同。Col-0生态型是天然hpl突变型，它表达基因转录物但因10个碱基对缺失而编码功能失调的酶，并因此缺乏C6-醛(Duan，H.等，Plant Physiol.139：1529-1544，2005)。

研究了多种背景中大米HPL3过量表达产生醛的作用(Chehab，E.W.等，PLoS ONE 3(4)：e1904，2008)。已显示，乙酸己烯酯是通过引导三级营养(植物-食草动物-天敌)相互作用调节间接防御响应的主要损伤诱导型挥发信号。

然而，现有技术尚未很好地理解这些代谢途径，特别是氢过氧化物裂合酶在除损伤和昆虫破坏应答以外的植物胁迫响应中的作用。本发明解决这一问题以及其它问题。

发明概述

本发明涉及耐非生物胁迫植物的开发。如本发明不同实施方式所述，提供了制备提高非生物胁迫耐受性和/或其它优势特征—例如，生物量增加、种子产率提高、籽粒更重、籽粒灌浆期更长和/或茎干更强健的植物。根据一个示范性实施方式，本发明涉及转基因植物的制备，所述转基因植物表达氢过氧化物裂合酶序列，优选为异源氢过氧化物裂合酶序列。

本发明所述方法包括将含有编码HPL酶的氢过氧化物裂合酶(HPL)多核苷酸的重组表达盒引入植物群；并选择耐非生物胁迫的植物，其中所述HPL酶包括(L/I)-(F/C)-G-(Y/F)-(Q/R)-(P/K)，其中所述HPL酶还包括(N/D)-K-(Q/I)-C-(A/P)-(G/A)-K-(D/N)。可以用任何已知方法进行所述表达盒的引入步骤。例如，可通过土壤杆菌介导的植物细胞转化、有性杂交或采用植物细胞微粒轰击引入所述表达盒。

根据本发明示范性实施方式的一个方面，所述HPL酶在所述植物群中表达时定位于质体外。在本发明的一些实施方式中，所述HPL酶识别9-氢过氧-十八碳三烯酸(9-HPOT)或9-氢过氧-十八碳二烯酸(9-HPOD)。在本发明的一些实施方式中，所述HPL酶识别13-氢过氧-十八碳三烯酸(13-HPOT)或13-氢过氧-十八碳二烯酸(13-HPOD)。

在本发明的一些实施方式中，所述HPL酶在所述植物群中表达时定位于质体外，其中所述HPL酶识别9-氢过氧-十八碳三烯酸(9-HPOT)或9-氢过氧-十八碳二烯酸(9-HPOD)。在本发明的一些实施方式中，所述HPL酶还识别13-氢过氧-十八碳三烯酸(13-HPOT)或13-氢过氧-十八碳二烯酸(13-HPOD)。

根据本发明的一个示范性实施方式，制备耐非生物胁迫植物的方法包括将含有编码HPL酶的氢过氧化物裂合酶(HPL)多核苷酸的重组表达盒引入植物群，其中所述HPL酶的氨基酸序列与SEQ ID NO.2、4或6至少90％相同，并且选择耐非生物胁迫的植物，其中所述HPL酶在植物群中表达时定位于质体外，其中所述HPL酶识别9-氢过氧-十八碳三烯酸(9-HPOT)或9-氢过氧-十八碳二烯酸(9-HPOD)，还识别13-氢过氧-十八碳三烯酸(13-HPOT)或13-氢过氧-十八碳二烯酸(13-HPOD)。

在本发明的一些实施方式中，所述非生物胁迫是干旱。在本发明的一些实施方式中，所述非生物性胁迫是盐度。

在本发明的一些实施方式中，所述HPL多核苷酸与启动子操作性连接。所选启动子可以是组成型启动子、或诱导型启动子或组织优选的启动子。

在本发明的一些实施方式中，所述HPL酶的氨基酸序列与SEQ ID NO.2、4或6至少90％相同。在本发明的一些实施方式中，所述HPL酶的氨基酸序列与SEQ ID NO.2、4或6至少91％、92％、93％、94％或95％相同。在本发明的一些实施方式中，所述HPL酶的氨基酸序列与SEQ ID NO.2、4或6至少96％、97％、98％或99％相同。在本发明的一些实施方式中，所述HPL酶与SEQ ID NO.2、4或6的氨基酸序列相同性可低于90％，只要所述HPL  酶包括(L/I)-(F/C)-G-(Y/F)-(Q/R)-(P/K)和(N/D)-K-(Q/I)-C-(A/P)-(G/A)-K-(D/N)。在本发明的一些实施方式中，所述HPL多核苷酸是SEQ ID NO.1、3或5。

所述HPL多核苷酸可引入任何能转化重组表达构建物的植物中。本文优选在水稻(Oryza sativa)中表达。根据本发明的各种示范性实施方式，可使用实用性相当的其它双子叶或单子叶植物。

本发明还涉及耐非生物胁迫的转基因植物。本发明所述转基因植物具有提高的非生物胁迫耐受性和/或其它优势特征，例如，生物量增加、种子产率提高、籽粒更重、籽粒灌浆期更长和/或茎干更强健。本发明涉及表达氢过氧化物裂合酶的转基因植物。

本发明所述转基因植物包含重组表达盒，其中含有编码HPL酶或其任何活性片段的HPL多核苷酸，其氨基酸序列或者与SEQ ID NO.2、4或6相同，或与SEQ ID NO.2、4或6的相同性足以获得与SEQ ID NO.2、4或6相似的功能性，其中所述转基因植物不是拟南芥。这些转基因植物的一种实施例是水稻(Oryza sativa)。

本发明还涉及来自本发明所述转基因植物的转基因种子。这些转基因种子的一种实施例是来自本发明所述转基因植物的转基因水稻种子。

附图简要说明

图1：HPL1和HPL2品系暴露于200mM盐的存活测试。数据表示为平均值±标准差。

图2：HPL品系暴露于干燥的存活测试。过量表达HPL1至3的品系分别定名为OsHPL1 OE、OsHPL2 OE和OsHPL3 OE；过量表达HP-3减去酶氨基末端质体转运肽前15个氨基酸的品系定名为OsHPL3-TP OE。数据表示为平均值±标准差。

发明详述

I.定义

术语“HPL多核苷酸”是指源自氢过氧化物裂合酶多肽编码基因及编码保留了氢过氧化物裂合酶酶活性的多肽的多核苷酸。HPL编码氢过氧化物裂合酶。从大米中分离出多个HPL基因，包括HPL1、HPL2和HPL3。本文所用术语涵盖的多核苷酸包括天然氢过氧化物裂合酶序列及其修饰和片段。本文所用术语HPL多核苷酸涵盖的多核苷酸分别包括天然氢过氧化物裂合酶序列及编码活性HPL多肽的修饰和片段。

术语“HPOT”指氢过氧-十八碳三烯酸。术语“HPOD”指氢过氧-十八碳二烯酸。术语“9-HPOT”指9-氢过氧-十八碳三烯酸。术语“9-HPOD”指9-氢过氧-十八碳二烯酸。术语“13-HPOT”指13-氢过氧-十八碳三烯酸。术语“13-HPOD”指13-氢过氧-十八碳二烯酸。

术语“多肽”指氨基酸聚合物，可包括全长蛋白质、多肽及其片段。本发明中，“HPL多肽”指具有至少一种HPL功能的多肽。

因此，本发明的术语“HPL多核苷酸”和“HPL多肽”可包括多核苷酸或多肽序列的变化，只要所述变化产生的分子显示HPL活性。因此，所述多核苷酸或多肽可以与参比序列(例如，SEQ ID NO：1-6)基本相同。所述序列相同性可低于90％，只要所述HPL酶包括(L/I)-(F/C)-G-(Y/F)-(Q/R)-(P/K)和(N/D)-K-(Q/I)-C-(A/P)-(G/A)-K-(D/N)。尽管一些天然HPL分子定位在质体内，一些定位在质体外。将通常定位在质体内的多肽定位到质体外的一个好方法是去除其质体转运肽的初始15个氨基酸或将其氨基末端与另一蛋白质融合并确认其不定位于质体。去除转运肽不应影响酶活性；但是，一些突变分子显示的活性可能和天然分子不在同一水平。本文所述多核苷酸的修饰通常包括天然HPL序列的缺失、添加和取代。这些修饰可以是有意的，例如通过定点诱变，或者可以是意外的，例如通过表达多核苷酸的植物的突变或PCR扩增所致差错。所述术语包括所表达野生型序列的等位基因变体，该变体可能由正常遗传改变产生或由基因工程方法生成并产生HPL活性。

涉及本发明核酸或多核苷酸的术语“异源”指来自外来物种或来自相同物种经某些方式改变(例如，突变、添加多拷贝、与非天然启动子或增强子序列连接等)的核酸或多核苷酸。

术语“质体”指植物内的细胞器，包括但不限于叶绿体和色质体。

术语“后代”通常指杂交的子代，包括直接F1代以及此后的F2、F3等代。

术语“渐渗”通常指来自一个物种的基因通过遗传杂交进入另一物种的基因库。这通常通过种间杂交株与其亲本之一的重复回交实现。

如本文所用，术语“非生物胁迫”或“非生物胁迫条件”指植物、植物细胞等暴露于对植物代谢、生长、发育、增殖和/或生存(总称“生长”)有副作用的非生存性(“非生物”)物理或化学试剂或条件。例如，可由于环境因素如水分过量或不足(例如水淹、干旱、脱水)、厌氧条件(例如氧水平低)、异常渗透条件、盐度或温度(例如，高温/热度、冷、冻、霜)、缺乏营养或暴露于污染物，或通过激素、第二信使或其它分子向植物施加非生物胁迫。例如，厌氧胁迫是由于足以产生胁迫响应的氧水平减少(低氧或缺氧)。淹水胁迫可因为植物、植物部分、组织或分离细胞长时或瞬时浸没在液体培养基中，例如发生在雨季、潮湿季节、突发洪水或植物过量灌溉等。冷胁迫或热胁迫可分别因为温度从特定植物物种的最优生长温度范围降低或升高而发生。本领域技术人员可以容易地测定或已知这种最优生长温度范围。脱水胁迫可通过细胞、组织、器官或整株植物的水分损失、膨压降低或水含量减少而引起。干旱胁迫可通过细胞、组织、器官或生物体的水分剥夺或水分供给减少引起或与其相关。盐水胁迫(盐胁迫)可与细胞胞内或胞外环境渗透势的扰动相关或由其引起。例如，渗透胁迫也可与植物细胞胞内或胞外环境的分子浓度变化相关或由其引起，特别是当所述分子不能跨植物细胞膜分隔时。

植物对非生物胁迫的响应包括生成过量活性氧物质(ROS)，包括单线态氧、超氧化物、过氧化氢和羟基自由基，它们作为信号转导分子并在防御机制启动中起作用。ROS在植物中参与多种环境胁迫。过度的极端温度、水胁迫，由盐度、空气污染和机械伤害(例如昆虫吮吸或咀嚼引起的损伤或风造成的破损等)引起的离子失衡导致通过ROS传播化学信号。对胁迫的适应将涉及通过一种或多种抗氧化酶或化合物如超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽、抗坏血酸、类胡萝卜素等消隐ROS信号。当环境胁迫超过植物的消隐系统时，可通过ROS发生过度且快速的变性反应，例如蛋白质变性和脂质过氧化。当部分的耐受性改善机理包括改进氧化性或ROS胁迫的消减时，所述对一种特定非生物胁迫如干旱的耐受性改善可赋予对另一胁迫如高亮度或热耐受性的相似改善。

当充分高的温度保持充分长时间足以导致植物功能、发育和/或产率发生不可逆损伤时，植物承受热胁迫。热胁迫可对生殖发育有不利影响并降低产率(异常生物量和/或果实与种子)。当承受极端热胁迫时，植物可能无法存活。

本发明提供比相应参比植物更耐受胁迫条件的遗传修饰植物，其可以是转基因植物。如本文所用，用于植物的胁迫条件的术语“耐受”指所述特定植物在暴露于胁迫条件时，其响应所述条件的效果比相应参比植物(天然产生的野生型植物或不含本发明构建物的植物)轻或没有影响。因此，本发明涵盖的植物显示由于非生物胁迫耐受性提高而改善农艺学性能和在更大变化条件下生长更好，例如生物量提高和/或产率更高和/或产生更多种子。优选地，在相应参比植物显示生长、产率、代谢或活力降低，或雄性或雌性不育率提高的环境条件下，所述转基因植物能基本正常生长。

如本文所用，术语“耐干旱”指植物在缺水胁迫条件下更理想的生产能力。当水的蒸散需求超出水供给时，产生缺水胁迫。缺水胁迫程度可重可轻(例如数天或数周很少或没有可用水)，但与干旱敏感型植物相比，耐干旱植物将显示更好的生长和/或胁迫恢复。

如本文所用，术语“用水效率”指植物每单位用水的更理想生产能力。所用水可以是降水或灌溉的结果。

如本文所用，术语“耐盐”指植物在盐度胁迫条件下更理想的生产能力。对每个物种，土壤和/或水盐度(常表示为导电性或E.C.)的临界值不同，耐盐植物在产率降低前具有更高的盐度临界值。耐盐也指产率对超出临界值的水和/或土壤盐度的敏感度。因此，耐盐植物中每单位盐度(E.C.)对产率的影响低于盐敏感植物。耐盐指临界值提高和/或超出临界值时产率对盐度灵敏度降低。

术语“植物”包括完整植株、枝条营养器官/结构(例如叶、茎干和块茎)、根、花和花器官/结构(例如，苞、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花粉囊和胚珠)、种子(包括胚芽、胚乳和种皮)和果实(成熟子房)、植物组织(例如，维管组织、基本组织等)和细胞(例如，保卫细胞、卵细胞、毛状体等)及其后代。本发明所述方法可用的植物种类通常宽泛到可使用转化技术的高等和低等植物，包括被子植物(单子叶和双子叶植物)、裸子植物、蕨类和多细胞藻类。其包括各倍体水平的植物，包括非整倍体、多倍体、二倍体、单倍体和半合子。

如本文所用，“转基因植物”包括其基因组内含有异源多核苷酸的植物。通常，所述异源多核苷酸稳定掺入基因组使所述多核苷酸传递至后续世代。所述异源多核苷酸可以单独或作为重组表达盒的部分掺入基因组。本文所用“转基因”包括因存在异源核酸而改变基因型的任何细胞、细胞系、胼胝体、组织、植物部分或植物，包括初始如此改变的转基因体以及从初始转基因体通过有性杂交或无性繁殖所产生的。如本文所用，术语“转基因”不包括通过常规植物育种方法或通过天然发生事件如随机杂交受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变产生的基因组(染色体或染色体外)改变。

术语“表达盒”指用于在任何细胞内的组成型或诱导型地体外或体内表达本发明所述核酸序列的任何重组表达系统，所述细胞除植物细胞以外还包括原核、酵母、真菌、昆虫或哺乳动物细胞。所述术语包括线性和环状表达系统。所述术语包括所有载体。所述盒可保持游离或掺入宿主细胞基因组。所述表达盒可具有自主复制的能力或不具有该能力(即，在细胞中仅驱动瞬时表达)。所述术语包括仅含所述重组核酸转录所需最少元件的重组表达盒。

术语“组成型”或“组成型地”指本发明所述多肽在根据本发明各示范性实施方式所述方法的植物中的时间和空间表达。术语“组成型”或“组成型地”指本发明所述多肽在植物组织中的表达延续所述植物整个生命，特别是在其完整生长周期中。在一些实施方式中，本发明所述多肽在所有植物组织中组成型表达。在一些实施方式中，本发明所述多肽在根、叶、茎、花和/或果实中组成型表达。在本发明的其它实施方式中，本发明所述多肽在根、叶和/或茎中组成型表达。

术语“诱导型”或“诱导型地”指在没有诱导剂时，本发明所述多肽不表达或以极低水平表达。本发明所述多肽的表达响应诱导剂而被强烈诱导。

术语“诱导剂”用于指影响诱导型调控元件转录的化学、生物或物理试剂或环境条件。在对诱导剂的响应中，诱导型调控元件的转录通常从头启动在基底或组成型表达水平上提高。可采用本文公开的方法鉴定这种诱导，包括检测所述调控元件操作性连接的核苷酸序列的RNA转录水平的提高、所述核苷酸序列编码多肽表达的提高、或所述编码多肽表达所赋予的表型。

术语“同源物”用于指在结构和进化起源上与另一物种的一个基因相似的基因。在HPL基因的情况中，同源物编码的蛋白质属于细胞色素P450家族并含有名为I-、K-螺旋和血红素结合域的典型特征结构域，其催化切割9/13-氢过氧化物产生相应的代谢物，包括但不限于，9-氢过氧-十八碳三烯酸/氢过氧-十八碳二烯酸的C9醛与酮酸，以及13-氢过氧-十八碳三烯酸/氢过氧-十八碳二烯酸的C8醛、己烯醛和己醛。系统发生分析的描述参见Chehab等(J.Integrative Plant Biol.49(1)：43-51，2007)，对来自多个物种HPL同源物的序列比对显示HPL共有序列(L/I)-(F/C)-G-(Y/F)-(Q/R)-(P/K)和(N/D)-K-(Q/I)-C-(A/P)-(G/A)-K-(D/N)。由于基因组序列可得到，可采用本领域已知方法鉴定来自其它物种的额外HPL同源物。

本发明的短语“基本相同”指多核苷酸或多肽与参比序列(例如，SEQ IDNO：1-6中之一)的序列相同性足以使之在植物中表达时实现与参比序列相似的功能性。根据本发明所述示范性实施方式的一个方面，显示与参比序列(例如，SEQ ID NO：1-6中之一)至少90％序列相同性的多核苷酸或多肽可认为是“基本相同”；但是，根据本发明的多个示范性实施方式，只要实现必需的功能性，显示序列相同性低于90％(甚至显著更低，如60％-70％或更低)的多核苷酸或多肽可以与其参比序列“基本相同”。或者，百分比相似性可以是90％-100％之间的任意值。更优选的实施方式至少包括：本文所用序列与参比序列用本文所述程序相比有90％、95％或99％相同；优选采用标准参数的BLAST，如下文所述。多核苷酸和多肽的序列相同性可低于90％，只要所述HPL酶包括(L/I)-(F/C)-G-(Y/F)-(Q/R)-(P/K)和(N/D)-K-(Q/I)-C-(A/P)-(G/A)-K-(D/N)。

对于序列比较，一般将一种序列用作与测试序列相比的参比序列。使用序列比较算法时，测试和参比序列均输入计算机，必要时指定子序列坐标，指定序列算法程序参数。可使用默认的程序参数，或者可指定另外的参数。然后，该序列比较算法根据程序参数计算出测试序列相对于参比序列的序列相同性百分数。

本文所用的“比较窗”包括参考任意数量的连续位置的区段，例如20-600，通常约50-200，更常是约100-150，对两个序列进行最优比对后，可将该序列与相同数量连续位置的参比序列作比较。若未提供范围，所述比较窗为参比序列的全长。比对序列的比较方法是本领域熟知的。可进行最优序列比对以作比较[例如，通过Smith和Waterman的局部同源性算法，Adv.Appl.Math.2：482(1981)；通过Needleman和Wunsch的同源性比对算法，J.Mol.Biol.48：443(1970)；通过Pearson和Lipman的相似性搜索法，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85：2444(1988)；通过计算机执行这些算法(遗传学计算组(Genetics Computer Group)的威斯康星遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，威斯康星州麦迪逊(Madison，WI)科学大道(Science Dr.)575号)，或通过手工比对和目测]。

适合测定序列相同性和序列相似性百分数的算法的例子是BLAST算法，参见Altschul，S.F.等，J Mol Biol 215：403-410(1990)。进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)从公开渠道获得。此算法包括：首先通过鉴定查询序列中长度为W的短字来鉴定高评分序列对(HSP)，与数据库序列中长度相同的字比对时它们能匹配或满足一些正值的阈值评分T。T称为相邻字评分阈值(Altschul，S.F.等，同上)。这些初始相邻字命中用作启动搜索的种子，以便找到含有它们的较长HSP。该字命中在沿各序列的两个方向上延伸，只要可提高累积比对评分。出现以下情况时中止字命中在各个方向上的延伸：累积比对评分比最大获得值降低X；由于一个或多个负评分残基比对的累积，累积评分变为零或零以下；或者达到各序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLAST程序使用的默认值为：字长(W)为11、BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915(1989))、比对(B)为50、期望值(E)为10、M＝5、N＝-4以及比较两条链。

BLAST算法也对两种序列进行相似性的统计学分析(参见例如，Karlin和Altschul，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 90：5873-5787(1993))。BLAST算法提供的一种相似性测量是最小概率和(P(N))，它表明两个核苷酸或氨基酸序列之间偶尔发生匹配的概率。例如，如果测试核酸与参比核酸的比较中最小概率和小于约0.2，优选小于约0.01，更优选小于约0.001，则认为该核酸类似于参比序列。

II.核酸

根据本发明示范性实施方式的一个方面，多核苷酸可包括(a)编码SEQID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6多肽的多核苷酸，包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5的示范性多核苷酸；(b)与(a)的多核苷酸有特定序列相同性的多核苷酸；(c)SEQ ID NO：1、3和5的同源物；(d)(a)、(b)或(c)多核苷酸的互补序列；以及(e)任何(a)、(b)、(c)或(d)的活性片段。

本发明提供分离的RNA、DNA核酸及其类似物和/或嵌合体等，包括本发明所述多核苷酸。

A.编码本发明所述多肽的多核苷酸

本发明提供包含本发明所述多核苷酸的分离核酸，其中所述多核苷酸编码本发明所述多肽或其活性片段。依据遗传编码，本文所述编码多肽的各核酸序列也描述该核酸的每种可能的沉默变异。本领域普通技术人员认识到，可修饰核酸中的各个密码子(除了AUG和UGG，AUG通常是甲硫氨酸的唯一密码子，UGG通常是色氨酸的唯一密码子)，以产生功能相同的分子。因此，编码本发明所述多肽的核酸的各沉默变异均隐含在各所述多肽序列中，并在本发明的范围内。因此，本发明包括本发明的多核苷酸和编码本发明所述多肽的多核苷酸。

B.与(A)的多核苷酸具有特定序列相同性的多核苷酸

根据不同的示范性实施方式，本发明提供含上文所述HPL多核苷酸的分离HPL核酸，其中所述HPL多核苷酸与上文(A)部分所公开多核苷酸在核苷酸水平上具有特定的相同性。例如，可采用BLAST算法在默认条件下计算相同性百分数。

C.作为同源物的多核苷酸

本发明提供的分离HPL核酸包含作为SEQ ID NO：1、3和5同源物的HPL核苷酸。Chehab等描述了一些HPL同源物(J.Integrative Plant Biol.49(1)：43-51，2007)，可采用本领域已知方法鉴定其它同源物，并且由于其它基因组序列可得到，能鉴定来自其它物种的补充HPL同源物。

D.与(A)-(C)的多核苷酸互补的多核苷酸

本发明提供的分离核酸包括与上文A-B部分的多核苷酸互补的多核苷酸。本领域技术人员应当理解，互补序列在其全长内与(A)-(C)部分的多核苷酸碱基配对(即序列在其全长内100％互补)。在双链核酸中互补碱基通过氢键连接。例如，下列碱基对是互补的：鸟嘌呤和胞嘧啶；腺嘌呤和胸腺嘧啶；以及腺嘌呤和尿嘧啶。此外，本领域技术人员应当理解，在全部重叠区碱基配对(即在重叠区100％互补，但在其全长内不是100％互补)的序列可以是互补的。另外，尽管互补度较低(例如60％-70％或更低)，不是100％互补的序列仍可作为反义构建物，并因此能实现本发明此方面所述功能。

III.核酸的构建

可采用标准重组方法、合成技术及其组合或任何现在已知或此后开发用于制备此类核酸的其它方法制备本发明所述分离的核酸。

A.用于构建核酸的重组方法

可采用本领域技术人员现在已知或此后设计的任意数量克隆方法从植物生物来源(例如植物的组织)获得本发明的分离核酸组合物。在一些实施方式中，采用在严格条件下与本发明所述多核苷酸选择性杂交的寡核苷酸探针鉴定cDNA或基因组DNA文库中的所需序列。本领域普通技术人员熟知RNA的分离和cDNA以及基因组文库的构建。参见例如，PlantMolecular Biology：A Laboratory Manual(植物分子生物学：实验手册)，Clark编著，Springer-Verlag，柏林，1997；和Current Protocols in Molecular Biology(新编分子生物学实验指南)，Ausubel等编著，格林出版公司(GreenePublishing)和Wiley-Interscience，纽约，1995。

A1.基因组DNA

可直接从水稻分离的基因组DNA中获得本发明所述分离的核酸组合物(Chehab等，Plant Phys.141：121-134，2006)。

A2.cDNA文库

已描述了提供富集全长cDNA文库的多种cDNA合成方案。构建富集的全长cDNA文库以包含所有含插入片段克隆中的至少60％，更优选至少70％、80％、90％或95％全长插入片段。这些文库中插入片段的长度可以是至少2、3、4、5、6、7、8、9、10千碱基(kb)对或更长。容纳这些尺寸插入片段的载体是本领域已知并有市售。参见例如，Stratagene公司的λZAP表达系统(lambda ZAP Express，克隆容量为0-12kb的cDNA克隆载体)。Carninci等描述了构建大于95％纯全长cDNA文库的示范性方法，Genomics37：327-336，1996。本领域已知生成全长文库的其它方法。参见例如，Edery等，Mol.Cell Biol.15(6)：3363-3371，1995；和PCT专利申请WO/1996/034981。

非均一化或消减cDNA文库还可根据标准方法用于构建本发明所述核酸。

可采用基于本发明所述HPL多核苷酸序列如本文所公开序列的探针筛选cDNA或基因组文库。探针可用于与基因组DNA或cDNA序列杂交以分离相同或不同植物物种内的同源基因。本领域技术人员应当理解，试验中可采用不同的杂交严谨程度；且杂交或清洗介质可以严格。

还可采用扩增技术从核酸样品中扩增感兴趣的核酸。例如，可使用聚合酶链反应(PCR)技术直接从基因组DNA或cDNA文库扩增本发明所述多核苷酸序列和相关基因。PCR和其它体外扩增方法也可用于，例如，克隆编码待表达蛋白质的核酸序列，制备核酸用作检测样品中是否存在所需mRNA、核酸测序或其它目的的探针。可用T4基因32蛋白(勃林格殷格翰公司(Boehringer Mannheim))改善长PCR产物的得率。

已描述基于PCR的筛选方法。Wilfinger等描述了基于PCR的方法，其中在第一步中鉴定最长的cDNA从而可以去除研究中的不完全克隆(BioTechniques 22(3)：481-486，1997)。这些方法与上述全长cDNA构建方法联合时尤其有效。

B.用于构建核酸的合成方法

本发明所述分离的核酸还可通过直接化学合成制备，例如用Narang等的磷酸三酯法，Meth.Enzymol.68：90-99，1979；Brown等的磷酸二酯法，Meth.Enzymol.68：109-151，1979；Beaucage等的二乙基亚磷酰胺法，Tetra.Letts.22：1859-1862，1981；Beaucage和Caruthers描述的固相亚磷酰胺三酯法，Tetra.Letts.22(20)：1859-1862，1981；例如使用自动合成仪，如Needham-VanDevanter等所述，Nucleic Acids Res.12：6159-6168，1984；以及美国专利第4,458,066号所述固相载体法。化学合成通常产生单链寡核苷酸。这可通过与互补序列杂交或用单链作为模板由DNA聚合酶进行聚合化而转化成双链DNA。技术人员应当理解，尽管DNA的化学合成最好用于约100个碱基或更短的序列，但可通过连接较短序列获得更长的序列。

IV.重组表达盒

根据示范性实施方式的另一方面，本发明提供包含本发明所述核酸的重组表达盒。编码本发明所需多核苷酸的核酸序列，例如编码本发明所述全长多肽的cDNA或基因组序列，可用于构建能引入所需宿主细胞的重组表达盒。重组表达盒通常包含与转录起始调控序列操作性连接的本发明所述多核苷酸，该调控序列指导所述多核苷酸在意向宿主细胞如转化植物组织内的转录。

例如，植物表达载体可包括(1)在5′和3′调控序列的转录控制下的克隆植物基因和(2)显性选择标记。需要时，这些植物表达载体还可包含启动子调控区(例如，赋予诱导型或组成型、环境或发育调节、或细胞或组织特异性/选择性表达)、转录起始位点、核糖体结合位点、RNA加工信号、转录终止位点和/或聚腺苷酸信号。

A.载体

本领域熟知可用于在高等植物中基因表达的典型载体。已描述了适合稳定转化植物细胞或建立转基因植物的多种表达载体，包括Weissbach和Weissbach，Methods for Plant Molecular Biology(植物分子生物学方法)，学术出版社(Academic Press)，1989，和Gelvin等，Plant Molecular BiologyManual(植物分子生物学手册)，克鲁学术出版社(Kluwer AcademicPublishers)，1990所述载体。具体示例包括来自根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的肿瘤诱导(Ti)质粒或根诱导(Ri)质粒，以及Herrera-Estrella，L.等(Nature 303：209，1983)，Bevan，M.(Nucl.Acids Res.12：8711-8721，1984)和Klee，H.J.(Bio/Technology 3：637-642，1985)中公开的用于双子叶植物的载体。可采用农杆菌介导转化将Ti衍生质粒转移至单子叶和双子叶物种内(Ishida等，Nat.Biotechnol.14：745-50，1996；Barton等，Cell32：1033-1043，1983)。本文所用示范性根瘤土壤杆菌质粒是Schardl等(Gene61：1-11，1987)和Berger等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：8402-6，1989)的pKYLX6和pKYLX7质粒。本文另一个有用的质粒是来自加利福尼亚州帕洛阿尔托的克隆技术实验室公司(CLONTECH Laboratories，Inc.，Palo Alto，Calif.)的pBI101.2。

或者，可使用非Ti载体采用游离DNA递送技术将DNA转移至植物和细胞内。例如，这些方法可包括使用脂质体、电穿孔、微粒轰击、碳化硅晶须和病毒。未成熟胚胎也可以是采用颗粒枪进行直接DNA递送技术(Weeks，T.等，Plant Physiol.102：1077-1084，1993；Vasil，V.，Bio/Technology10：667-674，1993；Wan，Y.和Lemeaux，P.，Plant Physiol.104：3748，1994)和用于农杆菌介导DNA转移(Ishida等，Nature Biotech.14：745750，1996)的良好靶组织。

B.启动子

B 1.组成型启动子

多种启动子可用于实施本发明。可使用在再生植物所有组织中指导本发明所述多核苷酸表达的植物启动子片段。这些启动子在本文中称为“组成型”启动子，并在大多数环境条件和发育状态或细胞分化中是活性的。组成型启动子的示例包括椰菜花叶病毒(CaMV)35S转录起始区。

B2.诱导型启动子

或者，所述植物启动子可以在环境控制下指导本发明所述多核苷酸的表达。这些启动子在本文中称为“诱导型”启动子。可通过诱导型启动子影响转录的环境条件包括生物胁迫、非生物胁迫、盐胁迫、干旱胁迫、病原体侵袭、厌氧条件、冷胁迫、热胁迫、低氧胁迫或光的存在。

诱导型启动子的示例包括但不限于，盐诱导型启动子rd29A(Kasuga，M.等，Nature Biotechnol.17，287-291，1999)，玉米的干旱诱导型启动子(Busk等，Plant J.11：1285-1295，1997)；马铃薯的冷、干旱和高盐诱导型启动子(Kirch，Plant Mol.Biol.33：897-909，1997)，光诱导型启动子PPDK，来自酮糖-1，5-二磷酸氢羧化酶小亚基(ssRUBISCO)的光诱导型启动子，低氧或冷胁迫诱导型启动子Adh1，热胁迫诱导型启动子Hsp70启动子，和本领域已知的很多冷诱导型启动子，例如拟南芥(Arabidopsis thaliana)的rd29a和cor15a启动子(GenBank ID：D13044和U01377)、大麦的bltlOl和blt4.8(GenBank ID：AJ310994和U63993)、小麦的wcsl20(GenBank ID：AF031235)和玉米的mlipl5(GenBank ID：D26563)。

已描述的其它诱导型启动子包括ABA-和膨压诱导型启动子、植物生长素结合蛋白基因的启动子(Schwob等，Plant J.4(3)：423-432，1993)、UDP葡萄糖类黄酮糖基转移酶基因启动子(Ralston等，Genetics 119：185-197，1988)、MPI蛋白酶抑制剂启动子(Cordero等，Plant J.6(2)：141-150，1994)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子(Kohler等，Plant Mol.Biol.29(6)：1293-1298，1995；Quigley等，J.Mol.Evol.29(5)：412-421，1989；Martinez等，J.Mol.Biol.208(4)：551-565，1989)。

B3.组织优选启动子

发育控制的启动子示例包括仅仅或优选在某些组织，例如叶、根、果实、种子或花中启动转录的启动子。有时称这些启动子为组织优选启动子。示范性启动子包括花粉囊特异性启动子5126(美国专利第5,689,049和5,689,051号)、glob-1启动子和γ-玉米醇溶蛋白基因启动子。MS8-15(PCT公开号WO 98/00533)是用于叶和杆优选表达的示范性启动子。种子优选启动子的示例包括但不限于，27kDγ-玉米醇溶蛋白基因启动子和蜡质基因启动子(Boronat，A.等，Plant Sci.47：95-102，1986；Reina，M.等，Nucleic AcidsRes.18(21)：6426，1990；和Kloesgen，R.B.等，Mol.Gen.Genet.203：237-244，1986)。PCT公开号WO 00/11177和WO 00/12733中公开了在胚胎、果皮和胚乳中表达的启动子，它们均通过引用纳入本文。启动子的操作也可根据其在基因组中的位置而不同。因此，发育调控的启动子可以在某些位置是完全或部分组成型的。需要时，也可修饰发育调控启动子用于弱表达。

异源和非异源(即，内源)启动子都可用于指导本发明所述核酸的表达。这些启动子还可用于如重组表达盒以驱动反义核酸的表达从而降低、提高或改变本发明所述蛋白质在所需组织中的浓度和/或组成。因此，在一些实施方式中，所述核酸构建物将含有操作性连接本发明所述多核苷酸的在植物细胞例如玉米(Zea mays)中有功能的启动子。这些实施方式所用的启动子包括驱动本发明所述多肽表达的内源启动子。

在一些实施方式中，作为启动子或增强子元件的分离核酸可引入本发明所述多核苷酸非异源形式的合适位置(通常在上游)从而上调或下调本发明所述多核苷酸的表达。例如，可在体内通过突变、缺失和/或取代来改变内源启动子(参见Kmiec，美国专利第5,565,350号和Zarling等，美国专利第5,763,240号)，或者分离的启动子可以从本发明所述基因的适当方向和适当距离引入植物细胞内从而控制所述基因的表达。可在适合植物生长的条件下调节基因表达，从而改变植物细胞内本发明所述多肽的总浓度和/或改变其组成。因此，本发明提供了用于制备与本发明所述多核苷酸的天然、内源(即，非异源)形式操作性连接的异源启动子和/或增强子的组合物及方法。

根据其它示范性实施方式，本发明所述表达盒还可包括增强子元件、聚腺苷酸区段、内含子增强元件、选择性标记和/或终止子元件。

本发明所述表达盒可用于赋予几乎任何植物非生物胁迫耐受性。具体地，本发明可用于单子叶如谷物植物，例如燕麦属(Avena)、大麦属(Hordeum)、水稻属(Oryza)、黑麦属(Secale)、高粱属(Sorghum)、小麦属(Triticum)和玉蜀黍属(Zea)。本发明还对广范围的植物有用，包括以下属的物种：天门冬(Asparagus)、颠茄(Atropa)、芸苔(Brassica)、柑橘(Citrus)、西瓜(Citrullus)、辣椒(Capsicum)、黄瓜(Cucumis)、南瓜(Cucurbita)、胡萝卜(Daucus)、草莓(Fragaria)、大豆(Glycine)、棉(Gossypium)、向日葵(Helianthus)、萱草(Heterocallis)、莨菪(Hyoscyamus)、莴苣(Lactuca)、亚麻(Linum)、黑麦(Lolium)、番茄(Lycopersicon)、苹果(Malus)、木薯(Manihot)、马郁兰(Majorana)、苜蓿(Medicago)、烟草(Nicotiana)、稷(Panieum)、狼尾草(Pannesetum)、鳄梨(Persea)、豌豆(Pisum)、梨(Pyrus)、李(Prunus)、萝卜(Raphanus)、千里光(Senecio)、白芥(Sinapis)、茄(Solanum)、胡卢巴(Trigonella)、葡萄(Vitis)和豇豆(Vigna)。在本发明的一些实施方式中，本发明所述表达盒用于赋予耐干旱性。在本发明的一些实施方式中，本发明所述表达盒用于赋予耐盐性。

V.植物转化

一旦构建出含本发明所述多核苷酸的表达盒，可使用任何已知技术或本领域技术人员此后设计的技术将所述多核苷酸引入植物。例如，参见Ammirato等Handbook of Plant Cell Culture--Crop Species(植物细胞培养手册—作物品种)，麦克米兰出版公司(Macmillan Publ.Co.)1984；Shimamoto等，Nature 338：274-276，1989；Fromm等，Bio/Technology 8：833-839，1990；和Vasil等，Bio/Technology 8：429-434，1990中所描述的方案。

植物的转化和再生是本领域公知的，本领域技术人员能确定本发明具体实施方式中最适转化技术的选择。合适的方法可包括但不限于：植物原生质体电穿孔；脂质体介导的转化；聚乙二醇(PEG)介导的转化；使用病毒的转化；植物细胞的微注射；植物细胞微粒轰击；真空浸润；和根瘤土壤杆菌介导的转化。转化意味着以引起所述序列稳定或瞬时表达的方式将核苷酸序列引入植物中。这些方法在不同植物中的示例包括：美国专利第5,571,706；5,677,175；5,510,471；5,750,386；5,597,945；5,589,615；5,750,871；5,268,526；5,780,708；5,538,880；5,773,269；5,736,369和5,610,042号。

转化以后，优选采用掺入转化载体的显性选择性标记选择植物。通常，这种标记将赋予转化植物抗生素或除草剂耐受性，可通过将所述植物暴露于适当浓度的所述抗生素或除草剂而实现转化株的选择。

所述经转化的细胞可根据常规方式长成植物。参见例如，McCormick等，Plant Cell Reports 5：81-84，1986。然后，这些植物可以生长，用相同转化植株或不同植株授粉，鉴定具有所需表型特征的所得杂交株。可生长2代或2代以上以确保目标表型特征稳定保持且被遗传，随后收集种子确保实现所需表型或其它特性。

VI.用遗传杂交生成转基因植物

本发明涉及产生耐非生物胁迫的植物的方法，通过将本发明所述核酸从供体植物转移入不具非生物胁迫耐受性的受体植株中，从而赋予所述受体植株该非生物胁迫耐受性特质。

因此，实现这种转移的一种方法是通过所述植物杂交将赋予或有助于这一特质的核酸序列从耐非生物胁迫的供体植物渐渗入不具非生物胁迫耐受性的受体植物内。因而，可采用传统育种技术适当实现这一转移。

在一种方法中，显示非生物胁迫耐受性并包含本发明所述核酸的供体植物与不具非生物胁迫耐受性并优选显示如籽粒更重、籽粒灌浆期更长和茎干更强健等商用理想性质的植物杂交。然后，使所得植物群体(代表F1杂交株)自花授粉并获得种子(F2种子)。然后，用本文所述任意方法筛选非生物胁迫耐受性的F2种子。

可采用轮回选择和回交、自体和/或双单倍体或用于制备亲本品系的任意其它方法产生近交的耐非生物胁迫植株系。在选择和回交的方法中，非生物胁迫耐受性特质可渐渗入靶受体植物(称为回归亲本)，通过将所述回归亲本与第一供体植物(不同于回归亲本，本文中称为“非回归亲本”)杂交实现。所述回归亲本无非生物胁迫耐受性并具有商用理想性质的植物。

所述非回归亲本显示非生物胁迫耐受性并包含本发明所述核酸，其中本发明所述多肽的表达强于不具非生物胁迫耐受性的植物。所述非回归亲本可以是与所述回归亲本杂交繁殖的任何植物品种或近交品系。回归亲本和非回归亲本之间杂交所得后代与回归亲本进行回交。然后，筛选所得植物群体。随后，选出包含本发明所述必需核酸的F1杂交植物，自花授精并选择多代以使得所述植物愈加近交。这一持续自花授精和选择的过程可进行2-5代或更多代。该育种和选择的结果是产生与非生物胁迫耐受性相关基因以及与商用利益特质相关的其它基因具有遗传同源性的品系。

可以根据多种熟知技术中的任意技术测试非生物胁迫耐受性。可通过用熟知的知方法比较经处理植物与对照(参比)植物来确定根据本发明所述方法修饰的提高了对引发胁迫条件耐受性的植物。例如，可通过使所述植物在含盐水平超出相应参比植物能够生长的介质所含盐量约100％的介质如土壤中生长来鉴定盐胁迫耐受性提高的植物。有利地，根据本发明所述方法处理的植物可生长的介质或土壤的含盐水平为相应参比植物能生长的介质或土壤的盐水平的至少约110％，优选至少约150％，更优选至少约200％，最优至少约400％。具体地，该处理植物可在含盐至少40mM，通常至少100mM，特定至少200mM，优选至少300mM的介质或土壤中生长，盐包括例如，水溶性无机盐如硫酸钠、硫酸镁、硫酸钙、氯化钠、氯化镁、氯化钙、氯化钾等；农用肥料的盐和与碱性或酸性土壤条件相关的盐；特别是NaCl。

可通过包括膨压、生长、得率等在内的多种标准测试中的任意测试确定耐干旱性。例如，可通过使所述植物在降水和/或灌溉供应的水量低于最适水量的条件下生长来鉴定干旱耐受性增强的植物。具体地，可通过使所述植物在含水量低于相应参比植物可生长介质的介质如土壤上生长来鉴定干旱耐受性增强的植物。有利地，根据本发明所述方法处理的植物可生长介质或土壤的含盐水平低于相应参比植物能生长的介质或土壤含水量的90％、优选低于约80％、更优选低于约50％、最优低于约20％。或者，可通过在一段干旱期后提供再水化时植物从干旱恢复的能力来鉴定耐干旱性增强的植物。有利地，当在至少3天、至少5天、优选至少7天、更优选至少约10天以及最优至少约18天干旱后提供再水化时，根据本发明所述方法处理的植物可恢复。

可通过评估每单位植物可用水的植物干生物量积累量(根据感兴趣的得率组成，生物量可以是营养性、生殖性或两者都有)测定用水效率。用水效率增强的植物将比相同条件下生长的对应参比植物具有更高的每单位可用水的干生物量积累量。叶子或植物水平的用水效率是指净CO₂同化率和蒸腾率间的比值，常在数秒或数分钟时间内检测。在限制水条件下，用水效率改善植物的得率将比相同条件下生长的对应参比植物高(例如高出1-5％、5-10％、10-15％)。

可通过评估相对温度升高的植物干生物量累积量(根据感兴趣的得率组成，生物量可以是营养性、生殖性或两者都有)测定热耐受性。在升温条件下(例如1℃、2℃、3℃、4℃等)，热耐受性改善植物的得率将比相同条件下生长的对应参比植物高(例如高出1-5％、5-10％、10-15％)。

一旦作出适当选择，则重复所述过程。重复与回归亲本回交并选择非生物胁迫耐受性的过程约5代或更多代。该过程所得后代是一个或多个非生物胁迫耐受性编码基因的杂合子。然后，将最后回交代自花授精以提供非生物胁迫耐受的纯合子纯育种后代。

本文所述非生物胁迫耐受性近交植物系可用于额外的杂交以产生进一步的非生物胁迫耐受性杂交植物。例如，本发明所述第一非生物胁迫耐受性近交植物可与具有其它商用理想特质的第二近交植物杂交。所述第二近交植物系也可显示或不显示非生物胁迫耐受性。

VII：实施例

实施例1：大米HPL的克隆和序列分析

用分离自粳稻日本晴(L.cv Nipponbare)的基因组DNA，基于PCR扩增这些基因，采用以下基因特异性寡核苷酸：OsHPL1(正向：5′-ATAGATATCGCATGCATGGCGCCGCCGCGAGCCAACTCCG-3′和反向：5′-ATATACGTACTGCAGCGCGCGCCGCCGCTTGACACTATTA-3′)、OsHPL2(正向：5′-ATAGATATCGCATGCATGGCGCCACCGCCAGTGAACTCCG-3′和反向：5′ATATACGTACTGCAGGCACGTGACGTCGACGTGCGTGCTA-3′)以及OsHPL3(正向：5′-ATAGATATCGCATGCATGGTGCCGTCGTTCCCGCAGCCGG-3′和反向：5′-ATATACGTACTGCAGGAGAGAATGGCGGCAGCAAAGCTTA-3′)。对于各扩增，采用Gene Amp PCR系统9700(应用生物系统公司(AppliedBiosystems))，在含10mM Tris-HCl(pH 8.3)、50mM KCl、1.5mM MgCl₂、4％二甲基亚砜(DMSO)、100μM各dNTP、500nM各正向和反向引物、0.625单位Taq DNA聚合酶(英杰公司(Invitrogen))和50ng基因组DNA的25μL反应混合物中进行30轮PCR循环。进行扩增：94℃持续1分钟，94℃持续30秒，OsHPL1在55℃、OsHPL2在63℃以及OsHPL3在55℃持续1分钟，72℃持续90秒，最后在72℃进行10分钟延伸步骤。通过1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳解析扩增产物。切出对应各全长基因的条带，用QIAquick凝胶提取试剂盒(凯杰公司(Qiagen))纯化并按照生产商说明书克隆入pCR 2.1-TOPO载体(英杰公司(Invitrogen))。通过DNA测序确认这些克隆的身份。采用Vector NTI高级程序9(英杰公司)进行所有DNA以及多肽序列分析。

实施例2：三种大米HPL的拟南芥转化

通过将经PCR扩增、TOPO克隆和EcoRI-/BamHI-消化的所有三种大米全长HPL的片段克隆入pEZS-NLGFP的EcoRI/BamHI位点构建用于稳定表达的绿色荧光蛋白(GFP)融合体。引物设计为消除终止密码子并将编码序列与GFP基因的5′末端融合。OsHPL1所用引物为：正向：5′-ATA-GAATTCATGGCGCCGCCGCGAG-3′和反向：5′-ATAGGATCCGCTA-CTCCGCGCCGCGCG-3′。OsHPL2所用引物为：正向：ATAGAATTCATGGCGCCACCGCCAGT-3′和反向：5′-ATAGGATCC-GCTCCCGACGACGCCCGT-3′。采用以下引物扩增OsHPL3：正向：5′-ATAGAATTCATGGTGCCGTCGTTCCC-3′和反向：5′-ATAGGATCCGCGCTGGGAGTGAGCTCCC-3′。为产生OsHPL3-TP(HPL3减去蛋白氨基末端前15个氨基酸的质体转运肽)，扩增OsHPL3cDNA(正向：5′-CCGGCCAATACCGGGG-3′和反向5′-TTAGCTGGGAGTGAGCTC-3′)。如上所述进行PCR扩增，对所有扩增基因采用Tm＝55℃。通过采用NotI限制性位点将OsHPL1、OsHPL2与OsHPL3的开放阅读框从pEZS-NLGFP亚克隆到二元载体内使GFP基因位于各基因的C末端，产生用于拟南芥转化的GFP融合体。对于OsHPL3-TP，根据生产商的推荐将PCR产物克隆入Gateway pENTER载体。然后，所述构建物被完整测序，并在入门克隆pENTR OsHPL3-15AA TP和pB7WGF2载体之间的重组反应中产生pB7WGF2-OsHPL3-15AA TP构建物。所述构建物经测序校验，引入土壤杆菌EHA101菌株，并通过花浸渍方法用于转化拟南芥植物(Clough，S.J.和Bent，A.F.，Plant J.16：735-743，1998)。T1植物在土壤上发芽。通过用1∶1,000Finale(商业产品，其是5.78％草丁膦铵)每周2次处理10至12天的幼苗来选择转基因植物。在转化植物中证实OsHPL1、HPL2和HPL3-TP定位于质体外，以及OsHPL3定位于质体内。

实施例3：大米HPL1和/或HPL2在拟南芥中的表达赋予耐盐性

根据测得的植物暴露于200mM NaCl 5天的存活率(图1)，观察到HPL1(p≤0.003)和HPL2(p≤0.001)品系对盐胁迫的耐性都提高。天然hpl的无效突变体Col-0用作对照。采用在Col-0内源启动子下表达HPL基因校正版本的纯合品系。

在第二项实验中，五周龄的HPL2和Col-0植物经受三周盐处理，然后恢复10天。每三天用营养液(改良的斯伯丁溶液(Spalding solution))给植物浇水一次。所加液体的体积可允许沥1/3体积。对于所用花盆尺寸，每盆加入50-75ml营养液。当盐处理植物时，每三天用加有100mM NaCl的营养液对它们浇水一次。在恢复期间，每三天用营养液给植物浇水一次。当植物生长于Sunshine Mix#3(67％相对50％)或Sunshine Mix#3和ProfileGreen(31％相对21％)的50/50混合物时，100mM盐胁迫后，HPL2品系的存活率高于Col-0品系。

实施例4：大米HPL在拟南芥质体外的表达赋予干旱耐受性

根据撤去水10天后测得的植物存活率(图2)，观察到HPL1、HPL2和HPL3-TP(HPL3减去质体转运肽的15个氨基酸，所述酶定位于质体外)品系对干旱胁迫的耐受性提高(分别为p≤0.001、0.004和0.001)。天然hpl的无效突变体Col-0用作对照。和HPL定位与质体外的品系相反，HPL3品系(酶定位在质体内)的存活与Col-0品系没有区别。植物在含有相同量土壤的盆中各自生长。所有盆用相同水量浇水。当植物为2.5周龄时(所有植物有8-10片真叶)，撤去水9天，此时约50％的Col-0植物看来已死。随后，植物过量浇水并在进一步分析前放置恢复5天。进行三次独立实验。在各实验中，各品系由10-14株植物代表。

实施例5：表达大米HPL1和HPL3的拟南芥品系的微阵列分析

评估表达大米HPL1和大米HPL3的拟南芥品系叶子相较Col-0的基因表达水平。从标准条件下(22℃下16小时光照/8小时避光循环)生长在生长室中的3周龄植物的叶中提取RNA。用来自安捷伦技术公司(AgilentTechnologies)的拟南芥芯片一式两份地运行三个生物性样品(HPL1，HPL3，Col-0)。尽管在HPL1品系和HPL3品系相较Col-0的基因表达水平中观察到一些差异，特别感兴趣的观察是与热激蛋白和热激转录因子有关的多个序列在HPL1品系中的增强程度高于HPL3品系(见表1)。

表1：与Col-0品系相比，在HPL1品系和HPL3品系中差异表达的热激相关蛋白的示例。

这些序列其一，热激蛋白101在HPL1中比Col-0上调了2.74倍，但在HPL3品系中相比Col-0没有改变(ND)。近来，热激蛋白101显示在赋予热耐受性中起到重要作用(Tonsor等，Mol.Ecol.17(6)：1614-1626，2008)。这些数据证明了HPL基因在质体外过量表达可能针对温度提高引起的损伤提供保护，引起热耐受性的增强。

应理解，本文所述的实施例和实施方式仅用于说明，本领域技术人员应了解据此作出的各种修饰或改变，且它们包括在本申请的精神和权限以及所附权利要求书的范围内。本文引用的所有发表物、专利和专利申请通过引用全部纳入本文以用于所有目的。

非正式序列表

SEQ ID NO：1(HPL1，AK105964)

   1 gtggctgtga cgatccgaca cctgcacgct agtacgtagt gcgtatacgt agccagtacc

  61 ctactcccgt ccatggcgcc gccgcgagcc aactccggcg acggtaacga cggcgccgtc

 121 ggagggcaga gcaagctctc gccgtcgggc ctgctgatac gcgagattcc gggcggctac

 181 ggcgtgccct tcctctcgcc gctgcgcgac cgcctcgact actattactt ccagggcgcc

 241 gacgagttct tccgctcacg cgtcgcccgc cacggcggcg ccaccgtgct ccgcgtcaac

 301 atgccgcccg gccccttcct cgccggcgac ccccgcgtcg tcgccctcct cgacgcgcgc

 361 agcttccgcg tcctcctcga cgactccatg gtggacaagg ccgacacgct cgacggcacc

 421 ttcatgccgt cgctcgcgct cttcggcggc caccgcccgc tcgccttcct cgacgccgcc

 481 gaccctcgcc acgccaagat caagcgcgtc gtgatgtcgc tcgccgcggc gaggatgcac

 541 cacgtcgcgc cggcgttccg cgccgccttc gccgccatgt tcgacgaggt cgacgccggc

 601 ctcgtcgccg gcggccccgt cgagttcaac aagctcaaca tgcggtacat gctcgacttc

 661 acctgcgccg cgctgttcgg cggcgcgccg ccgagcaagg ccatgggcga cgctgccgtg

 721 acgaaggcgg tgaagtggct catcttccag cttcacccgc tcgccagcaa ggtcgtcaag

 781 ccgtggccgc tggaggacct cctcctccac accttccgcc tgccgccgtt cctggtgcgc

 841 cgcgagtacg gcgagatcac ggcgtacttc gccgccgccg ccgcggccat cctcgacgac

 901 gccgagaaga accacccggg aatcccgcgc gacgagctcc tccacaacct cgtgttcgtc

 961 gccgtcttca acgcctacgg cggcttcaag atcttcctgc cacacatcgt caagtggctc

1021 gcccgcgccg gcccggagct ccacgccaag ctagcctccg aggtccgcgc cgccgcgccc

1081 gccggcggcg gcgagatcac catctccgcc gtggagaagg agatgccgct ggtgaagtcg

1141 gtggtgtggg aggcgctgcg catgaacccg ccggtggagt tccagtacgg gcgcgcgcgg

1201 cgcgacatgg tcgtcgagag ccacgacgcg gcgtacgagg tccgcaaggg ggagctgctg

1261 ttcgggtacc agccgctcgc cacccgcgac gagaaggtgt tcgaccgcgc cggcgagttc

1321 gtccccgacc ggttcgtctc cggcgccgga agcgccgccc ggccgctgct ggagcacgtg

1381 gtgtggtcga acgggccgga gaccgggacg ccatcggagg ggaacaagca gtgccccggg

1441 aaggacatgg tggtggcggt ggggcggctg atggtggcgg ggctgttccg gcggtacgac

1501 acgttcgccg ccgacgtgga ggagctgccg cttgagccgg tggtcacgtt cacgtcgctg

1561 acccgcgccg ccgacggcga cggcgccgcg cggcgcggag tataatagtg tcaagcggcg

1621 gcgcgcgtga gcggcgagtg ttggtgcggc gacgacgctg tccatgcatg gtcgctgtca

1681 gttggtcaga tttgcatgga tttctttttt ctttgaccta aaaaaattgg gaaaaaggtg

1741 tactttcgcg tgcttgtggg ggcaggttct taagtatagg gattcggttt gtcattgtgt

1801 gaagttcaat acgatgtttg aagttgaata aaattatgtg cgttcctcgt ggtttt

SEQ ID NO：2

MAPPRANSGDGNDGAVGGQSKLSPSGLLIREIPGGYGVPFLSPLRDRLDYYYFQGADEFFRSRVARHGGATVLRVNMPPGPFLAGDPRVVALLDARSFRVLLDDSMVDKADTLDGTFMPSLALFGGHRPLAFLDAADPRHAKIKRVVMSLAAARMHHVAPAFRAAFAAMFDEVDAGLVAGGPVEFNKLNMRYMLDFTCAALFGGAPPSKAMGDAAVTKAVKWLIFQLHPLASKVVKPWPLEDLLLHTFRLPPFLVRREYGEITAYFAAAAAAILDDAEKNHPGIPRDELLHNLVFVAVFNAYGGFKIFLPHIVKWLARAGPELHAKLASEVRAAAPAGGGEITISAVEKEMPLVKSVVWEALRMNPPVEFQYGRARRDMVVESHDAAYEVRKGELLFGYQPLATRDEKVFDRAGEFVPDRFVSGAGSAARPLLEHVVWSNGPETGTPSEGNKQCPGKDMVVAVGRLMVAGLFRRYDTFAADVEELPLEPVVTFTSLTRAADGDGAARRGV

SEQ ID NO：3(HPL2，AK107161)

   1 ctcctcgaac caacccaaca caacacttgc acttgcacta cgtactctca tttcatccgc

  61 tcccggccgg caatggcgcc accgccagtg aactccggcg acgccgccgc cgccgccacg

 121 ggagagaaga gcaagctctc gccgtcgggc ctccccatac gcgagatacc cggcggctac

 181 ggcgtgccct tcttctcgcc gctgcgcgac cgcctcgact acttctactt ccagggcgcc

 241 gaggagtact tccgatcacg cgtcgcccgc cacggcggcg ccaccgtgct ccgcgtcaac

 301 atgccgcccg gccccttcat ctccggcaac ccccgcgtcg tcgccctcct cgacgcgcgc

 361 agcttccgcg tcctcctcga cgactccatg gtggacaagg ccgacacgct cgacggcacc

 421 tacatgccgt cgcgcgcgct cttcggcggc caccgcccgc tcgccttcct cgacgccgcc

 481 gacccgcgcc acgccaagat caagcgcgtc gtgatgtcgc tcgccgccgc gcggatgcac

 541 cacgtcgcgc cggcgttccg cgccgccttt gccgccatgt tcgacgccgt cgaggccggc

 601 ctcggcgccg ccgtcgagtt caacaagctc aacatgaggt acatgctcga cttcacctgc

 661 gccgcgctgt tcggcggcga gccgccgagc aaggtggtcg gcgacggcgc cgtgacgaag

 661 gccgcgctgt tcggcggcga gccgccgagc aaggtggtcg gcgacggcgc cgtgacgaag

 721 gccatggcgt ggctcgcgtt ccagctgcac ccgatcgcga gcaaggtcgt caagccatgg

 781 ccgctcgagg agctactcct gcacaccttc tccctgccgc cgttcctggt gcggcgtggc

 841 tacgccgacc tgaaggcgta cttcgccgac gccgccgcgg ccgtcctcga cgacgccgag

 901 aagagccaca cgggaatccc gcgcgacgag ctcctcgaca accttgtgtt cgtcgccatt

 961 ttcaacgcct tcggcggctt caagatcttc ctgccacaca tcgtcaagtg gctcgcccgc

1021 gccggcccgg agctccacgc caagcttgcc accgaggtcc gcgccaccgt gcccaccggc

1081 gaggacgacg gcatcaccct cgccgccgtc gagcggatgc cgctggtgaa gtcggtggtg

1141 tgggaggcgc tgcgcatgaa cccgccggtg gagttccagt acggccacgc gcggcgcgac

1201 atggtggtcg agagccacga cgcggcgtac gaggtgcgca agggggagat gctgttcggc

1261 taccagccgc tcgccacccg cgacgagaag gtgttcgacc gcgccggcga gttcgtcgcc

1321 gaccggttcg tcgccggcgg cgccgccggc gaccggccgc tgctggagca cgtggtgtgg

1381 tcgaacgggc cggagacgag ggcgccatcg gaggggaaca agcagtgccc cgggaaggac

1441 atggtggtgg cggtggggcg gctgatggtg gcggagctgt tccggcggta cgacacgttc

1501 gccgccgacg tggtggaggc gccggtggag ccggtggtga cgttcacgtc gctgacacgg

1561 gcgtcgtcgg gatagcacgc acgtcgacgt cacgtgcgcg ccgtgctgtg atttagtact

1621 gtactaggtt ggtggatgtt ttaattgcgt ggttaattat taatcacgca taaagtatta

1681 atcatgtttt atcatctaac aacaatgaaa atattaatca  t

SEQ ID NO：4

MAPPPVNSGDAAAAATGEKSKLSPSGLPIREIPGGYGVPFFSPLRDRLDYFYFQGAEEYFRSRVARHGGATVLRVNMPPGPFISGNPRVVALLDARSFRVLLDDSMVDKADTLDGTYMPSRALFGGHRPLAFLDAADPRHAKIKRVVMSLAAARMHHVAPAFRAAFAAMFDAVEAGLGAAVEFNKLNMRYMLDFTCAALFGGEPPSKVVGDGAVTKAMAWLAFQLHPIASKVVKPWPLEELLLHTFSLPPFLVRRGYADLKAYFADAAAAVLDDAEKSHTGIPRDELLDNLVFVAIFNAFGGFKIFLPHIVKWLARAGPELHAKLATEVRATVPTGEDDGITLAAVERMPLVKSVVWEALRMNPPVEFQYGHARRDMVVESHDAAYEVRKGEMLFGYQPLATRDEKVFDRAGEFVADRFVAGGAAGDRPLLEHVVWSNGPETRAPSEGNKQCPGKDMVVAVGRLMVAELFRRYDTFAADVVEAPVEPVVTFTSLTRASSG

SEQ ID NO：5(HPL3，AY340220)-缺失带下划线的序列以避免所编码的多肽转运进入质体

   1 tagagtcagt gtcataacgc aagctaccac acgtagctga taagtccgat cgtcgccgcg

  61 cgccgcgcca tggtgccgtc gttcccgcag ccggccagtg cggcggcggc gacgcggcca

 121 ataccgggga gctacggccc gccgctgctc ggcccgctcc gcgaccgcct cgactacttc

 181 tggttccagg gccccgacga cttcttccgc cgccgcgccg ccgaccacaa gagcaccgtg

 241 ttccgcgcca acatcccgcc caccttcccc ttcttcctcg gcgtcgaccc gcgcgtcgtc

 301 gccgtcgttg atgccgccgc cttcaccgcg ctcttcgacc cggccctcgt cgacaagcgc

 361 gacgtcctca tcggccccta cgtccccagc ctcgccttca cccgcggcac ccgcgtcggc

 421 gtctacctcg acacccagga ccccgaccac gcccgcacca aggccttctc catcgacctc

 481 ctccgccgcg ccgcccgcaa ctgggccgcc gagctccgcg ccgccgtcga cgacatgctc

 541 gccgccgtcg aggaagacct caacagggcc cctgaccccg ccgccgcctc cgccagctac

 601 ctcatcccgc tccagaagtg catcttccgc ttcctctgca aggcgctcgt cggcgccgac

 661 ccggcggcgg acggcctcgt cgaccgcttc ggcgtgtaca tcctcgacgt gtggctggcg

 721 ttgcagctgg tgccgacgca gaaggtgggc gtcatcccgc agccgctgga ggagctcctg

 781 ctccactcct tcccgctgcc gtcgttcgtc gtcaagcccg ggtacgacct cctctaccgc

 841 ttcgtggaga agcacggcgc cgccgccgtg tccatcgctg agaaggagca cggcatcagc

 901 aaggaggagg ccatcaacaa catcctcttc gtgctcggct tcaacgcgtt cggcggcttc

 961 tcggtgttcc tgccgttcct ggtcatggag gtcggcaagc ccggccggga agacctgcgg

1021 cggcggctgc gggaggaggt gcgccgcgtg ctgggcggcg gcgacggcgg cgaggccggg

1081 ttcgcggcgg tgagggagat ggcgctggtg cggtcgacgg tgtacgaggt gctccggatg

1141 cagccgccgg tgccgctgca gttcgggcgg gcgcggcgag acttcgtgct gcggtcgcac

1201 ggcggcgcgg cgtacgaggt gggcaagggc gagctgctgt gcgggtacca gccgctggcc

1261 atgcgcgacc cggcggtgtt cgaccggccg gaggagttcg cgccggagag gttcctcggc

1321 gacgacggcg aggcgctgct gcagtacgtg tactggtcca acgggccgga gaccggcgag

1381 ccgtcgccgg ggaacaaaca gtgtgccgcc aaggaggtgg tcgtcgccac cgcgtgcatg

1441 ctcgtcgccg agcttttccg gcggtacgac gacttcgaat gcgacggcac ctccttcacc

1501 aagctcgaca agcgggagct cactcccagc taagctttgc tgccgccatt ctctcactcg

1561 atctccatgc acatatgcat gaagaaatta attaaattca agttgctagc tccatttttt

1621 ctctttgagc tgctgataaa aaaacatctc tattcttctg tgcaataagc caataattaa

1681 gcattaatca gagcgtacaa gtaaaaattg ttttcactgt tttatgtgga t

SEQ ID NO：6-缺失带下划线的序列以避免多肽转运进入质体

MVPSFPQPASAAAATRPIPGSYGPPLLGPLRDRLDYFWFQGPDDFFRRRAADHKSTVFRANIPPTFPFFLGVDPRVVAVVDAAAFTALFDPALVDKRDVLIGPYVPSLAFTRGTRVGVYLDTQDPDHARTKAFSIDLLRRAARNWAAELRAAVDDMLAAVEEDLNRAPDPAAASASYLIPLQKCIFRFLCKALVGADPAADGLVDRFGVYILDVWLALQLVPTQKVGVIPQPLEELLLHSFPLPSFVVKPGYDLLYRFVEKHGAAAVSIAEKEHGISKEEAINNILFVLGFNAFGGFSVFLPFLVMEVGKPGREDLRRRLREEVRRVLGGGDGGEAGFAAVREMALVRSTVYEVLRMQPPVPLQFGRARRDFVLRSHGGAAYEVGKGELLCGYQPLAMRDPAVFDRPEEFAPERFLGDDGEALLQYVYWSNGPETGEPSPGNKQCAAKEVVVATACMLVAELFRRYDDFECDGTSFTKLDKRELTPS

Claims (20)

1.一种制备耐非生物胁迫植物的方法，所述方法包括：

(a)将含有编码HPL酶的氢过氧化物裂合酶(HPL)多核苷酸的重组表达盒引入植物群体；以及

(b)选择耐受非生物胁迫的植物；

其中所述HPL酶包含(L/I)-(F/C)-G-(Y/F)-(Q/R)-(P/K)和(N/D)-K-(Q/I)-C-(A/P)-(G/A)-K-(D/N)。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述HPL酶在植物群体中表达时定位于质体外。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述HPL酶识别9-氢过氧-十八碳三烯酸(9-HPOT)或9-氢过氧-十八碳二烯酸(9-HPOD)。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述HPL酶识别13-氢过氧-十八碳三烯酸(13-HPOT)或13-氢过氧-十八碳二烯酸(13-HPOD)。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述HPL酶在所述植物群体中表达时定位于质体外，其中所述HPL酶识别9-氢过氧-十八碳三烯酸(9-HPOT)或9-氢过氧-十八碳二烯酸(9-HPOD)。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述HPL酶还识别13-氢过氧-十八碳三烯酸(13-HPOT)或13-氢过氧-十八碳二烯酸(13-HPOD)。

7.如上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述HPL酶的氨基酸序列与SEQ ID NO.2、4或6至少90％相同。

8.一种制备耐非生物胁迫植物的方法，所述方法包括：

(a)将包含编码HPL酶的氢过氧化物裂合酶(HPL)多核苷酸的重组表达盒引入植物群体，其中所述HPL酶的氨基酸序列与SEQ ID NO.2、4或6至少90％相同；以及

(b)选择耐受非生物胁迫的植物，

其中所述HPL酶在植物群体中表达时定位于质体外。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述引入步骤通过有性杂交进行。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述引入步骤采用微粒轰击进行。

11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述HPL多核苷酸是SEQ IDNO.1、3或5。

12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物是水稻(Oryza sativa)。

13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述非生物胁迫是干旱。

14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述非生物胁迫是盐。

15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述HPL多核苷酸与启动子操作性连接。

16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述启动子是组成型或诱导型。

17.一种包含重组表达盒的转基因植物，其中所述重组表达盒包含编码HPL酶的HPL多核苷酸，所述HPL酶的氨基酸序列与SEQ ID NO.2、4或6至少90％相同，前提是所述植物不是拟南芥。

18.如权利要求17所述的转基因植物，其特征在于，所述植物是水稻(Oryzasativa)。

19.一种来自如权利要求18所述的转基因植物的转基因种子。

20.如权利要求19所述的转基因种子，其特征在于，所述种子是转基因水稻种子。

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