CN101914161A - 抑制肿瘤生长的融合蛋白HGFα-Fc及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及蛋白质工程领域，具体涉及编码包含HGF片段和Fc片段的融合蛋白及其编码DNA。本发明要解决的技术问题是克服是HGF蛋白片段生物活性和稳定性不好的缺陷。解决该技术问题的技术方案是提供一种优化的融合蛋白。该抗肿瘤的融合蛋白质由来自人肝细胞生长因子HGF的α链与人免疫球蛋白Fc段构成，人肝细胞生长因子HGF的α链在氮端，人免疫球蛋白Fc段在碳端，HGF的α链和Fc之间由一条连接肽相连。此融合蛋白具有抑制HGF/HGFR信号转导和发挥Fc免疫学效应的双重作用，其功效得到了很大的提高，具有明显更强的生物活性和血浆半衰期，从而能够更有效地抑制并杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤的发展。

Description

抑制肿瘤生长的融合蛋白HGFα-Fc及其用途

技术领域

本发明涉及蛋白质工程领域，具体涉及编码包含HGF片段和Fc片段的融合蛋白及其编码DNA、以及该融合蛋白的制药用途。

背景技术

肿瘤是严重危害人类健康的一类疾病。大量研究已经证实，许多生长因子与肿瘤细胞表面的生长因子受体结合可以诱导肿瘤细胞的恶性增殖。体外细胞模型、动物模型和人体临床试验都表明，阻断该类生长因子与其受体的结合可以有效地抑制肿瘤细胞的生长或诱发肿瘤细胞的死亡，从而达到抑制肿瘤生长的效果。因此，生长因子受体抑制剂是目前抗肿瘤新药的研究热点，目前已经有多个该类生物新药获得了美国FDA的上市批准，同时还有数十种正处于各期临床试验阶段。

肿瘤的生长因子信号通路是一类多种活性生物因子参与的复杂调控过程，其中的一个关键环节是肿瘤细胞表面的受体与多种生长因子相结合从而被激活，然后经细胞内酪氨酸磷酸化信号转导途径控制肿瘤细胞的增殖，从而促进肿瘤的生长。在多种生长因子中，肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor，简称为HGF)是控制肿瘤细胞生长的一种重要因子，其受体肝细胞生长因子受体(Hepatocyte growth factor receptor，简称为HGFR，又被称为C-Met)在多种肿瘤细胞表面过量表达，因此导致此类肿瘤细胞对HGF的敏感性增强。HGF与肿瘤细胞表面的HGFR结合可以引发HGFR二聚化，从而导致HGFR细胞内部分的酪氨酸激酶位点活化，激活下游多种信号通路，最终促进肿瘤细胞的生长。目前许多研究已经证实，HGF依赖的HGFR活化与乳腺癌、肺癌、恶性胶质瘤、骨肉瘤等多种肿瘤的发生密切相关，阻断HGF/HGFR的结合可以有效抑制此类肿瘤的生长，因此，HGF/HGFR是治疗此类恶性肿瘤的一个重要的分子靶点。

HGF是在体内分布广泛的一种生长因子，除主要来源于间质细胞的分泌外，还来自于某些肿瘤细胞(如乳腺癌和恶性胶质瘤)的自分泌。HGF前体是由728个氨基酸组成的单链多肽，成熟HGF是由α链和β链通过二硫键组成的异二聚体。α链由463个氨基酸构成，其N端含有一个PAN结构域，C端含有四个连续的环饼(Kringle domain)结构域。β链由234个氨基酸构成，其中含有一个Peptidase S1结构域。已有研究证实HGF单独的α链依然保留了与HGFR结合的能力，并且可以与天然HGF竞争结合HGFR。由于缺乏β链，HGFα与HGFR的结合并不引发HGFR细胞内部分的酪氨酸磷酸化，因此HGFα片段能够起到阻断HGF/HGFR信号传递的作用，从而达到肿瘤细胞生长的效果。不仅如此，最近还有研究表明，HGFα包含的环饼结构域也能够诱导肿瘤和血管内皮细胞凋亡，这种凋亡是通过抑制EGF、VEGF和bFGF与其受体结合，从而抑制这些受体的磷酸化而发挥作用的。

尽管HGFα能够阻断生长因子类受体信号通路的活化，抑制肿瘤细胞的生长，但是其对肿瘤细胞的杀伤作用仍然不够强大，而且在血浆中的半衰期不理想，因此十分有必要进一步改造以提高其抗肿瘤效应。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服是HGF蛋白片段生物活性和稳定性不好的缺陷。解决该技术问题的技术方案是提供一种优化的包含截断的HGF片段和免疫球蛋白Fc的融合蛋白，其在体内外都具有良好的生物活性和稳定性，能够阻断HGF/HGFR信号传递，并且能够杀伤肿瘤细胞，从而抑制肿瘤的生长。

该抗肿瘤的融合蛋白质由来自人肝细胞生长因子HGF的α链与人免疫球蛋白Fc段构成，人肝细胞生长因子HGF的α链在氮端，人免疫球蛋白Fc段在碳端，HGF的α链和Fc之间由一条连接肽相连。

其中，上述融合蛋白质中所述人肝细胞生长因子HGF的α链包括PAN结构域和四个连续的环饼结构域，PAN结构域在氮端。

其中，上述融合蛋白质中所述人肝细胞生长因子HGF的α链氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

其中，上述融合蛋白质中所述人免疫球蛋白为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgM或IgA。

其中，上述融合蛋白质中所述人免疫球蛋白为IgG1，IgG1的Fc段的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所述。

其中，上述抗融合蛋白质中所述连接肽的氨基酸序列为：GGGGSGGGGSGGGGS。

进一步的，上述融合蛋白质，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.8所示；

或者：

其氨基酸序列为在SEQ ID NO.8的基础上缺失、替换或增加一个或几个氨基酸后所得的具有相同功能的融合蛋白质。

本发明还提供了编码上述的抗肿瘤的融合蛋白质的核苷酸序列。

其中，上述核苷酸序列SEQ ID NO.7所示。

本发明还提供了含有编码上述的抗肿瘤的融合蛋白质的核苷酸序列的重组载体。

本发明也提供了含有编码上述的抗肿瘤的融合蛋白质的核苷酸序列的重组载体的宿主细胞。

另外，本发明还提供了上述抗肿瘤的融合蛋白质、编码上述的抗肿瘤的融合蛋白质的核苷酸序列、含有编码上述的抗肿瘤的融合蛋白质的核苷酸序列的重组载体、或者含有上述重组载体的宿主细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明也提供了一种抗肿瘤药物组合物。该抗肿瘤药物组合物由上述抗肿瘤的融合蛋白质、编码上述的抗肿瘤的融合蛋白质的核苷酸序列、含有编码上述的抗肿瘤的融合蛋白质的核苷酸序列的重组载体、或者含有上述重组载体的宿主细胞作为主要活性成分添加药学上可接受的辅助性成分制备而成的。进一步的，上述抗肿瘤药物组合物还包括一种或几种其他的抗肿瘤药物。

本发明的抗肿瘤药物组合物，组合物可以和其它治疗方法一起治疗肿瘤，所述其它治疗方法包括化学疗法、放射疗法、生物疗法。

本发明的有益效果在于：设计并构建了一种优化了的包含截断型HGFα链片段即HGFα、连接肽和人免疫球蛋白Fc的融合蛋白，使得HGFα和Fc之间具有足够的柔韧性，保证了正确的空间构象；更重要的是，此融合蛋白具有抑制HGF/HGFR信号转导和发挥Fc免疫学效应的双重作用，其功效得到了很大的提高。因此，这种融合蛋白与单纯的截断型HGF片段或单纯HGFα链片段加人免疫球蛋白Fc的融合蛋白相比，具有明显更强的生物活性和血浆半衰期，从而能够更有效地抑制并杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤的发展。

附图说明

图1.HGFα-Fc融合蛋白的结构模式图，为了方便表达，在其氨基端可连接一信号肽。

图2.HGFα-Fc/pcDNA3.1(+)重组载体示意图

图3.重组载体双酶切鉴定。1，重组载体；2，载体经HindIII/XhoI双酶切；M，分子Marker图4.免疫印迹检测CHO细胞分泌表达HGFα-Fc融合蛋白。1，稳定转染的CHO细胞培养上清；2：未转染的CHO细胞培养上清。

图5.蛋白A亲和层析纯化HGFα-Fc融合蛋白(非还原SDS-PAGE)。M，蛋白marker；1和2，纯化前；3和4，纯化后。

图6.流式细胞术检测HGFα-Fc融合蛋白对A549肺癌细胞的结合效应。A，PBS；B，HGFα-Fc(10ug/ml)；C，HGFα-Fc(100ug/ml)l。

图7.HGFα-Fc融合蛋白对A549肺癌细胞的体外抑制作用。

图8.HGFα-Fc融合蛋白的小鼠体内抗肿瘤作用。

具体实施方式

以下实例对本发明所涉及的抗肿瘤融合蛋白(简称融合蛋白，也用HGFα-Fc融合蛋白表示)的构建、试验和应用作了详细说明。但是本发明的内容和用途并不仅限于实例的范畴。

本发明设计并构建了一种优化了的包含截断型HGFα链片段即HGFα、连接肽和人免疫球蛋白Fc的融合蛋白，使得HGFα和Fc之间具有足够的柔韧性，保证其正确的空间构象；更重要的是，此融合蛋白具有抑制HGF/HGFR信号转导和发挥Fc免疫学效应的双重作用。因此，这种融合蛋白与单纯的截断型HGF片段相比，具有更强的生物活性和血浆半衰期，从而能够更有效地抑制并杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤的发展。

研究表明，天然成熟的HGF是由α链和β链组成的异二聚体，其中α链含有的4个环饼结构对于HGF/HGFR的结合特别重要。HGF的β链含有Peptidase S1结构域，对于活化HGFR的细胞内信号具有重要作用。单独的β链由于缺乏环饼结构，失去了与HGFR的结合能力。单独的α链仍然可以与HGFR结合却不活化HGFR，而且与天然的HGF存在竞争结合HGFR的效应，因此HGF的α链是阻断HGF/HGFR信号通路的优选分子。然而，单独的HGFα链结构不稳定，抗肿瘤的生物学效应也有待进一步提升。免疫球蛋白Fc段不但可以延长融合蛋白的半衰期，而且还具有Fc免疫学效应，其作为融合分子来提高融合蛋白的稳定性和生物活性已经被证实。HGF的α链和免疫球蛋白Fc段是两个独立的具有不同功能的区域，均必须形成各自稳定有活性的三维空间结构，特别是在两个Fc段二聚化后，两个HGFα链必须保持其结构稳定性和生物活性，从而保证其对HGFR的亲和力。本发明提供了一段柔性结构的连接肽，用以连接HGFα链和免疫球蛋白Fc段，使得HGFα和Fc都有足够的空间来形成各自稳定的结构，避免了HGFα可能与Fc之间可能形成的空间位阻，不仅保证了此优化的HGFα-Fc融合蛋白对HGFR的亲和力，还能够使Fc发挥免疫学效应，从而大大提高了融合蛋白的生物活性。

由于天然HGF前体可以被蛋白酶在第494位氨基酸R(即HGFα碳末端最后一位氨基酸)切割，而且天然HGF前体的第487位氨基酸C可与HGFβ链形成二硫键，此类情况均有可能影响本发明融合蛋白的结构和生物学功能，因此，本发明使用了天然HGF的32-477位氨基酸，从而避免了上述情况的发生，保持了HGFα-Fc融合蛋白的完整性，提高了其结构的稳定性。

此融合蛋白的优化设计也可以用于其它具有生物活性的片段与HGFα融合，以提高融合蛋白的稳定性和生物活性。所形成的融合蛋白一方面可以发挥HGFα对天然HGF的竞争抑制效应和对肿瘤细胞的靶向作用，一方面可以发挥另一融合片段的生物活性，比如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素2(IL-2)和CD3抗体等，以发挥融合蛋白对目标细胞的杀伤作用。

本发明描述的HGFα链和Fc的优化融合蛋白是通过常规的基因重组技术所构建，具体实验步骤如《分子克隆》第三版(Joseph Sambrook，科学出版社)及类似的实验手册所记载。下述实施例中所使用的HGFα链、Fc和连接肽分别是：

1.肝细胞生长因子HGF的α链，表示为HGFα，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所述。

2.人免疫球蛋白Fc段来自于IgG1，表示为Fc，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所述。

3.HGFα和Fc之间的所用的连接肽，表示为(G4S)3，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.6所述。

上述的融合蛋白及其编码的DNA可以通过常规的基因重组技术获得。所需编码HGFα和Fc的DNA序列由NCBI(National Center for Biotechnology Information)的GenBank中获得(GenBank编号：NM_000601)，将编码上述融合蛋白的DNA序列用PCR或直接合成获得后分别克隆到载体中，所用载体可以是分子生物学常用的质粒、病毒或其他载体。构建载体时可以在编码上述融合蛋白的DNA序列前端加上蛋白分泌信号肽序列，以保证重组蛋白从细胞中分泌出来。载体序列中包括用于基因表达的启动子、蛋白质翻译起始和终止信号、以及多聚腺苷酸(PolyA)序列。载体中还可含有抗生素抗性基因，以利于载体在宿主细胞如细菌和真核细胞中的复制或表达。另外，载体中还可包括真核细胞选择性基因，用于稳定转染宿主细胞株的选择。

本发明优化融合蛋白中的HGFα发挥作用的区段为PAN结构域和四个连续的环饼结构域(Kringle domain)。因此在包含上述结构域的情况下，HGFα两端的氨基酸序列和长度可以有一定的变化而不减弱其生物活性，它们都属于本发明的范畴。

本发明融合蛋白中的Fc来自人免疫球蛋白IgG1，也可以是亚型IgG2、IgG3、IgG4、或者人免疫球蛋白IgE、IgM和IgA，该免疫球蛋白Fc片段可以为Fc全长或部分Fc序列，如选自CH2片段、CH3片段或铰链区，它们都属于本发明的范畴。

本发明融合蛋白连接肽的目的在于提供更好的柔韧性，以避免HGFα和Fc形成结构上的空间位阻，因此连接肽氨基酸序列和长度均可以有一定的变化，它们都属于本发明的范畴。

在完成含编码上述融合蛋白的DNA序列的质粒构建以后，即可用该重组载体转染或转化宿主细胞，表达相应的融合蛋白质。能够用于表达这些融合蛋白的表达系统有多种，可以是真核细胞，也可以是原核细胞，它们包括(但不限于)哺乳动物细胞、细菌、酵母、昆虫细胞等。由于本发明优化融合蛋白的氨基酸序列中包含可糖基化的氨基酸，因此哺乳动物细胞是表达该蛋白的优选系统。可用于大规模表达蛋白质的哺乳动物细胞有多种，例如CHO细胞、293细胞、NSO细胞、COS细胞、BHK细胞等，其它许多细胞也可以用于蛋白的表达，因此都包括在本发明所能使用的细胞之列。含有编码上述优化融合蛋白基因的重组质粒可经转染进入宿主细胞，转染细胞的方法有多种，其中包括(但不限于)电穿孔法、脂质体转染法和磷酸钙转染法等。

一种较佳的蛋白表达方法是在已经稳定转染的宿主细胞中对重组载体进行基因扩增，以提高相应重组融合蛋白的表达量。例如，用含有新霉素(Neomycin)抗性基因的重组载体稳定转染无新霉素抗性的宿主细胞后，可在细胞培养液中增加新霉素的浓度以扩增重组载体在宿主细胞中的拷贝数量；又例如用含有二氢叶酸还原酶(DHFR)基因的重组载体稳定转染缺乏DHFR的宿主细胞后，可在细胞培养液中增加氨甲喋呤(MTX)的浓度以扩增重组载体在宿主细胞中的拷贝数量。

哺乳动物细胞以外的其他表达系统，例如细菌、酵母、昆虫细胞等也可以用于表达本发明的优化融合蛋白，它们也被包含本发明所能使用的宿主细胞之列。这些表达系统的蛋白质产量比哺乳动物细胞的较高，但是所表达的蛋白质缺乏糖基化或形成的糖链结构与哺乳动物细胞有所不同。

本发明融合蛋白表达后，可用酶联免疫吸附试验(ELISA)或其他方法测定细胞培养液中的融合蛋白浓度。由于这些融合蛋白含有免疫球蛋白Fc，因此可以用蛋白A亲和层析法来纯化所表达的融合蛋白。此外，与其它蛋白纯化方法如离子交换层析等联合使用，可进一步纯化本发明的融合蛋白。

从重组体培养液中获得相应的融合蛋白后，可以用细胞ELISA和流式细胞术来检测其对HGFR的结合活性，实验结果表明，本发明的融合蛋白能够结合HGFR阳性的细胞如A549肺癌细胞，因此本发明所构建的优化融合蛋白可以阻断HGF/HGFR的结合，是一种针对HGF/HGFR良好的蛋白抑制剂。

应用纯化方法获得高纯度的融合蛋白后，可利用体外细胞模型和体内动物模型来检测其对肿瘤细胞的抑制效应。在体外实验中，HGFR表达阳性的肿瘤细胞如A549肺癌细胞、MDA-MB-435乳腺癌、Raji淋巴瘤细胞等都可以用MTT等方法来检测优化融合蛋白对这些细胞的生长抑制作用。在体内实验中，上述HGFR阳性的肿瘤细胞可以用来构建小鼠肿瘤模型，肿瘤模型可通过腹背侧皮下、腹腔、尾静脉等方法构建，以用于观察融合蛋白的抗肿瘤或抗转移实验。

实施例一：克隆编码HGFα-Fc融合蛋白的DNA序列及构建重组载体

本发明中编码HGFα-Fc融合蛋白的基因片段可以通过经典的分子生物技术获得，并且该基因序列可针对哺乳表达系统优化，以便得到更佳的表达量。HGFα-Fc基因片段与相应的表达载体重新连接可获得重组载体，以适应哺乳细胞的表达和筛选。

1、获得编码HGFα-Fc融合蛋白的基因片段

本优选实施例所构建的优化融合蛋白的结构见附图1。本发明的HGFα-Fc融合蛋白由HGFα和人免疫球蛋白IgG1Fc融合而成，在HGFα与IgG1Fc之间有一包含连续3个(GGGGS)重复序列的连接肽，融合蛋白N端加上了白介素2(IL-2)的信号肽以保证其分泌到哺乳细胞外。

其中的HGFα片段是在其天然的cDNA序列基础上，针对哺乳表达系统优化过的序列直接合成而得(SEQ ID NO.1)：

其中的IgG1Fc片段是其天然的cDNA序列基础上，针对哺乳表达系统优化过的序列直接合成而得(SEQ ID NO.3)：

其中连接肽的序列是通过基因合成而得(SEQ ID NO.5)：

信号肽的的序列是基于IL-2的分泌肽序列通过基因合成而得(SEQ ID NO.9)，在构建载体时置于HGFα-Fc融合蛋白基因之前：

HGFα-Fc融合蛋白基因是以上述的HGFα、连接肽和IgG1Fc的基因片段通过拼接PCR扩增所得。最后包括信号肽的融合片段则是以上述IL-2的信号肽基因片段和HGFα-Fc基因片段通过拼接PCR扩增所得。

2、表达HGF α-Fc融合蛋白重组载体的构建

编码本发明优化融合蛋白的基因克隆是由上述包括信号肽的HGFα-Fc融合片段通过HindIII和XhoI酶切位点插入到质粒载体pcDNA3.1(+)(Invitrogen公司)的HindIII和XhoI酶切位点所得(见图2)。该重组质粒利用CMV启动子来表达融合蛋白，并包含SV40的多聚腺苷酸(PolyA)序列以保证其表达最佳的表达量。该重组质粒还包括氨苄青霉素(Ampicillin)抗性基因以利于在细菌中的复制，和新霉素(Neomycin)抗性基因以用于稳定转染细胞的筛选。将编码HGFα-Fc融合蛋白的重组质粒转化E.coli(DH5α)后加入LB培养基培养过夜，以获取大量重组质粒的拷贝，用质粒提取试剂盒(Qiiagen公司)提取质粒后进行酶切和测序鉴定(见图3)，所获得的编码HGFα-Fc融合蛋白的DNA序列如SEQ ID NO.7所示。

实施例二：HGFα-Fc融合蛋白在细胞中的表达和纯化

本发明中HGFα-Fc融合蛋白是在CHO细胞中表达并分泌到培养液中的，并利用葡萄球菌蛋白A亲和层析的方法纯化所得，具体见下。

1、HGFα-Fc融合蛋白在CHO细胞中的瞬时表达

获得高纯度编码HGFα-Fc的重组质粒后，利用Lipofectamine 2000质粒转染试剂盒(Invitrogen公司)将重组质粒转染CHO细胞(ATCC)，在无血清培养基中培养三天后收集CHO细胞上清液，可以用免疫印迹检测HGFα-Fc融合蛋白的表达(见图4)。此方法可用于快速地获取少量的HGFα-Fc融合蛋白，其浓度可以用ELISA法定量检测，所用一抗可以为抗人IgG1Fc或HGFα抗体。

2、HGFα-Fc融合蛋白在CHO细胞中的稳定表达

将编码HGFα-Fc的重组质粒用Lipofectamine 2000质粒转染试剂盒(Invitrogen公司)转染CHO细胞，在无血清培养基中培养两天后加入新霉素，采用有限稀释法进行细胞克隆培养，大约14天后挑取新霉素抗性的细胞克隆进行细胞的扩大培养，并选取状态良好的细胞在液氮中冷冻保存。稳定转染后的CHO细胞可以在滚动细胞培养瓶中进一步扩大培养以生产大量的HGFα-Fc融合蛋白，此方法可用于获取大量的HGFα-Fc融合蛋白，其浓度可以用ELISA法定量检测，所用一抗可以为抗人IgG1Fc或HGFα抗体。。

3、HGFα-Fc融合蛋白的纯化

包含HGFα-Fc融合蛋白的细胞培养液可采用葡萄球菌蛋白A亲和层析的方法进行纯化(见图5)。将蛋白A-Sepharose层析柱以PBS缓冲液平衡后，将超滤器浓缩过的CHO细胞培养液上清液进样，以A280进行监测，用PBS缓冲液冲洗至未结合的蛋白全部被洗脱，然后用100mM的柠檬酸洗脱结合蛋白，立刻以1M的Tris-HCl进行中和。纯化后的融合蛋白可以用ELISA法检测浓度。包含融合蛋白的洗脱液经脱盐纯化后可以冻干，冻干后可置于-20℃长期保存。

实施例三：HGFα-Fc融合蛋白与HGFR阳性肿瘤细胞的体外结合实验

本发明的优化融合蛋白在体外可以能够结合HGFR阳性的细胞。本发明以A549肺癌细胞作为HGFR阳性的细胞，并以本发明中的HGFα-Fc融合蛋白来检测其细胞结合活性。HGFα-Fc融合蛋白与A549肺癌细胞的结合活性用流式细胞术检测。

HGFα-Fc融合蛋白与A549肺癌细胞混合于1％的牛血清白蛋白(BSA)和0.02％叠氮钠的PBS(染色缓冲液)中，至冰上孵育1小时。用同种型免疫球蛋白IgG1作为阴性对照。细胞用PBS缓冲液洗涤2次，然后与异硫氰酸荧光素(FITC)标记的山羊抗人IgG抗体在染色缓冲液中冰上孵育30分钟。细胞用流动缓冲液洗涤2次，并用流式细胞仪(ESP Elite，Coulter)进行分析。根据前向和侧向光散射，从分析中剔除死细胞和碎片。以平均对数荧光乘以阳性群体的百分数计算平均荧光强度(见图6)。结果表明：浓度为10ug/ml和100ug/ml的HGFα-Fc都可以有效结合A549肺癌细胞，而且表现出浓度依赖效应。

实施例四：HGFα-Fc融合蛋白的体外细胞生长抑制活性检测

本发明利用HGFR阳性的A549肺癌细胞作为细胞模型来检测HGFα-Fc融合蛋白的细胞生长抑制活性。

在96孔细胞培养板内接种A549肺癌细胞(1×10⁴/孔，200ul)，待细胞贴壁后，将不同浓度的HGFα-Fc融合蛋白加入到细胞培养孔，每个浓度设立5个复孔。继续培养细胞72小时后，每孔加20ul浓度为5mg/ml的MTT噻唑蓝溶液。继续孵育4小时后，吸弃细胞培养孔内的上清液，每孔加150ul二甲基亚砜(DMSO)，振摇10分钟，使结晶物充分融解。用酶联免疫检测仪测定各孔490nm波长的吸收值，以时间为横坐标、吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线(见图7)。结果表明：浓度为5ug/ml和50ug/ml的HGFα-Fc都可以有效抑制A549肺癌细胞的生长，而且表现出浓度依赖效应。

实施例五：HGFα-Fc融合蛋白的体内抗肿瘤活性

本发明利用HGFR表达阳性的A549细胞在SCID小鼠体内建立肺癌肿瘤模型，来检测HGFα-Fc融合蛋白的体内抗肿瘤活性。

6-8周龄SCID小鼠分为3组(6只/组)，5×10⁶个A549细胞皮下腹背侧接种于SCID小鼠建立肿瘤模型。在接种第5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天进行尾静脉注射HGFα-Fc融合蛋白(2组分别给药10ug/day和30ug/day，10天共给药100ug和300ug)或PBS(对照组，给予等体积PBS)，观察肿瘤大小和生存。肿瘤体积按照如下公式计算：肿瘤体积＝0.5×长径×宽径×宽径。结果表明：HGFα-Fc融合蛋白可以有效抑制体内A549肺癌肿瘤的生长，而且300ug给药组的抗肿瘤效果优于100ug给药组(见图8)。实验期间，各组小鼠生命体征基本正常，小鼠本身体重并无明显减轻，主要器官组织形态良好。

Claims (14)

1.融合蛋白，其特征在于：由来自人肝细胞生长因子HGF的α链与人免疫球蛋白Fc段构成，人肝细胞生长因子HGF的α链在氮端，人免疫球蛋白Fc段在碳端，HGF的α链和Fc之间由一条连接肽相连。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：所述人肝细胞生长因子HGF的α链包括PAN结构域和四个连续的环饼结构域，PAN结构域在氮端。

3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于：所述人肝细胞生长因子HGF的α链氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：所述人免疫球蛋白为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgM或IgA。

5.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：所述人免疫球蛋白为IgG1，其Fc段的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所述。

6.根据权利要求1～5任一项所述的融合蛋白，其特征在于：所述连接肽的氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGS。

7.根据权利要求1～6任一项所述的融合蛋白，其特征在于：

其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.8所示；

或者：

其氨基酸序列为在SEQ ID NO.8的基础上缺失、替换或增加一个或几个氨基酸后所得的具有相同功能的融合蛋白质。

8.编码权利要求1～7任一项所述的抗肿瘤的核苷酸序列。

9.根据权利要求8所述的核苷酸序列，其特征在于：其序列为SEQ ID NO.7所示。

10.含有权利要求8或9所述核苷酸序列的重组载体。

11.含有权利要求10所述重组载体的宿主细胞。

12.权利要求1～7任一项所述的融合蛋白、权利要求8或9所述核苷酸序列、权利要求10所述重组载体或者权利要求11所述宿主细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。

13.一种药物组合物，由权利要求1～7任一项所述的抗肿瘤的融合蛋白、权利要求8或9所述核苷酸序列、权利要求10所述重组载体或者权利要求11所述宿主细胞作为主要活性成分添加药学上可接受的辅助性成分制备而成的。

14.如权利要求13所述的药物组合物，其特征在于，还包括一种或几种其他的抗肿瘤药物。

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