CN101356188A - 具有改良生长特性的植物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及通过降低DEL1多肽的活性水平增加植物产率和/或增加胁迫抗性的方法。一种这样的方法包括向植物中引入包含DEL1核酸变体的核酸。另一种方法包括下调DEL1基因的表达。本发明还涉及已向其中引入了DEL1核酸或其变体的转基因植物，所述植物相对于对照植物具有增加的产率和/或增加的胁迫抗性。本发明还涉及新的DEL1蛋白及其编码序列，以及在本发明方法中有用的构建体。

Description

具有改良生长特性的植物及其制备方法

发明领域

本发明总体上涉及分子生物学领域，并且涉及相对于对照植物改良植物生长特性的方法。更具体地，本发明涉及增加植物产率和/或增加胁迫抗性的方法，包括降低DEL1多肽的活性水平。本发明还涉及具有降低的DEL1多肽活性的植物，所述植物相对于对照植物具有增加的产率和/或增加的胁迫抗性。优选通过调节DEL1多肽片段编码核酸的表达、或者通过下调DEL1基因或其变体的表达来获得降低的DEL1多肽活性。本发明还提供了新的DEL1多肽、编码此类多肽的核酸，以及在本发明方法中有用的构建体。

发明背景

不断增加的世界人口和逐渐减少的农业可用耕地迫使研究朝向提高农业的效率。传统的作物和园艺学改良方法利用选育技术来鉴定具有期望特性的植物。然而，此类选育技术有一些缺陷，即这些技术一般为劳动密集型的，而且产生的植物通常包含异质的遗传组分，当这些异质的遗传组分从亲本植物传递时可能并不总是产生期望的性状。分子生物学的进展已经允许人类修饰动物和植物的种质。植物基因工程需要分离和操作遗传物质(一般以DNA或RNA的形式)以及随后将遗传物质引入植物。这类技术具有传递具多种改良的经济、农业或园艺性状的作物或植物的能力。具有特别利益的性状是产率。产率通常定义为作物经济价值的可测量产出。这可以以数量和/或质量的方式进行定义。产率直接取决于多种因素，如器官的数量和大小、植物构造(例如，分枝的数量)、种子产量等等。根的发育、营养吸收和胁迫耐受性也是决定产率的重要因素。因此优化上述因素也可以促进作物产率的增加。

种子产率是尤其重要的性状，因为许多植物的种子对于人类和动物的营养非常重要。作物如谷物、稻、小麦、芸苔和大豆占人类总卡路里摄取量的一半以上，不论是通过种子本身的直接消耗，还是通过由加工的种子所饲养的肉类产品的消耗。它们也是工业加工所用的糖类、油类和多类代谢物的来源。种子含有胚(新的芽和根的来源)和胚乳(萌发以及幼苗早期生长过程中胚生长的营养源)。种子的发育涉及许多基因，并且需要代谢物自根、叶和茎转移至正在生长的种子。特别是胚乳，吸收糖类、油类和蛋白质的代谢前体，将其合成为贮存高分子，以使谷粒饱满。

非生物胁迫条件，例如太阳能、水和营养的短缺或过量、盐度、高温和低温以及污染(如重金属)对于植物生长具有重大的营养，并且能够显著降低例如作物栽培品种的产率。虽然光照由于提供代谢能量而为植物所必需，但是紫外光对于活体生物有害。尤其是UV-B辐射(280-320nm)影响蛋白质和核酸的稳定性，导致光合作用下降、生物量减少、蛋白质合成降低以及叶绿体功能受损，还造成DNA损伤。由于平流层中保护性臭氧层的缩减，有关UV-B辐射对于植物的影响的关注增多。对于这些胁迫的生理应答因细胞基因表达的变化而引起。

增加植物产率和胁迫抗性的能力将在各领域具有许多应用，如农业，包括观赏植物的生产、树木栽培(aboriculture)、园艺学和林业。增加产率也可以用于在生物反应器中使用的藻类生产(用于诸如药物、抗体或疫苗物质的生物技术生产，或用于有机废物的生物转化)及其它这类领域。

植物和动物细胞周期的G1/S转换受RB/E2F/DP通路控制。E2F转录因子构成此调控机制的关键组分(Stals&Inzé，Trends Plant Science 6，359-364，2001)。拟南芥(Arabidopsis thaliana)的E2F转录因子家族包括6个成员，可以分成两个亚家族(Mariconti等，J.Biol.Chem.277，9911-9919，2002)：一方是E2Fa、E2Fb和E2Fc，而另一方是E2Fd、E2Fe和E2Ff。第一亚家族的E2F成员具有1个DNA结合结构域，并且需要相互作用的DP配偶体以形成功能性转录激活因子(E2Fa和E2Fb)或抑制因子(E2Fc)。第二亚家族的成员拥有2个E2F样DNA结合结构域，并含有使之区别于第一亚群中3个成员的结构特征。AtE2Fd和AtE2Fe在其蛋白的C-末端部分具有核定位信号(NLS)，这足以进行DNA结合而无需DP配偶体，但是AtE2Ff没有NLS。实验数据提示第二个亚家族的E2F成员没有激活结构域，认为它们干扰其他AtE2F蛋白的活性(Mariconti等，2002)。

在拟南芥中，AtE2Fe(也称为DEL1或E2L3)在G₁/S转换之初以及S/G₂转换之际表达。该蛋白质能够结合E2F位点而无需DP配偶体。Vlieghe等(Current Biology 15，59-63，2005)的研究表明AtE2Fe可能参与控制核内周期。表明DEL1突变体(del1-1，在两个DNA结合结构域之间具有T-DNA插入)的倍性水平增加，而DEL1过表达植物具有降低的核内复制。倍性水平的变化与参与DNA复制的许多E2F靶基因改变的表达水平相关。在分裂细胞中检测到DEL1转录物，但是在核内周期细胞中没有，这提示DEL1可能参与抑制有丝分裂活跃细胞的核内周期。Barow M.和Meister A.(2003)Plant，Cell and Environment 26，571-584提出内多倍体植物物种在例如更高纬度生长时具有优势。植物核内周期的控制是复杂的过程，并涉及许多基因。

本发明令人惊讶地发现，降低DEL1多肽的活性水平使植物相对于对照植物具有增加的产率和/或增加的胁迫抗性。优选通过调节植物中DEL1多肽片段编码核酸的表达、或者通过下调DEL1基因或其变体的表达来获得降低的活性水平。优选DEL1多肽是植物来源的。

发明内容

根据本发明的一个实施方案，提供了增加植物产率和/或增加胁迫抗性的方法，包括降低DEL1多肽的活性水平，优选通过调节植物中DEL1多肽片段编码核酸的表达，或者通过下调DEL1基因或其变体的表达实现。

本文提及的任何“可用于本发明方法的多肽”应理解为表示本文所定义的DEL1多肽。本文提及的任何“可用于本发明方法的核酸”应理解为表示能够编码此类多肽的核酸。术语“多肽”和“蛋白质”在本文互换使用，并且是指任何长度的多聚体形式的氨基酸。术语“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“基因”在本文互换使用，并且是指任何长度的多聚体形式的核苷酸，无论是核糖核苷酸或是脱氧核糖核苷酸或是两者的组合。

选择合适的对照植物是实验设置的常规部分，并且包括相应的野生型植物或不含目的基因的相应植物。对照植物通常为相同的植物物种，或者甚至与待评估植物为同一品种。对照植物还可以是待评估植物的无效合子(nullizygote)。如本文所用的“对照植物”不仅指完整植物，而且指植物部分，包括种子和种子部分。

有利地，实施根据本发明的方法产生相对于对照植物具有增加的产率、特别是增加的种子产率和/或增加的生物量的植物。

术语“产率”通常定义为经济价值的可测量产出，其必然是与指定作物、面积以及时期相关的。各个植物部分基于其数量、大小和/或重量对产率直接做出贡献，而真正的产率是作物年亩产率，用总产量(既包括收获产量也包括评估产量)除以种植的英亩数予以确定。

术语“增加”、“改进”或“提高”可互换，且在本申请意义上应理解为与文中所定义的野生型植物相比，产率和/或生长多出至少5％、6％、7％、8％、9％或10％，优选至少15％或20％，更优选25％、30％、35％或40％。

文中所定义的术语“增加的产率”是指如下任何一个或多个方面的增加，每个都相对于对照植物而言：(i)植物一个或多个部分，特别是地上(可收获)部分增加的生物量(重量)、增加的根生物量或任何其它可收获部分(如果实、坚果和接荚植物可食种子)增加的生物量；(ii)增加的种子总产率，这包括种子生物量(种子重量)的增加，并且其可以是每株植物或单粒种子基础上的种子重量增加；(iii)增加的每株植物的花数；(iv)增加的(饱满)种子数量；(v)增加的种子饱满率(这可以表达为饱满种子数除以种子总数之间的比率)；(vi)增加的种子大小，这也可影响种子的组成；(vii)增加的种子体积，这也可影响种子的组成(包括油类、蛋白质和糖类的总含量和组成)；(viii)增加的单个种子面积；(ix)增加的单个种子长度和/或种子周长；(x)增加的收获指数，其表达为可收获部分如种子的产率与总生物量的比率；和(xi)增加的千粒重(TKW)，这通过计数饱满种子数和它们的总重量外推得到。TKW的增加可来自于种子大小和/或种子重量的增加。TKW的增加也可来自胚大小和/或胚乳大小的增加。产率的增加也可以导致改变的构造，或可以作为改变的构造的结果发生。

以谷物为例，产率增加可以表现为如下一个或多个方面：每公顷或每英亩植物数量的增加、每株植物谷穗数量的增加、行数、行粒数、粒重、千粒重、谷穗长度/直径的增加，种子饱满率(为饱满种子数除以种子总数并乘以100)的增加，等等。以稻为例，产率增加可以表现为如下一个或多个方面的增加：每公顷或每英亩的植物数量、每株植物的圆锥花序数、每个圆锥花序的小穗数、每个圆锥花序的花(小花)数(表达为饱满种子数占初期圆锥花序的比率)、种子饱满率(为饱满种子数除以种子总数并乘以100)的增加、千粒重的增加，等等。

根据优选的方面，实施本发明的方法产生具有增加的产率、尤其是增加的生物量和/或种子产率的植物。因此，本发明提供了增加植物产率的方法，该方法包括降低DEL1多肽的活性水平，优选通过调节植物中DEL1多肽片段编码核酸的表达，或者通过下调DEL1基因或其变体的表达实现。

由于本发明的转基因植物具有增加的产率，相对于对照植物在其生命周期相应阶段的生长速率而言，这些植物可能呈现增加的生长速率(至少在其部分生命周期中)。增加的生长速率可以是对植物的一个或多个部分(包括种子)特异性的，或者可以基本上遍及整株植物。具有增加生长速率的植物可以具有更短的生命周期。植物的生命周期可以理解为表示从成熟干种子生长至植物产生类似于起始材料的成熟干种子阶段所需的时间。此生命周期可以受到诸如早期活力、生长速率、绿度指数、开花时间和种子成熟速度等因素的影响。生长速率的增加可以出现在植物生命周期的一个或多个阶段，或者出现在基本上整个植物生命周期的过程中。在植物生命周期的早期阶段，生长速率的增加可以反映出增强的活力。生长速率的增加可以改变植物的收获周期，使植物能够比其他可能的情况更晚播种和/或更快收获(类似的效果可以通过较早的开花时间获得)。如果生长速率充分增加，可以允许播种同种植物物种更多的种子(例如完全在一个常规的生长期内，播种和收获稻类植物、接着播种和收获更多的稻类植物)。与此类似，如果生长速率充分地增加，可以允许播种不同植物物种更多的种子(例如播种和收获稻类植物，随后，例如，播种和任选的收获大豆、马铃薯或任何其他适合的植物)。在一些作物植物的情况下也可能从同一根茎收获增加的次数。改变植物的收获周期可以导致每英亩年生物量产量的增加(这是由于(比方说在一年中)任何特定植物可以生长和收获次数的增加)。与野生型对应物相比，生长速率的增加还能够在更广阔的地域栽培转基因植物，因为种植农作物的地域限制通常由种植时(早季)或收获时(晚季)不利的环境条件所决定。如果缩短收获周期，就可以避免这类不利条件。可以通过来自生长曲线的多种参数确定生长速率，这类参数可以是：T-Mid(植物达到其最大大小的50％所需时间)和T-90(植物达到其最大大小90％所需时间)等等。

实施本发明的方法产生具有增加的生长速率的植物。因此，本发明提供了增加植物产率的方法，该方法包括降低DEL1多肽的活性水平，优选通过调节植物中DEL1多肽片段编码核酸的表达，或者通过下调DEL1基因或其变体的表达实现。

有利地，实施根据本发明的方法产生相对于对照植物具有增加的胁迫抗性的植物。

通过所述方法获得的转基因植物具有增加的胁迫抗性，即能够在对照植物表现出降低的生长、代谢、存活力、生产力和/或雄性或雌性不育的环境条件下正常地生长。无论植物处于无胁迫条件下，或植物相对于对照植物接触多种胁迫时，都发生产率和/或生长速率的增加。如本文所用的术语耐受性包括抗胁迫保护，范围包括延缓到基本上完全抑制因胁迫条件所致的细胞代谢改变、细胞生长降低和/或细胞死亡。通常植物通过更加缓慢的生长来应答胁迫接触。在重度胁迫条件下，植物甚至可以完全停止生长。另一方面，轻度胁迫在文中定义为当植物接触时不导致植物完全停止生长丧失重新开始生长能力的任何胁迫。本发明意义上的轻度胁迫导致胁迫植物的生长与非胁迫条件下的对照植物相比，下降不到40％、35％或30％，优选不到25％、20％或15％，更优选不到14％、13％、12％、11％或10％或更低。由于耕作方法(灌溉、施肥、杀虫剂处理)的发展，栽培的作物植物常常不会遇到重度胁迫。因此，由轻度胁迫诱导的受损的生长通常成为农业中不期望的因素。轻度胁迫是植物可能接触的典型胁迫。这些胁迫可以是植物接触的日常的生物和/或非生物(环境)胁迫。典型的非生物或环境胁迫包括由反常的热或冷/冰冻温度产生的温度胁迫；盐胁迫；水胁迫(干旱或过量的水)；紫外辐射胁迫。光线并非仅仅包含适于进行光合作用的波长辐射：也存在着短波辐射，如紫外B辐射(UV-B，280-320nm)。UV-B对活生物体造成损害，因为细胞成分如蛋白质和核酸吸收这种富含能量的辐射。许多研究已证明了有害的UV-B效应，如光合作用降低、生物量下降、蛋白质合成减少、叶绿体功能削弱以及DNA损伤。另外，UV-B辐射改变许多基因的表达：例如，防御基因的转录增加，而叶绿体基因的mRNA水平下降。化学物质也可以引起非生物胁迫。生物胁迫一般是由病原如细菌、病毒、真菌和昆虫引起的那些胁迫。本文所用的术语“非胁迫”条件为植物可能遇到的那些允许植物最佳生长的、不显著背离正常气候的条件及其他非生物胁迫条件。本领域技术人员知晓给定地理位置的正常土壤条件和气候条件。

根据另一优选的方面，实施本发明的方法产生具有增加的胁迫抗性的植物。因此，本发明提供了增加植物胁迫抗性的方法，该方法包括降低DEL1多肽的活性水平，优选通过调节植物中DEL1多肽片段编码核酸的表达，或者通过下调DEL1基因或其变体的表达实现。

有利地，可以在任何植物中修饰上述生长特性。

本文所用术语“植物”包含整株植物、植物的祖先和后代以及植物部分，包括种子、枝条、茎、叶、根(包括块茎)、花以及组织和器官，其中上述每一种都包含目的基因/核酸。术语“植物”也包含植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，同样其中上述每一种都包含目的基因/核酸。

在本发明方法中尤其有用的植物包括所有属于植物界(Viridiplantae)超家族的植物，特别是单子叶和双子叶植物，包括选自下列清单的饲料或饲料豆科植物、观赏植物、粮食作物、乔木或灌木：槭树属物种(Acer spp.)、猕猴桃属物种(Actinidia spp.)、秋葵属物种(Abelmoschus spp.)、冰草属物种(Agropyron spp.)、葱芹属物种(Allium spp.)、苋属物种(Amaranthus spp.)、凤梨(Ananas comosus)、番荔枝属物种(Annona spp.)、芹菜(Apiumgraveolens)、落花生属物种(Arachis spp.)、木波罗属物种(Artocarpus spp.)、石刁柏(Asparagus officinalis)、燕麦属物种(Avena spp.)(如燕麦[Avenasativa]、野燕麦[Avena fatua]、红燕麦[Avena byzantina]、野燕麦[Avena fatuavar.sativa]、杂交燕麦[Avena hybrida])、阳桃(Averrhoa carambola)、冬瓜(Benincasa hispida)、巴西栗(Bertholletia excelsea)、甜菜(Beta vulgaris)、芸苔属物种(Brassica spp.)(如欧洲油菜[Brassica napus]、甘蓝型油菜[Brassica rapa ssp.][芸苔、油菜籽油菜、芜菁])、Cadaba farinosa、大叶茶(Camellia sinensis)、美人蕉(Canna indica)、辣椒属物种(Capsicum spp.)、苔草(Carex elata)、番木瓜(Carica papaya)、大果假虎刺(Carissamacrocarpa)、山核桃属物种(Carya spp.)、红花(Carthamus tinctorius)、栗属物种(Castanea spp.)、苦苣(Cichorium endivia)、樟属物种(Cinnamomumspp.)、西瓜(Citrullus lanatus)、柑橘属物种(Citrus spp.)、椰子属物种(Cocosspp.)、咖啡属物种(Coffea spp.)、芋(Colocasia esculenta)、可拉属(Colaspp.)、芫荽(Coriandrum sativum)、榛属物种(Corylus spp.)、山楂属物种(Crataegus spp.)、番红花(Crocus sativus)、南瓜属物种(Cucurbita spp.)、香瓜属物种(Cucumis spp.)、菜蓟属物种(Cynara spp.)、胡萝卜(Daucuscarota)、山马蟥属物种(Desmodium spp.)、龙眼(Dimocarpus longan)、薯蓣属物种(Dioscorea spp.)、柿树属物种(Diospyros spp.)、稗属物种(Echinochloa spp.)、油棕属(Elaeis)(如非洲油棕[Elaeis guineensis]、美洲油棕[Elaeis oleifera])、穇子(Eleusine coracana)、枇杷(Eriobotryajaponica)、红仔果(Eugenia uniflora)、荞麦属物种(Fagopyrum spp.)、山毛榉属物种(Fagus spp.)、无花果(Ficus carica)、金桔属物种(Fortunellaspp.)、草莓属物种(Fragaria spp.)、银杏(Ginkgo biloba)、大豆属物种(Glycinespp.)(如大豆[Glycine max]、黄豆[Soja hispida]或大豆[Soja max])、陆地棉(Gossypium hirsutum)、向日葵属物种(Helianthus spp.)(如向日葵[Helianthus annus])、萱草(Hemerocallis fulva)、木槿属物种(Hibiscusspp.)、大麦属物种(Hordeum spp.)(如大麦[Hordeum vulgare])、甘薯(Ipomoea batatas)、核桃属物种(Juglans spp.)、莴苣(Lactuca sativa)、山黧豆属物种(Lathyrus spp.)、兵豆(Lens culinaris)、亚麻(Linumusitatissimum)、荔枝(Litchi chinensis)、百脉根属物种(Lotus spp.)、棱角丝瓜(Luffa acutangula)、羽扇豆属物种(Lupinus spp.)、地杨梅(Luzulasylvatica)、番茄属物种(Lycopersicon spp.)(如番茄[Lycopersiconesculentum、Lycopersicon lycopersicum、Lycopersicon pyriforme]、硬皮豆属物种(Macrotyloma spp.)、苹果属物种(Malus spp.)、西印度樱桃(Malpighiaemarginata)、曼密苹果(Mammea americana)、芒果(Mangifera indica)、木薯属物种(Manihot spp.)、人心果(Manilkara zapota)、紫花苜蓿(Medicagosativa)、草木樨属物种(Melilotus spp.)、薄荷属物种(Mentha spp.)、苦瓜属物种(Momordica spp.)、黑桑(Morus nigra)、芭蕉属物种(Musa spp.)、烟草属物种(Nicotianum spp.)、木犀榄属物种(Olea spp.)、仙人掌属物种(Opuntiaspp.)、Ornithopus spp.、稻属物种(Oryza spp.)(如稻[Oryza sativa]，阔叶稻[Oryza latifolia])、黍(Panicum miliaceum)、鸡蛋果(Passiflora edulis)、欧防风(Pastinaca sativa)、鳄梨属物种(Persea spp.)、香芹(Petroselinumcrispum)、菜豆属物种(Phaseolus spp.)、刺葵属物种(Phoenix spp.)、酸浆属物种(Physalis spp.)、松属物种(Pinus spp.)、阿月浑子(Pistacia vera)、豌豆属物种(Pisum spp.)、早熟禾属物种(Poa spp.)、杨属物种(Populus spp.)、牧豆树属物种(Prosopis spp.)、李属物种(Prunus spp.)、番石榴属物种(Psidium spp.)、石榴(Punica granatum)、西洋梨(Pyrus communis)、栎属物种(Quercus spp.)、萝卜(Raphanus sativus)、波叶大黄(Rheumrhabarbarum)、茶藨子属物种(Ribes spp.)、悬钩子属物种(Rubus spp.)、甘蔗属物种(Saccharum spp.)、接骨木属物种(Sambucus spp.)、黑麦(Secalecereale)、胡麻属物种(Sesamum spp.)、白芥属物种(Sinapis sp.)、茄属物种(Solanum spp.)(如马铃薯[Solanum tuberosum]、红茄[Solanum integrifolium]或Solanum lycopersicum)、两色蜀黍(Sorghum bicolor)、菠菜属物种(Spinacia spp.)、蒲桃属物种(Syzygium spp.)、万寿菊属物种(Tagetes spp.)、酸豆(Tamarindus indica)、可可树(Theobroma cacao)、车轴草属物种(Trifolium spp.)、小黑麦(Triticosecale rimpaui)、小麦属物种(Triticumspp.)(如Triticum aestivum、硬粒小麦[Triticum durum]、圆锥小麦[Triticumturgidum]、Triticum hybernum、马卡小麦[Triticum macha]、面包小麦[Triticum sativum]或普通小麦[Triticum vulgare])、小金莲花(Tropaeolumminus)、旱金莲(Tropaeolum majus)、越桔属物种(Vaccinium spp.)、野豌豆属物种(Vicia spp.)、豇豆属物种(Vigna spp.)、香堇菜(Viola odorata)、葡萄属物种(Vitis spp.)、玉蜀黍(Zea mays)、北美洲野生稻(Zizania palustris)、枣属物种(Ziziphus spp.)等等。

根据本发明优选的实施方案，植物为作物植物。作物植物的实例包括大豆、向日葵、芸苔、苜蓿、油菜籽、棉花、番茄、马铃薯或烟草。还优选植物是单子叶植物。单子叶植物的实例包括甘蔗。更优选植物是谷类。谷类的实例包括稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、高粱或燕麦。

本文定义的术语“DEL1多肽”指E2F样蛋白质，具有两个翼状螺旋型DNA结合结构域(E2F_TDP结构域，Pfam PF02319，Interpro IPR003316)，但是缺乏二聚化结构域；参见例如图1。优选DEL1多肽包含标签序列1(SEQ ID NO：9)：

(Y/T/P)(S/D)RK(Q/D)KSL(G/W)(L/T)LC(T/E/Q/S)(N/R/K)F(L/V)(A/S/T/R)(L/I/R)Y(N/G/P/D)

还优选标签序列1为

(Y/T/P)(S/D)RK(Q/D)KSL(G/W)(L/T)LC(T/E/Q/S)(N/R/K)F(L/V)(A/S/T)(L/I/R)Y(N/G/P/D)

更优选标签序列1为：

(Y/T)(S/D)RK(Q/D)KSL(G/W)(L/T)LC(T/E/S)(N/R)F(L/V)(A/S/T)(L/I)Y(N/G/D)。

最优选标签序列1为YSRKQKSLGLLCTNFLALYN。

用于表征DEL1多肽的备选标签序列包括：

标签序列2(SEQ ID NO：10)：

(G/S)LD(D/E)(A/V)A(S/A/T/V/R/K)(K/R/S)LGVE；

标签序列3(SEQ ID NO：11)：

R(R/K)(E/D)KSL(G/A/R)(I/L)(L/M)(T/S)(Q/K)(K/N)F(I/V)(K/Q/M)LF(I/V/L/T)(C/A/V/M/N/T)(S/E/T/M)；

标签序列4(SEQ ID NO：12)：

(I/V/L)(S/T)L(D/E)(D/T/V/E)AA(K/R)(L/I/C/R)(L/I)(L/M/I)(G/E)；

和标签序列5(SEQ ID NO：13)：

(T/A)K(V/I)RRLYDIAN(V/I)L(S/C/T)S(M/L)(N/R/A/H/Q)(L/F)I(E/R/K/D)K(T/V/I)(H/Q/T)(T/V/Q/H)(L/G/A/T/V/P)(D/E)(S/T/E)R(K/G)(P/R)(A/K)(F/P)(K/L/A/R)(W/F)(L/K)。

优选标签序列2为(G/S)LDDAA(S/A/T/R/K)(K/R)LGVE，最优选标签序列2为GLDDAASKLGVE。

此外，标签序列3优选为：

R(R/K)(E/D)KSL(G/A/R)(I/L)(L/M)(T/S)Q(K/N)F(I/V)(K/Q/M)LF(I/V/L/T)(C/A/V/M/N/T)(S/E/M)，

更优选标签序列3为：

R(R/K)EKSL(G/A)LL(T/S)Q(K/N)F(I/V)(K/Q)LF(I/V/L/T)(C/A/M/N/T)(S/M)，

最优选标签序列3为RREKSLGLLTQNFIKLFICS。

标签序列4优选为：

(I/V)(S/T)L(D/E)(D/T/V/E)AA(K/R)(L/I)(L/I)(L/M/I)(G/E)，

更优选标签序列4为：

(I/V)SL(D/E)(D/T/E)AA(K/R)(L/I)(L/I)(L/M)G，

最优选标签序列4为ISLDDAAKLLLG。

标签序列5优选为：

(T/A)K(V/I)RRLYDIAN(V/I)L(S/C/T)S(M/L)(N/R/A)(L/F)I(E/R/K/D)K(T/V/I)(H/Q)(T/V/Q)(L/G/A/T)(D/E)(S/T/E)R(K/G)(P/R)(A/K)(F/P)(K/L/A/R)(W/F)(L/K)，

更优选标签序列5为：

(T/A)K(V/I)RRLYDIAN(V/I)L(S/C/T)S(M/L)(N/R)(L/F)I(E/R/D)K(T/V/I)(H/Q)(T/V/Q)(L/G/A/T)(D/E)(S/T)RKPAF(K/L/R)WL，

最优选标签序列5为

TKVRRLYDIANVLSSMNLIEKTHTLDSRKPAFKWL。

最优选DEL1蛋白如SEQ ID NO：8所示。

本发明的蛋白质可通过E2F_TDP结构域(如图1所示)的存在进行鉴定。术语“结构域”是指在进化相关蛋白质序列的比对中，在特定位置上保守的一组氨基酸。尽管其他位置上的氨基酸可能因同源物不同而改变，但是在特定位置上高度保守的氨基酸意味着对于蛋白质结构、稳定性或活性非常重要的氨基酸。“结构域”因其在所比对的家族蛋白质同源物序列中高度保守而得以鉴定，能够用作为标识符以确定任何所研究多肽是否属于先前鉴定到的多肽家族(在本案中为如本文所述的用于本发明方法的蛋白质及其编码核酸)。

术语“基序”或“共有序列”或“标签序列”是指进化相关蛋白质序列中短的保守区域。基序常常是高度保守的结构域部分，但也可以仅仅包括部分结构域，或者位于保守结构域之外(若基序的所有氨基酸都在所定义的结构域之外的话)。本领域技术人员将会明白，对于标签序列中有可能存在3种或多种氨基酸的位置而言，其序列不是太保守，且这些位置上可能发生错配。

术语“DEL1多肽”也包含SEQ ID NO：8的同源物。通过将其他蛋白质序列与SEQ ID NO：8进行比对，可以容易地鉴定上文详述的相应标签序列。以这种方式，利用本领域熟知的常规技术如通过序列比对，可以容易地鉴定DEL1多肽或其同源物。存在用于鉴定结构域的专业数据库，例如SMART(Schultz等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，5857-5864；Letunic等(2002)Nucleic Acids Res 30，242-244)、InterPro(Mulder等，(2003)Nucl.Acids.Res.31，315-318)、Prosite(Bucher和Bairoch(1994)，Ageneralized profile syntax for biomolecular sequences motifs and itsfunction in automatic sequence interpretation.(In)ISMB-94；第二届分子生物学智能系统国际会议记录(Proceedings 2nd International Conferenceon Intelligent Systems for Molecular Biology)Altman R.，Brutlag D.，KarpP.，Lathrop R.，Searls D.编辑，53-61页，AAAIPress，Menlo Park；Hulo等，Nucl.Acids.Res.32：D134-D137，(2004))或者Pfam(Bateman等，NucleicAcids Research 30(1)：276-280(2002)。进行蛋白质序列芯片(in silico)分析的一组工具可以从ExPASy蛋白质组学服务器获得(由瑞士生物信息学研究所(Swiss Institute of Bioinformatics)托管，Gasteiger等ExPASy：theproteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.NucleicAcids Res 31：3784-3788(2003))。

可以利用常规技术如通过序列比对鉴定结构域。为比较而进行序列比对的方法是本领域众所周知的，此类方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP使用Needleman和Wunsch的算法((1970)J.Mol.Biol.48：443-453)来寻找两序列(即跨越完整序列)之间匹配数最大化且空位数最小化的比对。BLAST算法(Altschul等(1990)J Mol Biol 215：403-10)计算序列同一性百分比，并对两序列之间的相似性进行统计学分析。执行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)公开地获得。例如，同源物可以使用ClustalW多重序列比对算法(1.83版)，采用默认的双比对参数以及百分比的记分方法而容易地鉴定。利用可获自MatGAT软件包(Campanella等BMC Bioinformatics.2003年7月10日4:29.MatGAT：an application that generates similarity/identity matrices using protein orDNA sequences)的方法之一，也可以确定全局相似性和同一性百分比。可以进行微小的人工编辑以优化保守基序之间的比对，这对于所属领域的技术人员而言将是显而易见的。此外，除了利用全长序列进行同源物鉴定以外，还可以利用特定结构域(如E2F_TDP结构域，或上文所定义的基序之一)。如下文实施例3所示，序列同一性值为百分比，是通过上述程序使用默认参数针对完整核酸或氨基酸序列，和/或选择的结构域或保守基序确定的。

实施例1提供了DEL1多肽或其同源物的实例。

可以实施测定法以确定DEL1活性。实施例6提供了用以确定DEL1活性的测定法实例。

SEQ ID NO：21所示的序列代表了迄今未知的DEL1蛋白。因此本发明提供了选自如下的分离的DEL1多肽：

(a)SEQ ID NO：21所示的多肽，

(b)这样的多肽，其具有的氨基酸序列与SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列具有至少60％序列同一性、优选70％序列同一性、更优选80％或90％序列同一性、最优选95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，

(c)(a)或(b)中所定义蛋白质的同源物、衍生物和/或功能性片段。

应该理解的是，落入“DEL1多肽或其同源物”定义的序列不限于SEQID NO：8、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：31所示的序列，而是任何这样的多肽，其包含如Pfam记录PF02319或Interpro记录IPR003316所说明的两个翼状螺旋型DNA结合结构域(E2F_TDP结构域)，但是缺乏二聚化结构域，和/或包含SEQ ID NO：9、10、11、12和13中详述的一个或多个标签序列，均可适用于实施本发明的方法。

同样可用于本发明方法的为实施例1表A所示任一氨基酸序列的同源物。蛋白质的“同源物”包括肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，其相对于所讨论的未修饰蛋白质具有氨基酸取代、缺失和/或插入，并且与其衍生自的未修饰蛋白质具有相似的生物活性和功能活性。

缺失是指从蛋白质中除去一个或多个氨基酸。

插入是指在蛋白质的预定位置引入一个或多个氨基酸残基。插入可以包括N-末端和/或C-末端的融合，以及单个或多个氨基酸的内部序列插入。通常，氨基酸序列内部的插入将小于N-或C-末端的融合，数量级为约1到10个残基。N-或C-末端融合蛋白质或肽的实例包括在酵母双杂合系统中应用的转录激活因子的结合结构域或激活结构域、噬菌体外壳蛋白质、(组氨酸)6标签、谷胱甘肽S-转移酶标签、蛋白质A、麦芽糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、Tag·100表位、c-myc表位、FLAG

表位、lacZ、CMP(钙调蛋白结合肽)、HA表位、蛋白质C表位和VSV表位。

取代是指蛋白质的氨基酸替换为具有相似特性的其他氨基酸。氨基酸取代通常是单个残基的取代，但是视施加于多肽的功能性限制而定也可能是成簇取代；插入通常在大约1到10个氨基酸残基的数量级。优选氨基酸取代包括保守的氨基酸取代。为产生这样的同源物，蛋白质的氨基酸可以替换为具有相似特性(如相似的疏水性、亲水性、抗原性、形成或打破α螺旋结构或β片层结构的倾向)的其它氨基酸。保守取代表是本领域众所周知的(例如见Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman and Company和下表1)。

表1：保守氨基酸取代的实例

残基	保守取代	残基	保守取代
				Ala	Ser	Leu	Ile；Val
Arg	Lys	Lys	Arg；Gln
				Asn	Gln；His	Met	Leu；Ile
Asp	Glu	Phe	Met；Leu；Tyr
				Gln	Asn	Ser	Thr；Gly
Cys	Ser	Thr	Ser；Val
				Glu	Asp	Trp	Tyr
Gly	Pro	Tyr	Trp；Phe
				His	Asn；Gln	Val	Ile；Leu
Ile	Leu，Val

可通过本领域众所周知的肽合成技术，如固相肽合成法等，或通过重组DNA操作容易地进行氨基酸的取代、缺失和/或插入。用于产生蛋白质的取代、插入或缺失变体的DNA序列操作方法是本领域众所周知的。例如，本领域技术人员熟知在DNA预定位置产生取代突变的技术，并且包括M13诱变、T7-Gen体外诱变(USB，Cleveland，OH)、QuickChange定点诱变(Stratagene公司，San Diego，CA)、PCR介导的定点诱变或其它定点诱变方法。

同样可用于本发明方法的为实施例1表A所示任一多肽的衍生物或任一前述SEQ ID NO的直系同源物或旁系同源物。“衍生物”包括肽、寡肽、多肽，与天然产生形式的蛋白质例如SEQ ID NO：8所示蛋白质的氨基酸序列相比，其可以包括非天然产生氨基酸残基的取代或非天然产生氨基酸残基的添加。实施例1表A所示多肽的衍生物为适用于本发明方法的更多实例。用于本发明方法的衍生物优选与其衍生自的未修饰蛋白质具有相似的生物活性和功能活性。

蛋白质的“衍生物”还包括肽、寡肽、多肽，与天然产生形式的多肽氨基酸序列相比，其可以包括天然产生的改变的(糖基化、酰基化、异戊烯化、磷酸化、肉豆蔻酰化、硫酸化等等)或非天然产生的改变的氨基酸残基。与其源自的氨基酸序列相比，衍生物还可以包括一个或多个非氨基酸取代或添加，例如共价或非共价地结合于氨基酸序列的报告分子或其它配体，例如与之结合有利于衍生物检测的报告分子，以及相对于天然产生蛋白质的氨基酸序列而言非天然产生的氨基酸残基。

考虑也可以如上所述通过氨基酸缺失、添加或取代，通过修饰DEL1蛋白的DNA结合结构域来实现的DEL1活性降低。此类修饰的DEL1蛋白也可用于本发明的方法。同样，其中DNA结合结构域发生了修饰的DEL1蛋白衍生物可考虑用于本发明的方法。

术语“同源物”包括直系同源序列和旁系同源序列，这两种特定形式的同源物涵盖用于描述基因祖先关系的进化概念。

术语“旁系同源物”涉及产生旁系同源基因的物种基因组内的基因复制。可以通过针对来自查询序列相同物种的一组序列进行BLAST分析而容易地找到DEL1的旁系同源物。

可以通过进行所谓的交互BLAST搜索容易地找到直系同源物和旁系同源物。通常，这包括以查询序列(例如，利用实施例1表A中所列的任一序列)针对任何序列数据库如可公共可获得的NCBI数据库进行BLAST的一次BLAST。当从核苷酸序列开始时，通常使用BLASTN或TBLASTX(利用标准默认值)，而当从蛋白质序列开始时，则使用BLASTP或TBLASTN(利用标准默认值)。BLAST结果可以任选地过滤。接着使用过滤的结果或者未过滤的结果中的全长序列针对查询序列来源生物的序列进行反向BLAST(二次BLAST)(在查询序列为SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的情况下，二次BLAST将会针对拟南芥序列)。然后比较一次和二次BLAST的结果。如果一次BLAST中分值靠前的命中事件来自查询序列源自的相同物种，则找到了旁系同源物，反向BLAST结果随即理想地以查询序列作为最高命中事件；如果一次BLAST中分值靠前的命中事件不是来自查询序列源自的相同物种，则找到了直系同源物，且优选反向BLAST后的结果是查询序列处于最高命中事件之列。

分值靠前的命中事件是E值低的命中事件。E值越低，分值越具有显著性(或者换句话说，偶然发现此命中事件的几率越低)。E值的计算是本领域众所周知的。除了E值之外，还对比较进行同一性百分比记分。同一性百分比是指两比较核酸(或多肽)序列之间在特定长度上的相同核苷酸(或氨基酸)数。在大家族的情况下可以使用ClustalW，继之以邻近连接树来辅助相关基因的聚类可视化，以鉴定直系同源物和旁系同源物。

实施例1表A给出了SEQ ID NO：8所示DEL1蛋白的直系同源物和旁系同源物的实例。更多的直系同源物和旁系同源物可以利用上文所述的BLAST方法容易地鉴定。

DEL1多肽由DEL1核酸/基因编码。因此本文定义的术语“DEL1核酸/基因”是编码上文所定义的DEL1多肽的任何核酸/基因。

DEL1核酸的实例包括但不限于实施例1表A所示的那些核酸。

SEQ ID NO：20所示的序列迄今未知。因此本发明提供了分离的核酸序列，其包含：

(i)SEQ ID NO：20所示的核酸序列或其互补链；

(ii)编码上文(a)至(c)中所定义的氨基酸序列的核酸序列；

(iii)能够(优选在严格条件下)与上述(i)或(ii)中的核酸序列杂交的核酸序列，所述杂交序列优选编码具有产率和/或胁迫抗性增加活性的蛋白质；

(iv)为(i)至(iii)中所述核酸序列的等位基因变体的核酸；

(v)为(i)至(iii)中所述核酸序列的剪接变体的核酸；

(vi)按照递增的优选顺序与SEQ ID NO：20或其互补物具有60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列；

(vii)上述(i)至(vi)中任一核酸序列的部分，所述部分优选编码具有产率和/或胁迫抗性增加活性的蛋白质。

用于本发明方法的DEL1蛋白编码核酸无需是全长核酸，因为本发明方法的实施不依赖于全长核酸序列的使用。适用于实施本发明方法的DEL1核酸的实例包括实施例1表A所示的核酸序列，但不局限于此。核酸变体也可用于实施本发明的方法。这类核酸变体的实例包括编码用于本发明方法的蛋白质的核酸的部分，与用于本发明方法的蛋白质的编码核酸杂交的核酸，编码用于本发明方法的蛋白质的核酸的剪接变体，编码用于本发明方法的蛋白质的核酸的等位基因变体，以及通过基因改组获得的编码用于本发明方法的蛋白质的核酸的变体。下面将对术语部分、杂交序列、剪接变体、等位基因变体和基因改组进行说明。

根据本发明，提供了改良植物生长特性的方法，包括在植物中引入和表达实施例1表A所示任一核酸序列的部分，或实施例1表A所示任一氨基酸序列的直系同源物、旁系同源物或同源物的编码核酸的部分。

如本文所定义的术语“部分”是指编码DEL1多肽的一段DNA，所述DNA片段编码的多肽缺乏DNA结合结构域之一的至少一部分，但是包含位于DNA结合结构域C-末端的至少一部分，并且任选地还包含上文所定义的一个或多个标签序列。例如，可以通过对DEL1核酸进行一个或多个缺失来制备“部分”。“部分”可以以分离的形式使用，或者可将其与其他编码(或非编码)序列融合，以便例如，生产组合了若干活性的蛋白质。当与其他编码序列融合时，经翻译后所产生的多肽可能比预测的DEL1片段要大。优选“部分”是实施例1表A所列任一序列所示核酸的部分。更优选所述核酸部分编码的DEL1多肽包含位于DNA结合结构域C-末端的至少一部分，并且任选地还包含上文所定义的一个或多个标签序列，但是缺乏至少一部分DNA结合结构域，或者编码的DEL1多肽缺乏一个或两个DNA结合结构域，例如缺失导致丧失DNA结合活性。最优选所述核酸部分如SEQ ID NO：1所示，或者编码SEQ ID NO：2所示的多肽。

如本发明所用的术语“DEL1多肽的片段”(下文称为DEL1f)是指这样的DEL1蛋白，其缺失至少一部分DNA结合结构域，或者缺乏一个或两个DNA结合结构域，但是仍然包含位于DNA结合结构域C-末端的部分，并且任选地还包含上文所定义的一个或多个标签序列，这样的缺失导致丧失DNA结合活性。优选DEL1f缺乏部分第一DNA结合结构域，最优选DEL1f如SEQ ID NO：2所示。

DEL1核酸/基因的其他变体为在降低的严格条件下、优选在严格条件下，能够与上文所定义的DEL1核酸/基因杂交的核酸，所述杂交核酸编码的多肽至少包含位于DNA结合结构域C-末端的序列，并且优选还包含上文所定义的一个或多个标签序列。杂交序列通常长度至少为600个连续核苷酸，优选长度至少为800个连续核苷酸，更优选长度至少为1000个连续核苷酸，且最优选长度至少为1200个连续核苷酸，所述连续核苷酸为实施例1表A所示任一核酸序列的连续核苷酸。优选杂交序列能够与编码实施例1表A所示蛋白质的核酸杂交，或与任一前述序列的部分杂交。最优选杂交序列能够与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：7杂交。

本文定义的术语“杂交”指其中基本同源互补的核苷酸序列彼此退火的过程。杂交过程能够完全在溶液中发生，即互补的核酸都在溶液中。杂交过程也可以如此进行，即互补核酸之一固定于基质如磁珠、琼脂糖珠或任何其它树脂上。此外，杂交过程也可以如此进行，即其中互补核酸之一固定在固相支持物如硝酸纤维素或尼龙膜上，或者例如用照相平板印刷固定在例如硅质玻璃支持物上(后者称为核酸阵列或微阵列，或称为核酸芯片)。为了使杂交发生，通常使核酸分子热变性或化学变性，以使双链解链成两条单链，和/或除去单链核酸中的发夹结构或其它二级结构。

术语“严格性”是指杂交发生的条件。杂交的严格性受诸如温度、盐浓度、离子强度和杂交缓冲液组成等条件的影响。通常，对于在确定的离子强度和pH值下的特定序列，选择比热解链温度(T_m)低约30℃的低严格条件。中等严格条件是温度比T_m低20℃，而高严格条件是温度比T_m低10℃。高严格杂交条件通常用于分离与靶核酸序列具有高序列相似性的杂交序列。不过，由于遗传密码的简并性，核酸可能在序列上有差异而依然编码基本上相同的多肽。因此有时可能需要中等严格杂交条件来鉴定这样的核酸分子。

T_m是在确定的离子强度和pH值下，50％的靶序列与完全匹配的探针杂交的温度。T_m取决于溶液条件和探针的碱基组成及长度。例如，较长的序列在较高温度下特异性杂交。在低于T_m值16℃到32℃获得最大杂交率。在杂交溶液中存在一价阳离子会减少两核酸链之间的静电排斥作用，从而促进杂合体形成；当钠浓度高达0.4M时，这一作用明显(对于更高的浓度，此作用可以忽略)。每个百分点的甲酰胺可使DNA-DNA和DNA-RNA双链体的解链温度降低0.6到0.7℃，加入50％甲酰胺能够使杂交在30到45℃完成，尽管这将降低杂交率。碱基对错配降低杂交率和双链体的热稳定性。平均而言，对于大的探针，每个百分点碱基错配使T_m值下降约1℃。T_m值可以用依赖于杂合体类型的下列方程式计算：

(i)DNA-DNA杂合体(Meinkoth和Wahl，Anal.Biochem.，138：267-284，1984)：

Tm＝81.5℃+16.6×log[Na⁺]^a+0.41×％[G/C^b]-500×[L^c]^-1-0.61×％甲酰胺

(ii)DNA-RNA或RNA-RNA杂合体：

Tm＝79.8+18.5(log₁₀[Na⁺]^a)+0.58(％G/C^b)+11.8(％G/C^b)²-820/L^c

(iii)寡DNA或寡RNA^d杂合体：

＜20个核苷酸：Tm＝2(l_n)

20-35个核苷酸：Tm＝22+1.46(l_n)

^a或对于其它一价阳离子，但是仅在0.01-0.4M范围内精确。

^b仅对于在30％到75％范围内的％GC精确。

^cL＝双链体的碱基对长度。

^d寡，寡核苷酸；l_n，引物的有效长度＝2×(G/C数)+(A/T数)。

可以通过许多已知技术中的任一来控制非特异性结合，例如，用含蛋白质的溶液封闭膜，在杂交缓冲液中添加异源RNA、DNA和SDS，以及用RNA酶处理。对于非同源探针，可以通过改变如下之一来进行系列杂交：(i)逐步降低退火温度(例如从68℃逐步降至42℃)或(ii)逐步降低甲酰胺浓度(例如从50％逐步降至0％)。熟练的技术人员知晓可以在杂交过程中改变的多种参数，从而保持或者改变严格条件。

除了杂交条件，杂交特异性还是杂交后洗涤的函数。为了除去非特异杂交产生的背景，用稀释的盐溶液洗涤样品。这类洗涤的关键因素包括最终洗涤溶液的离子强度和温度：盐浓度越低、洗涤温度越高，洗涤的严格性就越高。洗涤条件通常在等于或低于杂交严格性条件下进行。阳性杂交提供的信号至少为背景的两倍。通常，适用于核酸杂交测定或基因扩增检测操作的严格条件如上所示。也可以选择更高或更低的严格性条件。熟练的技术人员知晓可以在洗涤过程中改变的多种参数，从而保持或者改变严格条件。

例如，对于长于50个核苷酸的DNA杂合体，典型的高严格杂交条件包括于65℃在1×SSC中或者于42℃在1×SSC和50％甲酰胺中杂交，接着于65℃在0.3×SSC中洗涤。对于长于50个核苷酸的DNA杂合体，中等严格杂交条件的实例包括于50℃在4×SSC中或于40℃在6×SSC和50％甲酰胺中杂交，接着于50℃在2×SSC中洗涤。杂合体的长度是杂交核酸的预期长度。当序列已知的核酸杂交时，杂合体的长度可以通过比对序列并鉴定本文所述的保守区域来确定。1×SSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠；杂交和洗涤可以另外地包括5×Denhardt试剂、0.5-1.0％SDS、100μg/ml变性片段化的鲑精DNA、0.5％焦磷酸钠。

为了定义严格性水平，可以便利地参考Sambrook等(2001)的《分子克隆：实验室手册》，第三版，冷泉港实验室出版，冷泉港，纽约，或者CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989以及年度更新资料)。

可用于本发明方法的其他核酸变体为编码上文所定义的DEL1多肽的剪接变体。本文所用的术语“剪接变体”包括其中选择的内含子和/或外显子已被切除、替换或添加，或者其中内含子已被缩短或加长的核酸序列的变体。这样的变体将是基本上保留蛋白质生物活性的变体，这可以通过选择性地保留蛋白质的功能性片段来实现。这样的剪接变体可以是天然的或人工的。产生这类剪接变体的方法是本领域众所周知的(参见例如Foissac和Schiex，BMC Bioinformatics.2005；6：25)。优选的剪接变体是编码上文所定义的DEL1多肽的核酸的剪接变体。还优选编码SEQ ID NO：8所示多肽的直系同源物或旁系同源物如实施例1表A中所列多肽的核酸的剪接变体。最优选如SEQ ID NO：7所示的剪接变体。

可用于实施本发明方法的其他核酸变体为编码如上文所定义的DEL1多肽的核酸的等位基因变体。等位基因或等位基因变体为给定基因的可选形式，处于同一染色体位置上。等位基因变体天然存在，并且这些天然等位基因的用途包含于本发明的方法中。等位基因变体包括单核苷酸多态性(SNP)，以及小型插入/缺失多态性(INDEL)。INDEL的大小通常小于100bp。SNP和INDEL在大多数生物体天然存在的多态性株系中形成最大的一组序列变体。优选的等位基因变体为编码SEQ ID NO：8所示多肽的直系同源物或旁系同源物如实施例1表A中所列多肽的核酸的等位基因变体。最优选如SEQ ID NO：7所示的等位基因变体。

可用于本发明方法的另一核酸变体为通过基因改组获得的核酸变体。基因改组或定向进化也可用于产生编码上文所定义的DEL1或DEL1f蛋白的核酸的变体。这包括DNA改组的重复，继之以适当筛选和/或选择，以产生编码具有修饰的生物活性的DEL1多肽或其部分的DEL1核酸或其部分的变体(Castle等，(2004)Science 304(5674)：1151-4；美国专利5,811,238和6,395,547)。优选通过基因改组获得核酸变体编码的DEL1或DEL1f多肽包含本文所定义的任何一个或多个基序或结构域。

此外，可利用定点诱变获得核酸变体，包括编码DEL1f多肽的核酸。可以通过多种方法来完成定点诱变，最常见的是基于PCR的方法(currentprotocols in molecular biology.Wiley编辑)。

DEL1核酸或其变体可以来自任何天然或人工的来源。核酸/基因或其变体可以分离自微生物来源如酵母或真菌，或分离自植物、藻类或动物(包括人)来源。可以通过仔细的人为操作在组成和/或基因组环境上修饰所述核酸的天然形式。优选植物来源的核酸，无论来源于同一植物物种(例如对于其被引入的物种而言)，还是来源于不同植物物种。可以从双子叶物种，优选从十字花科(Brassicaceae)，更优选从拟南芥分离所述核酸。更优选从拟南芥中分离的DEL1核酸，且如SEQ ID NO：7所示，且DEL1氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示，而DEL1f如SEQ ID NO：1所示，且DEL1f氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

因此本文任何述及的DEL1或DEL1f蛋白应理解为表示上文所定义的DEL1或DEL1f蛋白。编码这样的DEL1或DEL1f蛋白的任何核酸均适用于实施本发明的方法。

可以通过引入遗传修饰(优选在DEL1基因座)调节DEL1多肽或其同源物编码核酸的表达。本文所定义的基因座意指基因组区，其包括目的基因和编码区上游或下游的10kb。

例如，可以通过任一(或多种)如下方法引入遗传修饰：T-DNA激活、TILLING、定点诱变、转座诱变、定向进化和同源重组，或通过在植物中引入和表达编码DEL1多肽或其片段的核酸。引入遗传修饰之后的步骤是选择DEL1多肽或其片段编码核酸受调节的表达，所述受调节的表达使植物产率增加和/或胁迫抗性增加。

T-DNA激活标记(Hayashi等Science(1992)1350-1353)包括将通常含有启动子(也可以是翻译增强子或内含子)的T-DNA插入在目的基因的基因组区或基因编码区上游或下游10kb，从而在构型上使启动子能够指导靶向基因的表达。通常天然启动子对靶向基因表达的调控被破坏，基因由新引入的启动子控制。启动子一般包含于T-DNA中。例如，通过农杆菌(Agrobacterium)感染将此T-DNA随机插入植物基因组并导致插入T-DNA附近的基因过表达。得到的转基因植物由于引入启动子附近的基因过表达而表现出显性表型。待引入的启动子可以是任意能够在期望生物体内(在本案中是植物)指导基因表达的启动子。例如，组成型、组织偏好型、细胞类型偏好型和诱导型启动子都适用于T-DNA激活。

也可以通过TILLING(靶向诱导的基因组局部突变)技术将遗传修饰引入DEL1基因座。这是一种诱变技术，其用于产生和/或鉴定并最终分离诱变的能够呈现DEL1或DEL1f活性的DEL1核酸变体。TILLING还允许选择携带此种突变变体的植物。这些突变变体甚至可能比其天然形式基因呈现更高的DEL1或DEL1f活性。TILLING结合了高密度诱变和高通量筛选方法。TILLING一般遵循的步骤有：(a)EMS诱变(Redei GP和Koncz C，(1992)In Methods in Arabidopsis Research，Koncz C，Chua NH，Schell J编辑，新加坡，World Scientific Publishing Co，16-82页；Feldmann等，(1994)In Meyerowitz EM，Somerville CR编辑，Arabidopsis.冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，137-172页；Lightner J和Caspar T，(1998)In JMartinez-Zapater，J Salinas编辑，Methods on Molecular Biology，82卷Humana Press，Totowa，NJ，91-104页)；(b)DNA制备和个体合并；(c)目的区域的PCR扩增；(d)变性和退火以形成杂双链体；(e)DHPLC，其中库中存在的杂双链体会在色谱图上检测到额外的峰；(f)突变个体的鉴定；和(g)突变PCR产物的测序。TILLING的方法是本领域众所周知的(McCallum等(2002)Nat Biotechnol 18：455-457，由Stemple综述(2004)Nat Rev Genet5(2)：145-50)。

转座诱变是以基因中的转座子插入为基础的诱变技术，常常导致基因敲除。此技术已经用于若干植物物种，包括稻(Greco等，Plant Physiol，125，1175-1177，2001)、玉米(McCarty等，Plant J.44，52-61，2005)和拟南芥(Parinov和Sundaresan，Curr.Opin.Biotechnol.11，157-161，2000)。

TDNA激活、TILLING、定点诱变、转座诱变和定向进化是能够产生新的等位基因和DEL1变体，和/或调节其表达的技术的实例。

同源重组允许向基因组中的指定选择位置引入所选的核酸。同源重组是生物科学中常规使用的标准技术，其用于低等生物体如酵母或小立碗藓(physcomitrella)。在植物中实施同源重组的方法已经不仅在模式植物中描述(Offringa等(1990)EMBO J.9(10)：3077-84)，而且也在作物植物如稻中描述(Terada等(2002)Nat Biotech 20(10)：1030-4；Iida和Terada(2004)Curr Opin Biotech 15(2)：132-8)。

引入遗传修饰(在本案中不需引入DEL1基因座中)的优选方法是在植物中引入和表达编码上文所定义的DEL1多肽或其片段的核酸。待引入植物的核酸可以是全长的核酸，或者是上述定义的部分或杂交序列。

根据本发明的优选方面，考虑DEL1f核酸或其变体增加的表达。增加基因或基因产物表达的方法在本领域有充分的记录，其包括，例如由适当的启动子驱动的过表达、转录增强子或翻译增强子的使用。例如，如果期望增加内源基因的表达，可以将用作启动子或增强子元件的分离的核酸引入非异源形式多核苷酸的适当位置上(一般是上游)，从而上调DEL1核酸或其变体的表达。例如，可以通过突变、缺失和/或取代，在体内改变内源启动子(见Kmiec，US 5,565,350；Zarling等，PCT/US93/03868)，或者将分离的启动子在本发明基因的适当方向和距离引入植物细胞中，从而控制基因的表达。

如果期望多肽表达，通常要在多核苷酸编码区的3’末端纳入多聚腺苷酸化区域。多聚腺苷酸化区域可以源自天然基因、多种其它植物基因或T-DNA。例如，待加入的3’末端序列可以源自胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因、或可选地源自其他植物基因、或次优选地源自任何其它真核基因。

也可以在5’非翻译区或部分编码序列的编码序列中加入内含子序列，来增加在胞质中累积的成熟信使的量。已显示，在植物和动物表达构建体的转录单位中纳入的可剪接内含子均可以在mRNA和蛋白质水平增加高达1000倍的基因表达，Buchman和Berg，Mol.Cell biol.8：4395-4405(1988)；Callis等，Genes Dev.1：1183-1200(1987)。通常这类内含子被放置在转录单位5’末端附近时，其增强基因表达的作用达到最大。玉米内含子Adh1-S内含子1、2和6，Bronze-1内含子的使用是本领域公知的。通常见The MaizeHandbook，116章，Freeling和Walbot编辑，Springer，N.Y.(1994)。

根据本发明另一优选的方面，考虑DEL1核酸序列降低的表达(减少或基本上消除)。

本文述及的“减少或基本上消除”应理解为表示内源基因表达和/或多肽水平和/或多肽活性相对于对照植物降低。减少或基本上消除按照递增的优选顺序与对照植物相比减少至少10％、20％、30％、40％或50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％、96％、97％、98％、99％。

本文述及的“内源基因”不仅指以其天然形式见于植物的所讨论基因(即不存在任何认为干预)，而且指分离形式的相同基因(或基本上同源的核酸/基因)，其随后被(重新)引入植物中(转基因)。例如，含此类转基因的转基因植物可能会遭遇转基因表达的基本上减少和/或内源基因表达的基本上减少。

为减少或基本上消除植物中内源基因的表达，需要足够长度的核酸序列的基本上连续的核苷酸。为进行基因沉默，可以少至20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10或更少的核苷酸，或者可以多至整个基因(包括5’和/或3’UTR，部分或全部)。基本上连续的核苷酸链可以衍生自SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：7，或者衍生自实施例1表A所示的任一核酸序列，或者衍生自能够编码表A所示任一氨基酸序列的直系同源物、旁系同源物或同源物的任一核酸。本文所讨论的用于减少或基本上消除内源基因表达的多种方法并不要求编码(功能性)多肽的核酸序列。

这种减少或基本上消除的表达可以利用常规工具和技术实现。减少或基本上消除内源基因表达的优选方法是在植物中引入和表达遗传构建体，而核酸(在本案中为基本上连续的核苷酸链，衍生自SEQ ID NO：1或SEQID NO：7，或者衍生自实施例1表A所示的任一核酸序列，或者衍生自能够编码表A所示任一氨基酸序列的直系同源物、旁系同源物或同源物的任一核酸)作为以间隔臂(非编码DNA)分开的反向重复(部分或全部)克隆在所述构建体中。

在这样的优选方法中，内源基因的表达利用反向重复的核酸或其部分(在本案中为基本上连续的核苷酸链，衍生自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：7，或者衍生自实施例1表A所示的任一核酸序列，或者衍生自能够编码表A所示任一氨基酸序列的直系同源物、旁系同源物或同源物的任一核酸)[优选能够形成发夹结构]通过RNA介导的沉默而减少或基本上消除。反向重复克隆在含控制序列的表达载体中。非编码DNA核酸序列(间隔臂，例如基质粘附区片段(MAR)、内含子、多聚接头等)位于形成反向重复的两个反向核酸之间。在反向重复转录之后，形成具有自身互补结构的嵌合RNA(部分或全部)。此双链RNA结构称为发夹RNA(hpRNA)。HpRNA被植物加工为siRNA，其被掺入到RNA诱导的沉默复合物(RISC)中。RISC还切割mRNA转录物，由此基本上减少待翻译为多肽的mRNA转录物的数目。关于更多的常规细节，参阅例如Grierson等(1998)WO 98/53083；Waterhouse等(1999)WO 99/53050)。

实施本发明的方法并不依赖于在植物中引入和表达其中已克隆了作为反向重复的核酸的遗传构建体，而是多种众所周知的“基因沉默”方法中的任何一种或多种均可用于实现相同的效果。

一种这样的用于减少内源基因表达的方法是RNA介导的基因表达沉默(下调)。这种情况下的沉默由植物中与靶内源基因基本上相似的双链RNA序列(dsRNA)触发。这种dsRNA还进一步被植物加工为大约20至大约26个核苷酸，称为短干扰RNA(siRNA)。SiRNA被掺入到RNA诱导的沉默复合物(RISC)中，后者切割内源靶基因的mRNA转录物，由此基本上减少待翻译为多肽的mRNA转录物的数目。优选双链RNA序列对应于靶基因。

RNA沉默方法的另一实例包括以有义方向向植物中引入核酸序列或其部分(在本案中为基本上连续的核苷酸链，衍生自SEQ ID NO：1或SEQID NO：7，或者衍生自实施例1表A所示的任一核酸序列，或者衍生自能够编码表A所示任一氨基酸序列的直系同源物、旁系同源物或同源物的任一核酸)。“有义方向”是指DNA序列与其mRNA转录物同源。因此引入植物中的将是至少一个拷贝的核酸序列。附加的核酸序列将会减少内源基因的表达，产生称为共抑制的现象。如果向植物中引入若干附加拷贝的核酸序列，则基因表达的减少将会更加显著，因为高水平转录物与共抑制触发之间存在正相关的关系。

RNA沉默方法的另一实例包括利用反义核酸序列。“反义”核酸序列包含与编码蛋白质的“有义”核酸序列互补的核苷酸序列，即与双链cDNA分子的编码链互补或与mRNA转录物序列互补。反义核酸序列优选与待沉默的内源基因互补。互补性可位于基因的“编码区”和/或“非编码区”。术语“编码区”指含有翻译成氨基酸残基的密码子的核苷酸序列区域。术语“非编码区”指侧接编码区的5’和3’序列，其被转录但不被翻译成氨基酸(也称为5’和3’非翻译区)。

可以根据Watson和Crick碱基配对原则设计反义核酸序列。反义核酸序列可以与完整核酸序列(在本案中为基本上连续的核苷酸链，衍生自SEQID NO：1或SEQ ID NO：7，或者衍生自实施例1表A所示的任一核酸序列，或者衍生自能够编码表A所示任一氨基酸序列的直系同源物、旁系同源物或同源物的任一核酸)互补，而且还可以是仅与部分核酸序列(包括mRNA5’和3’UTR)反义的寡核苷酸。例如，反义寡核苷酸序列可以与编码多肽的mRNA转录物翻译起始位点周围的区域互补。适宜的反义寡核苷酸序列的长度为本领域公知，并且长度可始于大约50、45、40、35、30、25、20、15或10个核苷酸或更短。可以利用本领域公知的方法通过化学合成和酶促连接反应构建根据本发明的反义核酸序列。例如，可以利用天然存在的核苷酸或多种修饰的核苷酸来化学合成反义核酸序列(如反义寡核苷酸序列)，设计所述修饰的核苷酸以增加分子的生物稳定性，或增加反义与有义核酸序列之间形成的双链体的物理稳定性，例如可以利用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。可用于产生反义核酸序列的修饰核苷酸的实例为本领域熟知。已知的核苷酸修饰包括甲基化、环化和“加帽”以及用类似物如肌苷取代一个或多个天然存在的核苷酸。核苷酸的其他修饰为本领域熟知。

可利用表达载体通过生物学方法生产反义核酸序列，所述表达载体中已经亚克隆了反义方向的核酸序列(即由插入核酸转录的RNA将与目的靶核酸呈反义取向)。优选反义核酸序列的植物生产通过稳定整合的核酸构建体进行，所述构建体含有启动子、有效连接的反义寡核苷酸和终止子。

用于进行本发明方法中的沉默的核酸分子(无论是引入到植物中还是原位产生)与编码多肽的mRNA转录物和/或基因组DNA杂交或结合，由此抑制蛋白质的表达，例如通过抑制转录和/或翻译而实现。杂交可以通过常规的核苷酸互补性而形成稳定的双链体，或者，例如在结合DNA双链体的反义核酸序列的情况下，通过双链体大沟的特异性相互作用实现。可以通过转化或直接向特定的组织位点注射而将反义核酸序列引入到植物中。可选地，可以修饰反义核酸序列，以靶向选择的细胞，然后系统施用。例如，为进行系统施用，可以修饰反义核酸序列，从而其与在选择的细胞表面上表达的受体或抗原特异性结合，例如，将反义核酸序列与结合细胞表面受体或抗原的肽或抗体进行连接。也可以利用本文所述的载体将反义核酸序列递送到细胞中。

根据另一方面，反义核酸序列为异头型(anomeric)核酸序列。异头型核酸序列与互补RNA形成特异性的双链杂合体，其中与常见的β单元(b-unit)相反，两条链彼此平行(Gaultier等(1987)Nucl Ac Res 15：6625-6641)。反义核酸序列也可以包含2’-O-甲基核糖核苷酸(Inoue等(1987)Nucl Ac Res 15，6131-6148)或嵌合RNA-DNA类似物(Inoue等(1987)FEBS Lett.215，327-330)。

也可以利用核酶实施内源基因表达的减少或基本上消除。核酶为具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，其能够切割与之具有互补区域的单链核酸序列如mRNA。因此核酶(如锤头状核酶(如Haselhoff和Gerlach(1988)Nature 334，585-591所述))可用于催化切割编码多肽的mRNA转录物，由此基本上减少待翻译为多肽的mRNA转录物的数目。可以设计对核酸序列具有特异性的核酶(参见例如：Cech等美国专利No.4,987,071；和Cech等美国专利No.5,116,742)。可选地，可利用对应于核酸序列的mRNA转录物从RNA分子库中选择具有特异性核糖核酸酶活性的催化性RNA(Bartel和Szostak(1993)Science 261，1411-1418)。本领域公知核酶在植物基因沉默方面的用途(如Atkins等(1994)WO 94/00012；Lenne等(1995)WO 95/03404；Lutziger等(2000)WO 00/00619；Prinsen等(1997)WO 97/13865和Scott等(1997)WO 97/38116)。

也可以通过插入诱变(例如T-DNA插入或转座子插入)或通过如Angell和Baulcombe((1999)Plant J 20(3)：357-62)、(Amplicon VIGS WO98/36083)或Baulcombe(WO 99/15682)等等所述的策略实现基因沉默。因此，根据本发明另一优选的方面，提供了经由插入诱变通过下调内源DEL1基因的表达来增加植物产率和/或增加胁迫抗性的方法。

如果内源基因中存在突变和/或随后引入植物中的分离的基因/核酸中存在突变，也可以发生基因沉默。无功能多肽可以造成减少或基本上消除。例如，多肽可以结合多种相互作用的蛋白质；因此一个或多个突变和/或截短可以确保多肽仍然能够结合相互作用的蛋白质(如受体蛋白质)但是不能呈现其正常的功能(如信号传递配体)。

另一引起基因沉默的方法是靶向与基因调控区(如启动子和/或增强子)互补的核酸序列，以形成三螺旋结构，防止靶细胞中基因的转录。参见Helene，C.，Anticancer Drug Res.6，569-84，1991；Helene等Ann.N.Y.Acad.Sci.660，27-36 1992；和Maher，L.J.Bioassays 14，807-15，1992。

其他方法，如利用针对内源多肽的抗体植物原位(in planta)抑制其功能，或干扰多肽所参与的信号传递通路，将是本领域技术人员众所周知的。尤其可以考虑人造分子可用于抑制靶多肽的生物功能或干扰靶多肽所参与的信号传递通路。

可选地，可以设置筛选程序以鉴定植物群中基因的天然变体，所述变体编码活性减少的多肽。此类天然变体也可用于例如实施同源重组。

人工和/或天然微RNA(miRNA)可用于敲除基因表达和/或mRNA翻译。内源miRNA为单链小RNA，通常长度19-24个核苷酸。其功能主要是调控基因表达和/或mRNA翻译。大多数植物微RNA(miRNA)与其靶序列具有完美或近乎完美的互补性。不过存在着具有多达5个错配的天然靶标。微RNA由具有特征性折回(fold-back)结构的较长RNA通过Dicer家族的双链特异性Rnase加工而来。微RNA一经加工，就通过结合RNA诱导的沉默复合物(RISC)的主要组分Argonaute蛋白而掺入其中。MiRNA作为RISC的特异性组分起作用，因为其与细胞质中的靶核酸主要是mRNA进行碱基配对。随后的调控事件包括靶mRNA切割和破坏和/或翻译抑制。因此miRNA过表达的效应通常反映为靶基因的mRNA水平下降。

人工微RNA(amiRNA)长度通常为21个核苷酸，可以特异性地进行遗传改造，以负调控单个或多个目的基因的基因表达。植物微RNA靶标选择的决定因素为本领域众所周知。靶标识别的经验参数已有定义，且能够用于辅助设计特异性amiRNA，Schwab R，2005。用于设计和产生amiRNA及其前体的便捷工具也是公众可获得的，Schwab等，2006。

为实现最佳性能，用于减少植物中内源基因表达基因沉默技术要求使用来自单子叶植物的核酸序列转化单子叶植物，以及用来自双子叶植物的核酸序列转化双子叶植物。优选将来自任何给定植物物种的核酸序列引入到相同的物种中。例如，将来自稻的核酸序列转化到稻植物中。不过，并非绝对要求待引入的核酸序列来源于与待引入的植物相同的植物物种。内源靶基因与待引入的核酸基本上同源就已足够。

上文所述的是用于减少或基本上消除植物中内源基因表达的多种方法的实例。本领域技术人员将能够容易地改造上述方法进行沉默，从而通过例如使用适宜的启动子，实现内源基因在整株植物或其部分中减少的表达。

旨在沉默基因表达的遗传构建体可以含有相对于启动子序列而言有义和/或反义方向的DEL1核苷酸序列，例如SEQ ID NO：7所示的序列(或其一个或多个部分)。本发明的方法可采用正向或反向重复形式的至少部分内源基因的多个有义或反义拷贝。也可以通过向植物中引入至少部分反义形式的DEL1核苷酸序列，例如SEQ ID NO：7所示的序列，改良植物的生长特性，尤其产率增加和/或胁迫抗性增加。应当清除部分核酸(部分)能够实现期望的结果。同源反义基因比异源反义基因更为优选，同源基因为来自引入沉默构建体的相同植物物种的植物基因，而异源基因为来自相关或无关植物物种的基因。

本发明还提供遗传构建体和载体，以促进用于本发明方法的核苷酸序列的引入和/或表达。

因此，提供的基因构建体含有：

(i)如上文所定义的DEL1多肽编码核酸或其变体；

(ii)一个或多个能够驱动(i)中核酸序列表达的控制序列；和任选的

(iii)转录终止序列。

可以使用本领域技术人员熟知的重组DNA技术构建用于本发明方法的构建体。可以将基因构建体插入可商购的、适合于转化进入植物并适于在转化的细胞中表达目的核酸的载体中。

使用含有目的序列(即编码DEL1f多肽或等同的DEL1蛋白片段的核酸，或设计用于减少或基本上消除内源DEL1基因表达的核酸序列)的载体转化植物。将目的序列有效连接于一个或多个控制序列(至少连接于启动子)。术语“调控元件”、“控制序列”和“启动子”在本文中都可互换使用，从广义上是指能够影响与之相连的序列表达的调控核酸序列。术语“启动子”通常指位于基因转录起点上游的核酸控制序列，且参与识别和结合RNA聚合酶以及其他蛋白质，由此指导有效连接核酸的转录。上述术语包括源自典型真核生物基因组基因的转录调控序列(包括具有或没有CCAAT盒序列的TATA盒，其对于精确的转录起始是必需的)，以及另外的调控元件(即上游激活序列、增强子和沉默子)，其通过应答发育刺激和/或外部刺激或以组织特异性方式改变基因表达。该术语还包括了经典原核生物基因的转录调控序列，在此情况下可以包括-35盒序列和/或-10盒转录调控序列。术语“调控元件”也包含合成的融合分子或衍生物，其赋予、激活或增强细胞、组织或器官中核酸分子的表达。本文所用的术语“有效连接”指在启动子序列和目的基因之间的功能性连接，以使启动子序列能起始目的基因的转录。

有利地，可以使用任意类型的启动子驱动核酸序列的表达。术语“启动子”指位于基因转录起点上游的核酸控制序列，且参与识别和结合RNA聚合酶以及其他蛋白质，由此指导有效连接核酸的转录。“植物”启动子包含调控元件，其介导编码序列区段在植物细胞中的表达。从而，植物启动子无需为植物来源的，而是可以来源于病毒或微生物，例如，特别是来源于攻击植物细胞的病毒。“植物启动子”也可以来源于植物细胞，例如，来源于经本文所述的欲在本发明方法中表达的核酸序列转化的植物。这对于其他“植物”调控信号同样适用，例如“植物”终止子的情况。位于用于本发明方法的核苷酸序列上游的启动子可以通过一个或多个核苷酸取代、插入和/或缺失进行修饰，而不会干扰启动子、开放阅读框(ORF)或3’-调控区如终止子或远离ORF位置上的其他3’调控区的功能或活性。此外还有可能通过修饰启动子的序列增加其活性，或者完全替换为更具活性的启动子、甚至是来自异源生物体的启动子。为在植物中表达，核酸分子必须如上文所述的那样，有效连接于或者包含合适的启动子，所述启动子在合适的地点适时地以期望的空间表达模式表达所述基因。

启动子可以是组成型启动子，是指在生长发育的大多数但不必是所有阶段中、并且在大多数环境条件下、在至少一种细胞、组织或器官中转录激活的启动子。可选地，启动子可以是诱导型启动子，即响应化学(综述参见Gatz 1997，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.，48：89-108)、环境或物理刺激，具有诱导的或增加的转录起始。其他诱导型启动子的实例是胁迫诱导型启动子，即当植物接触多种胁迫条件时激活的启动子或者是病原体诱导型启动子。

另外或备选的，启动子可以是器官特异性或组织特异性的启动子，即能够在某些器官或组织，如在叶、根、种子等组织中优先起始转录的启动子；或者可以是普遍存在的启动子，基本上在生物体的所有组织或细胞中激活；或者启动子可以是发育调控型的，从而在某些发育阶段或在发生发育改变的植物部分激活。能够仅在某些器官或组织中起始转录的启动子在文中称为“器官特异性”或“组织特异性”启动子，与此类似，能够仅在某些细胞中起始转录的启动子在文中称为“细胞特异性”启动子。

优选地，DEL1f核酸(即编码DEL1f多肽的核酸)或其变体有效连接于种子特异性启动子。种子特异性启动子主要在种子组织中转录激活，但不必仅在种子组织中激活(渗漏表达的情况下)。种子特异性启动可以在种子发育和/或萌发期间激活。种子特异性启动在本领域众所周知。优选种子特异性启动是如SEQ ID NO：5所示的启动子或功能等同的启动子。应当清楚，本发明的实用性不局限于SEQ ID NO：1所示的DEL1f核酸，本发明的实用性也不局限于受种子特异性启动子驱动的DEL1f核酸的表达。同样可用于驱动DEL1核酸表达的其他种子特异性启动子的实例如下表2所示。更多种子特异性启动子的实例由Qing Qu和Takaiwa(Plant Biotechnol.J.2，113-125，2004)给出，其公开内容作为参考并入本文，就如同充分阐述的那样。

表2：种子特异性启动子的实例

基因来源	参考文献
		种子特异性基因	Simon等，Plant Mol.Biol.5：191，1985；Scofield等，J.Biol.Chem.262：12202，1987；Baszczynski等，Plant Mol.Biol.14：633，1990.
巴西果白蛋白	Pearson等，Plant Mol.Biol.18：235-245，1992.
		豆球蛋白	Ellis等，Plant Mol.Biol.10：203-214，1988.
谷蛋白(稻)	Takaiwa等，Mol.Gen.Genet.208：15-22，1986；Takaiwa等，FEBS Letts.221：43-47，1987.
		玉米醇溶蛋白	Matzke等Plant Mol Biol，14(3)：323-32 1990
napA	Stalberg等，Planta 199：515-519，1996.
		小麦LMW和HMW麦谷蛋白-1	Mol Gen Genet 216：81-90，1989；NAR 17：461-2，1989
小麦SPA	Albani等，Plant Cell，9：171-184，1997

小麦α、β、γ-小麦醇溶蛋白	EMBO J.3：1409-15，1984
		大麦Itr1启动子	Diaz等(1995)Mol Gen Genet 248(5)：592-8
大麦B1、C、D大麦醇溶蛋白	Theor Appl Gen 98：1253-62，1999；Plant J 4：343-55，1993；Mol Gen Genet 250：750-60，1996
		大麦DOF	Mena等，The Plant Journal，116(1)：53-62，1998
blz2	EP99106056.7
		合成启动子	Vicente-Carbajosa等，Plant J.13：629-640，1998.
稻醇溶谷蛋白NRP33	Wu等，Plant Cell Physiology 39(8)885-889，1998
		稻a-球蛋白Glb-1	Wu等，Plant Cell Physiology 39(8)885-889，1998
稻OSH1	Sato等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：8117-8122，1996
		稻α-球蛋白REB/OHP-1	Nakase等Plant Mol.Biol.33：513-522，1997
稻ADP-葡萄糖焦磷酸化酶	Trans Res 6：157-68，1997
		玉蜀黍ESR基因家族	Plant J 12：235-46，1997
高粱α-高梁醇溶蛋白	DeRose et al.，Plant Mol.Biol 32：1029-35，1996
		KNOX	Postma-Haarsma等，Plant Mol.Biol.39：257-71，1999
稻油质蛋白	Wu等，J.Biochem.，123：386，1998
		向日葵油质蛋白	Cummins等，Plant Mol.Biol.19：873-876，1992
PRO0117，推定的稻40S核糖体蛋白	WO2004/070039
		PRO0136，稻丙氨酸转氨酶	未发表
PRO0147，胰蛋白酶	未发表

抑制剂ITR1(大麦)
		PRO0151，稻WSI18	WO 2004/070039
PRO0175，稻RAB21PRO005	WO 2004/070039WO 2004/070039
		PRO0095	WO 2004/070039
α-淀粉酶(Amy32b)	Lanahan等，Plant Cell 4：203-211，1992；Skriver等，Proc Natl Acad Sci USA 88：7266-7270，1991
		组织蛋白酶β样基因	Cejudo等，Plant Mol Biol 20：849-856，1992
大麦Ltp2	Kalla等，Plant J.6：849-60，1994
		Chi26	Leah等，Plant J.4：579-89，1994
玉蜀黍B-Peru	Selinger等，Genetics 149；1125-38，1998

在另一实施方案中，DEL1核酸或其变体有效连接于上文所定义的组成型启动子。优选组成型启动子具有与CaMV 35S启动子相当的表达模式，组成型启动子具有与CaMV 35S启动子相同的表达模式，最优选组成型启动子是CaMV 35S启动子。应当清楚，本发明的实用性并不局限于SEQ IDNO：1所示的DEL1f核酸，而且本发明的实用性也不局限于由组成型启动子所驱动的DEL1f核酸的表达。也可用来驱动DEL1核酸表达的其他组成型启动子的实例示于下表3中。

表3：组成型启动子的实例

基因来源	参考文献
		肌动蛋白	McElroy等，Plant Cell，2：163-171，1990
CAMV 35S	Odell等，Nature，313：810-812，1985
		CaMV 19S	Nilsson等，Physiol.Plant.100：456-462，1997
GOS2	de Pater等，Plant J Nov；2(6)：837-44，1992，WO 2004/065596
		泛素	Christensen等，Plant Mol.Biol.18：675-689，1992

稻亲环蛋白	Buchholz等，Plant Mol Biol.25(5)：837-43，1994
		玉蜀黍H3组蛋白	Lepetit等，Mol.Gen.Genet.231：276-285，1992
苜蓿H3组蛋白	Wu等Plant Mol.Biol.11：641-649，1988
		肌动蛋白2	An等，Plant J.10(1)；107-121，1996
34S FMV	Sanger等.，Plant.Mol.Biol.，14，1990：433-443
		Rubisco小亚基	US 4,962,028
OCS	Leisner(1988)Proc Natl Acad Sci USA 85(5)：2553
		SAD1	Jain等，Crop Science，39(6)，1999：1696
SAD2	Jain等，Crop Science，39(6)，1999：1696
		nos	Shaw等(1984)Nucleic Acids Res.12(20)：7831-7846
V-ATPase	WO 01/14572
		超级启动子	WO 95/14098
G盒蛋白	WO 94/12015

为鉴定功能等同的启动子，可以对候选启动子的启动子长度和/或表达模式进行分析，例如将启动子有效连接于报告基因，并测定报告基因在植物多种组织中的表达水平和模式。适宜的众所周知的报告基因包括例如β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶。通过测量β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶的酶促活性来测定启动子活性。然后可以将启动子长度和/或表达模式与参照启动子(如本发明方法中所用的启动子)进行比较。可选地，可以利用本领域公知的方法如Northern印迹(RNA分析)结合放射自显影图的密度定量分析、定量实时PCR或RT-PCR，通过定量mRNA水平或者通过将本发明方法中所用核酸的mRNA水平与持家基因如18S rRNA的mRNA水平进行比较，来测定启动子长度(Heid等，1996 Genome Methods 6：986-994)。通常，“弱启动子”旨在表示驱动编码序列低水平表达的启动子。“低水平”旨在表示每个细胞大约1/10,000个转录物至大约1/100,000个转录物，至大约1/500,0000个转录物的水平。相反，“强启动子”驱动编码序列高水平表达，或者每个细胞大约1/10个转录物至大约1/100个转录物，至大约1/1,000个转录物的水平。

任选的，还可以在引入植物的构建体中使用一个或多个终止子序列。术语“终止子”包括控制序列，其为位于转录单位末端的DNA序列，传递信号引发初级转录物的3’加工和多聚腺苷酸化以及转录的终止。终止子可以来自天然基因、多种其它植物基因或来自T-DNA。例如，待加入的终止子可以来自胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因、或可选地源自其他植物基因、或次优选地源自任何其它真核基因。另外的调控元件可以包括转录和翻译增强子。本领域技术人员将知道适合用于实施本发明的终止子和增强子的序列。这类序列为本领域技术人员所公知或者可以容易地获得。

其他控制序列(除启动子、增强子、沉默子、内含子序列、3’UTR和/或5’UTR区域之外)可以是蛋白质和/或RNA稳定元件。这类序列为本领域技术人员所公知或者可以容易地获得。

本发明的遗传构建体还包括在特定细胞类型中维持和/或复制所需的复制起点序列。一个实例是需要将遗传构建体作为附加型遗传元件(如质粒或粘粒分子)在细菌细胞中维持的情况。优选的复制起点包括但不限于f1-ori和colE1。

为检测本发明方法中所用核酸序列的成功转移和/或选择含有这些核酸的转基因植物，最好使用标记基因(或报告基因)。因此，遗传构建体可以任选地包括可选择的标记基因。如本文所用，术语“可选择的标记”或“可选择的标记基因”或“报告基因”包括赋予细胞表型的任何基因，该基因在细胞中表达，有利于鉴定和/或选择经本发明的核酸构建体转染或转化的细胞。这些标记基因能够通过一系列不同的原理鉴定核酸分子的成功转移。适当的标记可以选自赋予抗生素或除草剂抗性的标记，其引入新的代谢性状或允许可视选择。可选择标记基因的实例包括赋予抗生素抗性的基因(例如磷酸化新霉素和卡那霉素的nptII，或磷酸化潮霉素的hpt，或者赋予对例如博来霉素、链霉素、四环素、氯霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、遗传霉素(G418)、壮观霉素或杀稻瘟菌素抗性的基因)、赋予除草剂抗性的基因(例如提供Basta抗性的bar；提供草甘膦抗性的aroA或gox，或者赋予对例如咪唑啉酮、膦丝菌素或磺胺脲的抗性的基因)、或者提供代谢性状的基因(例如允许植物使用甘露糖作为唯一碳源的manA，或有关木糖利用的木糖异构酶；或抗营养标记如对2-脱氧葡萄糖的抗性)。可视标记基因的表达导致形成颜色(例如β-葡糖醛酸糖苷酶GUS或β-半乳糖苷酶及其着色底物例如X-Gal)、发光(例如荧光素/荧光素酶系统)或荧光(绿色荧光蛋白GFP及其衍生物)。这仅仅是一小部分可能的标记的清单。技术人员对这类标记极为熟悉。优选根据不同生物体和选择方法来使用不同的标记。

已知核酸稳定或瞬时整合进植物细胞，仅少数细胞摄入外来DNA，并整合进其基因组(如果期望的话)，这取决于所用的表达载体和所用的转染技术。为鉴定并选择这些整合体，通常将编码可选择标记(如上文所述那些)的基因与目的基因一起引入宿主细胞中。例如，这些标记可在突变体中使用，所述突变体中原有的这些基因没有功能，例如通过常规方法而缺失。此外，编码可选择标记的核酸分子与编码本发明多肽或本发明方法所用的序列可以在同一个载体中引入宿主细胞，或者在单独的载体中。由所引入的核酸稳定转染的细胞可以例如通过选择(例如，整合有可选择标记的细胞存活而其他细胞死去)予以鉴定。

一旦成功引入核酸，将不再需要或不期望转基因宿主细胞中存在标记基因，特别是抗生素和除草剂抗性基因，所以根据本发明引入核酸的方法有利地采用能够除去或切除这些标记基因的技术。一种这样的方法是称为共转化的方法。共转化法采用两个载体同时进行转化，一个载体携带根据本发明的核酸，而第二载体携带标记基因。较大比例的转化体接收或者对于植物而言含有(高达40％或以上的转化体)两个载体。对于农杆菌转化，转化体通常只接收载体的一部分，即为T-DNA所侧接的序列，其通常指表达盒。随后可通过杂交从转化植物中除去标记基因。在另一种方法中，利用整合进转座子的标记基因与期望的核酸一起进行转化(称为Ac/Ds技术)。转化体可与转座酶来源杂交，或者用赋予转座酶表达的核酸瞬时或稳定转化转化体。在有些情况下(约10％)，一旦成功进行了转化，转座子跳出宿主细胞基因组并丢失。在其他一些情况下，转座子跳至不同的位置。在这些情况下，必须通过杂交消除标记基因。在微生物学领域，研发了有可能或便于检测此类事件的技术。另一有利的方法有赖于称为重组系统的方法，其优势在于可以免除杂交消除步骤。最著名的这类系统称为Cre/lox系统。Cre1为重组酶，其切除位于loxP序列之间的序列。如果标记基因整合在loxP序列之间，一旦成功进行了转化，由于该重组酶的表达，其得以切除。其他重组系统有HIN/HIX、FLP/FRT及REP/STB系统(Tribble等，J.Biol.Chem.，275，2000：22255-22267；Velmurugan等，J.Cell Biol.，149，2000：553-566)。根据本发明的核酸有可能位点特异性地整合进植物基因组。这些方法自然也可以应用于微生物如酵母、真菌或细菌。

本发明还包括可通过本发明方法获得的植物或其部分(包括种子)。本发明因此提供了可通过本发明方法获得的植物，所述植物或植物部分引入了DEL1f核酸或其变体。

本发明还提供了产生具有增加的产率和/或增加的胁迫抗性的转基因植物的方法，所述方法包括在植物中引入和表达DEL1f核酸或其变体。

出于本发明的目的，“转基因的”、“转基因”或“重组”是指，例如，核酸序列、含有所述核酸序列的表达盒、基因构建体或载体或用所述核酸序列转化的生物体、根据本发明的表达盒或载体、通过重组方法产生的所有那些构建体，其中：

a)编码用于本发明方法的蛋白质的核酸序列，或

b)有效连接于根据本发明核酸序列的遗传控制序列，例如启动子，或

c)a)和b)

不存在于其天然遗传环境中，或者已通过重组方法修饰，有可能修饰采取的形式为例如一个或多个核苷酸残基的取代、添加、缺失、倒位或插入。天然遗传环境应理解为原始植物中的天然基因组或染色体座位或者存在于基因组文库之中。在基因组文库的情况下，优选维持核酸序列的天然遗传环境，至少是部分地维持。至少在核酸序列一侧侧接的环境序列长度至少为50bp、优选至少500bp、特别优选至少1000bp、最优选至少5000bp。当天然存在的表达盒——例如核酸序列的启动子与编码上文所述的用于本发明方法的多肽的相应核酸之间天然存在着的组合——经非天然的合成(“人工”)方法如诱变处理修饰时，此表达盒变成转基因表达盒。例如，合适的方法描述在US 5,565,350或WO 00/15815中。

更具体地，本发明提供了产生具有增加的产率和/或增加的胁迫抗性的转基因植物的方法，所述方法包括：

(i)向植物或植物细胞中引入和表达DEL1f核酸或其变体；和

(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞。

可以将核酸直接引入植物细胞或植物本身(包括引入组织、器官或植物的任何其它部分)。根据本发明的优选方面，优选通过转化将核酸引入植物。

外来基因转移进入植物基因组中称为转化。植物物种的转化目前是一种相当常规的技术。有利地，可以使用几种转化方法的任一向适当的祖先细胞引入目的基因。可以利用描述用于转化方法以及由植物组织或植物细胞再生植物的方法来进行瞬时或稳定转化。转化方法包括用脂质体、电穿孔、增强游离DNA摄取的化学物质、直接向植物注射DNA、粒子枪轰击、用病毒或花粉转化和显微投影(microprojection)。方法可以选自用于原生质体的钙/聚乙二醇方法(Krens，F.A.等，(1882)Nature 296，72-74；NegrutiuI.等，(1987)Plant Mol.Biol.8：363-373)；原生质体的电穿孔法(Shillito R.D.等，1985 Bio/Technol 3，1099-1102)；植物材料的显微注射(Crossway A.等，(1986)Mol.Gen Genet 202：179-185)；DNA或RNA包被的粒子轰击(KleinT.M.等，(1987)Nature 327：70)；(非整合的)病毒感染，等等。优选通过农杆菌介导的转化，产生转基因植物，包括转基因稻植物。有利的转化法是植物原位(in planta)转化。为此，有可能例如使农杆菌作用于植物种子，或用农杆菌接种植物分生组织。根据本发明，证明使转化的农杆菌悬液作用于完整植株或至少花原基尤为有利。随后培养植物，直至获得所处理植物的种子(Clough和Bent，Plant J.(1998)16，735-743)。农杆菌介导的稻转化方法包括众所周知的稻转化方法，例如在以下任一文献中描述的方法：欧洲专利申请EP 1198985A1，Aldemita和Hodges(Planta，199：612-617，1996)；Chan等(Plant Mol.Biol.22(3)491-506，1993)，Hiei等(Plant J.6(2)：271-282，1994)，其公开的内容如同其陈述的全部内容那样并入本文作为参考。至于谷物转化，优选的方法如Ishida等(Nat.Biotechnol.14(6)：745-50，1996)或Frame等(Plant Physiol.129(1)：13-22，2002)所述，其公开的内容如同其陈述的全部内容那样并入本文作为参考。作为举例，所述方法还由B.Jenes等，Techniques for Gene Transfer，在Transgenic Plants，卷1，Engineering and Utilization，编辑S.D.Kung和R.Wu，Academic Press(1993)128-143以及Potrykus Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991)205-225)中进一步描述。优选将待表达的核酸或构建体克隆到载体中，所述载体适用于转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)，例如pBin19(Bevan等，Nucl.Acids Res.12(1984)8711)。然后以已知的方式利用由这样的载体转化的农杆菌来转化植物，如用作为模型的植物，比如拟南芥(在本发明的范围内拟南芥不视为作物植物)或作物植物，例如作为举例的烟草植物，例如通过在农杆菌溶液中水浴擦伤的叶子或剁碎的叶子，然后在合适的培养基中培养之。例如，通过根癌农杆菌的植物转化由

和Willmitzer在Nucl.Acid Res.(1988)16，9877中描述，或者尤其是由于F.F.White，Vectors for Gene Transfer in Higher Plants在Transgenic Plants，卷1，Engineering and Utilization，编辑S.D.Kung和R.Wu，Academic Press，1993，15-38页而为人所知。

除了转化体细胞、然后再生为完整植株以外，还有可能转化植物分生组织的细胞，特别是发育成配子的那些细胞。在这种情况下，转化的配子循着天然植物的发育而产生转基因植物。因此，例如，用农杆菌处理拟南芥的种子，并从发育中的植物获得种子，其中一定比例经转化因而是转基因的[Feldman，KA和Marks MD(1987).Mol Gen Genet 208：274-289；Feldmann K(1992).在C Koncz，N-H Chua和J Shell编辑Methods inArabidopsis Research.Word Scientific，Singapore，第274-289页]。可选方法基于荧光的反复去除以及莲座叶中心切除部位与转化农杆菌一起进行的孵育，由此在随后的时间点同样能够获得转化的种子(Chang(1994).PlantJ.5：551-558；Katavic(1994).Mol Gen Genet，245：363-370)。然而，特别有效的方法是真空渗透法，及其改良法如“浸花法”(floral dip)。对于拟南芥的真空渗透，用农杆菌悬液减压处理完整植株[Bechthold，N(1993).C RAcad Sci Paris Life Sci，316：1194-1199]，而对于“浸花法”，将发育中的花组织与表面活性剂处理的农杆菌悬液一起短暂孵育[Clough，SJ und Bent，AF(1998).The Plant J.16，735-743]。在两种情况下均收获一定比例的转基因种子，且可通过在上述选择性条件下培养而将这些种子与非转基因种子区分开来。另外，质体的稳定转化是有利的，因为质体在多数作物中母系遗传，减少或消除了转基因通过花粉流失的风险。叶绿体基因组的转化通常通过Klaus等，2004[Nature Biotechnology 22(2)，225-229]系统展示的方法实现。简言之，将待转化的序列与可选择的标记基因一起克隆到同源于叶绿体基因组的侧翼序列之间。这些同源侧翼序列指导转基因位点特异性整合到质体中。质体转化已在许多不同的植物物种中描述，且综述可摘自Bock(2001)Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology.J Mol Biol.2001年9月21日；312(3)：425-38或Maliga，P(2003)Progresstowards commercialization of plastid transformation technology.TrendsBiotechnol.21，20-28。其他生物技术方法最近被报道为不含标记的质体转化体的形式，这可以通过瞬时共合体标记基因产生(Klaus等，2004，NatureBiotechnology 22(2)，225-229)。

遗传修饰的植物细胞能够通过技术人员熟悉的所有方法再生。合适的方法可见于上述S.D.Kung和R.Wu、Potrykus或者

和Willmitzer的出版物。

通常在转化以后，选出存在一个或多个标记的植物细胞或细胞群，所述标记由与目的基因共转移的植物可表达基因编码，继之将转化的材料再生成整个植物。为选择转化的植物，通常将在转化过程中获得的植物材料置于选择性条件中，从而可将转化植物与非转化植物区分开来。例如，可以种植以上述方式获得的种子，并在最初的生长周期之后，通过喷雾对其进行合适的选择。另一可能性包括使用合适的选择剂，将种子，适用的情况下是在授粉之后，种植在琼脂板上，从而仅转化的种子能够长成植物。可选地，针对转化的植物筛选可选择标记如上文所述标记的存在。

DNA转移和再生之后，可评估推定转化的植物，例如用Southern分析(DNA印迹)评价目的基因的存在、拷贝数和/或基因组构造。可选的或额外地，可用Northern和/或Western分析(蛋白质印迹)监测新引入基因的表达水平，这两种技术都是本领域普通技术人员所熟知的。

产生的转化植物可以通过多种方式繁殖，如用克隆繁殖或经典的育种技术。例如，第一代(或T1)转化的植物可自交并选择纯合的第二代(或T2)转化体，T2植物进一步通过经典育种技术繁殖。

产生的转化生物体可以有多种形式。例如，它们可以是转化细胞和非转化细胞的嵌合体；克隆的转化体(例如经转化含有表达盒的所有细胞)；转化和非转化组织的嫁接体(例如在植物中，转化的根茎嫁接到非转化的接穗上)。

本发明显然延及由本文所述方法产生的任何植物细胞或植物，以及所有的植物部分及其繁殖体。本发明还延及由任意上述方法产生的初级转化或转染的细胞、组织、器官或整个植物的后代，所述后代的唯一要求是与本发明方法产生的亲本呈现同样的基因型和/或表型特征。

本发明也包括含有分离的编码上文所定义的DEL1蛋白的核酸的宿主细胞。本发明优选的宿主细胞是植物细胞。

用于本发明方法所用核酸或载体、所述表达盒或构建体或载体的宿主植物原则上有利地为所有植物，它们能够合成本发明方法中所用的多肽。

因此，如上文所述，用于本发明目的的转基因植物应理解为表示：在所述植物的基因组中，本发明方法所用的核酸不在其天然基因座上，有可能核酸将要进行同源或异源表达。不过，正如所提到的那样，转基因的也表示：尽管在植物基因组中，根据本发明的核酸或本发明方法中所用的核酸在其天然位置上，但是所述序列已相对于天然序列而被修饰，和/或天然序列的调控序列已被修饰。转基因的优选理解为表示：根据本发明的核酸在基因组中非天然的座位上表达，即同源表达，或者优选地发生核酸的异源表达。优选的转基因植物在本文提及。

本发明也延及植物的可收获部分，例如，但不限于种子、叶、果实、花、茎、根茎、块茎和球茎。本发明还涉及由这样的植物的可收获部分衍生的、优选直接衍生的产品，如干丸或干粉、油类、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。

本发明还包括具有降低的DEL1基因表达的植物突变体在改良植物生长特性、特别是增加产率和/或增加胁迫抗性中的用途。

此外，本发明还包括DEL1核酸或其变体以及DEL1多肽或其同源物的用途。

一类这样的用途涉及改良植物生长特性，特别是增加产率和/或增加胁迫抗性。产率增加包括增加的生物量、增加的种子总重量和增加的饱满种子数中的至少一种。

可以在育种程序中使用DEL1核酸或其变体或者DEL1多肽或其同源物，其中鉴定可以遗传地连接于DEL1基因或其变体的DNA标记。可以使用DEL1核酸/基因或其变体或者DEL1多肽或其同源物界定分子标记。接着可以将此DNA或蛋白质标记在育种程序中使用，以选择具有增加的产率和/或增加胁迫抗性的植物。例如，DEL1基因或其变体可以是实施例1表A中所列任一序列所示的核酸。

DEL1核酸/基因的等位基因变体也可以用于标记辅助的育种程序。这类育种程序有时需要使用例如EMS诱变，通过植物诱变处理引入等位基因变异；可选的，此程序可以以收集无意产生的所谓“天然”起源的等位基因变体开始。然后通过例如PCR鉴定等位基因变体。随后是选择步骤，用以选择所讨论序列的较好等位基因变体，所述等位基因变体赋予植物增加的产率和/或增加胁迫抗性。一般通过监测含有所研究序列的不同等位基因变体植物的生长行为来进行选择，所述不同等位基因变体是例如实施例1表A中所列任一序列的不同等位基因变体。可以在温室或田地中监测生长行为。更多任选的步骤包括，将经鉴定含有较好等位基因变体的植物与另一植物杂交。例如，可使用这种方法产生感兴趣表型特征的组合。

DEL1核酸或其变体还可以作为探针，用于对为那些基因连锁性状的一部分并作为其标志物的基因进行遗传和物理的作图。这样的信息可以在植物育种中使用，以得到具有所期望表型的株系。DEL1核酸或其变体的这类应用仅需要长度至少15个核苷酸的核酸序列。DEL1核酸或其变体可以用作限制性片段长度多态性(RFLP)标记。可用DEL1核酸或其变体探测限制酶切消化的植物基因组DNA的Southern印迹(Sambrook J，Fritsch EF和Maniatis T(1989)《分子克隆：实验室手册》)。随后使用计算机程序如MapMaker(Lander等(1987)Genomics 1：174-181)对产生的带型进行遗传分析，以构建遗传图谱。此外，可以使用核酸在含有一组个体的限制性内切酶处理的基因组DNA中探测Southern印迹，所述一组个体为代表明确的遗传杂交的亲本和子代的一组个体。记录DNA多态性的分离并用于计算在先前用此群体获得的遗传图谱中DEL1核酸或其变体的位置(Botstein等(1980)Am.J.Hum.Genet.32：314-331)。

在遗传作图中使用的植物基因衍生探针的产生和用途描述于Bematzky和Tanksley(1986)Plant Mol.Biol.Reporter 4：37-41中。众多出版物中描述过用上述方法或其变通形式对特定cDNA克隆进行遗传作图。例如，可以使用F2杂交群体、回交群体、随机交配群体、近亲同基因系和其它个体组作图。这类方法是本领域技术人员众所周知的。

核酸探针也可以用于物理作图(即在物理图谱上安置序列；见Hoheisel等In：Non-mammalian Genomic Analysis：A Practical Guide，Academicpress 1996，第319-346页，及其中引用的参考文献)。

在另一个实施方案中，核酸探针可用于直接荧光原位杂交(FISH)作图(Trask(1991)Trends Genet.7：149-154)。尽管目前FISH作图的方法倾向使用大的克隆(几个kb到几百个kb；见Laan等(1995)Genome Res.5：13-20)，但是灵敏性的提高允许在FISH作图中应用较短的探针。

用于遗传和物理作图的多种基于核酸扩增的方法可以使用所述核酸进行。实例包括等位基因特异性扩增(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med11：95-96)、PCR扩增片段的多态性(CAPS；Sheffield等(1993)Genomics16：325-332)、等位基因特异性连接(Landegren等(1988)Science 241：1077-1080)、核苷酸延伸反应(Sokolov(1990)Nucleic Acid Res.18：3671)、放射杂交作图(Walter等(1997)Nat.Genet.7：22-28)和Happy作图(Dear和Cook(1989)Nucleic Acid Res.17：6795-6807)。为实施这些方法，使用核酸序列设计和产生用于扩增反应或引物延伸反应的引物对。这类引物的设计是本领域技术人员众所周知的。使用基于PCR的遗传作图的方法，可能需要鉴定跨越相应于本发明核酸序列区域作图的亲本之间DNA序列的差异。然而，这对作图方法通常不是必要的。

根据本发明的方法得到如前所述具有增加的产率和/或增加的胁迫抗性的植物。这些有利的生长特性还可以组合其它经济上有利的性状，如另外的产率增加性状、另外的对多种胁迫的耐受性、改良多种构造特征和/或生化和/或生理学特征的性状。

附图说明

现参考以下附图描述本发明，其中：

图1显示了DEL1多肽典型的结构域结构。DEL1蛋白包含2个E2F_TDP结构域(Pfam PF02319，Interpro IPR003316)，它们代表翼状螺旋型DNA结合结构域。所述结构域以粗体标出

图2显示了多种DEL1蛋白的多重比对。星号表示多种序列中相同的氨基酸，分号表示高度保守的取代，而点表示次保守的取代

图3显示了双元载体p037，用于在稻中表达处于种子特异性启动子(内参PRO0218)控制之下的拟南芥DEL1f编码序列。

图4详述了用于执行本发明方法的序列实例。

图5表示应答递增UV-B剂量的每株植物生物量的测量结果。用所示剂量的UV-B辐射18日龄的植物。在UV-B处理后8天测量植物的生物量。数值表示平均值±SE。DEL1.2和DEL1.4分别对应于DEL1过表达株系#2和#4。DEL1 KO对应于del1-1敲除株系。

图6显示了环丁烷嘧啶二聚体(CPD)光产物的测量结果。直接经UV-B处理5小时后(A)或者另行接触白光使之能够进行DNA光修复之后(B)对18日龄植物的第5叶进行CPD总水平的测量。将CPD水平相对于Col-0植物的测量水平进行绘图。

实施例

现参考以下实施例描述本发明，所述实施例仅意在举例说明。如下实施例并非旨在完全界定或以其他方式限制本发明的范围。

实施例1：SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8相关序列的鉴定

利用数据库序列搜索工具如基本局部比对工具(BLAST)(Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410；和Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402)，在美国国家生物技术信息中心(NCBI)Entrez核苷酸数据库维护的序列中鉴定SEQ ID NO：7相关的序列(全长cDNA、EST或基因组)和/或SEQ ID NO：8相关的蛋白质序列。通常BLAST程序通过将核酸或多肽序列与序列数据库进行比较，以及通过计算匹配的统计学显著性，用于寻找序列之间具有局部相似性的区域。对核酸SEQ ID NO：8所编码的多肽运用TBLASTN算法，使用默认设置，开启过滤器，以忽略低复杂度序列。分析的输出视窗为两两比较，并根据概率分值(E值)排序，其中分值反映特定比对偶然发生的概率(E值越低，命中事件的显著性越高)。除了E值之外，还对比较进行同一性百分比记分。同一性百分比是指两比较核酸(或多肽)序列之间在特定长度上的相同核苷酸(或氨基酸)数。在有些情况下，可以调整默认参数以更改搜索的严格度。

除了NCBI中可用的可公开获得的核酸序列之外，还按照如上文所述的相同方法对专利序列数据库进行了搜索。

下表A提供了与SEQ ID NO：7所示的核酸序列以及SEQ ID NO：8所示的蛋白质序列相关的核酸和蛋白质序列列表，另外参见图4。

表A：与用于本发明方法的核酸序列(SEQ ID NO：7)

相关的核酸序列以及相应推断的多肽

名称	来源生物	核酸SEQ ID NO：	多肽SEQ ID NO：	数据库登录号	状态
						DEL1	拟南芥	7	8	NM_114685	全长
OsDEL1	稻	14	15	XM_467698	全长
						ZmDEL1	玉蜀黍	16	17	AY107996	全长
OtDEL1	Ostreococcus tauri	18	19	AY675104	全长
						MtDEL1样	蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)	20	21	/	全长
TaE2Fe	小麦	22	23	DQ353854	全长
						OsDEL1样	稻	24	25	AK120032	全长
SlDEL1样	宽叶蝇子草(Silene latifolia)	26	27	DV768235	部分
						HDEL1样	向日葵属物种	28	29	EE619641	部分
GmDEL1样	大豆	30	31	Gm59592851	全长

实施例2：相关多肽序列的比对

使用来自Vector NTI(英骏公司，Invitrogen)的AlignX，其基于流行的渐进式比对Clustal算法(Thompson等(1997)Nucleic Acids Res25：4876-4882；Chenna等(2003)Nucleic Acids Res 31：3497-3500)。默认值为空位开放罚分10，空位延伸罚分0，1，且选择的权重矩阵为Blosum 62(如果比对多肽的话)。

利用与鉴定用于实施本发明方法的多肽相关的多肽进行多重序列比对的结果示于图2。能够容易地识别两个保守的E2F_TDP结构域。

实施例3：用于实施本发明方法的多肽序列之间全局同一性百分比的计算

用于实施本发明方法的全长多肽序列之间的全局相似性和同一性百分比利用MatGAT(矩阵全局比对工具)软件(BMC Bioinformatics.2003 4：29.MatGAT：an application that generates similarity/identity matrices usingprotein or DNA sequences.Campanella JJ，Bitincka L，Smalley J；由Ledion Bitincka托管的软件)来确定。MatGAT软件无需对数据进行预比对，即可产生DNA或蛋白质序列的相似性/同一性矩阵。该程序利用Myers和Miller全局比对算法(空位开放罚分为12，而空位延伸罚分为2)进行一系列的两两比对，利用例如Blosum 62(对于多肽而言)计算相似性和同一性，然后将结果排列成距离矩阵。序列相似性示于对角线下半部，而序列同一性示于对角线上半部。

比较所用的参数有：

记分矩阵：Blosum 62

首个空位：12

延伸空位：2

多肽序列全长范围(将部分多肽序列排除在外)的全局相似性和同一性的软件分析结果示于表B。对角线上方给出同一性百分比，而对角线下方给出相似性百分比。

与SEQ ID NO：8比较，用于实施本发明方法的多肽序列之间的同一性百分比显示可低至27.5％。

表B：多肽序列全长范围的全局相似性和同一性的MatGAT结果

	1	2	3	4	5	6	7	8	9
										1.SEQID8		42.9	44.2	27.5	51.5	45.6	43.4	36.2	35.7
2.SEQID15	60.8		63.6	28.6	45.4	63.7	60.2	29.6	31.4
										3.SEQID17	63.1	76.4		29.5	45.1	74.8	69.4	30.7	31.8
4.SEQID19	46.5	44.5	45.1		30.6	28.8	28.4	21.9	24.0
										5.SEQID21	69.7	60.8	61.5	44.1		46.8	43.1	36.4	37.3
6.SEQID23	63.0	75.1	85.2	42.7	62.8		71.8	31.0	32.3
										7.SEQID25	61.9	75.3	82.6	43.1	60.5	82.4		30.4	32.9
8.SEQID27	42.7	35.6	38.0	29.4	43.4	38.2	37.2		35.6
										9.SEQID29	47.6	41.7	43.2	35.6	49.6	42.4	43.1	53.3

实施例4：用于实施本发明方法的多肽序列中包含的结构域的鉴定

蛋白质家族、结构域和位点整合资源(Integrated Resource of ProteinFamilies，Domains and Sites(InterPro))数据库是进行基于文本以及序列的搜索常用的标签数据库的整合界面。InterPro数据库将这些数据库结合起来，它们利用不同的方法学和关于充分表征蛋白质的多样化角度生物信息，以获得蛋白质标签。合作数据库包括SWISS-PROT、PROSITE、TrEMBL、PRINTS、ProDom和Pfam、Smart和TIGRFAMs。Interpro由位于英国的欧洲生物信息学研究所(European Bioinformatics Institute)托管。

SEQ ID NO：8所示多肽序列的InterPro扫描结果示于表C

表C：SEQ ID NO：8所示多肽序列的InterPro扫描结果

数据库	登录号	登录名
			InterPro	IPR003316	E2F_TDP

实施例5：用于实施本发明方法的多肽序列的拓扑预测(亚细胞定位、跨膜...)

利用TargetP 1.1预测真核蛋白质的亚细胞定位。定位比对基于任一N-末端前序列预测的存在进行：叶绿体转运肽(cTP)、线粒体靶向肽(mTP)或分泌通路信号肽(SP)。以之为基础进行预测的分值并非真正的概率，且加起来并不必然为1。不过，分值最高的定位最可能符合TargetP，且分值(可靠性级别)之间的关系可作为所述预测多么可靠的指标。可靠性级别(RC)范围从1到5，其中1表示最强的预测。TargetP由丹麦技术大学(TechnicalUniversity of Denmark)的服务器维护。

对于经预测含有N-末端前序列的序列，还可以预测潜在的切割位点。

选择了多种参数，例如生物体类型(非植物或植物)、截断值设置(无、预先规定的截断值设置或者用户指定的截断值设置)以及切割位点的预测计算(是或否)。

SEQ ID NO：8所示多肽序列的TargetP 1.1分析结果示于表D。选择的是“植物”生物体类型，未规定截断值，并要求转运肽的预测长度。未能清晰预测到亚细胞定位，叶绿体定位仅有微弱预测(可靠性级别为3，相当地低)。因此，DEL1蛋白定位在细胞质或细胞核中。

表D：SEQ ID NO：8所示多肽序列的TargetP 1.1分析

长度(AA)	403
		叶绿体转运肽	0.269
线粒体转运肽	0.063
		分泌通路信号肽	0.053
其他亚细胞靶向	0.721
		预测的定位	/
可靠性级别	3
		预测的转运肽长度	12

可以利用许多其他的算法进行这样的分析，包括：

●ChloroP 1.1，由丹麦技术大学服务器托管；

●蛋白质寻觅亚细胞定位预测软件(Protein Prowler SubcellularLocalisation Predictor)，1.2版，由澳大利亚布里斯班昆士兰大学分子生物科学研究所(Institute for Molecular Bioscience，University of Queensland，Brisbane，Australia)的服务器托管；

●PENCE Proteome Analyst PA-GOSUB 2.5，由加拿大大阿尔贝塔埃德蒙顿阿尔贝塔大学(University of Alberta，Edmonton，Alberta，Canada)的服务器托管；

●用于亚细胞定位的PSORT(特别是WOLF PSORT)，由BrinkmanLaboratory at Simon Fraser University托管。

当使用默认值通过PSORT进行分析时，预测SEQ ID NO：8的DEL1蛋白定位在细胞核中(输出数据：nucl：10，chlo：1，cyto：1，pero：1，cysk：1)。

实施例6：DEL1活性测定

DEL1活性可以例如通过确定DNA结合活性进行测定，有多种测定法可用且为本领域众所周知(例如Kosugi&Ohashi(J.Biol.Chem.19，16553-16558，2002a)或Kosugi&Ohashi(Plant J.29，45-59，2002b所述的电泳迁移率变动分析(EMSA))。DEL1活性的另一方面即对E2F调控的启动子的阻遏，可以在有或无DEL1蛋白质的情况下，通过测量处于E2F调控的启动子控制之下的报告基因的转录进行测定(例如，如Kosugi和Ohshi(2002a))所述。

此外，与对照植物相比，在植物特别是稻中表达编码多肽SEQ ID NO：2[代表DEL1多肽的片段]核酸，具有增加转基因植物的产率的作用，其中增加的产率至少包括种子总重量或饱满种子数的增加。另外，在转基因植物中抑制DEL1的表达还具有增加植物胁迫抗性的作用，测量为经UV-B辐射处理后与对照植物相比增加的生物量(见下文实施例)。

实施例7：DEL1f的基因克隆

使用拟南芥幼苗cDNA文库(英俊公司，Invitrogen，Paisley，UK)作为模板通过PCR扩增拟南芥DEL1基因。从幼苗提取的RNA经反转录后，将cDNA克隆进入pCMV Sport 6.0。该库平均插入大小为1.5kb，并且原始克隆数的数量级在1.59×10⁷cfu。在6×10¹¹cfu/ml的第一次扩增之后，确定原始滴度为9.6×10⁵cfu/ml。提取质粒之后，将200ng模板用于50μl PCR混合物中。PCR扩增所用的引物包括Gateway重组的AttB位点，为prm00536(SEQ ID NO：3；有义，起始密码子为粗体，AttB1位点为斜体：5’-

gttgggcttgatgatgc 3’)和prm00324(SEQ ID NO：4；反向互补，终止密码子为粗体，AttB2位点为斜体：5’acggtgttgtgatgtattag 3’)。在标准条件下使用Hifi Taq DNA聚合酶进行PCR。同样用标准方法扩增和纯化1107bp(包括attB位点)的PCR片段。接着进行Gateway操作的第一步，BP反应，在此期间将PCR片段与pDONR201质粒体内重组以产生Gateway术语所称的“进入(entry)克隆”，p042。作为Gateway

技术一部分的质粒pDONR201购自英俊公司(Invitrogen)。

实施例8：载体构建

接着，将进入克隆p042与用于稻转化的指定载体p00831一起用于LR反应。此载体在T-DNA边界内包含如下功能性元件：植物可选择标记；可筛选标记表达盒；旨在与已克隆到进入克隆中的目的序列进行LR体内重组的Gateway表达盒。用于胚和糊粉特异性表达的启动子(PRO0218，SEQ IDNO：5)在此Gateway盒的上游。表达盒PRO0218::DEL1片段如SEQ ID NO：6所示。

LR重组步骤之后，将所产生的DEL1表达载体p037(图3)转化进农杆菌菌株LBA4044，随后转化进入稻植物。使转化的稻植物生长，随后检测实施例9中描述的参数。

实施例9：处于PRO0218启动子控制之下的DEL1f的评估及结果

大约产生了15到20个独立的T0稻类转化体。初级转化体由组织培养室转移到温室生长并收获T1种子。4个事件得以保留，其中T1代发生转基因存在/缺乏的3∶1分离。通过监测可视标记的表达，在每一事件中选出大约10个含转基因(杂合子和纯合子)的T1幼苗，和大约10个缺少转基因(无效合子)的T1幼苗。将所选择的T1植物转移到温室中。每个植物给予一个独特的条形码标记，以将表型数据与对应植物明确联系起来。所选择的T1植物在10cm直径花盆的土壤中在下列环境设置下生长：光周期＝11.5小时、日光强度＝30,000勒克斯或以上、日间温度＝28℃或更高、夜间温度＝22℃、相对湿度＝60-70％。小心使植物在最佳条件下生长。转基因植物和相应的无效合子在随机位置上并排生长。从播种期到成熟期，使植物几次通过数字成像箱。在每个时间点上对每株植物从至少6个不同的角度获取数字图像(2048×1536像素，1600万色)。

收获成熟的初级圆锥花序、装袋、贴上条形码标记，然后在烤箱中于37℃干燥三天。随后将圆锥花序脱粒，收集所有的种子。使用鼓风装置将饱满谷壳和空壳分开。在分离后，使用可商购的计数仪器对两批种子进行计数。弃去空壳。在分析天平上称重饱满的谷壳，并使用数字成像测量种子的截面积。此方法得到一组下面描述的种子相关参数。

通过计数在分离步骤之后剩下的饱满谷壳数确定饱满种子的数目。通过称量所有从植物中收获的饱满谷壳来测量种子总重量。通过计数从植物收获的谷壳的数目测量每株植物的种子总数。从计数的饱满种子数目和它们的总重外推得出千粒重(TKW)。收获指数在本发明中定义为种子总重量和地上面积(mm²)之间的比值，再乘以因子10⁶。这些参数是使用图像分析软件，以自动方式从数字图像中得到并且进行统计分析的。利用客户定制装置测量单个种子参数(包括宽度、长度、面积、重量)，所述装置由两个主要组件即称重装置和成像装置构成，连接于用于图像分析的软件。

使用双因子ANOVA(变异分析)作为植物表型特性整体评估的统计模型。在由本发明基因转化的所有事件的所有植物中，对所有测量参数进行F检验。进行F检验来检查所有转化事件中基因的效应，并验证基因的整体效应，亦称为“整体基因效应”。如果F检验的值显示数据具有显著性，那么结论是有“基因”效应，这意味着不仅仅是基因的存在或定位引起了效应。真实整体基因效应的显著性阈值设置为F检验的5％概率水平。

为了检查基因在事件中的效应，即株系特异性效应，在每一事件中使用来自转基因植物和相应无效植物的数据集进行t检验。“无效植物”或“无效分离子”或“无效合子”是以与转基因植物相同的方式处理、但是转基因已经从中分离的植物。也可以将无效植物描述为纯合的阴性转化植物。将t检验显著性的阈值设定为10％概率水平。一些事件的结果可以高于此阈值或低于此阈值。这是基于这种假设，即基因可以仅在基因组中的某些位置中具有效应，且这种位置依赖性效应的发生不是罕见的。本文此类基因效应也称为“基因的株系效应(line effect of the gene)”。通过将t值与t分布比较得到p值，或者通过将F值与F分布比较得到p值。p值给出了无效假设(即不存在转基因效应)正确的概率。

在第一个实验中获得的DEL1f数据在使用T2植物的第二个实验中得到证实。选择了具有正确表达模式的4个株系用于进一步分析。通过监控标记表达来筛选T1中来自阳性植物(杂合子和纯合子)的一批种子。对于每一个所选事件，随后保存几批杂合种子用于进行T2评估。在每批种子中，在温室中种植等量的阳性和阴性植物用于评估。

在T2代中评估了总计120个DEL1f转化植物，即每个事件的30个植物中，有15个为转基因阳性而15个为阴性。

由于进行的两个实验具有重叠事件，因此进行组合分析。这可用于检查两个实验中效应的一致性，并且如果情况果真如此，其可用于从两个实验中收集证据从而增加结论的可信性。使用的方法是考虑到数据的多级结构(即实验-事件-分离子)的混合模型方法。通过对比卡方分布的似然比测试来获得p值。

实施例10：DEL1f转化体的评估：产率相关参数的测量

当如上所述对种子进行分析时，发明人发现，与缺乏DEL1f转基因的植物相比，用DEL1f基因构建体转化的植物具有更高的种子产率，表达为饱满种子数、种子总重量和收获指数。饱满种子数通过计数在分离步骤之后剩下的饱满谷壳数来测定。需要指出的是，产率的增加是不存在胁迫条件的情况下获得的。T1代植物所获得的结果总结于表E：

表E：

	差异％	p值
			饱满种子数	+38	0.0055
种子总重量	+42	0.0039

T2代再次获得这些阳性结果。表F的数据显示了由T2代个体株系的数据计算得到的饱满种子数、种子总重量和收获指数的整体增长百分比，以及相应的p值。在与T1代结果的组合分析中，对这些T2数据进行了重新评估，并且获得的p值显示所观察到的效应具有高度显著性。

表F

实施例11：下调DEL1表达导致增加胁迫抗性

(Col-0)生态型拟南芥(Arabidopsis thaliana(L.)Heynh.ecotypeColumbia)的del1-1^KO等位基因由GABI-Kat T-DNA突变体保藏中心(http://www.mpiz-koeln.mpg.de/GABI-Kat/GABI-Kat_homepage)获得。为产生DEL1^OE株系，利用GATEWAY技术将完整的DEL1开放阅读框克隆到pK2GW7载体[Karimi等(2002)Trends Plant Sci.7，193-195]中，得到pKDEL1载体，通过辅助质粒pRK2013将其动员到含pMP90质粒的根癌农杆菌C58C1RifR菌株[Clough和Bent(1998)Plant J.16，735-743]中。通过浸花法转化植物[S4]。在含卡那霉素的培养基中选择转基因DEL1^OE植物。

将来自一株DEL1敲除株系(del1-1^KO)、两株独立的DEL1过表达株系(DEL1^OE#2和DEL1^OE#4)以及未转化的野生型(对照)植物的种子播种到土壤和沙子(4∶1)的混合物中，并在4℃春化处理3天。随后对植物进行70μmol.m^-2.s^-1的光合有效辐射方案，14h/10h光/暗周期，20℃/16-18℃光/暗温度，相对湿度70-80％。18天后，植物在日光模拟器(GSF；德国慕尼黑国家环境和健康研究中心(National Research Center for Enviroment andHealth，Munich，Germany))中接受UV-B光曝晒，为模拟到达地球表面的太阳光谱的培养室，补以附加剂量的UV-B(照度：172μmol.m^-2.s^-1(±5％)，3,27Wm^-2(±5％)。在UV-B曝晒0、3、5、7和9小时后，将植物移回正常培养室中，并随着时间跟踪其发育情况。

所测试的不同基因型对UV处理的应答明显不同。UV-B处理明显地以剂量依赖性的方式影响对照植物的生长。用UV-B处理5小时的植物叶子表现出坏死，并且尺寸减小。这种现象对于UV-B处理7小时的植物更为明显。DEL1水平增加的植物对UV-B表现出甚至更为严重的应答，在3小时UV-B的剂量下就已经表现出坏死以及叶子生长的抑制。相反，del1-1^KO株系令人惊讶地呈现出对UV-B表光增加的耐受性。处理3小时的del1-1^KO植物与对照植物无差别，但是对照植物的尺寸明显受3小时UV-B剂量的影响。同样在5小时UV-B的剂量下，与对照植物相比坏死水平大幅减小。

视觉观察结果得到了生物量测量结果的支持(图5)。测量了10-15株植物的质量，并计算每株植物的平均值。处理5小时以下的del1-1^KO株系呈现出与未处理植物相等的生物量，但是未转化的对照植物的每株植物的生物量显示出UV-B剂量依赖性的下降。同样在5小时UV-B或更长的剂量下，del1-1^KO植物比对照植物性能更佳。与DEL1下降导致增加的产率稳定性的观察结果一致的是，对于DEL1^OE#2和DEL1^OE#4株系观察到相反的表型，这些株系在施加的任何UV-B剂量下明显比对照株系受到的影响更大。

为鉴定del1-1^KO株系增加的产率稳定性背后的细胞基础，通过显微镜检测定表皮细胞的数目和大小。根据安置在双目镜(Stemi SV11，Zeiss，Jena，Germany)上的电荷耦合器件相机直接拍摄的数码照片确定第5叶的总叶片面积。利用公共领域的图像分析程序ImageJ(1.30版；可自美国国家卫生研究所NIH的网站获得)根据图像测定叶片面积。根据经甲醇清洗叶子接着由乳酸处理后距离叶尖和叶基25到75％位置处的下表皮上至少25个细胞轮廓的扫描的拔管(drawing-tube)图像确定细胞密度。根据图像计算平均细胞面积，并通过用叶片面积除以平均细胞面积(叶尖和叶基位置之间的平均值)计算每片叶子的细胞总数。对5小时UV-B处理叶子的对比分析表明对照植物经UV-B处理后总叶片面积下降52％。相反，del1-1^KO株系仅显示出15％的下降。当对细胞数目进行计数时，观察到两种基因型总细胞数目等同的下降(对照和del1-1^KO植物分别为-28％和-23％)。与此形成对照的是，对照植物的平均细胞大小下降33％(未处理的相对于处理的植物)，而del1-1^KO植物的细胞经UV-B处理后却增大11％。这些数据说明del1-1^KO植物经胁迫处理后所观察到的产率稳定性特别地归因于细胞的增大。

实施例12：del1-1^KO植物呈现出光解酶(photolyase)PHR1表达和活性水平增加

为揭开赋予DEL1缺陷型株系UV-B抗性的机制，进行了转录组分析。将DEL1敲除(del1-1^KO)、DEL1过表达#4(DEL1^OE#4)以及未转化的野生型(Col-0)种子播种至补充有0.6％植物组织培养琼脂(LabM，Bury，UK)的1×Murashige和Skoog培养基(Duchefa，Haarlem，The Netherlands)上。植物于4℃春化2天之后，转移到培养室中，并于22℃生长，采取65μE·m²·sec^-1辐射，16小时光/8小时暗的光周期，相对湿度50-60％。为进行微阵列分析，对差异最大的组织进行分析，即对照(Col-0)和del1-1^KO的所有8日龄幼苗，以及在播种后第8、15和22天收集的对照和DEL1^OE#4的发育中的第一对叶片(first leafpair)。经过统计分析后，发现16种基因在del1-1^KO和DEL1^OE#4植物中呈现出互补表达模式。在DEL1^OE#4株系中下调而在del1-1^KO中上调的基因之一编码2型CPD光解酶，其为能够在白光或蓝光的存在下在植物细胞中修复UV所致的DNA损伤的一种酶[Landry等，1997，PNAS 94，328-332]。这些数据表明DEL1水平低或无表达的植物经UV-B胁迫处理后呈现出增加的DNA修复活性。相反，DEL1过表达植物具有降低的2型CPD光解酶水平，将不能够与对照或del1-1^KO植物以相同的程度修复其DNA。为检验这种假说，将来自所述del1-1^KO株系、两株独立的DEL1过表达株系(DEL1^OE#2和DEL1^OE#4)以及未转化的野生型(Col-0)植物的种子播种到土壤和沙子(4∶1)的混合物中，并在4℃春化处理3天。随后对植物进行70μmol.m^-2.s^-1的PAR(光合有效辐射)方案，14h/10h光/暗周期，20℃/16-18℃光/暗温度，相对湿度70-80％。18天后，植物在日光模拟器(GSF；德国慕尼黑国家环境和健康研究中心(National Research Center for Enviromentand Health，Munich，Germany))中接受UV-B光曝晒，为模拟到达地球表面的太阳光谱的培养室，补以附加剂量的UV-B(照度：172μmol.m^-2.s^-1±5％)。在UV-B辐射5小时后，立即收获叶子，或者置于白光(70μmol.m-2.s-1PAR)下另行恢复5小时。利用Elisa通过测定环丁烷嘧啶二聚体(CPD)光产物的数量来测量光解酶的活性量。利用DNeasy植物迷你试剂盒(QIAGEN公司，Tokyo，Japan)提取基因组DNA。向各孔中放置浓度0.02μg.ml^-1的50μl等分式样的提取DNA。利用特异性抗体(TDM-2)如以前所述(Tanaka等，2002，The Plant Journal 46，317-326)检测CPD。当对UV-B处理后立即收获的样品的CPD水平进行比较时，所有基因型都呈现出相似的DNA损伤应答(图6A)。相反，当对在白光中恢复5小时的样品进行比较时，del1-1^KO突变体中几乎45％的DNA损伤位点得到了修复。与此形成对照的是，在相同的时间段内在对照和DEL1^OE过表达植物中观察不到DNA修复(图6B)。这些数据表明del1-1^KO株系由于更快的DNA修复而在UV-B处理后表现更佳。

实施例13：del1-1^KO株系在UV-B辐射后呈现出更佳的光合作用性能

将来自一株DEL1敲除株系(del1-1^KO)、两株独立的DEL1过表达株系(DEL1^OE#2和DEL1^OE#4)以及未转化的野生型(Col-0)植物的种子播种到标准市售的基于泥炭的混合肥料中，其中富含1/3 John Innes 3(基于肥土的混合物)，并在4℃春化处理一周。随后对植物进行100μmol.m^-2.s^-1的辐射方案，光周期12小时，温度20℃，相对湿度60-80％。25到30天后，对植物进行UV-B光短期脉冲曝晒。在辐射前及UV辐射6小时之后测量光合系统II的功效。当在辐射前测量时，不同的基因型之间未发现显著的差异。这说明所有的株系在UV处理前都是健康的且未受到胁迫，并且辐射以相同的程度影响所有的株系。相反，当对植物进行48小时长的UV-B处理结合PAR(光合有效辐射)时，del1-1^KO突变体比对照具有稍微更高的光合作用功效，而过与Col-0相比，表达株系的光合作用性能下降12％。这些数据表明在UV-B处理之后del1-1^KO株系的光合作用活性胜过对照植物。

实施例14：del1-1^KO植物在恒定UV-B辐射下还呈现出增加的胁迫抗性

为检验del1-1^KO的胁迫抗性在恒定低水平UV-B(而不是响应一次急性剂量)下是否有效，使植物在低通量的UV-B光下生长一周。在实验开始之后，在不同的基因型中未观察到莲座叶直径的显著差异。相反，在UV-B辐射一周之后，del1-1^KO植物的莲座叶直径(1.6cm)接近于未处理的植物(1.8cm)，而对照(1.4cm)和DEL1^OE(1.2cm)受UV-B处理影响更为显著。

序列表

<110>克罗普迪塞恩股份有限公司

     非营利性组织佛兰芒综合大学生物技术研究所

     国立比利时根特大学

<120>具有改良生长特性的植物及其制备方法

<130>PF57951

<160>31

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1044

<212>DNA

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>1

atggttgggc ttgatgatgc tgcctcgaaa ttaggagtgg agagacgaag aatctatgat    60

attgttaatg ttctggagag tgttggggtt ttaacaagaa gagcaaagaa tcagtatacg   120

tggaaagggt tttccgcaat tccaggagca ttgaaggagc tacaagaaga gggggttaag   180

gacacttttc atcgtttcta tgtcaatgag aatgttaaag gatctgatga tgaggatgat   240

gatgaagagt cttctcagcc tcactctagt agccagactg atagttcaaa acctggttct   300

cttccccaat cttcagatcc ctccaaaata gataaccgac gagagaaatc tttaggattg   360

cttactcaga actttatcaa actctttatt tgctctgaag ctattaggat catctccctt   420

gatgacgctg caaaattact gcttggtgat gcccacaata catcaataat gcgaactaaa   480

gtgaggcggc tttatgatat agcaaatgtc ttgtcgtcaa tgaatctcat agagaagact   540

cacaccttag attctaggaa accagctttc aagtggttag ggtacaatgg tgagcctact   600

ttcacactga gcagcgattt gttgcaattg gagtcaagaa aaagagcttt cggaactgat   660

attacaaacg tcaatgttaa gagaagcaaa tcatcatctt cgtcccaaga aaacgctaca   720

gagagaaggc taaagatgaa aaagcactca acaccagaga gttcttataa caaaagcttt   780

gatgttcatg aatcaagaca tggatcaaga ggaggttacc attttggacc ttttgcacca   840

ggcactggta catatccaac tgctggttta gaggataact ctaggagagc ttttgatgtt   900

gagaatctgg attctgatta ccgtccctct taccaaaacc aagttttgaa agacctcttt   960

tcccattaca tggatgcttg gaagacatgg ttcagcgaag tcacccagga gaatccatta  1020

cctaatacat cacaacaccg ttag                                         1044

<210>2

<211>347

<212>PRT

<213>拟南芥

<400>2

Met Val Gly Leu Asp Asp Ala Ala Ser Lys Leu Gly Val Glu Arg Arg

1               5                   10                  15

Arg Ile Tyr Asp Ile Val Asn Val Leu Glu Ser Val Gly Val Leu Thr

            20                  25                  30

Arg Arg Ala Lys Asn Gln Tyr Thr Trp Lys Gly Phe Ser Ala Ile Pro

        35                  40                  45

Gly Ala Leu Lys Glu Leu Gln Glu Glu Gly Val Lys Asp Thr Phe His

    50                  55                  60

Arg Phe Tyr Val Asn Glu Asn Val Lys Gly Ser Asp Asp Glu Asp Asp

65                  70                  75                  80

Asp Glu Glu Ser Ser Gln Pro His Ser Ser Ser Gln Thr Asp Ser Ser

                85                  90                  95

Lys Pro Gly Ser Leu Pro Gln Ser Ser Asp Pro Ser Lys Ile Asp Asn

            100                 105                 110

Arg Arg Glu Lys Ser Leu Gly Leu Leu Thr Gln Asn Phe Ile Lys Leu

        115                 120                 125

Phe Ile Cys Ser Glu Ala Ile Arg Ile Ile Ser Leu Asp Asp Ala Ala

    130                 135                 140

Lys Leu Leu Leu Gly Asp Ala His Asn Thr Ser Ile Met Arg Thr Lys

145                 150                 155                 160

Val Arg Arg Leu Tyr Asp Ile Ala Asn Val Leu Ser Ser Met Asn Leu

                165                 170                 175

Ile Glu Lys Thr His Thr Leu Asp Ser Arg Lys Pro Ala Phe Lys Trp

            180                 185                 190

Leu Gly Tyr Asn Gly Glu Pro Thr Phe Thr Leu Ser Ser Asp Leu Leu

        195                 200                 205

Gln Leu Glu Ser Arg Lys Arg Ala Phe Gly Thr Asp Ile Thr Asn Val

    210                 215                 220

Asn Val Lys Arg Ser Lys Ser Ser Ser Ser Ser Gln Glu Asn Ala Thr

225                 230                 235                 240

Glu Arg Arg Leu Lys Met Lys Lys His Ser Thr Pro Glu Ser Ser Tyr

                245                 250                 255

Asn Lys Ser Phe Asp Val His Glu Ser Arg His Gly Ser Arg Gly Gly

            260                 265                 270

Tyr His Phe Gly Pro Phe Ala Pro Gly Thr Gly Thr Tyr Pro Thr Ala

        275                 280                 285

Gly Leu Glu Asp Asn Ser Arg Arg Ala Phe Asp Val Glu Asn Leu Asp

    290                 295                 300

Ser Asp Tyr Arg Pro Ser Tyr Gln Asn Gln Val Leu Lys Asp Leu Phe

305                 310                 315                 320

Ser His Tyr Met Asp Ala Trp Lys Thr Trp Phe Ser Glu Val Thr Gln

                325                 330                 335

Glu Asn Pro Leu Pro Asn Thr Ser Gln His Arg

            340                 345

<210>3

<211>54

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物：prm00536

<400>3

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatggtt gggcttgatg atgc         54

<210>4

<211>52

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物：prm00324

<400>4

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc taacggtgtt gtgatgtatt ag           52

<210>5

<211>1236

<212>DNA

<213>稻(Oryza sativa)

<400>5

ggtcagccaa tacattgatc cgttgccaat catgcaaagt attttggctg tggccgagtg    60

ccggaattga taattgtgtt ctgactaaat taaatgacca gaagtcgcta tcttccaatg    120

tatccgaaac ctggattaaa caatcctgtt ctgttctcta gcccctcctg catggccgga    180

ttgttttttt gacatgtttt cttgactgag gcctgtttgt tctaaacttt ttcttcaaac    240

ttttaacttt ttcatcacat cagaactttt ctacacatat aaacttttaa cttttccgtc    300

acatcgttcc aatttcaatc aaactttcaa ttttggcgtg aactaaacac accctgagtc    360

ttttattgct cctccgtacg ggttggctgg ttgagaatag gtattttcag agagaaaatc    420

tagatattgg gaggaacttg gcatgaatgg ccactatatt tagagcaatt ctacggtcct    480

tgaggaggta ccatgaggta ccaaaatttt agtgtaaatt ttagtatctc attataacta    540

ggtattatga ggtaccaaat ttacaataga aaaaatagta cttcatggta ctttcttaag    600

taccgtaaaa ttgctcctat atttaagggg atgtttatat ctatccatat ccataatttg    660

attttgataa gaaaaaatgt gagcacacca agcatgtcca tgaccttgca ctcttggctc    720

actcgtcaac tgtgaagaac ctcaaaaatg ctcaatatag ctacaggtgc ctgaaaaaat    780

aactttaaag ttttgaacat cgatttcact aaacaacaat tattatctcc ctctgaaaga    840

tgatagttta gaactctaga atcattgtcg gcggagaaag taaattattt tccccaaatt    900

tccagctatg aaaaaaccct caccaaacac catcaaacaa gagttcacca aaccgcccat    960

gcggccatgc tgtcacgcaa cgcaccgcat tgcctgatgg ccgctcgatg catgcatgct   1020

tccccgtgca catatccgac agacgcgccg tgtcagcgag ctcctcgacc gacctgtgta   1080

gcccatgcaa gcatccaccc ccgccacgta caccccctcc tcctccctac gtgtcaccgc   1140

tctctccacc tatatatgcc cacctggccc ctctcctccc atctccactt cacccgatcg   1200

cttcttcttc ttcttcgtt g cattcatctt gctagc                            1236

<210>6

<211>2332

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>表达盒

<400>6

ggtcagccaa tacattgatc cgttgccaat catgcaaagt attttggctg tggccgagtg     60

ccggaattga taattgtgtt ctgactaaat taaatgacca gaagtcgcta tcttccaatg    120

tatccgaaac ctggattaaa caatcctgtt ctgttctcta gcccctcctg catggccgga    180

ttgttttttt gacatgtttt cttgactgag gcctgtttgt tctaaacttt ttcttcaaac    240

ttttaacttt ttcatcacat cagaactttt ctacacatat aaacttttaa cttttccgtc    300

acatcgttcc aatttcaatc aaactttcaa ttttggcgtg aactaaacac accctgagtc    360

ttttattgct cctccgtacg ggttggctgg ttgagaatag gtattttcag agagaaaatc    420

tagatattgg gaggaacttg gcatgaatgg ccactatatt tagagcaatt ctacggtcct    480

tgaggaggta ccatgaggta ccaaaatttt agtgtaaatt ttagtatctc attataacta    540

ggtattatga ggtaccaaat ttacaataga aaaaatagta cttcatggta ctttcttaag    600

taccgtaaaa ttgctcctat atttaagggg atgtttatat ctatccatat ccataatttg    660

attttgataa gaaaaaatgt gagcacacca agcatgtcca tgaccttgca ctcttggctc    720

actcgtcaac tgtgaagaac ctcaaaaatg ctcaatatag ctacaggtgc ctgaaaaaat    780

aactttaaag ttttgaacat cgatttcact aaacaacaat tattatctcc ctctgaaaga    840

tgatagttta gaactctaga atcattgtcg gcggagaaag taaattattt tccccaaatt    900

tccagctatg aaaaaaccct caccaaacac catcaaacaa gagttcacca aaccgcccat    960

gcggccatgc tgtcacgcaa cgcaccgcat tgcctgatgg ccgctcgatg catgcatgct   1020

tccccgtgca catatccgac agacgcgccg tgtcagcgag ctcctcgacc gacctgtgta  1080

gcccatgcaa gcatccaccc ccgccacgta caccccctcc tcctccctac gtgtcaccgc  1140

tctctccacc tatatatgcc cacctggccc ctctcctccc atctccactt cacccgatcg  1200

cttcttcttc ttcttcgttg cattcatctt gctagcattt aaatcaacta gggatatcac  1260

aagtttgtac aaaaaagcag gcttcacaat ggttgggctt gatgatgctg cctcgaaatt  1320

aggagtggag agacgaagaa tctatgatat tgttaatgtt ctggagagtg ttggggtttt  1380

aacaagaaga gcaaagaatc agtatacgtg gaaagggttt tccgcaattc caggagcatt  1440

gaaggagcta caagaagagg gggttaagga cacttttcat cgtttctatg tcaatgagaa  1500

tgttaaagga tctgatgatg aggatgatga tgaagagtct tctcagcctc actctagtag  1560

ccagactgat agttcaaaac ctggttctct tccccaatct tcagatccct ccaaaataga  1620

taaccgacga gagaaatctt taggattgct tactcagaac tttatcaaac tctttatttg  1680

ctctgaagct attaggatca tctcccttga tgacgctgca aaattactgc ttggtgatgc  1740

ccacaataca tcaataatgc gaactaaagt gaggcggctt tatgatatag caaatgtctt  1800

gtcgtcaatg aatctcatag agaagactca caccttagat tctaggaaac cagctttcaa  1860

gtggttaggg tacaatggtg agcctacttt cacactgagc agcgatttgt tgcaattgga  1920

gtcaagaaaa agagctttcg gaactgatat tacaaacgtc aatgttaaga gaagcaaatc  1980

atcatcttcg tcccaagaaa acgctacaga gagaaggcta aagatgaaaa agcactcaac  2040

accagagagt tcttataaca aaagctttga tgttcatgaa tcaagacatg gatcaagagg  2100

aggttaccat tttggacctt ttgcaccagg cactggtaca tatccaactg ctggtttaga  2160

ggataactct aggagagctt ttgatgttga gaatctggat tctgattacc gtccctctta  2220

ccaaaaccaa gttttgaaag acctcttttc ccattacatg gatgcttgga agacatggtt  2280

cagcgaagtc acccaggaga atccattacc taatacatca caacaccgtt ag          2332

<210>7

<211>1212

<212>DNA

<213>拟南芥

<400>7

atgtcagatc tatcgccaga aagattcaaa cttgccgtta cttctccttc ttccataccg     60

gaatcttctt cggctttaca attacaccat tcctatagtc gcaaacagaa atctctcgga    120

cttctttgta ccaatttctt agctttgtat aatcgagaag ggattgaaat ggttgggctt    180

gatgatgctg cctcgaaatt aggagtggag agacgaagaa tctatgatat tgttaatgtt    240

ctggagagtg ttggggtttt aacaagaaga gcaaagaatc agtatacgtg gaaagggttt    300

tccgcaattc caggagcatt gaaggagcta caagaagagg gggttaagga cacttttcat    360

cgtttctatg tcaatgagaa tgttaaagga tctgatgatg aggatgatga tgaagagtct    420

tctcagcctc actctagtag ccagactgat agttcaaaac ctggttctct tccccaatct    480

tcagatccct ccaaaataga taaccgacga gagaaatctt taggattgct tactcagaac    540

tttatcaaac tctttatttg ctctgaagct attaggatca tctcccttga tgacgctgca    600

aaattactgc ttggtgatgc ccacaataca tcaataatgc gaactaaagt gaggcggctt    660

tatgatatag caaatgtctt gtcgtcaatg aatctcatag agaagactca caccttagat    720

tctaggaaac cagctttcaa gtggttaggg tacaatggtg agcctacttt cacactgagc    780

agcgatttgt tgcaattgga gtcaagaaaa agagctttcg gaactgatat tacaaacgtc    840

aatgttaaga gaagcaaatc atcatcttcg tcccaagaaa acgctacaga gagaaggcta    900

aagatgaaaa agcactcaac accagagagt tcttataaca aaagctttga tgttcatgaa    960

tcaagacatg gatcaagagg aggttaccat tttggacctt ttgcaccagg cactggtaca   1020

tatccaactg ctggtttaga ggataactct aggagagctt ttgatgttga gaatctggat   1080

tctgattacc gtccctctta ccaaaaccaa gttttgaaag acctcttttc ccattacatg  1140

gatgcttgga agacatggtt cagcgaagtc acccaggaga atccattacc taatacatca  1200

caacaccgtt ag                                                      1212

<210>8

<211>403

<212>PRT

<213>拟南芥

<400>8

Met Ser Asp Leu Ser Pro Glu Arg Phe Lys Leu Ala Val Thr Ser Pro

1               5                   10                  15

Ser Ser Ile Pro Glu Ser Ser Ser Ala Leu Gln Leu His His Ser Tyr

            20                  25                  30

Ser Arg Lys Gln Lys Ser Leu Gly Leu Leu Cys Thr Asn Phe Leu Ala

        35                  40                  45

Leu Tyr Asn Arg Glu Gly Ile Glu Met Val Gly Leu Asp Asp Ala Ala

    50                  55                  60

Ser Lys Leu Gly Val Glu Arg Arg Arg Ile Tyr Asp Ile Val Asn Val

65                  70                  75                  80

Leu Glu Ser Val Gly Val Leu Thr Arg Arg Ala Lys Asn Gln Tyr Thr

                85                  90                  95

Trp Lys Gly Phe Ser Ala Ile Pro Gly Ala Leu Lys Glu Leu Gln Glu

            100                 105                 110

Glu Gly Val Lys Asp Thr Phe His Arg Phe Tyr Val Asn Glu Asn Val

        115                 120                 125

Lys Gly Ser Asp Asp Glu Asp Asp Asp Glu Glu Ser Ser Gln Pro His

    130                 135                 140

Ser Ser Ser Gln Thr Asp Ser Ser Lys Pro Gly Ser Leu Pro Gln Ser

145                 150                 155                 160

Ser Asp Pro Ser Lys Ile Asp Asn Arg Arg Glu Lys Ser Leu Gly Leu

                165                 170                 175

Leu Thr Gln Asn Phe Ile Lys Leu Phe Ile Cys Ser Glu Ala Ile Arg

            180                 185                 190

Ile Ile Ser Leu Asp Asp Ala Ala Lys Leu Leu Leu Gly Asp Ala His

        195                 200                 205

Asn Thr Ser Ile Met Arg Thr Lys Val Arg Arg Leu Tyr Asp Ile Ala

    210                 215                 220

Asn Val Leu Ser Ser Met Asn Leu Ile Glu Lys Thr His Thr Leu Asp

225                 230                 235                 240

Ser Arg Lys Pro Ala Phe Lys Trp Leu Gly Tyr Asn Gly Glu Pro Thr

                245                 250                 255

Phe Thr Leu Ser Ser Asp Leu Leu Gln Leu Glu Ser Arg Lys Arg Ala

            260                 265                 270

Phe Gly Thr Asp Ile Thr Asn Val Asn Val Lys Arg Ser Lys Ser Ser

        275                 280                 285

Ser Ser Ser Gln Glu Asn Ala Thr Glu Arg Arg Leu Lys Met Lys Lys

    290                 295                 300

His Ser Thr Pro Glu Ser Ser Tyr Asn Lys Ser Phe Asp Val His Glu

305                 310                 315                 320

Ser Arg His Gly Ser Arg Gly Gly Tyr His Phe Gly Pro Phe Ala Pro

                325                 330                 335

Gly Thr Gly Thr Tyr Pro Thr Ala Gly Leu Glu Asp Asn Ser Arg Arg

            340                 345                 350

Ala Phe Asp Val Glu Asn Leu Asp Ser Asp Tyr Arg Pro Ser Tyr Gln

        355                 360                 365

Asn Gln Val Leu Lys Asp Leu Phe Ser His Tyr Met Asp Ala Trp Lys

    370                 375                 380

Thr Trp Phe Ser Glu Val Thr Gln Glu Asn Pro Leu Pro Asn Thr Ser

385                 390                 395                 400

Gln His Arg

<210>9

<211>20

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>标签序列1

<220>

<221>变体

<222>(1)..(1)

<223>/替换＝″Thr″/替换＝″Pro″

<220>

<221>变体

<222>(5)..(5)

<223>/替换＝″Asp″

<220>

<221>变体

<222>(9)..(9)

<223>/替换＝″Trp″

<220>

<221>变体

<222>(10)..(10)

<223>/替换＝″Thr″

<220>

<221>变体

<222>(13)..(13)

<223>/替换＝″Glu″/替换＝″Gln″/替换＝″Ser″

<220>

<221>变体

<222>(14)..(14)

<223>/替换＝″Arg″/替换＝″Lys″

<220>

<221>变体

<222>(16)..(16)

<223>/替换＝″Val″

<220>

<221>变体

<222>(17)..(17)

<223>/替换＝″Thr″

<220>

<221>变体

<222>(18)..(18)

<223>/替换＝″Ile″/替换＝″Arg″

<220>

<221>变体

<222>(20)..(20)

<223>/替换＝″Gly″/替换＝″Pro″/替换＝″Asp″

<400>9

Tyr Ser Arg Lys Gln Lys Ser Leu Gly Leu Leu Cys Thr Asn Phe Leu

1               5                   10                  15

Ala Leu Tyr Asn

            20

<210>10

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>标签序列2

<220>

<221>变体

<222>(1)..(1)

<223>/替换＝″Ser″

<220>

<221>变体

<222>(4)..(4)

<223>/替换＝″Glu″

<220>

<221>变体

<222>(5)..(5)

<223>/替换＝″Val″

<220>

<221>变体

<222>(7)..(7)

<223>/替换＝″Thr″/替换＝″Val″/替换＝″Arg″/替换＝″Lys″

<220>

<221>变体

<222>(8)..(8)

<223>/替换＝″Arg″/替换＝″Ser″

<400>10

Gly Leu Asp Asp Ala Ala Ser Lys Leu Gly Val Glu

1               5                   10

<210>11

<211>20

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>标签序列3

<220>

<221>变体

<222>(2)..(2)

<223>/替换＝″Lys″

<220>

<221>变体

<222>(3)..(3)

<223>/替换＝″Asp″

<220>

<221>变体

<222>(7)..(7)

<223>/替换＝″Arg″

<220>

<221>变体

<222>(8)..(8)

<223>/替换＝″Leu″

<220>

<221>变体

<222>(9)..(9)

<223>/替换＝″Met″

<220>

<221>变体

<222>(10)..(10)

<223>/替换＝″Ser″

<220>

<221>变体

<222>(12)..(12)

<223>/替换＝″Asn″

<220>

<221>变体

<222>(14)..(14)

<223>/替换＝″Val″

<220>

<221>变体

<222>(15)..(15)

<223>/替换＝″Gln″/替换＝″Met″

<220>

<221>变体

<222>(18)..(18)

<223>/替换＝″Leu″/替换＝″Thr″

<220>

<221>变体

<222>(19)..(19)

<223>/替换＝″Ala″/替换＝″Val″/替换＝″Met″/替换＝″Asn″

<220>

<221>变体

<222>(20)..(20)

<223>/替换＝″Glu″

<400>11

Arg Arg Glu Lys Ser Leu Gly Ile Leu Thr Gln Lys Phe Ile Lys Leu

1               5                   10                  15

Phe Ile Cys Ser

            20

<210>12

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>标签序列4

<220>

<221>变体

<222>(1)..(1)

<223>/替换＝″Val″

<220>

<221>变体

<222>(2)..(2)

<223>/替换＝″Thr″

<220>

<221>变体

<222>(4)..(4)

<223>/替换＝″Glu″

<220>

<221>变体

<222>(5)..(5)

<223>/替换＝″Thr″/替换＝″Val″/替换＝″Glu″

<220>

<221>变体

<222>(8)..(8)

<223>/替换＝″Arg″

<220>

<221>变体

<222>(9)..(9)

<223>/替换＝″Ile″

<220>

<221>变体

<222>(10)..(10)

<223>/替换＝″Ile″

<220>

<221>变体

<222>(11)..(11)

<223>/替换＝″Met″/替换＝″Ile″

<220>

<221>变体

<222>(12)..(12)

<223>/替换＝″Glu″

<400>12

Ile Ser Leu Asp Asp Ala Ala Lys Leu Leu Leu Gly

1               5                   10

<210>13

<211>35

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>标签序列5

<220>

<221>变体

<222>(1)..(1)

<223>/替换＝″Ala″

<220>

<221>变体

<222>(3)..(3)

<223>/替换＝″Ile″

<220>

<221>变体

<222>(12)..(12)

<223>/替换＝″Ile″

<220>

<221>变体

<222>(14)..(14)

<223>/替换＝″Cys″/替换＝″Thr″

<220>

<221>变体

<222>(16)..(16)

<223>/替换＝″Leu″

<220>

<221>变体

<222>(17)..(17)

<223>/替换＝″Arg″/替换＝″Ala″

<220>

<221>变体

<222>(18)..(18)

<223>/替换＝″Phe″

<220>

<221>变体

<222>(20)..(20)

<223>/替换＝″Arg″/替换＝″Lys″/替换＝″Asp″

<220>

<221>变体

<222>(22)..(22)

<223>/替换＝″Val″/替换＝″Ile″

<220>

<221>变体

<222>(23)..(23)

<223>/替换＝″Gln″

<220>

<221>变体

<222>(24)..(24)

<223>/替换＝″Val″/替换＝″Gln″

<220>

<221>变体

<222>(25)..(25)

<223>/替换＝″Gly″/替换＝″Ala″/替换＝″Thr″

<220>

<221>变体

<222>(26)..(26)

<223>/替换＝″Glu″

<220>

<221>变体

<222>(27)..(27)

<223>/替换＝″Thr″/替换＝″Glu″

<220>

<221>变体

<222>(29)..(29)

<223>/替换＝″Gly″

<220>

<221>变体

<222>(30)..(30)

<223>/替换＝″Arg″

<220>

<221>变体

<222>(31)..(31)

<223>/替换＝″Lys″

<220>

<221>变体

<222>(32)..(32)

<223>/替换＝″Pro″

<220>

<221>变体

<222>(33)..(33)

<223>/替换＝″Leu″/替换＝″Ala″/替换＝″Arg″

<220>

<221>变体

<222>(35)..(35)

<223>/替换＝″Phe″

<220>

<221>变体

<222>(35)..(35)

<223>/替换＝″Lys″

<400>13

Thr Lys Val Arg Arg Leu Tyr Asp Ile Ala Asn Val Leu Ser Ser Met

1               5                   10                  15

Asn Leu Ile Glu Lys Thr His Thr Leu Asp Ser Arg Lys Pro Ala Phe

            20                  25                  30

Lys Trp Leu

       35

<210>14

<211>1581

<212>DNA

<213>稻

<400>14

cgcggacgca ccaagatcca atcctcgcga gcagaatcga tggcgacggc ggcggtgatg     60

gctgctgtac cctcgtcttc gccggccgac gcggcggagg ctgtggttat gacggaggcg    120

gtgccttctc tcccgcaacg ccagcagccg gtgttcgtcg agggcagagg cgggaagctg    180

cgtgaccacg cctacagccg caagcagaag tcgctcggcc tcctctgctc caatttcgtc    240

gctctgtaca accgcgacga cgtggagtct atcgggctgg acgacgcggc taggaggctc    300

ggcgtggaga ggcgccggat ctacgacatc gtcaacgtgc tcgagagcgt agggatcctc    360

gtgaggaagg ccaagaatcg ttattcttgg ataggcttcg gcggcgtccc aatggcattg    420

cgagaactca aggagagggc attgagagag aagtctggat tggctcctct gcccgtggag    480

gagccgtctg cagccattat gtcggatgac gaagatgaag ataagatggg tgacgctgat    540

ggtgataccg agagcgagaa gctgagtcaa ccagttgaca acccttctga caacaagcca    600

ggcgcacctc gctgccggct tagatctgac cataggaagg agaagtcgct tgggttgctc    660

acgcagaatt tcgtgaaact cttcctgacc atggaggttg acacaatctc acttgatgaa    720

gctgcaaagc tgctacttgg agaaggtcac gcagagaaca gtatgagaac taaagtccgg    780

agactgtatg acattgctaa cgtgctgtca tcactgaatt tcattgataa gatacaacag    840

gcagactcaa ggaaacctgc attccggtgg ttgggctcag cggggaaacc aaaagctgaa    900

aatggtgtca caatcgcagt acctccacca gggaagacca tatcgaacaa gagagcattt    960

gggactgaac tcactaacat tgacataaac agaagcagac tggactcaac aatcccaaag   1020

aaagcaaagc tgacactgag tggtggtgaa attttgaaga actgcaaatt gtcagtgcag   1080

aaacagctcg ggcagggtag caagggtggt tttgtttatg ggcctttcca ccctgctggt   1140

gcaagaaaac aagagcttga caatggtaat aaaggacaca cagataatgt tcaaaactgg   1200

gagagccttg ctgcttcatt tcgaccacaa taccagaacc aagcattggg cgatcttttt    1260

gctcattatg tggaagcctg gaaatcgtgg tactctgaat ttgcgcaagg cagcagcatg    1320

atgcagcagc actttggcat gcctgtcatt aaccagtttt tgtagtcaaa tcattaatct    1380

caagcactgt atttcttacc gcgtgcttgg gattttacct gtacaatttg tcaagaaaat    1440

gagggaacaa agacatgacc taggcctagg atccattgta tttactcaat gcaggaaata    1500

tccaggctat tcagtccaaa agataaactc gcctcattgt taggcatgta actgttaatt    1560

catctagcta taagctttcc t                                              1581

<210>15

<211>441

<212>PRT

<213>稻

<400>15

Met Ala Thr Ala Ala Val Met Ala Ala Val Pro Ser Ser Ser Pro Ala

1               5                   10                  15

Asp Ala Ala Glu Ala Val Val Met Thr Glu Ala Val Pro Ser Leu Pro

            20                  25                  30

Gln Arg Gln Gln Pro Val Phe Val Glu Gly Arg Gly Gly Lys Leu Arg

        35                  40                  45

Asp His Ala Tyr Ser Arg Lys Gln Lys Ser Leu Gly Leu Leu Cys Ser

    50                  55                  60

Asn Phe Val Ala Leu Tyr Asn Arg Asp Asp Val Glu Ser Ile Gly Leu

65                  70                  75                  80

Asp Asp Ala Ala Arg Arg Leu Gly Val Glu Arg Arg Arg Ile Tyr Asp

                85                  90                  95

Ile Val Asn Val Leu Glu Ser Val Gly Ile Leu Val Arg Lys Ala Lys

            100                 105                 110

Asn Arg Tyr Ser Trp Ile Gly Phe Gly Gly Val Pro Met Ala Leu Arg

        115                 120                 125

Glu Leu Lys Glu Arg Ala Leu Arg Glu Lys Ser Gly Leu Ala Pro Leu

    130                 135                 140

Pro Val Glu Glu Pro Ser Ala Ala Ile Met Ser Asp Asp Glu Asp Glu

145                 150                 155                 160

Asp Lys Met Gly Asp Ala Asp Gly Asp Thr Glu Ser Glu Lys Leu Ser

                165                 170                 175

Gln Pro Val Asp Asn Pro Ser Asp Asn Lys Pro Gly Ala Pro Arg Cys

            180                 185                 190

Arg Leu Arg Ser Asp His Arg Lys Glu Lys Ser Leu Gly Leu Leu Thr

        195                 200                 205

Gln Asn Phe Val Lys Leu Phe Leu Thr Met Glu Val Asp Thr Ile Ser

    210                 215                 220

Leu Asp Glu Ala Ala Lys Leu Leu Leu Gly Glu Gly His Ala Glu Asn

225                 230                 235                 240

Ser Met Arg Thr Lys Val Arg Arg Leu Tyr Asp Ile Ala Asn Val Leu

                245                 250                 255

Ser Ser Leu Asn Phe Ile Asp Lys Ile Gln Gln Ala Asp Ser Arg Lys

            260                 265                 270

Pro Ala Phe Arg Trp Leu Gly Ser Ala Gly Lys Pro Lys Ala Glu Asn

        275                 280                 285

Gly Val Thr Ile Ala Val Pro Pro Pro Gly Lys Thr Ile Ser Asn Lys

    290                 295                 300

Arg Ala Phe Gly Thr Glu Leu Thr Asn Ile Asp Ile Asn Arg Ser Arg

305                 310                 315                 320

Leu Asp Ser Thr Ile Pro Lys Lys Ala Lys Leu Thr Leu Ser Gly Gly

                325                 330                 335

Glu Ile Leu Lys Asn Cys Lys Leu Ser Val Gln Lys Gln Leu Gly Gln

            340                 345                 350

Gly Ser Lys Gly Gly Phe Val Tyr Gly Pro Phe His Pro Ala Gly Ala

        355                 360                 365

Arg Lys Gln Glu Leu Asp Asn Gly Asn Lys Gly His Thr Asp Asn Val

    370                 375                 380

Gln Asn Trp Glu Ser Leu Ala Ala Ser Phe Arg Pro Gln Tyr Gln Asn

385                 390                 395                 400

Gln Ala Leu Gly Asp Leu Phe Ala His Tyr Val Glu Ala Trp Lys Ser

                405                 410                 415

Trp Tyr Ser Glu Phe Ala Gln Gly Ser Ser Met Met Gln Gln His Phe

            420                 425                 430

Gly Met Pro Val Ile Asn Gln Phe Leu

        435                 440

<210>16

<211>1461

<212>DNA

<213>玉蜀黍(Zea mays)

<400>16

gcacgagccc tcccagctcg cgcgccctcg atggatgcct ccgccgccac ccccgccccc     60

gggccttcct tctctggcgc cgagtcctcc gcggccgccg cccagccgcc ggcggaggct    120

ccgcagttgc gcgtccacgg cgccggcagc ggcagcggcg tcgcgcgagc ctgccgccac    180

cacgcgtaca gccgcaagca gaagtcgctc ggccttctct gctccaactt cgtggcgctg    240

tacgaccggg aggacgtgga ggtgattggg ctggacgacg cggccaagcg tctcggcgtc    300

gagcgacgcc ggatctacga catagtcaac gttctcgaga gcgtcgggat tcttgtgcgg    360

agggccaaga atcggtatac atggctcgga ttcgggggag tccctgctgc gctgaaagaa    420

ctcaaggaga gggcgctaag gaagatgtcc ggatcaccgg tgttactgtc aatggaggac    480

tcgtctactg ccaacttatc agatgatgag gatgatgaaa aattgggcga tgctgatgaa    540

gatgctgaga gcgagaagct cagccaacct gttgacaata cgtctgataa gcctgacgca    600

cccagctgcc gccttagatc tgatcatcgg aaggagaagt cccttgggct cctcactcag    660

aattttgtca agctcttcct caacatggag gttgggacaa tctcacttga cgaagctgca    720

aggcttctcc ttggagaggg acatgcagac agcaacatga gaacagccaa agttcgtcga    780

ttgtatgaca ttgccaatgt gctgtcttct ttgaacctca ttgagaagac gcagcaagca    840

gacacaagaa aacctgcatt ccggtggcta ggccaggcaa agcgaaagca agataacaat    900

gtcatggttt ctgtacctcc atccatgaag gcaatgccca ataagagatc atttggtact    960

gatcttacaa acattgacaa taagcgaggc aagttagact cagcagcgga gaacaaagtc   1020

aagctcatgc agggtgctgg taacatagtg aagacttttg agaggcagct ggtgcaaggg   1080

aaaaggaatg actttgttta tgggcccttc caccctgctg gtgcaaagaa acacgaaact   1140

gatgatcaaa ctgttaagca gcaggagagg aagaacattc aggactggga aaaccttgct   1200

gtgtccttcc gtccacaata tcagaatcaa gcactgaatg atctttttgg tcattatgtg   1260

gaagcatgga aatcatggta cgtggatctt acccaggaaa cggcatcatg aagcagaatg   1320

ttggcaggtc agttgtaact tgtaagccgt ttccagtagt tagatcaact gagttgttga   1380

tgcttgctta gggaaccacc ctgtacaaga tggaataaaa acacgaaggc aattttgtct   1440

ttcgactgta tttactcgat g                                             1461

<210>17

<211>426

<212>PRT

<213>玉蜀黍

<400>17

Met Asp Ala Ser Ala Ala Thr Pro Ala Pro Gly Pro Ser Phe Ser Gly

1               5                   10                  15

Ala Glu Ser Ser Ala Ala Ala Ala Gln Pro Pro Ala Glu Ala Pro Gln

            20                  25                  30

Leu Arg Val His Gly Ala Gly Ser Gly Ser Gly Val Ala Arg Ala Cys

        35                  40                  45

Arg His His Ala Tyr Ser Arg Lys Gln Lys Ser Leu Gly Leu Leu Cys

    50                  55                  60

Ser Asn Phe Val Ala Leu Tyr Asp Arg Glu Asp Val Glu Val Ile Gly

65                  70                  75                  80

Leu Asp Asp Ala Ala Lys Arg Leu Gly Val Glu Arg Arg Arg Ile Tyr

                85                  90                  95

Asp Ile Val Asn Val Leu Glu Ser Val Gly Ile Leu Val Arg Arg Ala

            100                 105                 110

Lys Asn Arg Tyr Thr Trp Leu Gly Phe Gly Gly Val Pro Ala Ala Leu

        115                 120                 125

Lys Glu Leu Lys Glu Arg Ala Leu Arg Lys Met Ser Gly Ser Pro Val

    130                 135                 140

Leu Leu Ser Met Glu Asp Ser Ser Thr Ala Asn Leu Ser Asp Asp Glu

145                 150                 155                 160

Asp Asp Glu Lys Leu Gly Asp Ala Asp Glu Asp Ala Glu Ser Glu Lys

                165                 170                 175

Leu Ser Gln Pro Val Asp Asn Thr Ser Asp Lys Pro Asp Ala Pro Ser

            180                 185                 190

Cys Arg Leu Arg Ser Asp His Arg Lys Glu Lys Ser Leu Gly Leu Leu

        195                 200                 205

Thr Gln Asn Phe Val Lys Leu Phe Leu Asn Met Glu Val Gly Thr Ile

    210                 215                 220

Ser Leu Asp Glu Ala Ala Arg Leu Leu Leu Gly Glu Gly His Ala Asp

225                 230                 235                 240

Ser Asn Met Arg Thr Ala Lys Val Arg Arg Leu Tyr Asp Ile Ala Asn

                245                 250                 255

Val Leu Ser Ser Leu Asn Leu Ile Glu Lys Thr Gln Gln Ala Asp Thr

            260                 265                 270

Arg Lys Pro Ala Phe Arg Trp Leu Gly Gln Ala Lys Arg Lys Gln Asp

        275                 280                 285

Asn Asn Val Met Val Ser Val Pro Pro Ser Met Lys Ala Met Pro Asn

    290                 295                 300

Lys Arg Ser Phe Gly Thr Asp Leu Thr Asn Ile Asp Asn Lys Arg Gly

305                 310                 315                 320

Lys Leu Asp Ser Ala Ala Glu Asn Lys Val Lys Leu Met Gln Gly Ala

                325                 330                 335

Gly Asn Ile Val Lys Thr Phe Glu Arg Gln Leu Val Gln Gly Lys Arg

            340                 345                 350

Asn Asp Phe Val Tyr Gly Pro Phe His Pro Ala Gly Ala Lys Lys His

        355                 360                 365

Glu Thr Asp Asp Gln Thr Val Lys Gln Gln Glu Arg Lys Asn Ile Gln

    370                 375                 380

Asp Trp Glu Asn Leu Ala Val Ser Phe Arg Pro Gln Tyr Gln Asn Gln

385                 390                 395                 400

Ala Leu Asn Asp Leu Phe Gly His Tyr Val Glu Ala Trp Lys Ser Trp

                405                 410                 415

Tyr Val Asp Leu Thr Gln Glu Thr Ala Ser

            420                 425

<210>18

<211>1512

<212>DNA

<213>Ostreococcus tauri

<400>18

atgaacgggg atgggggggt ggagagctcg cgcgcgtcgg gcgggacgga tgtcccgggc     60

gaagacgcgg cgcggacgcg cgcgacgccg agcgcgacgt ctcggaaaga taagtcgttg    120

tggacgctgt gtgaacggtt tttgacgatt tatggagatg gatcgaagga gagcgtgtcg    180

ctggacgatg cggcgacgcg gctcggggtg gagcgtcgaa ggatttacga cgtcgcgaac    240

gtgttggaga gcgtggaggt gctcgagcgc aaggcaaaga atcagtacac gtggcacggc    300

gtgcgaagac tcccggagtg cctgaaacgg ctcaaggaga gtggattgcg ggaatttggg    360

acggatgtcg agctcgatgg aagcacgagc gagggacgtg acggggaaaa ggaggatgga    420

acggctcgag gcggcgacgc ctccgatcga agctctccca caaactcgtc gacgatcaac    480

ttggacgcga aacagcgggg tgagaaggtt actgggacta agttctttgg acaggggcga    540

ttcgccgtct cgagcgccag ttacgacagc cggcgggaga agagtcttgg cttgctgtcc    600

caaaaattcg ttcaactctt cctcgcgtca aagatgaatg ttgtcagtct ggaaacggcc    660

gccaggatta ttatgggaga agacgacgac gatgaagcca agttgaagac taaaattcgt    720

cgattgtacg atatcgccaa catcttgtgc tccttgcgcc tgattcgaaa ggtacacgtg    780

ggcgagacta gaaaaccagc cttcctttgg ctacagcgag aaaactccat cgcggagctc     840

atcgcgcagg gcaaggggct gatgtggttc gataaattga acgaagagga agagatgcgt     900

ttacaggcgt ccatcattga atcaaaactc gacgggaacg aggtgttgat ggttgacgcg     960

gagaataaac gacgaggcgc gttttacgat tcgcagacta agtcgggatc taagcgtcct    1020

cgaggacgtc caagactgcc gggtggtgac gtcgacgcgt tgccttcatc cgtacctcca    1080

ttaggcgcgt cttcgatgac gcccgaagaa gcggcgaggt tcaatcagtt gttcgcgttc    1140

accacgtcac aactcatggc acagtacccg ctggacgtgc gcgcggatgt gaacagcatc    1200

atggcgcaga gcgcgatggg taacgcaaac taccttcatc ttctcgcgca gtcttccgtg    1260

gcccaagcgc acgcggcgcg acggatggag aacaccgcaa aaggaatgag ctctgattcc    1320

agcatcgaca acacggctat gttcgtgccg ccacttcctg cgtttcccgc gatgcttccg    1380

gcgtggggca tgtctggctt gtcttaccac agcaaccaca tggaacacat gatgcggatg    1440

tacgaaactt ctctggcaac gattagcgac aacgacccct cgcatccaga tggaaagatt    1500

gccgaacaat aa                                                        1512

<210>19

<211>503

<212>PRT

<213>Ostreococcus tauri

<400>19

Met Asn Gly Asp Gly Gly Val Glu Ser Ser Arg Ala Ser Gly Gly Thr

1               5                   10                  15

Asp Val Pro Gly Glu Asp Ala Ala Arg Thr Arg Ala Thr Pro Ser Ala

            20                  25                  30

Thr Ser Arg Lys Asp Lys Ser Leu Trp Thr Leu Cys Glu Arg Phe Leu

        35                  40                  45

Thr Ile Tyr Gly Asp Gly Ser Lys Glu Ser Val Ser Leu Asp Asp Ala

    50                  55                  60

Ala Thr Arg Leu Gly Val Glu Arg Arg Arg Ile Tyr Asp Val Ala Asn

65                  70                  75                  80

Val Leu Glu Ser Val Glu Val Leu Glu Arg Lys Ala Lys Asn Gln Tyr

                85                  90                  95

Thr Trp His Gly Val Arg Arg Leu Pro Glu Cys Leu Lys Arg Leu Lys

            100                 105                 110

Glu Ser Gly Leu Arg Glu Phe Gly Thr Asp Val Glu Leu Asp Gly Ser

        115                 120                 125

Thr Ser Glu Gly Arg Asp Gly Glu Lys Glu Asp Gly Thr Ala Arg Gly

    130                 135                 140

Gly Asp Ala Ser Asp Arg Ser Ser Pro Thr Asn Ser Ser Thr Ile Asn

145                 150                 155                 160

Leu Asp Ala Lys Gln Arg Gly Glu Lys Val Thr Gly Thr Lys Phe Phe

                165                 170                 175

Gly Gln Gly Arg Phe Ala Val Ser Ser Ala Ser Tyr Asp Ser Arg Arg

            180                 185                 190

Glu Lys Ser Leu Gly Leu Leu Ser Gln Lys Phe Val Gln Leu Phe Leu

        195                 200                 205

Ala Ser Lys Met Asn Val Val Ser Leu Glu Thr Ala Ala Arg Ile Ile

    210                 215                 220

Met Gly Glu Asp Asp Asp Asp Glu Ala Lys Leu Lys Thr Lys Ile Arg

225                 230                 235                 240

Arg Leu Tyr Asp Ile Ala Asn Ile Leu Cys Ser Leu Arg Leu Ile Arg

                245                 250                 255

Lys Val His Val Gly Glu Thr Arg Lys Pro Ala Phe Leu Trp Leu Gln

            260                 265                 270

Arg Glu Asn Ser Ile Ala Glu Leu Ile Ala Gln Gly Lys Gly Leu Met

        275                 280                 285

Trp Phe Asp Lys Leu Asn Glu Glu Glu Glu Met Arg Leu Gln Ala Ser

    290                 295                 300

Ile Ile Glu Ser Lys Leu Asp Gly Asn Glu Val Leu Met Val Asp Ala

305                 310                 315                 320

Glu Asn Lys Arg Arg Gly Ala Phe Tyr Asp Ser Gln Thr Lys Ser Gly

                325                 330                 335

Ser Lys Arg Pro Arg Gly Arg Pro Arg Leu Pro Gly Gly Asp Val Asp

            340                 345                 350

Ala Leu Pro Ser Ser Val Pro Pro Leu Gly Ala Ser Ser Met Thr Pro

        355                 360                 365

Glu Glu Ala Ala Arg Phe Asn Gln Leu Phe Ala Phe Thr Thr Ser Gln

    370                 375                 380

Leu Met Ala Gln Tyr Pro Leu Asp Val Arg Ala Asp Val Asn Ser Ile

385                 390                 395                 400

Met Ala Gln Ser Ala Met Gly Asn Ala Asn Tyr Leu His Leu Leu Ala

                405                 410                 415

Gln Ser Ser Val Ala Gln Ala His Ala Ala Arg Arg Met Glu Asn Thr

            420                 425                 430

Ala Lys Gly Met Ser Ser Asp Ser Ser Ile Asp Asn Thr Ala Met Phe

        435                 440                 445

Val Pro Pro Leu Pro Ala Phe Pro Ala Met Leu Pro Ala Trp Gly Met

    450                 455                 460

Ser Gly Leu Ser Tyr His Ser Asn His Met Glu His Met Met Arg Met

465                 470                 475                 480

Tyr Glu Thr Ser Leu Ala Thr Ile Ser Asp Asn Asp Pro Ser His Pro

                485                 490                 495

Asp Gly Lys Ile Ala Glu Gln

            500

<210>20

<211>1161

<212>DNA

<213>蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)

<400>20

atggctgctt cctcctccga tcctccttca cgacaccaca cttacgaccg taaacaaaaa    60

tcccttggcc tcttatgcac caagttcttg agcttgtata acaaagatga tgttcgttta   120

attggtctcg acgatgctgc cgccaaatta ggtgttgaga gaagacggat ctatgatatt   180

gtcaatgttc tcgaaagcat cggggttctt gcaagaaaag ccaagaatca gtatacctgg   240

aaaggttttg cggcaattcc tgttgctcta caggagctta aggaagaggg tttatggcag   300

aatctcaatt cttcacaaga aggtgccaat gaagatgtga aggtatcgga tgaagaggat   360

gaggatgaat tgttatccca aaccactgga agtcagggtg aatcattatc ccaacccact   420

ggaagtcaga atgacaatct aaaccctaat tccgcttttc ccagatcttt gaaaaatgac   480

agaagggaaa aatctctggc gctgcttact cagaattttg tcaagctctt tgtctgttcc   540

aacctggaaa tgatatcgct tgatgatgca gcaaggttgt tgcttggaga tgcatataat   600

tcatcaacaa tgagaacaaa agtcaggcgc ctttatgata ttgcaaacgt gctaacctcc   660

atgaacctta ttgagaagac ccataccaca gatacaagaa aaccagcatt caggtggcta   720

ggcttaaaag ggaagacatt gaatgaggca tcactttaca attcaaaaca aaatgagtct   780

aggaaaaggg cgtttggaaa tgatgtcaca aacataagct ttgccaggaa tagaatggac   840

ttgttcatgg gcggggactt taagaagcaa aagacaatgg aaaatgatag tggactatgt   900

caggaagatg tgaaacaagg cataaaacag acttcagcag ctaactatca atttggtcct   960

tttgctcctg cctttgtatc caaagctgga agctctgaga ataaagtgaa gcaggtgcat  1020

gactgggaga gtctcgctac tgaacattgc cctcagtatc aaaaccaagc tttgaaagaa  1080

ctttactctc attacatgga agcatggaaa tcttggtact ctgaagttgc tgggaagagg  1140

tcaacgcaag ttttgtagta a                                            1161

<210>21

<211>385

<212>PRT

<213>蒺藜苜蓿

<400>21

Met Ala Ala Ser Ser Ser Asp Pro Pro Ser Arg His His Thr Tyr Asp

1               5                   10                  15

Arg Lys Gln Lys Ser Leu Gly Leu Leu Cys Thr Lys Phe Leu Ser Leu

            20                  25                  30

Tyr Asn Lys Asp Asp Val Arg Leu Ile Gly Leu Asp Asp Ala Ala Ala

        35                  40                  45

Lys Leu Gly Val Glu Arg Arg Arg Ile Tyr Asp Ile Val Asn Val Leu

    50                  55                  60

Glu Ser Ile Gly Val Leu Ala Arg Lys Ala Lys Asn Gln Tyr Thr Trp

65                  70                  75                  80

Lys Gly Phe Ala Ala Ile Pro Val Ala Leu Gln Glu Leu Lys Glu Glu

                85                  90                  95

Gly Leu Trp Gln Asn Leu Asn Ser Ser Gln Glu Gly Ala Asn Glu Asp

            100                 105                 110

Val Lys Val Ser Asp Glu Glu Asp Glu Asp Glu Leu Leu Ser Gln Thr

        115                 120                 125

Thr Gly Ser Gln Gly Glu Ser Leu Ser Gln Pro Thr Gly Ser Gln Asn

    130                 135                 140

Asp Asn Leu Asn Pro Asn Ser Ala Phe Pro Arg Ser Leu Lys Asn Asp

145                 150                 155                 160

Arg Arg Glu Lys Ser Leu Ala Leu Leu Thr Gln Asn Phe Val Lys Leu

                165                 170                 175

Phe Val Cys Ser Asn Leu Glu Met Ile Ser Leu Asp Asp Ala Ala Arg

            180                 185                 190

Leu Leu Leu Gly Asp Ala Tyr Asn Ser Ser Thr Met Arg Thr Lys Val

        195                 200                 205

Arg Arg Leu Tyr Asp Ile Ala Asn Val Leu Thr Ser Met Asn Leu Ile

    210                 215                 220

Glu Lys Thr His Thr Thr Asp Thr Arg Lys Pro Ala Phe Arg Trp Leu

225                 230                 235                 240

Gly Leu Lys Gly Lys Thr Leu Asn Glu Ala Ser Leu Tyr Asn Ser Lys

                245                 250                 255

Gln Asn Glu Ser Arg Lys Arg Ala Phe Gly Asn Asp Val Thr Asn Ile

            260                 265                 270

Ser Phe Ala Arg Asn Arg Met Asp Leu Phe Met Gly Gly Asp Phe Lys

        275                 280                 285

Lys Gln Lys Thr Met Glu Asn Asp Ser Gly Leu Cys Gln Glu Asp Val

    290                 295                 300

Lys Gln Gly Ile Lys Gln Thr Ser Ala Ala Asn Tyr Gln Phe Gly Pro

305                 310                 315                 320

Phe Ala Pro Ala Phe Val Ser Lys Ala Gly Ser Ser Glu Asn Lys Val

                325                 330                 335

Lys Gln Val His Asp Trp Glu Ser Leu Ala Thr Glu His Cys Pro Gln

            340                 345                 350

Tyr Gln Asn Gln Ala Leu Lys Glu Leu Tyr Ser His Tyr Met Glu Ala

        355                 360                 365

Trp Lys Ser Trp Tyr Ser Glu Val Ala Gly Lys Arg Ser Thr Gln Val

    370                 375                 380

Leu

385

<210>22

<211>1510

<212>DNA

<213>小麦(Triticum aestivum)

<400>22

ccctcctcca aggaccacaa aattcccccc tccctaccct ttccacctcg acatccaccg     60

gaaatggacc ccgccgccgc cgccggggct ccggcggccg ctgcgcagcc accgccccct    120

cctcctcctc cttacctgcc cccgcggctg gtcatcgacg gcgccggagg cggctcgggc    180

gccgccgtga gggcctgccg gcaccacgcc tacagccgca agcagaagtc cctcggcctc    240

ctctgctcca acttcgtggc gctgtacgac cgggacgacg tggagacggt ggggctggac    300

gacgccgcca ggcggctcgg cgtcgagagg cgccggatct acgacatcgt caacgtgctc     360

gagagcgtcg ggattctcgt gaggagggcc aagaatcggt acacatggat cggatttgag     420

ggcgtccctg ccgcgctcaa ggagcttaag gagaggacac tgagagagat gtctggatta     480

gctccgccac cggaggaatc atctgctgcc aatgtgtcgg acgatgaaga cgacgatgat     540

aaattgggcg atgcagatgg ggacgccgac agcgagaagc ttagccagtc cctcgacaat     600

gcttctgata agcctaacgt gcccatgtgc ccacctagat ctgtagacca taggaaggag     660

aagtcgcttg ggctgctcac gcagaatttt gtcaagctct tcctcaccat ggaggttgag     720

acagtctcac ttgacgaggc tgcaaggctg ctccttggag agagacatgc cgagagcaat     780

atgagaacta aggttcgtcg actgtatgac atcgccaatg tgctatcttc tttgaacctc     840

attgagaaga cacagcaggt ggactccaga aaacctgcat tccggtggct cggtcaggca     900

aagcgaaagg aaggtgccac tgtcacggtt gctttaccac catccaggaa gattatgtct     960

agcaagaggg catttggtac cgacatcaca aacattgaca ataagagggg caagttagtc    1020

ttggaaacag agaacaaacc caaactcatg cagggtggca gcagcatgtt gaaaactttc    1080

gagagtcagc tcgggcaagg gaagagtagt ggctttgttt atgggccctt ccaccctgct    1140

ggtgcaagga aacatgaagt tgatgatcag acagtgaggg agaatgagat gaagaacatt    1200

caagactggg agagtctcgc tgtttcattc cgtccacagt accaaaatca cgcgctgaat    1260

gatctttttg gccattatgt tgaagcatgg aaatcatggt acttggatct tacacgggat    1320

tcgacctcat gaaaggatgg tttattttag gcaggtctgt tgtaatcagt tcttgtaggc    1380

agatcaactc atctgccgag gaccctagaa aggattcgac ctgtacaaga tgtcataaaa    1440

gcacaaaggc tcatttcgcc tttgctcgat gtatttactc aatgcaaaaa agaaacggaa    1500

taatgccaaa                                                           1510

<210>23

<211>422

<212>PRT

<213>小麦

<400>23

Met Asp Pro Ala Ala Ala Ala Gly Ala Pro Ala Ala Ala Ala Gln Pro

1               5                   10                  15

Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Tyr Leu Pro Pro Arg Leu Val Ile Asp

            20                  25                  30

Gly Ala Gly Gly Gly Ser Gly Ala Ala Val Arg Ala Cys Arg His His

        35                  40                  45

Ala Tyr Ser Arg Lys Gln Lys Ser Leu Gly Leu Leu Cys Ser Asn Phe

    50                  55                  60

Val Ala Leu Tyr Asp Arg Asp Asp Val Glu Thr Val Gly Leu Asp Asp

65                  70                  75                  80

Ala Ala Arg Arg Leu Gly Val Glu Arg Arg Arg Ile Tyr Asp Ile Val

                85                  90                  95

Asn Val Leu Glu Ser Val Gly Ile Leu Val Arg Arg Ala Lys Asn Arg

            100                 105                 110

Tyr Thr Trp Ile Gly Phe Glu Gly Val Pro Ala Ala Leu Lys Glu Leu

        115                 120                 125

Lys Glu Arg Thr Leu Arg Glu Met Ser Gly Leu Ala Pro Pro Pro Glu

    130                 135                 140

Glu Ser Ser Ala Ala Asn Val Ser Asp Asp Glu Asp Asp Asp Asp Lys

145                 150                 155                 160

Leu Gly Asp Ala Asp Gly Asp Ala Asp Ser Glu Lys Leu Ser Gln Ser

                165                 170                 175

Leu Asp Asn Ala Ser Asp Lys Pro Asn Val Pro Met Cys Pro Pro Arg

            180                 185                 190

Ser Val Asp His Arg Lys Glu Lys Ser Leu Gly Leu Leu Thr Gln Asn

        195                 200                 205

Phe Val Lys Leu Phe Leu Thr Met Glu Val Glu Thr Val Ser Leu Asp

    210                 215                 220

Glu Ala Ala Arg Leu Leu Leu Gly Glu Arg His Ala Glu Ser Asn Met

225                 230                 235                 240

Arg Thr Lys Val Arg Arg Leu Tyr Asp Ile Ala Asn Val Leu Ser Ser

                245                 250                 255

Leu Asn Leu Ile Glu Lys Thr Gln Gln Val Asp Ser Arg Lys Pro Ala

            260                 265                 270

Phe Arg Trp Leu Gly Gln Ala Lys Arg Lys Glu Gly Ala Thr Val Thr

        275                 280                 285

Val Ala Leu Pro Pro Ser Arg Lys Ile Met Ser Ser Lys Arg Ala Phe

    290                 295                 300

Gly Thr Asp Ile Thr Asn Ile Asp Asn Lys Arg Gly Lys Leu Val Leu

305                 310                 315                 320

Glu Thr Glu Asn Lys Pro Lys Leu Met Gln Gly Gly Ser Ser Met Leu

                325                 330                 335

Lys Thr Phe Glu Ser Gln Leu Gly Gln Gly Lys Ser Ser Gly Phe Val

            340                 345                 350

Tyr Gly Pro Phe His Pro Ala Gly Ala Arg Lys His Glu Val Asp Asp

        355                 360                 365

Gln Thr Val Arg Glu Asn Glu Met Lys Asn Ile Gln Asp Trp Glu Ser

    370                 375                 380

Leu Ala Val Ser Phe Arg Pro Gln Tyr Gln Asn His Ala Leu Asn Asp

385                 390                 395                 400

Leu Phe Gly His Tyr Val Glu Ala Trp Lys Ser Trp Tyr Leu Asp Leu

                405                 410                 415

Thr Arg Asp Ser Thr Ser

            420

<210>24

<211>1530

<212>DNA

<213>稻

<400>24

aaatctctcc tcccgctcgc cgaaaccctc gccgtcgccg cgccatggcc gccgccgccg      60

atgctccccc gcctcctccg gaggtcgccc cgcccgcgcc cgcgcccgcc cccgcgccgg     120

cgccatatca gccgccgcgg ctggcggtgg ccgacggagc gggaggtggc ggcggcggcg     180

gcgggaagcc gtgcaggcac cacgcgtaca gccgcaagca gaagtcgctc ggcctcctct     240

gcaccaactt cgtggcgctg tacgaccggg aggacgtgga gtcggtgggg ctggacgacg     300

cggcgaggcg gctgggcgtc gagaggcgcc ggatctacga catcgtcaac gtgctcgaga     360

gcatcgggat gctcgtgagg agggccaaga atcggtatac gtggatcggc ttcggtggag     420

tccctgcggc gctcgcgaaa ctcaaggaga tgtcactgag ggcggtgtca agcgtggcgt     480

caccgtcgct ggatgaaaca tctgctgcta atgtctcgga tgatgaggat gatgacaagt     540

tagatgatgc tgagggcgat gcggagagcg agaagctcag cctcagccag tccattgaca     600

atccttctga taagcctgat gcaccccctt gcaagcttcg atccgagcat aggaaggaga     660

agtcccttgg gctgctcact cagaattttg tcaagctctt cctcaccatg gagattgaga     720

cgatctcact tgatgaagcc gcaaagcggc tccttggaga gggacatgcg gcgaacaata     780

tgagaaccaa agttcggcga ttgtacgata ttgccaatgt gctgtcttct ttgaatctta     840

ttgagaagac acaacaggcg gactcaagaa aacctgcatt ccggtggctg ggccaggcaa     900

aacggaatga aggcgtcacg gttgctttac ccccaaccaa gacgttgcct aacaagagag     960

catttggtac tgatctgact aacattgaca ataagagggg taagttggac tccacaatgg    1020

agaacagagg caagcccacg caggatggtg gcaacctatt caataatttg cagaggcaat    1080

tagggcaaga gaacaggagc gattttgctt atggcccctt ccaccctgct gttgcaagga    1140

aacaagaaca tggtaatcgc acagtacaag agaaggagag gaagagcatt caagactggg    1200

agaaccttgc ttcttctttc cgtccgcaat atcaaaatcc aggactgaac gatctttttg    1260

gccactacat ggaagcaagg aggtcatggt actcggatct caggcgagac agagcatcat    1320

aaaaccagat tcaggccggt ccgttgtaaa caaaattctt gtaggcagat aaactcattt    1380

gttgatgcat ggttagggat ttttgagtta tacaagatgt cacaaaaaca aaggctagtg    1440

ctggcctttg attgattgta tttactcagt gcaagaaatt ggaaagtcgt ttcgtcaata    1500

atactaggat acctgattgt cgatttgttt                                     1530

<210>25

<211>425

<212>PRT

<213>稻

<400>25

Met Ala Ala Ala Ala Asp Ala Pro Pro Pro Pro Pro Glu Val Ala Pro

1               5                   10                  15

Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Tyr Gln Pro Pro Arg

            20                  25                  30

Leu Ala Val Ala Asp Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Lys

        35                  40                  45

Pro Cys Arg His His Ala Tyr Ser Arg Lys Gln Lys Ser Leu Gly Leu

    50                  55                  60

Leu Cys Thr Asn Phe Val Ala Leu Tyr Asp Arg Glu Asp Val Glu Ser

65                  70                  75                  80

Val Gly Leu Asp Asp Ala Ala Arg Arg Leu Gly Val Glu Arg Arg Arg

                85                  90                  95

Ile Tyr Asp Ile Val Asn Val Leu Glu Ser Ile Gly Met Leu Val Arg

            100                 105                 110

Arg Ala Lys Asn Arg Tyr Thr Trp Ile Gly Phe Gly Gly Val Pro Ala

        115                 120                 125

Ala Leu Ala Lys Leu Lys Glu Met Ser Leu Arg Ala Val Ser Ser Val

    130                 135                 140

Ala Ser Pro Ser Leu Asp Glu Thr Ser Ala Ala Asn Val Ser Asp Asp

145                 150                 155                 160

Glu Asp Asp Asp Lys Leu Asp Asp Ala Glu Gly Asp Ala Glu Ser Glu

                165                 170                 175

Lys Leu Ser Leu Ser Gln Ser Ile Asp Asn Pro Ser Asp Lys Pro Asp

            180                 185                 190

Ala Pro Pro Cys Lys Leu Arg Ser Glu His Arg Lys Glu Lys Ser Leu

        195                 200                 205

Gly Leu Leu Thr Gln Asn Phe Val Lys Leu Phe Leu Thr Met Glu Ile

    210                 215                 220

Glu Thr Ile Ser Leu Asp Glu Ala Ala Lys Arg Leu Leu Gly Glu Gly

225                 230                 235                 240

His Ala Ala Asn Asn Met Arg Thr Lys Val Arg Arg Leu Tyr Asp Ile

                245                 250                 255

Ala Asn Val Leu Ser Ser Leu Asn Leu Ile Glu Lys Thr Gln Gln Ala

            260                 265                 270

Asp Ser Arg Lys Pro Ala Phe Arg Trp Leu Gly Gln Ala Lys Arg Asn

        275                 280                 285

Glu Gly Val Thr Val Ala Leu Pro Pro Thr Lys Thr Leu Pro Asn Lys

    290                 295                 300

Arg Ala Phe Gly Thr Asp Leu Thr Asn Ile Asp Asn Lys Arg Gly Lys

305                 310                 315                 320

Leu Asp Ser Thr Met Glu Asn Arg Gly Lys Pro Thr Gln Asp Gly Gly

                325                 330                 335

Asn Leu Phe Asn Asn Leu Gln Arg Gln Leu Gly Gln Glu Asn Arg Ser

            340                 345                 350

Asp Phe Ala Tyr Gly Pro Phe His Pro Ala Val Ala Arg Lys Gln Glu

        355                 360                 365

His Gly Asn Arg Thr Val Gln Glu Lys Glu Arg Lys Ser Ile Gln Asp

    370                 375                 380

Trp Glu Asn Leu Ala Ser Ser Phe Arg Pro Gln Tyr Gln Asn Pro Gly

385                 390                 395                 400

Leu Asn Asp Leu Phe Gly His Tyr Met Glu Ala Arg Arg Ser Trp Tyr

                405                 410                 415

Ser Asp Leu Arg Arg Asp Arg Ala Ser

            420                 425

<210>26

<211>645

<212>DNA

<213>宽叶蝇子草(Silene latifolia)

<400>26

gcacgagtca ccatcagaaa atcgatcttt gcatcatggt tatagtagaa agcagaaatc   60

tttgggtctt ctttgttcaa atttcttgag attgtataat cgagacgatg tcgatttgat  120

tggtctagat gatgctgcca gtaaattagg agtcgagcga agaaggatct atgatattgt  180

taatgtgttg gagagtgtag gggtgttagc aagaaaagcg aaaaatcagt acacatggaa  240

gggctacaag gcaattccta aggctcttgc cttgttaaag gaagatggtt tgaaggagaa  300

ttttggtact gcagagggaa gaagtagagt aaagtttcag gttttagact ttgatgatga  360

tgtagcttct aaccctgata ccggaagcca gtcggaggca ccaacacata gtggtgcttc  420

taagcctgat aacagaaggg aaaagtcatt ggggcttcta acacaaaact ttgtgaagct  480

attcctttgt tctgaggctg agctgatctc tctggaggaa gctgcaaagt gcttgcttgg  540

agatggtctt aatgcacaag tgatgcgaac taaagtgaga cgattgtatg atattgccaa  600

tgtattatcc tccatgcaac tcattgaaaa gactactcaa acaga                  645

<210>27

<211>214

<212>PRT

<213>宽叶蝇子草

<400>27

His Glu Ser Pro Ser Glu Asn Arg Ser Leu His His Gly Tyr Ser Arg

1               5                   10                  15

Lys Gln Lys Ser Leu Gly Leu Leu Cys Ser Asn Phe Leu Arg Leu Tyr

            20                  25                  30

Asn Arg Asp Asp Val Asp Leu Ile Gly Leu Asp Asp Ala Ala Ser Lys

        35                  40                  45

Leu Gly Val Glu Arg Arg Arg Ile Tyr Asp Ile Val Asn Val Leu Glu

    50                  55                  60

Ser Val Gly Val Leu Ala Arg Lys Ala Lys Asn Gln Tyr Thr Trp Lys

65                  70                  75                  80

Gly Tyr Lys Ala Ile Pro Lys Ala Leu Ala Leu Leu Lys Glu Asp Gly

                85                  90                  95

Leu Lys Glu Asn Phe Gly Thr Ala Glu Gly Arg Ser Arg Val Lys Phe

            100                 105                 110

Gln Val Leu Asp Phe Asp Asp Asp Val Ala Ser Asn Pro Asp Thr Gly

        115                 120                 125

Ser Gln Ser Glu Ala Pro Thr His Ser Gly Ala Ser Lys Pro Asp Asn

    130                 135                 140

Arg Arg Glu Lys Ser Leu Gly Leu Leu Thr Gln Asn Phe Val Lys Leu

145                 150                 155                 160

Phe Leu Cys Ser Glu Ala Glu Leu Ile Ser Leu Glu Glu Ala Ala Lys

                165                 170                 175

Cys Leu Leu Gly Asp Gly Leu Asn Ala Gln Val Met Arg Thr Lys Val

            180                 185                 190

Arg Arg Leu Tyr Asp Ile Ala Asn Val Leu Ser Ser Met Gln Leu Ile

        195                 200                 205

Glu Lys Thr Thr Gln Thr

    210

<210>28

<211>785

<212>DNA

<213>向日葵(Helianthus)

<400>28

cggggggacg gatcgaactg ttggattgga tgacgccgca acgaggctag gtgttgagag   60

acggcggatt tatgacattg ttaatgtttt ggaaagcgtt ggcgtccttg tgaaaaaggc  120

aaaaaacacg tatcattggt taggattggg ggcaatacct aaggctttag agcagctaaa  180

ggaagaaggt tttaggaata atgatgaaca tgttgatgtt aaatctggaa aggtttctga  240

tgatgaagaa gatgaaagag tttctagcca tagtgtttct ttacaggaaa aatcagatct  300

agattcaatg cataaaactt cagggccgtt taaatcgggt agtgtaacgg aaaatcggaa  360

ggaaaaatct ttggggcttc ttaccaagaa tttcatcaag cttttcctat gcactaattc  420

ggatatgctt tcgcttgatg acgctgcaaa aatattgctt ggagatgctc agaatccgtc  480

attgacccga actaaagtca gacgcctata tgatattgct aatgtcttgt cttccatgca  540

cttcatcgag aagatccatc acccagaaac ccgaaagccc gcctttaggt ggttgggaat  600

ggcaagtcac ccaaatagcc aaacgagatc agccactggt gtagctcata tagagtccaa  660

aaaaagggca tttgggactg agcttacaaa catttgtttc aaaagaagca agttgggtga  720

ccaggaggtg aagctgtttg accttcagag tcaacgcccg cctatcaaac ccagcactca  780

taatc                                                              785

<210>29

<211>261

<212>PRT

<213>向日葵

<400>29

Gly Gly Thr Asp Arg Thr Val Gly Leu Asp Asp Ala Ala Thr Arg Leu

1               5                   10                  15

Gly Val Glu Arg Arg Arg Ile Tyr Asp Ile Val Asn Val Leu Glu Ser

            20                  25                  30

Val Gly Val Leu Val Lys Lys Ala Lys Asn Thr Tyr His Trp Leu Gly

        35                  40                  45

Leu Gly Ala Ile Pro Lys Ala Leu Glu Gln Leu Lys Glu Glu Gly Phe

    50                  55                  60

Arg Asn Asn Asp Glu His Val Asp Val Lys Ser Gly Lys Val Ser Asp

65                  70                  75                  80

Asp Glu Glu Asp Glu Arg Val Ser Ser His Ser Val Ser Leu Gln Glu

                85                  90                  95

Lys Ser Asp Leu Asp Ser Met His Lys Thr Ser Gly Pro Phe Lys Ser

            100                 105                 110

Gly Ser Val Thr Glu Asn Arg Lys Glu Lys Ser Leu Gly Leu Leu Thr

        115                 120                 125

Lys Asn Phe Ile Lys Leu Phe Leu Cys Thr Asn Ser Asp Met Leu Ser

    130                 135                 140

Leu Asp Asp Ala Ala Lys Ile Leu Leu Gly Asp Ala Gln Asn Pro Ser

145                 150                 155                 160

Leu Thr Arg Thr Lys Val Arg Arg Leu Tyr Asp Ile Ala Asn Val Leu

                165                 170                 175

Ser Ser Met His Phe Ile Glu Lys Ile His His Pro Glu Thr Arg Lys

            180                 185                 190

Pro Ala Phe Arg Trp Leu Gly Met Ala Ser His Pro Asn Ser Gln Thr

        195                 200                 205

Arg Ser Ala Thr Gly Val Ala His Ile Glu Ser Lys Lys Arg Ala Phe

    210                 215                 220

Gly Thr Glu Leu Thr Asn Ile Cys Phe Lys Arg Ser Lys Leu Gly Asp

225                 230                 235                 240

Gln Glu Val Lys Leu Phe Asp Leu Gln Ser Gln Arg Pro Pro Ile Lys

                245                 250                 255

Pro Ser Thr His Asn

            260

<210>30

<211>1125

<212>DNA

<213>大豆(Glycine max)

<400>30

atgacttctt tgtctaccca tcacacctat agccgaaagc aaaaatctct cggcctcctc    60

tgcaccaatt ttctgagttt gtacaacaaa gaaggtgtgc gcctggtcgg tctcgatgac   120

gcagcttcgc ggttaggtgt agaaagacgt cggatctacg acatcgttaa tgttttagag   180

agtgtcggtg tgctaaccag aaaagctaag aatcagtata cttggaaagg attttgtgca   240

attcctgctg ccttacaaga acttaaggat gaaggtttga aggagaatcc tggatcattt   300

gatgactcca atgacaatgc aaaagtgtct gatgatgagg aggaggaaga agaaacattt   360

cctaatatta acattgggag tcagagtgag aaggaaaatc ctgattacac tgctactgtc   420

aaatcctcca agaatgaaaa cagaagggaa aaatctctgg cattgcttac tcagaatttt   480

gtcaagcttt ttgtctgctc taattttgaa atgatctccc ttgacgaagc tgcaaagttg   540

ttgcttggaa atgccaacaa tagaacaaaa gtcagacgtc tatatgatat tgcgaatgtg   600

ttatcctcca tgaacctaat cgagaagacc catacaacaa acacaagaaa accagcattc   660

aggtggttgg gtgtgagggg aaaaacatgg ggtggatcag ttgacttggc tcaaaattca   720

aatgtcaaag agtcacggaa aaggatgttt ggaactgaca ttggaaacat aagttttaaa   780

aggaacaaag ttgatttgtc catggatggc cagaattcta aaatgcaaaa tcaacacgaa   840

aatattagtc cacgagctca gttagagaaa atcatcataa aaaaagatgc taagcagact   900

tcagagagct atcagtttgg cccttttgct ccagcttatg tgcccaaagt tggaacctct   960

gaaaataata gtgtgaaaaa ggtgcatgac tgggacagcc tcgcacagga gcatcgtcct  1020

caatatcaaa accaaccttt aaaagatcta ttttcccact acatggaagc atggaaatct  1080

tggtactctg aagctgctgg gaaaaagtca acgaaaactt tataa                  1125

<210>31

<211>374

<212>PRT

<213>大豆

<400>31

Met Thr Ser Leu Ser Thr His His Thr Tyr Ser Arg Lys Gln Lys Ser

1               5                   10                  15

Leu Gly Leu Leu Cys Thr Asn Phe Leu Ser Leu Tyr Asn Lys Glu Gly

            20                  25                  30

Val Arg Leu Val Gly Leu Asp Asp Ala Ala Ser Arg Leu Gly Val Glu

        35                  40                  45

Arg Arg Arg Ile Tyr Asp Ile Val Asn Val Leu Glu Ser Val Gly Val

    50                  55                  60

Leu Thr Arg Lys Ala Lys Asn Gln Tyr Thr Trp Lys Gly Phe Cys Ala

65                  70                  75                  80

Ile Pro Ala Ala Leu Gln Glu Leu Lys Asp Glu Gly Leu Lys Glu Asn

                85                  90                  95

Pro Gly Ser Phe Asp Asp Ser Asn Asp Asn Ala Lys Val Ser Asp Asp

            100                 105                 110

Glu Glu Glu Glu Glu Glu Thr Phe Pro Asn Ile Asn Ile Gly Ser Gln

        115                 120                 125

Ser Glu Lys Glu Asn Pro Asp Tyr Thr Ala Thr Val Lys Ser Ser Lys

    130                 135                 140

Asn Glu Asn Arg Arg Glu Lys Ser Leu Ala Leu Leu Thr Gln Asn Phe

145                 150                 155                 160

Val Lys Leu Phe Val Cys Ser Asn Phe Glu Met Ile Ser Leu Asp Glu

                165                 170                 175

Ala Ala Lys Leu Leu Leu Gly Asn Ala Asn Asn Arg Thr Lys Val Arg

            180                 185                 190

Arg Leu Tyr Asp Ile Ala Asn Val Leu Ser Ser Met Asn Leu Ile Glu

        195                 200                 205

Lys Thr His Thr Thr Asn Thr Arg Lys Pro Ala Phe Arg Trp Leu Gly

    210                 215                 220

Val Arg Gly Lys Thr Trp Gly Gly Ser Val Asp Leu Ala Gln Asn Ser

225                 230                 235                 240

Asn Val Lys Glu Ser Arg Lys Arg Met Phe Gly Thr Asp Ile Gly Asn

                245                 250                 255

Ile Ser Phe Lys Arg Asn Lys Val Asp Leu Ser Met Asp Gly Gln Asn

            260                 265                 270

Ser Lys Met Gln Asn Gln His Glu Asn Ile Ser Pro Arg Ala Gln Leu

        275                 280                 285

Glu Lys Ile Ile Ile Lys Lys Asp Ala Lys Gln Thr Ser Glu Ser Tyr

    290                 295                 300

Gln Phe Gly Pro Phe Ala Pro Ala Tyr Val Pro Lys Val Gly Thr Ser

305                 310                 315                 320

Glu Asn Asn Ser Val Lys Lys Val His Asp Trp Asp Ser Leu Ala Gln

                325                 330                 335

Glu His Arg Pro Gln Tyr Gln Asn Gln Pro Leu Lys Asp Leu Phe Ser

            340                 345                 350

His Tyr Met Glu Ala Trp Lys Ser Trp Tyr Ser Glu Ala Ala Gly Lys

        355                 360                 365

Lys Ser Thr Lys Thr Leu

    370

Claims (37)

1.相对于对照植物增加植物产率和/或胁迫抗性的方法，包括降低植物中DEL1编码核酸的表达和/或降低DEL1多肽的活性，和任选地选择具有增加的产率的植物。

2.根据权利要求1的方法，其中所述DEL1蛋白包含SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13中任何一个或多个基序。

3.根据权利要求1或2的方法，其中通过引入遗传修饰，优选在编码DEL1多肽的基因座引入遗传修饰来实现所述降低的表达和/或活性。

4.根据权利要求3的方法，其中通过T-DNA激活、TILLING、定点诱变、转座诱变、T-DNA插入或定向进化中任一实现所述遗传修饰。

5.相对于对照植物增加植物产率和/或胁迫抗性方法，包括在植物中引入和表达DEL1核酸或其变体。

6.根据权利要求5的方法，其中所述核酸或变体编码SEQ ID NO：8的DEL1蛋白的直系同源物或旁系同源物。

7.根据权利要求5或6的方法，其中所述引入导致RNA介导的内源DEL1基因沉默。

8.根据权利要求7的方法，其中所述引入的DEL1核酸是植物来源的，优选为内源DEL1核酸或与DEL1核酸基本上同源。

9.根据权利要求5或6的方法，其中所述变体是DEL1核酸的部分或能够与DEL1核酸杂交的序列，所述部分或杂交序列编码多肽，所述多肽包含与位于DEL1蛋白DNA结合结构域C-末端的序列对应的序列，并且任选地还包含SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13中的一个或多个标签序列。

10.根据权利要求9的方法，其中所述部分编码的DEL1多肽缺乏部分或全部第一DNA结合区域和/或部分或全部第二DNA结合区域。

11.根据权利要求9或10的方法，其中所述所述部分编码的DEL1蛋白缺乏第一DNA结合结构域的N-末端部分。

12.根据权利要求9到11中任一项的方法，其中所述部分编码如SEQID NO：2所示的多肽。

13.根据权利要求5、6或9到12中任一项的方法，其中所述DEL1核酸或其变体在植物中过表达。

14.根据权利要求5、6或9到13中任一项的方法，其中所述DEL1核酸或其变体有效连接于种子特异性启动子。

15.根据权利要求14的方法，其中所述种子特异性启动子如SEQ IDNO：5所示。

16.根据权利要求1到15中任一项的方法，其中所述增加的产率是增加的种子产率。

17.根据权利要求16的方法，其中所述增加的种子产率包括增加的种子总重量和/或增加的饱满种子数。

18.根据权利要求1到15中任一项的方法，其中所述增加的胁迫抗性是增加的非生物胁迫抗性，优选增加的UV辐射抗性。

19.可根据权利要求1到18中任一项的方法获得的植物或植物细胞，前提是不通过T-DNA插入获得所述植物。

20.构建体，含有：

(i)DEL1核酸或其变体，

(ii)能够驱动(i)的核酸序列表达的一个或多个控制序列；和任选的

(iii)转录终止序列。

21.根据权利要求20的构建体，其中所述控制序列是种子特异性启动子。

22.根据权利要求21的构建体，其中所述种子特异性启动子如SEQ IDNO：5所示。

23.用于RNA介导的内源DEL1基因沉默的构建体，含有：

(i)DEL1核酸或其变体，

(ii)能够驱动(i)的核酸序列表达的一个或多个控制序列；和任选的

(iii)转录终止序列。

24.根据权利要求20到23中任一项的构建体在增加植物产率或增加胁迫抗性中的用途。

25.由根据权利要求20到23中任一项的构建体转化的植物或植物细胞。

26.产生具有增加的产率和/或增加的胁迫抗性的转基因植物的方法，所述方法包括：

(i)在植物或植物细胞中引入和表达DEL1核酸或其变体；

(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞。

27.具有增加的产率和/或增加的胁迫抗性的转基因植物，其通过将DEL1核酸或其变体引入所述植物而产生。

28.根据权利要求19、25或27的转基因植物，其中所述植物是单子叶植物如甘蔗，或者其中所述植物是谷类如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、燕麦或高粱。

29.根据权利要求19、25、27或28中任一项的植物的可收获部分。

30.根据权利要求29的植物可收获部分，其中所述可收获部分是种子。

31.从根据权利要求25的植物和/或从根据权利要求29或30的植物可收获部分直接衍生的产品。

32.分离的DEL1多肽，其选自：

(a)SEQ ID NO：21所示的多肽，

(b)这样的多肽，其具有的氨基酸序列与SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列具有至少60％序列同一性、优选70％序列同一性、更优选80％或90％序列同一性、最优选95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，

(c)(a)或(b)中所定义蛋白质的同源物、衍生物和/或功能性片段。

33.分离的核酸序列，其包含：

(i)SEQ ID NO：20所示的核酸序列或其互补链；

(ii)编码根据权利要求27的氨基酸序列的核酸序列；

(iii)能够(优选在严格条件下)与上述(i)或(ii)中的核酸序列杂交的核酸序列，所述杂交序列优选编码具有产率增加活性的蛋白质；

(iv)为(i)至(iii)中所述核酸序列的等位基因变体的核酸；

(v)为(i)至(iii)中所述核酸序列的剪接变体的核酸；

(vi)按照递增的优选顺序与SEQ ID NO：20或其互补物具有60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列；

(vii)上述(i)至(vi)中任一核酸序列的部分，所述部分优选编码具有产率增加活性的蛋白质。

34.DEL1核酸/基因或其变体、或者DEL1多肽或其同源物在相对于对照植物提高产率、特别是种子产率中的用途。

35.根据权利要求34的用途，其中所述种子产率包括增加的种子总重量和/或增加的饱满种子数。

36.DEL1核酸/基因或其变体、或者DEL1多肽或其同源物在相对于对照植物胁迫抗性、特别是非生物胁迫抗性中的用途。

37.DEL1核酸/基因或其变体、或者DEL1多肽或其同源物作为分子标记的用途。

Images