CN110003341A - 一种融合蛋白 - Google Patents

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党二乐
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Abstract

本发明公开了一种融合蛋白，属于生物制药技术领域，所述融合蛋白是由调节蛋白CD46和调节蛋白CD55融合得到的融合蛋白。

Description

一种融合蛋白
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种融合蛋白。
背景技术
补体系统是体内重要的免疫效应放大系统和免疫调节系统，广泛参与固有免疫和适应性免疫，补体活化后的产物具有溶解细胞、介导炎症、调节免疫应答和清除免疫复合物等众多生物功能，但补体缺陷、功能障碍或过度活化会导致多种疾病的发生。在正常生理状态下，机体对补体系统活化存在着精细的调控机制，使补体系统处于抑制且无生物学功能状态，以维持内环境的稳定。在抗原抗体复合物、微生物成分以及其他外源性和内源性物质刺激下可被激活，而如此强大有效的系统需要区别自身和非自身成分，以避免不必要的急慢性活化而造成自身组织损伤。体内存在着一类参与调节补体活化和细胞杀伤效应的蛋白统称为补体调节蛋白，以可溶性或膜结合形式广泛分布于血浆和细胞膜表面，能通过控制级联酶促反应过程中酶活性和MAC组装等关键步骤抑制补体过度激活，减轻机体免疫损伤。膜辅蛋白CD46（Membrane Cofactor Protein, MCP）、衰变加速因子CD55（DecayAccerlerating Factor, DAF）、膜反应性溶解抑制物是具有明显的同种限制作用的膜结合型调节蛋白，能够与I 因子共同作用通过对C3b和C4b的裂解、抑制C3转化酶等多种方式在三条补体激活途径中发挥调节作用。总之，维持补体系统的功能平衡离不开补体调节蛋白的参与。
CD46和CD55是典型的补体调节蛋白，以膜结合型和可溶型两种形式共同发挥作用，是补体系统中具有明显的同种限制作用的补体下调因子。CD46有“multitasker”之称，在机体内主要以膜结合形式分布在除红细胞之外的几乎所有组织细胞，故又称膜辅助蛋白，其主要功能是作为一种辅助因子，促进I因子介导的C3b、C4b的降解，从而抑制补体C3激活的级联反应，被认为是抑制补体旁路激活的最有效的因子。CD55又称衰变加速因子,分布在所有外周血细胞、上皮细胞及内皮细胞等与血液紧密接触的各型细胞膜上，可抑制补体活化过程中C4b2a的形成，分解已在细胞膜表面形成的C4b2a，还可以促进Bb和C3b的解离，加速C3转化酶的衰变，在补体活化过程中发挥重要的负调控作用，与CD46一起被认为是重要的补体下调因子。
发明内容
本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种新的融合蛋白。
为达到上述目的，本发明的技术方案如下：
一种融合蛋白，所述融合蛋白是由调节蛋白CD46和调节蛋白CD55融合得到的融合蛋白。
进一步地，所述融合蛋白包括调节蛋白CD46中的胞外1-4个结构域中的至少一个结构域和调节蛋白CD55中的胞外第2-4个结构域中的至少一个结构域。
进一步地，所述调节蛋白CD46和调节蛋白CD55通过氨基酸进行连接。
通过上述技术方案，本发明的有益效果是：
本发明通过研究分析，找出CD55和CD46中的有效成分，并将其融合形成新的融合蛋白，其结构简单，合成方法容易操作，便于实现和制备。
本发明提供的融合蛋白，结构简单，制备容易，便于使用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1-A为本发明提供的CD55的疏水性预测图；
图1-B为本发明提供的CD55的跨膜区预测图；
图1-C为本发明提供的CD55的信号肽预测图；
图1-D为本发明提供的CD55的结构域结构图；
图1-E为本发明提供的CD55的结构域序列表；
图2-A为本发明提供的CD55的疏水性预测图；
图2-B为本发明提供的CD46的跨膜区预测图；
图2-C为本发明提供的CD46的信号肽预测图；
图2-D为本发明提供的CD46的结构域结构图；
图2-E为本发明提供的CD46的结构域序列表。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
参照附图1-2所示，本发明提供的本发明提供的一种融合蛋白，所述融合蛋白是由调节蛋白CD46和调节蛋白CD55融合得到的融合蛋白。
进一步地，所述融合蛋白由质量份数为1-2:1-3的调节蛋白CD46和调节蛋白CD55融合而成。
进一步地，所述融合蛋白包括调节蛋白CD46中的胞外1-4个结构域中的至少一个结构域和调节蛋白CD55中的胞外第2-4个结构域中的至少一个结构域。
进一步地，所述融合蛋白中，所述调节蛋白CD46和调节蛋白CD55通过氨基酸进行连接。
具体地，氨基酸的序列为GGGSGGGSGGGS。
参照附图1所示，其为调节蛋白CD55蛋白信息及结构分析。
参照附图1-A 为CD55的疏水性预测图，该分子的疏水性是通过网站在线预测得到的。参照附图1-A为CD55的疏水性分析图，采用K-D法，通过附图可知，CD55较高正值的氨基酸具有较强的疏水性，而较低负值的氨基酸则具有较强的亲水性。根据Protscale在线分析发现CD55蛋白在N-端10-40个aa处有一个典型的疏水区。
参照附图1-B ，其为CD55的跨膜区预测图，该跨膜区是通过软件在线预测得到，其中TMHMM是一个基于隐马尔可夫模型（HMM）预测跨膜螺旋的程序，它综合了跨膜区疏水性、电荷偏倚、螺旋长度和膜蛋白拓扑学限制等分析，可对跨膜区及膜内外区进行整体预测。该分析可为后续可溶性融合蛋白的设计提供参考。
参照附图1-B所示，为CD55的跨膜区预测，CD55蛋白 1-381位氨基酸位于细胞膜表面，为可见的明显的跨膜区。
参照附图1-C，其为CD55分子的信号肽预测图，其是通过网站在线预测的，SignalP4.1 Server为目前比较公认的信号肽在线预测网站。该分析也是为后续融合蛋白的设计做铺垫。观察图可知，
Measure Position Value Cutoff signal peptide
Max.C 35 0.744------剪切位点分值
Max.Y 35 0.829------信号肽分值
Max.S 23 0.972------综合剪切位点分值
Mean S 1-34 0.869
D 1-34 0.851 0.450 YES------有信号肽
Name=Sequence SP=‘YES’ Cleavage site between pos.34 and 35:VWG-DC
D=0.851 D-cutoff=0,450 Networks=signal-noTM。
参照附图1-C所示，为CD55的信号肽预测图，信号肽剪切位点预测通过Y最大值来判断，是否为分泌蛋白是通过S平均值（mean S-scre）来判断，即若S平均值>0.5,则预测为分泌蛋白，存在信号肽。以上分析结果表明 mean S score为0.869>0.5，存在信号肽，最可能的酶切位点位于第34和35位氨基酸之间。
综上分析，CD55的理化性质总结如下：氨基酸个数为381个，蛋白质分子量为41400.14 等电点PI为7.79 蛋白稳定系数为48.59 脂肪指数为71.84 亲水性平均系数GRAVY为-0.306（其中，负值则代表是亲水性蛋白，反之则为疏水性蛋白）；综上所述可知，CD55的表面蛋白并不是很稳定。
综上分析可知，对于CD55：
信号肽：1-34aa
重复序列（结构域）：35-96aa
CCP2: 96-160aa
CCP3：161-222aa
CCP4：223-285aa
ST : 287-356aa
通过以上分析得出，CD55分子基因编码381 个氨基酸，1 次跨膜，21-38 可能为跨膜区（来源于http://www.cbs.dtu.dk/cgi-bin/webface2.fcgijobid=58DDBF4400000C89EA3B0364&wait=20），1-34aa 为信号肽序列（来源于Uniprot），局部亲水性好。
同时参照附图1-D，该图是结合Uniprot 、Pfam以及结构域在线预测网站smart.embl-heidelberg.de预测结果综合得到，融合蛋白的设计也是基于对两种分子的结构域、疏水区、跨膜区、信号肽进行分析后，参考文献，综合设计。其中SP为信号肽，CCP1、2、3、4为CD55的四个重复序列组成的四个结构域，又名Sushi/SCR domain，参与多种生命过程的识别反应，可识别并结合多种补体分子的C3b和C4b片段。ST-为位于C-端的一个丝氨酸/苏氨酸富集区。
参照附图1-E,其表为CD55分子个结构域的氨基酸序列位置，融合的蛋白的设计是严格按照该表中的序列设计的。
参照附图2所示，其为调节蛋白CD46蛋白信息及结构分析
通过检测可知，CD46的理化性质总结如下：氨基酸个数为392个，蛋白质分子量为43747.31；等电点PI为6.34 ；蛋白稳定系数为44.86；脂肪指数为73.80 ；疏水性平均系数为-0.232；综上所述可知，CD46的表面蛋白并不是很稳定。
参照附图2-A为CD 46的疏水性分析图，分子的疏水性是通过http://web.expasy.org/protscale/在线预测得到的，其图表为在线预测自动输出图表。采用K-D法，通过附图可知，CD46较高正值的氨基酸具有较强的疏水性，而较低负值的氨基酸则具有较强的亲水性。根据Protscale在线分析发现CD46蛋白在N-端0-40个aa处和C-端330-370处为典型的疏水区。
参照附图2-B所示，为CD46的跨膜区检测，该跨膜区是通过http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/网站在线预测得到，其中TMHMM是一个基于隐马尔可夫模型（HMM）预测跨膜螺旋的程序，它综合了跨膜区疏水性、电荷偏倚、螺旋长度和膜蛋白拓扑学限制等分析，可对跨膜区及膜内外区进行整体预测。该分析可为后续可溶性融合蛋白的设计提供参考。
观察可知，CD46蛋白1-343位氨基酸位于细胞膜表面，344-366位氨基酸之间形成一个典型的跨膜螺旋区，367-392位氨基酸位于细胞内，即胞内段。与该蛋白的疏水性区域分析结果基本一致，表面CD46蛋白可能作为膜受体起作用，也可能是定位在膜上的锚定蛋白和离子通道蛋白。
参照附图2-C所示，为CD 46的肽信号检测图，CD55分子的信号肽是通过http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/网站在线预测的，SignalP 4.1 Server为目前比较公认的信号肽在线预测网站。该分析也是为后续融合蛋白的设计做铺垫。 经过分析可知，信号肽剪切位点预测通过Y最大值来判断，是否为分泌蛋白是通过S平均值（mean S-scre）来判断，即若S平均值>0.5,则预测为分泌蛋白，存在信号肽。以上分析结果表明 mean Sscore为0.869>0.5，存在信号肽，最可能的酶切位点位于第34和35位氨基酸之间。
参照附图2-D，其为CD46的结构域，该图是结合Uniprot 、Pfam以及结构域在线预测网站smart.embl-heidelberg.de预测结果综合得到，融合蛋白的设计也是基于对两种分子的结构域、疏水区、跨膜区、信号肽进行分析后，参考文献，综合设计。其中SP为信号肽，CCP1、2、3、4为CD46的四个重复序列组成的四个结构域，又名Sushi/SCR domain，参与多种生命过程的识别反应，可识别并结合多种补体分子的C3b和C4b片段。ST-为位于C-端的一个丝氨酸/苏氨酸富集区。
参照附图1-E，其为CD46结构域序列，该表为CD46分子个结构域的氨基酸序列位置，融合的蛋白的设计是严格按照该表中的序列设计的。
综上分析可知，对于CD46结果分析：
该基因编码392个氨基酸，1次跨膜，344-366 为跨膜区（来源于Uniprot），1-34aa 为信号肽序列（来源于Uniprot），局部亲水性好，建议表达胞外段35-343aa。
综上分析可知，调节蛋白CD46胞外1-4个结构域和调节蛋白CD55总的胞外2-4个结构域有一定活性，可以抑制补体系统激活。
其中，结构域是生物大分子中具有特异结构和独立功能的区域，特别指蛋白质中这样的区域。在球形蛋白中，结构域具有自己特定的四级结构,其功能部依赖于蛋白质分子中的其余部分，但是同一种蛋白质中不同结构域间常可通过不具二级结构的短序列连接起来。蛋白质分子中不同的结构域常由基因的不同外显子所编码。
进一步地，所述融合蛋白包括质量份数为1:1的调节蛋白CD46和调节蛋白CD55。
进一步地，所述融合蛋白包括调节蛋白CD46中的胞外1-4个结构域和调节蛋白CD55中的胞外第2-4个结构域。
一种融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：
（1）重组质粒的构建及小量表达：
设计引物，构建原核表达载体PET-28a（标签大小约4kD）和pCOLD-sumo（标签大小约16kD）的表达载体，构建完成后，测序结果100%正确无突变，进入小试验证，通过助溶标签和温度诱导的方案实现分泌表达。若通过多种优化，依然表达为包涵体，会对其进行复性，保证最终制备的蛋白尽可能实现构象正确！
基本路线：引物设计——载体构建——测序验证——转化表达菌株（DE3 和Rosseta）——小量表达验证——破菌分离上清沉淀检测
（2）大量表达及蛋白纯化选择最佳的载体进行扩大，首先采用金属螯合镍柱进行亲和层析，利用高亲和Ni-NTA 纯化介质把螯合剂（氮川三乙酸或NTA）共价偶联到琼脂糖介质（4%交联）上，然后再螯合Ni2+制备而成。NTA 能够通过四个位点牢固的螯合Ni2+从而减少纯化过程中Ni2+泄露到蛋白样品中。
（3）验收标准
保证浓度在1mg/ml 的情况下，SDS 验证纯度在85%以上，若低于85%，继续采用分子筛及离子交换精细纯化。
一种融合蛋白的应用，融合蛋白作为制备治疗BP药物中的应用。
上述应用中，当治疗BP疾病时，所述融合蛋白的用量为A-B。
上述应用中，所述融合蛋白的剂型为按照药学常规方法制成的剂型。
另外，提供一种用于治疗BP的药物组合物，以调节蛋白CD46和调节蛋白CD55为活性成分，辅以药学上可接收的基质形成。
进一步地，该药物组合物为按照药学常规方法制成的剂型。
同时，通过分析可知，融合蛋白中有如下特点：
连接linker：基因序列:GGCGGAGGAAGTGGGGGAGGATCTGGCGGAGGATCT
氨基酸序列： GGGSGGGSGGGS。
实施例1
本实施例中，新的融合蛋白为CD55（1-356）+CD46（35-326）；即 CD55（SP+Domian1-4+ST）+CD46（Domian1-4+ST）
基因序列：1068bp+876bp=1944bp
氨基酸序列： 356aa+292aa=648aa ，MW=71.175KD ，pI=6.36
首先，分析说明这个蛋白融合，然后说其成分，再说融合步骤，最后说治疗BP的实施例。
实施例2
本实施例中，新的融合蛋白为CD46（35-285）+CD55（96-285）+CD46（35-285）；即 CD46（Domian1-4）+CD55（Domian2-4）+ CD46（Domian1-4）
基因序列：753bp+570bp+753bp=2076aa
氨基酸序列： 251aa+190aa+251aa=692aa，MW=77.703KD ，pI=5.33
首先，分析说明这个蛋白融合，然后说其成分，再说融合步骤，最后说治疗BP的实施例。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
序列表
<110> 中国人民解放军第四军医大学
<120> 一种融合蛋白
<130> 2017
<141> 2018-01-05
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 12
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 1
gggsgggsgg gs 12
<210> 2
<211> 1146
<212> DNA
<213> CD55
<400> 2
atgaccgtcg cgcggccgag cgtgcccgcg gcgctgcccc tcctcgggga gctgccccgg 60
ctgctgctgc tggtgctgtt gtgcctgccg gccgtgtggg gtgactgtgg ccttccccca 120
gatgtaccta atgcccagcc agctttggaa ggccgtacaa gttttcccga ggatactgta 180
ataacgtaca aatgtgaaga aagctttgtg aaaattcctg gcgagaagga ctcagtgatc 240
tgccttaagg gcagtcaatg gtcagatatt gaagagttct gcaatcgtag ctgcgaggtg 300
ccaacaaggc taaattctgc atccctcaaa cagccttata tcactcagaa ttattttcca 360
gtcggtactg ttgtggaata tgagtgccgt ccaggttaca gaagagaacc ttctctatca 420
ccaaaactaa cttgccttca gaatttaaaa tggtccacag cagtcgaatt ttgtaaaaag 480
aaatcatgcc ctaatccggg agaaatacga aatggtcaga ttgatgtacc aggtggcata 540
ttatttggtg caaccatctc cttctcatgt aacacagggt acaaattatt tggctcgact 600
tctagttttt gtcttatttc aggcagctct gtccagtgga gtgacccgtt gccagagtgc 660
agagaaattt attgtccagc accaccacaa attgacaatg gaataattca aggggaacgt 720
gaccattatg gatatagaca gtctgtaacg tatgcatgta ataaaggatt caccatgatt 780
ggagagcact ctatttattg tactgtgaat aatgatgaag gagagtggag tggcccacca 840
cctgaatgca gaggaaaatc tctaacttcc aaggtcccac caacagttca gaaacctacc 900
acagtaaatg ttccaactac agaagtctca ccaacttctc agaaaaccac cacaaaaacc 960
accacaccaa atgctcaagc aacacggagt acacctgttt ccaggacaac caagcatttt 1020
catgaaacaa ccccaaataa aggaagtgga accacttcag gtactacccg tcttctatct 1080
gggcacacgt gtttcacgtt gacaggtttg cttgggacgc tagtaaccat gggcttgctg 1140
acttag 1146

Claims (3)

1.一种融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白是由调节蛋白CD46和调节蛋白CD55融合得到的融合蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括调节蛋白CD46中的胞外1-4个结构域中的至少一个结构域和调节蛋白CD55中的胞外第2-4个结构域中的至少一个结构域。
3.根据权利要求1所述的一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白中，所述调节蛋白CD46和调节蛋白CD55通过氨基酸进行连接。
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