CN116042645A - 玉米ZmHPL1基因在改良作物持绿性和光合性能上的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域。具体地，涉及玉米ZmHPL1基因在改良作物持绿性和光合性能上的应用，本发明的基因来源于玉米自然变异突变体nec1（Necrotic leaf tips‑1），位于玉米第4染色体上，ZmHPL1为nec1的功能基因，通过在植物中超表达ZmHPL1基因提高植物光合性能、增强持绿性，进而提高玉米籽粒产量，为玉米改良提供了新基因。

Description

玉米ZmHPL1基因在改良作物持绿性和光合性能上的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域。具体地，涉及玉米ZmHPL1基因在改良作物持绿性和光合性能上的应用，本发明的基因来源于玉米自然变异突变体nec1(Necrotic leaftips-1)，位于玉米第4染色体上，ZmHPL1为nec1的功能基因，超表达该基因可显著提高玉米的持绿性和光合性能。

背景技术

玉米(Zea mays)隶属禾本科玉米属(Zea)，是全球三大粮食作物之一，也是重要的动物饲料、工业原料及能源作物，目前其产量已经超过小麦和水稻而位居第一。随着全球人口的增加、人民生活水平的提高及畜牧业的不断壮大，玉米的工业价值将被不断发现，据联合国粮食及农业组织估计，到2050年全球粮食产量需要在目前的基础上再增加70％才能满足人类的需求，其中约一半的增长需求将来自于玉米产量的提高。

持绿作为一个重要的表型性状，与玉米开花后的耐旱适应性和产量密切相关。在玉米遗传改良过程中，持绿一直被作为一个延长有效光合作用时间的重要性状被选育。研究表明，过去几十年中通过持绿选育玉米杂交种，使得其产量提高了60％。相比于应用的超前，玉米持绿分子基础的研究相对滞后，其分子调控机制仍然不清晰。

同时，持绿突变体还是研究植物衰老进程、叶绿素代谢、光合电子传递、植物应对激素响应、抗逆性(抗旱，盐胁迫，耐高温等)等生理代谢过程的理想材料。持绿突变体的研究，不仅可以获得一些抗衰、高产、抗性新材料，还可以丰富作物抗逆基因资源，对于作物品种改良有重要意义。

目前，已报道的HPL基因及其功能研究主要集中在水稻、拟南芥、大豆等作物中，而且大部分功能与抗病有关，HPL基因与持绿性及光合性能的相关性在植物中未见报道。在拟南芥中，AtHPL1基因可调节拟南芥中12-氧代植物2烯酸的积累。在水稻中过表达OsHPL2可增强其对白叶枯病的抗性，而OsHPL3突变后造成病变模拟突变体并也增强了对白叶枯病的抗性。大豆中GmHPL突变导致病变模拟突变体，突变体表现出对细菌性叶脓疱病抗性降低和切根虫的抗性增强。茶树中CsHPL突变会影响其酶活活性。

综上所述，植物中已发表的关于HPL基因的研究主要集中在抗病虫功能及应用上，与持绿性和光合作用相关的功能及其应用还未被报道。

鉴于此，本申请利用田间自然变异的玉米叶片坏死突变体nec1，采用图位克隆技术，定位到控制该性状的基因是位于玉米第4染色体上的ZmHPL1，编码脂氢过氧化物裂解酶。基于连锁分析、功能验证、相关分子生物学分析和生理学实验，证实了该基因的功能缺失会导致玉米苗期死亡，然而，该基因的超表达材料可增加植株持绿性，提高光合性能，同时，其授粉后期籽粒的鲜重和干重都有明显提高。说明该基因具有增产的潜力，也可为玉米育种提供基因资源和理论支撑。

发明内容

本发明的目的在于提供玉米基因ZmHPL1在提高玉米产量上的应用，所述的产量提高是通过提升持绿性和光合性能实现的，所述的玉米基因ZmHPL1编码的蛋白为SEQ IDNO.1所示。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

SEQ ID NO.1所示蛋白或编码SEQ ID NO.1所示蛋白的基因在提高玉米产量上的应用，所述的产量提高是通过提升持绿性和光合性能实现的；

以上所述的应用中，优选的，编码SEQ ID NO.1所示蛋白的基因为SEQ ID NO.2所示。

以上所述的应用，超表达时使用的植物表达载体为pZZ01523；

本发明的保护范围还包括：

超表达ZmHPL1获得持绿性提升和产量提高的转基因玉米。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)克隆并证实了一个控制玉米叶片坏死的基因ZmHPL1，提供了玉米ZmHPL1基因及其编码蛋白ZmHPL1；

(2)通过在玉米中超表达ZmHPL1基因提高玉米光合性能、增强持绿性，进而提高玉米籽粒产量，为玉米改良提供了新基因。

附图说明

图1为nec1与野生型表型对比图。

图2为野生型和突变体nec1的叶绿体超微结构的透射电镜图；

图A和图B为野生型材料未出现表型时的叶绿体结构，图C和图D为野生型材料已出现表型时的叶绿体结构。与此对应的，图E、图F及图G、图H分别为nec1未出现表型和已出现表型时的叶绿体结构。

图3为ZmHPL1基因的精细定位与功能验证；

其中图A为基因定位示意图，图B为功能互补试验野生型，nec1及基因敲除材料KO1及KO2图片。

图4为本发明玉米基因ZmHPL1编码的蛋白在玉米原生质体中的亚细胞定位；

从左到右图示依次为叶绿体marker基因ZmPCR3的定位；ZmHPL1-GFP在叶绿体中的定位；前两个图像的叠加图；明场。

图5显示玉米ZmHPL1基因转化玉米后的不同表型情况；

ZmHPL1基因转化玉米后导致玉米净光合速率(A)、气孔导度(B)、叶绿素含量(C)显著增加，NPQ(D)也较野生型更高；E：超表达ZmHPL1基因玉米与野生型的田间表现；F：超表达ZmHPL1基因玉米与野生型授粉后20天(DAP20)、30天(DAP30)、35天(DAP35)的叶片表型。

图6显示玉米ZmHPL1基因转化玉米后产量指标的变化；

ZmHPL1基因转化玉米后导致玉米籽粒在授粉后18天开始至36天籽粒鲜重增加(A)，授粉后30天和36天的籽粒干重增加(B)，C图为授粉后籽粒各时期照片。

图7为本发明中HPL1基因敲除CPB-ZmUbi-hspCas9载体示意图。

图8为本发明的植物表达载体pZZ-GFP的结构示意图。

具体实施方式

以下实施实例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1：

nec1突变体的分离和遗传分析

玉米叶片坏死突变体nec1是在选育玉米自交系的过程中，玉米材料发生自然变异获得。与野生型相比，nec1在第10天突变体开始出现表型，叶片出现水渍斑，颜色发白发褐。随后范围扩大，叶片坏死，之后整个植株枯萎死去，但是植株的根部不受影响(图1)。

由于纯和的突变体nec1苗期致死，因此利用存活单株自交获得种子，单穗收获分别播种观察表型分离情况。其中一个单穗播种发苗后，获得了119株存活苗和48株致死苗，符合3：1的分离比(χ²＝1.25<χ² _0.05＝3.84)，表明该突变性状是由隐性单基因控制。

实施例2：

突变体nec1叶绿体透射电镜的观察

通过对苗期野生型和突变体nec1的叶绿体超微结构进行透射电镜观察发现：在播种后8天未出现表型时，野生型(图2中A和图2中B)和突变体(图2中E和图2中F)的叶绿体结构无明显差异，类囊体结构堆叠整齐有序。而在播种后10天当nec1出现表型时，较野生型(图2中C和图2中D)而言，突变体(图2中G和图2中H)中叶绿体膜及细胞膜结构崩溃，内部结构变得松散。

实施例3：

玉米基因ZmHPL1基因的精细定位和互补验证

为了克隆控制nec1的基因，我们利用F₂群体进行BSR混池测序，将nec1初定位于第4染色体上的SSR68和Indel076之间。经过多年多点的精细定位，最终将区间定位于标记SR66-67和Indel67-69之间。该区间只包含一个基因ZmHPL1，编码脂氢过氧化物裂解酶(图3中A)。其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

ZmHPL1的互补验证是利用KN5585中ZmHPL1全长CDS序列(SEQ ID NO.2)作为应用基因，根据网站http://cbi.hzau.edu.cn/crispr/进行基因靶标设计，最终得到两个GuideRNA，用Hind3单酶切方法将Guide RNA连接到CPB-ZmUbi-hspCas9载体上(图7，引物序列见表1，引物ID为11)。然后再用CRISPR载体检测引物(引物序列见表1，引物ID为12)对得到的克隆进行测序，确定基因连接到载体上。将得到的正确克隆的质粒通过农杆菌介导的遗传转化到玉米自交系KN5585(遗传转化由未米生物科技(江苏)有限公司完成)。目前，获得了两个转化事件Crispr-KO(KO1，KO2)，这两个转化事件的表型与突变体一致(图3中B)，说明nec1的表型由ZmHPL1基因负责。

表1本发明所用的引物及其序列

实施例4：

玉米基因ZmHPL1在玉米中超表达的遗传转化

利用引物ID10从玉米KN5585叶片的cDNA中克隆并测序获得ZmHPL1基因，其序列如SEQ ID NO.2所示；其编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

PCR反应程序为：95℃5min预变性，95℃30s，58℃30s，72℃1.5min，34个循环，72℃5min延申。

玉米基因ZmHPL1在玉米中超表达的遗传转化是利用KN5585中ZmHPL1全长CDS序列(如SEQ ID NO.2所示)作为应用基因，在引物上添加Sma1的酶切接头(引物见序列表1，引物ID为13)，因此扩增得到的片段可以用限制性核酸内切酶Sma1进行酶切，连接在载体pZZ01523(源自文章An ethylene biosynthesis enzyme controls quantitativevariation in maize ear length and kernel yield)。然后再用(引物序列见表1，引物ID为10)所示的引物对得到的克隆进行测序，确定基因连接到载体上(图8)。将得到的正确克隆的质粒通过农杆菌介导的遗传转化到玉米自交系KN5585(遗传转化由未米生物科技(江苏)有限公司完成)。

由此获得了两个转化事件(OE4，OE6)，利用引物序列见表1中引物ID14对转化事件进行检测发现这两个事件的HPL1基因表达量显著提高。

实施例5：

玉米基因ZmHPL1编码蛋白在转基因玉米中的定位

用大提质粒试剂盒提取ZmHPL1-GFP的质粒用于玉米原生质体转化。

(1)玉米种植：取B73种子种植在营养土中，营养土提前加水拌匀，控制湿度，于生化培养箱28℃黑暗培养7-9天。

(2)配制酶解液：20mM MES(pH 5.7)+1.5％(wt/vol)CellμLase R10+0.4％(wt/vol)Macerozyme R10+0.4M Mannitol+20mM KCl，55℃水浴10min，以失活DNA酶和蛋白酶。室温冷却后，加入10mM CaCl₂和0.1％BSA，充分混匀后酶解液应该是淡褐色，澄清的液体。酶解液配好后用0.22μm孔径的滤膜过滤。(加入酶粉末之前应把MES溶液于70℃预热2-3min)。

(3)挑取健康、长势良好的叶片，一般取第二片叶中间靠上端位置，在0.4MMannitol的环境中切成0.5-1mm宽的细丝，切好的叶片立即放入酶解液中，使叶片完全浸没在酶解液里，切完之后于黑暗中抽真空30min。

(4)静置避光酶解3-4h后，再于40r/min摇床上避光酶解30min。

(5)加入等体积的W5溶液(2mM MES(pH 5.7)+154mM NaCl+125mM CaCl₂+5mM KCl加ddH₂O定容至20mL)终止酶解反应，吸起酶解产物，经200目筛网过滤到圆底的离心管中，操作要轻柔。加速减速设为2档，4℃，100g离心8min。

(6)小心吸出上清弃去，视原生质体数目用适量的预冷W5溶液重悬原生质体，冰上静置原生质体30min。经重力作用，原生质体应沉淀于底部。尽可能吸出上清弃去，用室温保存的MMG溶液(4mM MES(pH 5.7)+0.4M Mannitol+15mM MgCl₂)重悬原生质体。

(7)将质粒(5-10kb)按3ug/kb加到2ML离心管中，以水补齐至10uL。

(8)加100μL原生质体与质粒混匀，再加入110μL PEG/Ca²⁺(20-40％(wt/vol)+0.2MMannitol+0.1M CaCl₂)，立即轻柔颠倒混匀，室温放置15min。

(9)加入400-450μL W5溶液，轻柔颠倒混匀以终止反应。

(10)室温下100g离心2min，小心弃去上清，用1mL WI溶液(4mM MES(pH 5.7)+0.5MMannitol+20mM KCl)重悬原生质体，室温下暗处培养14-18h。

(11)100g离心2min收集原生质体，剩余100-200μL液体重悬制片，激光共聚焦显微镜ZeissLSM700观察。结果显示ZmHPL1定位于叶绿体，见图4。

实施例6：

玉米基因ZmHPL1可改良玉米持绿性和光合性能

ZmHPL1基因超表达材料(HPL1-OE)在田间表现的持绿性明显要高于野生型(图5中E),于是，，我们选取超表达与野生型玉米各6株，在授粉后20天、30天和35天的叶片，利用LI-6400光合作用测量系统进行光合速率和气孔导度的测定，结果显示超表达植株的光合速率和气孔导度在每个时期都显著高于野生型(见图5中A，图5中B)。利用手持式SPAD仪对叶片叶绿素含量进行测定，发现超表达材料要显著高于野生型(见图5中C)。利用叶绿素荧光检测系统测量NPQ值，发现超表达材料略高于野生型(图5中D)。

实施例7：

玉米基因HPL1可提高玉米鲜重和干重

在授粉后6天、12天、18天、24天、30天及36天，我们取超表达和野生型玉米果穗各6个，统计其50粒籽粒鲜重，之后烘干后用于统计其干重。结果显示，在授粉后18天开始，超表达籽粒的鲜重要显著高于野生型(见图6中A)。授粉后30天和36天的超表达籽粒的干重显著高于野生型(见图6中B)。

Claims (4)

1.超表达SEQ ID NO.1所示蛋白或编码SEQ ID NO.1所示蛋白的基因在提高玉米产量上的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，所述的编码SEQ ID NO.1所示蛋白的基因为SEQ IDNO.2所示。

3.根据权利要求1所述的应用，所述的超表达时使用的植物表达载体为pZZ01523。

4.利用权利要求1所述应用获得的玉米。

Images