CN104745714A - 一种选择与湖羊产肉性能相关的分子标记的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种选择与湖羊产肉性能相关的分子标记的方法及其应用。首先是利用实时荧光定量技术检测湖羊Lats1基因在不同生长阶段、不同组织和不同性别的表达特性，继而，分析Lats1基因与其它六个肌肉生长和肌纤维有关的主效基因的相关性，从而验证Lats1可以作为湖羊产肉性状的分子标记的可能性。本发明的方法可以有效筛出与湖羊产肉性能的有关的分子标记，从而为利用分子标记辅助选择提高湖羊产肉性能奠定基础。
Description
技术领域
一种选择与湖羊产肉性能相关的分子标记的方法及其应用，首先利用实时荧光定量技术检测湖羊Lats1基因在不同生长阶段、不同组织和不同性别的表达特性，继而分析Lats1基因与YAP1基因、肌球蛋白重链亚型(MyHC Ⅰ、MyHCⅡA、MyHCⅡX)基因、MSTN基因、MyoG基因六个肌肉生长和肌纤维有关的主效基因的相关性，从而验证Lats1可以作为湖羊产肉性状的分子标记的可能性。
背景技术
Lats基因(Large tumor suppressor gene)(也称wts基因)，最早由Xu等在果蝇中发现，它可能编码一个丝氨酸/苏氨酸激酶，是一个肿瘤抑制基因，随后它在哺乳动物中的同源基因也被证实是肿瘤抑制基因，并且是CDKs负调因子家族中的成员。在哺乳动物中，Lats家族包括Lats1和Lats2两个成员，人类Lats1和Lats2基因分别位于染色体6q24-25和13q11-12，其编码丝氨酸-苏氨酸激酶在有丝分裂早期与细胞周期调控因子CDC2激酶构成有丝分裂复合物，参与细胞周期调控，为潜在的肿瘤抑制基因。Lats1缺陷的小鼠将会引发软组织肉瘤和卵巢肿瘤，缺失Lats2的小鼠将会导致胚胎致死。在体外细胞培养中，Lats1已经被证明能够将YAP磷酸化。在人正常乳腺上皮细胞中过表达Lats1可降低YAP介导的上皮细胞间质化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)和细胞迁移。在小鼠胚胎成纤维细胞中，Hippo信号通道中Lats1通过Lats2的表达和YAP的稳定性准确的协调控制细胞生长和染色体的稳定性。Lats1最近被确定为新兴Hippo信号通道中的一个中心角色，在控制器官大小、肿瘤、干细胞的分化和重建等过程中起着重要的作用。
动物的产肉性能包含肌肉细胞的生长和肌纤维的分化。在现有技术中，尚未有研究发现以及证明Lats1基因可以作为湖羊产肉性状的分子标记的可能性。
发明内容
本发明提供了一种选择与湖羊产肉性能相关的分子标记的方法及其应用。
本方法首先利用实时荧光定量技术检测湖羊Lats1基因在不同生长阶段、不同组织和不同性别的表达特性，继而分析Lats1基因与YAP1基因、肌球蛋白重链亚型(MyHC Ⅰ、MyHCⅡA、MyHCⅡX)基因、MSTN基因、MyoG基因六个肌肉生长和肌纤维有关的主效基因的相关性，从而验证Lats1可以作为湖羊产肉性状的分子标记的可能性。
本研究选择六个与肌细胞增值和肌纤维分化有关的主效基因作为筛选新的与产肉性能有关的分子标记的依据，这些主效基因包括：YAP1是一种转录调节因子，它既可以作为共激活因子，也可以作为辅阻遏物，它是位于Hippo通路下游的关键调节因子，YAP1由Lats1/2磷酸化，抑制其易位进入细胞核，来调节与细胞增殖、细胞死亡以及细胞迁移相关的重要因子。研究表明，YAP1在细胞增殖与凋亡的调控、器官大小的控制、细胞接触性抑制乃至肿瘤的发生过程中有重要作用。肌肉生长抑制因子(myostatin,MSTN)基因，也被称为转化生长因子8(GDF-8)，是TGF-β超家族成员之一，在骨骼肌中广泛表达，是肌肉生成中的一个负调控因子，通过控制成肌细胞的增殖来发挥作用。MSTN可以通过Smad蛋白的介导抑制成肌细胞的分化。肌细胞生成素(myogenin,MyoG)基因是MRFs基因家族成员，其中MyoG基因是MyoD家族最重要的成员之一，是肌细胞终末端分化的关键因子，能够在调控肌细胞生成的过程中起核心作用，其表达可以终止成肌细胞的增殖，调节单核成肌细胞融合为多核肌细胞的过程，也是MyoD基因家族中唯一在所有骨骼肌成肌细胞增殖分化的所有时期均有表达的基因，是骨骼肌发育的一种正调控因子。肌球蛋白广泛存在于肌细胞中，是骨骼肌的主要收缩蛋白。肌球蛋白含有两个重链和两对轻链组成，根据肌纤维类型可以分为多种类型，包括MyHC Ⅰ、MyHCⅡ A、MyHCⅡ X等。
本发明的技术方案是：首先利用实时荧光定量技术分析Lats1基因在湖羊中的时空表达，继而分析Lats1基因与YAP1基因、肌球蛋白重链亚型(MyHC Ⅰ、MyHCⅡA、MyHCⅡX)基因、MSTN基因、MyoG基因的表达相关性。
本发明所提供的用于分析Lats1基因在骨骼肌表达的方法，是利用实时荧光定量技术分析Lats1在不同肌肉组织、不同生长阶段、不同性别的肌肉组织中的表达情况。
本发明所提供的用于分析Lats1基因与其他主效基因关联的方法，是分析Lats1与YAP1基因、肌球蛋白重链亚型(MyHC Ⅰ、MyHCⅡA、MyHCⅡX)基因、MSTN基因、MyoG基因在不同肌肉组织表达相关性关系分析，以及Lats1与YAP1基因、肌球蛋白重链亚型(MyHC Ⅰ、MyHCⅡA、MyHCⅡX)基因、MSTN基因、MyoG基因在不同生长阶段表达相关性分析。
本发明所述的实时荧光定量技术分析Lats1在骨骼肌中的表达情况，是使用ABI7500荧光定量PCR仪，通过提取总RNA，采用反转录方法获得不同组织样品cDNA，然后进行实时荧光定量分析。
本发明的方法步骤包括：
选择三个阶段的试验动物湖羊，包括初生期、断奶期和成熟期的公湖羊和母湖羊；对每个阶段的湖羊选取饲养条件相同、生长发育良好、体重相近的湖羊进行屠宰。
分别采每个阶段湖羊的集背最长肌、比目鱼肌、腓肠肌、趾长伸肌四种肌肉组织于液氮罐保存，然后转移至冰箱冷冻保存。
根据GenBank已公布的7种基因(YAP1基因、MyHC Ⅰ基因、MyHCⅡA基因、MyHCⅡX基因、MSTN基因和MyoG基因和Lats1基因)和内参基因18S的CDS区序列，设计实时荧光定量PCR引物并合成引物。
用Trizol法提取总RNA，用反转录技术合成cDNA。以合成的不同组织样品的cDNA为模板，根据所设计的基因引物对湖羊不同组织的表达量进行分析。
采用SPSS16.0计算重复样品间Ct均值以及标准偏差，采用2-△△Ct方法处理数据，2-△△Ct表示实验组目的基因的表达相对于对照组变化的倍数分析基因相对表达差异量。
本发明的方法采用实时荧光定量技术，可以检测出Lats1在不同生长阶段、不同性别、不同肌肉组织中的表达，可以迅速简便的分析Lats1在骨骼肌中的表达情况。本发明的方法还包括分析Lats1与YAP1基因、肌球蛋白重链亚型(MyHC Ⅰ、MyHCⅡA、MyHCⅡX)基因、MSTN基因、MyoG基因在不同肌肉组织表达相关性关系分析，以及Lats1与YAP1基因、肌球蛋白重链亚型(MyHC Ⅰ、MyHCⅡA、MyHCⅡX)基因、MSTN基因、MyoG基因在不同生长阶段表达相关性分析。本发明的方法为研究湖羊Lats1基因在肌肉生长发育过程中发挥作用奠定了基础。
附图说明
图1为总RNA琼脂糖凝胶电泳图。
图2为湖羊Lats1基因在不同肌肉组织中表达的差异比较。
图3为湖羊Lats1基因在不同生长阶段表达的差异比较。
图4为湖羊Lats1基因在不用性别表达的差异比较
具体实施方式
下面通过实施实例对本发明进行具体的描述
1.试验动物
试验羊只均购自苏州市种羊场。试验动物湖羊选择共分为三个阶段。包括：2日龄(初生期)、2月龄(断奶期)、6月龄(成熟期)每阶段3公3母共18只。每个阶段选择饲养条件相同、生长发育良好、体重相近的湖羊进行屠宰，采集背最长肌、比目鱼肌、腓肠肌、趾长伸肌四种肌肉组织于液氮罐保存，然后转移至-70℃冰箱保存。
2.总RNA的提取
(1)将超低温的RNA组织样品迅速转移至液氮预冷的研钵里，用研杵研磨组织，期间不断加液氮，直至研磨成粉末状。
(2)将研磨好的粉末用药匙加入已装有1ml Trizol的2ml去RNA酶指形管中(药匙用液氮预冷)，再用匀浆器将粉末充分搅拌至接近透明后静置5min。
(3)加入200ul氯仿，剧烈震荡15s，待溶液乳化后(无分层现象)，再静置5min
(4)12000rpm 4℃离心15min(离心机需提前空转预冷)。
(5)取上清液至新的1.5ml指形管。
(6)向上清液加入等体积异丙醇(大约500ul)，上下颠倒指形管，充分混匀，静置10min。
(7)12000rpm 4℃离心10min，试管底部出现沉底。
(8)小心弃上清液，加入75％乙醇1ml(用0.1％DEPC配制)轻轻上下颠倒洗涤，12000rpm4℃离心5min，小心弃乙醇，然后瞬时离心，再用无酶枪头吸出剩余乙醇溶液。
(9)干燥5min，加入适当DEPC处理水(30-60ul)，吹打溶解。
3.实时荧光定量PCR引物的设计与合成
表1 用于扩增湖羊Lats1、YAP1、肌球蛋白重链亚型、MSTN、MyoG及18S(真核)基因片段的实时荧光定量PCR引物
4.cDNA第一链的合成
从-70℃冰箱中取出已经提好的RNA溶液，在冰盒上进行解冻，然后在无酶的PCR管中配制反应溶液。
反转录反应体系为：总RNA 4μL(10uL体系中不超过500ng)Oligo dT 0.5μL；Random6mers 0.5μL；PrimerScript Buffer 2μL；PrimerScript RT Enzyme Mix I 0.5μL；RNase free H2O2.5uL总体积10uL。
将PCR管置于PCR仪中进行反应，37℃反应15min后，85℃变性5s。
5.实时荧光定量PCR
以获得的不同组织样品的cDNA为模板，根据表1中所设计的Lats1、YAP1、MyHC Ⅰ、MyHCⅡA、MyHCⅡX、MSTN、MyoG、以及内参18S(真核)的引物对湖羊不同组织的表达量进行分析。
实时荧光定量PCR反应体系为：SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10μL，PCRForward Primer(10μM)0.8μL，PCR Reverse Primer(10μM)0.8μL，ROX Reference DyeII 0.4μL，cDNA 1μL；RNase-free dH2O 7μL，总体积20μL。
实验过程均在冰上进行，每个样品设3个重复，混合样品时，均不能产生气泡。
实时荧光定量PCR反应程序如下：
荧光定量PCR扩增程序：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火34s，40个循环；为分析扩增产物的特异性，PCR扩增结束后采集多个信息点进行溶解曲线分析，程序为：95℃15s，60℃1min；95℃15s，60℃15s。
6..数据处理与统计分析
采用SPSS16.0计算重复样品间Ct均值以及标准偏差，采用2-△△Ct方法处理数据，2-△△Ct表示实验组目的基因的表达相对于对照组变化的倍数分析基因相对表达差异量。△Ct＝Ct(目的基因)-Ct(内参基因)(Ct值即每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数)；湖羊同月龄同组织不同性别比较中△△Ct＝△Ct(公)-△Ct(母)；湖羊同性别同组织不同月龄比较中△△Ct＝△Ct(其他月龄)-△Ct(二日龄)；同月龄同性别不同组织比较中△△Ct＝△Ct(其他肌肉组织)-△Ct(背最长肌)。湖羊同月龄同组织不同性别的比较用t检验进行显著性分析，湖羊同性别同月龄不同肌肉组织间的比较以及同组织同性别不同月龄间的比较采用单因素方差分析(ANOVA)进行显著性分析，在分析时均以二日龄母羊背最长肌为参照。
7.结果分析
8.(1)Lats1基因在湖羊肌肉中的时空表达分析
由图2可知，Lats1基因在腓肠肌中相对表达量最高，在背最长肌相对表达量最低。二日龄公羊、二月龄公羊的各个肌肉组织相对表达量均不存在显著性差异，二日龄母羊、二月龄母羊、六月龄公羊、六月龄公羊个肌肉组织相对表达量均存在显著或极显著差异。
由图3可知，湖羊Lats1基因在不同生长阶段的相对表达量呈现出：二日龄相对表达量>六月龄相对表达量>二月龄相对表达量(除了公羊背最长肌)。湖羊Lats1基因在不同生长阶段的相对表达量除了母羊腓肠肌差异不显著外，其他均存在差异显著或极显著。
由图4可知，二日龄公羊各肌肉组织的相对表达量均高于二日龄母羊的相对表达量。二月龄、六月龄整体上呈现出母羊的相对表达量高于公羊的相对表达量。除了二日龄背最长肌、六月龄背最长肌、六月龄比目鱼肌、六月龄腓肠肌公母之间存在显著或极显著差异外，其他均不存在显著性差异。
(2)Lats1与YAP1、MyHC Ⅰ、MyHCⅡA、MyHCⅡX、MSTN、MyoG基因表达的关联分析
表2 Lats1与YAP1、MyHC Ⅰ、MyHCⅡA、MyHCⅡX、MSTN、MyoG基因在二日龄不同组织间表达的相关分析
| 指标 | Lats1 | YAP1 | MyHC Ⅰ | MyHCⅡA | MyHCⅡX | MSTN | MyoG |
| Lats1 | 1 | 0.087 | 0.084 | -0.004 | -0.010 | -0.090 | 0.017 |
| YAP1 | 0.087 | 1 | 0.149 | 0.022 | 0.002 | 0.259* | 0.441** |
| MyHC Ⅰ | 0.084 | 0.149 | 1 | -0.846** | -0.849** | -0.509** | 0.535** |
| MyHCⅡA | -0.004 | 0.022 | -0.864* | 1 | 0.965** | 0.632** | -0.362** |
| MyHCⅡX | -0.010 | 0.002 | -0.849** | 0.965** | 1 | 0.675** | -0.316** |
| MSTN | -0.090 | 0.259* | -0.509** | 0.632** | 0.675** | 1 | 0.163 |
| MyoG | 0.017 | 0.441** | 0.535** | -0.362** | -0.316** | 0.163 | 1 |
由表2可知，在二日龄的不同肌肉组织中，Lats1基因的表达与YAP1、MyHC Ⅰ、MyoG的表达呈现不显著正相关，与MyHCⅡA、MyHCⅡX、MSTN呈现不显著负相关(P＞0.05)；YAP1基因的表达与MSTN存在显著正相关(P＜0.05)，与MyoG存在极显著正相关(P＜0.01)，与MyHC Ⅰ、MyHCⅡA、MyHCⅡX的表达呈现不显著正相关(P＞0.05)；MyHC I与MyHCⅡA、MyHCⅡX、MSTN存在极显著负相关(P＜0.01)，与MyoG存在极显著正相关(P＜0.01)；MyHCⅡA与MyHCⅡX、MSTN存在极显著正相关(P＜0.01)，与MyoG存在极显著负相关(P＜0.01)；MyHCⅡX与MSTN存在极显著正相关(P＜0.01)，与MyoG存在极显著负相关(P＜0.01)；MSTN与MyoG呈现不显著正相关(P＞0.05)。
表3 Lats1与YAP1、MyHC Ⅰ、MyHCⅡA、MyHCⅡX、MSTN、MyoG基因在二月龄不同组织间表达的相关分析
| 指标 | Lats1 | YAP1 | MyHC Ⅰ | MyHCⅡA | MyHCⅡX | MSTN | MyoG |
| Lats1 | 1 | 0.272* | 0.142 | -0.045 | 0.004 | 0.155 | 0.207 |
| YAP1 | 0.272* | 1 | 0.563* | 0.101 | 0.256* | 0.369** | 0.406** |
| MyHC Ⅰ | 0.142 | 0.563** | 1 | -0.368** | -0.390** | -0.268* | 0.209 |
| MyHCⅡA | -0.045 | 0.101 | -0.368** | 1 | 0.882** | 0.763** | -0.336** |
| MyHCⅡX | 0.004 | 0.256* | -0.390** | 0.882** | 1 | 0.930** | -0.032 |
| MSTN | 0.155 | 0.369** | -0.268* | 0.763** | 0.930** | 1 | 0.129 |
| MyoG | 0.207 | 0.406** | 0.209 | -0.336** | -0.032 | 0.129 | 1 |
由表3可知，在二月龄的不同肌肉组织中，Lats1基因的表达与YAP1存在显著正相关(P＜0.05)，与MyHC Ⅰ、MyHCⅡX、MSTN、MyoG呈现不显著正相关(P＞0.05)，与MyHCⅡA呈现不显著负相关(P＞0.05)；YAP1与MyHC I、MyHCⅡX存在显著正相关(P＜0.05)，与MSTN、MyoG存在极显著正相关(P＜0.01)，与MyHC IIA呈现不显著正相关(P＞0.05)；MyHC Ⅰ与MyHCⅡA、MyHCⅡX存在极显著负相关(P＜0.01)，与MSTN存在显著负相关(P＜0.05)，与MyoG呈现不显著正相关(P＞0.05)；MyHCⅡA与MyHCⅡX、MSTN存在极显著正相关(P＜0.01)，与MyoG存在极显著负相关(P＜0.01)；MyHCⅡX与MSTN存在极显著正相关(P＜0.01)，与MyoG呈现不显著负相关(P＞0.05)；MSTN与MyoG呈现不显著正相关(P＞0.05)。
表4 Lats1与YAP1、MyHC Ⅰ、MyHCⅡA、MyHCⅡX、MSTN、MyoG基因在六月龄不同组织间表达的相关分析
| 指标 | Lats1 | YAP1 | MyHC Ⅰ | MyHCⅡA | MyHCⅡX | MSTN | MyoG |
| Lats1 | 1 | 0.591** | 0.319** | 0.141 | 0.165 | 0.152 | 0.648** |
| YAP1 | 0.591** | 1 | 0.235* | 0.230 | 0.263* | 0.300* | 0.474* |
| MyHC Ⅰ | 0.319** | 0.235* | 1 | -0.478** | -0.574** | -0.424** | 0.362** |
| MyHCⅡA | 0.141 | 0.230 | -0.478** | 1 | 0.923** | 0.885** | -0.302* |
| MyHCⅡX | 0.165 | 0.263* | -0.574** | 0.923** | 1 | 0.900** | -0.163 |
| MSTN | 0.152 | 0.300* | -0.424** | 0.885** | 0.900** | 1 | -0.197 |
| MyoG | 0.648** | 0.474** | 0.362** | -0.302* | -0.163 | -0.197 | 1 |
由表4可知，在六月龄的不同肌肉组织中，Lats1基因的表达与YAP1、MyHC Ⅰ、MyoG存在极显著正相关(P＜0.01)，与MyHCⅡA、MyHCⅡX、MSTN呈现不显著正相关(P＞0.05)；YAP1与MyHC Ⅰ、MyHCⅡX、MSTN、MyoG存在显著正相关(P＜0.05)，与MyHCⅡA呈现不显著正相关；MyHC Ⅰ与MyHCⅡA、MyHCⅡX、MSTN存在极显著负相关(P＜0.01)，与MyoG存在极显著正相关(P＜0.01)；MyHCⅡA与MyHCⅡX、MSTN存在极显著正相关(P＜0.01)，与MyoG存在显著负相关(P＜0.05)；MyHCⅡX与MSTN存在极显著正相关(P＜0.01)，与MyoG呈现不显著负相关(P＜0.05)；MSTN与MyoG呈现不显著负相关(P＞0.05)。
表5 Lats1与YAP1、MyHC Ⅰ、MyHCⅡA、MyHCⅡX、MSTN、MyoG基因在背最长肌不同生长阶段间表达的相关分析
| 指标 | Lats1 | YAP1 | MyHC Ⅰ | MyHCⅡA | MyHCⅡX | MSTN | MyoG |
| Lats1 | 1 | -0.166 | -0.026 | 0.051 | -0.181 | 0.089 | 0.131 |
| YAP1 | -0.166 | 1 | 0.439** | 0.240 | 0.429** | 0.506** | 0.323* |
| MyHC Ⅰ | -0.026 | 0.439** | 1 | 0.861** | 0.744** | 0.355** | 0.428** |
| MyHCⅡA | 0.051 | 0.240 | 0.861** | 1 | 0.685** | 0.134 | 0.429** |
| MyHCⅡX | -0.181 | 0.429** | 0.744** | 0.685** | 1 | 0.374** | 0.538** |
| MSTN | 0.089 | 0.506** | 0.355** | 0.134 | 0.374** | 1 | 0.246 |
| MyoG | 0.131 | 0.323* | 0.428** | 0.429** | 0.538** | 0.246 | 1 |
由表5可知，在背最长肌的不同生长阶段中，Lats1的表达与YAP1、MyHC Ⅰ、MyHCⅡX呈现不显著负相关(P＞0.05)，与MyHCⅡA、MSTN、MyoG呈现不显著正相关(P＞0.05)；YAP1与MyHC Ⅰ、MyHCⅡX、MSTN存在极显著正相关(P＜0.01)，与MyoG存在显著正相关(P＜0.05)，与MyHCⅡA呈现不显著正相关(P＞0.05)；MyHC Ⅰ与MyHCⅡA、MyHCⅡX、MSTN、MyoG存在极显著正相关(P＜0.01)；MyHCⅡA与MyHCⅡX、MyoG存在极显著正相关(P＜0.01)，与MSTN呈现不显著正相关(P＞0.05)；MyHCⅡX与MSTN、MyoG存在极显著正相关(P＜0.01)；MSTN与MyoG呈现不显著正相关(P＞0.05)。
表6 Lats1与YAP1、MyHC Ⅰ、MyHCⅡA、MyHCⅡX、MSTN、MyoG基因在比目鱼肌不同生长阶段间表达的相关分析
| 指标 | Lats1 | YAP1 | MyHC Ⅰ | MyHCⅡA | MyHCⅡX | MSTN | MyoG |
| Lats1 | 1 | -0.107 | 0.371** | 0.191 | -0.110 | 0.140 | 0.534** |
| YAP1 | -0.107 | 1 | -0.153 | -0.157 | 0.124 | 0.402** | 0.322* |
| MyHC Ⅰ | 0.371** | -0.153 | 1 | 0.553** | 0.219 | 0.311* | 0.336* |
| MyHCⅡA | 0.191 | -0.157 | 0.553** | 1 | 0.733** | 0.176 | 0.323* |
| MyHCⅡX | -0.110 | 0.124 | 0.219 | 0.733** | 1 | 0.133 | 0.297* |
| MSTN | 0.140 | 0.402** | 0.311* | 0.176 | 0.133 | 1 | 0.622** |
| MyoG | 0.534** | 0.322* | 0.336* | 0.323* | 0.297* | 0.622** | 1 |
由表6可知，在比目鱼肌的不同生长阶段中，Lats1的表达与YAP1、MyHCⅡX呈现不显著负相关(P＞0.05)，与MyHC Ⅰ、MyoG存在极显著正相关(P＜0.01)，与MyHCⅡA、MSTN呈现不显著正相关(P＞0.05)；YAP1与MyHC Ⅰ、MyHCⅡA呈现不显著负相关(P＞0.05)，与MyHCⅡX呈现不显著正相关(P＞0.05)，与MSTN存在极显著正相关(P＜0.01)，与MyoG存在显著正相关(P＞0.05)；MyHC Ⅰ与MyHCⅡA存在极显著正相关(P＜0.01)，与MyHCⅡX呈现不显著正相关(P＞0.05)，与MSTN、MyoG存在显著正相关(P＜0.05)；MyHCⅡA与MyHCⅡX存在极显著正相关(P＜0.01)，与MSTN呈现不显著正相关(P＞0.05)，与MyoG存在显著正相关(P＜0.05)；MyHCⅡX与MSTN呈现不显著正相关(P＞0.05)，与MyoG存在显著正相关(P＜0.05)；MSTN与MyoG存在极显著正相关(P＜0.01)。
表7 Lats1与YAP1、MyHC Ⅰ、MyHCⅡA、MyHCⅡX、MSTN、MyoG基因在腓肠肌不同生长阶段间表达的相关分析
| 指标 | Lats1 | YAP1 | MyHC Ⅰ | MyHCⅡA | MyHCⅡX | MSTN | MyoG |
| Lats1 | 1 | 0.034 | 0.353* | -0.239 | -0.148 | -0.257 | 0.347* |
| YAP1 | 0.034 | 1 | -0.481** | 0.646** | 0.683** | 0.652** | -0.050 |
| MyHC Ⅰ | 0.353* | -0.481** | 1 | -0.814** | -0.865** | -0.768** | 0.347* |
| MyHCⅡA | -0.239 | 0.646** | -0.814** | 1 | 0.930** | 0.837** | -0.282* |
| MyHCⅡX | -0.148 | 0.683** | -0.865** | 0.930** | 1 | 0.921** | -0.258 |
| MSTN | -0.257 | 0.652** | -0.768** | 0.837** | 0.921** | 1 | -0.221 |
| MyoG | 0.347* | -0.050 | 0.347* | -0.282* | -0.258 | -0.221 | 1 |
由表7可知，在腓肠肌的不同生长阶段中，Lats1的表达与YAP1呈现不显著正相关(P＞0.05)，与MyHCⅡA、MyHCⅡX、MSTN呈现不显著负相关(P＞0.05)，与MyHC Ⅰ、MyoG存在显著正相关(P＜0.05)；YAP1与MyHC Ⅰ存在极显著负相关(P＜0.01)，与MyHCⅡA、MyHCⅡX、MSTN存在极显著正相关(P＜0.01)，与MyoG呈现不显著负相关(P＞0.05)；MyHC Ⅰ与MyHCⅡA、MyHCⅡX、MSTN存在极显著负相关(P＜0.01)，与MyoG存在显著正相关(P＜0.05)；MyHCⅡA与MyHCⅡX、MSTN存在极显著正相关(P＜0.01)，与MyoG存在极显著负相关(P＜0.01)；MyHCⅡX与MSTN存在极显著正相关(P＜0.01)，与MyoG呈现不显著负相关(P＞0.05)；MSTN与MyoG呈现不显著负相关(P＞0.05)。
表8 Lats1与YAP1、MyHC Ⅰ、MyHCⅡA、MyHCⅡX、MSTN、MyoG基因在趾长伸肌不同生长阶段间表达的相关分析
| 指标 | Lats1 | YAP1 | MyHC Ⅰ | MyHCⅡA | MyHCⅡX | MSTN | MyoG |
| Lats1 | 1 | 0.259 | 0.186 | 0.600** | 0.516** | 0.204 | 0.230 |
| YAP1 | 0.259 | 1 | 0.070 | 0.309* | 0.394** | 0.535** | 0.312* |
| MyHC Ⅰ | 0.186 | 0.070 | 1 | 0.475** | 0.219 | -0.040 | 0.333* |
| MyHCⅡA | 0.600** | 0.309* | 0.475** | 1 | 0.619** | 0.034 | 0.092 |
| MyHCⅡX | 0.516** | 0.394** | 0.219 | 0.619** | 1 | 0.223 | 0.330* |
| MSTN | 0.204 | 0.535** | -0.040 | 0.034 | 0.223 | 1 | 0.298* |
| MyoG | 0.230 | 0.312* | 0.333* | 0.092 | 0.330* | 0.298* | 1 |
由表8可知，在趾长伸肌的不同生长阶段中，Lats1的表达与YAP1、MyHC Ⅰ、MSTN、MyoG呈现不显著正相关(P＞0.05)，与MyHCⅡA、MyHCⅡX存在极显著正相关(P＜0.01)；YAP1与MyHC Ⅰ呈现不显著正相关(P＞0.05)，与MyHCⅡA、MyoG存在显著正相关(P＜0.05)，与MyHCⅡX、MSTN存在极显著正相关(P＜0.01)；MyHC Ⅰ与MyHCⅡA存在极显著正相关(P＜0.01)，与MyHCⅡX呈现不显著正相关(P＞0.05)，与MSTN呈现不显著负相关(P＞0.05)，与MyoG存在显著正相关(P＜0.05)；MyHCⅡA与MyHCⅡX存在极显著正相关(P＜0.01)，与MSTN、MyoG呈现不显著正相关(P＞0.05)；MyHCⅡX与MSTN呈现不显著正相关(P＞0.05)，与MyoG存在显著正相关(P＜0.05)；MSTN与MyoG存在显著正相关(P＜0.05)。
Claims (8)
1.Lats1基因作为湖羊产肉性状的分子标记的应用。
2.一种验证Lats1基因作为湖羊产肉性状的分子标记的方法，其特征在于：通过检测Lats1基因与湖羊肌肉生长性状的相关性来验证Lats1基因能够作为湖羊产肉性状的分子标记：首先分析Lats1基因在湖羊不同生长阶段、不同组织和不同性别的表达特性，继而分析Lats1与其它六个肌肉生长和肌纤维有关的主效基因YAP1基因、MyHC Ⅰ基因、MyHC Ⅱ A基因、MyHC Ⅱ X基因、MSTN基因和MyoG基因的相关性，从而证明Lats1基因能够作为湖羊产肉性状的分子标记。
3.根据权利要求2所述的一种验证Lats1基因作为湖羊产肉性状的分子标记的方法，其特征在于：其具体方法步骤如下：
(1)选择初生期、断奶期和成熟期三个阶段的公湖羊和母湖羊作为试验动物；对每个阶段的湖羊选取饲养条件相同、生长发育良好、体重相近的湖羊进行屠宰，并分别采每个阶段湖羊的集背最长肌、比目鱼肌、腓肠肌、趾长伸肌四种肌肉组织于液氮罐保存，然后转移至冰箱冷冻保存；
(2)根据GenBank已公布的7种基因和内参基因18S的CDS区序列，设计实时荧光定量PCR引物并合成引物：
(3)分别提取在冰箱中冷冻保存的三个阶段的试验动物湖羊的四种肌肉组织，即集背最长肌、比目鱼肌、腓肠肌、趾长伸肌组织的各自的总RNA，并通过反转录技术合成cDNA，以合成的三个阶段四种不同肌肉组织样品的cDNA为模板，根据所设计的基因引物对不同肌肉组织的表达量分别进行荧光定量分析；
(4)分析Lats1与其它六个肌肉生长和肌纤维有关的主效基因YAP1、MyHC Ⅰ、MyHC Ⅱ A、MyHC Ⅱ X、MSTN和MyoG的相关性。
4.根据权利要求3所述的一种验证Lats1基因作为湖羊产肉性状的分子标记的方法，其特征在于：步骤(3)中提取总RNA所采用的方法是Trizol法。
5.根据权利要求3所述的一种验证Lats1基因作为湖羊产肉性状的分子标记的方法，其特征在于：步骤(3)中通过反转录技术合成cDNA的反应体系为：总RNA 4μL(微升)；OligodT 0.5μL；Random6 mers 0.5μL；PrimerScript Buffer 2μL；PrimerScript RT Enzyme Mix I0.5μL；RNase free H2O 2.5uL总体积10uL；合成cDNA的反应条件为：将PCR管置于PCR仪中进行反应，37℃反应15min后，85℃变性5s。
6.根据权利要求3所述的一种验证Lats1基因作为湖羊产肉性状的分子标记的方法，其特征在于：步骤(3)中所述的荧光定量分析的PCR反应体系为：SYBR Green Realtime PCR MasterMix 10μL，PCR上游引物(10μM)0.8μL，PCR下游引物(10μM)0.8μL，ROX Reference DyeII0.4μL，cDNA 1μL；RNase-free dH2O 7μL，总体积20μL；PCR扩增程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火34s，40个循环。
7.根据权利要求6所述的一种验证Lats1基因作为湖羊产肉性状的分子标记的方法，其特征在于：步骤(3)中所述的荧光定量分析的PCR扩增程序结束后还进行溶解曲线分析，所述的溶解曲线分析的程序为：95℃15s，60℃1min；95℃15s，60℃15s。
8.根据权利要求3所述的一种验证Lats1基因作为湖羊产肉性状的分子标记的方法，其特征在于：步骤(4)中采用SPSS16.0计算重复样品间Ct均值以及标准偏差，采用2-△△Ct方法处理数据。
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