CN118028516A - 一种龙眼红色果皮表型的筛选标记 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种龙眼红色果皮表型的筛选标记。本发明提供了一种DlMYBrp基因，能够积累花色苷，对RP龙眼和SX龙眼的cDNA序列进行分析发现，在R3保守结构域内存在3个碱基的错配，造成两个氨基酸的替换，这导致了RP龙眼和SX龙眼在积累花色苷的差异，实验表明RP龙眼和SX龙眼的DlMYBrp基因均能提高AtCHS等的表达量，能够显著地积累花色苷。本发明基于RP龙眼和SX龙眼的DlMYBrp基因在R3保守结构域内的碱基差异，得到了用于鉴定龙眼杂合群体的SNP位点，这为后续利用RP龙眼进行杂交育种鉴定阳性子代提供了功能标记。

Description

一种龙眼红色果皮表型的筛选标记
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种龙眼红色果皮表型的筛选标记。
背景技术
龙眼(Dimocarpus longan Lour.)是无患子科(Sapindaceae)龙眼属(DimocarpusLour)常绿果树，在热带亚热带很多地区均有栽培。因此，龙眼产业的持续高效发展对于促进热区经济发展和果农增产增收具有重要意义。在我国，龙眼栽培文化历史已逾2000年，拥有龙眼品种(系)超300个，其中培育了近40个栽培品种，形成了具有地方特色的不同的地域类型(韩冬梅等2015，郑少泉等2019)。虽然龙眼品种(系)众多，但目前在龙眼具有商品价值的品种中，果实果皮外观色泽以黄褐色或黄灰色为主调。相对单一的色泽，严重阻碍了龙眼栽培资源生物学特性的多样性发展以及多元化市场的竞争潜力，因此特色龙眼资源的挖掘以及优异性状的利用已成为龙眼育种工作的重中之重。
随着人们收入提高以及消费升级，消费者行为习惯从对价格敏感逐渐转向品质敏感。而果实色泽作为最直观的品质，即便是风味极佳的品种，也需要丰富的色泽来满足日益多元化的消费市场。课题组前期从国外引进红皮(RP)龙眼资源，打破了传统栽培种龙眼仅有不积累花色苷生态型的认识，更重要的是作为特异的宝贵亲本材料，为创制具有商品价值的龙眼优异品种提供了新的育种方案。利用多组学联合分析，已经明确了龙眼果实颜色主要来自于花色苷的积累。然而目前关于红皮龙眼花色苷积累调控机制的研究仍处于空白。鉴于花色苷对于龙眼外观品质改良的重要作用，其代谢调控的分子机制是龙眼品种改良及新品种创制工作的重点，因此研究龙眼花色苷代谢调控的分子机理，对提高龙眼果实外观品质和培育出具有商品价值的红皮龙眼品种具有重要的理论和实践意义。
本研究以课题组收集的特色龙眼资源RP龙眼及主栽品种‘石硖’(SX)龙眼为研究材料，解析RP龙眼花色苷的调控机制，旨在为提升龙眼果实品质提供分子理论基础，并以此理论依据开发出与红色性状相关的分子标记进行辅助育种。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种龙眼红色果皮表型的筛选标记。
本发明的第一个方面是提供一种DlMYBrp基因，其CDS序列如SEQ ID NO:1或者SEQID NO:2所示。
本发明的第二个方面是提供本发明第一个方面所述DlMYBrp基因编码的蛋白质。
本发明的第三个方面是提供含有本发明第一个方面所述DlMYBrp基因的CDS序列的重组载体或宿主菌或表达盒。
其中，所述重组载体原始载体可以采用基因重组领域中常用的载体，例如病毒、质粒等。本发明对此不进行限定。
本发明的第四个方面是提供如本发明第一个方面所述的DlMYBrp基因、或者如本发明第二个方面所述的蛋白质、或者如本发明第三个方面所述的重组载体或宿主菌或表达盒在提高AtCHS、和/或AtCHI、和/或AtF3H、和/或AtDFR、和/或AtANS、和/或AtUFGT的表达量中的应用。
本发明的第五个方面是提供如本发明第一个方面所述的DlMYBrp基因、或者如本发明第二个方面所述的蛋白质、或者如本发明第三个方面所述的重组载体或宿主菌或表达盒在调控植物积累花色苷中的应用，其中，所述DlMYBrp基因的CDS序列如。
DlMYBrp基因能够促进植物积累花色苷，尤其是SEQ ID NO:1所示的DlMYBrp基因促进植物积累花色苷效果显著。
本发明的第六个方面是提供一种SNP标记，所述SNP标记为SNP1、SNP2或SNP3；SNP1位于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的第197位，碱基为T或G；SNP2位于SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的第317位，碱基为G或A；SNP3位于SEQ ID NO:1或SEQID NO:2所示核苷酸序列的第318位，碱基为A或T。
本发明的第七个方面是提供一种SNP标记组合，所述SNP标记组合包括SNP2和SNP3；SNP2位于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的第317位，碱基为G或A；SNP3位于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的第318位，碱基为A或T。
本发明的第八个方面是提供用于扩增含有如本发明第八个方面所述的SNP标记组合的核苷酸序列的引物组，所述引物组包含：mybrparms-af：5`-GCTCATGCTTTGATGTCTGGTC-3`，和mybrparms-ar：5`-CTTTGCATTGTCTTCTTCTGTAC-3。
本发明的第九个方面是提供用于扩增如本发明第一个方面所述的DlMYBrp基因的引物组，所述引物组包含：Inf-DlMYBrp-F：cGGTACCCGGGGATCCATGGAGGGTCACGTAGGAGTT，和Inf-DlMYBrp-R：TGCTCACCATGTCGACCTTTGCATTGTCTTCTTCTGTACTTAGAAGATTCC。
本发明的第十个方面是提供一种鉴别龙眼的引物组，所述引物组包含：mybrparms-af：5`-GCTCATGCTTTGATGTCTGGTC-3`，mybrparms-ar：5`-CTTTGCATTGTCTTCTTCTGTAC-3`，ybrparms-bf：5`-TCAAGAACTATTGGAACACACAT-3`，和mybrparms-br：5`-GCAACAGCTTTTTTGCGTAATC-3`。
本发明的第十一个方面是提供如本发明第七个方面所述SNP标记、或者本发明第八个方面所述SNP标记组合、或者如本发明第九个方面所述的引物组、或者本发明第十个方面所述的引物组、或者本发明第十一个方面所述引物组在鉴别龙眼中的应用。
本发明的第十二个方面是提供一种龙眼的鉴别方法，检测待测龙眼品种如本发明第七个方面所述的SNP标记或本发明第八个方面所述的SNP标记组合，获得基因型。若SNP1位点的基因型为TT，则为纯合红皮龙眼，若为GG，则为纯合石硖龙眼，若为GT，则为杂合龙眼(本发明的杂合龙眼是指红皮龙眼和石硖龙眼的杂种后代)；若SNP2位点的基因型为GG，则为纯合红皮龙眼，若为AA，则为纯合石硖龙眼，若为GA，则为杂合龙眼；若SNP3位点的基因型为AA，则为纯合红皮龙眼，若为TT，则为纯合石硖龙眼，若为AT，则为杂合龙眼。
本发明的第十三个方面是提供另一种龙眼的鉴定方法，采用本发明第十一个方面所述的引物组对待测龙眼品种进行PCR扩增，扩增出716bp和253bp条带的为纯合红皮龙眼，扩增出716bp和506bp条带的纯合石硖龙眼，扩增出716bp、506bp和253bp三条条带的为杂合龙眼。
本发明提供了一种DlMYBrp基因，能够积累花色苷，对RP龙眼和SX龙眼的DlMYBrp基因的cDNA序列进行分析发现，在R3保守结构域内存在3个碱基的错配，造成两个氨基酸的替换，这导致了RP龙眼和SX龙眼在积累花色苷的差异，实验表明RP龙眼和SX龙眼的DlMYBrp基因均能提高AtCHS、AtCHI、AtF3H、AtDFR、AtANS、AtUFGT的表达量，尤其是SX龙眼的DlMYBrp基因对他们表达的促进效果显著，能够显著地积累花色苷。本发明基于RP龙眼和SX龙眼的DlMYBrp基因在R3保守结构域内的碱基差异，得到了用于鉴定龙眼杂合群体的SNP位点，这为后续利用RP龙眼进行杂交育种鉴定阳性子代提供了功能标记。
附图说明
图1为RP龙眼与SX龙眼果皮与叶片的表型差异。(A)SX龙眼成熟果实的形态特征。(B)RP龙眼成熟果实的形态特征。(C)SX龙眼成熟叶片的形态特征。(D)RP龙眼成熟叶片的形态特征。
图2为DlMYBrprp和DlMYBrpsx蛋白序列比对。R2、R3保守结构域用黑线表示，星号表示RP龙眼和SX龙眼在保守结构域内的差异。
图3为系统发育分析。
图4为DlMYBrprp和DlMYBrpsx亚细胞定位。
图5为红皮龙眼果实发育阶段花色苷含量及DlMYBrp时空表达谱。(A)RP龙眼果实发育阶段中花色苷(G1-G5分别代表15、35、55、75和95DAA)。(B)DlMYBrp在RP龙眼不同发育阶段的表达量。(C)DlMYBrp在RP龙眼不同组织中的表达量分析。
图6为龙眼愈伤遗传体系的建立。
图7为烟草叶片中瞬时表达DlMYBrp。(A)DlMYBrp在烟草叶片中瞬时转化的表型特征，以pCAMBIA2300-35S为阴性对照。(B)瞬时表达烟草叶片总花色苷含量。
图8为DlMYBrp在拟南芥中稳定表达的表型及相关基因表达量。(A)拟南芥表型。a、b和c分别表示转化了空载、35S:DlMYBrpsx和35S:DlMYBrprp的拟南芥花组织。EV：空载。(B)DlMYBrp在拟南芥中的表达量。(C)DlMYBrp超表系中花色苷生物合成相关基因的表达量分析。
图9为DlMYBrprp定点突变在烟草中的表型及相关基因表达量。(A)DlMYBrprp定点突变在烟草中瞬时表型。(B)、(C)烟草花色苷生物合成相关基因在不同点突变类型中的表达量。
图10为mybrparms功能标记在杂交后代及不同龙眼品种中的扩增结果。(A)RP龙眼与SX龙眼杂种后代阳性鉴定。(B)21份种质资源PCR结果。M代表2000bp marker，红色箭头表示RP龙眼特异性条带。BY代表八一早，DBL代表大鼻龙，BQ代表白乾焦龙，MJ代表闽焦，SN代表水南1号，DWY代表大乌圆，SF代表松风本，ZB代表早白焦，YT代表油谭本，DB代表东壁，LL代表灵龙，LQ代表良庆2号，GM代表桂明1号，KT代表康坛，CS代表处暑本，QYM代表青圆木本，XP代表西埔本，GH代表桂花味，FG代表风广，Lee为Lee，SX代表石硖，RP代表红皮龙眼。
图11为DlMYB15和DlMYBrp时空表达谱。DlMYB15和DlMYBrp在RP龙眼不同发育阶段的表达量(G1-G5分别代表15、35、55、75和95DPA)。
图12为蛋白互作分析。
图13为烟草叶片瞬时表达及总花色苷含量测定。(A)DlMYB15、DlMYBrp、DlbHLH3及不同组合在烟草叶片中瞬时转化的表型特征，以pCAMBIA2300-35S为阴性对照。(B)DlMYB15、DlMYBrp、DlbHLH3及不同组合总花色苷的含量。
具体实施方式
下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
缩略词表
1植物材料
本研究中利用的‘石硖’龙眼(SX龙眼)和红皮龙眼(RP龙眼)种植于中国热带农业科学院南亚热带作物研究所荔枝龙眼种质资源圃。SX龙眼的果皮与大多数栽培品种一样均为黄褐色，而RP龙眼果皮内外表面均呈现深红色，这在龙眼品种中极为少见。在SX龙眼中子叶不积累花色苷，而RP龙眼子叶则积累少量的花色苷；而二者的假种皮均为典型的乳白色(图1A&B)。SX龙眼的叶片正反面均为绿色，叶脉呈现淡黄色(图1C)；RP龙眼叶片正面均为深红色，叶背为深绿色(图1D)。
转录组分析采集两龙眼品种花后95d(After 95days post-anthesis,DPA)的果皮及成熟叶片。红皮龙眼果实发育阶段(15、35、55、75、和95DPA)果皮、种子、果肉及不同组织部位(叶片、花)样品采集后立即液氮速冻并置于-80℃保存备用。
2实验所需引物
表1实验所需引物
实施例1
1、DlMYBrp基因克隆、转化及序列分析
(1)目的片段的克隆与回收
分别从SX龙眼和RP果皮组织提取RNA，通过RevertAidFirst StrandcDNASynthesis Kit,with DNase I(Thermo Scientific,USA)反转录试剂盒合成cDNA。
通过龙眼参考基因组获得基因的参考序列，设计带15bp同源臂特异性引物从红皮龙眼和‘石硖’龙眼果皮cDNA中扩增目的基因的CDS区。引物由广州艾基生物有限公司合成。得到的引物使用无菌ddH2O溶解并稀释至工作浓度10μM待用。利用引物Inf-DlMYBrp-F：5`-cGGTACCCGGGGATCCATGGAGGGTCACGTAGGAGTT-3`，和Inf-DlMYBrp-R：5`-TGCTCACCATGTCGACCTTTGCATTGTCTTCTTCTGTACTTAGAAGATTCC-3`，通过高保真DNA聚合酶KOD进行PCR扩增。PCR反应体系如下：
PCR扩增程序：94℃2min；94℃15s，62℃30s，68℃1min，30个循环；16℃保存。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后利用Sigma的DNA胶回收试剂盒切胶回收，回收产物经琼脂糖凝胶电泳检测。
(2)载体线性化及目的片段的连接转化
将pCAMBIA2300载体进行双酶切使其线性化，酶切位点为BamHⅠ、SalⅠ，反应体系如下：
将混合体系置于PCR中37℃保温2h，80℃20min。琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，并通过切胶回收线性化载体。采用SnapAssembly Cloning Kit(Takara，Japan)无缝克隆连接试剂盒，将带15bp同源臂的Inf-DlMYBrp片段插入到线性化的pCAMBIA2300载体中，连接体系如下(50℃15min)：
取2μL连接产物于50μL半融化状态的DH5α感受态细胞中，轻拨管底并冰浴25min；随后42℃热激30s，静置于冰中2min；加入700μL无抗的LB培养基，37℃复苏1h；随后4500rpm离心1min，去掉上清600μL，吸取重悬菌液均匀涂布于LB(含100mg/L Kana)固体板，37℃暗培养12-16h。在平板中挑取单菌落到500μLLB(含100mg/L Kana)液体培养基中培养3h，以每管菌液作为模板，以载体引物p35S-F和目的基因下游引物Inf-DlMYBrp-R进行菌落阳性检测。PCR反应体系如下：
PCR反应程序：94℃2min；94℃10s，60℃10s，72℃20s，35个循环；72℃5min，16℃保存。经琼脂糖凝胶电泳检测正确的菌液送广州艾基生物有限公司测序。结果显示，克隆获得DlMYBrp基因，从RP龙眼中获得的DlMYBrp基因命名为DlMYBrprp，其CDS序列如SEQ ID NO:1所示，从SX龙眼中获得的DlMYBrp基因命名为DlMYBrpsx，其CDS序列如SEQ ID NO:2所示。序列分析发现，R3结构域上均存在与bHLH蛋白结合的关键基序：[D/E]Lx2[R/K]x3Lx6Lx3R。然而在R3保守结构域中存在3个碱基的变异造成了两个氨基酸的替换，分别是位于DlMYBrp基因的第197位碱基T替换为G，导致精氨酸替换为甲硫氨酸，第317位和318位的碱基GA替换为AT，导致组氨酸替换为精氨酸，该位置位于R3保守结构域的第三个α螺旋中(图2)。
对测序正确的菌液进行扩摇并按照质粒小体试剂盒说明书进行重组质粒的提取。
(3)DlMYBrp基因结构、多序列比对及系统发育树分析
利用NCBI保守结构域数据库(Conserved Domain Database,CDD,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)进行蛋白保守结构域预测及分析。从NCBI及拟南芥基因组数据库中调取相关蛋白序列，利用GeneDoc软件进行多序列比对。同时利用Fastatree软件构建系统发育树。结果如图3所示，D.long035496(依据swiss-port数据库的注释信息将D.long035496命名为DlMYBrp)与LcMYB1、CsRUBY、ATMYB15、ATMYB90、ATMYB113、ATMYB114、FaMYB10、AcMYB10、AcMYB75具有较高的同源性。
2、亚细胞定位
将DlMYBrpsx和DlMYBrp rp完整编码区(去除终止密码子)构建至表达载体pCAMBIA2300中GFP的5’端形成pCAMBIA2300：DlMYBrprp：GFP和pCAMBIA2300：DlMYBrpsx：GFP融合重组载体，详细步骤参见实施例1.1。
将pCAMBIA2300：DlMYBrprp：GFP、pCAMBIA2300：DlMYBrpsx：GFP融合重组载体及空载分别加入100μL半融状态的农杆菌GV3101中，轻拨管底，冰浴5min，液氮冷冻5min，37℃温水浴5min，随后冰浴5min；加入600μL无抗生素的YEP培养基，28℃200rpm活化3h；3000rpm离心3min，弃上清400μL，吸取重悬菌液100μL均匀涂布于YEP(含100mg/L Kana和25mg/L RMP)固体板，28℃暗培养48-72h。
挑取单克隆阳检并将阳检正确的单克隆进行扩摇，将新鲜洋葱切成1平方厘米，然后将内表皮细胞置于MS培养基中，在28℃下黑暗中培养两天。随后在重悬的根癌农杆菌中浸泡8min，在28℃的黑暗培养基中培养24-72h，用LSM 800激光共聚焦显微镜(Zeiss,Germany)检测绿色荧光蛋白的表达。
洋葱鳞片叶表皮细胞亚细胞定位分析发现，空载定位于细胞膜以及细胞核中，而DlMYBrprp-GFP与DlMYBrpsx-GFP则显示定位于洋葱表皮细胞核中(图4)，具有转录因子特性。
实施例2DlMYBrp是调控红皮龙眼着色的关键转录因子
1、红皮龙眼果实发育阶段花色苷含量、DlMYBrp表达量分析
采用pH示差法进行花色苷的提取和测定。具体步骤如下：(1)样品准备：将植物组织在液氮中研磨成细粉；(2)试剂准备：提取液(1％盐酸/甲醇)，pH＝1.0测定缓冲液(250mMKCl缓冲溶液)，pH＝4.5测定缓冲液(400mM KAc缓冲溶液)；(3)提取：将提前称取的置于15mL离心管的0.3g样品中加入10mL提取液，充分混匀，4℃黑暗提取24h，10000rpm低温离心8min，转移上清液于另一离心管中(可于-20℃保存)；(4)测定：准备400μL pH＝1.0和pH＝4.5的测定缓冲液于两个离心管中，各加入400μL上清液，混匀，低温避光静置15min，利用多功能酶标仪测定在510nm和700nm下的吸光度，分别以测定缓冲液作为对照；(5)计算：按照下面公式计算花色苷含量：C(mg/100g FW)＝ΔA·V·n·MW·100/(ε·m)，其中，ΔA＝(A510-A700)pH1.0-(A510-A700)pH4.5；V为提取液体积(10mL)；n为稀释倍数(2)；MW为花色苷测定标品矢车菊素-3-半乳糖苷的相对分子质量(449.2g/mol)；ε为矢车菊素-3-半乳糖苷的摩尔比吸收系数30200；m为样品质量(0.3g)。
果实色泽是果实最重要的外观品质之一，RP龙眼果实呈现不同于普通栽培龙眼的深红色。通过对RP龙眼果实发育阶段的花色苷含量发现，红皮龙眼果实在花后15天并未积累花色苷，在转色期(35DPA)显著积累花色苷，其含量达3.58mg/100gFW，在果实成熟期(95DPA)果皮花色苷含量最高，达到6.58mg/100gFW(图5A)。通过测定DlMYBrp在果实发育阶段及不同组织的表达量可以发现，DlMYBrp在转色期显著上调表达，并随着果实的成熟而逐渐下调表达(图5B)。在积累花色苷的果皮、果核、叶片中均能检测到DlMYBrp的表达，而在不积累花色苷的果肉中未能检测其表达，说明DlMYBrp具有组织特异性，仅在积累花色苷的组织中上调表达(图5C)。表明DlMYBrp可能参与调节RP龙眼花色苷的生物合成。
2、龙眼愈伤组织遗传转化
遗传转化体系则采用农杆菌浸泡侵染的方法，具体操作步骤如下：(1)将实施例1.1获得的重组质粒转染GV3101农杆菌，然后将含有重组质粒的GV3101农杆菌，用15mL YEP液体培养基(含25mg/L的利福平和100mg/L的卡那霉素)28℃震荡培养。(2)过夜培养至菌液浑浊，5000rpm离心8-10min收集菌体。(3)加入15mL无菌ddH2O重悬洗菌，5000rpm离心5min再次收集菌体(重复一次)。(4)再次加入15mL MS培养基(含有100mg/L乙酰丁香酮)重悬，即为侵染液(可用无菌水代替MS)。(5)将生长状态良好的龙眼愈伤组织分散均匀，浸没到的侵染液中，于28℃震荡30min。(6)以无菌滤纸过滤，弃侵染液，留愈伤组织。(7)将愈伤组织以无菌滤纸，吸干多余水分，轻柔操作，避免机械损害。(8)将愈伤组织置MS(17-18)固体培养基上，于黑暗处共培养2d。(9)将共培养2d的愈伤组织用无菌水清洗一遍，吸干水分，平铺于MS(17-18)固体培养基(含有100mg/L卡那霉素和200mg/L特美汀)上正常培养。(10)以后约每20天继代一次，且特美汀浓度上调至500mg/L，连续继代3-5个月。
为了验证DlMYBrp是红皮龙眼花色苷积累过程中重要的调控因子，将DlMYBrprp通过农杆菌浸染的方式，将其导入龙眼愈伤，并通过对浸染愈伤进行抗性的筛选，对筛选的愈伤在一定的选择压中多次继代，最终形成稳定的超表系(图6)。可以发现，与野生型相比DlMYBrprp超表系愈伤中花色苷积累明显说明了DlMYBrprp能够引起花色苷的积累。因此，DlMYBrp是调控红皮龙眼着色的关键转录因子。
实施例2DlMYBrp序列差异造成其功能表征变异的验证
1、烟草叶片瞬时转化
将实施例1.1获得的重组质粒转入GV3101农杆菌，用15mL YEP液体培养基(含25mg/L的利福平和100mg/L的卡那霉素)28℃震荡培养。过夜培养至菌液浑浊，6000rpm离心5min收集菌体，并用无菌水重悬两次，尽量洗净多余的含利福平的培养基。后用MMA重悬液1mL重悬一次，最后用MMA重悬液调节菌液OD600为0.5，黑暗条件下静置2-3h。配制MMA重悬液，配方如下：
取1mL的无菌注射器，取下针头，吸取菌液，从烟草叶片的背部轻轻将菌液注射进去，做好标记，并于黑暗条件下放置16-24h，随后进行正常光周期处理，36-48h观察叶片表型并进行拍照、取样、冻存等用于后续实验分析。
结果显示，DlMYBrprp具有促进烟草叶片花色苷积累的能力，而DlMYBrpsx与空载在烟草叶片中肉眼并未有可见的花色苷积累。通过对瞬转材料叶片的取样并进行总花色苷含量的测定，注射空载的总花色苷含量为0，注射DlMYBrpsx的总花色苷含量为0.139mg·100g-1FW，注射DlMYBrprp的总花色苷含量为1.298mg·100g-1FW，可见DlMYBrprp显著促进了烟草叶片花色苷的积累(图7)，因此，DlMYBrp的氨基酸序列差异可能是其具有积累花色苷的重要原因。
2、拟南芥遗传转化
将实施例1.1获得的重组质粒转入农杆菌。拟南芥稳定转化体系构建采用花序浸染法，待植株生长至大部分花序抽出时进行农杆菌浸染。挑取转化成功的单克隆(同实施例2.1)于YEP(含50Mg/L卡那霉素，25Mg/L利福平)培养基中小摇过夜，从中取100μL新鲜菌液于100mL含相应抗生素的YEP培养基中，28℃摇菌至菌液呈黄色浑浊状态即可，室温条件下6000rpm离心8min收集细胞弃上清，加入250mL渗透培养液(50g/L蔗糖溶液)悬浮菌体，浸染时加入sillwet-77，使其浓度为200μL/L，混匀后将去除已开放花蕾的拟南芥花序浸泡于渗透液中30s，黑暗条件下平放培养24h，后正常直立培养，约一周后重复上述实验步骤一次，待种子成熟(T0)烘干并于4℃中保存。
转基因拟南芥种子筛选，将T0代种子置于70％酒精中消毒1min，后用3％次氯酸钠(含0.05％Tween20)灭菌10min，期间每两分钟剧烈震荡一次，无菌水清洗3-5遍。随后用无菌的0.05％琼脂糖重悬种子，均匀播种于1/2MS(含50Mg/L卡那霉素)固体培养基中，野生型种子播种于1/2MS培养基中，置于4℃中暗培养3d，随后置于正常光周期培养箱中培养，挑选绿色幼苗栽种于土壤中，待长大后阳检。连续培养直至T3代获得纯合的转基因株系，观察植株表型，并分析相关基因的表达规律。
将DlMYBrprp与DlMYBrpsx转入拟南芥中，收获的T3代纯合植株表型可发现，过表达DlMYBrpsx不能促进拟南芥植株积累花色苷，而过表达DlMYBrprp拟南芥植株的花瓣、花萼前端及花丝均可积累花色苷(图8A)。进一步验证拟南芥中花色苷合成通路结构基因的表达量发现，DlMYBrpsx能够不同程度的诱导AtCHS(NCBI登录号AT5G13930.1)、AtCHI(NCBI登录号AT3G55120.1)、AtF3H(NCBI登录号AT3G51240.1)、AtDFR(NCBI登录号AT5G42800.1)的表达，而DlMYBrprp则能促进AtCHS、AtCHI、AtF3H等基因的表达，花色苷生物合成的后期合成基因AtDFR、AtANS(NCBI登录号AT4G22880.1)、AtUFGT(NCBI登录号AT5G17050.1)表达增加尤其显著(图8C)。稳定转化拟南芥实验进一步证实了DlMYBrp编码区的序列变异是造成其功能表征变异的原因。
实施例3点突变载体的构建及其突变位点功能分析
先前研究已表明DlMYBrp编码区的序列变异是造成其功能表征变异的原因，为了验证DlMYBrp中R3保守结构域中氨基酸的替换是否是造成其功能变化的原因，利用桥接PCR构建了点突变序列并连接到植物双元表达载体pCAMBIA2300:35S。所用引物见表1，PCR反应体系如下：
PCR扩增程序：94℃2min；94℃15s，62℃30s，68℃1min，30个循环；16℃保存。将DlMYBrprp第197位碱基T替换为G(第66位氨基酸由甲硫氨酸替换为精氨酸)，并将其命名为DlMYBrp-197；将DlMYBrprp第317和318位碱基由GA替换为AT(第106位氨基酸由精氨酸替换为组氨酸)并将其命名为DlMYBrp-317。通过农杆菌注射烟草的方法观察表型，并测定了烟草中花色苷合成结构基因在不同突变体中的表达量，发现DlMYBrp-197在烟草叶片中促进其花色苷积累的能力强于DlMYBrp-317(图9A)，通过qRT-PCR对不同点突变处理的烟草中花色苷生物合成相关结构基因的表达量进行测定发现，相对于DlMYBrprp处理的叶片，DlMYBrp-197和DlMYBrp-317的处理花色苷结构基因均不同程度的显著性下调，且DlMYBrp-317效果最为显著(图9B和图C)。
实施例4龙眼DlMYBrp基因花色苷积累突变位点功能标记的开发
本发明通过对RP龙眼和SX龙眼DlMYBrp功能的分析，研究发现DlMYBrprp和DlMYBrpsx在R3保守结构域内存在3个碱基的替换，分别使位于197位的G替换为T(精氨酸转变为甲硫氨酸)，位于317位的AT替换为GA(组氨酸转变为精氨酸)，从而使得花色苷积累能力的迅速减弱。为此针对基因内碱基突变造成的差异设计分子标记，采用四引物扩增受阻突变PCR(Tetra-primerARMS-PCR)，通过一次PCR扩增将RP龙眼突变型与SX龙眼普通型、杂种杂合型进行有效区分。
1、DlMYBrp基因SNP功能标记的开发
根据DlMYBrp的R3保守结构域的双突变位点(AT→GA)，本研究开发了一组突变功能标记，为mybrparms，每组各4条引物。对于mybrparms首先设计1对外引物mybrparms-af：5`-GCTCATGCTTTGATGTCTGGTC-3`和mybrparms-ar：5`-CTTTGCATTGTCTTCTTCTGTAC-3`作为参考对照，在RP龙眼和SX龙眼中均能扩增出716bp的条带，且扩增产物均包含DlMYBrp突变位点，随后依据突变位点设计两条反向内引物mytrparms-bf：5`-TCAAGAACTATTGGAACACACAT-3`和mybrparms-br：5`-GCAACAGCTTTTTTGCGTAATC-3`，其中mytrparms-br与突变型基因匹配，其3’端对应突变碱基GA，引物mytrparms-bf与SX龙眼基因匹配，其3’端对应碱基AT。PCR反应体系如下：
PCR扩增程序：95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃54s，36个循环；16℃保存。
参照Tetra-primerARMS-PCR引物设计策略预测：mytrparms-af/mytrparms-br可扩增出大小为253bp的条带，是RP龙眼DlMYBrprp特有条带；mytrparms-bf/mytrparms-ar可扩增出大小为506bp的条带，为SX龙眼DlMYBrpsx特有条带。由此可见RP龙眼可扩增出两条带，大小分别为716bp和253bp；而SX龙眼扩增的两条带为716bp和506bp。若为杂种后代则将扩增716bp、506bp和253bp三条杂合型的条带。
2、mytrparms功能标记的验证
依据mytrparms功能标记的扩增特性，当利用红皮龙眼作为杂交亲本之一进行杂交育种时，若子代通过Tetra-primerARMS-PCR能够扩增出双亲两条特异性条带，以及一条共有的条带，则能够认定该子代为真杂种。于是对8个杂种后代进行真实性鉴定发现有两株子代(F1-7和F1-8)成功扩增出716bp、506bp和253bp三条杂合型的条带，表明该两株为真杂种而其余6株为假杂种(图10A)。
在22个种质资源中进行四引物扩增受阻突变PCR，可以发现，仅在积累花色苷的红皮龙眼中能够扩增特异性的253bp的条带，而其余21个不能积累花色苷的品种中都与SX龙眼一样仅能特异性扩增506bp长度的条带(图10B)。基于以上的结果，利用此特性到龙眼杂交群体的鉴定中，将有助于早期筛选龙眼杂交种，缩短育种周期，以及对培育特色新品种具有重要意义。
实施例5关于DlMYB15基因
1、DlMYB15基因克隆
取红皮龙眼果皮提取RNA，得到符合后续试验要求的总RNA。通过RevertAid FirstStrand cDNA Synthesis Kit,with DNase I(Thermo Scientific,USA)反转录试剂盒合成cDNA。设计读码框PCR扩增引物DlMYB15-f：5’-cGGTACCCGGGGATCCATGGGGAGGAGCCCATGT-3’和DlMYB15-r：5’-TGCTCACCATGTCGACGGGCCACTCATCGGAATCAAG-3’，以获得的cDNA作为模板，进行PCR扩增，PCR反应体系及反应程序同实施例1。回收PCR产物，按照实施例1.1的方法进行载体线性化及目的片段的连接转化，转染，测序，得到正确的DlMYB15基因(其CDS序列序列如SEQ ID NO:4)。对测序正确的菌液进行扩摇并按照质粒小体试剂盒说明书进行重组质粒的提取。
2、DlMYB15基因组织特异性表达
测定DlMYB15基因在果实发育阶段及不同组织的表达量，发现DlMYB15与DlMYBrp的表达模式基本一致(图11)，因此我们推测DlMYB15同样具有与DlMYBrp相类似的促进花色苷积累的功能。
实施例6关于DlbHLH3基因
1、DlbHLH3基因克隆
取红皮龙眼果皮提取RNA，得到符合后续试验要求的总RNA。通过RevertAid FirstStrand cDNA Synthesis Kit,with DNase I(Thermo Scientific,USA)反转录试剂盒合成cDNA。设计读码框PCR扩增引物DlbHLH3-f：5’-cGGTACCCGGGGATCCATGGCTACTACTGGGGTTCAAAG-3’和DlbHLH3-r：5’-TGCTCACCATGTCGACACACTTCCAAATGACTCTGTCAAGTGA-3’，以获得的cDNA作为模板，进行PCR扩增，PCR反应体系及反应程序同实施例1。回收PCR产物，按照实施例1.1的方法进行载体线性化及目的片段的连接转化，转染，测序，得到正确的DlbHLH3基因(其CDS序列如SEQ ID NO:3)。对测序正确的菌液进行扩摇并按照质粒小体试剂盒说明书进行重组质粒的提取。
实施例7DlMYB15、DlbHLH3和DlMYBrprp的相互作用
1、酵母双杂交实验
取红皮龙眼果皮提取RNA，得到符合后续试验要求的总RNA。通过RevertAid FirstStrand cDNA Synthesis Kit,with DNase I(Thermo Scientific,USA)反转录试剂盒合成cDNA。分别以表1中酵母实验部分含有酶切位点的pGBKT7-DlMYBrp引物对、pGBKT7-DlMYB15引物对、pGADT7-DlMYB15引物对、pGADT7-DlbHLH3进行扩增，PCR反应体系及反应程序同实施例1.1，从而在目的基因上引入相应的酶切位点。然后将目的基因连接于pGBKT7和pGADT7载体中，通过EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点将DlMYBrprp基因、DlMYB15基因分别连接到pGBKT7载体上，构建BD载体(下表的pGBKT7-DlMYBrp质粒、pGBKT7-DlMYB15质粒)；通过EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点将将DlbHLH3基因、DlMYB15基因分别连接到pGADT7载体上，构建AD载体(下表的pGADT7-DlbHLH3质粒、pGADT7-DlMYB15质粒)。以pGBKT7-Lam和pGADT7-T为阴性对照；以pGBKT7-53和pGADT7-T为阳性对照。
将AH109酵母甘油菌划线于YPDA平板上，29℃倒置培养3d左右，挑取单克隆于2mLYPDA培养基中，220rpm培养8h；随后取5μL菌液于5mL YPDA培养基中过夜培养；700xg离心5min，去上清，5mL无菌水重悬菌液两次；而后用1mL 1.1倍TE/LiAc溶液重悬酵母，1,2000rpm离心15s，再次加入1mL 1.1倍TE/LiAc溶液重悬及为酵母感受态。随后按下表组合将质粒转入AH109感受态细胞中：
(其中pGBKT7-DlMYBrp为搭载DlMYBrprp基因的pGBKT7重组质粒。)
每管反应加入5μL预变性的CarrierDNA，300μL 1×TE/LiAc/PEG4000溶液，50μL酵母感受态细胞，混匀后30℃水浴30min；加入20μL DMSO混匀，42℃水浴热激15min，期间每5min涡旋混匀一次；700xg离心5min，弃上清，以1mLYPDA培养基重悬并于28℃200rpm培养1h；1,2000rpm离心15s，弃上清，加入100μL 0.9％NaCl溶液重悬细胞。每个体系取100分别以稀释10倍、100倍的菌液涂布于DDO平板，28℃倒置培养3d左右，观察菌落直径。挑取直径大于2mm单克隆，分别接种于5mL YPDA液体培养基，30℃220rpm培养至OD600值为0.4-0.6；分别取5μL菌液点种到DDO(SD/-Leu/-Trp)、QDO/3AT(SD/-Leu-/Trp/-His/-Ade/3AT)、QDO/X/3AT(SD/-Leu-/Trp/-His/-Ade/X-α-Gal/3AT)平板，30℃培养3d左右，观察菌斑生长情况。
结果如图12所示，酵母双杂交实验初步证明，DlMYB15与DlbHLH3不存在互作关系，但DlMYB15与DlMYBrp互作，DlbHLH3与DlMYBrp互作。
2、烟草叶片瞬时转化
取实施例1.1、实施例5.1和实施例6.1获得的重组质粒进行实验。实验分成8组：(1)空载体(Empty Vector)转染烟草叶片，(2)搭载DlMYBrprp基因的重组质粒(DlMYBrprp)转染烟草叶片；(3)搭载DlMYB15基因的重组质粒(DlMYB15)转染烟草叶片；(4)搭载DlbHLH3基因的重组质粒(DlbHLH3)转染烟草叶片；(5)搭载DlMYB15基因的重组质粒和搭载DlMYBrprp基因的重组质粒(DlMYB15/DlMYBrprp)转染烟草叶片；(6)搭载DlMYB15基因的重组质粒和搭载DlbHLH3基因的重组质粒(DlbHLH3/DlMYB15)转染烟草叶片；(7)搭载DlbHLH3基因的重组质粒和搭载DlMYBrp rp基因的重组质粒(DlbHLH3/DlMYBrprp)转染烟草叶片；(8)搭载DlMYB15基因的重组质粒、搭载DlbHLH3基因的重组质粒和搭载DlMYBrprp基因的重组质粒(DlbHLH3/DlMYB15/DlMYBrprp)转染烟草叶片。
转化及摇菌方法同实施例1的“2、亚细胞定位”。实验操作步骤如下：将含有重组质粒的GV3101农杆菌，用15mLYEP液体培养基(含25mg/L的利福平和100mg/L的卡那霉素)28℃震荡培养。过夜培养至菌液浑浊，6000rpm离心5min收集菌体，并用无菌水重悬两次，尽量洗净多余的含利福平的培养基。后用MMA重悬液1mL重悬一次，最后用MMA重悬液调节菌液OD600为0.5，黑暗条件下静置2-3h。配制MMA重悬液，配方如下：
取1mL的无菌注射器，取下针头，吸取菌液，从烟草叶片的背部轻轻将菌液注射进去，做好标记，并于黑暗条件下放置16-24h，随后进行正常光周期处理，36-48h观察叶片表型并进行拍照、取样、冻存等用于后续实验分析。
结果如图13所示。瞬时共转化烟草实验表明DlMYB15单独注射、DlbHLH3单独注射及DlMYB15/DlbHLH3共同注射均无法促进花色苷的积累；单独注射DlMYBrp时，花色苷积累量为1.298mg·100g-1FW；DlMYB15/DlMYBrp共同注射烟草叶片时，花色苷积累量为1.506mg·100g-1FW，单独注射DlMYBrp，花色苷积累量有明显增加；DlbHLH3/DlMYBrp共同注射烟草叶片时，花色苷积累量为2.667mg·100g-1FW，相比单独注射DlMYBrp，花色苷积累量也有明显增加；尤其是当DlMYB15/DlbHLH3/DlMYBrp三者共同注射烟草叶片时，花色苷积累量为6.188mg·100g-1FW，花色苷积累量显著增加，是单独注射DlMYBrp的4.77倍。可见，DlMYB15可能通过与DlMYBrp互作以及与DlMYBrp和DlbHLH3所形成的复合体互作增强花色苷的积累，DlbHLH3可能通过与DlMYBrp以及与DlMYBrp和DlMYB15所形成的复合体互作增强花色苷的积累。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该实用进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (6)

1.一种SNP标记，其特征在于，所述SNP标记为SNP1、SNP2或SNP3；SNP1位于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的第197位，碱基为T或G；SNP2位于SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2所示核苷酸序列的第317位，碱基为G或A；SNP3位于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的第318位，碱基为A或T。
2.一种SNP标记组合，其特征在于，所述SNP标记组合包括SNP2和SNP3；SNP2位于SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的第317位，碱基为G或A；SNP3位于SEQ ID NO:1或SEQID NO:2所示核苷酸序列的第318位，碱基为A或T。
3.用于扩增含有如权利要求2所述的SNP标记组合的核苷酸序列的引物组，所述引物组包含：mybrparms-af：5`-GCTCATGCTTTGATGTCTGGTC-3`，和mybrparms-ar：5`-CTTTGCATTGTCTTCTTCTGTAC-3``。
4.一种鉴别龙眼的引物组，其特征在于，所述引物组包含：
mybrparms-af：5`-GCTCATGCTTTGATGTCTGGTC-3`，
mybrparms-ar：5`-CTTTGCATTGTCTTCTTCTGTAC-3`，
ybrparms-bf：5`-TCAAGAACTATTGGAACACACAT-3`，和
mybrparms-br：5`-GCAACAGCTTTTTTGCGTAATC-3`。
5.如权利要求1所述SNP标记、或者如权利要求2所述SNP标记组合、或者如权利要求3或4所述的引物组在鉴别龙眼中的应用。
6.一种龙眼的鉴别方法，其特征在于，检测待测龙眼品种如权利要求1所述的SNP标记或权利要求2所述的SNP标记组合，获得基因型；若SNP1位点的基因型为TT，则为纯合红皮龙眼，若为GG，则为纯合石硖龙眼，若为GT，则为杂合龙眼；若SNP2位点的基因型为GG，则为纯合红皮龙眼，若为AA，则为纯合石硖龙眼，若为GA，则为杂合龙眼；若SNP3位点的基因型为AA，则为纯合红皮龙眼，若为TT，则为纯合石硖龙眼，若为AT，则为杂合龙眼；或者
采用权利要求4所述的引物组对待测龙眼品种进行PCR扩增，扩增出716bp和253bp条带的为纯合红皮龙眼，扩增出716bp和506bp条带的纯合石硖龙眼，扩增出716bp、506bp和253bp三条条带的为杂合龙眼；
所述杂合龙眼是指红皮龙眼和石硖龙眼的杂种后代。
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