KR20230031343A - 혼합된 리포터를 사용하는 핵산의 멀티플렉스 검출 - Google Patents

혼합된 리포터를 사용하는 핵산의 멀티플렉스 검출 Download PDF

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엘리슨 벨리안 토드
니콜 제인 하식
령 래 김
안드레아 리 로렌스
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스피디엑스 피티와이 리미티드
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Abstract

본 발명은 표적 핵산의 검출 및/또는 차별에서 올리고뉴클레오티드 및 그들의 사용 방법을 제공한다. 올리고뉴클레오티드 및 방법은 동시에 여러 표적 증폭, 검출, 및/또는 구별에서 특정한 적용을 찾는다.

Description

혼합된 리포터를 사용하는 핵산의 멀티플렉스 검출
기술 분야
본 발명은 일반적으로 분자 생물학의 분야에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 표적 핵산의 검출 및/또는 차별에서 올리고뉴클레오티드 및 그들의 사용 방법을 제공한다. 올리고뉴클레오티드 및 방법은 동시에 여러 표적 증폭, 검출, 구별 및/또는 정량화에서 특정한 적용을 찾는다.
배경
유전적 분석은 질환 위험 평가, 질환의 진단, 요법에 대한 환자의 예후 또는 반응 예측, 그리고 환자의 진행 모니터링을 위하여 임상에서 일상적이 되고 있다. 이러한 유전적 검사의 도입은 유전적 변이를 구별하기 위하여 간단한, 저렴한, 및 신속한 검정의 개발에 의존한다.
시험관내 핵산 증폭의 방법은 유전학 및 질환 진단에서 광범위하게 적용된다. 이러한 방법은 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR), 역전사 폴리머라제 연쇄 반응 (RT-PCR), 가닥 변위 증폭 (SDA), 니킹 효소 증폭 반응 (NEAR), 헬리카제 의존적 증폭 (HDA), 리콤비나제 폴리머라제 증폭 (RPA), 루프-매개 등온 증폭 (LAMP), 회전 환 증폭 (RCA), 전사-매개 증폭 (TMA), 자가-지속 서열 복제 (3SR), 핵산 서열 기반된 증폭 (NASBA), 리가제 연쇄 반응 (LCR) 또는 분지화 증폭 방법 (RAM)을 포함한다. 이들 표적 증폭 전략의 각각은 올리고뉴클레오티드 프라이머(들)의 사용을 필요로 한다. 증폭의 과정은 그들의 5' 말단에서 올리고뉴클레오티드 프라이머를 통합하는 그리고 프라이머들 사이 위치해 있는 서열의 새롭게 합성된 카피를 함유하는 앰플리콘의 기하급수적 증폭을 초래한다.
실시간으로, 또는 증폭의 끝에 앰플리콘의 축적을 모니터링하기 위하여 흔히 사용된 방법은 범용 기질 프로브, 표적-특이적 분자성 비콘, 슬로피 비콘, 이클립스 프로브, TaqMan 프로브 또는 가수분해 프로브, 스콜피온 유니-프로브 또는 비-프로브, 캐처/피처 프로브, 이중 혼성화 프로브 및/또는 인터칼레이팅 염료 예컨대 SybGreen과 MNA자임을 이용하는 검출을 포함한다. 고해상도 용융 곡선 분석이 이들 프로토콜의 몇몇의 끝에 또는 동안에 수행되어 추가의 정보를 수득할 수 있는 것은 상이한 서열이 있는 앰플리콘이 용융 온도 또는 Tm으로서 알려진, 상이한 온도에서 변성하기 때문이다. 이러한 프로토콜은 어느 한쪽 a) 인터칼레이팅 염료의 존재 하에서 이중 가닥 앰플리콘의 2개 가닥의 분리, 또는 b) 앰플리콘의 1개 가닥 그리고 형광단 및 퀀처로 표지된 상보적 표적-특이적 프로브의 분리 또는 c) 비-표적 관련된 듀플렉스, 예를 들어, 표적의 존재 하에서 단지 생성되는 캐처 듀플렉스의 분리에서 비롯하는 용융 곡선을 측정한다. 용융 곡선 분석은 가열 동안 2개 DNA 가닥의 해리 동역학에 대한 정보를 제공한다. 용융 온도 (Tm)는 DNA의 50%가 해리되는 온도이다. Tm은 짝짓기된 뉴클레오티드의 길이, 서열 조성 및 G-C 함량에 의존적이다. 용융 곡선 분석으로부터 표적 DNA에 대한 정보의 해명은 전형적으로 넓은 온도 범위에 걸쳐, 작은 간격으로 획득된 일련의 형광 측정을 관례적으로 포함한다. 용융 온도는 염기 서열에 단지 의존하지 않는다. 용융 온도는 올리고뉴클레오티드의 농도, 완충액에서 양이온 (양쪽 1가 (Na+) 및 2가 (Mg2+) 염), 및/또는 탈안정화 제제 예컨대 요소 또는 포름아미드의 존재 또는 부재를 포함하는 많은 인자에 의해 영향받을 수 있다.
일반적으로, 별개 파장을 모니터링할 수 있는 이용가능한 형광성 채널의 수는 형광성 판독기에서 단일 반응으로 검출 및 구체적으로 식별될 수 있는 표적의 수를 제한시킨다. 최근, "태깅 올리고뉴클레오티드 절단 및 확장" (TOCE)으로서 알려진 프로토콜은 여러 표적이 단일 파장에서 분석되게 하는 이 능력을 확대시킨다. TOCE 기술은 피처 및 캐처 올리고뉴클레오티드를 사용한다. 피처는 2개 영역, 표적에 상보적인 표적화 부분, 및 비-상보적이고 5' 단부에 위치해 있는 태깅 부분을 갖는다. 포착 올리고뉴클레오티드는 이중 표지되고 피처의 태깅 부분에 상보적인 이의 3' 단부에서 한 영역을 갖는다. 증폭 동안, 피처는 앰플리콘에 결합하고 프라이머가 확장하는 때 폴리머라제의 엑소뉴클레아제 활성은 태깅 부분을 피처로부터 절단시킬 수 있다. 방출된 태깅 부분은 그 다음 캐처 올리고뉴클레오티드에 결합하고 프라이머로서 기능하여 상보적 가닥을 합성시킨다. 이중 가닥 캐처 분자의 용융 온도 (캐처-Tm)는 그 다음 원래 템플레이트에 대하여 대리 마커의 역할을 한다. 상이한 서열 및 길이가 있는 다중 캐처를 통합하고, 이들 모두가 상이한 온도에서 용융하는 것이 가능하므로, 단일 파장에서 여전히 측정하면서 일련의 표적을 나타내는 일련의 캐처-Tm 값을 수득하는 것이 가능하다. 이 접근법을 이용한 한계는 인공 표적 상에서 제2 확장을 개시 및 완료하기 위해 방출된 단편을 필요로 함에 따라 내재적 복잡성을 포함하고 여러 표적의 증폭후 분석은 각 특정 표적에 관련된 신호의 분율을 차별화 또는 정량화하기 위해 복잡한 알고리즘을 필요로 한다.
헤어핀 프로브 또는 스템-루프 프로브는 핵산의 검출 및/또는 표적 증폭 모니터링을 위한 유용한 도구로 또한 증명되었다. 형광단 및 퀀처 염료 쌍으로 이중 표지되는, 헤어핀 프로브의 1개 유형은 당업계에서 분자성 비콘으로서 흔히 알려진다. 일반적으로, 이들 분자는 3개 속성; 1) 올리고뉴클레오티드의 상보적 5' 및 3' 단부의 혼성화에 의해 형성된 스템 구조; 2) 검출되어야 하는 표적, 또는 표적 앰플리콘에 상보적인 루프 영역; 및 3) 분자성 비콘의 말단에 부착된 형광단 퀀처 염료 쌍을 갖는다. PCR 동안, 루프 영역은 상보성으로 인해 앰플리콘에 결합하고 이것은 스템을 개방시키고 그래서 형광단 퀀처 염료 쌍을 분리시킨다. 분자성 비콘의 필수적 속성은 이들 분자의 루프 영역이 증폭 동안 온전하게 유지되고 표적 또는 표적 앰플리콘의 존재 하에서 분해되거나 절단되지 않는다는 것이다. 개방 분자성 비콘의 말단 상에서 부착된 염료 쌍의 분리는 표적의 존재를 나타내는 형광에서의 변화를 야기시킨다. 본 방법은 단일 PCR 검사에서 여러 표적의 멀티플렉스 분석에 흔히 사용된다. 일반적으로 멀티플렉스 분석의 경우, 각 분자성 비콘은 상이한 표적-특이적 루프 영역 및 고유한 형광단을 가져서, 각 앰플리콘 종에 각 상이한 분자성 비콘의 혼성화는 별도 채널에서 즉 별도 파장에 모니터링될 수 있다.
분자성 비콘의 개념은 슬로피 비콘으로서 알려진 전략에서 확장되었다. 이 프로토콜에서 단일 비콘의 루프 영역은 미스매칭된 염기를 허용할 수 있고 따라서 하나 이상의 뉴클레오티드에 의해 달라지는 다수의 밀접하게 관련된 표적에 결합할 수 있도록 충분히 길다. 증폭 이후, 용융 곡선 분석은 수행되고 상이한 표적 종은 슬로피 비콘의 루프 영역과 표적 종의 혼성화에 의해 형성된 듀플렉스의 각각이 분리 (용융)하는 온도에 기반하여 차별될 수 있다. 이러한 식으로 여러 밀접하게 관련된 종은 단일 파장에서 검출될 수 있고 단일 슬로피 비콘으로 특정 표적의 용융 프로파일을 특성규명함으로써 동시에 구별될 수 있다. 표준 분자성 비콘 및 슬로피 비콘은 이들이 증폭 동안 분해 또는 절단되도록 의도되지 않는다는 점에서 TaqMan 및 가수분해 프로브와 상이하다. DNA 혼성화-기반 기술 예컨대 슬로피 비콘 및 TOCE의 단점은 이들이 프로브와 비-표적 핵산 서열 사이 비-특이적 혼성화로 인해 위양성 결과를 낳을 수 있다는 것이다.
많은 핵산 검출 검정은 용융 곡선 분석을 활용하여 어느 한쪽 주어진 샘플에서 특정 표적 서열의 존재를 식별하거나 증폭된 서열에 대한 정보를 해명한다. 용융 곡선 분석 프로토콜은 점진적으로 증가하는 온도 범위에 걸쳐 다양한 온도에서 형광 측정을 수반한다. 이 곡선의 경사에서의 변화는 그 다음 온도의 함수로서 플롯팅되어 용융 곡선을 수득한다. 이 과정은 종종 느리고 전형적으로 어디든지 완료하는데 30-60 분 걸린다. 더욱이, 용융 곡선 분석은 숙련된 인력에 의한 해석 및/또는 결과 해석을 위한 전문화된 소프트웨어의 사용을 요구할 수 있다. 따라서, 용융 곡선 분석에 대한 더 빠른 및/또는 더 간단한 대안이 많이 요구된다.
용융 곡선은 PCR후 전형적으로 분석되고 그러므로 샘플에서 표적의 존재 또는 부재의 정성적 결정을 단지 허용한다. 많은 경우에, 샘플에서 존재하는 게놈성 물질의 양의 정량적, 또는 절반-정량적 결정이 요구된다. 그러므로, 샘플에 대한 정량적 정보를 또한 제공하는 용융 곡선 분석에 대한 신속한 대안이 많이 요구된다.
PCR에 의해 또는 대안적 표적 증폭 프로토콜에 의해 생성된 여러 고유한 앰플리콘의 동시 검출, 차별, 및/또는 정량화를 위한 개선된 조성물 및 방법에 대한 필요성이 실재한다.
발명의 개요
본 발명은 현행 멀티플렉스 검출 검정에서 실재하는 하나 이상의 결함을 다룬다.
증폭 프로토콜 동안 멀티플렉싱하는 능력을 확장시키는 방법 및 조성물이 본원에 제공된다. 이들 방법은, 본원에 LOCS (스템에 연결된 루프)로서 지칭된 구조(들)와 함께, 당업계에서 잘 알려진 기질 및 프로브를 포함하는, "표준 리포터"를 조합시킨다. 표준 리포터는, 비제한적으로, 선형 MNA자임 기질, TaqMan 프로브 또는 가수분해 프로브, 분자성 비콘, 슬로피 비콘, 이클립스 프로브, 스콜피온 유니-프로브 또는 비-프로브, 포착/피처 올리고뉴클레오티드, 및 이중-혼성화 프로브를 포함하는 프로브 및 기질을 포함한다. 모든 종이, 예를 들어, 단일 검출 모이어티 (예를 들면 동일한 형광단 및 퀀처 쌍)로 표지될 수 있는 하나 이상의 LOCS와 함께, 표준 리포터 시스템의 조합은 여러 표적이 단일 반응 내에서 개별적으로 구별되도록 한다. 본 접근법은 하나 이상의 온도에서 "표준 리포터" 및 하나 이상의 LOCS로부터 생성된 신호의 측정을 포함한다. LOCS로부터 신호의 생성은 다음 중 어느 하나 이상을 포함하는 몇몇 인자에 의존적일 수 있다:
- 신호가 측정되는 온도;
- LOCS의 루프 부분이 표적의 존재에 반응하여 절단 또는 분해되었는지 여부;
- 이의 "온전한", 또는 이의 절단된 또는 분해된, "분할된" 입체구조에서 특이적 LOCS의 스템 부분의 용융 온도.
분할된 LOCS의 스템 영역의 용융 온도는 온전한 LOCS의 루프의 표적-의존적 절단 또는 분해를 매개하였던 특정 표적에 대하여 대리 마커의 역할을 한다. 스템-루프 구조를 통합하는 다른 방법은 어느 한쪽 (a) 염료 쌍들 사이 거리를 증가시키기 위해 표적 앰플리콘 (예를 들면 분자성 비콘 & 슬로피 비콘)에 루프 영역의 혼성화 이후, 또는 (b) 염료 (예를 들면 절단가능한 분자성 비콘)의 물리적 분리를 허용하는 표적-매개 절단에 의해 형광성 신호에서의 변화를 이용하였다. 절단가능한 분자성 비콘은 단일 파장에서 주어진 표적에 대하여 양성 또는 음성 신호를 생성하는데 전형적으로 사용되었다. 멀티플렉스 표적 검출은 일반적으로 상이한 파장에서 방사된 신호를 통해 상이한 표적의 검출을 요구한다. 이와 같이, 유사한 또는 동일한 검출 모이어티로 표지된 그리고 상이한 표적을 검출하도록 설계된 상이한 절단가능한 분자성 비콘에 변이체 스템의 통합은, 표적들 사이 뚜렷한 검출가능한 신호를 이용하는 필요보다는, 스템 용융 온도에서 차이에 기반된 개별 표적을 나타내는 검출가능한 신호들 사이 구별하는 능력을 제공한다.
본 발명은 각 스템이 용융하고 상이한 온도에서 신호를 생성하도록 스템의 길이 및/또는 서열 조성을 변화시킴으로써 스템-루프 구조의 스템 부분의 용융 온도 조작하기를 통해서, 적어도 부분적으로, 발생하는 기존의 멀티플렉스 검출 검정에 대한 개선을 제공한다.
본 발명은 단일 반응에서 단일 LOCS 리포터 또는 다중 LOCS 리포터와 함께 표준 리포터의 사용을 포함할 수 있다. 양쪽 표준 및 LOCS 리포터는 본질적으로 동일한 방식으로 검출될 수 있는 동일한 또는 유사한 검출 모이어티(들) (예를 들면 가시 스펙트럼의 동일한 영역에서 방사하는 형광단, 비색계 또는 SPR 검출을 위한 동일한 크기 및/또는 유형의 나노입자, 화학발광성 검출을 위한 반응성 모이어티 (예를 들면 알칼리성 포스파타제 또는 퍼옥시다제 효소), 전기화학적 검출을 위한 전기활성 종 (예를 들면 페로센, 메틸렌 블루 또는 퍼옥시다제 효소)으로 표지될 수 있다. 다중 LOCS가 존재하고, 예를 들어, 동일한 검출 모이어티로 표지되는 때 이들은 (a) 동시에 여러 표적의 직접 또는 간접 검출을 각각 허용하는 상이한 루프 서열 및/또는 (b) 별개 온도에서 용융하는 그리고 조사 중인 여러 표적 내에서 존재하는 특정 표적(들)을 식별하는데 사용될 수 있는 상이한 스템 서열을 함유할 수 있다. 본 발명의 방법은 기술-알려진 방법 예컨대, 예를 들어, 별도 캐처 분자가 요구되지 않는다는 점에서 TOCE 프로토콜보다 하나 이상의 이점을 제공하는 LOCS를 사용하고, 따라서 이것은 반응 믹스에서 구성요소의 수를 줄이고 비용을 줄인다. 더욱이, 본 발명의 방법은 합성 표적 상에서 제2 확장을 개시 및 완료하기 위해 방출된 단편을 필요로 하는 TOCE 방법보다 내재적으로 덜 복잡하다.
일부 구현예에서, LOCS 프로브는 범용 (표적 서열과 독립적)일 수 있고/거나 다양한 검출 기술과 조합될 수 있고, 그래서 분자성 진단의 분야에서 넓은 적용가능성을 전달할 수 있다. 추가적으로, 다른 종래 증폭 및 검출 기법에서 사용된 용융 온도는 표적 핵산과 프로브의 혼성화 및 용융에 전형적으로 기반된다. 이것은 프로브와 비-표적 핵산 서열 사이 비-특이적 혼성화로 인해 증가된 위-양성의 단점으로 시달린다. 본 발명의 방법이 이 한계를 극복하는 것은 범용 기질을 함유하는 그들 LOCS 리포터 프로브가 표적 서열과 결합하지 않기 때문이다. 마지막으로, 분자내 결합이 분자간 결합보다 강하고 그래서, 이들 절단되지 않은 (온전한) LOCS가 비-특정 표적과 혼성화하여 위-양성 신호를 생산할 가능성이 훨씬 더 낮다는 것은 당업계에 잘-알려진다.
분자간 결합보다 강한 분자내 결합의 결과로서, 이중 표지된 LOCS는 온전한 때 1개 온도에서 용융할 것이고, LOCS를 2개 단편으로 분할하는 루프 영역의 표적-의존적 절단 또는 분해 이후 더 낮은 온도에서 용융할 것이다. 핵산의 이 특성은 단일 유형의 검출기 예컨대 1개 형광 채널, 또는 특정 모드의 비색계, 표면 플라즈몬 공명 (SPR), 화학발광성, 또는 전기화학적 검출을 사용하여 여러 표적을 차별하기 위해 기구의 능력을 확장하기 위해 본 발명에서 이용된다.
본 발명의 LOCS 리포터에 의해 생산된 온도 의존적 형광성 신호는 잘-정의되고 표적 DNA와 독립적이다. 그래서, 완전한 온도 기울기보다는, 선택된 온도에서 생성된 형광성 신호의 측정으로부터 표적 DNA에 대한 정보를 해명하는 것이 가능하여, 열 주기화 장치 (예를 들면 PCR 장치)에서 실행 시간의 축소에서 이점을 제공한다. 비-제한 예로써, Bio-Rad CFX96 PCR 시스템 상에서, 0.5℃ 증분 및 5 초 유지 시간으로 20℃ 내지 90℃ 온도로 설정하는 전통적 용융 분석 실행하기는 141개 형광 측정 주기 및 대략 50 분의 실행 시간을 요구한다. LOCS 프로브의 사용으로, 표적 DNA에 대한 정보는 2-6개 형광 측정이 있는 동일한 장치로부터 수득될 수 있고 대략 2-5 분의 실행 시간을 요구할 수 있다. 임의의 특정 제한 없이, 실행 시간의 축소는, 예를 들어, 진단을 포함하는 수많은 적용에서 유리할 수 있다.
본 발명에서, LOCS 프로브는 표준 리포터 또는 프로브 또는 기질과 조합되어 여러 표적을 동시에 검출, 차별, 및/또는 정량화한다. 다양한 표적을 나타내는 개별 신호는 동일한 수단에 의해 예컨대, 예를 들어, 단일 형광성 채널에서 방사하는 신호를 통해 검출가능할 수 있거나 특정 모드의 비색계, 표면 플라즈몬 공명 (SPR), 화학발광성, 또는 전기화학적 검출에 의해 검출가능할 수 있다. 종래 qPCR에서, 표적 DNA의 정량화는 각 증폭 주기에 단일 온도에서 형광을 측정함으로써 수득된 증폭 곡선으로부터 주기 정량화 (Cq) 값을 사용하여 결정될 수 있다. Cq 값은 표적 DNA의 농도의 음의 대수 값에 비례하고, 그러므로 실험적으로 결정된 Cq 값으로부터 농도를 결정하는 것이 가능하다. 하지만, 프로브/들이 신호에 기여하고 있는지를 식별하기 어려움에 따라 단일 채널에서 1개 초과 표적-특이적 프로브가 있는 경우 각 표적을 올바르게 정량화하는 것은 도전적이다. 이 문제를 해결하기 위해, LOCS 리포터는 증폭 동안 1개 초과 온도에서 형광을 측정함으로써 수득된 증폭 곡선을 생성함으로써 단일 채널에서 1개 초과 표적의 올바른 및 구체적 정량화를 하는데 사용될 수 있다. 이것은 LOCS 리포터가 상이한 온도에서 상당히 상이한 양의 형광을 생산할 수 있기 때문에 가능하다. 더욱이, LOCS 리포터는, 실시간으로 제1 온도에서 (표적 1), 그리고 증폭 이전 및 이후 제2 온도에서 (표적 2) 형광을 획득함으로써, 제1 표적의 올바른 및 구체적 정량화, 그리고 단일 채널에서 제2 표적의 동시 정성적 검출을 하는데 사용될 수 있다. 후자 시나리오의 이점은 증폭 프로토콜의 전반적 실행-시간에 영향을 미치지 않고 분석을 위한 전문화된 소프트웨어를 요구하지 않을 수 있다는 것이다. 이 접근법은 정량화 또는 Cq 결정이 표적들 중 1개에 대하여 단지 요구되는 시나리오에서 유용할 수 있다.
분석이 PCR 내에 제한된 수의 시점에서, 예를 들어 증폭의 시작에서 또는 근처에서 그리고 증폭 이후 종점에서 형광성 획득을 단지 요구하는 일부 구현예에서, LOCS 구조 사용하기는 각 주기에 획득에 대한 필요를 제거한다. 이와 같이, 이들 구현예는 결과에 이르는 시간을 단축시킬 수 있는 매우 신속한 주기화 프로토콜에 매우 적합하다.
위에서 언급된 대로, 용융 곡선 분석 프로토콜은 점진적으로 증가하는 온도 범위 (예를 들면 30℃ 내지 90℃)에 걸쳐 다양한 온도에서 형광 측정하기를 수반한다. 이 곡선의 경사에서의 변화는 그 다음 온도의 함수로서 플롯팅되어 용융 곡선을 수득할 수 있다. 이 과정은 종종 느리고, 예를 들어, 어디든지 완료하는데 30-60 분 걸릴 수 있다. 용융 곡선 분석의 스피드 증가하기는 고도로 전문화된 계측에 대한 접근을 요구하고 표준 PCR 장치를 사용하여 성취될 수 있다. 그래서, 표준 계측을 사용하여 단일 형광 채널에서 여러 표적의 동시 검출을 제공할 수 있는 용융 곡선 분석에 대한 더욱 신속한 대안이 많이 필요하다. 본 발명의 LOCS 구조의 용융 온도 (Tm)는 사전-결정되고 주어진 실험적 조건에 대하여 일정하고 (즉 표적 서열 또는 농도에 영향받지 않고), 그러므로 전체 온도 기울기를 통해서 램핑을 요구하지 않는다. 각 LOCS 구조는 이의 특정 Tm에서 단일 형광성 측정을 단지 요구하여, 전체 온도 기울기를 실행할 필요를 부정하고, 결과에 이르는 더욱 신속한 시간을 촉진시키고 그러므로 상기 한계를 극복한다.
더욱이, 용융 곡선 분석은 전형적으로 숙련된 인력에 의한 해석 또는 결과 해석을 위한 전문화된 소프트웨어의 사용을 요구한다.
본 발명의 일부 구현예에서, PCR의 완료 이후 별개 온도 형광 측정의 사용은 용융 곡선의 주관적 해석의 필요를 제거할 수 있고 표적의 존재 또는 부재의 객관적 결정을 용이하게 할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에서, 분석은 각 주기에서 획득의 필요를 제거하는 PCR 내에 제한된 수의 시점, 예를 들어 PCR전 및 PCR후에 형광성 획득을 단지 요구할 수 있다. 이와 같이, 이들 구현예는 결과에 이르는 시간을 단축시킬 수 있는 매우 신속한 주기화 프로토콜에 매우 적합하다.
완전히 매칭된 및 미스매칭된 프로브들 사이 구분을 용이하게 하기 위한 2개 온도 획득을 포함하는, PCR 동안 여러 온도에서 형광 획득을 포함하는 몇몇 방법은 기재되었다. 추가적으로, 일부 프로토콜은 2개 표적이 존재하고 단일 채널로부터 검출되는 때 각 표적의 농도를 정량화하기 위해 각 PCR 주기 후에 여러 획득 온도를 사용한다. 2개 표적의 동시 정량화를 위한 다른 방법은 각 PCR 주기의 끝에 완전한 용융 곡선을 수행함으로써 달성된다.
본 발명은 LOCS를 다른 유형의 리포터 분자와 조합하기의 이점을 이용한다. LOCS 구조는 실시간 및 종점 PCR의 대부분 및 잠재적으로 모든 기존의 분석 방법과 호환적일 수 있다. LOCS 프로브만이 단일 반응에서 여러 표적을 구별하는데 사용되는 분석을 수행하는 것이 가능하지만, 단일 반응에서 여러 유형의 프로브를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 예로써, 단일 LOCS 프로브는 다음 기술들 중 임의의 것과 조합으로 사용될 수 있다: 선형 MNA자임 기질, 선형 TaqMan 프로브, 제한 효소로 절단가능한 프로브, 이클립스 프로브, 비-절단가능한 분자성 비콘 프로브, 비-절단가능한 슬로피 비콘, 스콜피온 유니-프로브, 스콜피온 비-프로브, 이중 혼성화 프로브 쌍, 또는 캐처 및 피처 기술을 이용하는 프로브 (예를 들면 TOCE 프로브).
본 발명의 다양한 구현예에서, 단일 LOCS 프로브 및 선형 MNA자임 기질, 선형 TaqMan 프로브, 또는 비-절단가능한 분자성 비콘 프로브는 동일한 또는 유사한 검출 모이어티로 표지될 수 있다. 비-제한 예로써, 이것은 형광계 검출을 위한 동일한 형광단, 비색계 또는 SPR 검출을 위한 동일한 크기 및/또는 유형의 나노입자 (예를 들면 금 또는 은), 화학발광 검출을 위한 반응성 모이어티 (예를 들면 알칼리성 포스파타제 또는 퍼옥시다제 효소) 또는 전기화학적 검출을 위한 전기활성 종 (예를 들면 페로센, 메틸렌 블루 또는 퍼옥시다제 효소)을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서 제1 표적-특이적 MNA자임에 의해 절단될 수 있는 선형 MNA자임 기질은 제2 표적-특이적 MNA자임에 의해 절단될 수 있는 단일 LOCS 프로브와 조합될 수 있다. 1개 선형 MNA자임 기질 및 1개 LOCS 프로브가 2개 표적을 가시 스펙트럼의 1개 파장에서, 또는 예로 검출하는데 사용되는 구현예는, 선형 프로브의 제조가 LOCS 프로브의 제조보다 더욱 단순하고 덜 비싸므로, 2개 LOCS 프로브를 사용하는 구현예보다 유리할 수 있다. 이것은 선형 기질이 LOCS 프로브 스템 영역에 요구된 추가의 서열을 요구하지 않고 따라서 더 짧기 때문이다. 유사하게, 선형 TaqMan 프로브의 제조는 LOCS 프로브보다 덜 비쌀 수 있다.
다른 유형의 표준 리포터와 조합으로 어느 한쪽 단일, 또는 다중 LOCS의 사용에 관련하는 추가의 이점은 선형 프로브의 배경 형광에서 내재적 차이와 관련하고, 여기에서 시간적/공간적 파라미터는, 형광단 및 퀀처가 스템 부분에 의해 바로 가까이에 유지되는, 형광단과 퀀처 사이 더 큰 거리 그리고 따라서 LOCS 프로브와 비교된 더 높은 배경 형광을 초래한다. 더욱이, 상이한 유형의 프로브는 이들이 상이한 온도에서 상이한 형광 및 퀀칭 특성을 나타내는 상이한 기전을 사용하여 신호를 생성한다. 아래 예시된 다양한 구현예에서, 형광 및 퀀칭 능력에서 이 차이는 조사자가 단일 파장에서 여러 표적을 검출, 구별 및/또는 정량화하기 위해 특정 온도에서 검출 신호의 크기를 조작할 수 있는 추가의 도구를 제공한다.
일부 구현예에서 본 발명은 LOCS 프로브 및 캐처-피처 프로브가 대향 형광/퀀칭 특성을 상이한 온도에서 갖는다는 사실을 이용한다. 예를 들어, 표적의 존재 또는 부재에 관계없이, 캐처-피처 프로브는 듀플렉스의 변성 그리고 캐처 가닥의 입체구조에서의 변화로 인해 높은 온도 (즉 캐처-피처 듀플렉스의 Tm 초과)에서 퀀칭된 채로 남아 있을 것이다. 반대로, LOCS 프로브는, 혼성화된 스템이 형광단 및 퀀처를 바로 가까이에 유지하기 때문에, 표적의 존재 또는 부재에 관계없이, 낮은 온도 (즉 분할된 LOCS 스템의 Tm 미만)에서 퀀칭된 채로 남아 있을 것이다. 더욱이, 표적의 존재 하에서, 캐처-피처 프로브는 낮은 온도 (즉 캐처-피처 듀플렉스의 Tm 미만)에서 형광에서의 증가를 생성할 반면 LOCS 프로브는 높은 온도 (즉 분할된 LOCS 스템의 Tm 초과)에서 형광에서의 증가를 생성할 것이다. 높은 및 낮은 온도에서 이들 대향 형광/퀀칭 특성은 캐처-피처 프로브를 사용하여 제1, 낮은 온도에서 1개 표적이 검출되도록 그리고 LOCS 프로브를 사용하여 제2, 더 높은 온도에서 또다른 표적이 검출되도록 하는 2개 표적의 특정 검출을 가능하게 한다.
본 발명의 다양한 구현예에서, 1개 선형 기질 또는 프로브, 예를 들어 선형 MNA자임 기질 또는 TaqMan 프로브를 LOCS 프로브와 조합하기의 이점은 이용된다. 예를 들어, 하나의 더 낮은 및 하나의 더 높은 Tm 스템이 있는 한 쌍의 LOCS 프로브 사용하기와 비교에서 이점은 양쪽 절단된 선형 MNA자임 기질, 및 분해된 TaqMan 프로브가 넓은 범위의 온도에 걸쳐서 유사한 형광 신호를 생산한다는 것이다. 유사하게, 미절단된 선형 MNA자임 기질, 및 온전한 TaqMan 프로브는 넓은 범위의 온도에 걸쳐서 유사한 형광 신호를 생산한다. 그러므로, 양쪽 프로브 유형의 경우 신호-대-잡음 비는 광범위의 검출 온도에 걸쳐서 일정하다. 비교해 보면, 분할된 저-Tm LOCS 프로브로부터 발생하는 관찰된 신호 대 잡음 비는 온전한 LOCS 스템의 변성에 의해 생성되는 더 큰 배경 형광으로 인해 더 높은 검출 온도에서 감소할 수 있다. 이것은 선형 MNA자임 기질, 또는 TaqMan 프로브의 절단이 더욱 제한된 검출 온도 범위를 갖는 저-Tm LOCS의 것과 비교하여 더 넓은 범위의 검출 온도에 걸쳐서 검출될 수 있음을 의미한다. 이것은 서모사이클링에서 더 많은 유연성을 허용하고 더 빠르고 단순화된 멀티플렉스 검정 개발에 유용할 수 있다. 추가 이점은 다른 기술 예컨대 TaqMan 프로브를 사용하여 기존 상업적 키트와 하나 이상의 LOCS 프로브를 조합하고 그래서 그들의 다중화 능력을 확대하는 능력에서 기인한다.
다른 구현예에서 본 발명은 LOCS 프로브 및 스콜피온 유니-프로브 또는 비-프로브가 또한 2개 상이한 검출 온도에서 2개 표적의 특정 검출을 가능하게 하는 상이한 온도에서 상이하게 거동한다는 사실에 의해 부여된 이점을 이용한다. 예를 들어, 높은 검출 온도에서, 스콜피온 유니-프로브는 스템이 개방적이고 형광중이며 루프가 특정 표적 (표적 1)의 앰플리콘에 결합할 수 없다면 어느 한쪽 표적의 존재 또는 부재에 관계없이 항상 형광성 (PCR전 및 PCR후)일 수 있다. 유사하게 높은 검출 온도에서, 스콜피온 비-프로브는 상보적 퀀처 서열이 프로브에 결합할 수 없고, 프로브가 특정 표적 (표적 1)의 앰플리콘에 결합할 수 없으므로 어느 한쪽 표적의 존재 또는 부재에 관계없이 항상 형광성 (PCR전 및 PCR후)일 수 있다. 양쪽 사례 (유니-프로브 또는 비-프로브)에, 동일한 높은 온도에서 LOCS 프로브는 스템의 절단 및 해리로 인해 특정 표적 (표적 2)의 존재 하에서 형광을 단지 생성할 것이다. 반대로, 낮은 검출 온도에서, LOCS 프로브는 양쪽 온전한 LOCS 및 분할된 LOCS의 스템의 Tm이 이 온도 초과인 반면, 이 동일한 온도에서, 스콜피온 유니-프로브 또는 비-프로브가 표적 1 앰플리콘에 루프 또는 프로브 영역 각각의 혼성화로 인해 특정 표적의 존재 하에서 형광을 단지 형성할 것이므로 어느 한쪽 표적의 존재 또는 부재에 관계없이 항상 (PCR전 및 PCR후) 퀀칭될 것이다. 높은 및 낮은 온도에서 이들 대향 형광/퀀칭 특성은, 표적 1이 어느 한쪽 스콜피온 유니-프로브 또는 스콜피온 비-프로브를 사용하여 제1, 낮은 온도에서 검출될 수 있고 표적 2가 LOCS 프로브를 사용하여 제2, 더 높은 온도에서 검출될 수 있는, 2개 표적의 특정 검출을 가능하게 한다.
다양한 유형의 표준 리포터 기질 및 프로브는 어느 한쪽 광범위의 온도에 걸쳐 또는 단지 제한된 범위에 걸쳐 형광할 것이다. 예를 들어, 비제한적으로, 선형 MNA자임 기질, 이클립스 프로브, TaqMan 프로브, 가수분해 프로브, 및 기타를 포함하는 선형 리포터 기질 또는 프로브는 일반적으로 넓은 범위의 온도에 걸쳐 형광성 신호를 생산한다. 이러한 프로브는 PCR 전에 일반적으로 퀀칭되고 표적이 존재하면 PCR 이후 형광하고 이 형광은 넓은 범위의 온도에 걸쳐서 측정될 수 있다. 대조적으로, LOCS 프로브, 분자성 비콘, 스콜피온 유니-프로브 또는, 비-프로브 및 피처 및 캐처 형광 시스템 (예를 들면 TOCE 프로브)는 이들이 한정된 온도 범위 내에서 형광성이거나 퀀칭되도록 조작될 수 있다.
분자성 비콘은 분자성 비콘 루프가 표적에 결합하고 형광하는 것 미만인 온도에서 혼성화된 스템으로 퀀칭된다. 대조적으로, 온전한 LOCS 프로브의 스템은 분할된 LOCS가 용융하는 것 초과인 온도에서 혼성화된다. 추가로, 많은 리포터 시스템이 표적의 존재 하에 형광에서의 증가를 측정하는 한편, 다른 기술 예컨대 이중 혼성화 프로브는 표적이 존재하는 때 형광에서의 감소를 초래한다. 본 발명은 특정 프로브 조합으로 특정 온도에서 검출가능한 신호에서의 증가 또는 감소가 개선된 다중화 시나리오를 허용하도록 프로브를 조합하고 파라미터를 설정하는 새로운 방법을 제공한다. 이와 같이, 표준 리포터 기질 및 프로브의 상이한 유형의 상이한 거동의 이용은, 동일한 또는 유사한 검출 모이어티로 표지된 LOCS 프로브와 조합되고 단일 반응 내에서 존재하는 때, 표적의 분석을 위한 많은 이점을 차례로 제공하는 여러 온도에서, 신호의 존재 또는 부재의 조작, 예를 들어 형광 또는 퀀칭을 허용한다.
본 발명은 하기 구현예 1-194에 적어도 부분적으로 관련한다:
구현예 1. 샘플에서 제1 및 제2 표적의 존재 또는 부재를 결정하는 방법으로서:
(a) 제1 및 제2 표적을 추정적으로 포함하는 샘플 또는 이의 유도체를
- 제1 표적의 검출을 위한, 그리고 제1 검출가능한 신호를 생성할 수 있는 제1 검출 모이어티를 포함하는 제1 올리고뉴클레오티드;
- 제2 표적의 검출을 위한, 그리고 혼성화된 뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분을 포함하고, 이의 대향 가닥은 미혼성화된 뉴클레오티드의 끊어지지 않은 단일-가닥 루프 부분에 의해 연결되며, 스템 부분이 제2 검출가능한 신호를 생성할 수 있는 제2 검출 모이어티를 포함하는, 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드,
여기서 제1 및 제2 검출 모이어티는 단일 유형의 검출기를 사용하여 단일 온도에서 차별될 수 없는 검출가능한 신호를 생성할 수 있음; 및
- 제2 표적이 샘플에서 존재하는 때만 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 미혼성화된 뉴클레오티드의 하나 이상을 소화시킬 수 있는 제1 효소
와 접촉시킴으로써 반응을 위한 혼합물을 제조하는 단계;
(b) 다음에 적합한 조건 하에 혼합물을 처리하는 단계:
- 제1 올리고뉴클레오티드에 대한 변형을 유도하여 이에 의해 제1 검출 모이어티가 제1 검출가능한 신호를 생성할 수 있게 하는 제1 표적,
- 이에 의해 단일-가닥 루프 부분을 끊고 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드를 제공하기 위해, 제2 표적이 샘플에서 존재하는 때만, 제1 효소에 의해 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 미혼성화된 뉴클레오티드의 하나 이상의 소화;
(c) 다음을 측정하는 단계:
- 혼합물에서, 또는, 대조군 혼합물에서 제1 및 제2 검출 모이어티에 의해 제공된 배경 신호;
(d) 상기 처리 동안 또는 후에 하나 이상의 시점에서 다음 여부를 결정하는 단계:
- 상기 변형으로부터 발생하는 제1 검출가능한 신호가 배경 신호와 상이한 제1 온도에서 생성되고 샘플에서 제1 표적의 존재를 나타내는지;
- 제2 검출가능한 신호가 배경 신호와 상이한 제2 온도에서 생성되고 샘플에서 제2 표적의 존재를 나타내는지
를 포함하되;
- 제1 온도에서 제2 검출가능한 신호는 배경 신호와 상이하지 않고,
제2 온도에서,
존재한다면, 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분의 가닥은 부분적으로 또는 완전히 해리되어 제2 검출 모이어티가 제2 검출가능한 신호를 제공할 수 있게 하고;
존재한다면, 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분의 가닥은 해리할 수 없어 이에 의해 제2 검출가능한 모이어티가 제2 검출가능한 신호를 제공하는 것을 방지하는,
방법.
구현예 2. 구현예 1에 있어서, 파트 (d)에서 상기 결정하기가
- 미리결정된 역치를 사용하여 상기 변형으로부터 발생하는 제1 검출가능한 신호가 제1 온도에서 임의의 배경 신호와 상이한지를 결정하는 단계; 및/또는
- 미리결정된 역치를 사용하여 제2 검출가능한 신호가 제2 온도에서 임의의 배경 신호와 상이한지를 결정하는 단계
를 포함하는, 방법.
구현예 3. 구현예 1 또는 구현예 2에 있어서, 대조군 혼합물이
- 제1 표적; 또는
- 제2 표적; 또는
- 제1 및 제2 표적
을 포함하지 않지만, 달리 혼합물과 동등한, 방법.
구현예 4. 구현예 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 대조군 혼합물이 미리결정된 양의
- 제1 표적; 또는
- 제2 표적; 또는
- 제1 및 제2 표적
을 포함하지 않지만, 달리 혼합물과 동등한, 방법.
구현예 5. 구현예 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서,
- 제1 올리고뉴클레오티드에 대한 변형이 제1 검출 모이어티가 제1 온도에서 또는 미만에서 제1 검출가능한 신호를 제공하게 할 수 있고;
- 제1 검출가능한 신호의 생성이 가역적인,
방법.
구현예 6. 구현예 5에 있어서,
- 파트 (c)가 혼합물에서, 또는, 대조군 혼합물에서 제1 및 제2 검출 모이어티에 의해 제공된, 제1 온도의 1℃, 2℃, 3℃, 4℃, 또는 5℃에서 또는 내에서 제1 배경 신호, 및 제2 온도의 1℃, 2℃, 3℃, 4℃, 또는 5℃에서 또는 내에서 제2 배경 신호를 측정하는 단계를 포함하고;
- 파트 (d)가 상기 처리 동안 또는 후에 하나 이상의 시점에서:
상기 변형으로부터 발생하는 제1 검출가능한 신호가 제1 배경 신호와 상이한 제1 온도에서 생성되고 샘플에서 제1 표적의 존재를 나타내는지;
제2 검출가능한 신호가 제2 배경 신호와 상이한 제2 온도에서 생성되고 샘플에서 제2 표적의 존재를 나타내는지
여부를 결정하는 단계를 포함하는,
방법.
구현예 7. 구현예 5 또는 구현예 6에 있어서,
- 제1 표적이 핵산 서열이고;
- 제1 올리고뉴클레오티드가 모두 또는 한 부분이 제1 표적에 상보적인 미혼성화된 뉴클레오티드의 끊어지지 않은 단일-가닥 루프 부분에 의해 연결되는 대향 가닥 상에 혼성화된 뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분을 포함하는 스템-루프 올리고뉴클레오티드이고;
- 제1 올리고뉴클레오티드의 변형이 상보적 염기 짝짓기에 의해 제1 올리고뉴클레오티드의 단일-가닥 루프 부분에 표적의 혼성화로부터 발생하는 입체구조적 변화인,
방법.
구현예 8. 구현예 7에 있어서,
- 입체구조적 변화가 상보적 염기 짝짓기에 의해 제1 올리고뉴클레오티드의 단일-가닥 루프 부분에 표적의 혼성화로부터 발생하는 제1 올리고뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분에서 가닥의 해리인,
방법.
구현예 9. 구현예 7 또는 구현예 8에 있어서,
- 제1 올리고뉴클레오티드의 스템 부분이 제1 올리고뉴클레오티드의 단일-가닥 루프 부분에 표적의 혼성화로부터 형성된 이중-가닥 듀플렉스의 Tm 미만, 및 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과인 용융 온도 (Tm)를 갖고;
- 이중-가닥 듀플렉스가 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과, 및 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과인 Tm을 갖고;
- 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분이 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고;
- 제1 온도가 상기 이중-가닥 듀플렉스, 제1 올리고뉴클레오티드의 스템 부분, 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분, 및 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고;
- 제2 온도가 상기 이중-가닥 듀플렉스, 제1 올리고뉴클레오티드의 스템 부분, 및 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고; 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고;
- 제1 온도가 제2 온도 미만인,
방법.
구현예 10. 구현예 7 또는 구현예 8에 있어서,
- 제1 올리고뉴클레오티드의 스템 부분이 제1 올리고뉴클레오티드의 단일-가닥 루프 부분에 표적의 혼성화로부터 형성된 이중-가닥 듀플렉스의 Tm 미만, 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만인 용융 온도 (Tm)를 갖고;
- 상기 이중-가닥 듀플렉스가 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과인 Tm을 갖고;
- 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분이 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과인 Tm을 갖고;
- 제1 온도가 상기 이중-가닥 듀플렉스, 제1 올리고뉴클레오티드의 스템 부분, 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분, 및 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고;
- 제2 온도가 제1 올리고뉴클레오티드의 스템 부분, 및 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고; 상기 이중-가닥 듀플렉스, 및 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고;
- 제1 온도가 제2 온도 미만인,
방법.
구현예 11. 구현예 7 또는 구현예 8에 있어서,
- 제1 올리고뉴클레오티드의 스템 부분이 제1 올리고뉴클레오티드의 단일-가닥 루프 부분에 표적의 혼성화로부터 형성된 이중-가닥 듀플렉스의 Tm 미만, 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만, 및 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만인 용융 온도 (Tm)를 갖고;
- 상기 이중-가닥 듀플렉스가 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만인 Tm을 갖고;
- 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분이 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과인 Tm을 갖고;
- 제1 온도가 상기 이중-가닥 듀플렉스, 제1 올리고뉴클레오티드의 스템 부분, 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분, 및 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고;
- 제2 온도가 상기 이중-가닥 듀플렉스, 제1 올리고뉴클레오티드의 스템 부분, 및 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고; 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고;
- 제1 온도가 제2 온도 미만인,
방법.
구현예 12. 구현예 7 또는 구현예 8에 있어서,
- 제1 올리고뉴클레오티드의 스템 부분이 제1 올리고뉴클레오티드의 단일-가닥 루프 부분에 표적의 혼성화로부터 형성된 이중-가닥 듀플렉스의 Tm 미만, 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과, 및 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과인 용융 온도 (Tm)를 갖고;
- 상기 이중-가닥 듀플렉스가 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과, 및 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과인 Tm을 갖고;
- 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분이 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과인 Tm을 갖고;
- 제1 온도가 제1 올리고뉴클레오티드의 스템 부분 및 상기 이중-가닥 듀플렉스의 Tm 미만이고; 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분 및 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고;
- 제2 온도가 제1 올리고뉴클레오티드의 스템 부분, 상기 이중-가닥 듀플렉스, 및 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고; 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고;
- 제1 온도가 제2 온도 초과인,
방법.
구현예 13. 구현예 7 내지 12 중 어느 하나에 있어서,
- 제1 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm이 상기 이중-가닥 듀플렉스의 Tm보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 낮고/거나;
- 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm이 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 높고/거나;
- 제1 온도가 제1 올리고뉴클레오티드의 스템 부분, 및/또는 상기 이중-가닥 듀플렉스의 Tm보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 낮고/거나;
- 제2 온도가 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 낮고/거나;
- 제2 온도가 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 높은,
방법.
구현예 14. 구현예 5 또는 구현예 6에 있어서,
- 제1 표적이 핵산 서열이고;
- 제1 올리고뉴클레오티드가
이의 대향 가닥이, 이의 전부 또는 한 부분이 제1 표적에 상보적인, 미혼성화된 뉴클레오티드의 단일-가닥 루프 부분, 및 3' 방향으로 상기 대향 가닥들 중 하나로부터 확장하고 제1 표적의 한 부분에 상보적인 서열로 종결하는 제2 단일-가닥 부분에 의해 연결되는, 혼성화된 뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분, 그리고
제1 표적의 부분에 상보적인 상기 서열에 선행하는 차단제 분자
를 포함하는 스템-루프 올리고뉴클레오티드이고;
- 혼합물이 추가로 폴리머라제를 포함하고;
- 혼합물 상기 처리가
상보적 염기 짝짓기에 의해 제1 표적에 제2 단일-가닥 부분을 혼성화하기;
상기 차단제 분자는 폴리머라제가 템플레이트로서 제1 올리고뉴클레오티드의 스템 부분을 사용하여 제1 표적을 확장시키는 것을 방지하는, 템플레이트 서열로서 제1 표적 및 폴리머라제를 사용하여 제2 단일-가닥 부분을 확장시켜 이중-가닥 핵산을 제공하기; 및
이중-가닥 핵산을 변성시키고 상보적 염기 짝짓기에 의해 제1 올리고뉴클레오티드의 단일-가닥 루프 부분에 폴리머라제에 의해 확장된 제2 단일-가닥 부분을 혼성화하여 신호전달 듀플렉스를 생산하고 이에 의해 상기 변형을 제1 올리고뉴클레오티드에 제공하여 제1 검출 모이어티가 제1 검출가능한 신호를 제공하게 하기
를 포함하는, 방법.
구현예 15. 구현예 14에 있어서,
- 제1 올리고뉴클레오티드의 스템 부분이 신호전달 듀플렉스의 Tm 미만 및 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과인 용융 온도 (Tm)를 갖고;
- 신호전달 듀플렉스가 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과, 및 분할된 스템-루프 올리고 뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과인 Tm을 갖고;
- 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분이 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과인 Tm을 갖고;
- 제1 온도가 신호전달 듀플렉스, 제1 올리고뉴클레오티드의 스템 부분, 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분, 및 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고;
- 제2 온도가 신호전달 듀플렉스, 제1 올리고뉴클레오티드의 스템 부분, 및 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고; 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고;
- 제1 온도가 제2 온도 미만인,
방법.
구현예 16. 구현예 14에 있어서,
- 제1 올리고뉴클레오티드의 스템 부분이 신호전달 듀플렉스의 Tm 미만, 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만인 용융 온도 (Tm)를 갖고;
- 신호전달 듀플렉스가 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과인 Tm을 갖고;
- 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분이 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과인 Tm을 갖고;
- 제1 온도가 신호전달 듀플렉스, 제1 올리고뉴클레오티드의 스템 부분, 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분, 및 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고;
- 제2 온도가 제1 올리고뉴클레오티드의 스템 부분, 및 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고; 신호전달 듀플렉스, 및 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고;
- 제1 온도가 제2 온도 미만인,
방법.
구현예 17. 구현예 14에 있어서,
- 제1 올리고뉴클레오티드의 스템 부분이 신호전달 듀플렉스의 Tm 미만, 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만, 및 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만인 용융 온도 (Tm)를 갖고;
- 신호전달 듀플렉스가 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만인 Tm을 갖고,
- 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분이 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과인 Tm을 갖고;
- 제1 온도가 신호전달 듀플렉스, 제1 올리고뉴클레오티드의 스템 부분, 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분, 및 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고;
- 제2 온도가 신호전달 듀플렉스, 제1 올리고뉴클레오티드의 스템 부분, 및 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고; 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고;
- 제1 온도가 제2 온도 미만인,
방법.
구현예 18. 구현예 14에 있어서,
- 제1 올리고뉴클레오티드의 스템 부분이 신호전달 듀플렉스의 Tm 미만, 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과, 및 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과인 용융 온도 (Tm)를 갖고;
- 신호전달 듀플렉스가 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과, 및 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과인 Tm을 갖고;
- 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분이 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과인 Tm을 갖고;
- 제1 온도가 제1 올리고뉴클레오티드의 스템 부분 및 신호전달 듀플렉스의 Tm 미만; 및 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분 및 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고;
- 제2 온도가 제1 올리고뉴클레오티드의 스템 부분, 신호전달 듀플렉스, 및 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고; 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고;
- 제1 온도가 제2 온도 초과인,
방법.
구현예 19. 구현예 14 내지 18 중 어느 하나에 있어서,
- 제1 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm이 신호전달 듀플렉스의 Tm보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 낮고/거나;
- 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm이 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 높고/거나;
- 제1 온도가 제1 올리고뉴클레오티드의 스템 부분, 및/또는 신호전달 듀플렉스의 Tm보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 낮고/거나;
- 제2 온도가 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 낮고/거나;
- 제2 온도가 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 높은,
방법.
구현예 20. 구현예 5 내지 19 중 어느 하나에 있어서,
- 제1 검출 모이어티가 형광단이고 변형이 퀀처 분자로부터 이의 거리를 증가시키는,
방법.
구현예 21. 구현예 20에 있어서,
- 제1 올리고뉴클레오티드가 퀀처 분자를 포함하는,
방법.
구현예 22. 구현예 21에 있어서,
- 형광단 및 퀀처 분자가 제1 올리고뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분의 대향 가닥 상에 위치해 있는,
방법.
구현예 23. 구현예 5 또는 구현예 6에 있어서,
- 제1 표적이 핵산 서열이고;
- 제1 올리고뉴클레오티드가
이의 제1 가닥이 제1 표적의 한 부분에 혼성화할 수 있는 상보적 서열로 종결하는 단일-가닥 부분으로 확장하되, 제1 가닥이 상기 상보적 서열에 선행하는 차단제 분자를 포함하는, 혼성화된 뉴클레오티드의 제1 이중-가닥 부분
을 포함하고;
- 혼합물이 추가로 폴리머라제를 포함하고;
- 혼합물 상기 처리가
상보적 염기 짝짓기에 의해 제1 표적의 한 부분에 단일-가닥 부분의 상보적 서열을 혼성화하기;
상기 차단제 분자는 폴리머라제가 템플레이트로서 상기 제1 이중-가닥 부분의 제1 가닥을 사용하여 제1 표적을 확장시키는 것을 방지하는, 템플레이트 서열로서 제1 표적 및 폴리머라제를 사용하여 상보적 서열을 확장시켜 제2 이중-가닥 부분을 제공하기;
제1 및 제2 이중-가닥 부분을 변성시키기; 및
상보적 염기 짝짓기에 의해 제1 이중-가닥 부분의 제1 가닥에 폴리머라제에 의해 확장된 상보적 서열을 혼성화하여 신호전달 듀플렉스를 생산하고 이에 의해 상기 변형을 제1 올리고뉴클레오티드에 제공하여 제1 검출 모이어티가 제1 검출가능한 신호를 제공하게 하기
를 포함하는, 방법.
구현예 24. 구현예 23에 있어서,
- 제1 이중-가닥 부분이 신호전달 듀플렉스의 Tm 미만, 및 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과인 용융 온도 (Tm)를 갖고;
- 신호전달 듀플렉스가 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과, 및 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과인 Tm을 갖고;
- 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분이 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과인 Tm을 갖고;
- 제1 온도가 신호전달 듀플렉스, 제1 이중-가닥 부분, 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분, 및 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고;
- 제2 온도가 신호전달 듀플렉스, 제1 이중-가닥 부분, 및 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고; 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고;
- 제1 온도가 제2 온도 미만인,
방법.
구현예 25. 구현예 23에 있어서,
- 제1 이중-가닥 부분이 신호전달 듀플렉스의 Tm 미만, 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만인 용융 온도 (Tm)를 갖고;
- 신호전달 듀플렉스가 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과인 Tm을 갖고;
- 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분이 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과인 Tm을 갖고;
- 제1 온도가 신호전달 듀플렉스, 제1 이중-가닥 부분, 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분, 및 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고;
- 제2 온도가 제1 이중-가닥 부분, 및 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고; 신호전달 듀플렉스, 및 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고;
- 제1 온도가 제2 온도 미만인,
방법.
구현예 26. 구현예 23에 있어서,
- 제1 이중-가닥 부분이 신호전달 듀플렉스의 Tm 미만, 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만, 및 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만인 용융 온도 (Tm)를 갖고;
- 신호전달 듀플렉스가 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만인 Tm을 갖고;
- 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분이 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과인 Tm을 갖고;
- 제1 온도가 신호전달 듀플렉스, 제1 이중-가닥 부분, 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분, 및 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고;
- 제2 온도가 신호전달 듀플렉스, 제1 이중-가닥 부분, 및 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고; 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고;
- 제1 온도가 제2 온도 미만인,
방법.
구현예 27. 구현예 23에 있어서,
- 제1 이중-가닥 부분이 신호전달 듀플렉스의 Tm 미만, 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과, 및 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과인 용융 온도 (Tm)를 갖고;
- 신호전달 듀플렉스가 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과, 및 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과인 Tm을 갖고;
- 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분이 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과인 Tm을 갖고;
- 제1 온도가 제1 이중-가닥 부분 및 신호전달 듀플렉스의 Tm 미만이고; 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분 및 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고;
- 제2 온도가 제1 이중-가닥 부분, 신호전달 듀플렉스, 및 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고; 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고;
- 제1 온도가 제2 온도 초과인,
방법.
구현예 28. 구현예 23 내지 27 중 어느 하나에 있어서,
- 제1 이중-가닥 부분의 Tm이 신호전달 듀플렉스의 Tm보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 낮고/거나;
- 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm이 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 높고/거나;
- 제1 온도가 제1 이중-가닥 부분, 및/또는 신호전달 듀플렉스의 Tm보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 낮고/거나;
- 제2 온도가 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 낮고/거나;
- 제2 온도가 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 높은,
방법.
구현예 29. 구현예 23 내지 28 중 어느 하나에 있어서,
- 제1 검출 모이어티가 형광단이고 변형이 퀀처 분자로부터 이의 거리를 증가시키는,
방법.
구현예 30. 구현예 29에 있어서,
- 제1 올리고뉴클레오티드가 퀀처 분자를 포함하는,
방법.
구현예 31. 구현예 30에 있어서,
- 형광단 및 퀀처 분자가 제1 이중-가닥 부분의 대향 가닥 상에 위치해 있는,
방법.
구현예 32. 구현예 5 또는 구현예 6에 있어서,
- 제1 표적이 핵산 서열이고;
- 혼합물이 추가로
제1 표적에서 제1 서열에 상보적인 제1 프라이머,
제1 서열과 상이한 제1 표적에서 제2 서열에 상보적인 구성요소, 및 제1 표적에 상보적이지 않은 태그 부분을 포함하는 제2 올리고뉴클레오티드,
엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 제1 폴리머라제, 및
임의로 제2 폴리머라제
를 포함하고,
- 혼합물 상기 처리가
제1 표적에 제1 프라이머 및 제2 올리고뉴클레오티드를 혼성화하기에 적합한 조건,
템플레이트로서 표적 및 제1 폴리머라제를 사용하여 제1 프라이머를 확장시켜 이에 의해 태그 부분을 절단 제거하기,
상보적 염기 짝짓기에 의해 제1 올리고뉴클레오티드에 절단된 태그 부분을 혼성화하기,
그리고, 템플레이트로서 제1 올리고뉴클레오티드 및 제1 또는 제2 폴리머라제를 사용하여 태그 부분을 확장시켜 제1 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중-가닥 서열을 생성하여 이에 의해 제1 올리고뉴클레오티드에 상기 변형을 제공하고 제1 검출 모이어티가 제1 검출가능한 신호를 제공하게 하기
를 포함하는, 방법.
구현예 33. 구현예 32에 있어서,
- 이중-가닥 서열이 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과, 및 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과인 Tm을 갖고;
- 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분이 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과인 Tm을 갖고;
- 제1 온도가 이중-가닥 서열, 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분, 및 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고;
- 제2 온도가 이중-가닥 서열, 및 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고; 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고;
- 제1 온도가 제2 온도 미만인,
방법.
구현예 34. 구현예 32에 있어서,
- 이중-가닥 서열이 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과인 Tm을 갖고;
- 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분이 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과인 Tm을 갖고;
- 제1 온도가 이중-가닥 서열, 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분, 및 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고;
- 제2 온도가 그리고 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고; 이중-가닥 서열, 및 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고;
- 제1 온도가 제2 온도 미만인,
방법.
구현예 35. 구현예 32에 있어서,
- 이중-가닥 서열이 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만인 Tm을 갖고;
- 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분이 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과인 Tm을 갖고;
- 제1 온도가 이중-가닥 서열, 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분, 및 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고;
- 제2 온도가 이중-가닥 서열, 및 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고; 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고;
- 제1 온도가 제2 온도 미만인,
방법.
구현예 36. 구현예 32에 있어서,
- 이중-가닥 서열이 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과, 및 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과인 Tm을 갖고;
- 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분이 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과인 Tm을 갖고;
- 제1 온도가 이중-가닥 서열의 Tm 미만이고; 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분 및 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고;
- 제2 온도가 이중-가닥 서열 및 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고; 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고;
- 제1 온도가 제2 온도 초과인,
방법.
구현예 37. 구현예 32 내지 36 중 어느 하나에 있어서,
- 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm이 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 높고/거나;
- 제1 온도가 이중-가닥 서열의 Tm보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 낮고/거나;
- 제2 온도가 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 낮고/거나;
- 제2 온도가 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 높은,
방법.
구현예 38. 구현예 32 내지 37 중 어느 하나에 있어서,
- 제1 올리고뉴클레오티드가 형광단 및 퀀처 분자를 포함하고,
- 태그 부분 상기 확장하기가 형광단과 퀀처 분자 사이 거리를 증가시키는,
방법.
구현예 39. 구현예 5 또는 구현예 6에 있어서,
- 제1 표적이 핵산 서열이고;
- 제1 올리고뉴클레오티드가 표적의 제1 부분에 상보적이고;
- 혼합물이 추가로, 제1 표적의 제1 및 제2 부분이 서로 측접하지만 중첩하지 않는, 제1 표적 제2 부분에 상보적인 추가 올리고뉴클레오티드를 포함하고;
- 혼합물 상기 처리가
(i) 상보적 염기 짝짓기에 의해 표적에 제1 올리고뉴클레오티드를 혼성화시킴으로써 제1 이중-가닥 구성요소, 및
(ii) 상보적 염기 짝짓기에 의해 표적에 추가 올리고뉴클레오티드를 혼성화시킴으로써 제2 이중-가닥 구성요소
를 포함하는 듀플렉스 구조를 형성하기,
이에 의해 제1 및 추가 올리고뉴클레오티드를 근접시키고, 제1 올리고뉴클레오티드에 상기 변형을 제공하여 제1 검출 모이어티가 제1 검출가능한 신호를 제공하게 하기
를 포함하는, 방법.
구현예 40. 구현예 39에 있어서,
- 듀플렉스 구조가 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만인 Tm을 갖고;
- 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분이 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과인 Tm을 갖고;
- 제1 온도가 듀플렉스 구조, 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분, 및 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고;
- 제2 온도가 듀플렉스 구조, 및 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고; 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고;
- 제1 온도가 제2 온도 미만인,
방법.
구현예 41. 구현예 40의 구현예 39에 있어서,
- 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm이 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 높고/거나;
- 제1 온도가 듀플렉스 구조의 Tm보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 낮고/거나;
- 제2 온도가 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 낮고/거나;
- 제2 온도가 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 높은,
방법.
구현예 42. 구현예 39 내지 41 중 어느 하나에 있어서,
- 제1 검출가능한 모이어티가 형광단이고 추가 올리고뉴클레오티드가 퀀처를 포함하고;
- 듀플렉스 구조의 형성이 추가로 형광단 및 퀀처를 근접시키고;
- 상기 검출가능한 신호가 제1 검출 모이어티에 의해 제공된 형광에서의 감소인,
방법.
구현예 43. 구현예 5 또는 구현예 6에 있어서,
- 제1 표적이 핵산 서열이고;
- 제1 검출 모이어티가 나노입자, 금속성 나노입자, 귀금속 나노입자, 알칼리 금속 나노입자, 금 나노입자, 또는 은 나노입자이고; 여기에 제1 올리고뉴클레오티드가 결합되고;
- 혼합물 상기 처리가
제1 올리고뉴클레오티드에 제1 표적을 혼성화시켜 이에 의해 제1 올리고뉴클레오티드에 변형을 유도하여 제1 검출 모이어티가 샘플에서 제1 표적의 존재를 나타내는 제1 검출가능한 신호를 제공하게 하기를 포함하되;
제1 검출가능한 신호가, 제1 올리고뉴클레오티드의 변형 이후 제1 검출 모이어티로부터 발생하는,
(i) 굴절률에서의 변화,
(ii) 색에서의 변화; 및/또는
(iii) 흡수 스펙트럼에서의 변화인,
방법.
구현예 44. 구현예 5 또는 구현예 6에 있어서,
- 제1 표적이 핵산 서열이고;
- 제1 검출 모이어티가 제1 올리고뉴클레오티드가 결합되는 전기화학적 제제이고;
- 혼합물 상기 처리가
제1 올리고뉴클레오티드에 제1 표적을 혼성화시켜 이에 의해 제1 올리고뉴클레오티드에 변형을 유도 또는 촉진하여 제1 검출 모이어티가 샘플에서 제1 표적의 존재를 나타내는 제1 검출가능한 신호를 제공하도록 하기를 포함하되;
제1 검출가능한 신호가 제1 올리고뉴클레오티드의 변형 이후 제1 검출 모이어티로부터 발생하는 전기화학적 신호에서의 변화인,
방법.
구현예 45. 구현예 44에 있어서,
- 전기화학적 제제가 나노입자, 메틸렌 블루, 톨루엔 블루, 오라세트 블루, Hoechst 33258, [Ru(phen)3]2+, 페로센, 및/또는 다우노마이신 중 어느 하나 이상으로부터 선택되는,
방법.
구현예 46. 구현예 5 내지 19, 23 내지 28, 32 내지 37, 및 39 내지 41 중 어느 하나에 있어서,
- 제1 검출 모이어티가 나노입자, 금속성 나노입자, 귀금속 나노입자, 알칼리 금속 나노입자, 금 나노입자, 또는 은 나노입자이고; 여기에 제1 올리고뉴클레오티드가 결합되고;
- 제1 검출가능한 신호가, 제1 올리고뉴클레오티드의 변형 이후 제1 검출 모이어티로부터 발생하는,
(i) 굴절률에서의 변화,
(ii) 색에서의 변화; 및/또는
(iii) 흡수 스펙트럼에서의 변화인,
방법.
구현예 47. 구현예 5 내지 19, 23 내지 28, 32 내지 37, 및 39 내지 41 중 어느 하나에 있어서,
- 제1 검출 모이어티가 제1 올리고뉴클레오티드가 결합되는 전기화학적 제제이고;
- 제1 검출가능한 신호가 제1 올리고뉴클레오티드의 변형 이후 제1 검출 모이어티로부터 발생하는 전기화학적 신호에서의 변화인,
방법.
구현예 48. 구현예 47에 있어서,
- 전기화학적 제제가 나노입자, 메틸렌 블루, 톨루엔 블루, 오라세트 블루, Hoechst 33258, [Ru(phen)3]2+, 페로센, 및/또는 다우노마이신 중 어느 하나 이상으로부터 선택되는,
방법.
구현예 49. 구현예 43 내지 48 중 어느 하나에 있어서,
- 제2 검출 모이어티가 나노입자, 금속성 나노입자, 귀금속 나노입자, 알칼리 금속 나노입자, 금 나노입자, 또는 은 나노입자이고; 여기에 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드가 결합되고;
- 제2 검출가능한 신호가, 해리하는 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분의 가닥으로부터 발생하는,
(i) 굴절률에서의 변화,
(ii) 색에서의 변화; 및/또는
(iii) 흡수 스펙트럼에서의 변화인,
방법.
구현예 50. 구현예 43 내지 48 중 어느 하나 중 어느 하나에 있어서,
- 제2 검출 모이어티가 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드가 결합되는 전기화학적 제제이고;
- 제2 검출가능한 신호가 해리하는 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분의 가닥으로부터 발생하는 전기화학적 신호에서의 변화인,
방법.
구현예 51. 구현예 50에 있어서,
- 전기화학적 제제가 나노입자, 메틸렌 블루, 톨루엔 블루, 오라세트 블루, Hoechst 33258, [Ru(phen)3]2+, 페로센, 및/또는 다우노마이신 중 어느 하나 이상으로부터 선택되는,
방법.
구현예 52. 구현예 20 내지 22, 29 내지 31, 38, 및 42 중 어느 하나에 있어서,
- 제2 검출 모이어티가 형광단이고,
- 해리하는 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분의 가닥에 의해 제공된 제2 검출가능한 신호가 퀀처 분자로부터 형광단의 거리를 증가시키는,
방법.
구현예 53. 구현예 52에 있어서,
- 형광단 및 퀀처 분자가 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분의 대향 가닥 상에 위치해 있는,
방법.
구현예 54. 구현예 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서,
- 제1 검출가능한 신호의 생성이 가역적이지 않고;
- 제1 올리고뉴클레오티드에 대한 변형이 제1 검출 모이어티가 제1 온도에서 또는 미만에서 제1 검출가능한 신호를 제공하게 하고;
- 제1 온도에서 또는 미만에서 제공된 제1 검출가능한 신호가 제2 온도에서 검출가능하게 유지하는,
방법.
구현예 55. 구현예 54에 있어서,
- 파트 (c)가 혼합물에서, 또는, 대조군 혼합물에서 제1 및 제2 검출 모이어티에 의해 제공된
(i) 제1 온도의 1℃, 2℃, 3℃, 4℃, 또는 5℃에서 또는 내에서 제1 배경 신호, 및 제2 온도의 1℃, 2℃, 3℃, 4℃, 또는 5℃에서 또는 내에서 제2 배경 신호, 및/또는
(ii) 제3 온도에서 제3 배경 신호
를 측정하는 단계를 포함하고;
- 파트 (d)가 상기 처리 동안 또는 후에 하나 이상의 시점에서
(i) 상기 변형으로부터 발생하는 제1 검출가능한 신호가 제1 또는 제3 배경 신호와 상이한 제1 온도에서 생성되되,
제1 온도에서 제2 검출가능한 신호가 제1 또는 제3 배경 신호와 상이하지 않고,
제1 검출가능한 신호와 제1 또는 제3 배경 신호 사이 차이의 검출이 샘플에서 제1 표적의 존재 및 제1 올리고뉴클레오티드의 변형을 나타내는지; 그리고
(ii) 제2 검출가능한 신호가 제2 또는 제3 배경 신호와 상이한 제2 온도에서 생성되고 샘플에서 제2 표적의 존재를 나타내는지
여부를 결정하는 단계를 포함하는,
방법.
구현예 56. 구현예 55에 있어서,
- 제1 표적이 샘플에서 존재하는 때, 제2 검출가능한 신호가 제2 온도에서 생성되는지 여부의 결정하기가 제2 검출가능한 신호를 측정하는 때 존재하는 제1 검출가능한 신호 보상하기를 포함하는,
방법.
구현예 57. 구현예 55 또는 구현예 56에 있어서,
- 제1 배경 신호와 상이한 제1 신호가 생성되고,
- 제2 배경 신호와 상이한 제2 신호가 생성되고,
- 제1 검출가능한 신호가 제1 배경 신호와 상이한 것보다 큰 정도로 제2 검출가능한 신호가 제2 배경 신호와 상이하여,
이에 의해 제2 표적이 샘플에서 존재함을 나타내는,
방법.
구현예 58. 구현예 57에 있어서,
- 제1 온도가 제2 온도, 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분의 Tm, 및 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만인,
방법.
구현예 59. 구현예 57에 있어서,
- 제1 온도가 제2 온도, 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm, 및 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm보다 높은,
방법.
구현예 60. 구현예 55에 있어서,
- 제3 배경 신호와 상이한 제1 신호가 생성되고,
- 제3 배경 신호와 상이한 제2 신호가 생성되고,
- 제1 신호가 제3 배경 신호와 상이한 것보다 큰 정도로 제2 신호가 제3 배경 신호와 상이하여,
이에 의해 제2 표적이 샘플에서 존재함을 나타내는,
방법.
구현예 61. 구현예 55에 있어서,
- 제2 온도가 제1 온도보다 높고,
- 제3 온도가 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분의 Tm보다 낮고,
- 제3 배경 신호와 상이한 제1 검출가능한 신호가 생성되고,
- 제3 배경 신호와 상이한 제2 검출가능한 신호가 생성되고,
- 제1 신호가 제3 배경 신호와 상이한 것보다 큰 정도로 제2 검출가능한 신호가 제3 배경 신호와 상이하여,
이에 의해 제2 표적이 샘플에서 존재함을 나타내는,
방법.
구현예 62. 구현예 55 내지 61 중 어느 하나에 있어서,
- 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm이 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고;
- 제1 온도가 제2 온도 미만이고, 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고;
- 제2 온도가 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과 및 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만인,
방법.
구현예 63. 구현예 62에 있어서,
- 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm이 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 높고/거나;
- 제1 온도가 제2 온도보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 낮고/거나;
- 제1 온도가 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 낮고/거나;
- 제2 온도가 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 높고/거나;
- 제2 온도가 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 낮은,
방법.
구현예 64. 구현예 62 또는 구현예 63에 있어서,
- 제3 온도가 제2 온도 미만인, 상기 제3 배경 신호를 측정하는 단계
를 포함하는, 방법.
구현예 65. 구현예 64에 있어서,
- 제3 온도가 제2 온도보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 낮은,
방법.
구현예 66. 구현예 55 내지 61 중 어느 하나에 있어서,
- 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm이 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고;
- 제1 온도가 제2 온도 초과이고, 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고, 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고;
- 제2 온도가 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만인,
방법.
구현예 67. 구현예 66에 있어서,
- 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm이 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 높고/거나;
- 제1 온도가 제2 온도보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 높고/거나;
- 제1 온도가 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 높고/거나;
- 제1 온도가 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 높고/거나;
- 제2 온도가 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 높고/거나;
- 제2 온도가 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 낮은,
방법.
구현예 68. 구현예 54 내지 67 중 어느 하나에 있어서,
- 제1 올리고뉴클레오티드가 다-구성요소 핵산 효소 (MNA자임)를 위한 기질이고;
- 혼합물이 추가로
제1 표적이 샘플에서 존재하는 때 제1 올리고뉴클레오티드를 절단시킬 수 있는 MNA자임
을 포함하고;
- 혼합물 상기 처리가 추가로
제1 표적에 MNA자임을 결합시키고 상보적 염기 짝짓기에 의해 제1 올리고뉴클레오티드에 MNA자임의 기질 아암을 혼성화하여 제1 올리고뉴클레오티드의 절단을 촉진시켜 이에 의해 제1 올리고뉴클레오티드에 상기 변형을 제공하고 제1 검출 모이어티가 제1 검출가능한 신호를 제공하게 하기를 포함하는,
방법.
구현예 69. 구현예 68에 있어서,
- 제1 표적이 핵산 서열이고;
- 반응 혼합물 상기 처리가 추가로
상보적 염기 짝짓기에 의해 MNA자임의 센서 아암에 제1 표적을 혼성화하여 이에 의해 MNA자임의 조립을 촉진시키기를 포함하는,
방법.
구현예 70. 구현예 54 내지 67 중 어느 하나에 있어서,
- 제1 올리고뉴클레오티드가 압타자임을 위한 기질이고;
- 제1 표적이 분석물, 단백질, 화합물 또는 분자이고;
- 혼합물이 추가로 제1 표적에 결합할 수 있는 압타머를 포함하는 압타자임을 포함하고;
- 혼합물 상기 처리가 추가로
제1 표적 및 제1 올리고뉴클레오티드에 압타자임을 결합하여 제1 올리고뉴클레오티드의 절단을 촉진시켜 이에 의해 제1 올리고뉴클레오티드에 상기 변형을 제공하고 제1 검출 모이어티가 제1 검출가능한 신호를 생성하게 하기를 포함하는,
방법.
구현예 71. 구현예 54 내지 67 중 어느 하나에 있어서,
- 제1 표적이 핵산 서열이고;
- 제1 올리고뉴클레오티드가 제1 표적에 상보적인 서열을 포함하고,
- 혼합물이 추가로
제1 표적의 한 부분에 상보적인 프라이머, 및
엑소뉴클레아제 활성이 있는 폴리머라제
를 포함하고;
- 혼합물 상기 처리가
상보적 염기 짝짓기에 의해 제1 표적에 프라이머를 혼성화하기,
상보적 염기 짝짓기에 의해 제1 표적에 제1 올리고뉴클레오티드를 혼성화하기
템플레이트 서열로서 제1 표적 및 폴리머라제를 사용하여 프라이머를 확장시켜 이에 의해 제1 올리고뉴클레오티드를 소화시키고 제1 올리고뉴클레오티드에 상기 변형을 제공하여 제1 검출 모이어티가 제1 검출가능한 신호를 생성하게 하기
를 포함하는, 방법.
구현예 72. 구현예 54 내지 67 중 어느 하나에 있어서,
- 제1 표적이 핵산 서열이고;
- 혼합물이 추가로
제1 표적을 포함하는 이중-가닥 듀플렉스를 소화시킬 수 있는 제한 엔도뉴클레아제
를 포함하고;
- 혼합물 상기 처리가
상보적 염기 짝짓기에 의해 제1 표적에 제1 올리고뉴클레오티드를 혼성화하여 이에 의해 이중-가닥 듀플렉스를 형성하고,
제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 듀플렉스를 소화시켜 이에 의해 제1 올리고뉴클레오티드에 상기 변형을 제공하고 제1 검출 모이어티가 제1 검출가능한 신호를 제공하게 하기
를 포함하는, 방법.
구현예 73. 구현예 72에 있어서,
- 제한 엔도뉴클레아제가 상기 이중-가닥 듀플렉스의 가닥과 결합할 수 있고 이를 절단시킬 수 있는 니킹 엔도뉴클레아제이고, 상기 가닥이 제1 올리고뉴클레오티드의 전부 또는 한 부분을 포함하는, 방법.
구현예 74. 구현예 54 내지 67 중 어느 하나에 있어서,
- 혼합물이 추가로 촉매적 활성을 위한 보조-인자를 필요로 하는 DNA자임 또는 리보자임을 포함하고;
- 혼합물의 처리가
이것을 촉매적으로 활성으로 만들기 위해 DNA자임 또는 리보자임에 보조인자의 결합하기,
상보적 염기 짝짓기에 의해 제1 올리고뉴클레오티드에 DNA자임 또는 리보자임의 혼성화, 및
DNA자임 또는 리보자임의 촉매적 활성에 적합한 조건 사용하기를 포함하여 이에 의해 제1 올리고뉴클레오티드를 소화시키고 이에 의해 제1 올리고뉴클레오티드에 상기 변형을 제공하여 제1 검출 모이어티가 제1 검출가능한 신호를 제공하게 하는 방법으로서.
제1 표적이 보조-인자인,
방법.
구현예 75. 구현예 74에 있어서, 보조-인자가 금속 이온, 또는 Mg2+, Mn2+, Ca2+, Pb2+로부터 선택된 금속 이온인, 방법.
구현예 76. 구현예 54 내지 75 중 어느 하나에 있어서,
- 제1 검출 모이어티가 형광단이고 제1 올리고뉴클레오티드에 대한 변형이 퀀처 분자로부터 형광단의 거리를 증가시키는,
방법.
구현예 77. 구현예 76에 있어서,
- 제1 올리고뉴클레오티드가 퀀처 분자를 포함하는,
방법.
구현예 78. 구현예 76 또는 구현예 77에 있어서,
- 제2 검출 모이어티가 형광단이고,
- 해리하는 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분의 가닥에 의해 제공된 제2 검출가능한 신호가 퀀처 분자로부터 형광단의 거리를 증가시키는,
방법.
구현예 79. 구현예 78에 있어서,
- 형광단 및 퀀처 분자가 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분의 대향 가닥 상에 위치해 있는,
방법.
구현예 80. 구현예 54 내지 79 중 어느 하나에 있어서,
- 제1 검출 모이어티가 나노입자, 금속성 나노입자, 귀금속 나노입자, 알칼리 금속 나노입자, 금 나노입자, 또는 은 나노입자이고; 여기에 제1 올리고뉴클레오티드가 결합되고;
- 제1 검출가능한 신호가, 제1 올리고뉴클레오티드의 변형 이후 제1 검출 모이어티로부터 발생하는,
(i) 굴절률에서의 변화,
(ii) 색에서의 변화; 및/또는
(iii) 흡수 스펙트럼에서의 변화인,
방법.
구현예 81. 구현예 54 내지 79 중 어느 하나에 있어서,
- 제1 검출 모이어티가 제1 올리고뉴클레오티드가 결합되는 전기화학적 제제이고;
- 제1 검출가능한 신호가 제1 올리고뉴클레오티드의 변형 이후 제1 검출 모이어티로부터 발생하는 전기화학적 신호에서의 변화인,
방법.
구현예 82. 구현예 81에 있어서,
- 전기화학적 제제가 나노입자, 메틸렌 블루, 톨루엔 블루, 오라세트 블루, Hoechst 33258, [Ru(phen)3]2+, 페로센, 및/또는 다우노마이신 중 어느 하나 이상으로부터 선택되는,
방법.
구현예 83. 구현예 80 내지 82 중 어느 하나에 있어서,
- 제2 검출 모이어티가 나노입자, 금속성 나노입자, 귀금속 나노입자, 알칼리 금속 나노입자, 금 나노입자, 또는 은 나노입자이고; 여기에 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드가 결합되고;
- 제2 검출가능한 신호가, 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드 해리하기의 이중-가닥 스템 부분의 가닥으로부터 발생하는,
(i) 굴절률에서의 변화,
(ii) 색에서의 변화; 및/또는
(iii) 흡수 스펙트럼에서의 변화인,
방법.
구현예 84. 구현예 80 내지 82 중 어느 하나 중 어느 하나에 있어서,
- 제2 검출 모이어티가 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드가 결합되는 전기화학적 제제이고;
- 제2 검출가능한 신호가 해리하는 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분의 가닥으로부터 발생하는 전기화학적 신호에서의 변화인,
방법.
구현예 85. 구현예 84에 있어서,
- 전기화학적 제제가 나노입자, 메틸렌 블루, 톨루엔 블루, 오라세트 블루, Hoechst 33258, [Ru(phen)3]2+, 페로센, 및/또는 다우노마이신 중 어느 하나 이상으로부터 선택되는,
방법.
구현예 86. 구현예 1 내지 85 중 어느 하나에 있어서, 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드가 제1 효소에 의한 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 하나 이상의 미혼성화된 뉴클레오티드의 소화 동안 제2 표적에 혼성화되지 않는, 방법.
구현예 87. 구현예 1 내지 86 중 어느 하나에 있어서,
- 제1 효소가 제1 MNA자임이고,
- 혼합물 상기 처리가
제2 표적에 제1 MNA자임을 결합시키고 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 루프 부분에 상기 제1 MNA자임의 기질 아암을 혼성화하여, 이에 의해 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 하나 이상의 미혼성화된 뉴클레오티드를 소화시키고 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드를 제공하기
를 포함하는, 방법.
구현예 88. 구현예 87에 있어서,
- 제2 표적이 핵산 서열이고;
- 혼합물 상기 처리가 추가로 상보적 염기 짝짓기에 의해 제1 MNA자임의 센서 아암에 제2 표적을 혼성화시켜 이에 의해 제1 MNA자임의 조립을 촉진시키기
를 포함하는, 방법.
구현예 89. 구현예 1 내지 86 중 어느 하나에 있어서,
- 제2 표적이 분석물, 단백질, 화합물 또는 분자이고;
- 제1 효소가 제2 표적에 결합할 수 있는 압타머를 포함하는 압타자임이고;
- 압타머에 제2 표적의 결합하기가 제1 효소를 촉매적으로 활성으로 만들 수 있는,
방법.
구현예 90. 구현예 89에 있어서,
- 제1 효소가 압타-DNA자임, 압타-리보자임, 압타-MNA자임 중 어느 하나인,
방법.
구현예 91. 구현예 1 내지 86 중 어느 하나에 있어서,
- 제2 표적이 분석물, 단백질, 화합물 또는 분자이고;
- 제1 올리고뉴클레오티드가 압타자임을 위한 기질이고;
- 제1 효소가 제2 표적에 결합할 수 있는 압타머 부분, 및 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 하나 이상의 미혼성화된 뉴클레오티드를 소화시킬 수 있는 핵산 효소 부분을 포함하는 압타자임이고
- 혼합물 상기 처리가 추가로
압타자임의 압타머 부분에 제2 표적을 결합시켜 핵산 효소 부분의 촉매적 활성의 활성화를 촉진시키고, 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드를 활성 핵산 효소 부분에 혼성화시켜 이에 의해 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 하나 이상의 미혼성화된 뉴클레오티드를 소화시키기
를 포함하는, 방법.
구현예 92. 구현예 1 내지 85 중 어느 하나에 있어서,
- 제2 표적이 핵산 서열이고;
- 제1 효소가 제1 제한 엔도뉴클레아제이고, 혼합물 상기 처리가
상보적 염기 짝짓기에 의해 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 단일-가닥 루프 부분에 제2 표적의 혼성화에 적합한 조건을 사용하여 제1 제한 엔도뉴클레아제를 위한 이중-가닥 서열을 형성하여 단일-가닥 루프 부분의 하나 이상의 미혼성화된 뉴클레오티드와 결합하고 이를 소화시켜 이에 의해 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드를 형성하기
를 포함하는, 방법.
구현예 93. 구현예 92에 있어서,
- 제1 제한 엔도뉴클레아제가 제1 제한 엔도뉴클레아제를 위한 상기 이중-가닥 서열의 가닥과 결합할 수 있고 이를 절단시킬 수 있는 제1 니킹 엔도뉴클레아제이고, 상기 가닥이 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 단일-가닥 루프 부분의 전부 또는 한 부분을 포함하는,
방법.
구현예 94. 구현예 1 내지 85 중 어느 하나에 있어서,
- 제1 효소가 엑소뉴클레아제 활성이 있는 폴리머라제를 포함하고,
- 혼합물 상기 처리가
제2 표적의 한 부분을 포함하는 제1 이중-가닥 서열을 형성하기 위해 상보적 염기 짝짓기에 의해 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 단일-가닥 루프 부분에 제2 표적의 혼성화,
제2 표적의 부분을 포함하는 제1 이중-가닥 서열에 비하여 업스트림 위치해 있는 제2 이중-가닥 서열을 형성하기 위한 제2 표적에 제1 프라이머 올리고뉴클레오티드의 혼성화,
엑소뉴클레아제 활성이 있는 폴리머라제를 사용하고 템플레이트 서열로서 제2 표적을 사용하여 프라이머 확장하기
에 적합한 조건을 사용하는 것을 포함하되,
엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 제1 폴리머라제가 제1 이중-가닥 서열의 단일-가닥 루프 부분을 소화시키고 이에 의해 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드를 형성하는,
방법.
구현예 95. 구현예 1 내지 85 중 어느 하나에 있어서,
- 제1 효소가 엑소뉴클레아제이고,
- 혼합물 상기 처리가
제2 표적의 한 부분을 포함하는 제1 이중-가닥 서열을 형성하기 위해 상보적 염기 짝짓기에 의해 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 단일-가닥 루프 부분에 제2 표적의 혼성화,
엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 제1 효소의 제2 표적을 포함하는 이중-가닥 서열과의 결합, 및
제2 표적을 포함하는 제1 이중-가닥 서열의 단일-가닥 루프 부분을 소화시키고 이에 의해 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드를 형성하게 하는 엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 제1 효소의 촉매적 활성
에 적합한 조건 사용하기를 포함하는,
방법.
구현예 96. 구현예 1 내지 85 중 어느 하나에 있어서,
- 제1 효소가 촉매적 활성을 위한 보조-인자를 필요로 하는 DNA자임 또는 리보자임이고, 혼합물 상기 처리가
- 촉매적으로 활성으로 만들기 위한 제1 효소에 보조인자의 결합하기,
- 상보적 염기 짝짓기에 의해 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 단일-가닥 루프 부분에 DNA자임 또는 리보자임의 혼성화,
- 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 단일-가닥 루프 부분의 하나 이상의 미혼성화된 뉴클레오티드를 소화시키고 이에 의해 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드를 형성하기 위한 DNA자임 또는 리보자임의 촉매적 활성
에 적합한 조건을 사용하기를 포함하되,
제2 표적이 보조-인자인,
방법.
구현예 97. 구현예 96에 있어서, 보조-인자가 금속 이온, 또는 Mg2+, Mn2+, Ca2+, Pb2+로부터 선택된 금속 이온인, 방법.
구현예 98. 구현예 1 내지 97 중 어느 하나에 있어서,
- 제1 표적이 제2 표적과 상이하고/거나;
- 제1 올리고뉴클레오티드가 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 단일-가닥 루프 부분 내에 없는 서열을 포함하거나 이로 이루어지는,
방법.
구현예 99. 구현예 1 내지 98 중 어느 하나에 있어서,
- 제1 효소가 제2 표적을 소화시키지 않는,
방법.
구현예 100. 구현예 1 내지 71, 74 내지 91, 또는 94 내지 99 중 어느 하나에 있어서,
- 임의의 효소가 제1 표적 및/또는 제2 표적을 소화시키지 않는,
방법.
구현예 101. 구현예 1 내지 100 중 어느 하나에 있어서,
- 제1 온도가 1℃, 2℃, 3℃, 4℃, 5℃, 6℃, 7℃, 8℃, 9℃, 10℃, 11℃, 12℃, 13℃, 14℃, 15℃, 16℃, 17℃, 18℃, 19℃, 20℃, 25℃, 30℃, 35℃, 40℃, 45℃, 50℃, 55℃, 또는 60℃ 초과만큼 제2 온도와 상이한,
방법.
구현예 102. 구현예 1 내지 101 중 어느 하나에 있어서, 상기 결정하기가 제1 검출가능한 신호 및/또는 임의의 배경 신호(들)의 검출을
- 상기 처리 동안 하나 이상의 시점에서; 또는
- 상기 처리 동안 하나 이상의 시점에서 그리고 상기 처리 후에 하나 이상의 시점에서
포함하는, 방법.
구현예 103. 구현예 1 내지 101 중 어느 하나에 있어서, 상기 결정하기가 제1 검출가능한 신호 및/또는 임의의 배경 신호(들)의 검출을
- 상기 처리 후에 하나 이상의 시점에서
포함하는, 방법.
구현예 104. 구현예 1 내지 101 중 어느 하나에 있어서, 상기 결정하기가 제2 검출가능한 신호 및/또는 임의의 배경 신호(들)의 검출을
- 상기 처리 동안 하나 이상의 시점에서; 또는
- 상기 처리 동안 하나 이상의 시점에서 그리고 상기 처리 후에 하나 이상의 시점에서
포함하는, 방법.
구현예 105. 구현예 1 내지 101 중 어느 하나에 있어서, 상기 결정하기가 제2 검출가능한 신호 및/또는 임의의 배경 신호(들)의 검출을
- 상기 처리 후에 하나 이상의 시점에
포함하는, 방법.
구현예 106. 구현예 1 내지 105 중 어느 하나에 있어서,
- 제1 및 제2 표적의 존재 또는 부재 결정하기가 용융 곡선 분석을 포함하는,
방법.
구현예 107. 구현예 6에 있어서,
- 제1 및 제2 표적의 존재 또는 부재 결정하기가 제1 및 제2 검출가능한 신호 및 임의로 제1 및 제2 배경 신호를 포함하는 용융 곡선 분석을 포함하는,
방법.
구현예 108. 구현예 55에 있어서,
- 제1 및 제2 표적의 존재 또는 부재 상기 결정하기가 제1 및 제2 검출가능한 신호 및 임의로 제1 및 제2 배경 신호; 또는
- 제1 및 제2 검출가능한 신호 및 임의로 제3 배경 신호
를 포함하는 용융 곡선 분석을 포함하는,
방법.
구현예 109. 구현예 1 내지 108 중 어느 하나에 있어서,
- 제1 표적 및/또는 제2 표적이 핵산의 앰플리콘인,
방법.
구현예 110. 구현예 1 내지 109 중 어느 하나에 있어서,
- 제1 표적이 핵산이고/거나 제2 표적이 핵산이고,
- 혼합물이 추가로 상기 제1 및/또는 제2 표적의 증폭을 위한 시약을 포함하고,
- 혼합물 상기 처리가 추가로 제1 및/또는 제2 표적의 증폭을 실행하기에 적합한 조건을 포함하는,
방법.
구현예 111. 구현예 110에 있어서,
- 증폭이 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR), 가닥 변위 증폭 (SDA), 니킹 효소 증폭 반응 (NEAR), 헬리카제 의존적 증폭 (HDA), 리콤비나제 폴리머라제 증폭 (RPA), 루프-매개 등온 증폭 (LAMP), 회전 환 증폭 (RCA), 전사-매개 증폭 (TMA), 자가-지속 서열 복제 (3SR), 핵산 서열 기반된 증폭 (NASBA), 리가제 연쇄 반응 (LCR) 또는 분지화 증폭 방법 (RAM), 및/또는 역전사 폴리머라제 연쇄 반응 (RT-PCR) 중 어느 하나 이상인,
방법.
구현예 112. 구현예 110 또는 구현예 111에 있어서, 상기 결정하기가
- 상기 증폭에 앞서 또는 상기 증폭 시작하기의 1, 2, 3, 4, 또는 5 주기 내에 발생하고/거나;
- 상기 증폭의 완료 후에 발생하는,
방법.
구현예 113. 구현예 110 내지 112 중 어느 하나에 있어서, 상기 결정하기가
- 상기 증폭에 앞서 또는 상기 증폭 시작하기의 1, 2, 3, 4, 또는 5 분 내에 발생하고/거나;
- 상기 증폭의 완료 후에 발생하는,
방법.
구현예 114. 구현예 110 내지 113 중 어느 하나에 있어서, 상기 결정하기가
- 상기 증폭에 앞서 제1 시점에서; 및
- 상기 증폭의 완료 후에 제2 시점에서
발생하는, 방법.
구현예 115. 구현예 110 내지 114 중 어느 하나에 있어서,
- 증폭 방법이 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)이고;
- 상기 결정하기가 임의로 각 주기에서 여러 주기로 발생하는,
방법.
구현예 116. 구현예 110 또는 구현예 111에 있어서,
- 상기 증폭에 앞서 및/또는 반응 상기 처리에 앞서 제1 온도에서 생성된 양성 대조군 신호를 사용하여 상기 증폭 동안 또는 후에 한 시점에서 측정된 제1 온도에서 제1 검출가능한 신호; 및/또는
- 상기 증폭에 앞서 및/또는 반응 상기 처리에 앞서 제2 온도에서 생성된 양성 대조군 신호를 사용하여 상기 증폭 동안 또는 후에 한 시점에서 측정된 제2 온도에서 제2 검출가능한 신호
를 정규화하는 추가로 단계를 포함하는, 방법.
구현예 117. 구현예 110 또는 구현예 111에 있어서,
- 상기 증폭에 앞서 및/또는 반응 상기 처리에 앞서 제1 온도에서 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드에 의해 생성된 검출가능한 신호를 사용하는 제1 검출가능한 신호; 및/또는
- 상기 증폭에 앞서 및/또는 반응 상기 처리에 앞서 추가의 온도에서 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드에 의해 생성된 검출가능한 신호를 사용하는 제2 검출가능한 신호
를 정규화하는 단계를 추가로 포함하되;
추가의 온도가 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 Tm 초과인,
방법.
구현예 118. 구현예 1 내지 117 중 어느 하나에 있어서,
- 상기 변형 후에 제1 표적의 알려진 농도 및/또는 제1 올리고뉴클레오티드의 알려진 농도를 사용하여 제1 표적 양성 대조군 신호를 생성하는 단계
를 추가로 포함하는, 방법.
구현예 119. 구현예 1 내지 118 중 어느 하나에 있어서,
- 상기 제1 표적을 포함하는 별도 대조군 샘플 상에서 방법을 반복함으로써 제1 표적 양성 대조군 신호를 생성하는 단계를 추가로 포함하는,
방법.
구현예 120. 구현예 119에 있어서,
- 제1 표적을 포함하는 별도 대조군 샘플이 제1 표적의 알려진 농도를 포함하는,
방법.
구현예 121. 구현예 119 또는 구현예 120에 있어서,
- 제1 표적을 포함하는 별도 대조군 샘플이 제2 표적을 추가로 포함하는,
방법.
구현예 122. 구현예 1 내지 121 중 어느 하나에 있어서,
- 상기 변형 후에 제2 표적의 알려진 농도 및/또는 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 알려진 농도를 사용하여 제2 표적 양성 대조군 신호를 생성하는 단계
를 추가로 포함하는, 방법.
구현예 123. 구현예 1 내지 122 중 어느 하나에 있어서,
- 제2 표적을 포함하는 별도 대조군 샘플 상에서 상기 방법을 반복함으로써 제2 표적 양성 대조군 신호를 생성하는 단계
를 추가로 포함하는, 방법.
구현예 124. 구현예 123에 있어서,
- 제2 표적을 포함하는 대조군 샘플이 제2 표적의 알려진 농도를 포함하는,
방법.
구현예 125. 구현예 123 또는 구현예 124에 있어서,
- 제2 표적을 포함하는 상기 대조군 샘플이 상기 제1 표적을 추가로 포함하는,
방법.
구현예 126. 구현예 1 내지 125 중 어느 하나에 있어서,
- 제1 표적 및 제2 표적을 포함하는 별도 대조군 샘플 상에서 상기 방법을 반복함으로써 조합된 양성 대조군 신호를 생성하는 단계
를 추가로 포함하는, 방법.
구현예 127. 구현예 126에 있어서,
- 조합된 대조군 샘플이 제1 표적의 알려진 농도 및/또는 제2 표적의 알려진 농도를 포함하는,
방법.
구현예 128. 구현예 116 내지 127 중 어느 하나에 있어서,
- 임의의 양성 대조군 신호를 사용하여 제1 검출가능한 신호 및/또는 제2 검출가능한 신호를 정규화하는 단계
를 추가로 포함하는, 방법.
구현예 129. 구현예 116 내지 128 중 어느 하나에 있어서,
- 구현예 1 내지 115 중 어느 하나의 방법을
(i) 상기 제1 표적; 또는
(ii) 상기 제2 표적; 또는
(iii) 상기 제1 표적 또는 상기 제2 표적
을 함유하지 않는 별도 음성 대조군 샘플 상에서 반복함으로써 음성 대조군 신호의 수준을 평가하는 단계를 추가로 포함하는,
방법.
구현예 130. 구현예 129에 있어서,
- 상기 음성 대조군 신호를 사용하여 제1 검출가능한 신호 및/또는 제2 검출가능한 신호를 정규화하는 단계
를 추가로 포함하는, 방법.
구현예 131. 구현예 116 내지 130 중 어느 하나에 있어서,
- 임의의 대조군 신호가 형광성 대조군 신호인,
방법.
구현예 132. 구현예 1 내지 131 중 어느 하나에 있어서, 제1 및/또는 제2 검출가능한 신호를 역치와 비교하는 단계를 추가로 포함하되:
- 역치가 구현예 1 내지 115 중 어느 하나의 방법에 따라 검사된 일련의 샘플 또는 이의 유도체로부터 유래된 검출가능한 신호를 사용하여, 그리고
(i) 무 템플레이트 대조군 및 제1 표적
(ii) 무 템플레이트 대조군 및 제2 표적
(iii) 무 템플레이트 대조군, 제1 표적, 및 제2 표적
중 어느 하나 이상을 포함하여 생성되어 이에 의해 샘플에서 제1 및 제2 표적의 존재 또는 부재를 결정하는,
방법.
구현예 133. 구현예 132에 있어서,
- 일련의 샘플 또는 이의 유도체가 제1 올리고뉴클레오티드의 알려진 농도 및/또는 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 알려진 농도를 사용하여 검사되는,
방법.
구현예 134. 구현예 1 내지 133 중 어느 하나에 있어서,
- 샘플이 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플인,
방법.
구현예 135. 구현예 1 내지 133 중 어느 하나에 있어서,
- 방법이 시험관내 수행되는,
방법.
구현예 136. 구현예 1 내지 133 중 어느 하나에 있어서,
- 방법이 생체외 수행되는,
방법.
구현예 137. 구현예 1 내지 136 중 어느 하나에 있어서,
- 제1 및 제2 검출가능한 모이어티가 가시 스펙트럼의 동일한 색 영역에서 방사하는,
방법.
구현예 138.
- 제1 표적이 핵산이고 제1 올리고뉴클레오티드의 적어도 한 부분에 상보적인, 제1 표적의 검출을 위한 제1 올리고뉴클레오티드, 및
- 제1 검출 모이어티, 여기서:
제1 검출 모이어티는 제1 올리고뉴클레오티드의 변형시 제1 검출가능한 신호를 생성할 수 있고,
변형은 상보적 염기 짝짓기에 의해 제1 올리고뉴클레오티드에 제1 표적의 혼성화에 의해 유도됨;
- 이중-가닥 스템 부분의 적어도 하나의 가닥이 제2 검출 모이어티를 포함하는, 제2 표적의 검출을 위한, 그리고 미혼성화된 뉴클레오티드의 끊어지지 않은 단일-가닥 루프 부분에 의해 연결되는 대향 가닥에 혼성화된 뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분을 포함하는 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드; 및
- 제2 표적이 샘플에서 존재하는 때에만 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 미혼성화된 뉴클레오티드의 하나 이상을 소화시켜, 이에 의해 단일-가닥 루프 부분을 끊고 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드를 제공할 수 있는 제1 효소
를 포함하되;
- 제2 검출 모이어티가 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분의 해리시 제2 검출가능한 신호를 생성할 수 있고,
- 제1 및 제2 검출 모이어티가 단일 유형의 검출기를 사용하여 단일 온도에서 차별될 수 없는 검출가능한 신호를 생성할 수 있는,
조성물.
구현예 139. 구현예 138에 있어서,
- 제1 표적에 상보적인 제1 올리고뉴클레오티드의 영역이 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분의 각 가닥에 상이한 용융 온도 (Tm)를 갖는,
조성물.
구현예 140. 구현예 138 또는 구현예 139에 있어서, 제1 올리고뉴클레오티드가
온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분의 각 가닥; 및
온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 단일-가닥 루프 부분
과 서열에서 상이한, 조성물.
구현예 141. 구현예 138 내지 140 중 어느 하나에 있어서,
- 제1 올리고뉴클레오티드가 전부 또는 한 부분이 제1 표적에 상보적인 미혼성화된 뉴클레오티드의 끊어지지 않은 단일-가닥 루프 부분에 의해 연결되는 대향 가닥 상에 혼성화된 뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분을 포함하는 스템-루프 올리고뉴클레오티드인,
조성물.
구현예 142. 구현예 141에 있어서,
- 제1 표적이 제1 올리고뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분에서 가닥의 해리를 야기시키는 상보적 염기 짝짓기에 의해 제1 올리고뉴클레오티드에 혼성화되어 제1 검출 모이어티가 제1 검출가능한 신호를 제공하게 하는,
조성물.
구현예 143. 구현예 138 내지 140 중 어느 하나에 있어서,
- 제1 올리고뉴클레오티드가
이의 대향 가닥이 미혼성화된 뉴클레오티드의 단일-가닥 루프 부분에 의해 연결되고, 이의 전부 또는 한 부분이 제1 표적에 상보적인, 혼성화된 뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분, 및
3' 방향으로 상기 대향 가닥 중 하나로부터 확장하고 제1 표적의 한 부분에 상보적인 서열로 종결하는 제2 단일-가닥 부분, 및
제1 표적의 부분에 상보적인 상기 서열에 선행하는 차단제 분자
를 포함하는 스템-루프 올리고뉴클레오티드인,
조성물.
구현예 144. 구현예 143에 있어서,
- 제1 표적이 상보적 염기 짝짓기에 의해 이의 제2 단일-가닥 부분에 혼성화되고;
조성물이 이중-가닥 핵산을 제공하기 위해 템플레이트 서열로서 제1 표적을 사용하여 제2 단일-가닥 부분을 확장시킬 수 있는 폴리머라제를 추가로 포함하되, 상기 차단제 분자는 템플레이트로서 상기 1개 대향 가닥을 사용하여 제1 표적을 확장시키는 폴리머라제를 방지할 수 있고,
이중-가닥 핵산의 변성 시, 폴리머라제에 의해 확장된 제2 단일-가닥 부분이 상보적 염기 짝짓기에 의해 제1 올리고뉴클레오티드의 단일-가닥 루프 부분에 혼성화하여 신호전달 듀플렉스를 생산할 수 있고 이에 의해 제1 검출 모이어티가 제1 검출가능한 신호를 제공하게 하는,
조성물.
구현예 145. 구현예 141 내지 144 중 어느 하나에 있어서,
- 제1 검출 모이어티가 형광단인,
조성물.
구현예 146. 구현예 145에 있어서,
- 제1 올리고뉴클레오티드가 퀀처 분자를 포함하고, 형광단 및 퀀처 분자가 제1 올리고뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분의 대향 가닥 상에 위치해 있는,
조성물.
구현예 147. 구현예 138 내지 140 중 어느 하나에 있어서,
- 제1 올리고뉴클레오티드가
제1 가닥이 상기 상보적 서열에 선행하는 차단제 분자를 포함하는, 이의 제1 가닥이 제1 표적의 한 부분에 혼성화할 수 있는 상보적 서열로 종결하는 단일-가닥 부분으로 확장하는, 혼성화된 뉴클레오티드의 제1 이중-가닥 부분
을 포함하고.
- 조성물이 폴리머라제를 추가로 포함하는,
조성물.
구현예 148. 구현예 147에 있어서,
제1 표적의 한 부분이 상보적 염기 짝짓기에 의해 단일-가닥 부분의 상보적 서열에 혼성화되고;
조성물이 제2 이중-가닥 부분을 제공하기 위해 템플레이트 서열로서 제1 표적을 사용하여 상보적 서열을 확장시킬 수 있는 폴리머라제를 추가로 포함하되, 상기 차단제 분자는 템플레이트로서 단일-가닥 부분을 사용하여 제1 표적을 확장시키는 폴리머라제를 방지하고;
제1 및 제2 이중-가닥 부분이 변성되는 때, 폴리머라제에 의해 확장된 상보적 서열이 상보적 염기 짝짓기에 의해 제1 이중-가닥 부분의 제1 가닥에 혼성화하여 신호전달 듀플렉스를 생산할 수 있고 이에 의해 제1 검출 모이어티가 제1 검출가능한 신호를 제공하게 하는,
조성물.
구현예 149. 구현예 147 또는 구현예 148에 있어서,
- 제1 검출 모이어티가 형광단이고 변형이 퀀처 분자로부터 이의 거리를 증가시키는,
조성물;
구현예 150. 구현예 149에 있어서,
- 제1 올리고뉴클레오티드가 퀀처 분자를 포함하고, 형광단 및 퀀처 분자가 제1 이중-가닥 부분의 대향 가닥 상에 위치해 있는,
조성물.
구현예 151. 구현예 138 내지 140 중 어느 하나에 있어서,
- 제1 올리고뉴클레오티드가 표적의 제1 부분에 상보적이고;
- 조성물이 제1 표적 제2 부분에 상보적인 추가의 올리고뉴클레오티드를 추가로 포함하되, 제1 표적의 제1 및 제2 부분은 서로 측접하지만 중첩하지 않고, 각각 제1 표적에 혼성화하여
(i) 표적에 제1 올리고뉴클레오티드 혼성화에 의해 또는 상보적 염기 짝짓기에 의해 제1 이중-가닥 구성요소, 및
(ii) 상보적 염기 짝짓기에 의해 표적에 추가의 올리고뉴클레오티드를 혼성화시킴으로써 제2 이중-가닥 구성요소
를 포함하는 듀플렉스 구조를 형성할 수 있고,
이에 의해 제1 및 추가의 올리고뉴클레오티드를 근접시키고, 제1 검출 모이어티가 제1 검출가능한 신호를 제공하게 하는,
조성물.
구현예 152. 구현예 151에 있어서,
- 제1 검출가능한 모이어티가 형광단이고 추가의 올리고뉴클레오티드가 퀀처를 포함하고;
- 듀플렉스 구조의 형성이 추가로 형광단 및 퀀처를 근접시키고;
- 상기 검출가능한 신호가 제1 검출 모이어티에 의해 제공된 형광에서의 감소인,
조성물.
구현예 153. 구현예 138 내지 140 중 어느 하나에 있어서,
- 제1 올리고뉴클레오티드가 상보적 염기 짝짓기에 의해 제1 표적에 혼성화되고,
- 조성물이
상보적 염기 짝짓기에 의해 제1 표적의 한 부분에 혼성화된 프라이머, 및
템플레이트 서열로서 제1 표적을 사용하여 프라이머를 확장시켜 이에 의해 제1 올리고뉴클레오티드를 소화시키고 제1 올리고뉴클레오티드를 변형시켜 제1 검출 모이어티가 제1 검출가능한 신호를 제공하게 할 수 있는 엑소뉴클레아제 활성이 있는 폴리머라제
를 추가로 포함하는, 방법.
구현예 154. 구현예 138 내지 140 중 어느 하나에 있어서,
- 제1 표적이 상보적 염기 짝짓기에 의해 제1 올리고뉴클레오티드에 혼성화되어 이에 의해 이중-가닥 듀플렉스를 형성하고,
- 조성물이 제1 표적을 포함하는 이중-가닥 듀플렉스를 소화시켜 이에 의해 제1 올리고뉴클레오티드를 변형시키고 제1 검출 모이어티가 제1 검출가능한 신호를 제공하게 할 수 있는 제한 엔도뉴클레아제를 추가로 포함하는,
조성물.
구현예 155. 구현예 154에 있어서,
- 제한 엔도뉴클레아제가 상기 이중-가닥 듀플렉스의 가닥과 결합할 수 있고 이를 절단시킬 수 있는 니킹 엔도뉴클레아제이고, 상기 가닥이 제1 올리고뉴클레오티드를 포함하는,
조성물.
구현예 156. 구현예 153 내지 155 중 어느 하나에 있어서,
- 제1 검출 모이어티가 형광단이고 제1 올리고뉴클레오티드의 변형이 퀀처 분자로부터 형광단의 거리를 증가시키는,
조성물.
구현예 157. 구현예 156에 있어서,
- 제1 올리고뉴클레오티드가 퀀처 분자를 포함하는,
조성물.
구현예 158.
- 제1 검출 모이어티를 포함하는 제1 표적의 검출을 위한 제1 올리고뉴클레오티드, 여기서:
제1 검출 모이어티는 제1 올리고뉴클레오티드의 변형시 제1 검출가능한 신호를 생성할 수 있고,
변형은 제1 표적에 의해 유도됨;
- 이중-가닥 스템 부분의 적어도 하나의 가닥이 제2 검출 모이어티를 포함하는, 제2 표적의 검출을 위한, 그리고 미혼성화된 뉴클레오티드의 끊어지지 않은 단일-가닥 루프 부분에 의해 연결되는 대향 가닥에 혼성화된 뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분을 포함하는 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드; 및
- 제2 표적이 샘플에서 존재하는 때에만 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 미혼성화된 뉴클레오티드의 하나 이상을 소화시켜, 이에 의해 단일-가닥 루프 부분을 끊고 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드를 제공할 수 있는 제1 효소
를 포함하되;
- 제2 검출 모이어티가 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분의 해리시 제2 검출가능한 신호를 생성할 수 있고,
- 제1 및 제2 검출 모이어티가 단일 유형의 검출기를 사용하여 단일 온도에서 차별될 수 없는 검출가능한 신호를 생성할 수 있는,
조성물.
구현예 159. 구현예 158에 있어서, 제1 올리고뉴클레오티드가
온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분의 각 가닥; 및
온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 단일-가닥 루프 부분
과 서열에서 상이한, 조성물.
구현예 160. 구현예 158 또는 구현예 159에 있어서,
- 제1 표적이 핵산 서열이고;
- 조성물이
제1 표적에서 제1 서열에 상보적인 제1 프라이머,
제1 서열과 상이한 제1 표적에서 제2 서열에 상보적인 구성요소, 및 제1 표적에 상보적이지 않은 태그 부분을 포함하는 제2 올리고뉴클레오티드,
엑소뉴클레아제 활성이 있는 제1 폴리머라제, 및
임의로 제2 폴리머라제
를 추가로 포함하는, 조성물.
구현예 161. 구현예 160에 있어서,
- 제1 프라이머 및 제2 올리고뉴클레오티드가 상보적 염기 짝짓기에 의해 제1 표적에 각 혼성화되고,
제1 폴리머라제가 템플레이트로서 표적을 사용하여 제1 프라이머를 확장시켜 이에 의해 태그 부분을 절단 제거하여, 절단된 태그 부분이 상보적 염기 짝짓기에 의해 제1 올리고뉴클레오티드에 혼성화할 수 있게 하고,
제1 폴리머라제 또는 임의적 제2 폴리머라제가 템플레이트로서 제1 올리고뉴클레오티드를 사용하여 태그 부분을 확장시켜 제1 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중-가닥 서열을 생성하여 이에 의해 제1 올리고뉴클레오티드를 변형시킬 수 있고 제1 검출 모이어티가 제1 검출가능한 신호를 제공할 수 있게 하는,
조성물.
구현예 162. 구현예 160 또는 구현예 161에 있어서,
- 제1 올리고뉴클레오티드가 형광단 및 퀀처 분자를 포함하는,
조성물.
구현예 163. 구현예 162에 있어서,
- 제1 올리고뉴클레오티드가 형광단 및 퀀처 분자를 포함하고,
- 태그 부분 상기 확장이 형광단과 퀀처 분자 사이 거리를 증가시키는,
조성물.
구현예 164. 구현예 158 또는 구현예 159에 있어서,
- 제1 표적이 효소 촉매적 활성을 위한 보조-인자이고;
- 조성물이 촉매적 활성을 위한 보조-인자를 필요로 하는 DNA자임 또는 리보자임을 추가로 포함하고,
- DNA자임 또는 리보자임이 제1 표적에 결합할 수 있고 상보적 염기 짝짓기에 의해 제1 올리고뉴클레오티드에 혼성화하여, 이에 의해 제1 올리고뉴클레오티드를 소화 및 변형시켜 제1 검출 모이어티가 제1 검출가능한 신호를 생성하게 할 수 있는,
조성물.
구현예 165. 구현예 164에 있어서, 보조-인자가 금속 이온, 또는 Mg2+, Mn2+, Ca2+, Pb2+로부터 선택된 금속 이온인, 조성물.
구현예 166. 구현예 158 또는 구현예 159에 있어서,
- 제1 올리고뉴클레오티드가 다-구성요소 핵산 효소 (MNA자임)를 위한 기질이고;
- 제1 표적이 샘플에서 존재하는 때 조성물이 제1 올리고뉴클레오티드를 절단시킬 수 있는 MNA자임을 추가로 포함하고;
- MNA자임이 제1 표적에 결합할 수 있고 이의 기질 아암을 통해 상보적 염기 짝짓기에 의해 제1 올리고뉴클레오티드에 혼성화할 수 있고, 상기 혼성화가 제1 올리고뉴클레오티드의 절단을 용이하게 하여 이에 의해 이를 변형시키고 제1 검출 모이어티가 제1 검출가능한 신호를 제공하게 하는,
방법.
구현예 167. 구현예 166에 있어서,
- 제1 표적이 핵산 서열이고;
- 제1 표적이 상보적 염기 짝짓기에 의해 MNA자임의 센서 아암에 혼성화되어 이에 의해 MNA자임의 조립을 촉진시키는,
조성물.
구현예 168. 구현예 158 또는 구현예 159에 있어서,
- 제1 표적이 분석물, 단백질, 화합물 또는 분자이고;
- 제1 올리고뉴클레오티드가 압타자임을 위한 기질이고;
- 조성물이 제1 표적에 결합할 수 있는 압타머 부분, 및 제1 올리고뉴클레오티드를 소화시키고 이에 의해 이를 변형시켜 제1 검출 모이어티가 제1 검출가능한 신호를 제공하게 할 수 있는 핵산 효소 부분을 포함하는 압타자임을 추가로 포함하는,
조성물.
구현예 169. 구현예 168에 있어서,
- 제1 표적이 압타자임의 압타머 부분에 결합되고 제1 올리고뉴클레오티드가 상보적 염기 짝짓기에 의해 활성 핵산 효소 부분에 혼성화되어 제1 올리고뉴클레오티드의 소화를 촉진시키고 이에 의해 이를 변형시켜 제1 검출 모이어티가 제1 검출가능한 신호를 제공하게 하는,
조성물.
구현예 170. 구현예 166 내지 169 중 어느 하나에 있어서,
- 제1 검출 모이어티가 형광단이고 제1 올리고뉴클레오티드 상기 변형이 퀀처 분자로부터 형광단의 거리를 증가시키는,
조성물.
구현예 171. 구현예 170에 있어서,
- 제1 올리고뉴클레오티드가 퀀처 분자를 포함하는,
조성물.
구현예 172. 구현예 138 내지 144, 147, 148, 151, 153 내지 155, 158 내지 161, 및 164 내지 169 중 어느 하나에 있어서,
- 제1 검출 모이어티가 나노입자, 금속성 나노입자, 귀금속 나노입자, 알칼리 금속 나노입자, 금 나노입자, 또는 은 나노입자이고; 여기에 제1 올리고뉴클레오티드가 결합되고;
- 제1 검출가능한 신호가, 제1 올리고뉴클레오티드의 변형 이후 제1 검출 모이어티로부터 발생하는,
(i) 굴절률에서의 변화,
(ii) 색에서의 변화; 및/또는
(iii) 흡수 스펙트럼에서의 변화인,
조성물.
구현예 173. 구현예 172에 있어서,
- 제1 검출 모이어티가 제1 올리고뉴클레오티드가 결합되는 전기화학적 제제이고;
- 제1 검출가능한 신호가 전기화학적 신호에서의 변화인,
조성물.
구현예 174. 구현예 173에 있어서,
- 전기화학적 제제가 나노입자, 메틸렌 블루, 톨루엔 블루, 오라세트 블루, Hoechst 33258, [Ru(phen)3]2+, 페로센, 및/또는 다우노마이신 중 어느 하나 이상으로부터 선택되는,
조성물.
구현예 175. 구현예 172 내지 174 중 어느 하나에 있어서,
- 제2 검출 모이어티가 나노입자, 금속성 나노입자, 귀금속 나노입자, 알칼리 금속 나노입자, 금 나노입자, 또는 은 나노입자이고; 여기에 제2 올리고뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분의 적어도 하나의 가닥이 결합되고
- 제2 검출가능한 신호가, 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분의 해리시 발생하는,
(i) 굴절률에서의 변화,
(ii) 색에서의 변화; 및/또는
(iii) 흡수 스펙트럼에서의 변화인,
조성물.
구현예 176. 구현예 172 내지 174 중 어느 하나에,
- 제2 검출 모이어티가 제2 올리고뉴클레오티드가 결합되는 전기화학적 제제이고;
- 제2 검출가능한 신호가 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분의 해리시 발생하는 전기화학적 신호에서의 변화인,
조성물.
구현예 177. 구현예 176에 있어서,
- 전기화학적 제제가 나노입자, 메틸렌 블루, 톨루엔 블루, 오라세트 블루, Hoechst 33258, [Ru(phen)3]2+, 페로센, 및/또는 다우노마이신 중 어느 하나 이상으로부터 선택되는,
조성물.
구현예 178. 구현예 145, 146, 149, 150, 152, 156, 157, 162, 163, 170, 및 171 중 어느 하나에 있어서,
- 제2 검출 모이어티가 형광단이고,
- 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분의 해리시 상기 제2 검출 모이어티에 의해 제공된 제2 검출가능한 신호가 퀀처 분자로부터 형광단의 거리를 증가시키는,
조성물.
구현예 179. 구현예 178에 있어서,
- 형광단 및 퀀처 분자가 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분의 대향 가닥 상에 위치해 있는,
조성물.
구현예 180. 구현예 138 내지 179 중 어느 하나에 있어서,
- 제1 효소가 제1 MNA자임이고,
- 제1 MNA자임이 상기 제2 표적에 결합되고,
- 상기 제1 MNA자임의 기질 아암이 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 단일 루프 부분에 상보적 염기 짝짓기에 의해 혼성화되어, 이에 의해 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 하나 이상의 미혼성화된 뉴클레오티드의 소화를 촉진시키고 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드를 제공하는,
조성물.
구현예 181. 구현예 180에 있어서,
- 제2 표적이 또는 핵산 서열이고;
- 제2 표적이 상보적 염기 짝짓기에 의해 제1 MNA자임의 센서 아암에 혼성화되어 이에 의해 제1 MNA자임의 조립을 촉진시키는,
조성물.
구현예 182. 구현예 138 내지 179 중 어느 하나 중 어느 하나에 있어서,
- 제2 표적이 분석물, 단백질, 화합물 또는 분자이고;
- 제1 효소가 제2 표적에 결합할 수 있는 압타머를 포함하는 압타자임이고;
- 압타머가 제2 표적에 결합되어 이에 의해 제1 효소를 촉매적으로 활성으로 만드는,
조성물.
구현예 183. 구현예 182에 있어서,
- 제1 효소가 압타-DNA자임, 압타-리보자임, 압타-MNA자임 중 어느 하나인,
조성물.
구현예 184. 구현예 138 내지 179 중 어느 하나에 있어서,
- 제2 표적이 분석물, 단백질, 화합물 또는 분자이고;
- 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 단일-가닥 루프 부분이 압타자임을 위한 기질이고;
- 조성물이 제2 표적에 결합할 수 있는 압타머 부분, 및 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 하나 이상의 미혼성화된 뉴클레오티드를 소화시켜 이에 의해 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드를 형성할 수 있는 핵산 효소 부분을 포함하는 압타자임을 추가로 포함하는,
조성물.
구현예 185. 구현예 184에 있어서,
- 제2 표적이 압타자임의 압타머 부분에 결합되고 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 단일-가닥 루프 부분이 상보적 염기 짝짓기에 의해 활성 핵산 효소 부분에 혼성화되어, 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 하나 이상의 미혼성화된 뉴클레오티드의 소화를 촉진시켜 이에 의해 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드를 형성하는,
조성물.
구현예 186. 구현예 138 내지 179 중 어느 하나에 있어서,
- 제2 표적이 핵산 서열이고;
- 제1 효소가 제1 제한 엔도뉴클레아제이고,
- 제2 표적이 상보적 염기 짝짓기에 의해 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 단일-가닥 루프 부분에 혼성화되어 제1 제한 엔도뉴클레아제를 위한 이중-가닥 서열을 형성하여 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 하나 이상의 미혼성화된 뉴클레오티드와 결합하고 이를 소화시켜 이에 의해 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드를 형성하는,
조성물.
구현예 187. 구현예 186에 있어서,
- 제1 제한 엔도뉴클레아제가 제1 제한 엔도뉴클레아제를 위한 상기 이중-가닥 서열의 가닥과 결합할 수 있고 이를 절단시킬 수 있는 제1 니킹 엔도뉴클레아제이고, 상기 가닥이 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드를 포함하는,
조성물.
구현예 188. 구현예 138 내지 179 중 어느 하나에 있어서,
- 제1 효소가 엑소뉴클레아제 활성이 있는 폴리머라제를 포함하고,
- 제2 표적이 상보적 염기 짝짓기에 의해 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 단일-가닥 루프 부분에 혼성화되어 제2 표적의 한 부분을 포함하는 제1 이중-가닥 서열을 형성하고,
- 조성물이 제2 표적에 상보적 염기 짝짓기에 의해 혼성화된 제1 프라이머 올리고뉴클레오티드를 추가로 포함하여 제2 표적의 부분을 포함하는 제1 이중-가닥 서열에 비하여 업스트림 위치해 있는 제2 이중-가닥 서열을 형성하고,
- 프라이머가 템플레이트 서열로서 제2 표적 및 엑소뉴클레아제 활성이 있는 폴리머라제를 사용하여 확장되어, 제1 이중 가닥 서열의 단일-가닥 루프 부분을 소화시키고 이에 의해 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드를 형성하는,
조성물.
구현예 189. 구현예 138 내지 179 중 어느 하나에 있어서,
- 제1 효소가 엑소뉴클레아제이고,
- 제2 표적이 제2 표적의 한 부분을 포함하는 제1 이중-가닥 서열을 형성하는 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 단일-가닥 루프 부분에 상보적 염기 짝짓기에 의해 혼성화되고, 여기에 엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 제1 효소가 결합할 수 있고 이에 의해 제2 표적을 포함하는 제1 이중 가닥 서열의 단일-가닥 루프 부분을 소화시켜 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드를 형성할 수 있는,
조성물.
구현예 190. 구현예 138 내지 179 중 어느 하나에 있어서,
- 제1 효소가 촉매적 활성을 위한 보조-인자를 필요로 하는 DNA자임 또는 리보자임이고,
- 제2 표적이 보조-인자이고 DNA자임 또는 리보자임에 결합되고,
- DNA자임 또는 리보자임이 상보적 염기 짝짓기에 의해 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 단일-가닥 루프 부분에 혼성화되어, 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 단일-가닥 루프 부분의 하나 이상의 미혼성화된 뉴클레오티드를 소화시키고 이에 의해 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드를 형성하게 하는,
조성물.
구현예 191. 구현예 190에 있어서, 보조-인자가 금속 이온, 또는 Mg2+, Mn2+, Ca2+, Pb2+로부터 선택된 금속 이온인, 조성물.
구현예 192. 구현예 138 내지 150, 153, 156 내지 158,166 또는 167 중 어느 하나에 있어서,
- 제1 올리고뉴클레오티드가 Molecular Beacon®, Scorpions® 프라이머, TaqMan® 프라이머, 또는 MNA자임 기질 중 어느 하나 이상으로부터 선택되는,
조성물.
구현예 193. 구현예 138 내지 192 중 어느 하나에 있어서,
- 제1 표적 및/또는 제2 표적이 핵산의 앰플리콘인,
조성물.
구현예 194. 샘플에서 제1 및 제2 표적의 존재 또는 부재를 결정하는 방법으로서,
(a) 제1 및 제2 표적 또는 이들의 앰플리콘을 추정적으로 포함하는 샘플 또는 이의 유도체를
- 제1 표적 또는 이의 앰플리콘의 검출을 위한, 그리고 제1 검출가능한 신호를 생성할 수 있는 제1 검출 모이어티를 포함하는 제1 올리고뉴클레오티드;
- 제2 표적 또는 이의 앰플리콘의 검출을 위한, 그리고 혼성화된 뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분을 포함하고, 이의 대향 가닥은 미혼성화된 뉴클레오티드의 끊어지지 않은 단일-가닥 루프 부분에 의해 연결되며, 스템 부분이 제2 검출가능한 신호를 생성할 수 있는 제2 검출 모이어티를 포함하는 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드,
여기서 제1 및 제2 검출 모이어티는 단일 유형의 검출기를 사용하여 단일 온도에서 차별화될 수 없음; 및
- 제2 표적 또는 이의 앰플리콘이 샘플에서 존재하는 때만 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 미혼성화된 뉴클레오티드의 하나 이상을 소화시킬 수 있는 제1 효소
와 접촉시킴으로써 반응을 위한 혼합물을 제조하는 단계;
(b) 다음에 적합한 조건 하에 혼합물을 처리하는 단계:
- 제1 올리고뉴클레오티드에 대한 변형을 유도하여 이에 의해 제1 검출 모이어티가 제1 검출가능한 신호를 제공하게 하는 제1 표적 또는 이의 앰플리콘,
- 이에 의해 단일-가닥 루프 부분을 끊고 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드를 제공하기 위해, 제2 표적 또는 이의 앰플리콘이 샘플에서 존재하는 때만, 제1 효소에 의해 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 미혼성화된 뉴클레오티드의 하나 이상의 소화;
(c) 혼합물에서, 또는, 대조군 혼합물에서 제1 및 상기 제2 검출 모이어티에 의해 제공된 다음을 측정하는 단계:
- 제1 온도의 5℃에서 또는 내에서 제1 배경 신호, 및 제2 온도의 5℃에서 또는 내에서 제2 배경 신호, 또는
- 제3 온도에서 제3 배경 신호;
(d) 상기 처리 동안 또는 후에 하나 이상의 시점에서 다음을 결정하는 단계:
- 제1 검출가능한 신호가 제1 또는 제3 배경 신호와 상이한 제1 온도에서 생성되는지, 여기서:
제1 온도에서 생성된 제2 검출가능한 신호는 제1 또는 제3 배경 신호와 상이하지 않고,
제1 검출가능한 신호와 제1 또는 제3 배경 신호 사이 차이의 검출은 제1 올리고뉴클레오티드의 변형 그리고 샘플에서 제1 표적 또는 이의 앰플리콘의 존재를 나타냄; 및
- 제2 검출가능한 신호가 제2 또는 제3 배경 신호와 상이한 제2 온도에서 생성되는지
를 포함하되, 제2 온도에서:
분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분의 가닥은 해리하여 제2 검출 모이어티가 샘플에서 제2 표적 또는 이의 앰플리콘의 존재를 나타내는 제2 검출가능한 신호를 제공하게 하고;
온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분의 가닥은 해리할 수 없어 이에 의해 제2 검출가능한 모이어티의 억압 그리고 샘플에서 제2 표적의 부재를 나타내는 제2 검출가능한 신호의 부재를 보장하는,
방법.
도면의 간단한 설명
본 발명의 바람직한 구현예는 아래 제시된 대로 첨부하는 도면을 참조하여 예만의 방식으로 이제 기재될 것이다.
도 1 온전한 및 분할된 입체구조로 예시적 LOCS 리포터 및 이의 용융 온도 (Tm)가 실례된다. 예시된 대로 LOCS 리포터는 핵산의 검출을 위하여 당업계에서 잘 알려진 다양한 표준 리포터 프로브 및 기질과 조합으로 사용될 수 있다. 예시적 온전한 LOCS 리포터 (도 1A, LHS; 상단 및 하단)는 절단 또는 분해될 수 있는 루프 영역, 스템 영역 및 검출 모이어티, 예를 들어 형광단 (F) 퀀처 (Q) 염료 쌍을 갖는다. 표적의 존재 하에서 루프 영역의 절단 또는 분해는 분할된 LOCS 리포터 구조 (도 1B RHS; 상단 및 하단)를 생산할 수 있다. 온전한 LOCS의 스템 영역의 용융 온도 (Tm A)는 분할된 LOCS내 스템 영역의 Tm (Tm B)보다 높다. 따라서 온전한 LOCS의 스템은 Tm A 이상의 온도에 용융 및 분리할 것이다. 대조적으로, 분할된 LOCS의 2개 단편을 보유하는 스템은 증가된 형광을 초래하는 Tm B 이상의 온도에서 용융 및 분리할 것이다.
도 2는 범용이고 임의의 표적을 검출하는데 사용될 수 있는 LOCS 올리고뉴클레오티드를 사용하여 표적의 검출을 위한 예시적 전략을 실례한다. 이 체계에서 LOCS 올리고뉴클레오티드는 스템 영역, 형광단 퀀처 염료 쌍 및 루프 영역을 함유한다. 루프 영역은 촉매적 핵산에 대한 범용 기질 예컨대 당업계에서 PlexZyme으로서 또한 알려진, MNA자임을 포함한다. 구성요소 파트자임의 표적 센서 아암이 표적 상에 인접해서 정렬하는 때 MNA자임은 형성한다. LOCS 올리고뉴클레오티드의 루프 영역은 조립된 MNA자임의 기질 결합 아암에 결합하고 LOCS 루프 내에서 기질은 MNA자임에 의해 절단되어 분할된 LOCS 구조를 생성한다. 양쪽 온전한 LOCS 및 분할된 LOCS는, 반응 환경의 온도가 그들의 스템의 용융 온도, 즉 Tm A 및 Tm B 각각 초과 또는 미만인지 여부에 따라, 어느 한쪽 퀀칭될 것이거나, 형광을 생성할 것이다. Tm B와 Tm A 사이 온도에서 형광의 존재는 절단을 촉진시키는 표적의 존재를 나타낸다. 표적은 직접적으로 검출될 수 있거나, 표적 증폭 프로토콜에 의해 생산된 표적 앰플리콘은 검출될 수 있다.
도 3은 선형 MNA자임 기질이 이의 루프 내에서 MNA자임 기질을 포함하는 단일 LOCS 프로브와 공동으로 사용되는 경우 본 발명의 바람직한 구현예를 위한 예시적 전략을 실례한다. 선형 MNA자임 기질 및 단일 LOCS 프로브는 동일한 검출 모이어티, 예를 들어 특정 형광단 (F)/퀀처 (Q) 염료 쌍으로 양쪽 표지된다. 선형 기질은 제1 표적 1의 존재 하에서 조립하는 제1 MNA자임에 의해 절단가능한 제1 기질 서열을 함유한다 (도 3A). 표적 1의 존재 하에서 선형 기질은 절단되어, 모든 온도에서 검출될 수 있는 형광에서의 증가를 초래한다. LOCS 프로브는 제2 표적 2의 존재 하에서 조립하는 제2 MNA자임에 의해 절단가능한 이의 루프 내에서 제2 기질 서열을 함유한다 (도 3B). 표적 2의 존재 하에서 LOCS 기질은 절단되어 온전한 LOCS의 용융 온도 (Tm A)보다 낮은 Tm B에서 용융하는 분할된 LOCS를 생성한다. Tm B 미만 온도에서, 분할된 LOCS의 스템 부분은 혼성화된 채로 남아있고 (밀폐되고) 따라서 퀀칭된 채로 남아있다. Tm B 초과 온도에서, 분할된 LOCS의 스템 부분은 해리 (분리)하고 형광은 증가한다. 양쪽 표적이 존재하고, 형광이 Tm B 미만 온도에서 측정되는 때, 형광에서의 증가는 표적 1과만 연관되고; 형광이 Tm B 초과, 그러나 Tm A 미만 온도에서 측정되는 때, 형광에서의 증가는 표적 1 및/또는 표적 2와 연관될 수 있다.
도 4는, 다른 유형의 리포터 프로브 또는 기질 이러한 표준 TaqMan, 분자성 비콘, 스콜피온 유니-프로브, 스콜피온 비-프로브 또는 선형 MNA자임 기질 프로브와 조합으로 사용될 수 있는, 표적에 특이적인 LOCS 올리고뉴클레오티드를 사용하여 표적의 검출을 위한 예시적 전략을 실례한다. 온전한 LOCS 올리고뉴클레오티드는 표적 앰플리콘에 상보적인 영역을 포함하는 스템 영역, 형광단 퀀처 염료 쌍 및 루프 영역을 함유할 수 있다. 도 4A에 실례된 체계에서, LOCS 올리고뉴클레오티드의 루프 영역은 증폭 동안 표적 앰플리콘에 상보적이고 결합한다. 프라이머의 확장 동안, 폴리머라제의 엑소뉴클레아제 활성은 루프 영역을 분해하지만 스템 영역을 온전하게 남긴다. 스템 영역은 서로에 상보적이지만 그들의 표적에 대해서는 아니다. 분해는 분할된 LOCS를 생성하고, 여기서 스템은 스템의 Tm 미만 온도에서 혼성화된 및 퀀칭된 채로 남아있다. 온도가 스템의 Tm 초과로 상승되는 때, 가닥은 분리하고, 형광은 방사될 수 있다. 도 4B에 실례된 체계에서, LOCS 올리고뉴클레오티드의 루프 영역은 표적 앰플리콘에 상보적인 영역을 포함하고 제한 효소, 예를 들어 니킹 효소에 대한 인식 부위를 추가로 함유한다. LOCS 올리고뉴클레오티드의 루프 영역은 표적에 결합하고 니킹 효소는 루프 영역을 절단시켜, 표적 분자를 온전하게 남긴다. 이것은 LOCS를 분할시키고 형광성 신호는 스템의 용융 온도 초과 온도에서 방사된다. 더 낮은 온도에서 분할된 LOCS 구조의 스템 영역은 형광을 어닐링 및 퀀칭할 수 있다. 전략은 표적 서열을 직접적으로 검출하는데 사용될 수 있거나 표적 증폭 방법과 조합된 때 표적 앰플리콘을 검출할 수 있다.
도 5는 비-절단가능한 분자성 비콘이 MNA자임에 의해 절단가능한 LOCS 프로브와 조합될 수 있는 구현예를 실례한다. 양쪽 분자성 비콘 및 LOCS 프로브는 동일한 형광단으로 표지될 수 있다. 분자성 비콘은 Tm A가 있는 스템 영역 그리고 Tm B가 있는 제1 표적 1과 특이적으로 혼성화할 수 있는 루프 영역을 가질 수 있고; 여기에서 Tm B는 Tm A보다 크다. 이것은 Tm C가 있는 스템 영역 그리고 제2 표적 2의 존재에서 MNA자임에 의해 절단되어 그래서 분할된 LOCS를 생성할 수 있는 Tm D가 있는 루프 영역을 가질 수 있는 온전한 LOCS 프로브와 조합될 수 있고; 여기에서 Tm D는 Tm C보다 적다. 표적 1 및/또는 표적 2의 존재는 어느 한쪽 실시간으로; 또는 증폭의 시작에서 또는 근처에서 및 증폭 이후 획득된 별개 측정을 사용하여 2개 온도에서 형광을 측정함으로써 구별될 수 있다.
도 6은 제2 표적 2 (NGopa)의 가변 농도의 존재 또는 부재 하에 제1 온도에서 제1 표적 1 (CTcry)의 정량적 분석에 대하여 예시적 PCR 증폭 곡선을 실례한다. 프로토콜은 (표적 1을 위한) 1개 선형 MNA자임 기질을 (표적 2를 위한) 1개 LOCS 리포터와 조합하였다. 결과는 어느 한쪽 단독 (도 6A)으로 또는 NGopa (표적 2)의 어느 한쪽 20,000 (도 6B) 또는 32 (도 6C) 카피의 배경에서 CTcry 템플레이트의 20,000 (흑색 점), 4,000 (흑색 대시), 800 (흑색 정방형), 160 (회색 입방형) 또는 32 (회색 점) 카피를 함유하는 반응에 대하여 52℃의 획득 온도에서 CTcry (표적 1)의 정량적 검출을 위한 HEX 채널에서 수득되었다. 52℃에서 형광성 데이터는 CTcry가 부족하지만 NGopa 템플레이트의 어느 한쪽 20,000 (흑색 선) 또는 32 카피 (회색 선)를 함유하는 반응에 대하여 또한 수집되었다 (도 6D). 무 표적 대조군 (뉴클레아제 없는 H2O)은 도 6A 내지 6C (흑색 실선)에 도시된다. 증폭 곡선은 삼중 반응으로부터 형광 수준의 평균이다.
도 7은 HEX 채널에서 종점 분석 방법 1을 사용하여 2개 온도 (D1 및 D2)에서 표적 1 (CTcry) 및/또는 표적 2 (NGopa)의 동시 정성적 검출을 실례한다. 제시된 결과는 삼중 반응으로부터 평균이고 오차 막대는 이들 반복실험 사이 표준 편차를 나타낸다. 구체적으로, 데이터는 1개 선형 기질 및 1개 LOCS 프로브가 인간 게놈성 DNA의 배경에서 존재하였던 CTcry (CT 카피 수 20K, 4, 800, 160, 32 또는 0) 및/또는 NGopa (NG 카피 수 20K, 32 또는 0) 표적 각각의 검출 및 구별을 허용하는 형광성 신호에서의 변화를 도시한다. 추가로, 게놈성 DNA에서 인간 TFRC 유전자의 존재는 교정기로서 사용을 위한 텍사스 레드 채널에서 측정되었다. 도 7A는 신호에서의 변화 (ΔS; 여기서 ΔS = SD-PCR후 - SD-PCR전)를 도시한다. 온도 1에서 ΔS (ΔSD1; 52℃)는 흑색 및 백색 패턴으로서 도시되고 온도 2에 ΔS (ΔSD2; 70℃)는 회색으로 도시된다. 결과는 CTcry가 샘플 내에서 존재하는 때 온도 1에 신호 (ΔSD1; 흑색 막대)가 임계값 1 (X1)을 넘지만 NGopa만이 존재하는 때 이 임계값을 넘지 않음을 보여준다. 그러므로, 온도 1에 임계값 1보다 큰 ΔSD1은 제1 표적, (CTcry)의 존재를 나타낸다. 도 7A에서 결과는 또한 온도 2에 신호에서의 변화 (ΔSD2; 회색 막대)가 온도 1에보다 큰 때 (ΔSD2　> ΔSD1), 그리고 임계값 X1보다 큰 때 (ΔSD2　> X1), NGopa가 샘플 내에서 존재함을 보여준다. 도 7B 및 7C에서 결과는 ΔSD1　및 ΔSD2를 교정하기 위하여 교정기 신호의 사용을 보여준다. 도 7B는 텍사스 레드 채널에서 측정된 TFRC 교정기 신호에서의 변화 (ΔC)를 실례하고, 여기서 임계값 C를 초과하는 값은 ΔC에 대하여 양성 신호를 나타내고 한편 임계값 C 미만 값은 ΔC (NTC)에 대하여 음성 신호를 나타낸다. 교정기 템플레이트 (TFRC)는 무 표적 대조군 (NF H2O)을 배제한, 모든 샘플의 배경에서 인간 게놈성 DNA에서 존재하였다.　도　7C는 ΔC에 대해 교정된 각 온도에 신호에서의 변화 (ΔS/ΔC)를 도시한다. 결과가 도 7B에서 ΔC에 양성인 반응에 대하여 수득되었지만, (해당사항 없음(N/A)으로 표시된) ΔC에 음성인 것들에 대하여 수득되지 않았던 온도 1에 신호에서의 변화 (ΔSD1/ΔC; 52℃)는 흑색 및 백색 패턴으로서 나타나고 온도 2에 신호에서의 변화 (ΔSD2/ΔC; 70℃)는 회색으로 나타난다. 추가로, 도 7C에서 데이터는 패턴이 일관되므로 신호의 교정이 종점 분석 방법 1 (도 7A)을 사용하여 수득된 결과를 변경하지 않음을 보여준다.
도 8은 분석 방법 2를 사용하여 2개 온도에서 제1 표적 (CTcry) 및/또는 제2 표적 (NGopa)의 동시 정성적 검출을 실례한다. CTcry (CT 카피 수 20K, 4, 800, 160, 32 또는 0) 및/또는 NGopa (NG 카피 수 20K, 32 또는 0) 표적은 인간 게놈성 DNA의 배경에서 존재하였다. 데이터는 분석 방법 2 (ΔSD2 마이너스 ΔSD1 = ΔΔSD2ΔSD1)를 사용하여 온도 2 (D2; 70℃) 및 온도 1 (D1; 52℃)에 HEX 채널에서 수득된 형광성 신호에서의 변화에서 차이를 보여준다. 결과는 NGopa가 샘플 내에서 존재하는 때 ΔΔSD2ΔSD1이 임계값 2 (X2)를 넘지만, CTcry가 존재하는 때, 및/또는 NGopa가 샘플로부터 부재 (NTC)인 때 이 임계값을 넘지 않는다. 그러므로, 임계값 2보다 큰 형광성 신호에서의 변화에서 차이 (ΔΔ SD2ΔSD1 > X2)는 NGopa의 존재를 나타낸다.
도 9는 종점 분석 방법 3을 사용하여 제1 표적 (CTcry) 및/또는 제2 표적 (NGopa)의 존재 하에서 2개 상이한 온도 (52℃ 및 70℃)에 HEX 채널에서 PCR 동안 수득된 형광성 신호에서의 변화 (ΔS)를 실례한다. CTcry (CT 카피 수 20K, 4, 800, 160, 32 또는 0) 및/또는 NGopa (NG 카피 수 20K, 32 또는 0) 표적은 인간 게놈성 DNA의 배경에서 존재하였다. 도 9A에서는 온도 2에 ΔS (ΔSD2)를 도시한다. ΔSD2가 임계값 X1보다 큰 때, 이것은 CTcry 및/또는 NGopa가 샘플에서 존재함을 나타낸다. ΔSD2가 임계값 X1보다 작은 때, 이것은 CTcry도 NGopa도 반응에서 존재하지 않음을 나타낸다. 도 9B는 표적이 반응에서 존재함을 나타내는데 사용되는 비율 ΔSD1:ΔSD2를 도시한다. 비율이 임계값 R1보다 큰 때, 이것은 NGopa가 아닌 CTcry가 존재함을 나타낸다. 비율이 임계값 R2보다 작은 때, 이는 CTcry가 아닌 NGopa가 존재함을 나타낸다. 비율이 임계값 R1과 R2 사이인 때, 이는 양쪽 CTcry 및 NGopa가 존재함을 나타낸다. CTcry도 NGopa도 반응에서 존재하지 않는 때 (도 9A), 비율의 계산에 대한 필요는 부정되고, 도 9B에 도시된 대로 N/A로서 표시된다.
도 10은 다양한 표적에 대하여 HEX (A-D) 및 FAM (E-H) 채널에서 52℃에 획득된 PCR 증폭 곡선을 실례한다. 표적의 20,000 카피 (흑색 선) 및 32 카피 (회색 선)를 이용하여 파선으로 표시된 PCR 곡선은 반응당 단일 유전자 표적의 존재를 나타내고 반면에 실선으로 표시된 것들은 반응당 양쪽 유전자 표적의 존재를 나타낸다. HEX 채널에서, 결과는 CTcry 단독 (A), CTcry 및 NGopa (B), NGopa 단독 (C), 그리고 10,000 카피 TFRC (게놈성 DNA 내인성 대조군), TVbtub, 및 MgPa (D)를 포함하는 모든 잔류 표적외 대조군에 대하여 나타난다. FAM 채널에서, 결과는 TVbtub 단독 (E), TVbtub 및 MgPa (F), MgPa 단독 (G), 그리고 10,000 카피 TFRC (게놈성 DNA 내인성 대조군) 또는 CTcry 및 NGopa의 20,000 카피 및 32 카피 (H)를 포함하는 모든 잔류 표적외 대조군에 대하여 나타난다. 모든 도면에서, 흑색 점선은 무-템플레이트 대조군 (NF H2O)을 나타낸다. 증폭 곡선은 삼중 반응으로부터 형광 수준의 평균이다.
도 11은 종점 분석 방법 1을 사용하여 (A) HEX에서 CTcry 및 NGopa 및 (B) FAM에서 TVbtub 및 MgPa의 검출을 위한 신호에서의 변화 (ΔS; 여기에서 ΔS = SD-PCR후 - SD-PCR전)를 도시한다. 결과는 ΔSD1 (52℃)에 대하여 흑색 및 백색 패턴 그리고 ΔSD2 (70℃)에 대하여 회색으로 표시된다. 각 샘플에 대한 값은 3개 반복실험의 평균이고 오차 막대는 이들 반복실험 사이 표준 편차를 나타낸다.
도 12는 종점 분석 방법 2 (ΔSD2 - ΔSD1 = ΔΔSD2ΔSD1)를 사용하여 HEX 채널에서 NGopa (A) 및 FAM 채널에서 MgPa (B)의 정성적 종점 검출을 실례한다. 각 샘플에 대한 값은 3개 반복실험의 평균이고 오차 막대는 이들 반복실험 사이 표준 편차를 나타낸다.
도 13은 종점 분석 방법 3을 사용하여 2개 상이한 온도에 HEX (도 13A & 13B) 및 FAM (도 13C & 13D) 채널에서 수득된 형광성 신호에서의 변화를 실례한다. (도 13A) HEX 채널에서 ΔSD2를 사용하는 CTcry (CT; 20,000 (20K) 또는 32 카피) 및/또는 NGopa (NG; 20,000 (20K) 또는 32 카피)의 검출 (도 13B) 비율 ΔSD1:ΔSD2를 사용하는 HEX에서 CTcry 및 NGopa의 차별. CTcry 단독의 검출은 ΔSD1:ΔSD2 > 임계값 R1일때 결정된다. NGopa 단독의 검출은 ΔSD1:ΔSD2 < 임계값 R2일때 결정된다. 양쪽 표적을 함유하는 동시감염의 검출은 ΔSD1:ΔSD2 > 임계값 R2 및 < 임계값 R1일때 결정된다. (도 13C) FAM 채널에서 ΔSD2를 사용하는 TVbtub 및/또는 MgPa의 검출 (도 13D) 비율 ΔSD1:ΔSD2를 사용하는 FAM에서 TVbtub 및 MgPa의 차별. TVbtub 단독의 검출은 ΔSD1:ΔSD2 > 임계값 R1일때 결정된다. MgPa 단독의 검출은 ΔSD1:ΔSD2 < 임계값 R2일때 결정된다. 양쪽 표적을 함유하는 동시감염의 검출은 ΔSD1:ΔSD2 > 임계값 R2 및 < 임계값 R1일때 결정된다. 각 샘플에 대한 값은 3개 반복실험의 평균이고 오차 막대는 이들 반복실험 사이 표준 편차를 나타낸다.
도 14는 종점 분석 방법 2를 사용하여 Cy5.5. 채널에서 온도 1 (D1)에 TFRC (도 14A) 및 온도 2 (D2)에 TPApolA (도 14B)의 검출을 실례한다. TFRC의 검출 (도 14A)은 온도 1에서 PCR후 형광으로부터 온도 1에서 PCR전 형광의 뺄셈 (SD1)에 의해 달성된다. TPApolA의 검출 (도 14B)은 온도 2에서 PCR후 형광으로부터 온도 2에 PCR전 형광의 뺄셈 (ΔSD2), 이어서 ΔSD1의 뺄셈 (ΔΔSD2ΔSD1)에 의해 달성된다. 각 샘플에 대한 값은 NF H2O, 10,000 cps TPApolA, 40 cps TPApolA, 10,000 cps TPApolA 및 10,000 cps TFRC, 40 cps TPApolA 및 10,000 cps TFRC에 대하여 2개 반복실험의 평균이다. 10,000 cps TFRC에 대한 값은, TPApolA-단독 샘플을 제외한, TFRC가 내인성 대조군으로서 사용되었고 각 반응 웰에서 10,000cps에 게놈성 DNA내 존재하기 때문에 48개 반복실험의 평균이다. 오차 막대는 각 샘플에 대하여 각 반복실험 사이 표준 편차를 나타낸다.
도 15 (도 15A) TFRC의 10,000 카피 (흑색 실선)의 존재 하에서 기질 4의 절단에 의해 생산된 용융 시그니처. (도 15B) TPApolA의 10,000 카피 (흑색 실선) 및 TPApolA의 40 카피 (회색 실선)의 존재 하에서 LOCS-3의 절단에 의해 생산된 용융 시그니처. (C) TPApolA의 10,000 카피 더하기 TFRC의 10,000 카피 (흑색 실선), 그리고 TPApolA의 40 카피 더하기 TFRC의 10,000 카피 (회색 실선)의 존재 하에서 기질 4 및 LOCS-3의 절단에 의해 생산된 용융 시그니처. 양쪽 표적 (NF H2O)의 부재에서 비롯하는 용융 시그니처는 파선으로 (도 15A-C)에서 나타난다. 결과는 온도에 따라 형광에서의 변화의 속도 (-d(RFU)/dT)를 나타낸다.
도 16은 39℃ (A) 및 72℃ (B)에 어느 한쪽 CTcry의 20,000 카피 (흑색 실선), NGopa의 20,000 카피 (대시된 흑색 선), 양쪽 표적의 20,000 카피 (회색 실선) 또는 양쪽 없는 표적 (NTC; 회색 파선)을 함유하는 반응으로부터 수득된 PCR 증폭 플롯을 실례한다. 역치 임계값 X 및 임계값 Y는 39℃ 및 72℃ 각각에 수득된 증폭 플롯에 대하여 표시된다. EX1, EX2, EY1 및 EY2 지정된 종점 형광 값은 표시된다.
도 17은 지시된 대로 가변 카피 수로 표적 Y/NGopa의 배경에서 표적 X/CTcry의 카피; 즉 CTcry의 어느 한쪽 0 카피 (흑색 실선), 32 카피 (회색 선) 또는 20,000 카피 (흑색 점선)를 함유하는 반응으로부터 수득된 PCR 증폭 플롯을 실례한다. 플롯 A, D 및 G는 20,000 카피 (A), 32 카피 (D) 또는 무 카피 (G)에 NGopa를 함유하는 반응에 대하여 39℃에 형광을 도시한다. 플롯 B, E 및 H는 20,000 카피 (B), 32 카피 (E) 또는 무 카피 (H)에 NGopa를 함유하는 반응에 대하여 74℃에 형광을 도시한다. 플롯 C, F 및 I는 20,000 카피 (C), 32 카피 (F) 또는 무 카피 (I)에 NGopa를 함유하는 반응에 대하여 FAF로 정규화후 74℃에 형광을 도시한다.
도 18은 FAM 채널에서 (D1) 52℃에 인간 GAPDH의 정량적 검출을 위한 PCR 증폭 곡선이다. (도 18A) 곡선은 GAPDH 표적 단독의 10,000 카피 (회색 실선) 및 100 카피 (흑색 파선)로부터 생산된 신호를 나타낸다 (도 18B) MgPa 표적 단독의 10,000 카피 (회색 실선) 및 100 카피 (흑색 파선)에 의해 생산된 결과. (도 18C) 곡선은 GAPDH 및 MgPa의 10,000 카피 (회색 실선) 및 100 카피 (흑색 파선)를 각 함유하는 표적 혼합물로부터 생산된 신호를 나타낸다. 무 템플레이트 대조군 (NF H2O)은 흑색 실선으로서 (도 18A 내지 C)에 나타난다. 증폭 곡선은 삼중 반응으로부터 형광 수준의 평균이다.
도 19는 FAM 채널에서 2개 온도에 1개 TaqMan 프로브 및 1개 LOCS 프로브, 각각을 사용하여 GAPDH 및 MgPa의 정성적 검출을 실례한다. 결과는 종점 분석 방법 1-3을 사용하여 수득되었다.각 샘플에 대한 값은 3개 반복실험의 평균이고 오차 막대는 이들 반복실험 사이 표준 편차를 나타낸다. (도 19A) 종점 분석 방법 1로 수득된 결과는 PCR후와 PCR전 형광성 측정 사이 신호에서의 변화 (ΔS)를 보여준다. 결과는 ΔSD1 (52℃)에 대하여 흑색 및 백색 패턴 그리고 ΔSD2 (70℃)에 대하여 회색으로 나타난다. (도 19B) 종점 분석 방법 2 (ΔΔSD2ΔSD1)로부터 수득된 결과로 MgPa 단독의 검출. (도 19C 및 19D) 종점 분석 방법 3 (ΔSD1:ΔSD2)으로부터 수득된 결과. (도 19C) FAM 채널에서 ΔSD2를 사용하는 GAPDH (인간 10,000 또는 100 카피) 및/또는 MgPa (MG 10,000 또는 100 카피)의 검출 (도 19D) ΔSD1:ΔSD2 비를 사용하여 FAM에서 GAPDH 및 MgPa의 차별. GAPDH 단독의 검출은 ΔSD1:ΔSD2 > 임계값 R1일때 결정된다. MgPa 단독의 검출은 ΔSD1:ΔSD2 < 임계값 R2일때 결정된다. 양쪽 표적을 함유하는 동시감염의 검출은 ΔSD1:ΔSD2 > 임계값 R2 및 < 임계값 R1일때 결정된다. 결과는 비율 단위로 측정된다.
도 20은 52℃ (도 20A) 및 74℃ (도 20B)에 어느 한쪽 TVbtub의 25,600 카피 (흑색 점선), MgPa의 25,600 카피 (흑색 파선), 양쪽 표적의 25,600 카피 (회색 실선)를 함유하는 혼합물 또는 무 표적 (NF H2O; 흑색 실선)을 함유하는 반응으로부터 FAM 채널에서 수득된 PCR 증폭 곡선을 실례한다. 52℃ (D1)에 형광에서의 증가는 분자성 비콘에 의해 검출된 TVbtub의 존재를 나타내고 74℃ (D2)에 형광에서의 증가는 LOCS 프로브에 의해 검출된 MgPa의 존재를 나타낸다. D1 및 D2에 결정된 Cq 값은 특별한 분석 방법에 대한 필요 없이 샘플에서 TVbtub 및 MgPa, 각각의 양을 정량화하는데 사용되었다. 곡선은 삼중 반응으로부터 평균 형광 수준을 나타낸다.
도 21은 TVbtub의 정량화에 사용된 52℃ (D1)에 수득된 표준 곡선 (도 20A) 및 MgPa의 정량화에 사용된 74℃ (D2)에 수득된 표준 곡선 (도 20B)을 실례한다. 합성 TVbtub 및 MgPa G-Block 템플레이트의 25600, 6400, 1600, 400 및 100 카피의 삼중반복실험은 표준 곡선을 생성하는데 사용되었다.
도 22는 이중 혼성화 프로브가 MNA자임에 의해 절단가능할 수 있는 LOCS 프로브와 조합될 수 있는 구현예를 실례한다. 양쪽 이중 혼성화 프로브 및 LOCS 프로브는 동일한 형광단으로 표지될 수 있다. 2개 이중 혼성화 프로브는 Tm A 및 Tm B 각각으로 표적 1에 결합할 수 있다. 이들은 제2 표적 2 존재 하에서 MNA자임에 의해 절단되어 그래서 분할된 LOCS를 생성할 수 있는 Tm D가 있는 루프 영역 및 Tm C가 있는 스템 영역을 가질 수 있는 온전한 LOCS 프로브와 조합될 수 있고; 여기에서 Tm D는 Tm C보더 더 적다. 표적 1 및/또는 표적 2의 존재는 어느 한쪽 실시간으로; 또는 증폭의 시작에서, 또는 근처에서 그리고 증폭 이후 획득된 별개 측정을 사용하여 2개 온도에 형광을 측정함으로써 결정될 수 있다.
도 23은 52℃ (ΔSD1, 도 23A) 및 74℃ (ΔSD2, 도 23B)에 PCR 동안 형광에서의 변화를 측정함으로써 1개 비-절단가능한 분자성 비콘 및 1개 LOCS 프로브를 사용하여 FAM 채널에서 2개 표적 (TVbtub 및 MgPa)의 동시 종점 검출을 실례한다. 플롯팅된 값은 그래프에서 특정된 대로 TVbtub 및/또는 MgPa의 가변량을 함유하는 삼중 반응의 평균이다. 도 23A에서, 특정된 임계값 초과 ΔSD1은 반응에서 TVbtub의 존재 또는 미만이면 부재를 나타낸다. 도 23B에서, 특정된 임계값 초과 ΔSD2는 반응에서 MgPa의 존재 또는 미만이면 부재를 나타낸다. y-축은 52℃ (ΔSD1, 도 23A) 또는 74℃ (ΔSD2, 도 23B)에 형광에서 결정된 증가이다.
도 24는 52℃ (ΔSD1/C, 도 24A) 및 74℃ (ΔSD2/C, 도 24A)에 PCR 동안 교정된 형광 신호에서의 변화를 측정함으로써 1개 비-절단가능한 분자성 비콘 및 1개 LOCS 프로브를 사용하여 FAM 채널에서 2개 표적 (TVbtub 및 MgPa)의 동시 종점 검출을 실례한다. 플롯팅된 값은 그래프에서 특정된 대로 TVbtub 및/또는 MgPa 템플레이트의 가변량을 함유하는 반복실험의 평균이고, 오차 막대는 이들 반복실험 사이 표준 편차를 나타낸다. 도 24A에서, 임계값 1 초과 ΔSD1/C는 반응에서 TVbtub의 존재 또는 미만이면 부재를 나타낸다. 도 24B에서, 임계값 2 초과 ΔSD2/C는 반응에서 MgPa의 존재 또는 미만이면 부재를 나타낸다.
도 25는 검사된 3개 Bio-Rad CFX96 기계 (흑색 줄무늬로 기계 1, 회색으로 기계 2 및 백색으로 기계 3)에 걸쳐 52℃ (ΔSD1, 도 25A) 및 70℃ (ΔSD2, 도 25B)에 PCR 동안 형광 신호, 그리고 52℃ (ΔSD1/C, 도 25C) 및 70℃ (ΔSD2/C, 도 25D)에 교정된 신호에서의 변화를 측정함으로써 1개 선형 MNA자임 기질 및 1개 LOCS 프로브를 사용하여 HEX 채널에서 2개 표적 (CTcry 및 NGopa)의 동시 종점 검출을 실례한다. 플롯팅된 값은 그래프에서 특정된 대로 CTcry 및/또는 NGopa 템플레이트의 가변량을 함유하는 삼중반복실험의 평균이고. 오차 막대는 이들 반복실험 사이 표준 편차를 나타낸다. 임계값 C1 초과 도 25A에서의 신호 또는 도 25C에서의 교정된 신호는 반응에서 CTcry의 존재 또는 미만이면 부재를 나타낸다. 도 25D에서 교정된 신호는 임계값 C2 미만일 때 CTcry 및 NGopa의 부재, 임계값 C3 초과일 때 양쪽 CTcry 및 NGopa의 존재, 그리고 임계값 C2와 C3 사이일 때 CTcry 및 NGopa 중 단 1개의 존재를 나타낸다. 도 25B는 임계값 C3의 값이 도 25D에서 도시된 것 (도 25B에서 도시되지 않은 임계값 C2)과 달리 교정 없이 기계들 사이 가변함을 도시한다.
도 26은 종점 분석 방법 2를 사용함으로써 1개 선형 MNA자임 기질 및 1개 LOCS 프로브를 사용하여 HEX 채널에서 표적 1 (CTcry) 및/또는 표적 2 (NGopa)의 동시 종점 검출을 실례한다. NSD1 (LHS) 및 ΔNSD2NSD1 (RHS)을 실례하는 그래프는 실험적 샘플로부터 D1 (52℃) 및 D2 (70℃)에 획득된 PCR후 신호를 채집하고 40℃ (도 26A 내지 B); 52℃ (도 26C 내지 D) 및 62℃ (도 26E 내지 F)에 동일한 반응 웰로부터 PCR전 형광 측정 (SD3)으로서 배경 신호를 결정함으로써 CTcry 검출 및 NGopa 검출, 각각에 대하여 결정되었다. 도 26A, 26C 및 26E에서, NSD1이 임계값 X1 초과인 경우, 이는 반응에서 CTcry의 존재 또는 미만이면 부재를 나타낸다. 도 26B, 26D 및 26F에서, ΔNSD2NSD1이 임계값 X2 초과인 경우, 이것은 반응에서 NGopa의 존재 또는 미만이면 부재를 나타낸다.
도 27은 종점 분석 방법 2를 사용함으로써 1개 선형 MNA자임 기질 및 1개 LOCS 프로브를 사용하여 HEX 채널에서 2개 표적 (CTcry 및 NGopa)의 동시 종점 검출을 실례한다. NSD1 (LHS) 및 ΔNSD2NSD1 (RHS)은 D1 (52℃) 및 D2 (70℃)에 획득된 PCR후 신호를 채집하고 PCR에 앞서 D1/D3B 에 (도 27A 내지 B) 그리고 PCR에 앞서 D1 및 D2에 (도 27C 내지 D) 그리고 PCR 이후 (도 27E 내지 F) 측정된 무 템플레이트 대조군 신호의 평균으로서 PCR전 형광 측정 (SD3)으로서 배경 신호를 결정함으로써 CTcry 검출 및 NGopa 검출, 각각에 대하여 결정되었다. 도 27A, 27C 및 27E에서, NSD1이 임계값 X1 초과인 경우, 이는 반응에서 CTcry의 존재 또는 미만이면 부재를 나타낸다. 도 26B, 26D 및 26F에서, ΔNSD2NSD1이 임계값 X2 초과인 경우, 이것은 반응에서 NGopa의 존재 또는 미만이면 부재를 나타낸다.
정의
본 출원에 사용된 경우에, 단수 형태 ("a", "an" 및 "the")는 문맥이 달리 명확하게 지시하지 않는 한 복수 참조물을 포함한다. 예를 들어, 어구 "폴리뉴클레오티드"는 또한 복수의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "포함하는"은 "포괄하는"을 의미한다. 단어 "포함하는"의 이형, 예컨대 "포함하다" 및 "포함한다"는 대응하여 가변된 의미를 갖는다. 그래서, 예를 들어, 뉴클레오티드의 한 서열을 "포함하는" 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드의 그 서열로 배타적으로 이루어질 수 있거나 하나 이상의 추가의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 경우에 용어 "복수"는 1개 초과를 의미한다. 특정 구체적 양태 또는 구현예에서, 복수는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 또는 그 이상, 및 그 안에서 파생가능한 임의의 정수, 및 그 안에서 파생가능한 임의의 범위를 의미할 수 있다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "대상체"는 소과, 말과, 양과, 영장류, 조류 및 설치류 종을 포함하는 경제적, 사회적 또는 연구 중요성의 임의의 동물을 포함한다. 따라서, "대상체"는 포유동물 예컨대, 예를 들어, 인간 또는 비-인간 포유동물일 수 있다. 비제한적으로, 박테리아, 바이러스, 진균/효모, 원생생물 및 선충을 포함하는 미생물 대상체가 또한 포괄된다. 존재 발명에 따라 "대상체"는 감염성 제제 예컨대 프리온을 또한 포함한다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"은 호환적으로 사용될 수 있고, 비제한적으로 DNA, 메틸화된 DNA, 알킬화된 DNA, RNA, 메틸화된 RNA, microRNA, siRNA, shRNA, mRNA, tRNA, snoRNA, stRNA, smRNA, pre- 및 pri-microRNA, 다른 비-코딩 RNA, 리보솜성 RNA, 이들의 유도체, 이들의 앰플리콘 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 염기의 단일- 또는 이중-가닥 중합체, 또는 이들의 유사체, 유도체, 변이체, 단편 또는 조합을 지칭한다. 비-제한 예로써, 핵산의 공급원은 합성, 포유류, 인간, 동물, 식물, 진균, 박테리아, 바이러스, 고세균 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 그룹으로부터 선택될 수 있다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "올리고뉴클레오티드"는 DNA 또는 DNA-함유 핵산 분자, 또는 RNA 또는 RNA-함유 분자, 또는 이들의 조합의 세그먼트를 지칭한다. 올리고뉴클레오티드의 예는 핵산 표적; 기질, 예를 들어, MNA자임에 의해 변형될 수 있는 것들; 프라이머 예컨대 방법 예컨대 PCR에 의해 시험관내 표적 증폭에 사용된 것들; MNA자임의 구성요소; 및 비제한적으로, TaqMan 또는 가수분해 프로브; 분자성 비콘; 슬로피 비콘; 이클립스 프로브; 스콜피온 유니-프로브, 스콜피온 비-프로브 프라이머/프로브, 포착/피처 및 이중-혼성화 프로브를 포함하는 리포터 프로브의 다양한 다른 유형을 포함한다. 용어 "올리고뉴클레오티드"는, 달리 지시되지 않는 한, 임의의 특정된 서열 뿐만 아니라 거기에 상보적인 서열 지칭을 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 비제한적으로 4-아세틸시티딘, 5-(카르복시하이드록실메틸)우리딘, 2'-O-메틸시티딘, 5-카르복시메틸아미노메틸 티오우리딘, 디하이드로우리딘, 2'-O-메틸슈도우리딘, 베타 D-갈락토실퀘오신, 2'-O-메틸구아노신, 이노신, N6-이소펜테닐아데노신, 1-메틸아데노신, 1-메틸슈도우리딘, 1-메틸구아노신, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아노신, 2-메틸아데노신, 2-메틸구아노신, 3-메틸시티딘, 5-메틸시티딘, N6-메틸아데노신, 7-메틸구아노신, 5-메틸아미노메틸우리딘, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우리딘, 베타 D-만노실메틸우리딘, 5-메톡시카르보닐메틸우리딘, 5-메톡시우리딘, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데노신, N-((9-베타-리보푸라노실-2-메틸티오푸린-6-일)카르바모일)트레오닌, N-((9-베타-리보푸라노실푸린-6-일)N-메틸-카르바모일)트레오닌, 우리딘-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우리딘-5-옥시아세트산 (v), 와이부톡소신, 슈도우리딘, 퀘오신, 2-티오시티딘, 5-메틸-2-티오우리딘, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, 5-메틸우리딘, N-((9-베타-D-리보푸라노실푸린-6-일)카르바모일)트레오닌, 2'-O-메틸-5-메틸우리딘, 2'-O-메틸우리딘, 와이부토신, 3-(3-아미노-3-카르복시프로필)우리딘, 베타 D-아라비노실 우리딘, 베타 D-아라비노실 티미딘을 포함하는 그룹을 포함하여, 적어도 하나 부가 또는 치환을 포함할 수 있다.
용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산" "올리고뉴클레오티드"는 달리 지시되지 않는 한 임의의 특정된 서열 뿐만 아니라 거기에 상보적인 서열 지칭을 포함한다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "상보적", "상보성", "매치" 및 "매칭된"은 왓슨-크릭 염기-짝짓기, 동요 염기-짝짓기 및 후그스틴 염기-짝짓기 (예를 들면 LNA, PNA 또는 BNA)를 포함하는 비정규 염기-짝짓기 또는 부자연 염기 짝짓기 (UBP)를 통해 서로 혼성화하는 뉴클레오티드 (예를 들면 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드 또는 이들의 조합)의 능력을 지칭한다. 결합은 아데닌 (A) 염기와 우라실 (U) 염기 사이, 아데닌 (A) 염기와 티민 (T) 염기 사이, 시토신 (C) 염기와 구아닌 (G) 염기 사이 왓슨-크릭 염기-짝짓기를 통해 형성될 수 있다. 동요 염기 쌍은 폴리뉴클레오티드 듀플렉스 (예를 들면 구아닌-우라실, 이노신-우라실, 이노신-아데닌, 및 이노신-시토신)에서 2개 뉴클레오티드 사이 비정규 염기 짝짓기이다. 후그스틴 염기 쌍은, 왓슨-크릭 염기 쌍처럼, 아데닌 (A)과 티민 (T) 염기 사이, 및 시토신 (C)과 구아닌 (G) 염기 사이 발생하지만, 왓슨-크릭 염기 짝짓기에서와 비교하여 피리미딘과 관련하여 퓨린의 다른 입체구조를 가진다. 부자연 염기 쌍은 실험실에서 합성되고 자연에서 발생하지 않는 제조된 하위단위이다. "상보적"으로서 지칭된 또는 서로의 "보체"인 뉴클레오티드는 그들의 각자의 염기 사이 어느 한쪽 왓슨-크릭 염기 짝짓기에 의해 또는 비정규 염기 짝짓기 (동요 염기 짝짓기, 후그스틴 염기 짝짓기)에 의해 또는 부자연 염기 짝짓기 (UBP)에 의해 함께 혼성화하는 능력을 갖는 뉴클레오티드이다. 본원에 뉴클레오티드의 또다른 서열에 "상보적"인 뉴클레오티드의 서열은 제1 서열이 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100개 또는 그 이상 뉴클레오티드의 영역에 걸쳐서 제2 서열의 보체와 100% 동일함을 의미할 수 있다. 본원에 뉴클레오티드의 또다른 서열에 "실질적으로 상보적"인 뉴클레오티드의 서열 지칭은 제1 서열이 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100개 또는 그 이상 뉴클레오티드의 영역에 걸쳐서 제2 서열의 보체와 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일함을 의미할 수 있다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "비-상보적", "상보적이지 않은", "미스매치" 및 "미스매칭된"은 그들의 각자의 염기 사이 어느 한쪽 왓슨-크릭 염기 짝짓기에 의해 또는 동요 염기 짝짓기에 의해 함께 혼성화하는 능력이 부족한 뉴클레오티드 (예를 들면 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 및 이들의 조합)를 지칭한다. 본원에 뉴클레오티드의 또다른 서열에 "비-상보적"인 뉴클레오티드의 서열은 제1 서열이 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100개 또는 그 이상 뉴클레오티드의 영역에 걸쳐서 제2 서열의 보체와 0% 동일함을 의미할 수 있다.
본원에 뉴클레오티드의 또다른 서열에 "실질적으로 비-상보적"인 뉴클레오티드의 서열 지칭은 제1 서열이 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100개 또는 그 이상 뉴클레오티드의 영역에 걸쳐서 제2 서열의 보체와 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 또는 40% 미만 동일함을 의미할 수 있다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "표적"은 본 발명의 방법이 검출하는데 사용될 수 있는 샘플에서 존재하는 임의의 분자 또는 분석물을 지칭한다. 용어 "표적"은 핵산 표적, 및 비-핵산 표적 예컨대, 예를 들어 단백질, 펩티드, 분석물, 리간드, 및 이온 (예를 들면 금속 이온)을 포함하도록 이해될 것이다.
본원에 사용된 경우에, "효소"는 화학적 반응 (예를 들면 폴리뉴클레오티드의 증폭, 폴리뉴클레오티드의 절단 등)을 촉매화시킬 수 있는 임의의 분자를 지칭한다. 본 발명에서 사용에 적합한 효소의 비-제한 예는 핵산 효소 및 단백질 효소를 포함한다. 적합한 핵산 효소의 비-제한 예는 리보자임, MNA자임 DNA자임 및 압타자임을 포함한다. 적합한 단백질 효소의 비-제한 예는 엑소뉴클레아제 및 엔도뉴클레아제를 포함한다. 효소는 본원에 기재된 방법들 중 하나 이상 실시하기에 일조하는 촉매적 활성을 일반적으로 제공할 것이다. 비-제한 예로써, 엑소뉴클레아제 활성은, 예를 들어, 폴리머라제의 내재된 촉매적 활성일 수 있다. 비-제한 예로써, 엔도뉴클레아제 활성은, 예를 들어, 니킹 엔도뉴클레아제, 리보엔도뉴클레아제 또는 듀플렉스 특이적 뉴클레아제 (DSN)를 포함하는 제한 효소의 내재된 촉매적 활성일 수 있다.
본원에 사용된 경우에, "앰플리콘"은 비제한적으로 PCR, RT-PCR, SDA, NEAR, HDA, RPA, LAMP, RCA, TMA, LCR, RAM, 3SR, NASBA, 및 이들의 임의의 조합을 포함하는 천연 또는 인공 핵산 증폭 또는 복제 이벤트의 산물인 핵산 (예를 들면 DNA 또는 RNA, 또는 이들의 조합)을 지칭한다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "스템-루프 올리고뉴클레오티드"는 단일-가닥 루프 구성요소에 결합된 이중-가닥 스템 구성요소를 포함하거나 이로 이루어지는 DNA 또는 DNA-함유 분자, 또는 RNA 또는 RNA-함유 분자, 또는 이들의 조합 (즉 DNA-RNA 혼성 분자 또는 복합체)을 의미하도록 이해될 것이다. 이중-가닥 스템 구성요소는, 단일-가닥 루프 구성요소의 5' 뉴클레오티드에 결합된 순방향 가닥의 3' 뉴클레오티드, 및 단일-가닥 루프 구성요소의 3' 뉴클레오티드에 결합된 역방향 가닥의 5' 뉴클레오티드로, 상보적 역방향 가닥에 상보적 염기 짝짓기에 의해 혼성화된 순방향 가닥을 포함한다. 이중-가닥 스템 구성요소는 비제한적으로, 1개 가닥 (예를 들면 순방향 가닥) 상에 형광단, 및 대향 가닥 (예를 들면 역방향 가닥) 상에 하나 이상의 퀀처를 포함하는, 하나 이상의 검출 모이어티를 추가로 포함할 수 있다. 다른 비-제한 예는 비색계 검출을 위하여 양쪽 가닥 상에 금 또는 은 나노입자, SPR 검출을 위하여 금 표면 (예를 들면 순방향 가닥) 및 대향 가닥 (예를 들면 역방향 가닥) 상에서 금 나노입자에 대한 1개 가닥의 부동화, 및 전기화학적 검출을 위하여 전극 표면 (예를 들면 순방향 가닥) 및 대향 가닥 (예를 들면 역방향 가닥) 상에서 메틸렌 블루 분자에 대한 1개 가닥의 부동화를 포함한다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "스템-루프 올리고뉴클레오티드"는 본원에 "LOCS 올리고뉴클레오티드", "LOCS 구조" "LOCS 리포터", "온전한 LOCS", "폐쇄된 LOCS" 및 "LOCS 프로브로서 또한 지칭된 "LOCS"를 포함하도록 이해될 것이다. LOCS의 단일-가닥 루프 구성요소는 촉매적 핵산 예컨대, 예를 들어, MNA자임, DNA자임, 리보자임, 압타-MNA자임, 또는 압타자임에 대한 기질의 역할을 할 수 있는 영역을 포함할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 단일-가닥 루프 구성요소는 표적 핵산 (예를 들면 검출, 정량화 및 기타 등등을 위한 표적), 및/또는 거기로부터 유래된 앰플리콘에 상보적인, 그리고 추가로 엑소뉴클레아제 효소에 대한 기질의 역할을 할 수 있는 영역을 포함할 수 있다. 비-제한 예로써, 엑소뉴클레아제는 폴리머라제 효소의 내재된 활성일 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 단일-가닥 루프 구성요소 영역은 (i) 검출되고 있는 표적에 상보적일 수 있는, (ii) 이중 가닥 제한 효소 인식 부위의 1개 가닥을 포함할 수 있는; 그리고 (iii) 제한 효소, 예를 들어 니킹 엔도뉴클레아제에 대한 기질의 역할을 할 수 있는 영역을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 경우에, 용어 "분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드", "분할된 LOCS", "분할된 LOCS 올리고뉴클레오티드", "분할된 LOCS 구조" "분할된 LOCS 리포터", "분할된 LOCS 프로브", "절단된 LOCS" 및 "분해된 LOCS"는 본원에 호환적으로 사용되고 루프 내에서 인접한 뉴클레오티드 사이 적어도 하나의 결합이 제거되어, 이에 의해 루프 영역에서 비-연속 섹션을 제공하도록 단일-가닥 루프 구성요소가 (예를 들면 본원에 기재된 대로 효소에 의해) 절단된, 소화된, 및/또는 분해된 "LOCS" 지칭이도록 이해될 것이다. 분할된 LOCS에서, 이중-가닥 스템 부분의 순방향 및 역방향 가닥은 온도-의존적 방식으로 스템을 형성하기 위해 서로 혼성화하는 능력을 유지할 수 있다.
LOCS는 분할된 LOCS를 생성하는 효소에 의해 루프 영역의 표적-의존적 절단을 가능하게 하는 절단가능한 루프 영역을 포함하도록 설계된다. 이것은 차례로 온전한 또는 분할된 LOCS의 스템 부분의 결합 (혼성화) 또는 해리 이후 특정 온도(들)에 생성된 검출가능한 신호로부터 표적의 검출을 용이하게 할 수 있다. 대조적으로, 분자성 비콘은 본원에 사용된 경우에 본원에 기재된 방법 동안 절단가능하지 않은 루프 영역을 포함하도록 설계된 스템 루프 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 분자성 비콘은 검출되어야 하는 표적이 있는 프로브의 루프 부분의 결합 (혼성화) 또는 해리 (분리) 이후 특정 온도에 검출가능한 신호를 생성함으로써 표적 검출을 매개할 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 맥락에서 스템 루프 구조의 이들 2개 유형 사이 주요 차이는 LOCS가 온전한 또는 분할된 LOCS의 스템 영역의 혼성화 또는 해리로 인해 신호에서의 변화를 측정함으로써 모니터링되고, 반면에 분자성 비콘은 루프 영역 및 표적의 혼성화 또는 해리로 인해 신호에서의 변화를 측정함으로써 모니터링된다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "범용 스템"은 임의의 LOCS 구조에 통합될 수 있는 이중 가닥 서열을 지칭한다. 동일한 "범용 스템"은 어느 한쪽 촉매적 핵산 기질 또는 관심의 표적에 상보적인 서열을 포함하는 루프를 함유하는 LOCS에서 사용될 수 있다. 단일 범용 스템은 특정 LOCS의 분할하기를 용이하게 할 수 있는 임의의 표적에 대하여 대리 마커로서 사용될 수 있다. 일련의 범용 스템은 표적의 임의의 세트의 분석을 위하여 설계된 일련의 LOCS에 통합될 수 있다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "범용 LOCS"는 "범용 스템", 그리고 MNA자임 표적 센싱 아암의 서열에 관계없이 상보적 기질 결합 아암이 있는 임의의 MNA자임에 의해 절단될 수 있는 범용 촉매적 핵산 기질을 포함하는 "범용 루프"를 함유하는 LOCS 구조를 지칭한다. 단일 범용 LOCS는 특정 LOCS의 분할하기를 용이하게 할 수 있는 임의의 표적에 대하여 대리 마커로서 사용될 수 있다. 일련의 범용 LOCS는 표적의 임의의 세트를 분석하도록 설계된 임의의 멀티플렉스 검정에 통합될 수 있다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "핵산 효소", "촉매적 핵산", "촉매적 활성이 있는 핵산", 및 "촉매적 핵산 효소"는 본원에 호환적으로 사용되고 DNA 또는 DNA-함유 분자 또는 복합체, 또는 RNA 또는 RNA-함유 분자 또는 복합체, 또는 이들의 조합 (즉 DNA-RNA 혼성 분자 또는 복합체)을 의미할 수 있으며, 이들은 적어도 하나의 기질을 인식할 수 있고 적어도 하나의 기질의 변형 (예컨대 절단)을 촉매화할 수 있다. 촉매적 핵산에서의 뉴클레오티드 잔기는 염기 A, C, G, T, 및 U, 뿐만 아니라 이들의 유도체 및 유사체를 포함할 수 있다. 상기 용어는, 적어도 하나의 기질을 인식할 수 있고 적어도 하나의 기질의 변형 (예컨대 절단)을 촉매화할 수 있는 DNA-RNA 혼성 분자인, 단일 DNA 또는 DNA-함유 분자 (당업계에서 "DNA 효소", "데옥시리보자임" 또는 "DNA자임"으로서 또한 알려짐) 또는 RNA 또는 RNA-함유 분자 (당업계에서 "리보자임"으로서 또한 알려짐) 또는 이들의 조합을 포함할 수 있는 단분자성 핵산 효소를 포함한다. 상기 용어는, 적어도 하나의 기질을 인식할 수 있고 적어도 하나의 기질의 변형 (예컨대 절단)을 촉매화할 수 있는 DNA-RNA 혼성 복합체인, DNA 또는 DNA-함유 복합체 또는 RNA 또는 RNA-함유 복합체 또는 이들의 조합을 포함하는 핵산 효소를 포함한다. 용어 "핵산 효소", "촉매적 핵산", "촉매적 활성이 있는 핵산", 및 "촉매적 핵산 효소"는 그들의 의미 내에서 MNA자임을 포함한다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "MNA자임" 및 "다-구성요소 핵산 효소"는 본원에 사용된 경우에 동일한 의미를 갖고, MNA자임 조립 촉진자 (예를 들어, 표적)의 존재 하에서만, 기질을 촉매적으로 변형시킬 수 있는 활성 핵산 효소를 형성하는 2개 이상의 올리고뉴클레오티드 서열 (예를 들면 파트자임)을 지칭한다. "MNA자임"은 당업계에서 "PlexZyme"으로서 또한 알려진다. MNA자임은 기질의 절단, 및 한 기질 또는 기질들의 다른 효소적 변형을 포함하는 다양한 반응을 촉매화할 수 있다. 엔도뉴클레아제 또는 절단 활성이 있는 MNA자임은 "MNA자임 절단제"로서 또한 알려진다. 구성요소 파트자임, 파트자임 A 및 B 각각은 염기 짝짓기를 통해서 조립 촉진자 (예를 들면 표적 DNA 또는 RNA 서열)에 결합한다. MNA자임은 파트자임 A 및 B의 센서 아암이 조립 촉진자 상에 서로 인접하여 혼성화하는 때 단지 형성한다. MNA자임의 기질 아암은 기질을 관여시키고, 이의 변형 (예를 들면 절단)은, 파트자임 A 및 B의 부분적 촉매적 도메인의 상호작용에 의해 형성된, MNA자임의 촉매적 코어에 의해 촉매화된다. MNA자임은 DNA/RNA 키메라 리포터 기질을 절단할 수 있다. 형광단과 퀀처 염료 쌍 사이 기질의 MNA자임 절단은 형광성 신호를 생성할 수 있다. 용어 "다-구성요소 핵산 효소" 및 "MNA자임"은 2개 분자로 구성된 이분 구조, 또는 3개 핵산 분자로 구성된 삼분 구조, 또는 기타 다분 구조, 예를 들어 4개 이상의 핵산 분자에 의해 형성된 것들을 포함한다.
용어 "MNA자임" 및 "다-구성요소 핵산 효소"가 본원에 사용된 경우에 PCT 특허 공개 번호 WO/2007/041774, WO/2008/040095, WO2008/122084, 및 관련된 US 특허 공개 번호 2007-0231810, 2010-0136536, 및 2011-0143338 (이들 문서들의 각각의 내용은 그들 전체가 참고로 본원에 포함됨) 중 어느 하나 이상에 개시된 것들을 포함하는 모든 알려진 MNA자임 및 변형된 MNA자임을 포괄하는 것이 이해될 것이다. 용어 "MNA자임" 및 "다-구성요소 핵산 효소"에 의해 포괄된 MNA자임 및 변형된 MNA자임의 비-제한 예는 (본원에 예시된 대로) 절단 촉매적 활성이 있는 MNA자임, 하나 이상의 조립 억제제를 포함하는 해체된 또는 부분적으로 조립된 MNA자임, 하나 이상의 압타머를 포함하는 MNA자임 ("압타-MNA자임"), 하나 이상의 절두된 센서 아암 및 임의로 하나 이상의 안정화 올리고뉴클레오티드를 포함하는 MNA자임, 하나 이상의 활성 억제제를 포함하는 MNA자임, 다-구성요소 핵산 비활성 전효소 (MNAi)를 포함하고, 이들의 각각은 WO/2007/041774, WO/2008/040095, US 2007-0231810, US 2010-0136536, 및/또는 US 2011-0143338 중 하나 이상에서 상세히 기재된다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "파트자임", "구성요소 파트자임" 및 "파트자임 구성요소"는 DNA-함유 또는 RNA-함유 또는 DNA-RNA-함유 올리고뉴클레오티드를 지칭하되, 이의 2개 이상은, 본원에 정의된 대로 MNA자임 조립 촉진자의 존재 하에서만, "MNA자임"을 함께 형성할 수 있다. 특정 바람직한 구현예에서, 하나 이상의 구성요소 파트자임, 및 바람직하게는 적어도 2개는 3개 영역 또는 도메인: 변형을 촉매화시키는 촉매적 코어의 부분을 형성하는 "촉매적" 도메인; 조립 촉진자와 회합 및/또는 이에 결합할 수 있는 "센서 아암" 도메인; 및 기질과 회합 및/또는 이에 결합할 수 있는 "기질 아암" 도메인을 포함할 수 있다. 용어 "센서 아암", "표적 센서 아암" 또는 "표적 센싱 아암" 또는 "표적 아암"은 조립 촉진자, 예를 들어 표적에 결합하는 파트자임의 도메인을 설명하기 위해 호환적으로 사용될 수 있다. 파트자임은 본원에 "압타-파트자임"으로서 지칭된, 비제한적으로 압타머를 포함하는 적어도 하나 추가의 구성요소를 포함할 수 있다. 파트자임은, 어느 한쪽 조립 촉진자 또는 기질과 상호작용함으로써 MNA자임 구조를 안정화시키는 안정화 아암 구성요소 및 절두된 센서 아암이 있는 파트자임 구성요소를 비제한적으로 포함하는, 다중 구성요소를 포함할 수 있다.
용어 "조립 촉진자 분자", "조립 촉진자", "MNA자임 조립 촉진자 분자", 및 "MNA자임 조립 촉진자"는 본원에 사용된 경우에 MNA자임의 센서 아암과 상호작용에 의해 촉매적으로 활성 MNA자임을 형성하기 위해 구성요소 파트자임의 자가-조립을 용이하게 할 수 있는 독립체를 지칭한다. 본원에 사용된 경우에, 조립 촉진자는 절단 또는 다른 효소적 활성을 갖는 MNA자임의 조립을 용이하게 할 수 있다. 바람직한 구현예에서 조립 촉진자는 MNA자임의 자가-조립에 요구된다. 조립 촉진자는 1개 분자로 구성될 수 있거나, 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 "파트자임"의 센서 아암과 짝짓기, 또는 이에 결합할 수 있는 2개 이상의 "조립 촉진자 구성요소"로 구성될 수 있다. 조립 촉진자는 MNA자임의 센서 아암/들과 서열 상보성을 공유하지 않는 하나 이상의 뉴클레오티드 구성요소/들을 포함할 수 있다. 조립 촉진자는 표적일 수 있다. 표적은 DNA, 메틸화된 DNA, 알킬화된 DNA, RNA, 메틸화된 RNA, 마이크로RNA, siRNA, shRNA, tRNA, mRNA, snoRNA, stRNA, smRNA, pre- 및 pri-microRNA, 다른 비-코딩 RNA, 리보솜성 RNA, 이들의 유도체, 앰플리콘, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 핵산일 수 있다. 핵산은 증폭될 수 있다. 증폭은 PCR, RT-PCR, SDA, NEAR, HDA, RPA, LAMP, RCA, TMA, RAM, LCR, 3SR, 또는 NASBA 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
MNA자임은 스템-루프 LOCS 리포터 프로브 구조의 루프 영역 내에서 존재하는 기질 및/또는 선형 기질을 절단할 수 있다. 선형 기질의 절단은 표적의 검출을 허용하는 형광단 및 퀀처를 분리시킬 수 있다. MNA자임에 의한 LOCS의 루프 영역의 절단은 스템의 용융 온도 미만 온도에서 혼성화된 및 결합된 채로 남아있을 수 있는 그리고 분할된 LOCS의 스템의 용융 온도 초과 온도에서 분리 및 해리할 수 있는 2개 단편으로 구성된 분할된 LOCS 구조를 생성할 수 있다.
용어 "검출가능한 효과" 및 "검출가능한 신호"는 본원에 호환적으로 사용되고 동일한 의미를 갖도록 이해될 것이다. 본 용어는, 전형적으로 이의 입체구조, 구조, 배향, 다른 실체(들)에 대한 위치, 및 기타 등등을 변경시키기 위한 올리고뉴클레오티드의 변형시, 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 부착되거나 달리 이와 결합되는 검출 모이어티 (예를 들면 프로브, 리포터 또는 기질)로부터 생성된 신호 또는 효과를 지칭한다. 변형은, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드가 검출하도록 설계되는 표적의 존재에 의해 유도될 수 있다. 이러한 변형의 비-제한 예 (예를 들면 표적의 존재에 의해 유도된 것들)는 분자성 비콘의 스템-루프 부분의 개방, 스콜피온 유니프로브 및 비프로브의 이중-가닥 부분의 개방, 이중 혼성화 프로브의 표적 서열에의 결합, 캐처 듀플렉스의 생산, 및 선형 MNA자임 기질 또는 TaqMan 프로브의 절단/소화, 및 기타 등등을 포함한다. 검출가능한 효과는 형광 분광법, 표면 플라즈몬 공명 (SPR), 질량 분광법, NMR, 전자 스핀 공명, 편광 형광 분광법, 원편광 이색성, 면역검정, 크로마토그래피, 방사측정법, 광도법, 신티그래피, 전자 방법, 전기화학적 방법, UV, 가시광선 또는 적외선 분광법, 효소적 방법 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 다양한 방법에 의해 검출될 수 있다. 검출가능한 신호/효과는 검출 또는 정량화될 수 있고, 이의 크기는 입력의 존재 및/또는 정량 예컨대 샘플에서 존재하는 표적 분자의 양을 나타낼 수 있다. 추가로, 검출 모이어티에 의해 제공된 검출가능한 신호/효과의 크기는, 비제한적으로, 반응 온도를 포함하는, 검출가능한 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오티드가 활용되는 반응의 조건을 변경시킴으로써 조정될 수 있다. 표적-의존적 신호, 및/또는 표적-독립적 배경 신호를 생성하기 위해 올리고뉴클레오티드에 부착되거나 달리 이와 결합된 검출가능한 모이어티의 능력은 그래서 조정될 수 있다.
본원에 사용된 경우에 용어 "배경 신호" 및 "기준선 신호"는 호환적으로 사용되고 동일한 의미를 갖도록 이해될 것이다. 본 용어는, 올리고뉴클레오티드가 측정의 특정 조건 하에서 측정 또는 검출하도록 설계되는 특정 표적의 존재 또는 부재와 무관한, 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 부착되거나 달리 이와 결합된 검출가능한 모이어티에 의해 생성된 신호를 지칭한다.
용어 "폴리뉴클레오티드 기질", "올리고뉴클레오티드 기질" 및 "기질"은 본원에 사용된 경우에 촉매적 핵산 효소를 포함하는 효소에 의해 인식, 작용 또는 변형될 수 있는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 염기의 임의의 단일- 또는 이중-가닥 중합체, 또는 이들의 유사체, 유도체, 변이체, 단편 또는 조합을 포함한다. "폴리뉴클레오티드 기질" 또는 "올리고뉴클레오티드 기질" 또는 "기질"은 비제한적으로 절단을 포함하는 다양한 효소적 활성에 의해 변형될 수 있다. "폴리뉴클레오티드 기질" 또는 "올리고뉴클레오티드 기질" 또는 "기질"의 절단 또는 분해는 효소의 촉매적 활성 모니터링을 위하여 "검출가능한 효과"를 제공할 수 있다. "폴리뉴클레오티드 기질" 또는 "기질"은, 비제한적으로, 촉매적 핵산 효소 예컨대 MNA자임, AptaMNA자임, DNA자임, 압타자임, 리보자임 및/또는 단백질 효소 예컨대 엑소뉴클레아제 또는 엔도뉴클레아제를 포함하는 하나 이상의 효소에 의해 절단 또는 분해할 수 있다.
"리포터 기질"은 본원에 사용된 경우에 기질의 어느 한쪽 절단 또는 분해 혹은 촉매화된 반응과 관련하여 절단된 산물의 외관의 측정을 용이하게 하기 위해 특히 적응되는 기질이다. 리포터 기질은 용액에서 자유로울 수 있거나, 예를 들어, 표면에, 또는 또다른 분자에 결합 (또는 "테더링")될 수 있다. 리포터 기질은, 예를 들어, (하나 이상의 추가의 구성요소, 예컨대 퀀처가 있거나 없이) 형광단, 방사성 표지, 비오틴 (예를 들면 비오틴화) 또는 화학발광성 표지를 포함하는 임의의 매우 다양한 수단에 의해 표지될 수 있다.
본원에 사용된 경우에, "선형 MNA자임 기질"은 복수의 MNA자임에 의해 인식되고 촉매적으로 작용되는 기질, 예를 들어, 리포터 기질이다. "선형 MNA자임 기질"은 스템을 형성하기 위해 혼성화할 수 있는 이의 5' 또는 3' 단부에 서열을 함유하지 않는다. 대안적으로, MNA자임 기질은 LOCS 프로브의 루프 영역 내에서 존재할 수 있다.
본원에 사용된 경우에, "범용 기질"은 복수의 MNA자임에 의해 인식되고 촉매적으로 작용되는 기질, 예를 들어, 리포터 기질이고, 이들의 각각이 상이한 조립 촉진자를 인식할 수 있다. 이러한 기질의 사용은 범용 기질을 인식하는 구조적으로 관련된 MNA자임 모두를 사용하여 매우 다양한 조립 촉진자의 검출, 식별, 또는 정량화를 위한 별도 검정의 개발을 용이하게 한다. 이들 범용 기질은 하나 이상의 표지로 각각 독립적으로 표지될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 독립적으로 검출가능한 표지는 하나 이상의 범용 기질을 표지하는데 사용되어 MNA자임을 사용하여 다양한 조립 촉진자를 독립적으로 또는 동시에 검출하기 위한 편리한 시스템의 창출을 허용한다. 일부 구현예에서 기질은 보조인자, 예를 들어 금속 이온 보조-인자 예컨대 납 또는 수은의 존재 하에서 촉매적으로 활성인 DNA자임에 의해 촉매적 변형할 수 있다. 일부 구현예에서 기질은 압타자임의 압타머 부분에 결합하여 이에 의해 핵산 효소 부분의 촉매적 잠재력을 활성화시킬 수 있는 분석물, 단백질, 화합물 또는 분자의 존재 하에서 촉매적으로 활성이 될 수 있는 압타자임에 의해 촉매적 변형에 순응할 수 있다.
용어 "프로브" 및 "리포터"는 본원에 사용된 경우에 표적 분자 (예를 들면 핵산 또는 분석물)의 검출에 사용되는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 당업계에서 잘 알려지는 표준 프로브 또는 리포터의 비-제한 예는, 비제한적으로, 선형 MNA자임 기질, TaqMan 프로브 또는 가수분해 프로브, 분자성 비콘, 슬로피 비콘, 이클립스 프로브, 스콜피온 유니-프로브, 스콜피온 비-프로브 프라이머/프로브, 포착/피처 올리고뉴클레오티드, 및 이중-혼성화 프로브를 포함한다. 본 발명의 구현예는 표준 프로브를 LOCS 프로브와 조합시킨다. 일부 LOCS 프로브는 범용일 수 있는, 그리고 핵산 효소 예컨대 MNA자임, DNA자임 및 압타자임에 의해 촉매적 절단할 수 있는 루프 영역 내에서 핵산 효소 기질을 포함한다. 다른 LOCS 프로브는 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제를 포함하는 단백질 효소에 의해 촉매적 절단할 수 있는 루프 영역 내에서 표적 특이적 서열을 포함한다.
용어 "산물"은 기질의 효소적 변형의 결과로서 생산되는 새로운 분자 또는 분자들을 지칭한다. 본원에 사용된 경우에 용어 "절단 산물"은 효소에 의해 절단 또는 엔도뉴클레아제 활성의 결과로서 생산된 새로운 분자를 지칭한다. 일부 구현예에서, 온전한, LOCS 구조의 효소적 절단 또는 분해의 산물은 분할된 LOCS로서 집합적으로 지칭된, 2개 올리고뉴클레오티드 단편을 포함하고, 여기서 2개 올리고뉴클레오티드 단편은 반응의 온도에 따라 어느 한쪽 혼성화 또는 해리/분리할 수 있다.
본원에 사용된 경우에, 폴리뉴클레오티드의 맥락에서 용어 "용융 온도" 및 "Tm"의 사용은, 달리 구체적으로 지시되지 않는 한, Tm = 2℃ (A+T) + 4℃ (G+C)인, 월리스 법칙을 사용하여 계산된 대로 용융 온도 (Tm) 지칭이도록 이해될 것이다 (Wallace 등, (1979) Nucleic Acids Res. 6, 3543 참조). 용융 온도에 관한 서열 조성의 효과는 다음 공식: Tm (℃) = ΔH° / (ΔS° + R ln[올리고]) - 273.15에 의해 지배되는 가장 가까운 이웃 방법을 사용하여 이해될 수 있다. 스템 길이 및 서열 조성 이외에, 용융 온도에 영향을 미치는 것으로 알려지는 다른 인자는 이온성 강도 및 올리고뉴클레오티드 농도를 포함한다. 더 높은 올리고뉴클레오티드 및/또는 이온 농도는 용융 온도에서의 증가로 이어지는 듀플렉스 형성의 기회를 증가시킨다. 대조적으로, 더 낮은 올리고뉴클레오티드 및/또는 이온 농도는 용융 온도에서의 감소로 이어지는 스템의 해리를 선호한다.
본원에 사용된 경우에 용어 "퀀처"는 형광단에 바로 근접한 때, 형광단에 의해 생성된 방사 에너지를 흡수하고 에너지를 열로서 소멸시키거나 형광단의 방사 파장보다 긴 파장의 광을 방사하는 어느 한쪽인 임의의 분자를 포함한다. 퀀처의 비-제한 예는 Dabcyl, TAMRA, 그래핀, FRET 형광단, ZEN 퀀처, ATTO 퀀처, 블랙 홀 퀀처 (BHQ) 및 블랙 베리 퀀처 (BBQ)를 포함한다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "염기"는 핵산의 맥락에서 사용된 때 용어 "뉴클레오티드"와 동일한 의미를 갖도록 이해될 것이다.
본원에 사용된 경우에 용어 "차단제" 또는 "차단제 분자"는 상보적 가닥의 합성을 위한 템플레이트로서 올리고뉴클레오티드의 한 부분을 사용하여 폴리머라제를 방지하기 위해 올리고뉴클레오티드에 통합될 수 있는 임의의 분자 또는 작용기를 지칭한다. 비-제한 예로써, 헥사틸렌 글리콜 차단제는, 예를 들어, 이의 5' 프로빙 서열을 이의 3' 프라이밍 서열에 연결시키기 위해 스콜피온 프로브에 통합될 수 있고, 여기서 차단제는 템플레이트로서 프로빙 서열을 사용하여 폴리머라제를 방지하는 기능을 한다.
본원에 사용된 경우에 용어 "정규화하다", "정규화하는" 및 "정규화된"은 측정된 신호 (예를 들면 검출 모이어티에 의해 생성된 검출가능한 신호)의 알려진 및 반복가능한 값에 대한 또는 대조군 값에 대한 척도로의 전환을 지칭한다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "키트"는 물질을 전달하기 위한 임의의 전달 시스템을 지칭한다. 이러한 전달 시스템은 하나의 위치에서 또다른 위치로 반응 시약 (예를 들어 적절한 컨테이너에서 표지, 참조 샘플, 지지 물질, 등) 및/또는 지지 물질 (예를 들어, 완충액, 검정을 수행하기 위한 서면 지침 등)의 보관, 수송, 또는 전달을 허용하는 시스템을 포함한다. 예를 들어, 키트는 관련한 반응 시약 및/또는 지지 물질이 들어있는 하나 이상의 동봉물, 예컨대 박스를 포함할 수 있다. 용어 "키트"는 양쪽 단편화된 및 조합된 키트를 포함한다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "단편화된 키트"는 총 키트 구성요소의 하위부분이 각각 들어있는 2개 이상의 별도 컨테이너를 포함하는 전달 시스템을 지칭한다. 컨테이너는 의도된 수령인에게 함께 또는 별도로 전달될 수 있다. 총 키트 구성요소의 하위부분이 각각 들어있는 2개 이상의 별도 컨테이너를 포함하는 임의의 전달 시스템은 용어 "단편화된 키트"의 의미 내에 포함된다.
본원에 사용된 경우에, "조합된 키트"는 단일 컨테이너에서 (예를 들면 원하는 구성요소 각각을 수용하는 단일 박스에서) 반응 검정의 구성요소들의 모두가 들어있는 전달 시스템을 지칭한다.
인용된 숫자 값을 참조하여 본원에 용어 "약" 사용이 인용된 숫자 값 그리고 인용된 값의 더하기 또는 빼기 10 퍼센트 내에서 숫자 값을 포함하는 것이 이해될 것이다.
본원에 용어 "사이"의 사용이 숫자 값의 범위를 지칭하는 때 범위의 각 종점에서 숫자 값을 포괄하는 것이 이해될 것이다. 예를 들어, 길이가 10개 잔기 내지 20개 잔기의 폴리펩티드는 길이가 10개 잔기의 폴리펩티드 및 길이가 20개 잔기의 폴리펩티드를 포함한다.
본원에 선행 기술 문헌의 임의의 설명, 또는 그들 문헌에서 유래되거나 이에 기반된 본원에 진술은 문헌 또는 유래된 진술이 관련한 기술분야의 공통 일반 지식의 부분임을 인정하는 것은 아니다.
설명의 목적을 위하여 본원에 지칭된 모든 문헌은 달리 언급되지 않는 한 그들 전체가 참조로 이로써 포함된다.
약어
하기 약어는 본원에 그리고 명세서 전반에 걸쳐 사용된다:
LOCS: 스템에 연결된 루프
MNA자임: 다-구성요소 핵산 효소;
파트자임: 부분적 효소 함유 올리고뉴클레오티드;
PCR: 폴리머라제 연쇄 반응;
gDNA: 게놈성 DNA
NTC: 무 템플레이트 대조군
qPCR: 실시간 정량적 PCR
Ct; 임계값 주기
Cq; 정량화 주기
R 2 ; 상관 계수
nM; 나노몰
mM; 밀리몰
μL; 마이크로리터
μM; 마이크로몰
dNTP; 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트
NF-H 2 O: 뉴클레아제-없는 물;
LNA : 잠금된 핵산;
F: 형광단;
Q: 퀀처;
N = A, C, T, G, 또는 이들의 임의의 유사체;
N' = N에 상보적인, 또는 N과 염기 짝짓기할 수 있는 임의의 뉴클레오티드;
(N) x : N의 임의의 수;
(N') x : N'의 임의의 수;
W: A 또는 T;
R: A, G, 또는 AA;
rN: 임의의 리보뉴클레오티드 염기;
(rN) x : rN의 임의의 수;
rR: A 또는 G;
rY: C 또는 U;
M: A 또는 C;
H: A, C, 또는 T;
D: G, A, 또는 T;
JOE 또는 6-JOE: 6-카르복시-4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시플루오레세인;
FAM 또는 6-FAM: 6-카르복시플루오레세인.
BHQ1: 블랙 홀 퀀처 1
BHQ2: 블랙 홀 퀀처 2
RT-PCR: 역전사 폴리머라제 연쇄 반응
SDA: 가닥 변위 증폭
NEAR: 니킹 효소　증폭　반응
HDA: 헬리카제 의존적 증폭
RPA: 리콤비나제 폴리머라제 증폭
LAMP: 루프-매개 등온 증폭
RCA: 회전 환 증폭
TMA: 전사-매개 증폭
3SR: 자가-지속 서열 복제
NASBA: 핵산 서열 기반된 증폭
LCR: 리가제 연쇄 반응
RAM: 분지화 증폭 방법
IB: Iowa Black® FQ
IBR: Iowa Black® RQ
shRNA: 짧은 헤어핀 RNA
siRNA: 짧은 간섭 RNA
mRNA: 메신저 RNA
tRNA: 운반 RNA
snoRNA: 소핵소체 RNA
stRNA: 소분자 RNA
smRNA: 소조절 RNA
pre-microRNA: 전구체 마이크로RNA
pri-microRNA: 1차 마이크로RNA
LHS: 좌변
RHS: 우변
DSO: 이중 가닥 올리고뉴클레오티드
Tm: 용융 온도
RFU: 상대 형광 단위
CT: 클라미디아 트라코마티스
NG: 임균
SPR: 표면 플라즈몬 공명
GNP: 금 나노입자
상세한 설명
하기 상세한 설명은 당업자가 본 발명을 실시하게 하도록 충분히 상세하게 본 발명의 예시적 구현예를 전한다. 기재된 다양한 구현예의 속성 및 한계는 본 발명의 다른 구현예 또는 본 발명을 전체적으로 반드시 제한하지 않는다. 따라서, 하기 상세한 설명은 본 발명의 범위를 제한하지 않되, 청구항에 의해서만 한정된다.
본 발명은 표적 (예를 들면 핵산, 단백질, 분석물, 화합물, 분자 및 기타 등등)의 개선된 다중화된 검출을 위한 방법 및 조성물에 관련한다. 방법 및 조성물은 다양한 다른 제제/들과 조합으로 사용될 수 있는, 다른 올리고뉴클레오티드 리포터, 프로브 또는 기질과 함께 LOCS 올리고뉴클레오티드의 조합을 각각 이용한다.
- 리포터, 프로브 및 기질
본 발명에 따르면, 표적 분자의 멀티플렉스 검출은 멀티플렉스 검출 검정에서 프로브로서 사용에 적합한 또다른 올리고뉴클레오티드와 조합으로 LOCS를 사용하여 촉진된다.
핵산 표적의 검출을 위한 많은 올리고뉴클레오티드는 기재되었고 당업계에서 잘 알려진다. LOCS와 조합으로 사용될 수 있는 적합한 올리고뉴클레오티드는, 비제한적으로, MNA자임 기질, TaqMan 또는 가수분해 프로브, 분자성 비콘, 슬로피 비콘, 이클립스 프로브, 스콜피온 유니-프로브, 스콜피온 비-프로브, 이중-혼성화 프로브 및 포착/피처 프로브를 포함한다.
일부 구현예에서, 이들 올리고뉴클레오티드는 직접적으로 표적 또는 표적 앰플리콘에 결합하여 그들의 검출을 촉진시키지만, MNA자임 기질 및 포착/피처 올리고뉴클레오티드는 이들이 범용일 수 있고 임의의 표적의 검출에 적합할 수 있음에 따라 예외를 제공한다.
일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 효소적으로 매개된 절단 또는 분해로 인해 표적, 예를 들어, MNA자임 기질 및 TaqMan 또는 가수분해 프로브의 존재 하에서 형광을 생성한다.
다른 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 표적 또는 표적 앰플리콘 (예를 들면 분자성 비콘, 슬로피 비콘, 이클립스 프로브, 스콜피온 유니-프로브, 스콜피온 비-프로브 및 이중-혼성화 프로브)에 결합함으로써 유도된 입체구조 변화의 결과로서 형광성 신호의 상이한 수준을 제공한다.
TOCE 시스템에서, 캐처는 표적의 존재 하에서 단지 활성화되고 방출되는 피처의 결합 및 확장에 의해 유도된 입체구조 변화의 결과로서 형광을 변화시킨다.
리포터 올리고뉴클레오티드의 이들 유형의 임의의 것 또는 모두는 비제한적으로, 단일 파장에서 측정된 형광에서의 변화를 포함하는 단일 검출 모이어티에 관련된 변화의 측정에 의해 여러 표적의 검출을 매개하기 위해 LOCS 프로브와 공동으로 사용에 적합하다.
LOCS와 조합을 위한 올리고뉴클레오티드는 표준 프로토콜에 따라 합성될 수 있다. 예를 들어, 이들은 보호기의 제거, 포스포르아미다이트 커플링, 캡핑 및 산화를, 어느 한쪽 고체상 또는 용액상에서 그리고 임의로 자동화된 합성기 장치에서 포함하는 순차적 합성 주기로 뉴클레오시드 및 비-뉴클레오시드 포스포르아미다이트를 사용하여 포스포르아미다이트 화학에 의해 합성될 수 있다. 대안적으로, 이들은 상업적 원천으로부터 구매될 수 있다. MNA자임 기질, TaqMan 또는 가수분해 프로브, 분자성 비콘, 슬로피 비콘, 이클립스 프로브, 스콜피온 유니-프로브, 스콜피온 비-프로브, 이중-혼성화 프로브 및 포착/피처 프로브가 포함하거나, 구매될 수 있거나 달리 수득될 수 있는 상업적 출처의 비-제한 예는 다음을 포함한다: MNA자임 기질은 SpeeDx (plexpcr.com)로부터 구매될 수 있고; TaqMan 및 가수분해 프로브는 Thermo Fisher Scientific (www.thermofisher.com), Sigma Aldrich (www.sigmaaldrich.com), Promega (www.promega.com), Generi Biotech (www.generi-biotech.com)로부터 구매될 수 있고; 분자성 비콘 및 슬로피 비콘은 Integrated DNA Technologies (www.idtdna.com), Eurofins (www.eurofinsgenomics.com), Sigma Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 및 TriLink BioTechnologies (www.trilinkbiotech.com)로부터 구매될 수 있고; 이클립스 프로브는 Integrated DNA Technologies (www.idtdna.com)로부터 구매될 수 있고; 스콜피온 유니-프로브는 Sigma Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 및 Bio-Synthesis (https://www.biosyn.com)로부터 구매될 수 있고; 스콜피온 비-프로브는 Bio-Synthesis (https://www.biosyn.com)로부터 구매될 수 있고; 이중-혼성화 프로브는 Bio-Synthesis (https://www.biosyn.com), Sigma Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 및 Eurofins (www.eurofinsgenomics.com)로부터 구매될 수 있고 캐처 피처 검정은 Seegene (www.seegene.com)으로부터 구매될 수 있다.
- LOCS 올리고뉴클레오티드
본 발명에서 사용을 위한 예시적 LOCS 올리고뉴클레오티드는 도 1에 실례된다. 도시된 예시적 온전한 LOCS 올리고뉴클레오티드 (도 1a, LHS)는 루프 영역, 스템 영역 및 형광단 (F)/퀀처 (Q) 염료 쌍을 갖는다. 형광단/퀀처 쌍으로 예시되었지만, 당업자는 임의의 다른 적합한 검출 모이어티(들)이 동일한 목적으로 사용될 수 있음을 인식할 것이다. 루프 영역은 표적 또는 표적 앰플리콘의 존재 하에서 효소적 절단 또는 분해가 가능한 기질 영역을 함유한다. 온전한 LOCS 내에서 루프의 절단 또는 분해는 분할된 LOCS 듀플렉스를 생성한다 (도 1b, RHS).
일부 구현예에서, 온전한 LOCS 올리고뉴클레오티드의 용융 온도 ("Tm")는 분할된 LOCS 구조의 Tm보다 높다.
분자내 결합이 분자간 결합보다 강하므로, 온전한 LOCS 구조의 스템 영역은 일반적으로 분할된, 절단된 또는 분해된 LOCS 올리고뉴클레오티드 구조의 스템보다 높은 온도에 용융할 것이다. 예를 들어, 온전한 LOCS A의 스템은 분할된 LOCS 스템이 용융하는 온도인 Tm B보다 높은 Tm A에 용융할 것이다 (도 1b). 온전한 LOCS가 아닌 분할된 LOCS의 용융을 허용하는 온도에서 형광의 존재는 표적, 또는 표적 앰플리콘의 존재를 나타낸다. 도 2에서 묘사된 예시적 LOCS에서, LOCS 올리고뉴클레오티드의 루프 영역의 서열은, 예를 들어, MNA자임 또는 다른 촉매적 핵산/들에 대한 기질일 수 있다.
본 발명에서 사용에 적합한 예시적 LOCS는 도 2에서 실례되는 촉매적 핵산에 대한 기질을 포함하는 루프 영역을 함유할 수 있다. 이들 구현예에서, LOCS 올리고뉴클레오티드는 임의의 표적을 검출하는데 사용될 수 있는 범용 기질을 포함한다. LOCS 올리고뉴클레오티드는 스템 영역, 형광단 퀀처/염료 쌍 (대안적 검출 모이어티(들)가 본원에 기재된 대로 이용될 수 있음) 및 촉매적 핵산 예컨대 MNA자임에 대한 범용 기질을 포함하는 간섭 루프 영역을 함유한다. MNA자임은 표적을 직접적으로 검출할 수 있거나 표적 증폭 동안 생성된 앰플리콘을 검출하는데 사용될 수 있다. 파트자임 각각의 표적 센서 아암이 MNA자임의 활성 촉매적 코어를 형성하기 위해 상보적 염기 짝짓기에 의해 표적에, 또는 표적 앰플리콘에 혼성화하는 때 MNA자임은 형성한다. LOCS 올리고뉴클레오티드의 루프 영역은 상보적 염기 짝짓기에 의해 MNA자임의 기질 결합 아암에 혼성화하고 루프 내에서의 기질은 MNA자임에 의해 절단된다. 이것은 온전한 LOCS의 Tm A보다 낮은 Tm B가 있는 스템을 갖는 분할된 LOCS 구조를 생성한다. Tm B 초과 그러나 Tm A 미만 온도에서 형광성 신호의 측정은 반응에서 표적의 존재를 나타낸다. 당업자는 표적이 실시간으로 또는 반응의 끝에 검출될 수 있음을 인식할 것이다.
도 3에서 실례된 예시적 구현예를 참조하여, 표준 선형 MNA자임 기질은 도시되고 이의 루프 내에서 MNA자임 기질을 포함하는 단일 LOCS 프로브와 공동으로 사용된다. 선형 MNA자임 기질 및 단일 LOCS 프로브는 둘 다 동일한 (또는 유사한) 검출 모이어티, 예를 들어 특이적 형광단(F)/퀀처(Q) 염료 쌍으로 표지될 수 있다. 대안적 검출 모이어티(들)는 본원에 기재된 대로 이용될 수 있다. 선형 기질은 제1 표적의 존재 하에서 조립하는 제1 MNA자임에 의해 절단가능한 제1 기질 서열을 포함한다 (도 3a). 제1 표적의 존재 하에서, 선형 기질은 제1 MNA자임에 의해 절단되어, 넓은 범위의 온도에 걸쳐 검출될 수 있는 형광에서의 증가를 초래한다. LOCS는 제2 표적의 존재 하에서 조립하는 제2 MNA자임에 의해 절단가능한 이의 루프 내에서 제2 기질 서열을 함유한다 (도 3b). 제2 표적의 존재 하에서 LOCS는 절단되어 온전한 LOCS의 용융 온도 (Tm A)보다 낮은 Tm B에 용융하는 분할된 LOCS를 생성한다. Tm B 미만 온도에서, 분할된 LOCS의 스템 부분은 혼성화된 채로 남아있고 따라서 형광단은 퀀처 분자에 대한 근접성으로 인해 퀀칭된다. Tm B 초과 온도에서, 분할된 LOCS의 스템 부분은 퀀처 분자로부터 형광단을 해리하고 분리시켜 형광 증가를 초래한다. 양쪽 표적이 존재하고, 형광이 Tm B 미만 제1 온도에서 측정되는 때, 형광에서의 증가는 제1 표적 1과만 연관된다. 형광이 Tm B 초과, 그러나 TmA 미만 제2 온도에서 측정되는 때, 형광에서의 증가는 제1 표적 및/또는 제2 표적과 연관된다. 양쪽 표적 1 및 표적 2가 존재하는 때, 제2 온도에서 증폭 동안 플루오레센스에서의 관찰된 변화는 제1 온도에서 변화보다 커서 표적 1, 또는 표적 2, 또는 표적 1 및 2, 또는 어느 표적도 없음이 반응에서 존재하는지 여부의 결정을 허용한다.
본 발명의 다른 구현예에서, 표준 리포터 프로브와의 조합에 유용한 대안적 LOCS 구조는 사용될 수 있다. 도 4A 및 도 4B에서 예시된 경우에, LOCS 올리고뉴클레오티드의 루프 영역은 검출되어야 하는 표적에 완전히 또는 부분적으로 상보적인, 그리고 이중-가닥인 때, 엑소뉴클레아제에 의해, 예를 들어, 폴리머라제에 내재된 엑소뉴클레아제 활성에 의해 분해를 위한 기질의 역할을 할 수 있는 표적-특이적 서열을 포함할 수 있다 (도 3A). 도 3B에서 실례된, 더욱 추가 구현예에서, 루프 내에서 표적 특이적 서열은 이중-가닥 제한 효소 인식 부위의 1개 가닥을 추가로 포함할 수 있다. 표적 서열에 루프 서열의 혼성화는 기능적, 절단가능한 제한 부위를 초래할 수 있다. 바람직한 구현예에서 제한 효소는 표적을 온전하게 남기면서 LOCS 올리고뉴클레오티드의 루프 가닥을 절단할 수 있는 니킹 효소이다.
본 발명의 다양한 구현예에서, 잘-알려진 리포터 프로브 또는 기질의 상이한 조합은 단일 반응에서 LOCS 프로브와 조합될 수 있다. 비-제한 예로써, 2개 표적의 검출을 위한 반응은, 비제한적으로, 범용 MNA자임 기질을 포함하는 LOCS 프로브, 엑소뉴클레아제에 대하여 표적-특이적 기질을 포함하는 LOCS 프로브, 및 엔도뉴클레아제 예컨대 니킹 효소에 대하여 표적-특이적 기질을 포함하는 LOCS 프로브를 포함하는 그룹 2로부터 선택된 제2 프로브와 함께, 비제한적으로, 선형 MNA자임 기질, TaqMan 또는 가수분해 프로브, 분자성 비콘, 슬로피 비콘, 이클립스 프로브, 스콜피온 유니-프로브, 스콜피온 비-프로브, 포착/피처 올리고뉴클레오티드, 및 이중-혼성화 프로브를 포함하는 그룹 1로부터 선택된 제1 프로브의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
그룹 2 프로브와 그룹 1 프로브의 임의의 조합은 본 발명의 방법에 따라 단일 반응에서 여러 표적을 측정하는데 사용될 수 있다. 도 3에서 실례된 구현예는 제2 MNA자임에 의해 절단가능한 LOCS 프로브와 조합된 제1 MNA자임에 의해 절단가능한 선형 MNA자임 기질의 예시적 조합을 실례한다. 본 발명의 다른 비-제한 구현예는 비-절단가능한 분자성 비콘이 MNA자임에 의해 절단가능한 LOCS 프로브와 조합될 수 있는 도 5에서 실례된다. 양쪽 분자성 비콘 및 LOCS 프로브는 동일한 (또는 유사한) 검출 모이어티, 예를 들어 유사한 파장에 방사하는 동일한 형광단 또는 형광단들로 표지될 수 있다. 분자성 비콘은 Tm A가 있는 스템 영역 및 제1 표적 1과 특이적으로 혼성화할 수 있는 Tm B가 있는 루프 영역을 가질 수 있고; 여기에서 Tm B는 Tm A보다 크다. 이것은 Tm C가 있는 스템 영역 및 제2 표적 2 존재 하에서 MNA자임에 의해 절단되어서 분할된 LOCS를 생성할 수 있는 Tm D가 있는 루프 영역을 가질 수 있는 온전한 LOCS 프로브와 조합될 수 있고, 여기에서 Tm D는 Tm C보다 적다. 표적 1 및/또는 표적 2의 존재는 어느 한쪽 실시간으로, 또는 증폭의 시작에서, 또는 근처에서 그리고 증폭 이후 획득된 별개 측정을 사용하여 2개 온도에서 형광을 측정함으로써 구별될 수 있다.
- 가역적 프로브를 포함하는 LOCS 조합
일부 구현예에서 본 발명의 조성물 및 방법은 온도에 의해 가역적으로 조정될 수 있는 표적-의존적 검출가능한 신호를 생성할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브 및 LOCS의 조합을 포함한다. 추가로, LOCS 및 올리고뉴클레오티드 프로브는 온도에 의해 표적-독립적 신호 생성을 조정하여서 배경 잡음 또는 기준선 수준의 조작을 허용할 수 있다.
예를 들어, 올리고뉴클레오티드 프로브는 검출가능한 신호의 방사가 억압되는 표적의 부재 하에서 제1 입체구조 또는 배열, 및 표적의 존재를 나타내는 검출가능한 신호의 방사를 촉진시키는 표적의 존재 하에서 제2 입체구조 또는 배열을 채택할 수 있다. 이 범주에서 올리고뉴클레오티드 프로브의 비-제한 예는 분자성 비콘, 슬로피 비콘, 스콜피온 유니프로브, 스콜피온 비-프로브, 및 포착/피처 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
대안적으로, 이중 혼성화 프로브의 사례에서, LOCS 이외에 2개 추가의 올리고뉴클레오티드는 검출가능한 신호가 표적의 존재 하에서 억압되는 그리고 검출가능한 신호가 표적이 부재인 때 생성되는 배열을 채택할 수 있다.
상기 구현예에서, 온전한 LOCS는 표적-의존적 절단 이벤트를 거쳐 분할된 LOCS를 제공한다. 분할된 LOCS의 이중-가닥 스템 부분은 제1 올리고뉴클레오티드(들)의 입체구조 또는 배열 및 연관된 검출가능한 신호에서 표적-의존적 변화가 생성되는 온도와 상이한 온도에서 해리하도록 설계될 수 있다.
일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 분자성 비콘이다. 하기 시나리오는 본 발명의 구현예에 따른 멀티플렉스 검출 검정의 비-제한 예를 제공한다. 이들 시나리오에서, 분자성 비콘은 표적 1 및 2, 각각의 검출을 위하여 LOCS와 조합으로 사용될 수 있다. 분자성 비콘은 이의 이중-가닥 스템 부분의 용융 온도인 Tm A, 및 이의 단일-가닥 루프 듀플렉스와 표적 1 사이 형성된 듀플렉스의 용융 온도인 Tm B를 포함할 수 있다. LOCS는 온전한 때 이의 이중-가닥 스템 부분의 용융 온도인 Tm C, 및 분할된 때 이의 이중-가닥 스템 부분의 용융 온도인 Tm D를 포함할 수 있다. 분자성 비콘의 이중-가닥 스템 부분의 대향 가닥은, LOCS의 것들이 할 수 있듯이, 형광단 및 퀀처로 표지될 수 있다. 분자성 비콘의 형광단은 동일할 수 있거나, LOCS의 형광단으로서, 가시 스펙트럼의 동일한 영역에서 방사할 수 있다. 대안적 구현예에서, 상이한 검출 모이어티는, 예를 들어, 비색계 또는 SPR 검출을 위한 동일한 또는 유사한 크기 및/또는 유형의 나노입자, 화학발광성 검출을 위한 반응성 모이어티 (예를 들면 알칼리성 포스파타제 또는 퍼옥시다제 효소), 전기화학적 검출을 위한 전기활성 종 (예를 들면 페로센, 메틸렌 블루 또는 퍼옥시다제 효소)을 포함하여 활용될 수 있다. 숙련된 사람은 이들 사례에서 분자성 비콘이 슬로피 비콘, 스콜피온 유니프로브, 또는 스콜피온 비-프로브로 치환될 수 있음을 용이하게 이해할 것이다.
다양한 관계는 반응이 측정되는 온도와 리포터 프로브의 다양한 영역의 용융 온도 사이 실재할 수 있다. 4개 시나리오는 1개 분자성 비콘 및 1개 LOCS 프로브를 포함하는 반응의 맥락 내에서 아래 상세히 기재되고 이러한 시나리오에 대하여 비-제한 예시적 온도는 아래 표 1에서 개괄된다.
Figure pct00001
시나리오 1
제1 비-제한 예에서, Tm A는 Tm D보더 더 클 수 있고, Tm B는 Tm D보더 더 클 수 있다. 표적 1 및/또는 표적 2의 존재는 어느 한쪽 증폭의 시작에서, 또는 근처에서 그리고 증폭 이후 획득된 2개 온도에서 형광을 측정함으로써 구별될 수 있다. 표적 1 및/또는 표적 2의 존재 하에서, Tm A, Tm B 및 Tm D보더 더 적을 수 있는 제1 온도 1에서 형광의 측정은 표적 1만의 존재를 나타내는 신호를 생성할 수 있다. 이 온도에서, 분자성 비콘은 (존재한다면) 표적 1에 혼성화 및 형광화될 것이지만; 표적 1의 부재 하에서, 이의 스템은 내부적으로 혼성화된 및 따라서 퀀칭된 채로 남아있을 것이다. 온도 1에서 양쪽 온전한 및/또는 분할된 LOCS 종은 이 온도에서 그들의 각자의 스템의 혼성화로 인해 퀀칭될 것이다. 추가적으로, 표적 1 및/또는 표적 2의 존재 하에서, 양쪽 온도 1 및 Tm D보더 더 크지만, 양쪽 Tm B 및 Tm C보다 적은 제2 온도 2에서 형광의 측정은 표적 1 및/또는 표적 2의 존재를 나타낼 수 있다. 이 제2 온도에서 분자성 비콘은 (존재한다면) 표적 1에 혼성화될 것이고 형광화할 것이지만, 표적 1의 부재 하에서 이의 스템은 내부적으로 혼성화된 및 따라서 퀀칭된 채로 남아있을 것이다. 추가적으로, 이 제2 온도에서, 표적 2가 부재이면, LOCS 프로브는 온전한 및 퀀칭된 채로 남아있을 것이지만, (존재한다면) 표적 2에 특이적인 MNA자임에 의해 분할될 것이고 이의 스템은 해리되어 형광을 생성할 것이다. 이 시나리오에 온도 1에서 형광이 증폭 동안 증가하면, 이것은 표적 1이 존재함을 나타낸다. 추가로, 증폭의 과정 동안 온도 2에서 관찰된 형광에서의 증가가 온도 1에서 관찰된 것보다 크면, 이것은 표적 2가 존재함을 나타낸다.
시나리오 2
제2 비-제한 예에서, Tm A는 Tm D와 유사할 수 있고, Tm B는 Tm C와 유사할 수 있고, Tm B는 Tm D보더 더 클 수 있다. 표적 1 및/또는 표적 2의 존재는 어느 한쪽 실시간으로; 또는 어느 한쪽 증폭의 시작에서, 또는 근처에서 그리고 증폭 이후 획득된 단일 측정을 사용하여 2개 온도에서 형광을 측정함으로써 구별될 수 있다. 표적 1 및/또는 표적 2의 존재 하에서, Tm A보더 더 적을 수 있고, Tm B보더 더 적을 수 있고, Tm D보더 더 적을 수 있는, 제1 온도 1에서 형광의 측정은 표적 1만의 존재를 나타내는 신호를 생성할 수 있다. 이 온도에서, 분자성 비콘은 (존재한다면) 표적 1로 혼성화될 수 있고 형광화할 수 있지만, 이의 스템은 표적 1의 부재 하에서 내부적으로 혼성화된 채로 남아있을 것이고 퀀칭된 채로 남아있을 것이다. 이 제1 온도 1에서, 양쪽 온전한 및/또는 분할된 LOCS 종은 이 온도에서 스템 영역의 혼성화로 인해 퀀칭될 것이다. 추가적으로, 표적 1 및/또는 표적 2의 존재 하에서, 양쪽 온도 1 및 Tm A 및 Tm D보다 크지만, 양쪽 Tm B 및 Tm C보다 적은 제2 온도 2에서 형광의 측정은 표적 2의 존재를 나타낼 수 있다. 이 제2 온도에서 분자성 비콘은 (존재한다면) 표적 1에 혼성화될 것이고 형광화할 것이거나; 이 온도에서 이의 스템의 해리 및 개방으로 인해 표적-의존적 방식으로 형광화할 것이다. 이와 같이 분자성 비콘은 증폭 동안 변화되지 않은 채로 남아있을 수 있는 이 온도에서 배경 형광 수준을 제공하는, 어느 한쪽 표적의 존재 또는 부재와 관계없이 형광화할 것이다. 추가적으로, 이 제2 온도에서, 표적 2가 부재이면 LOCS 프로브는 온전하고 퀀칭된 채로 남아있을 것이지만; (존재한다면) 표적 2에 특이적인 MNA자임에 의해 분할될 것이고 이의 스템은 해리하고 그래서 형광을 생성할 것이다. 이 시나리오에, 온도 1에서 형광이 증폭 동안 증가하면, 이것은 표적 1이 존재하고 분자성 비콘에 의해 검출됨을 나타내고, 한편 증폭 동안 온도 2에 형광에서의 증가는 표적 2가 존재하고 LOCS 프로브에 의해 검출됨을 나타낸다. 정성적 데이터는 PCR의 시작 및 끝에서/근처에서 별개 온도 측정을 사용하여 수득될 수 있고/거나; 정량적 데이터는 PCR 동안 각 온도에서 생성된 2개 증폭 곡선으로부터 직접적으로 판독될 수 있다. 대안적으로, Tm A 및 Tm D가 유사하지 않은 경우, 2개 온도에서 형광 수준과 표적/들의 존재 또는 부재 사이 동일한 관계는 양쪽 Tm A 및 Tm D가 온도 1보더 더 크고 온도 2보더 더 적으면 유지한다.
상기 접근법은 단일 파장에서 여러 표적을 구분하기 위해 여러 온도에서 측정을 이용하는 당업계에서 알려진 다른 방법(들) 예컨대, 예를 들어, TOCE보다 주요 이점을 제공할 수 있다. TOCE는 제1 온도에서 제1 표적으로부터 형광을 측정하고, 제2 온도에서 2개 표적 (제1 표적 더하기 제2 표적)으로부터 형광을 측정한다. 이 데이터는 온도 자체와 관련하는 형광에서의 내재된 차이를 설명하기 위해 추가적으로 조정이 필요한 복합 분석에서 제2 표적을 정량화하도록 제2 온도에서 제1 표적과 관련된 형광의 양을 수학적으로 뺄셈하기 위해 분석된다. 여기에 기재된 현행 발명의 구현예는 제1 온도에서 생성된 제1 증폭 곡선으로부터 제1 표적의 직접 정량화 그리고 제2 온도에서 생성된 제2 증폭 곡선으로부터 제2 표적의 직접 정량화를 허용하므로 복잡한 PCR후 분석에 대한 필요를 부정하는 방법에서 분자성 비콘 및 LOCS 프로브를 이용한다. 이들 구현예는 각 표적을 개별적으로 측정하고 추가로 각 표적이 데이터 획득을 위하여 선택된 2개 온도 중 하나에서 배경 위에 검출가능한 신호를 단지 생성할 것이므로 동일한 분자의 형광 출력에서의 차이를 설명하기 위하여 조정에 대한 요건은 없다.
시나리오 3
제3 비-제한 예에서, Tm A는 Tm D보다 적을 수 있고, Tm B는 Tm D와 유사할 수 있고 Tm C는 Tm B보다 클 수 있다. 표적 1 및/또는 표적 2의 존재는 어느 한쪽 실시간으로; 또는 어느 한쪽 증폭의 시작에서, 또는 근처에서 그리고 증폭 이후 획득된 단일 측정을 사용하여 2개 온도에서 형광을 측정함으로써 구별될 수 있다. 표적 1 및/또는 표적 2의 존재 하에서, Tm A보다 적을 수 있고, Tm B보다 적을 수 있고, Tm D보다 적을 수 있는 제1 온도 1에서 형광의 측정은 표적 1만의 존재를 나타내는 신호를 생성할 수 있다. 이 온도에서, 분자성 비콘은 (존재한다면) 표적 1에 혼성화될 것이고 형광화할 것이지만; 이의 스템은 표적 1의 부재 하에서 내부적으로 혼성화된 채로 남아있을 것이고 퀀칭될 것이다. 이 온도 1에서, 양쪽 온전한 및/또는 분할된 LOCS 종은 이 온도에서 그들의 스템의 혼성화로 인해 퀀칭될 것이다. 추가적으로, 표적 1 및/또는 표적 2의 존재 하에서, 양쪽 온도 1 및 Tm D 그리고 Tm A 및 Tm B보다 크지만, Tm C보다 적은 제2 온도 2에서 형광의 측정은 표적 2의 존재를 나타낼 수 있다. 이 제2 온도에서 분자성 비콘은 표적 1에 혼성화할 수 없고, 개방 해리된 스템을 항상 가질 것이고 따라서 증폭 동안 변화되지 않은 채로 남아있을 수 있는 이 온도에서 배경 형광 수준을 제공하는, 어느 한쪽 표적의 존재 또는 부재와 관계없이 형광할 것이다. 추가적으로, 이 제2 온도에서, 표적 2가 부재이면, LOCS 프로브는 온전하고 퀀칭된 채로 남아있을 것이지만, (존재한다면) 표적 2에 특이적인 MNA자임에 의해 분할될 것이고 이의 스템은 해리되어서 형광을 생성할 것이다. 이 시나리오에, 온도 1에서 형광이 증폭 동안 증가하면, 이것은 표적 1이 존재하고 분자성 비콘에 의해 검출됨을 나타내고, 한편 온도 2에 형광에서의 증가는 표적 2가 존재하고 LOCS 프로브에 의해 검출됨을 나타낸다. 정성적 데이터는 PCR의 시작 및 끝에서/근처에서 별개 온도 측정을 사용하여 수득될 수 있고/거나; 정량적 데이터는 PCR 동안 각 온도에서 생성된 2개 증폭 곡선으로부터 직접적으로 판독될 수 있다. 대안적으로, Tm A 및 Tm D가 유사하거나 Tm A가 Tm D보다 큰 경우, 2개 온도에서 형광 수준과 표적/들의 존재 또는 부재 사이 동일한 관계는 양쪽 Tm A 및 Tm D가 온도 1보다 크고 온도 2보다 적으면 유지한다.
시나리오 4
제4 비-제한 예에서, 양쪽 Tm A 및 Tm B는 Tm C 및 Tm D보다 클 수 있다. 표적 1 및/또는 표적 2의 존재는 어느 한쪽 증폭의 시작에서, 또는 근처에서 그리고 증폭 이후 획득된 2개 온도에서 형광을 측정함으로써 구별될 수 있다. 표적 1 및/또는 표적 2의 존재 하에서, Tm A 및 Tm B보다 적을 수 있지만 Tm C 및 Tm D보다 클 수 있는 제1 온도 1에서 형광의 측정은 표적 1의 존재를 나타내는 신호를 생성할 수 있다. 이 온도에서, 분자성 비콘은 (존재한다면) 표적 1에 혼성화될 것이고 형광화할 것이지만; 이의 스템은 표적 1의 부재 하에서 내부적으로 혼성화된 채로 남아있을 것이고 퀀칭될 것이다. 이 온도에서, LOCS는 표적 2의 존재 또는 부재와 관계없이 형광할 것이고 따라서 증폭 동안 변화되지 않은 채로 남아있을 배경에 단지 기여할 것이다. 표적 2의 부재 하에서 온전한 LOCS의 스템은 해리 및 형광할 것이고, 유사하게 표적 2의 존재 하에서 분할된 LOCS의 스템은 해리 및 형광할 것이다. 추가적으로, 온도 1보다 적고, Tm C 및 Tm A 및 Tm B보다 적지만, Tm D보다 큰 온도 2에 증폭의 과정 동안 형광에서의 증가는 표적 1 및/또는 표적 2의 존재를 나타낼 수 있다. 이 제2 온도에서 분자성 비콘은 (존재한다면) 표적 1에 혼성화될 것이고 따라서 형광할 것이거나, 표적 1의 부재 하에서 혼성화된 스템으로 퀀칭된 채로 남아있을 것이다. 추가적으로, 이 제2 온도에서, 표적 2가 부재이면 온전한 LOCS 프로브 스템은 혼성화된 및 퀀칭된 채로 남아있을 것이거나, 표적 2가 존재하면 LOCS는 표적 2에 특이적인 MNA자임에 의해 분할될 것이고 분할된 LOCS의 스템은 해리 및 형광화할 것이다. 이 시나리오에 온도 2에서 형광이 증폭 동안 증가하면, 이것은 표적 1 및/또는 표적 2가 존재함을 나타낸다. 추가로, 온도 2에 증폭의 과정 동안 관찰된 형광에서의 증가가 온도 1에서 관찰된 것보다 크면 이것은 표적 2가 존재함을 나타낸다.
- 캐처-피처 프로브를 포함하는 LOCS 조합
일부 구현예에서 본 발명의 조성물 및 방법은 TOCE 검정의 캐처 구성요소로서 기능하는 제1 올리고뉴클레오티드 및 LOCS의 조합을 포함할 수 있다. 이 조합은, 예를 들어, PCR 동안 실시간으로 2개 온도에서 형광 판독을 획득함으로써 단일 형광성 채널에서 2개 표적의 동시 검출 및 정량화를 허용할 수 있다. 대안적으로, 실시간 모니터링의 부재에서 접근법은 별개 시점에서, 예를 들어 증폭의 시작 근처에서 또는 시작에서 그리고 증폭 이후 수집된 형광성 데이터에 적용될 수 있다.
일 구현예에서, 캐처를 포함하는 제1 올리고뉴클레오티드는 LOCS 프로브와 조합될 수 있고, 이들의 양쪽은 동일한 형광 채널에서 동시 검출을 위하여 동일한 형광단 및 퀀처 모이어티로 표지될 수 있다. 반응은 캐처에 상보적인 5' 태그 영역 그리고 제1 표적 1에 상보적인 3' 센서 영역을 포함하는 단일-가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 피처를 또한 함유할 수 있다. 캐처는 5' 단부에서 퀀처 및 그 퀀처에 형광단 다운스트림 그리고 피처의 태그 부분에 상보적인 3' 영역으로 표지된 단일-가닥 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 캐처가 단일-가닥 입체구조인 때, 형광단은 퀀처와 가까이 근접하게 되고 신호는 퀀칭된다.
증폭 반응의 비-제한 예 예컨대 PCR을 고려하면, 프라이머 그리고 피처의 3' 센서 영역은 표적 1에 혼성화할 수 있다. 템플레이트로서 표적 1 또는 이의 앰플리콘을 사용하는 프라이머 확장 동안, 피처는 DNA 폴리머라제의 엑소뉴클레아제 활성에 의해 분해되어 태그 부분의 방출을 초래할 수 있다. 방출된 태그는 그 다음 캐처의 상보적 3' 부분에 혼성화할 수 있고, DNA 폴리머라제에 의해 확장될 수 있어서, 형광단 및 퀀처가 분리되어 표적 1의 존재를 나타내는 증가된 형광을 초래하는 Tm A와 이중-가닥 캐처 듀플렉스를 생성할 수 있다. 추가적으로, 반응은 Tm C가 있는 스템 영역 그리고 제2 표적 2 존재 하에서 MNA자임에 의해 절단될 수 있는 루프 영역을 가진 온전한 LOCS 프로브를 함유하여, Tm A보다 낮은 Tm D가 있는 분할된 LOCS를 생성할 수 있다. 다양한 관계는 반응이 측정되는 온도와 캐처 듀플렉스 및 LOCS 리포터의 용융 온도 사이 실재할 수 있다. 3개 시나리오는 1개 캐처 프로브 및 1개 LOCS 프로브를 포함하는 반응의 맥락 내에서 아래 상세히 기재되고 이러한 시나리오의 비-제한 예시적 온도는 아래 표 2에서 개괄된다.
Figure pct00002
제1 비-제한 시나리오에서, (표 2 참조) 신호가 Tm A, Tm C 및 Tm D보다 낮은 제1 검출 온도에서 측정되는 때, 표적 1의 존재 하에서, 캐처 듀플렉스는 형성 및 형광할 수 있고, 반면 표적 1의 부재 하에서, 단일 가닥 캐처는 퀀칭된 채로 남아있을 것이다. 이 온도에서, 양쪽 온전한 및 분할된 LOCS의 스템은 혼성화될 것이고 따라서 표적 2의 존재 또는 부재와 관계없이 퀀칭될 것이다. 이와 같이, 증폭 동안 형광에서의 증가는 표적 1을 나타낸다. 추가적으로, Tm D보다 높지만 Tm A 및 Tm C보다 적은, 제2 검출 온도에서 형광 측정은 표적 1 및/또는 표적 2의 존재를 나타낼 수 있다. 이 제2 온도에서, 캐처는 표적의 부재 하에서 단일-가닥 및 퀀칭된 채로 남아있고 표적의 존재 하에서 듀플렉스를 형성하고 형광한다. 추가적으로, 이 제2 온도에서, 표적 2가 부재이면, LOCS 프로브는 온전하고 퀀칭된 채로 남아있을 것이지만, 표적 2의 존재 하에서 절단될 것이고 이의 스템은 해리하여 형광을 생성할 것이다. 이 시나리오에 온도 1에서의 형광이 증폭 동안 증가하면, 이것은 표 1이 존재함을 나타낸다. 추가로, 증폭의 과정 동안 온도 2에서 관찰된 형광에서의 증가가 온도 1에서 관찰된 것보다 크면, 이것은 표적 2가 존재함을 나타낸다. 제1이 아닌, 제2 온도에서 형광의 증가는 표적 2만이 존재함을 나타낸다.
제2 비-제한 시나리오에 (표 2 참조), 제1 검출 온도에서 제1 표적의 특정 검출은 상기 시나리오 1에 따라 달성될 수 있다. 추가적으로, Tm A 및 Tm D보다 높지만 Tm C보다 낮은 제2 검출 온도에서, 캐처 듀플렉스는 캐처 듀플렉스가 형성할 수 있는 것보다 위에 온도가 있으므로 표적 1 및/또는 표적 2의 존재 또는 부재와 관계없이 해리 (즉 단일-가닥)되고 퀀칭된다. 표적 2 의 부재 하에서, 모든 LOCS는 온전하고 퀀칭될 것이지만; 표적 2가 존재하는 때 분할된 LOCS는 생성될 것이고, 그들의 스템은 해리할 것이고 형광에서의 증가는 관찰될 수 있다. 그러므로, 제1 온도에서 PCR 동안 형광에서의 증가는 표적 2의 존재 또는 부재와 관계없이 표적 1의 존재를 나타내고; 반대로, 제2 온도에서 PCR 동안 형광에서의 증가는 표적 1의 존재 또는 부재와 관계없이 표적 2의 존재를 나타낸다. 이와 같이, LOCS 및 캐처-피처 프로브의 조합은, 제1 온도에서 배경 위에 형광에서의 증가에 의해 모니터링된 경우, 캐처-피처 프로브를 사용하여 표적 1만의 검출; 그리고 제2 온도에서 배경 위에 형광에서의 증가에 의해 모니터링된 경우, LOCS 프로브를 사용하여 표적 2만의 검출을 허용할 수 있다.
제3 비-제한 시나리오에 (표 2 참조), 신호가 Tm A보다 적지만 Tm C 및 Tm D보다 높은 제1 검출 온도에서 측정되는 때, 표적 1만의 존재 하에서, 캐처 듀플렉스는 형성하고 형광화할 수 있고, 반면 표적 1의 부재 하에서, 단일 가닥 캐처는 퀀칭된 채로 남아있을 것이다. 이 온도에서, 양쪽 온전한 및 분할된 LOCS의 스템은, 표적 2의 존재 또는 부재와 관계없이, 해리될 것이고 배경 형광의 높은 수준을 생성할 것이다. 이와 같이, 증폭 동안 배경 형광 위에 형광에서의 증가는 표적 1만을 나타낸다. 추가적으로, Tm A 및 Tm C보다 적지만 Tm D보다 높은 제2 검출 온도에서 형광 측정은 표적 2만의 존재를 나타낼 수 있다. 이 제2 온도에서, 캐처는 표적의 부재 하에서 단일-가닥 및 퀀칭된 채로 남아있고 듀플렉스를 형성하고 표적의 존재 하에서 형광한다. 추가적으로, 이 제2 온도에서, 표적 2가 부재이면, LOCS 프로브는 온전하고 퀀칭된 채로 남아있을 것이지만, 표적 2의 존재 하에서 절단될 것이고 이의 스템은 해리하여 형광을 생성할 것이다. 이 시나리오에 온도 1에서 형광이 증폭 동안 증가하면, 이것은 표적 1만의 존재를 나타내고 온도 2에서 형광이 증폭 동안 증가하면, 이것은 표적 2만의 존재를 나타낸다.
또다른 비-제한 양식, 예를 들어 SPR에 의한 검출에서, 캐처는 금 나노입자 (GNP)에 부착되고 용액에서 자유로울 수 있고, 반면 피처는 금 표면에 부착될 수 있다. 표적 1의 존재 하에서, 그리고 Tm A 미만 온도에서, 캐처 듀플렉스는 SPR 신호에서 측정가능한 시프트를 생산할 금 표면에 GNP를 가까이 근접시키고 이를 형성할 수 있다. 하지만, 표적 1의 부재 하에서, 캐처는 단일-가닥이고 용액에서 자유로울 것이고 (즉 금 표면에 가까이 근접하지 않을 것이고) 그러므로 기준선 SPR 신호의 것 위에 SPR 신호에서 임의의 측정가능한 시프트를 생산하지 않을 것이다. 그러므로, 이 온도에서 SPR 신호에서의 임의의 측정가능한 시프트는 샘플에서 표적 1의 존재를 나타낼 것이다. 추가로 LOCS는 GNP에 대한 1개 단부에 그리고 금 표면에 부착된 다른 단부에 부착될 수 있다. 표적 2의 부재 하에서, GNP는 항상 부착될 것이고, 반면에 표적 2의 존재 하에서 분할된 LOCS는 생성될 것이고 이와 같이 이 사례에서 GNP는 검출 온도가 분할된 LOCS의 것 미만인 때 금 표면에 단지 근접할 것이다. 이전과 같이, 상기 시나리오 2와 유사한 시나리오에서, 제1 검출 온도가 Tm B, Tm C 및 Tm D 미만이면 신호에서의 변화는 캐처 상에서 GNP가 금 표면에 가까워질 것이므로 표적 1의 존재를 나타낼 것이다. 제2 검출 온도가 Tm C 미만, 그러나 Tm A 및 Tm D 초과이면 신호에서의 변화는 분할된 LOCS 상에서 GNP가 금 표면에서 떨어져 움직일 것이므로 표적 2의 존재를 나타낼 것이다.
더욱 또다른 양식, 예를 들어 비색계 검출에서, 양쪽 캐처 및 LOCS 프로브는 양쪽 말단 상에서 GNP로 표지될 수 있다. Tm A, Tm C 및 Tm D 미만, 제1 온도에서, 표적 1의 존재는, 표적 2의 존재 또는 부재와 관계없이, 보라색 (GNP 응집됨)부터 적색 (GNP 분산됨)까지 측정가능한 색상 변화를 초래할 것이다. Tm A 및 Tm D 초과 그러나 Tm C 미만 제2 온도에서 표적 2의 존재는, 표적 1의 존재 또는 부재와 관계없이, 보라색 (GNP 응집됨)부터 적색 (GNP 분산됨)까지 측정가능한 색상 변화를 초래할 것이다.
더욱 또다른 양식에서, 캐처는 전기활성 모이어티 예컨대 메틸렌 블루 또는 페로센으로 표지될 수 있고 피처는 전극 표면에 부착될 수 있다. 제1 온도 (Tm A 미만)에서, 캐처 듀플렉스는 (표적 1 존재하면) 전극 표면 상에서 형성하여, 전기화학적 신호 (즉 산화 또는 환원 전류)에서 측정가능한 시프트를 생산할 전극 표면에 전기활성 모이어티를 가까이 근접시킬 것이다. 하지만, 표적 1의 부재 하에서, 캐처는 용액에서 자유롭고 전극 표면에 가까이 근접하지 않을 것이며 그러므로 기준선 신호의 것 위에 전기화학적 신호 (즉 산화 또는 환원 전류)에서 임의의 측정가능한 시프트를 생산하지 않을 것이다. 그러므로, 이 온도에서 전기화학적 신호에서의 임의의 측정가능한 시프트는 샘플에서 표적 1의 존재를 나타낼 것이다.
- 이중 혼성화 프로브와 조합된 LOCS
일부 구현예에서 본 발명의 조성물 및 방법은 2개 표적 특이적 구성요소를 포함하는 올리고뉴클레오티드 프로브 및 LOCS의 조합을 포함한다.
이중 혼성화 프로브는 Tm A가 있는 제1 올리고뉴클레오티드 및 Tm B가 있는 제2 올리고뉴클레오티드를 함유할 수 있고, 여기서 Tm A 및 Tm B는 동일할 수 있거나, Tm A 및 Tm B는 상이할 수 있다. 제1 올리고뉴클레오티드는 이의 3' 말단에서 형광단으로 표지될 수 있고 제2 올리고뉴클레오티드는 이의 5' 말단에서 퀀처로 표지될 수 있다. (대안적으로, 1개 올리고뉴클레오티드는 이의 3' 말단에서 퀀처로 표지될 수 있고 다른 것은 이의 5' 말단에서 형광단으로 표지될 수 있다.) 2개 올리고뉴클레오티드 프로브는 표적 1 상에서 인접해서 또는 실질적으로 인접해서 (예를 들면 2, 3, 4, 또는 5 뉴클레오티드 갭 미만) 혼성화하고 Tm A 및 Tm B 중 최저인 것과 동일한 Tm이 있는 듀플렉스 구조를 형성한다. 이 시나리오에서, 데이터 획득에 적합한 제1 온도는 Tm A 및 Tm B 미만, 그리고 Tm C 및 Tm D 미만; 즉 온전한 및 분할된 LOCS 각각의 스템의 Tm일 수 있다. 이 제1 온도에서, 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드는 용액에서 자유롭고 증폭에 앞서, 또는 표적 1의 부재 하에서 형광성이지만, 존재하면 표적 1에 대한 혼성화는 형광단 및 퀀처를 가까이 근접시켜 퀀칭을 야기시킨다. 추가로 제1 온도에서, 양쪽 온전한 및 분할된 LOCS의 스템은 퀀칭될 것이다. 이와 같이, 제1 온도에 형광에서의 관찰된 감소는, 표적 2의 존재 또는 부재와 관계없이, 표적 1의 존재를 나타낸다.
LOCS 프로브는 제2 표적 2 존재 하에서 MNA자임에 의해 절단될 수 있고, 데이터 획득은 Tm A 및/또는 Tm B 초과, Tm D 초과 그러나 Tm C 미만인 제2 온도에서 수행될 수 있다. 이 시나리오에서, 온전한 LOCS는 증폭에 앞서 그리고 표적의 부재 하에서 퀀칭된 채로 남아있지만, 표적 2의 존재 하에서 분할된 LOCS 스템은 해리하여 형광 증가를 초래할 것이다. 이 온도에서, 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드는 이들이 이 온도에서 표적 1에 혼성화할 수 없으므로 표적 1의 존재 또는 부재와 관계없이 형광할 것이다. 이 형광은 이 온도에서 배경 신호에 기여한다. 이와 같이 증폭 이후 배경 위에 형광에서의 증가는 표적 1의 존재 또는 부재와 관계없이 표적 2의 존재를 나타낸다.
이와 같이, 조합은 제1 온도에 형광에서의 감소로서 결정된, 이중 혼성화 프로브를 사용하여 표적 1의 검출; 및 제2 온도에 형광에서의 증가에 의해 결정된, LOCS 프로브를 사용하여 표적 2만의 검출을 허용한다.
또다른 양식, 예를 들어 SPR에 의한 검출에서, 제1 올리고뉴클레오티드는 금 나노입자 (GNP)에 부착될 수 있고 제2 올리고뉴클레오티드는 금 표면에 부착될 수 있다. 제1 온도에서, 2개 올리고뉴클레오티드 프로브는 (존재한다면) 표적 1 상에 인접해서 혼성화하여, 듀플렉스 구조를 형성할 수 있고 SPR 신호에서 측정가능한 시프트를 생산할 수 있는 금 표면에 GNP를 가까이 근접시킬 수 있다. 하지만, 표적 1의 부재 하에서, 제1 올리고뉴클레오티드는 용액에서 자유로울 수 있고 금 표면에 가까이 근접하지 않을 수 있고 그러므로 기준선 SPR 신호의 것 위에 SPR 신호에서 임의의 측정가능한 시프트를 생산할 수 있다. 그러므로, 이 온도에서 SPR 신호에서의 임의의 측정가능한 시프트는 샘플에서 표적 1의 존재를 나타낼 수 있다.
더욱 또다른 양식, 예를 들어 비색계 검출에서, 양쪽 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드는 금 나노입자로 표지될 수 있다. 제1 온도에서, 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드는 용액에서 자유로울 수 있고 표적 1의 부재 하에서 적색 색상을 나타내는 중일 수 있다. 하지만, 표적 1의 존재 하에서, 2개 올리고뉴클레오티드 프로브는 표적 상에서 인접해서 혼성화하여, 듀플렉스 구조를 형성할 수 있고 적색부터 보라색까지 측정가능한 색상 변화를 생산하기 위해 서로 GNP를 가까이 근접시킬 수 있다. 그러므로, 적색부터 보라색까지 측정가능한 색상 변화는 샘플에서 표적 1의 존재를 나타낼 수 있다.
더욱 또다른 양식에서, 제1 올리고뉴클레오티드는 전기활성 모이어티 예컨대 메틸렌 블루 또는 페로센으로 표지될 수 있고 제2 올리고뉴클레오티드는 전극 표면에 부착될 수 있다. 제1 온도에서, 2개 올리고뉴클레오티드 프로브는 (존재한다면) 표적 1 상에 인접해서 혼성화하여, 전극 표면 상에서 듀플렉스 구조를 형성할 수 있고 전기화학적 신호 (즉 산화 또는 환원 전류)에서 측정가능한 시프트를 생산할 전극 표면에 전기활성 모이어티를 가까이 근접시킬 수 있다. 하지만, 표적 1의 부재 하에서, 제1 올리고뉴클레오티드는 용액에서 자유로울 수 있고 전극 표면에 가까이 근접하지 않을 수 있고 그러므로 기준선 신호의 것 위에 전기화학적 신호 (즉 산화 또는 환원 전류)에서 임의의 측정가능한 시프트를 생산하지 못할 것이다. 그러므로, 이 온도에서 전기화학적 신호에서의 임의의 측정가능한 시프트는 샘플에서 표적 1의 존재를 나타낼 수 있다.
- 소화가능한 프로브를 포함하는 LOCS 조합
일부 구현예에서 본 발명의 조성물 및 방법은 온도에 의해 가역적으로 조정될 수 없는 표적-의존적 검출가능한 신호를 생성하는 올리고뉴클레오티드 프로브 및 LOCS의 조합을 포함한다. 하지만, LOCS는 표적-의존적 방식으로 온도에 의한 신호 생성의 조정에 순응한 채로 남아있어서, 배경 잡음 또는 기준선 수준의 조작을 허용한다.
예를 들어, 제1 표적 1에 대한 제1 올리고뉴클레오티드 프로브는, 검출의 온도 변화시에 억압될 수 없는, 검출가능한 신호를 제공하였던 표적-의존적 변형을 겪을 수 있다. 표적-의존적 변형은 이에 의해 표적의 존재를 나타내는 검출가능한 신호를 촉발시키기 위한 제1 올리고뉴클레오티드의 절단 또는 소화일 수 있다. 이 범주에서 올리고뉴클레오티드 프로브의 비-제한 예는 표적 의존적 방식으로 제한 효소에 의해 절단가능한 TaqMan 프로브, MNA자임 기질 및 프로브를 포함한다. 변형 이후, 이들 프로브에 의해 생성된 신호는 광범위의 온도에 걸쳐서 측정될 수 있다.
이들 구현예에서, 제2 표적 2를 검출하도록 설계된 온전한 LOCS는 이 표적의 존재 하에서 분할된 LOCS만을 생성하기 위해 절단을 겪을 수 있다. 표적 2의 측정은 온전한 LOCS의 스템의 Tm 미만 그러나 분할된 LOCS의 스템의 Tm 초과 온도에서 검출을 필요로 한다. 대조적으로 제1 표적이 검출되는 온도는 양쪽 온전한 및 분할된 LOCS의 스템의 Tm 미만, 또는 양쪽 온전한 및 분할된 LOCS의 스템의 Tm 초과 어느 한쪽일 수 있다. 제1 검출 온도가 스템의 Tm 미만인 때, 양쪽 온전한 및/또는 분할된 스템이 결합된 및 퀀칭된 채로 남아있을 것이기 때문에 배경 신호는 억압될 것이고, 반면에 제1 검출 온도가 스템의 Tm 초과인 때, 배경 신호는 양쪽 온전한 및/또는 분할된 스템의 해리로 인해 더 높을 것이다. 이와 같이, 제1 온도에서 신호의 검출은, 표적 2의 존재 또는 부재와 관계없이, 표적 1에 특이적일 수 있다. 제2 온도에서 신호의 검출은 표적 1 및/또는 표적 2의 존재를 나타내지만; 제2 온도에서 관찰된 신호에서의 증가가 제1 온도에서 관찰된 것보다 크면, 이것은 표 2가 존재함을 나타낸다. 신호에서의 변화가 제2 온도에서 단지 관찰되고 제1 온도에서 관찰되지 않으면, 이것은 제2 표적만의 존재를 나타낼 것이다.
하기 시나리오는 본 발명의 구현예에 따른 멀티플렉스 검출 검정의 비-제한 예를 제공하고 아래 표 3에 요약된다. 이들 시나리오에서, LOCS는 온전한 때 이의 이중-가닥 스템 부분의 용융 온도인 Tm A, 그리고 분할된 때 이의 이중-가닥 스템 부분의 용융 온도인 Tm B를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 프로브 (예를 들면 MNA자임 기질)는, LOCS의 이중-가닥 스템 부분의 대향 가닥이 할 수 있듯이, 형광단 및 퀀처로 표지될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 프로브의 형광단은 LOCS의 형광단과 동일할 수 있거나, 가시 스펙트럼의 동일한 영역에서 방사할 수 있다. 대안적 구현예에서, 상이한 검출 모이어티는, 예를 들어, 비색계 또는 SPR 검출을 위한 동일한 또는 유사한 크기 및/또는 유형의 나노입자, 화학발광성 검출을 위한 반응성 모이어티 (예를 들면 알칼리성 포스파타제 또는 퍼옥시다제 효소) 또는 전기화학적 검출을 위한 전기반응성 종 (예를 들면 페로센, 메틸렌 블루 또는 퍼옥시다제 효소)을 포함하여 활용될 수 있다. 숙련된 사람은 올리고뉴클레오티드 프로브가, 예를 들어, MNA자임 기질, TaqMan 프로브, 가수분해 프로브, 또는 표적-의존적 방식으로 제한 효소에 의해 절단가능한 프로브 (RE 프로브)일 수 있다.
제1 표적의 존재 또는 부재로 인해 신호에서의 변화는 이 동일한 제1 온도에서 PCR에 (PCR전) 증폭의 시작에서, 또는 근처에서 어느 한쪽 획득된 배경 형광에 대해 정규화된 제1 온도에서 (PCR후) 증폭 이후 형광을 측정함으로써 수득될 수 있고; 반면 제2 표적의 존재 또는 부재로 인해 신호에서의 변화는 이 제2 온도에서 PCR전 측정된 배경 형광에 대해 정규화된 제2 온도에서 PCR후 총 형광을 획득함으로써 수득될 수 있다. 대안적으로, 제1 및 제2 표적 각각의 존재 또는 부재로 인해 신호에서의 변화는 동일한 반응에서 또는 동등하지만 표적이 부족한 것으로 알려진 대조군 반응에서 임의의 시간에 어느 한쪽 PCR전 획득된 제3 온도에서 배경 형광에 대해 정규화될 수 있는 제1 및 제2 온도 양쪽에 증폭 이후 총 형광을 측정함으로써 수득될 수 있다. 배경의 측정은 제1 온도가 제2 온도보다 적고, 제3 온도가 온전한 스템의 Tm보다 적으면 제3 온도에서 수행될 수 있다.
모든 시나리오에서 제1 표적을 나타내는 신호의 존재 또는 부재는, 예를 들어, MNA자임 기질, TaqMan 프로브 또는 RE 프로브일 수 있는 제1 프로브를 사용하여 제1 온도에서 측정된다. 증폭에 앞서 이 프로브는 퀀칭될 것이지만; 표적 1이 존재하면, 프로브는 증폭 동안 절단되어 양쪽 제1 및 제2 온도에서 검출가능한 형광에서의 증가를 초래할 것이다. 제2 표적의 존재 또는 부재는 제2 온도가 항상 분할된 LOCS (Tm B)의 Tm 초과 그러나 온전한 LOCS (Tm A)의 Tm 미만인 LOCS 프로브를 사용하여 제2 온도에서 결정된다.
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시나리오 1.
제1 비-제한 예에서, 표 3에 기재된 대로, 제1 온도는 제2 온도보다 낮고, Tm A 및 Tm B보다 낮다. 제1 온도에 형광에서의 증가는 표적 1의 존재를 나타낼 것이고 배경 신호는 양쪽 온전한 및/또는 분할된 스템이 결합된 채로 남아있는 퀀칭된 LOCS의 존재를 반영할 것이다. 제1 온도 및 제2 온도에서 배경은 각 온도 각각에서 PCR에 앞서 측정될 수 있다. 대안적으로, 배경 측정은 제3 온도에서 측정될 수 있되, 제3 온도는 양쪽 제1 및 제2 온도 미만이다.
시나리오 2
제2 비-제한 예에서, 표 3에 기재된 대로, 제1 온도는 제2 온도보다 높고, 또한 Tm A 및 Tm B보다 높다. 제1 온도에 형광에서의 증가는 표적 1의 존재를 나타낼 것이고 배경 신호는 해리된 스템을 가진 온전한 및/또는 분할된 LOCS로부터 형광을 반영할 것이다. 제1 온도 및 제2 온도에서 배경은 각 온도 각각에서 PCR에 앞서 측정될 수 있다.
시나리오 3
제3 비-제한 예에서, 표 3에 기재된 대로, 제1 온도는 제2 온도보다 낮고, Tm A 및 Tm B보다 낮다. 제1 온도에 형광에서의 증가는 표적 1의 존재를 나타낼 것이고 배경 신호는 양쪽 온전한 및/또는 분할된 스템이 결합된 채로 남아있는 퀀칭된 LOCS의 존재를 반영할 것이다. 제1 온도 및 제2 온도에서 배경은 각 온도 각각에서 PCR에 앞서 측정될 수 있다. 대안적으로, 배경 측정은 제3 온도에서 측정될 수 있되, 제3 온도는 제2 온도 미만 그러나 제1 온도 초과이다.
다른 양식, 예를 들어 SPR에 의한 검출에서, 제1 올리고뉴클레오티드 및 LOCS 프로브는 하나의 단부에서 금 나노입자 (GNP)에 부착될 수 있고 다른 단부에서 금 표면에 부착될 수 있다. 표적의 부재 하에서, 제1 올리고뉴클레오티드는 온전한 채로 남아있을 수 있고 GNP는 금 표면에 가까이 근접하여, SPR 신호의 기준선 수준을 생산할 것이다. 표적 1의 존재 하에서, 제1 올리고뉴클레오티드는 절단되어, GNP를 금 표면으로부터 분리시키고 측정가능한 시프트를 SPR 신호에서 생산하여, 샘플에서 제1 표적의 존재를 나타낼 수 있다. 이것은 어느 한쪽 온전한 또는 분할된 LOCS로 부착되거나 결합된 GNP가 표면 상에 남아있을 수 있도록 Tm A 및 Tm B 미만 제1 온도에서 측정될 수 있다. 분할된 LOCS의 Tm 초과 제2 온도에서 SPR 신호에서의 변화의 측정은 제1 및/또는 제2 표적(들)의 존재를 나타낼 수 있다. 추가로, 신호에서의 변화가 제1 온도에서 관찰되고 더 큰 변화가 제2 온도에서 관찰되었다면 이것은 표적 2의 존재를 나타낼 것이다. 대안적으로 신호가 제2 온도에서 검출되지만 제1 온도에서 검출되지 않았다면, 이것은 또한 제2 표적만을 나타낼 것이다.
또다른 양식, 예를 들어 비색계 검출에서, 제1 올리고뉴클레오티드 프로브 및 LOCS는 금 나노입자로 양쪽 단부에서 양쪽 표지될 수 있다. Tm A 및 Tm B 미만 제1 온도에서, 제1 올리고뉴클레오티드는, 보라색 색상을 나타내는, GNP가 서로 바로 가까이에 응집된 상태일 수 있는 표적 1의 부재 하에서 온전한 채로 남아있을 수 있다. 하지만, 제1 올리고뉴클레오티드는 표적 1의 존재 하에서 절단되어, GNP를 분리시킬 수 있고 보라색부터 적색까지 측정가능한 색상 변화를 나타낼 수 있다. 그러므로, 보라색부터 적색까지 측정가능한 색상 변화는 샘플에서 표적 1의 존재를 나타낼 수 있다. 제2 표적만의 존재 하에서, 제1 온도 초과 및 Tm B 초과 그러나 Tm A 미만인, 제2 온도에서, LOCS는 분할될 수 있고 GNP는 분산된 상태일 것이고, 색상은 보라색부터 적색까지 변화할 것이다. 양쪽 표적이 존재하면, 색상에서 시프트는 더욱 강해질 수 있다.
더욱 또다른 양식에서, 제1 올리고뉴클레오티드는 다른 단부에서 전극 표면에 부착된 하나의 단부에서 전기활성 모이어티 예컨대 메틸렌 블루 또는 페로센으로 표지될 수 있다. 제1 온도에서 및 표적 1의 부재 하에서, 제1 올리고뉴클레오티드는 온전한 채로 남아있을 수 있고 전극 표면에 바로 가까이에서 전기활성 종은 전기화학적 신호 (즉 산화 또는 환원 전류)의 기준선 수준을 생산한다. 하지만, 표적 1의 존재 하에서, 제1 올리고뉴클레오티드는 절단될 수 있고 전기활성 모이어티는 용액에 방출되어, 기준선 신호의 것 위에 전기화학적 신호 (즉 산화 또는 환원 전류)에서 측정가능한 시프트를 생산할 수 있다. 그러므로, 이 온도에서 전기화학적 신호에서의 임의의 측정가능한 시프트는 샘플에서 표적 1의 존재를 나타낼 수 있다.
- 추가 예시적 구현예
특정 구현예에서, 본 발명의 LOCS 올리고뉴클레오티드를 포함하는 리포터 올리고뉴클레오티드는 표적을 직접적으로 검출하는데 사용될 수 있다. 다른 예시적 구현예에서 리포터 프로브 또는 기질은, 비제한적으로, PCR, RT-PCR, SDA, NEAR, HDA, RPA, LAMP, RCA, TMA, 3SR, LCR, RAM 또는 NASBA를 포함하는 표적 증폭 기술에 의해 생성된 표적 앰플리콘을 검출하는데 사용될 수 있다. LOCS의 분할을 초래하는 절단 또는 분해는 표적 증폭 동안 실시간으로 발생할 수 있거나 증폭 이후, 반응의 종점에서 수행될 수 있다. 루프 영역은 비제한적으로 MNA자임, DNA자임, 리보자임을 포함하는 촉매적 핵산의 효소적 활성에 의해, 또는 엑소뉴클레아제 또는 엔도뉴클레아제를 포함하는 단백질 효소의 효소적 활성에 의해 매개된 표적-의존적 절단 또는 분해에 의해 분할될 수 있다. 비-제한 예로써, 엑소뉴클레아제 활성은, 예를 들어, 폴리머라제의 내재된 촉매적 활성일 수 있다. 비-제한 예로써, 엔도뉴클레아제 활성은, 예를 들어, 니킹 엔도뉴클레아제, 리보엔도뉴클레아제 또는 듀플렉스 특이적 뉴클레아제 (DSN)를 포함하는 제한 효소의 내재된 촉매적 활성일 수 있다.
본 발명의 반응은 리포터 프로브의 다른 유형(들)과 조합으로 단일 LOCS 올리고뉴클레오티드를 사용하여 동시에 여러 표적을 검출하도록 설계된다. 당업자에게 명백할 대로, 표준 리포터 프로브는 추가의 LOCS와 추가로 조합될 수 있고, 예를 들어, 여기서 각 LOCS는 이의 루프 내에서 상이한 범용 기질, 및 상이한 MNA자임에 의한 기질/루프의 절단 이후 상이한 온도에서 용융할 수 있는 상이한 스템 영역을 포함할 수 있다.
반응 믹스는 상이한 형광단 및 퀀처 쌍으로 표지된 LOCS와 조합된 추가의 리포터 프로브 또는 기질을 추가로 포함할 수 있다. 비-제한 예로써, 리포터 올리고뉴클레오티드 1 및 온전한 LOCS 올리고뉴클레오티드 2는 형광단 A로 표지될 수 있고, 리포터 올리고뉴클레오티드 3 및 온전한 LOCS 올리고뉴클레오티드 4는 형광단 B로 표지될 수 있다. 리포터 올리고뉴클레오티드 1 및 3이 선형 MNA자임 기질인 구현예에서, MNA자임 1은 표적 1의 존재 하에서 형성할 수 있고 리포터 올리고뉴클레오티드 1을 절단시켜 형광을 모든 온도에서 생성할 수 있고; MNA자임 2는 표적 2의 존재 하에서 형성할 수 있고 기질 2를 LOCS 올리고뉴클레오티드 2 내에서 절단시켜 온도 X에서 용융하는 스템 2를 함유하는 절단된, 분할된 LOCS 구조 2를 초래할 수 있다. MNA자임 3은 표적 3의 존재 하에서 형성할 수 있고 리포터 올리고뉴클레오티드 3을 절단시켜 모든 온도에서 형광을 생성할 수 있다. MNA자임 4는 표적 4의 존재 하에서 형성할 수 있고 기질 4를 LOCS 올리고뉴클레오티드 4 내에서 절단시켜 온도 Y에서 용융하는 스템 4를 함유하는 분할된 LOCS 구조 4를 초래할 수 있다.
형광이 양쪽 X 및 Y 미만 온도에서 분석되는 때, 형광단 A의 파장에서 여기는 표적 1을 나타내고 형광단 B의 파장에서 여기는 표적 3의 존재를 나타낸다. 형광이 양쪽 X 및 Y 초과 그러나 양쪽 온전한 LOCS 올리고뉴클레오티드 2 및 4의 용융 온도 미만 온도에서 분석되는 때, 형광단 A의 파장에서 여기는 표적 1 및/또는 표적 2를 나타내고 형광단 B의 파장에서 여기는 표적 3 및/또는 표적 4의 존재를 나타낸다.
반응의 용융 프로파일이 형광단 A의 여기 파장에서 분석되는 때, 제1 온도 X에서 피크의 존재 및, 온도 X보다 높은 제2 온도 2에서 피크의 부재는 LOCS 리포터 2가 표적 2의 존재 하에서 MNA자임에 의해 분할/절단됨을 나타낸다. 대안적으로, 온도 X에서 피크의 부재 및 온도 2에서 피크의 존재는 LOCS 리포터 2가 온전한 채로 남아있고 샘플에서 표적 2의 부재로 인해 MNA자임에 의해 절단되지 않았음을 나타낸다. 반응의 용융 프로파일이 형광단 B의 여기 파장에서 분석되는 때, 제3 온도 Y에서 피크의 존재 및 온도 Y보다 높은 제4 온도 4에서 피크의 부재는 표적 4의 존재 하에서 MNA자임에 의한 LOCS 리포터 4의 절단을 나타내고, 반면에 온도 Y에서 피크의 부재 및 온도 4에서 피크의 존재는 LOCS 리포터 4가 온전한 채로 남아있고 샘플에서 표적 4의 부재로 인해 MNA자임에 의해 절단되지 않았음을 나타낸다. 이와 같이 기구 상에 2개 채널에서 판독된, 2개 파장에서의 분석은, 나머지 2개 표적의 존재가 다른 검출 수단 예컨대 실시간 검출을 사용하여 결정된다면, 표적을 검출하고 차별하기 위한 확증적 도구로서 사용될 수 있다. 숙련된 사람은 전략이 1개 특이적 파장에서 2개 초과 표적의 절단을 모니터링하도록 확장될 수 있고 추가로 분석된 형광단의 수가 개별 파장을 구별하기 위한 이용가능한 기구의 최대 능력에 의해 결정된 것으로 증가될 수 있음을 인식할 것이다.
추가 예시적 구현예에서, 양쪽이 동일한 형광단/퀀처 염료 쌍을 함유하고 기질 영역이 DNA자임 또는 리보자임, 예를 들어, 특이적 금속 이온의 존재 하에서 촉매적으로 활성일 수 있을 뿐인 DNA자임 또는 리보자임에 특이적인 선형 MNA자임 기질 및 LOCS 올리고뉴클레오티드는 조합될 수 있다. 특이적 DNA자임 및 리보자임은 촉매적 활성을 가능하게 하기 위해 금속 양이온 보조인자를 필요로 하는 것으로 당업계에서 알려진다. 예를 들어, 일부 DNA자임 및 리보자임은, 예를 들어, 납 또는 수은의 존재 하에서 촉매적으로 활성일 수 있을 뿐이다. 이러한 금속은, 예를 들어, 환경적 샘플에서 존재할 수 있다. 반응은, 예를 들어, 수은 의존적인, DNA자임에 대하여 하나의 선형 MNA자임 기질을 포함할 수 있고, 여기서 샘플에서 수은의 존재는 선형 MNA자임 기질의 절단 및 형광성 신호의 생성을 초래할 수 있다. 동일한 반응은, 예를 들어, 납 의존적인 DNA자임에 대하여 기질을 포함하는 루프를 함유하는 LOCS 리포터를 또한 포함할 수 있고, 여기서 샘플에서 납의 존재는 분할된 LOCS의 Tm보다 높은 온도에서 LOCS의 절단 및 형광성 신호의 생성을 초래할 수 있다. 분할된 LOCS의 Tm 미만인, 제1 온도에 형광에서의 증가는 수은의 존재를 나타낼 것이다. 분할된 LOCS의 Tm 초과 그러나 온전한 LOCS의 Tm 미만인, 제2 온도에 형광에서의 증가는 수은 및/또는 납의 존재를 나타낼 것이다. 수은이 제1 온도에서 검출되었다면, 제2 온도에 형광에서의 추가 증가는 납의 존재를 나타낼 것이다. 이것은 절단된, 분할된 LOCS 구조의 스템이 재-어닐링하도록 반응이 냉각되도록 하고, 그 다음 용융 곡선 분석을 수행하여 분할된 LOCS 구조의 존재를 나타내는 피크의 존재 또는 부재를 결정함으로써 확증될 수 있다. 당업자는 특이적 금속 보조인자의 존재 하에서 절단가능한 다중 프로브가 단일 반응에서 조합될 수 있고 어느 한쪽 실시간으로 또는 반응의 끝에 검출될 수 있음을 용이하게 인식할 것이다.
다른 잘-알려진 프로브 유형과 조합으로 LOCS 올리고뉴클레오티드를 사용하여 검출될 수 있는 표적 핵산 (즉 폴리뉴클레오티드)의 비-제한 예는 DNA, 메틸화된 DNA, 알킬화된 DNA, 상보적 DNA (cDNA), RNA, 메틸화된 RNA, microRNA, siRNA, shRNA, mRNA, tRNA, snoRNA, stRNA, smRNA, pre- 및 pri-microRNA, 다른 비-코딩 RNAs, 리보솜성 RNA, 이들의 유도체, 이들의 앰플리콘 또는 이들의 임의의 조합 (데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드 염기의 혼합된 중합체 포함)을 포함할 수 있다.
검출가능한 신호의 생성
본 발명의 방법 및 조성물은 검출가능한 신호를 제공하기 위해 검출 모이어티를 활용한다. 모이어티가 생산할 수 있는 검출가능한 신호의 성격은 검출 모이어티의 유형 및/또는 이것이 결합되는 올리고뉴클레오티드의 입체구조에 의존할 것이다.
이것이 결합되는 올리고뉴클레오티드의 변형시 검출가능한 신호를 제공할 수 있는 임의의 적합한 검출가능한 모이어티는 활용될 수 있다. 적합한 검출가능한 모이어티의 비-제한 예는 형광성 신호 생성을 위한 형광단, 비색계 또는 SPR 신호 생성을 위한 나노입자, 화학발광성 신호 생성을 위한 반응성 모이어티 (예를 들면 알칼리성 포스파타제 또는 퍼옥시다제 효소), 전기화학적 신호 생성을 위한 전기활성 종, 및 이들의 임의의 조합을 포함한다. 비-제한 예로써, 적합한 전기활성 종은 메틸렌 블루, 톨루엔 블루, 오라세트 블루, 페로센, Hoechst 33258, [Ru(phen)3]2+ 또는 다우노마이신을 포함하고 가장 흔한 전극 물질은 금, 유리질 탄소, 연필 흑연 또는 탄소 이온성 액체를 포함하고, 형광성, 화학발광성, 비색계, 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 및 전기화학적 신호의 검출 및 측정 방법은 당업자에서 잘 알려진다.
비-제한 예로써, LOCS를 포함하는, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 부착된 하나 이상의 형광단을 가질 수 있다. 형광단에 의해 내재적으로 생성된 검출가능한 신호는 하나 이상의 퀀처 분자에 대한 근접성으로 인해 퀀칭될 수 있다. 예를 들어 및 제한 없이, 형광단(들)은 분자성 비콘 또는 LOCS의 이중-가닥 스템 부분의 단일 가닥에 (예를 들면 5' 또는 3' 말단에서) 부착될 수 있고, 퀀처(들)는 이중-가닥 스템 부분의 대향 가닥에 (예를 들면 5' 또는 3' 말단에서) 부착될 수 있다. 대안적으로, 퀀처(들)는 형광단에 의해 내재적으로 생성된 검출가능한 신호가 퀀칭될 수 있도록 올리고뉴클레오티드가 결합되는 또다른 실체 (예를 들면 표면 또는 또다른 올리고뉴클레오티드)에 부착될 수 있다. 표적의 존재 하에서, 올리고뉴클레오티드는 형광단(들)을 퀀처 분자(들)에서 멀리 두어서 검출가능한 신호를 생성하는 변형을 겪을 수 있다.
추가적으로 또는 대안적으로, 올리고뉴클레오티드 (LOCS 포함)는 비색계 검출을 위하여 GNP에 부착될 수 있다. 금 나노입자가 서로 가까이 근접하여 응집되는 때 이들은 보라색 색상 (즉 더 긴 파장에서 흡광도)를 나타내고 금 나노입자가 분리되는 때 이들은 보라색부터 적색까지 (예를 들면 LOCS, 선형 MNA자임 기질, 캐처-피처 프로브, TaqMan 프로브 및 제한 효소 프로브) 또는 대안적으로 적색부터 보라색까지 (예를 들면 이중 혼성화 프로브) 측정가능한 색상 변화가 샘플에서 특정 표적의 존재를 나타내는 적색 색상 (즉 더 짧은 파장에서 흡광도)를 나타낸다.
추가적으로 또는 대안적으로, 올리고뉴클레오티드 (LOCS 포함) 및/또는 올리고뉴클레오티드 구성요소는 샘플에서 표적의 SPR 검출을 위하여 GNP 및/또는 금 표면에 부착될 수 있다. GNP가 가까이 근접하여 움직이는 때, 또는 대안적으로 이들이 금 표면에서 멀리 떨어져 움직이는 때, 이들은 일부 접근법 (예를 들면 LOCS, 선형 MNA자임 기질, TaqMan 프로브 및 제한 효소 프로브)를 사용하여 SPR 신호에서의 감소가 샘플에서 특정 표적의 존재를 나타낼 수 있는 또는 대안적으로 다른 접근법 (예를 들면 캐처-피처 프로브 및 이중 혼성화 프로브)를 사용하여 SPR 신호에서의 증가가 샘플에서 특정 표적의 존재를 나타낼 수 있는 측정가능한 SPR 신호에서의 변화를 생성할 수 있다.
추가적으로, 또는 대안적으로, 올리고뉴클레오티드 리포터 및 프로브 (LOCS 포함) 및/또는 올리고뉴클레오티드 구성요소는 전기화학적 검출을 위하여 전기활성 종에 및/또는 전극 표면 상에 부착될 수 있다. 전기활성 종에 부착된 올리고뉴클레오티드가 전극 표면과 가까이 근접하여 움직이는 때, 또는 대안적으로 이들이 멀리 떨어져 움직이는 때, 이들은 산화 또는 환원 전류에서 측정가능한 변화를 생성할 수 있다. 일부 구현예 (예를 들면 LOCS, 선형 MNA자임 기질, TaqMan 프로브 및 제한 효소 프로브)에서, 전극 표면에서 멀리 떨어져 움직이는 전기활성 종으로부터 발생하는 생성된 측정가능한 신호는 샘플에서 특정 표적의 존재를 나타낸다 대안적으로, 다른 구현예 (예를 들면 캐처-피처 프로브 및 이중 혼성화 프로브)에서, 전극 표면에 가까이 근접하여 움직이는 전기활성 종으로부터 발생하는 생성된 측정가능한 신호는 샘플에서 특정 표적의 존재를 나타낸다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 동일한 검출 모이어티, 또는 (예를 들면 단일 유형의 검출기 예컨대 1개 형광 채널, 또는 비색계, 표면 플라즈몬 공명 (SPR), 화학발광성, 또는 전기화학적 검출의 특정 모드를 사용하여) LOCS의 검출가능한 모이어티에 의해 생성된 신호와 동시에 검출될 수 있는 검출가능한 신호를 생성하는 유사한 검출 모이어티에 부착되는 또다른 올리고뉴클레오티드 프로브와 조합으로 특정 검출 모이어티에 부착된 LOCS를 활용한다.
형광성 신호의 분석
제한 없이 및 예만으로써, 본 발명에 따라 사용된 검출가능한 모이어티는 변형시 이들 검출가능한 모이어티에 의해 생성된 형광성 신호를 포함하고, 분할된 LOCS 구조의 해리를 포함하여, 이들이 부착되거나, 커플링되거나, 달리 결합되는 올리고뉴클레오티드 프로브의 절단 또는 소화는 본 발명의 방법에 따라 표적 분자를 검출, 차별, 및/또는 정량화하기 위해 임의의 적합한 방식으로 분석될 수 있다.
표준 용융 곡선 분석이 사용될 수 있어도, 다양한 검정 양식의 분석에 용이하게 채택될 수 있는 다양한 다른 접근법은 본원에 개시되고 예시된다 (실시예 참조).
비-제한 예로써, 단일 온도에서, 또는 여러 온도에서 형광성 신호의 측정은 LOCS 올리고뉴클레오티드의 루프 영역의 절단 또는 분해 검출하기에 적합한 반응 내에 다양한 시점에서 수득될 수 있다. 비-제한 예로써, 이들 시점은 (i) 반응의 시작에서, 또는 근처에서 한 시점, 및/또는 (ii) 반응의 과정 동안 단일 시점, 또는 여러 시점; 및/또는 (iii) 반응의 종료 또는 종점에서 한 시점을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 형광성 신호의 측정은 증폭 반응, 예컨대 PCR 증폭 동안 각 주기에 2개 이상의 온도에서 수득될 수 있다. 분석은 제1 및/또는 제2 온도에서 및 /또는 추가 온도에서 수득된 형광의 수준을 비교함으로써 수행될 수 있다.
몇몇 구현예에서, 형광성 신호의 측정은 동일한 파장에 2개 표적을 측정하도록 맞춤화되는 반응에 2개 온도에서 수득될 수 있다.
일부 구현예에서 제1 표적은 형광성 신호가 여러 시점에, 또는 여러 주기에, 예를 들어, PCR 동안 각 주기에 측정될 수 있는 제1 올리고뉴클레오티드 리포터 프로브 또는 기질을 사용하여 검출될 수 있다. 동일한 반응에서 제2 표적은 PCR전 및 PCR후 형광 수준을 비교함으로써 LOCS 프로브를 사용하여 검출될 수 있다. 이러한 구현예에서, 정량적 데이터는 제1 표적에 대하여 결정될 수 있고, 반면 정성적 데이터는 제2 표적에 대하여 생성될 수 있다. 비-제한 예로써, 제1 올리고뉴클레오티드 프로브는 제1 표적의 존재 하에서 제1 MNA자임에 의해 절단되고 실시간으로 모니터링된 MNA자임 기질일 수 있고; 반면에 LOCS 프로브는 제2의 존재 하에서 제2 MNA자임에 의해 절단될 수 있고 종점 검출 분석을 사용하여 모니터링될 수 있다. 실시간 정량적 분석 및 종점 정성적 분석 조합하기의 예는 1개 선형 MNA자임 기질 및 1개 LOCS 프로브를 활용하는 실시예 1, 및 1개 TaqMan 프로브 및 1개 LOCS 프로브를 활용하는 실시예 6을 포함한다.
일부 구현예에서 제1 온도에 형광에서의 증가는 제1 표적의 존재를 나타내고 제2 온도에 형광에서의 증가는 제1 및/또는 제2 표적의 존재를 나타낸다. 다른 구현예에서 제1 온도에 형광에서의 증가는 제1 표적의 존재를 나타내고 제2 온도에 형광에서의 증가는 제2 표적의 존재를 나타낸다. 더욱 다른 구현예에서 제1 온도에 형광에서의 감소는 제1 표적의 존재를 나타내고 제2 온도에 형광에서의 증가는 제2 표적의 존재를 나타낸다. 다른 구현예에서, 형광성 신호의 측정은 PCR 동안 각 주기에 2개 이상의 온도에서 수득될 수 있고, 증폭 곡선은 각 온도에서 수득된 각 일련의 측정에 대하여 플롯팅될 수 있다. 임계 형광 값은 각 특정 온도에 대하여 각 증폭 플롯에 할당될 수 있고 Cq 값은 증폭 플롯이 역치를 넘는 주기 수로서 측정될 수 있다. 제1 프로브가 표적 1의 검출을 위한 표준 선형 MNA자임 기질이고 제2 프로브가 표적 2의 검출을 위한 LOCS 리포터인; 그리고 형광성 신호의 측정이 PCR 동안 각 주기에 2개 온도에서 수득되는 구현예에서, 분할된 LOCS Tm의 것 미만인, 더 낮은 온도에서 선형 MNA자임 기질로부터 형광성 신호를 사용하여 측정된 Cq는 제1 표적의 시작하는 농도의 직접 정량화를 허용할 수 있고; 분할된 LOCS의 Tm 초과 그러나 온전한 LOCS의 Tm 미만인, 더 높은 온도에서 양쪽 선형 MNA자임 기질 및 LOCS 리포터로부터 총 형광성 신호를 사용하여 측정된 Cq는 실시예 4에서 예시된 대로 분석되어서, 제2 표적의 시작하는 농도의 정량화를 허용할 수 있다.
다른 구현예에서, 형광성 신호의 측정은 PCR 동안 각 주기에 2개 이상의 온도에서 수득될 수 있고, 증폭 곡선은 각 온도에서 수득된 각 일련의 측정에 대하여 플롯팅될 수 있다. 임계 형광 값은 각 특정 온도에 대하여 각 증폭 플롯에 할당될 수 있고 Cq 값은 증폭 플롯이 역치를 넘는 주기 수로서 측정될 수 있다. 어느 한쪽 표준 분자성 비콘, 또는 캐처/피처 프로브, 또는 스콜피온 유니-프로브, 또는 스콜피온 비-프로브인, 제1 표적의 검출을 위한 제1 프로브가, LOCS 리포터일 수 있는 제2 표적의 검출을 위한 제2 프로브와 조합되는; 그리고 형광성 신호의 측정이 PCR 동안 각 주기에 2개 온도에서 수득되는 구현예에서, 분할된 LOCS의 Tm 미만인, 더 낮은 온도에서 제1 프로브로부터 형광성 신호를 사용하여 측정된 Cq는 제1 표적의 시작하는 농도의 직접 정량화를 허용할 수 있고; 분할된 LOCS의 Tm 초과 그러나 온전한 LOCS의 Tm 미만인, 더 높은 온도에서 LOCS 리포터로부터 형광성 신호를 사용하여 측정된 Cq는 제2 표적의 시작하는 농도의 직접 정량화를 허용할 수 있다. 제1 표준 프로브의 제2 LOCS 프로브와의 특정 조합은 제1 프로브의 특정 영역의 Tm에 대하여, 그리고 상기 개괄된 대로 및 실시예 5 및 7에서 분자성 비콘에 대하여; 실시예 9에서 스콜피온 프로브에 대하여, 그리고 실시예 11에서 캐처 피처 올리고뉴클레오티드에 대하여 예시된 대로, 데이터가 획득되는 2개 온도에 대한 추가의 요건을 가질 수 있다.
비-제한 예로써, 기준선 형광 신호는 형광을 선택된 온도, 예를 들어 제1 및 제2 온도에서, 어느 한쪽 반응의 시작에서, 또는 근처에서, 예를 들어 PCR전인 한 시점에서 측정함으로써 수득될 수 있다. PCR에 앞서 및 제1 온도에서, 표준 리포터 프로브, 예를 들어 선형 MNA자임 기질 또는 TaqMan 프로브 또는 분자성 비콘, 및 온전한 LOCS는, 이 온도가 온전한 LOCS (및 존재한다면 분자성 비콘)의 스템의 Tm 미만이면, 퀀칭될 것이고 유의미한 형광 신호를 생산하지 않을 것이다. 분석은 반응의 시작 (예를 들면 PCR전)에 한 시점에서 제1 및 제2 온도에 수득된 형광의 수준 및 반응 동안 및/또는 이후 (예를 들면 PCR 동안 동안 또는 PCR후)에 한 시점에서 제1 및 제2 온도에 수득된 형광의 수준을 비교함으로써 수행될 수 있다.
실시예 1에서 입증된 대로, 제1 온도 PCR후 시점에서 측정된, 선형 MNA자임 기질의 절단은 제1 온도 PCR전 시점에서 측정된 온전한, 선형 MNA자임 기질의 신호에 비해 유의미한 형광 신호를 생산한다. 이 상대 신호 (ΔSD1)는 샘플에서 제1 표적의 존재를 나타내는 제1 사전-결정된 임계값을 넘는다. 이 제1 온도에서, 온전한, LOCS 및/또는 절단된, 분할된 LOCS는 양쪽 LOCS 구조의 스템의 Tm으로 인해 PCR전 수득된 신호에 비해 유의미한 형광 신호의 생산에 기여하지 않는다. 제1 온도보다 높은 제2 온도에서, 그리고 PCR후 시점에서, LOCS의 절단은 PCR전 시점에 제2 온도에서 수득된 신호에 비해 유의미한 형광 신호를 생산한다. 실시예 1 (종점 분석 방법 1)에서 입증된 대로, 선형 MNA자임 기질이 절단되는지 아닌지 여부 및 그래서 분할된 LOCS의 검출 및 따라서 제2 표적의 존재를 나타내는지와 관계없이, 이 상대 신호 (ΔSD2)는 제2 사전-결정된 임계값을 넘고 제1 온도에서 상대 신호 (ΔSD1)보다 크다. 이 제2 온도에서 그리고 PCR후 한 시점에서, 온전한 LOCS는 동일한 제2 온도에서 PCR전 시점에 비해 유의미한 형광 신호의 생산에 기여하지 않고 사전-결정된 임계값을 넘지 않는다. 대안적으로, 제2 온도에서 PCR 전 및 후 수득된 상대 신호와 제1 온도에서 PCR 전 및 후 수득된 상대 신호 사이 차이 (ΔSD2 - ΔSD1)는 사전-결정된 임계값과 비교되어 절단된, 분할된 LOCS의 존재를 결정할 수 있다. 실시예 1 (종점 분석 방법 2)에서 입증된 대로, 샘플에서 제2 표적의 존재를 나타내는 절단된, 분할된 LOCS의 존재는 차이가 사전-결정된 임계값보다 큰 (ΔSD2 - ΔSD1 > 임계값) 경우 결정될 수 있다. 샘플에서 제2 표적의 부재는 차이 값이 사전-결정된 임계값보다 적은 (ΔSD2 - ΔSD1 < 임계값) 경우 결정될 수 있다. 추가적으로, 제2 온도에서 PCR 전 및 후 수득된 상대 신호와 제1 온도에서 PCR 전 및 후 수득된 상대 신호 사이 차이 (ΔSD2 - ΔSD1)가 사전-결정된 임계값을 넘는 경우, 온도 1 대 온도 2에서 형광 변화의 고유한 비율 (ΔSD1:ΔSD2), 또는 역비 (ΔSD2:ΔSD1)는 표적 1, 표적 2 또는 양쪽 표적 1 및 2가 샘플 내에서 존재하는지를 결정하는데 사용될 수 있다. 실시예 1 (종점 분석 방법 3)에서 입증된 대로, ΔSD1:ΔSD2가 임계값 R1보다 크면, 이것은 표적 1만이 존재함을 나타내고; ΔSD1:ΔSD2가 임계값 R2보다 적으면, 이것은 표적 2만이 존재함을 나타내고; ΔSD1:ΔSD2가 임계값 R1보다 적지만 임계값 R2보다 크면, 이것은 양쪽 표적 1 및 표적 2가 존재함을 나타낸다.
다른 표준 리포터/프로브와 조합된 때 LOCS 올리고뉴클레오티드의 예시적 적용
- 표적 증폭 동안 또는 이후 표적의 검출
본 발명의 LOCS 올리고뉴클레오티드는 증폭된 표적 핵산 서열의 존재를 결정하는 사용될 수 있다. LOCS 리포터가 적용될 수 있는 증폭 기법과 관련하여 특정한 제한은 실재하지 않는다. 다양한 반응에 의해 생성된 앰플리콘은, 표적 앰플리콘의 존재가 LOCS 리포터의 절단 또는 분해를 촉진시켜 분할된 LOCS 구조를 생산하면, LOCS 리포터에 의해 검출될 수 있다. LOCS 구조 내에서 함유된 루프 영역 절단하기 또는 분해하기에 유용한 방법의 비-제한 예는 MNA자임, DNA자임, 리보자임, 제한 효소, 엔도뉴클레아제에 의한 절단 또는 비제한적으로 폴리머라제의 엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 엑소뉴클레아제에 의한 분해를 포함한다.
일반적으로, 핵산 증폭 기법은 효소 (예를 들면 폴리머라제)를 활용하여 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머에 의해 특이적으로 결합되는 표적 핵산의 카피를 생성한다. LOCS 올리고뉴클레오티드가 사용될 수 있는 증폭 기법의 비-제한 예는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR), 역전사 폴리머라제 연쇄 반응 (RT-PCR), 가닥 변위 증폭 (SDA), 헬리카제 의존적 증폭 (HDA), 리콤비나제 폴리머라제 증폭 (RPA), 루프-매개 등온 증폭 (LAMP), 회전 환 증폭 (RCA), 전사-매개 증폭 (TMA), 자가-지속 서열 복제 (3SR), 핵산 서열 기반된 증폭 (NASBA), 리가제 연쇄 반응 (LCR) 또는 분지화 증폭 방법 (RAM) 중 하나 이상을 포함한다.
당업자는 상기 기재된 LOCS 올리고뉴클레오티드의 적용이 비-제한 예시화만의 목적으로 제공됨을 용이하게 이해할 것이다. 개시된 LOCS 올리고뉴클레오티드는 임의의 프라이머-기반 핵산 증폭 기법에서 사용될 수 있고 본 발명은 구체적으로 기재된 그들 구현예에 그렇게 제한되지 않는다.
- LOCS 리포터를 사용하여 생성된 앰플리콘의 검출
상기 논의된 대로, 본 발명의 LOCS 리포터는 임의의 폴리뉴클레오티드 증폭 기법에서 활용될 수 있고, 이의 비-제한 예는 PCR, RT-PCR, SDA, HDA, RPA, LAMP, RCA, TMA, RAM, LCR, 3SR, 또는 NASBA를 포함한다.
이들 기법에 의해 생성된 앰플리콘은 당업계에서 알려진 임의의 적합한 방법을 사용하여 절단 또는 분해될 수 있는 LOCS 리포터를 활용하여 검출될 수 있다. 비-제한 예는 촉매적 핵산, 엑소뉴클레아제, 엔도뉴클레아제 및 기타 등등의 사용을 포함한다.
MNA자임은 방법 예컨대 PCR, RT-PCR, SDA, HDA, RPA, TMA, LAMP, RCA, LCR, RAM, 3SR, 및 NASBA를 통해서 생성된 앰플리콘을 검출함으로써 분할된 LOCS 리포터를 생성하는데 활용될 수 있다. MNA자임은 하나 이상의 파트자임(들)을 포함할 수 있다. MNA자임은, 예를 들어, 검출되어야 하는 표적 예컨대 프라이머를 사용하여 폴리뉴클레오티드 서열로부터 생성된 앰플리콘일 수 있는 조립 촉진자의 존재 하에서 조립되고 단지 촉매적으로 활성인 다-구성요소 핵산 효소이다. MNA자임은 하나 이상의 조립 촉진자의 존재 하에서 자가-조립하고 기질을 촉매적으로 변형시키는 활성 MNA자임을 형성하는 다중 파트-효소, 또는 파트자임으로 구성된다. 기질 및 조립 촉진자 (표적)는 별도 핵산 분자이다. 파트자임은 (i) 조립 촉진자 (예컨대 표적 핵산)에 결합하는 센서 아암; (ii) 기질을 결합시키는 기질 아암, 및 (iii) 조립시, 완전한 촉매적 코어를 제공하기 위해 조합하는 부분적 촉매적 코어 서열을 포함하는 다중 도메인을 갖는다. MNA자임은, 예를 들어, 상이한 표적 핵산 서열을 포함하는 넓은 범위의 조립 촉진자를 인식하도록 설계될 수 있다. 조립 촉진자의 존재에 응하여, MNA자임은 그들의 기질을 변형시킨다. 이 기질 변형은 신호 생성에 연결될 수 있고 그래서 MNA자임은 효소적으로 증폭된 출력 신호를 생성할 수 있다. 조립 촉진자는 생물학적 또는 환경적 샘플에서 존재하는 표적 핵산 (예를 들면 프라이머를 사용하여 폴리뉴클레오티드 표적으로부터 생성된 앰플리콘)일 수 있다. 이러한 사례에서, MNA자임 활성에 의한 기질의 변형의 검출은 표적의 존재를 나타낸다. 핵산 기질을 절단시킬 수 있는 몇몇 MNA자임은 당업계에서 알려진다. MNA자임 및 이의 변형된 형태는 당업계에서 알려지고 PCT 특허 공개 번호 WO/2007/041774, WO/2008/040095, WO2008/122084, 및 관련된 미국 특허 공개 번호 2007-0231810, 2010-0136536, 및 2011-0143338 (이들 문헌의 각각의 내용은 그들 전체가 참조로 본원에 포함됨)에 개시된다.
- 기계-대-기계 변동 또는 웰-대-웰 변동에 대한 내부 교정기로서 LOCS 리포터의 사용
실시예 12에서 입증된 교정기 방법은 반응에 추가되어야 하는 추가의 시약의 사용도 필요 없고 다른 웰로부터 수득된 데이터의 사용도 필요 없는 점을 포함하여 몇몇 이점을 갖는다. 이 방법은 존재할 수 있는 웰-대-웰 변동에 대하여 교정 및 수정하는 기능을 한다. 더욱이, 교정은 동일한 채널에서 획득된 데이터를 사용하여 가공되고 그러므로 기구들 사이 존재할 수 있는 임의의 채널-대-채널 변동에 의해 영향받지 않는다. 여러 채널이 멀티플렉스 반응에 활용되는 경우, 각 채널은 각 채널내 LOCS 교정 신호에 대해 독립적으로 교정될 수 있다. 이것은, 채널 사이 예상된 신호 강도의 비율이 기구들 사이 상당히 상이하면 교정이 불리하게 영향받아, 채널-대-채널 변동을 야기시키기 때문에, 신호가 상이한 채널, 예컨대 내부 대조군 또는 내인성 대조군으로부터의 것에서 신호에 대해 교정되는 시나리오에 유리하다.
- 진단적 적용
LOCS 올리고뉴클레오티드와 조합으로 표준 리포트 프로브를 사용하는 방법은 본원에 기재된 방법에 따라 진단적 및/또는 예후적 목적으로 사용될 수 있다. 진단적 및/또는 예후적 방법은 생체외 또는 시험관내 수행될 수 있다. 하지만, 본 발명의 방법은 진단적 및/또는 예후적 목적에 반드시 사용될 필요는 없고, 따라서 진단적 또는 예후적이지 않은 적용이 또한 고려된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 대상체에서 감염을 진단하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 방법은 대상체에서 박테리아, 바이러스, 진균/효모, 원생생물 및/또는 선충에 의한 감염을 진단하는데 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 바이러스는 엔테로바이러스일 수 있다. 대상체는 소과, 말과, 양과, 영장류, 조류 또는 설치류 종일 수 있다. 예를 들어, 대상체는 포유동물, 예컨대 인간, 개, 고양이, 말, 양, 염소, 또는 소일 수 있다. 대상체는 감염으로부터 발생하는 질환에 시달릴 수 있다. 예를 들어, 대상체는 엔테로바이러스 감염으로부터 발생하는 수막염이 있을 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 특정 구현예에서 수막염을 진단하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 방법은 샘플 상에서 수행될 수 있다. 샘플은 임의의 출처에서 유래될 수 있다. 예를 들어, 샘플은 환경적 출처, 산업적 출처로부터, 또는 화학적 합성에 의해 수득될 수 있다.
본원에 고려된 경우 "샘플"이 이의 원래 상태로부터, 예를 들어, 임의의 다른 구성요소 또는 구성요소들의 정제, 희석 또는 첨가에 의해 변형되는 샘플을 포함하는 것이 이해될 것이다.
비제한적으로 진단적 및/또는 예후적 방법을 포함하는 본 발명의 방법은 생물학적 샘플 상에서 수행될 수 있다. 생물학적 샘플은 대상체로부터 채집될 수 있다. 보관된 생물학적 샘플은 또한 사용될 수 있다. 적합한 생물학적 샘플의 비-제한 예는 전혈 또는 이의 구성요소 (예를 들면 혈구, 혈장, 혈청), 소변, 대변, 타액, 림프, 담즙액, 가래, 눈물, 뇌척수액, 기관지 폐포 세척액, 활액, 정액, 복수 종양 액체, 모유 및 고름을 포함한다.
키트
본 발명은 본 발명의 방법을 수행하기 위하여 하나 이상의 제제를 포함하는 키트를 제공한다. 전형적으로, 본 발명의 방법을 실시하기 위한 키트는 본 방법을 실시하기 위해 모든 필요한 시약을 함유한다.
일부 구현예에서 키트는 적절한 조립 촉진자 (예를 들면 본원에 기재된 대로 앰플리콘)의 존재 하에서 MNA자임을 형성할 수 있는 올리고뉴클레오티드 구성요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 키트는 제1 및 제2 파트자임을 포함하는 적어도 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드 구성요소, 및 기질을 포함하는 제2 컨테이너를 포함할 수 있되, MNA자임에 제1 및 제2 파트자임, 및 기질의 자가-조립은 검사 샘플에서 존재하는 조립 촉진자 (예를 들면 앰플리콘)의 연관을 필요로 한다. 따라서, 이러한 구현예에서, 제1 및 제2 파트자임, 그리고 루프 영역 내에서 기질을 포함하는 LOCS 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 표적 앰플리콘의 존재를 결정하기 위해 검사 샘플에 적용될 수 있다. 일반적으로, 키트는 본원에 제공된 적어도 하나의 LOCS 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
전형적으로, 본 발명의 키트는 다른 시약, 세정 시약, 효소 및/또는 본 발명의 방법 예컨대 PCR 또는 다른 핵산 증폭 기법의 수행에 요구된 경우 다른 시약을 또한 포함할 것이다.
키트는 본원에 정의된 대로 단편화된 키트 또는 조합된 키트일 수 있다.
단편화된 키트는 별도 컨테이너에 수용되는 시약을 포함하고, 플라스틱 또는 종이의 작은 유리 컨테이너, 플라스틱 컨테이너 또는 스트립을 포함할 수 있다. 이러한 컨테이너는 샘플 및 시약의 교차-오염을 피하면서 하나의 구획에서 또다른 구획으로 시약의 효율적 이전, 및 정량적 방식으로 하나의 구획에서 또다른 구획으로 각 컨테이너의 제제 또는 용액의 첨가를 허용할 수 있다.
이러한 키트는 검사 샘플을 받아들일 컨테이너, 검정에서 사용된 시약을 함유하는 컨테이너, 세정 시약을 함유하는 컨테이너, 및 검출 시약을 함유하는 컨테이너를 또한 포함할 수 있다.
조합된 키트는 단일 컨테이너에서 (예를 들면 원하는 구성요소의 각각을 수용하는 단일 박스에서) 반응 검정의 구성요소들의 모두를 포함한다.
본 발명의 키트는 적절한 방법을 실시하기 위해 키트 구성요소 사용을 위한 설명서를 또한 포함할 수 있다. 본 발명의 키트 및 방법은, 예를 들어, 비제한적으로, 실시간 PCR 기계를 포함하는 자동화된 분석 장비 및 시스템과 공동으로 사용될 수 있다.
상이한 표적의 증폭, 검출, 식별 또는 정량화에 적용의 경우, 본 발명의 단일 키트는 적용가능할 수 있거나, 대안적으로 예를 들어 각 표적에 특이적인 시약을 함유하는 상이한 키트가 요구될 수 있다. 본 발명의 방법 및 키트는 임의의 실체를 검출, 식별 또는 정량화하는데 바람직한 임의의 환경에서 적용한다.
수많은 변동 및/또는 수정이 광범위하게 기재된 대로 본 발명의 사상 또는 범위를 벗어나지 않고 특정 구현예에서 개시된 대로 본 발명에 이루어질 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다. 본 구현예는, 그러므로, 모든 면에서 예시적이고 제한적이지 않은 것으로 간주되어야 한다.
실시예
본 발명은 이제 하기 특정 실시예를 참조하여 더욱 상세히 추가로 기재될 것이며, 이는 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예 1: 제2 표적의 정성적 종점 검출과 조합된 1개 표적의 동시 실시간 정량화, 또는 채널당 2개 표적의 동시 정성적 종점 분석 어느 한쪽을 허용하는 양식으로 1개 선형 MNA자임 기질 및 1개 LOCS 프로브를 사용하여 단일 파장에서 여러 표적의 분석 방법.
하기 실시예는 1개 선형 기질 및 1개 LOCS 리포터가 용융 곡선 분석에 대한 필요 없이 단일 형광성 채널에서 2개 표적 (CTcry 및 NGopa)의 검출 및 차별을 위하여 그리고 1개 표적 (CTcry)의 정량화를 위하여 조합으로 사용되는 접근법을 입증한다. 검정은 CTcry가 선형 MNA자임 기질을 사용하여 검출 및 정량화될 수 있고, NGopa가 이의 루프 내에서 상이한 MNA자임 기질을 포함하는 LOCS 리포터를 사용하여 종점에서 검출 및 차별될 수 있도록 설계된다.
PCR 동안, MNA자임 1은 CTcry의 존재 하에서 선형 기질 1을 절단시켜 형광단 및 퀀처를 분리하여 넓은 범위의 온도에 걸쳐서 검출될 수 있는 신호에서의 증가를 생산할 수 있다. 본 실시예에서, CTcry의 실시간 검출 및 정량화는 온도 1 (D1) (52℃)에 PCR 동안 동안 각 주기에서 형광을 획득함으로써 달성된다. 양쪽 온전한 및 분할된 구성에서 LOCS-1의 스템은 온도 1 (52℃)보다 높은 용융 온도 (Tm)를 갖고 그러므로 LOCS-1은 샘플에서 NGopa의 존재 또는 부재와 관계없이 온도 1에서 신호를 제공하지 않는다.
NGopa의 존재 하에서, MNA자임 2는 PCR 동안 LOCS-1을 절단시킬 수 있다. NGopa의 종점 검출은 증폭에 앞서 및 증폭 이후 더 높은 온도 2 (70℃)에서 형광 신호를 비교함으로써 달성될 수 있다 (ΔSD2). 온전한 LOCS-1 스템의 Tm이 온도 2보다 높고 (Tm >70℃), 분할된 LOCS-1 스템의 Tm이 온도 2보다 낮으므로 (Tm <70℃), (존재한다면) 이 온도에서 절단된 선형 기질 1에 관련되는 것 위에, PCR 동안 형광에서의 증가는 해리된 스템을 가진 분할된 LOCS-1과 연관되고 NGopa의 존재를 나타낸다.
본 실시예에서, 표적 2 (NGopa)의 종점 검출과 커플링된 표적 1 (CTcry)의 실시간 정량화는 입증된다. 또한, 본 실시예에서, 양쪽 표적 1 (CTcry) 및 표적 2 (NGopa)의 종점 검출은 이들 데이터의 분석의 여러 대안적 방법과 함께 입증된다.
하기 종점 분석 방법 (1 내지 3)은 별개 시점에서만, 즉; 증폭 반응의 시작 (PCR전 형광) 및 증폭 이후 (종점 또는 PCR후 형광)에서, 또는 근처에서 형광의 측정을 요구한다. 판독은 여러 온도 (D1 및 D2)에 이들 시점에서 이루어지고 분석은 표적 1, 또는 표적 2, 또는 표적 1 및 2의 존재, 또는 표적 1도 표적 2도 없음을 해명한다.
종점 분석 방법 1
온도 1 (D1)에서, 기질 1의 표적-매개 절단은 PCR 동안 형광 신호에서 유의미한 증가 (ΔSD1)를 생산하고, 이는 D1에 PCR후 형광 (SD1-PCR후)과 D1에 PCR전 형광 (SD1-PCR전) 사이 차이로서 측정되고, 이는 SD1-PCR후 - SD1-PCR전 = ΔSD1 > X1이도록 제1 임계값 (X1)을 능가한다. 대조적으로 이 온도에서, LOCS-1의 절단이 발생하였다면, 이것은 형광 신호에서 유의미한 증가를 생산하지 않고 그래서 임계값 (X1)을 능가하지 않는다. 이것은 분할된 스템의 Tm이 D1보다 높고 구조가 퀀칭된 채로 남아있기 때문에 발생한다. 그러므로, 온도 1에서 형광의 PCR전 및 PCR후 측정의 비교는 절단된 기질 1 및 따라서 표적 1의 특정 검출을 허용한다.
온도 1 (D1)보다 높은 온도 2 (D2)에서, LOCS-1의 표적-매개 절단은 증폭 동안 형광 신호에서 유의미한 증가를 생산한다. 분할된 LOCS-1의 존재 하에서, D2에 신호에서의 증가 (ΔSD2)는 임계값 X1 초과이다. 추가로, D2에 신호에서의 증가 (ΔSD2)는, 기질 1이 절단되는지 아닌지와 관계없이, D1에서 그것 (ΔSD1) 초과이다. 그러므로, SD2-PCR후 - SD2-PCR전 = ΔSD2이도록 D2에 PCR후 형광 (SD2-PCR후)과 D2에 PCR전 형광 (SD2-PCR전) 사이 차이로서 측정된, D2에 형광에서의 증가 (ΔSD2)의 크기가, ΔSD2 > ΔSD1 및 ΔSD2 > 임계값 X1이도록, D1 (ΔSD1) 및 임계값 X1에서 양쪽 그것을 능가하는 때, 이것은 분할된 LOCS-1의 검출 및 따라서 표적 2의 존재를 나타낸다.
종점 분석 방법 2
온도 1 (D1)에서, 기질 1의 절단은 ΔSD1 > X1와 같은 제1 임계값 (X1)을 능가하는 PCR 동안 형광 신호에서 유의미한 증가 (ΔSD1)를 생산하지만; LOCS-1의 절단은 D1에 형광 신호에서 유의미한 증가를 생산하지 않고 어느 한쪽 온전한 또는 분할된 때 D1을 능가하는 스템의 높은 Tm으로 인해 임계값 (X1)을 능가하지 않는다. 그러므로, D1에서 PCR전 및 PCR후 형광 측정 (ΔSD1)의 비교는 절단된 기질 1 및 따라서 표적 1의 특정 검출을 허용한다.
온도 1 (D1)보다 높은 온도 2 (D2)에서, PCR 내내 LOCS-1의 절단은 ΔSD2와 ΔSD1 사이 차이 (ΔSD2 - ΔSD1)가 제2 임계값 (X2)을 넘는 온도 1에서 관찰된 변화 (ΔSD1)보다 큰 형광 신호에서의 변화 (ΔSD2)를 생산하여; 이로써 ΔSD2 - ΔSD1 = ΔΔSD2ΔSD1 > X2이다. 대조적으로, 기질 1 단독의 절단은 유사한 ΔSD2 및 ΔSD1 값을 생산하되, 이들 2개 값 사이 차이 (ΔΔSD2ΔSD1)는 유의미하지 않고 제2 임계값 (X2)을 넘지 않는다. 그러므로, 이 방식으로 온도 2에서 형광의 분석은 표적 2의 존재를 나타내는 절단된, 분할된 LOCS-1의 특정 검출을 허용한다.
종점 분석 방법 3
어느 한쪽 표적 1 및/또는 표적 2가 샘플 내에서 존재하는 때, 온도 2에 증폭 동안 신호에서의 증가 (ΔSD2)는 유의미하고 임계값 X1을 넘는다. 그러므로, ΔSD2 > X1일때, 이것은 어느 한쪽 CTcry 및/또는 NGopa가 샘플 내에서 존재함을 나타낸다. 더욱이, ΔSD2 < X1일때 이것은 CTcry도 NGopa도 샘플에서 존재하지 않음을 나타낸다.
추가로, ΔSD2 > X1일때, 온도 1 대 온도 2에서 형광 변화의 고유한 비율 (ΔSD1:ΔSD2), 또는 역비 (ΔSD2:ΔSD1)는 표적 1, 표적 2 또는 양쪽 표적 1 및 2가 샘플 내에서 존재하는지를 결정하는데 사용될 수 있다.
이 사례에서, ΔSD1:ΔSD2가 임계값 R1보다 크면, 이것은 표적 1만이 존재함을 나타내고; ΔSD1:ΔSD2가 임계값 R2보다 적으면, 이것은 표적 2만이 존재함을 나타내고; ΔSD1:ΔSD2가 임계값 R1보다 적지만 임계값 R2보다 크면, 이것은 양쪽 표적 1 및 표적 2가 존재함을 나타낸다.
종점 분석 방법 1, 2 및 3
더욱이, 상기 종점 분석 방법 1 내지 3에서, 온도 1 및 2에 신호에서의 변화 (ΔSD1 및 ΔSD2)는 교정기로부터 신호 (C) 또는 교정기로부터 PCR후와 PCR전 신호 사이 차이 (ΔC)에 대해 또한 교정될 수 있다. 비-제한 예에 의해, 교정기는, 사전정의된 온도 또는 온도들에 동일한 채널에서 또는 상이한 채널에서 측정될 수 있는, 내인성 대조군, 내부 대조군 또는 설계된 교정기 올리고를 포함할 수 있다. 온도 1 및 2에 신호에서의 변화 (ΔSD1 및 ΔSD2)는 교정기로부터 신호에서의 변화에 대한 비율 (예를 들면 ΔSD2/ΔC, ΔSD1/ΔC)로서 또는 대안적으로 반비 (예를 들면 ΔC/ΔSD2, ΔC/ΔSD1)로서 표현될 수 있되, ΔC는, ΔC가 임계값 C보다 크도록 (ΔC > 임계값 C), 양의 신호로서 결정된다.
Figure pct00004
올리고뉴클레오티드
본 실험에 특이적인 올리고뉴클레오티드는 다음을 포함한다; 순방향 프라이머 1 (서열번호: 1), 역방향 프라이머 1 (서열번호: 2), 파트자임 A1 (서열번호: 3), 파트자임 B1 (서열번호: 4), 순방향 프라이머 2 (서열번호: 5), 역방향 프라이머 2 (서열번호: 6), 파트자임 A2 (서열번호: 7), 파트자임 B2 (서열번호: 8), 순방향 프라이머 3 (서열번호: 9), 역방향 프라이머 3 (서열번호: 10), 파트자임 A3 (서열번호: 11), 파트자임 B3 (서열번호: 12), 선형 MNA자임 기질 1 (서열번호: 13), LOCS-1 (서열번호: 14) 및 선형 MNA자임 기질 2 (서열번호: 15). 서열은 서열 목록에서 열거된다.
표적 1 (CTcry) 증폭 및 검출에 특이적인 올리고뉴클레오티드는 기질 1, 파트자임 A1, 파트자임 B1 (MNA자임 1), 순방향 프라이머 1 및 역방향 프라이머 1이다. 표적 2 (NGopa) 증폭 및 검출에 특이적인 올리고뉴클레오티드는 LOCS-1, 파트자임 A2, 파트자임 B2 (MNA자임 2), 순방향 프라이머 2 및 역방향 프라이머 2이다. 교정기 유전자 (TFRC) 증폭 및 검출에 특이적인 올리고뉴클레오티드는 기질 2, 파트자임 A3, 파트자임 B3 (MNA자임 3), 순방향 프라이머 3 및 역방향 프라이머 3이다.
반응 조건
실시간 증폭 및 검출은 BioRad® CFX96 서모사이클러를 사용하여 20 μL의 총 반응 부피에서 수행되었다. 주기화 파라미터, 및 형광성 데이터 획득 (DA) 지점은 다음이었다: 2 분 동안 95℃, 15 초 동안 52℃ (DA), 15 초 동안 70℃ (DA)의 1 주기; 5 초 동안 95℃ 및 30 초 동안 61℃의 10 주기 (주기당 0.5℃ 점감); 5 초 동안 95℃ 및 40 초 동안 52℃의 40 주기 (각 주기에서 DA); 및 15 초 동안 70℃ (DA)의 1 주기. 모든 반응은 삼중으로 실행되었고 40 nM의 각 순방향 프라이머, 200 nM의 각 역방향 프라이머, 200 nM의 각 파트자임 A, 200 nM의 각 파트자임 B, 200 nM의 각 기질, 200 nM LOCS-1 및 1x SensiFast Buffer (Bioline)를 함유하였다. 반응은 어느 한쪽 무 표적 (NF H2O), 또는 CTcry (20,000, 4,000, 800, 160 또는 32 카피)의 합성 G-Block; 또는 NGopa 유전자 (20,000 또는 32 카피); 또는 다양한 농도의 CTcry 유전자 (20,000, 4,000, 800, 160 또는 32 카피)를 NGopa 유전자 (20,000 및 32 카피)의 배경에서 함유하였다. 무 표적 대조군 (NF H2O)을 제외한 모든 반응은 34.5 ng (10,000 카피)의 인간 게놈성 DNA의 배경을 추가로 함유하였다. 마지막으로, 추가의 대조군은 임의의 CTcry 또는 NGopa G 블록 없이 게놈성 DNA만을 함유하였다.
결과
본 실시예에서, 3개 MNA자임 (MNA자임 1 내지 3)은 단지 2개 형광성 채널 (HEX 및 텍사스 레드)을 사용하여 3개 표적 핵산 (CTcry, NGopa 및 인간 TFRC, 각각)을 동시에 검출 및 차별하기 위해 단일 PCR에서 사용되었다. CTcry 및/또는 NGopa의 존재 또는 부재는 HEX 채널에서 검출 및 차별되었고 TFRC 유전자의 존재는 텍사스 레드 채널에서 검출되었다. CTcry 및 TFRC 유전자의 존재는 HEX 및 텍사스 레드 채널 각각에서 52℃ (D1)에 형광 신호에서의 증가에 의해 실시간으로 검출되었고 52℃에 종점에서 또한 검출되었다. NGopa의 존재는 LOCS-1의 절단을 모니터링하는 HEX 채널에서 70℃ (D2)에 별개 측정을 사용하여 검출되었다.
도 6에 도시된 결과는 어느 한쪽 단독 (도 6A) 또는 NGopa 템플레이트의 어느 한쪽 20,000 (도 6B) 또는 32 (도 6C) 카피의 배경에서 CTcry 템플레이트의 20,000 (흑색 점), 4,000 (흑색 대시), 800 (흑색 정방형), 160 (회색 입방형) 또는 32 (회색 점) 카피를 함유하는 반응으로부터 52℃의 획득 온도에 HEX 채널에서 수득된 PCR 증폭 곡선을 실례한다. 52℃에서 형광성 데이터는 CTcry가 부족하지만 NGopa 템플레이트의 어느 한쪽 20,000 (흑색 선) 또는 32 카피 (회색 선)를 함유하는 반응에 대하여 또한 수집되었다 (도 6D). 무 표적 대조군 (NF H2O)은 도 6A 내지 6C (흑색 실선)에 도시된다. 증폭 곡선은 삼중 반응으로부터 형광 수준의 평균이다. 상기 반응의 각각에 대하여 CTcry의 계산된 카피 수는 해당 없음 (N/A)이 그들 반응에서 CTcry의 부재와 일치하는 52℃에 결정된 Cq 값이 없는 경우를 지칭하는 표 5에 표시된다. Cq 값은 BioRad 소프트웨어 (Baseline Subtracted Curve Fit) 상에서 회귀 모드를 사용하여 결정되었다.
표 5에서 결과는 CTcry 표준 곡선이 0.99보다 큰 R2 값을 가졌음, 그리고 PCR 효율이 높았음 (100 - 106%)을 보여준다. 반응에서 NGopa의 20,000 또는 32 카피의 존재는 CTcry의 계산된 유전자 카피 수를 유의미하게 변화시키지 않았고 (짝짓기된 스튜던트 t-검사, p-값 0.144 및 0.315 각각), 그래서 52℃에 실시간 검출이 샘플에서 CTcry의 직접 정량적 분석에 사용될 수 있음을 입증하였다.
Figure pct00005
도 7에서 결과는 종점 분석 방법 1을 사용하여 2개 상이한 온도에 HEX 채널에서 측정된 PCR 동안 형광성 신호에서의 변화를 실례한다. 도　7A에서, 온도 1에 신호에서의 변화 (ΔSD1; 52℃)는 흑색 및 백색 패턴으로 표시되고 온도 2에 신호에서의 변화 (ΔSD2; 70℃)는 회색으로 표시된다. 결과는 NGopa가 존재하는지 또는 부재하는지와 관계없이 샘플 내에서 CTcry가 존재하는 때 온도 1에 신호에서의 변화 (ΔSD1; 흑색 및 백색 패턴 막대)가 임계값 1 (X1)을 넘지만, NGopa 단독 존재 하에서 및/또는 CTcry가 샘플로부터 부재하는 때 이 임계값을 넘지 않음을 보여준다. 그러므로, 온도 1에 임계값 1보다 큰 종점 신호 변화는 CTcry의 존재를 나타낸다. 도 7A에서 결과는 온도 2에 신호에서의 변화 (ΔSD2; 회색 막대)가 온도 1에 신호에서의 변화보다 크고 (ΔSD2 > ΔSD1), 또한 임계값 X1보다 큰 (ΔSD2 > X1) 경우, NGopa가 샘플 내에서 존재함을 또한 보여준다.
대안적으로, 온도 1 및 2에 신호에서의 변화는 교정기 신호에서의 변화 (ΔC)에 대해 교정될 수 있다. 도 7B는 텍사스 레드 채널에서 측정된 TFRC 교정기 신호에서의 변화 (ΔC)를 실례하고, 여기서 임계값 C를 능가하는 값은 ΔC에 대하여 양성 신호를 나타내는 한편 임계값 C 아래 값은 ΔC에 대하여 음성 신호를 나타낸다. 도　7C에서, ΔC에 대해 교정된 온도 1에 신호에서의 변화 (ΔSD1/ΔC; 52℃)는 흑색 및 백색 패턴으로 표시되고 ΔC에 대해 교정된 온도 2에 신호 변화 (ΔSD2/ΔC; 70℃)는 도 7B에서 ΔC에 대하여 양성 간주된 반응의 경우에, 회색으로 표시되고, 여기에서 해당 없음 (N/A)은 도 7B에서 ΔC에 대하여 음성 간주된 반응을 지칭한다. 도 7C에서 결과는, 표적 1 및 2의 검출에 관한 동일한 결론을 해명하는, 도 7A와 동일한 식으로 분석될 수 있다.
도 8에서 결과는 종점 분석 방법 2 (ΔΔSD2ΔSD1)를 사용하여 온도 2 (ΔSD2) 및 온도 1 (ΔSD1)에 HEX 채널에서 수득된 형광성 신호에서의 변화에서 차이를 실례한다. 결과는 NGopa가 샘플 내에서 존재하는 때 ΔΔSD2ΔSD1이 임계값 2 (X2)를 넘지만, CTcry만이 샘플 내에서 존재하는 때 및/또는 NGopa가 샘플이 부재하는 때 (NTC 및 게놈성 DNA 단독) 이 임계값을 넘지 않음을 보여준다. 그러므로, 임계값 2보다 큰 종점 형광성 신호에서의 차이 (ΔΔSD2ΔSD1>X2)는 NGopa의 존재를 나타낸다.
도 9에서 결과는 종점 분석 방법 3을 사용하여 2개 상이한 온도에 HEX 채널에서 수득된 형광성 신호에서의 변화를 실례한다. 도 9A에서, ΔSD2가 임계값 X1보다 큰 경우, 이것은 CTcry 및/또는 NGopa가 샘플에서 존재함을 나타낸다. ΔSD2가 임계값 X1보다 낮은 경우, 이는 CTcry도 NGopa도 반응에서 존재하지 않음을 나타낸다 (NTC 및 게놈성 DNA 단독). 도 9B는 비율 ΔSD1:ΔSD2가 표적이 반응에서 존재함을 나타내는데 사용될 수 있음을 도시한다. 비율이 임계값 R1보다 높은 경우, 이것은 CTcry가 존재하지만 NGopa가 존재하지 않음을 나타낸다. 비율이 임계값 R2보다 낮은 경우, 이것은 NGopa가 존재하지만 CTcry가 존재하지 않음을 나타낸다. 비율이 임계값 R1과 R2 사이인 경우, 이것은 양쪽 CTcry 및 NGopa가 존재함을 나타낸다. CTcry도 NGopa도 반응에서 존재하지 않는 경우 (도 9A), 비율의 계산에 대한 필요는 부정되고, 도 9B에서 도시된 대로, N/A로서 나타난다.
전반적으로, 본 실시예는 2개 표적이 실시간으로 및 별개 시점 (PCR전 및 PCR후)에 형광을 모니터링함으로써 2개 상이한 온도에 단일 형광성 채널에서 검출될 수 있음을 입증한다. 이 방법으로 1개 표적은 선형 MNA자임 기질을 사용하여 정량화될 수 있고, 다른 표적은 LOCS 프로브를 사용하여 검출될 수 있다. 간단한 방법은 PCR후 용융 곡선 분석을 요구하지 않는다. 본 실시예는 정성적 데이터가 여러 온도에 PCR전 및 PCR후 형광 값의 비교에 의해 단일 파장에서 여러 표적에 대하여 수득될 수 있음을 또한 입증한다. 더욱이, 몇몇 분석 방법은 이 데이터의 분석에 적용될 수 있다.
실시예 2: 2개 선형 MNA자임 기질 및 2개 LOCS 리포터를 사용하여 2개 형광성 채널의 각각에 걸쳐서 2개 표적의 동시 실시간 정량화 및 2개 표적의 정성적 검출 방법.
하기 실시예는 4개 표적의 동시 검출 및 차별을 위하여 2개 형광성 채널, HEX 및 FAM의 사용을 입증하고, 여기서 Cq 결정은 단일 반응에서 이들 표적 중 2개에 대하여 이루어질 수 있다. HEX 채널에서, 1개 표적 (CTcry)의 실시간 검출 및 Cq 결정, 뿐만 아니라 제2 표적 (NGopa)의 종점 검출은 1개 선형 MNA자임 기질 및 1개 LOCS 리포터, 각각을 사용하여 달성되었다. 유사하게, FAM 채널에서, 제3 표적 (TVK)의 실시간 검출 및 Cq 결정, 뿐만 아니라 제4 표적 (MgPa)의 종점 검출은 제2 선형 MNA자임 기질 및 제2 LOCS 리포터, 각각을 사용하여 달성되었다. 마지막으로, 제5 표적, 인간 TFRC 유전자는 텍사스 레드 채널에서 판독된 제3 선형 MNA자임 기질을 사용하여 배경 인간 게놈성 DNA에서 검출되었다.
그들의 각자의 MNA자임에 의한 선형 기질의 표적-매개 절단은 형광단 및 퀀처의 분리를 야기시켜 넓은 범위의 온도에 걸쳐서 신호에서의 증가를 생산한다. 본 실시예에서, 선형 기질로부터 신호는 표적이 존재하는 때 PCR 동안 발생하는 형광에서의 증가를 측정함으로써 종점에서 또는 온도 1 (D1 = 52℃)에 PCR 동안 각 주기에서 형광을 획득함으로써 실시간으로 검출될 수 있다. 이 온도에서, NGopa 및 MgPa에 대하여 양쪽 분할된 및 온전한 LOCS 리포터가 임의의 검출가능한 신호를 생산하지 않는 것은, 그들의 스템 영역의 Tm이 온도 1보다 높기 때문이다. 그러므로, PCR 동안 각 파장에서 온도 1에 수득된 Cq 값은 (다른 표적의 존재 또는 부재와 관계없이) 표적 Ctcry, TVK 및 TFRC의 시작하는 정량을 반영하고 그래서 정량화에 사용될 수 있다.
그들의 각자의 MNA자임에 의한 LOCS 리포터의 표적-매개 절단은 특정 범위의 온도에 걸쳐서 신호에서의 증가를 야기시킨다. 본 실시예에서, 이 형광 신호는, 분할된 LOCS 리포터의 양쪽의 Tm보다 높은, 그러나 양쪽 온전한 LOCS 리포터의 Tm보다 낮은 (온전한 LOCS 리포터 Tm > 온도 2 > 분할된 LOCS 리포터 Tm), 온도 2 (D2 = 70℃)에 측정되고 그러므로 온전한 LOCS 리포터는 온도 2에 유의미한 신호를 제공하지 않는다. 그러므로, 온도 2에 신호에서의 증가는, HEX 및 FAM 채널, 각각에서 특정 표적 NGopa 및 MgPa의 존재를 확증하는, 분할된 LOCS 리포터의 존재를 반영한다.
본 실시예는 PCR 전 및 후 형광 판독의 비교에 의해 해명된 2개 다른 표적의 간단한 검출과 조합된, 3개 표적에 대하여 실시간 모니터링 및 Cq 결정으로 단일 반응에서 혼합된 정량적 및 정성적 데이터의 동시 생성을 입증한다. 추가적으로, 본 실시예는 (실시예 1에 개괄된 대로) 종점 분석 방법 1 내지 3과 커플링된 2개 형광성 채널에서 4개 표적의 정성적 검출을 입증한다.
올리고뉴클레오티드
본 실험에 대해 특이적인 올리고뉴클레오티드는 순방향 프라이머 1 (서열번호: 1), 역방향 프라이머 1 (서열번호: 2), 파트자임 A1 (서열번호: 3), 파트자임 B1 (서열번호: 4), 순방향 프라이머 2 (서열번호: 5), 역방향 프라이머 2 (서열번호: 6), 파트자임 A2 (서열번호: 7), 파트자임 B2 (서열번호: 8), 순방향 프라이머 3 (서열번호: 9), 역방향 프라이머 3 (서열번호: 10), 파트자임 A3 (서열번호: 11), 파트자임 B3 (서열번호: 12), 선형 MNA자임 기질 1 (서열번호: 13), LOCS-1 (서열번호: 14), 선형 MNA자임 기질 2 (서열번호: 15), 순방향 프라이머 4 (서열번호: 16), 역방향 프라이머 4 (서열번호: 17), 파트자임 A4 (서열번호: 18), 파트자임 B4 (서열번호: 19), 순방향 프라이머 5 (서열번호: 20), 역방향 프라이머 5 (서열번호: 21), 파트자임 A5 (서열번호: 22), 파트자임 B5 (서열번호: 23), 선형 MNA자임 기질 3 (서열번호: 24), LOCS-2 (서열번호: 25)를 포함한다. 서열은 서열 목록에서 열거된다.
CTcry 증폭 및 검출에 특이적인 올리고뉴클레오티드는 기질 1, 파트자임 A1, 파트자임 B1 (MNA자임 1), 순방향 프라이머 1 및 역방향 프라이머 1이다. NGopa 증폭 및 검출에 특이적인 올리고뉴클레오티드는 LOCS-1, 파트자임 A2, 파트자임 B2 (MNA자임 2), 순방향 프라이머 2 및 역방향 프라이머 2이다. TFRC 증폭 및 검출에 특이적인 올리고뉴클레오티드는 기질 2, 파트자임 A3, 파트자임 B3 (MNA자임 3), 순방향 프라이머 3 및 역방향 프라이머 3이다. TVK 증폭 및 검출에 특이적인 올리고뉴클레오티드는 기질 3, 파트자임 A4, 파트자임 B4 (MNA자임 4), 순방향 프라이머 4 및 역방향 프라이머 4이다. MgPa 증폭 및 검출에 특이적인 올리고뉴클레오티드는 LOCS-2, 파트자임 A5, 파트자임 B5 (MNA자임 5), 순방향 프라이머 5 및 역방향 프라이머 5이다.
반응 조건
실시간 증폭 및 검출은 BioRad® CFX96 서모사이클러를 사용하여 20 μL의 총 반응 부피에서 수행되었다. 주기화 파라미터, 및 형광성 데이터 획득 (DA) 지점은 다음이었다: 2 분 동안 95℃, 15 초 동안 52℃ (DA), 15 초 동안 70℃ (DA)의 1 주기, 5 초 동안 95℃ 및 30 초 동안 61℃의 10 주기 (주기당 0.5℃ 점감), 5 초 동안 95℃ 및 40 초 동안 52℃의 40 주기 (각 주기에서 DA) 및 15 초 동안 70℃ (DA). 모든 반응은 이중으로 실행되었고 40 nM의 각 순방향 프라이머, 200 nM의 각 역방향 프라이머, 200 nM의 각 파트자임 A, 200 nM의 각 파트자임 B, 200 nM의 각 기질, 200 nM LOCS-1, 300 nM LOCS-2 및 1x SensiFast Buffer (Bioline)를 함유하였다. 반응은 어느 한쪽 무 표적 (NF H2O), CTcry (20,000 또는 32 카피)의 합성 G-Block, NGopa 유전자 (20,000 또는 32 카피), 양쪽 CTcry 및 NGopa (20,000 또는 32 카피 각), TVK (20,000 또는 32 카피), MgPa 유전자 (20,000 또는 32 카피) 또는 양쪽 TVK 및 MgPa (20,000 또는 32 카피 각각)를 함유하였다. 무 표적 대조군 (NF H2O)을 제외한 모든 반응은 10,000 카피의 인간 게놈성 DNA의 배경을 함유하였다. 추가의 대조군은 게놈성 DNA만을 함유하였다.
결과
본 실시예에서, 5개 MNA자임 (MNA자임 1 내지 5)은 단지 3개 형광성 채널 (HEX, 텍사스 레드 및 FAM)을 사용하여 5개 표적 핵산 (CTcry, NGopa, TFRC, TVK 및 MgPa 각각)을 동시에 검출 및 차별하기 위해 단일 PCR 반응에서 사용되었다. CTcry 및/또는 NGopa의 존재 또는 부재는 HEX 채널에서 검출 및 차별되었고, 게놈성 DNA내 TFRC 유전자의 존재는 텍사스 레드 채널에서 검출되었고 TVK 및/또는 MgPa의 존재 또는 부재는 FAM 채널에서 검출 및 차별되었다. CTcry, TFRC 및 TVK 유전자의 존재는 HEX, 텍사스 레드 및 FAM 채널 각각에서 52℃에 형광 신호에서의 증가에 의해 실시간으로 검출되었고, 52℃에 종점에서 또한 검출되었다. NGopa 및 MgPa의 존재는, LOCS-1 및 LOCS-2 각각의 절단을 모니터링하는, HEX 및 FAM 채널 각각에서 70℃에 종점에서 검출되었다.
도 10에서 도시된 결과는 52℃의 획득 온도에 HEX (도 10A 내지 D) 및 FAM (도 10E 내지 H) 채널에서 수득된 PCR 증폭 곡선을 실례한다. 생산된 증폭 곡선은 HEX 채널에서 수득된 CTcry 템플레이트 단독의 20,000 카피 및 32카피 (도 10A) 또는 FAM 채널에서 수득된 TVK 단독 (도 10E)을 나타낸다. 증폭 곡선은 HEX 채널에서 수득된 양쪽 CTcry 및 NGopa 템플레이트의 어느 한쪽 20,000 카피 및 32 카피 각각 (도 10B), 또는 FAM 채널에서 수득된 TVK 및 MgPa 템플레이트의 20,000 카피 및 32 카피 각각 (도 10F)을 함유하는 템플레이트 혼합물에 대하여 또한 생산되었다. 증폭은 NGopa 단독의 20,000 카피 및 32 카피를 함유하는 샘플에 대하여 HEX 채널에서 보여지지 않았고 (도 10C), TVK, MgPa 및 TFRC (내인성 대조군)를 포함하는 남은 표적의 임의의 농도에 대하여 기록된 임의의 증폭도 없었다 (도 10D). 마찬가지로, FAM 채널에서, 증폭은 MgPa 템플레이트 단독의 20,000 카피 및 32 카피를 함유하는 샘플에 대하여 기록되지 않았고 (도 10G), CTcry, NGopa 및 TFRC를 포함하는 남은 표적의 임의의 농도에 대하여 기록된 임의의 증폭도 없었다 (도 10H). 모든 무 표적 대조군 (NF H2O) 반응에 대하여 신호에서의 증가는 없었고 결과는 흑색 점선으로서 이다 보여준다 (도 10A 내지 H). 증폭 곡선은 삼중 반응으로부터 평균이고 마이크로소프트 엑셀 (버전 14)을 사용하여 플롯팅되었다. Cq 값은 100 RFU (Baseline Subtracted Curve Fit)에 설정된 단일 임계값 방법을 사용하여 결정되었다.
상기 반응의 각각에 대하여 Cq 값은 표 6에 표시되고, 여기에서 해당 없음 (N/A)은, 그들 반응에서 CTcry 및 TVK의 부재와 일치하는, 52℃에 결정된 Cq 값이 없는 경우를 지칭한다. 결과는 CTcry 및 TVK에 대하여 Cq 값이 각각 FAM 채널에서 NGopa 템플레이트 또는 HEX 채널에서 MgPa 템플레이트의 존재에 의해 영향받지 않음을 나타낸다. 또한, 비-표적 반응의 각각은 검출가능한 증폭 곡선 또는 Cq 값을 생산하지 않았다. 그러므로, HEX 및 FAM 채널로부터 수득된 Cq 값은 각각 샘플에서 CTcry 및 TVK의 직접 정량적 분석에 사용될 수 있다.
Figure pct00006
도 11에서 결과는 종점 분석 방법 1을 사용하여 2개 상이한 온도에 HEX (도 11A) 및 FAM 채널 (도 11B)에서 수득된 증폭 동안 형광성 신호에서의 변화 (PCR후 빼기 PCR전)를 실례한다. 온도 1에 신호에서의 변화 (ΔSD1; 52℃)는 흑색 및 백색 패턴으로 표시되고 온도 2에 신호에서의 변화 (ΔSD2; 70℃)는 회색으로 표시된다. 도 11A는 CTcry가 샘플 내에서 존재하는 경우 ΔSD1이 임계값 X1을 넘지만 CTcry가 샘플로부터 부재하는 경우 이 임계값을 넘지 않음을 도시한다. 그러므로, ΔSD1 > X1은 CTcry의 존재를 나타낸다. 도 11A에서 결과는 온도 2에 신호에서의 변화 (ΔSD2)가 온도 1에 변화보다 크고 (ΔSD2 >ΔSD1), 임계값 X1보다 또한 큰 (ΔSD2 > X1) 경우, NGopa가 샘플 내에서 존재함을 또한 보여준다. ΔSD2가 임계값 X1을 넘지만 ΔSD1이 넘지 않는 경우, 이것은 NGopa 단독의 존재를 나타낸다. 유사하게, 도 11B는 TVK가 샘플 내에서 존재하는 경우 온도 1에 신호에서의 변화 (ΔSD1)가 임계값 X1을 넘지만 TVK가 샘플로부터 부재하는 경우 이 임계값을 넘지 않음을 도시한다. 그러므로, ΔSD1 > X1은 TVK의 존재를 나타낸다. 도 11B에서 결과는 온도 2에 신호에서의 변화 (ΔSD2)가 온도 1에 신호에서의 변화보다 유의미하게 크고 (ΔSD2 >ΔSD1), 또한 임계값 X1보다 큰 (ΔSD2 > X1) 경우, MgPa가 샘플 내에서 존재함을 또한 보여준다. SD2가 임계값 X1을 넘지만 SD1이 넘지 않는 경우, 이것은 MgPa 단독의 존재를 나타낸다.
도 12에서 결과는 종점 분석 방법 2 (ΔΔSD2ΔSD1)를 사용하여 온도 2 및 온도 1에 HEX (도 12A) 및 FAM (도 12B) 채널에서 수득된 종점 형광성 신호 증가에서의 차이를 실례한다. 도 12A에서 결과는 NGopa가 샘플 내에서 존재하는 경우 ΔΔSD2ΔSD1이 임계값 X2를 넘지만 NGopa가 샘플로부터 부재하는 경우 이 임계값을 넘지 않음을 보여준다. 유사하게, 도 12B에서 결과는 MgPa가 샘플 내에서 존재하는 경우 ΔΔSD2ΔSD1이 임계값 X2를 넘지만 MgPa가 샘플로부터 부재하는 경우 이 임계값을 넘지 않음을 보여준다. 그러므로, HEX 및 FAM 채널에서 ΔΔSD2ΔSD1 > X2인 경우 이것은 NGopa 및 MgPa 각각의 존재를 나타낸다.
도 13에서 결과는 종점 분석 방법 3을 사용하여 2개 상이한 온도에 HEX (도 13A, B) 및 FAM (도 13C, D) 채널에서 수득된 형광성 신호에서의 변화를 실례한다. 도 13A에서, HEX 채널에서 ΔSD2가 임계값 X1보다 큰 경우, 이는 CTcry 및/또는 NGopa가 샘플에서 존재함을 나타낸다. HEX 채널에서 ΔSD2가 임계값 X1보다 낮은 경우, 이는 CTcry도 NGopa도 반응에서 존재하는 않음을 나타낸다. 도 13B는, 표적이 반응에서 존재함을 나타내는, HEX 채널에서 비율 ΔSD2: ΔSD1을 도시한다. 비율이 임계값 R1보다 높은 경우, 이는 CTcry가 존재하지만 NGopa가 존재하지 않음을 나타낸다. 비율이 임계값 R2보다 낮은 경우, 이는 NGopa가 존재하지만 CTcry가 존재하지 않음을 나타낸다. 비율이 임계값 R1과 R2 사이인 경우, 이는 양쪽 CTcry 및 NGopa가 존재함을 나타낸다. 도 13A는 CTcry도 NGopa도 반응에서 존재하지 않는 경우를 도시하고, 그러므로 도 13B의 경우 비율 계산에 대한 필요는 부정되고 N/A로서 표시된다. 도 13C에서, FAM 채널에서 ΔSD2는 임계값 X1보다 커서, TVK 및/또는 MgPa가 샘플에서 존재함을 나타낸다. FAM 채널에서 ΔSD2가 임계값 X1보다 낮은 경우, 이는 TVK도 MgPa도 반응에서 존재하지 않음을 나타낸다. 도 13D는 표적이 반응에서 존재함을 나타내는 FAM 채널에서 비율 ΔSD2:ΔSD1을 도시한다. 비율이 임계값 R1보다 높은 경우, 이는 TVK가 존재하지만 MgPa가 존재하지 않음을 나타낸다. 비율이 임계값 R2보다 낮은 경우, 이는 MgPa가 존재하지만 TVK가 존재하지 않음을 나타낸다. 비율이 임계값 R1과 R2 사이인 경우, 이는 양쪽 MgPa 및 TVK가 존재함을 나타낸다. 도 13C는 TVK도 MgPa도 반응에서 존재하지 않음을 도시하고, 그러므로 도 13D의 경우 비율 계산에 대한 필요는 부정되고 N/A로서 표시된다.
실시예 3 - 용융 곡선 분석을 사용하여 추가의 확증과 1개 선형 MNA자임 기질 및 1개 LOCS 리포터를 사용하여 단일 채널에서 2개 표적의 종점 검출 및 차별.
하기 실시예는 1개 선형 MNA자임 기질 및 1개 LOCS 리포터가 종점 분석 및 용융 곡선 분석을 사용하여 단일 형광성 채널에서 2개 표적 (TPApolA 및 TFRC)의 검출 및 차별에 조합으로 사용되는 접근법을 입증한다. 검정은 TFRC가 선형 MNA자임 기질을 사용하여 종점에서 검출 및 차별될 수 있고 TPApolA가 LOCS 리포터를 사용하여 종점에서 검출 및 차별될 수 있도록 설계된다. TPApolA의 확증적 검출은 동시에 용융 곡선 분석을 사용하여 또한 달성될 수 있다.
본 실시예에서, TFRC는 반응당 10,000 카피의 단일 농도에서 내인성 대조군으로서 포함된다. TPApolA는 2개 상이한 농도: 반응당 10,000 카피 및 반응당 40 카피에서 검사되었다. 양쪽 TPApolA 및 TFRC의 동시 검출은 하기 농도에서 검사되었다: 반응당 TPApolA의 10,000 카피와 함께 TFRC의 10,000 카피, 및 반응당 TPApolA의 40 카피와 함께 TFRC의 10,000 카피. 이 검정은 CTcry, LGV, NGopa, NGporA, MgPa, TVbtub, HSV-1 및 HSV-2를 포함하는 8개 다른 표적의 증폭 및 검출을 위하여 프라이머, 파트자임 및 LOCS를 또한 함유하였던 10-표적 멀티플렉스이다.
PCR 동안, MNA자임 6은 TFRC의 존재 하에서 선형 기질 4를 절단시켜 형광단 및 퀀처를 분리하여 넓은 범위의 온도에 걸쳐서 검출될 수 있는 신호에서의 증가를 생산할 수 있다. 본 실시예에서, TFRC의 종점 검출은 온도 1 (48℃)에 PCR 주기화 이전 및 이후 형광을 획득함으로써 달성된다.
PCR 동안, MNA자임 7은 TPApolA의 존재 하에서 LOCS-3을 절단시킬 수 있다. 검정은 LOCS-3의 스템이, 양쪽 온전한 및 분할된 구성에 대하여, 온도 1 (48℃)보다 높은 용융 온도 (Tm)를 갖고 그러므로 샘플에서 TPApolA의 존재 또는 부재와 관계없이 온도 1에 신호를 제공하지 않도록 설계된다. 추가로, 검정은 온전한 LOCS-3이 온도 2보다 큰 Tm (Tm > 68℃)을 갖고 분할된 구성이 온도 2 이하인 Tm (Tm ≤ 68℃)을 갖도록 설계된다. 그러므로, TPApolA의 종점 검출 및 차별은 온도 2 (68℃)에 PCR 주기화 이전 및 이후 형광을 획득함으로써 달성된다.
본 실시예에서, TFRC 및 TPApolA의 검출 및 차별은 온도 1 (48℃) 및 온도 2 (68℃), 각각에 PCR 주기화 이전 및 이후 형광을 측정함으로써 달성된다. PCR 주기화 이전 획득된 형광 값은 각 온도에 PCR 주기화 이후 획득된 형광 값에서 뺄셈되어 MNA자임 6 또는 MNA자임 7의 표적-개시 절단에 관련되지 않은 배경 형광을 제거한다. 추가 분석은, 다음과 같이, 그 다음 수행된다:
분석 방법 2 (실시예 1)에서 이전에 기재된 대로, 온도 1에 (D1), 기질 4의 절단은 ΔSD1 > X1이도록 제1 임계값 (X1)을 능가하는 PCR 동안 형광 신호 (ΔSD1)에서 유의미한 증가를 생산하지만; LOCS-3의 절단은 D1에 형광 신호에서 유의미한 증가를 생산하지 않고 어느 한쪽 온전한 또는 분할된 경우 D1을 능가하는 스템의 높은 Tm으로 인해 임계값 (X1)을 능가하지 않는다. 그러므로, D1에 PCR전 및 PCR후 형광 측정 (ΔSD1)의 비교는 절단된 기질 4 및 따라서 TFRC 표적의 특정 검출을 허용한다.
온도 1 (D1)보다 높은 온도 2 (D2)에, PCR 내내 LOCS-3의 절단은 ΔSD2와 ΔSD1 사이 차이 (ΔSD2 - ΔSD1)가 제2 임계값 (X2)을 넘지 않는 온도 1에 관찰된 변화 (ΔSD1)보다 큰 형광 신호에서의 변화 (ΔSD2)를 생산하고; 이로써 ΔSD2 - ΔSD1 = ΔΔSD2ΔSD1 > X2이다. 대조적으로, 기질 4 단독의 절단은 유사한 ΔSD2 및 ΔSD1 값을 생산하고, 여기서 이들 2개 값 (ΔΔSD2ΔSD1) 사이 차이는 유의미하지 않고 제2 임계값 (X2)을 넘지 않는다. 그러므로, 이 방식으로 D2에 형광의 분석은 TPApolA의 존재를 나타내는 절단된, 분할된 LOCS-3의 특정 검출을 허용한다.
TPApolA의 검출 및 차별은 용융 곡선 분석을 사용하여 또한 확증될 수 있다. 고유한 용융 곡선 시그니처는 TPApolA가 샘플에서 부재하는 반응과 구별되는 샘플에서 TPApolA가 존재하는 경우 생산된다. 이것은 TPApolA가 샘플에서 존재하는지 아닌지의 시각적 확증을 허용한다.
올리고뉴클레오티드
본 실험에 대해 특이적인 올리고뉴클레오티드는 순방향 프라이머 3 (서열번호: 9), 역방향 프라이머 3 (서열번호: 10), 파트자임 A6 (서열번호: 26), 파트자임 B6 (서열번호: 27), 기질 4 (서열번호: 28), 순방향 프라이머 6 (서열번호: 29), 역방향 프라이머 6 (서열번호: 30), 파트자임 A7 (서열번호: 31), 파트자임 B7 (서열번호: 32), LOCS-3 (서열번호: 33), 순방향 프라이머 1 (서열번호: 1), 순방향 프라이머 2 (서열번호: 2), 파트자임 A1 (서열번호: 3), 파트자임 B1 (서열번호: 4), LOCS-4 (서열번호: 34), 순방향 프라이머 2 (서열번호: 5), 순방향 프라이머 3 (서열번호: 6), 파트자임 A8 (서열번호: 35), 파트자임 B8 (서열번호: 36), LOCS-5 (서열번호: 37), 순방향 프라이머 7 (서열번호: 38), 역방향 프라이머 7 (서열번호: 39), 파트자임 A9 (서열번호: 40), 파트자임 B9 (서열번호: 41), LOCS-6 (서열번호: 42), 순방향 프라이머 8 (서열번호: 43), 역방향 프라이머 8 (서열번호: 44), 파트자임 A10 (서열번호: 45), 파트자임 B10 (서열번호: 46), LOCS-7 (서열번호: 47), 순방향 프라이머 9 (서열번호: 48), 역방향 프라이머 9 (서열번호: 49), 파트자임 A11 (서열번호: 50), 파트자임 B11 (서열번호: 51), LOCS-8 (서열번호: 52), 순방향 프라이머 10 (서열번호: 53), 역방향 프라이머 10 (서열번호: 54), 파트자임 A12 (서열번호: 55), 파트자임 B12 (서열번호: 56), LOCS-9 (서열번호: 57), 순방향 프라이머 11 (서열번호: 58), 역방향 프라이머 11 (서열번호: 59), 파트자임 A13 (서열번호: 60), 파트자임 B13 (서열번호: 61), LOCS-10 (서열번호: 62), 순방향 프라이머 12 (서열번호: 63), 역방향 프라이머 12 (서열번호: 56), 파트자임 A14 (서열번호: 65), 파트자임 B14 (서열번호: 66), LOCS-11 (서열번호: 67)을 포함한다. 서열은 서열 목록에서 열거된다.
TFRC 증폭 및 검출에 특이적인 올리고뉴클레오티드는 기질 4, 파트자임 A6, 파트자임 B6 (MNA자임 6), 순방향 프라이머 3 및 역방향 프라이머 3이다. TPApolA 증폭 및 검출에 특이적인 올리고뉴클레오티드는 LOCS-3, 파트자임 A7, 파트자임 B7 (MNA자임 7), 순방향 프라이머 6 및 역방향 프라이머 6이다. CTcry 증폭 및 검출에 특이적인 올리고뉴클레오티드는 LOCS-4, 순방향 프라이머 1, 역방향 프라이머 1, 파트자임 A1 및 파트자임 B1 (MNA자임 1)이다. LGV 증폭 및 검출에 특이적인 올리고뉴클레오티드는 LOCS-6, 순방향 프라이머 7, 역방향 프라이머 7, 파트자임 A9 및 파트자임 B9 (MNA자임 9)이다. NGopa 증폭 및 검출에 특이적인 올리고뉴클레오티드는 LOCS-5, 순방향 프라이머 2, 역방향 프라이머 2, 파트자임 A8 및 파트자임 B8 (MNA자임 8)이다. NGporA 증폭 및 검출에 특이적인 올리고뉴클레오티드는 LOCS-7, 순방향 프라이머 8, 역방향 프라이머 8, 파트자임 A10 및 파트자임 B10 (MNA자임 10)이다. MgPa 증폭 및 검출에 특이적인 올리고뉴클레오티드는 LOCS-10, 순방향 프라이머 11, 역방향 프라이머 11, 파트자임 A13 및 파트자임 B13 (MNA자임 13)이다. TVbtub 증폭 및 검출에 특이적인 올리고뉴클레오티드는 LOCS-11, 순방향 프라이머 12, 역방향 프라이머 12, 파트자임 A14 및 파트자임 B14 (MNA자임 14)이다. HSV-1 증폭 및 검출에 특이적인 올리고뉴클레오티드는 LOCS-8, 순방향 프라이머 9, 역방향 프라이머 9, 파트자임 A11 및 파트자임 B11 (MNA자임 11)이다. HSV-2 증폭 및 검출에 특이적인 올리고뉴클레오티드는 LOCS-9, 순방향 프라이머 10, 역방향 프라이머 10, 파트자임 A12 및 파트자임 B12 (MNA자임 12)이다.
반응 조건
실시간 증폭 및 검출은 BioRad® CFX96 서모사이클러를 사용하여 20 μL의 총 반응 부피에서 수행되었다. 주기화 파라미터, 및 형광성 데이터 획득 (DA) 지점은 다음이었다: 20 초 동안 42℃ (DA), 20 초 동안 48℃ (DA), 20 초 동안 65℃ (DA), 20 초 동안 68℃ (DA) 및 2 분 동안 95℃의 I 주기 각각; 5 초 동안 95℃ 및 30 초 동안 61℃ (주기당 0.5℃ 점감)의 10 주기; 5 초 동안 95℃, 40 초 동안 52℃ 및 5 초 동안 65℃ (각 주기에서 DA)의 40 주기; 및 20 초 동안 30℃ (DA), 20 초 동안 42℃ (DA), 20 초 동안 48℃ (DA), 20 초 동안 65℃ (DA), 20 초 동안 68℃ (DA)의 1 주기 각각. 용융 곡선 파라미터는 5 초 유지 (유지중 DA)하면서 20℃에서 95℃까지 0.5℃ 점증이었다. 모든 반응은 이중으로 실행되었고 40 nM의 각 순방향 프라이머, 200 nM의 각 역방향 프라이머, 200 nM의 각 파트자임 A, 200 nM의 각 파트자임 B, 200 nM의 기질 4, 300 nM 각각의 LOCS-3, LOCS-4, LOCS-7, LOCS-8, 200 nM 각각의 LOCS-5, LOCS-6, LOCS-9, 240 nM의 LOCS-10, 120 nM의 LOCS-11, 8 mM MgCl2 (Bioline), 0.2 mM dNTPs (Bioline), 2 단위 MyTaq 폴리머라제 (Bioline) 및 1x NH4 Buffer (Bioline)를 함유하였다. 반응은 TPApolA, NGopa 및/또는 porA, gpd 및/또는 gpd3, TV-Btub 및/또는 MgPa, CTcry 및/또는 LGV 유전자에 상동인 어느 한쪽 합성 G-Block 템플레이트 (10,000 또는 40 카피)를 함유하였거나 표적 (NF H2O)을 함유하지 않았다. TPApolA-단독 반응을 제외한 모든 반응은 내인성 대조군의 역할을 하는 TFRC 유전자 표적을 갖는 인간 게놈성 DNA의 10,000 카피의 배경을 함유하였다. TFRC 유전자의 검출은 Cy5.5 채널에서 형광에서의 증가에 의해 내부 대조군으로서 (TPApolA-단독 반응을 제외한) 모든 반응에서 모니터링되었다.
결과
본 실시예에서, 2개 MNA자임 (MNA자임 6 및 7)은 1개 형광성 채널 (Cy5.5)을 사용하여 2개 표적 핵산 (TFRC 및 TPApolA 각각)을 동시에 검출 및 차별하기 위해 단일 PCR 반응에서 사용되었다. TPApolA 및/또는 TFRC의 존재 또는 부재는 종점 분석을 사용하여 Cy5.5 채널에서 검출 및 차별되었다. TPApolA는 LOCS-3의 절단 및 용융에 의해 야기된 형광에서의 증가를 통해 68℃ (D2)에 검출되었고 TFRC는 기질 4의 절단을 통해 48℃ (D1)에 검출되었다. 샘플에서 TPApolA의 존재는 절단된 및 분할된 LOCS-3에 의해 생산된 형광을 대표하는, 68℃ (D2)에 용융 피크의 존재에 의해 용융 곡선 분석에서 확증되었다. 샘플에서 TPApolA의 부재는 미절단된 LOCS-3에 의해 생산된 형광을 대표하는, 85℃에 용융 피크의 존재에 의해 용융 곡선에서 확증되었다.
본 실시예에서, 8개 추가의 표적 (채널당 2개 표적)은 용융 곡선 분석 (데이터 표시되지 않음)을 사용하여 성공적으로 증폭, 검출 및 차별되었다. TFRC 및 TPApolA가 채널 Cy5.5에서 검출 및 차별된 한편, CTcry 및 LGV는 Cy5 채널에서 검출 및 차별되었고, NGopa 및 NGporA는 FAM 채널에서 검출 및 차별되었고, MgPa 및 TVbtub는 텍사스 레드 채널에서 검출 및 차별되었고, HSV-1 및 HSV-2는 JOE 채널 (데이터 표시되지 않음)에서 검출 및 차별되었다.
도 14에서 결과는 종점 분석 (ΔSD1 및 ΔΔSD2ΔSD1, 각각)을 사용하여 온도 1 (D1) 및 온도 2 (D2)에 Cy5.5 채널에서 수득된 종점 형광성 신호에서의 차이를 실례한다. 결과는 이중 반응의 평균이고 마이크로소프트 엑셀 (버전 14)을 사용하여 플롯팅되었다. 결과는 TFRC가 샘플에서 존재하는 경우 ΔSD1이 임계값 1 (X1)을 넘지만 TPApolA 단독이 존재하는 경우 및/또는 TFRC (및 TPApolA)가 부재하는 경우 임계값을 넘지 않음을 보여준다 (도 14A). 마찬가지로, ΔΔSD2ΔSD1은 TPApolA가 샘플 내에서 존재하는 경우 임계값 2 (X2)를 넘지만 TFRC 단독이 샘플 내에서 존재하는 경우 및/또는 TPApolA (및 TFRC)가 부재하는 경우 이 임계값을 넘지 않는다 (도 14B). 그러므로, 임계값 1보다 큰 (ΔSD1 > X1) 종점 형광성 신호는 TFRC의 존재를 나타내고 임계값 2보다 큰 (ΔΔSD2ΔSD1 > X2) ΔSD2와 ΔSD1 사이 종점 형광 신호에서의 차이는 TPApolA가 반응에서 단독 또는 TFRC와 함께 존재하는지와 관계없이 TPApolA의 존재를 나타낸다.
본 실시예에서, PCR 증폭 및 종점 분석 다음은 TPApolA의 존재 또는 부재가 어느 한쪽 68℃ (분할된 LOCS) 또는 85℃ (온전한 LOCS) 각각에 LOCS 용융 피크를 기반으로 확증된 PCR후 용융 주기가 뒤따랐다. 도 15에서 도시된 결과는 TFRC의 10,000 카피 (도 15A), TPApolA의 10,000 카피 및 40 카피 (도 15B)를 함유하는 반응 및 TFRC의 10,000 카피와 TPApolA의 10,000 카피 및 TFRC의 10,000 카피 (도 15C)와 TPApolA의 40 카피를 함유하는 공감염으로부터 증폭 후 수득된 각자의 용융 곡선 시그니처를 실례한다. 결과는 TPApolA를 함유하는 모든 샘플에 대하여 그리고 표적 (NF H2O)을 함유하지 않았던 반응에 대하여 이중 반응으로부터 평균이고 TFRC 단독에 대하여 결과는 48 반복실험으로부터 평균이고, 여기에서 TFRC의 10,000 카피는 내인성 대조군으로서 사용되었다. 곡선은 마이크로소프트 엑셀 (버전 14)을 사용하여 플롯팅되었다. 결과는 TFRC 유전자 표적의 존재 하에서, 또는 표적 없이 기질 4에 의해 생산된 용융 시그니처 (Tm 85℃에 피크)가 TPApolA의 존재 하에서 또는 양쪽 TFRC 및 TPApolA의 존재 하에서 LOCS-3에 의해 생산된 용융 시그니처 (Tm 68℃에서 피크)와 구별됨을 입증한다. 결과는 표 7에서 요약된다.
Figure pct00007
본 실시예의 경우 용융 곡선이 20℃ 내지 90℃ 넓은 온도 범위에 걸쳐서 수행되었고 측정이 매 0.5도에 이루어졌어도, 이것은 LOCS 리포터를 사용하는 때 필요하지 않다. 미절단된 것 및 절단된 것의 Tm, 분할된 LOCS는 표적 농도가 달라지면서 변화하지 않으므로, 더 작은 온도 범위는 확증적 용융 곡선을 생산하기 위해 이용될 수 있다. 절단된, 분할된 LOCS-3 및 미절단된 온전한 LOCS-3의 Tm은 68℃ 및 85℃, 각각이고, 그러므로 용융 곡선 분석은 ~50℃ 내지 90℃ 실행되어 양쪽 피크를 포착할 수 있고 결과에 이르는 시간을 줄일 수 있다. 마찬가지로, 데이터 수집 지점은 예를 들어, 매 0.5℃보다는 매 1℃ 획득으로 제한되어 용융 곡선 분석을 단순화시킬 수 있고 용융 곡선을 생산하는데 필요한 시간을 이론적으로 반감시킬 수 있다. 이것은 용융 곡선 분석이 종점 분석을 지원하기 위한 확증적 도구로서 사용 중인 때 유리하다.
본 실시예는 1개 표적이 선형 MNA자임 기질을 사용하여 검출되고 다른 것이 LOCS 리포터를 사용하여 검출되는 2개 표적이 임의적 용융 곡선 분석과 종점 분석을 사용하여 2개 상이한 온도에 단일 형광성 채널에서 검출될 수 있음을 입증한다. 모든 표적 시나리오는 종점 분석을 사용하여 검출될 수 있었고 TPApolA의 존재 또는 부재는 용융 피크 시그니처에 의해 추가로 확증될 수 있었다. 본 실시예는 단일 형광성 채널에서 여러 표적을 검출하기 위한 2개 방법을 제공하고, 여기서 종점 형광 측정 방법은 결과 확증을 위하여 용융 곡선 분석과 동시에 또는 독립적으로 사용될 수 있다.
실시예 4: 1개 선형 MNA자임 기질 및 1개 LOCS 리포터를 사용하여 단일 형광성 채널에서 2개 표적의 동시 검출 및 정량화 방법.
하기 실시예는 1개 선형 MNA자임 기질 및 1개 LOCS 리포터의 조합이 PCR 동안 실시간으로 2개 온도에서 형광 판독을 획득함으로써 단일 형광성 채널에서 2개 표적의 동시 검출 및 정량화를 허용하는 접근법을 입증한다. 추가로, 본 실시예는, 샘플에서 존재한다면, 어느 한쪽 및/또는 양쪽 표적의 양을 정량화하는 방법을 기재한다.
본 실시예에서, 1개 선형 MNA자임 기질 및 1개 LOCS 리포터는 각 PCR 주기에서 2개 상이한 온도 (D1 및 D2)에 실시간으로 형광을 측정함으로써 JOE 채널에서 2개 표적 (표적 X 및 표적 Y)을 동시에 검출, 차별 및 정량화하는데 사용되었다. 검정은 표적 X가 (표적 X의 존재 하에서만 MNA자임 X에 의해 절단가능한) 선형 기질 X를 사용하여 모니터링되고, 표적 Y가 (표적 Y의 존재 하에서만 MNA자임 Y에 의해 절단가능한) LOCS-Y를 사용하여 모니터링되도록 설계된다. 추가로, 검정은 분할된 LOCS-Y가 검출 온도 (D1)보다 높은 Tm을 갖도록 설계된다.
더 낮은 검출 온도 (D1)는 절단된 선형 기질 X가 형광하도록 선택되고; 반면에 절단되지 않은 선형 기질 X, 분할된 LOCS-Y 및 온전한 LOCS-Y는 모두 퀀칭된 채로 남아있을 것이다. 더 높은 온도 (D2)는 온전한 LOCS-Y의 스템이 결합된 및 퀀칭된 채로 남아있을 것이지만 분할된 LOCS-Y의 스템이 용융 (결합)하여 증가된 형광을 초래할 것이도록 선택된다.
2개 PCR 증폭 곡선은 D1 및 D2 온도에 이루어진 형광 측정을 사용하여 플롯팅될 수 있다. 표적 X 및/또는 Y의 존재의 결정을 위한 역치는 양쪽 D1 플롯 (임계값 X)에 대하여 그리고 D2 플롯 (임계값 Y)에 대하여 설정된다. 임계값 (임계값 X 및 임계값 Y), 및 반응이 안정기로 알려지는 다양한 종점은 이전 실험을 기반으로 사전-결정될 수 있고, 여기에서 반응은 D1에 종점 X1 (EX1)에서 또는 D2에 종점 X2 (EX2)에서 단지 표적 X 안정기를 함유하고; 반응은 D2에 종점 Y1 (EY1)에서 단지 표적 Y 안정기를 함유하고, 반응은 D2에 종점 Y2 (EY2)에서 양쪽 표적 X 및 표적 Y 안정기를 함유한다. 임의로, 종점 EX1, EX2, EY1 및 EY2는 실험적 샘플과 병렬로 실행된 양성 대조군에서 유래될 수 있다.
D1 증폭 플롯과 관련하여, PCR이 임계값 X를 넘고, 임계값 X를 능가하는 종점 EX1에서 안정기에 드는 증폭 곡선을 생산한다면, 이 결과는 표적 X와 결합된 절단된 선형 기질 X의 존재를 나타낼 것이다. 표적 Y가 또한 존재하였다면, 증폭 곡선은 절단된 LOCS-Y가 D1에 형광을 생산하지 않으므로 영향받지 않아야 한다. 그러므로, 임계값 X를 넘는 증폭 곡선으로부터 수득된 Cq 값은 샘플에서 표적 X의 정량화를 허용한다.
D2 증폭 플롯과 관련하여, PCR이 임계값 Y를 넘고 어느 한쪽 EY1 또는 EY2에서 안정기에 드는 증폭 곡선을 생산한다면, 이것은 표적 Y의 존재를 나타낸다. 임계값 Y는 값 EX2 위로 설정되고, 이로써 단지 표적 X를 함유하는 반응으로부터 증폭 곡선은 이 임계값을 넘지 않는다. 양쪽 표적 X 및 Y가 존재하는 경우, 선형 기질 X 및 LOCS-Y의 절단은, 표적 Y만의 존재 하에서 절단된 LOCS-Y와 결합되는, 종점 EY1보다 큰 종점 EY2에서 안정기에 들고 임계값 Y를 넘는 증폭 곡선을 생산할 것이다. EX2 < 임계값 Y < EY1 < EY2 및 EX2 ≠ 임계값 Y ≠ EY1 ≠ EY2이므로, 증폭 곡선이 안정기에 드는 종점은 표적 X, Y 또는 양쪽의 존재를 나타낼 수 있다. 하지만, 임계값 Y를 넘는 D2 증폭 곡선으로부터 수득된 Cq 값은 양쪽 표적 X 및 Y의 양에 의해 영향받을 것이고, 그러므로 추가 데이터 조작 없이 결과는 표적 Y에 대하여 단지 절반-정량적이다. 표적 X가 또한 존재하는 샘플에서 존재하는 표적 Y의 양을 계산하기 위한 분석적 방법은 아래 기재된다.
표적 Y 정량화 방법
D1 (39℃) 및 D2 (72℃)에 절단된 선형 MNA자임 기질 X 단독으로부터 발생하는 2개 증폭 곡선은 상이한 종점, EX1 및 EX2 각각에서 동일한 효율 및 Cq 그러나 안정기를 갖는다. 그러므로, 72℃에 절단된 기질 X (SX)로부터 발생하는 형광 신호 (SXD2)는 형광 조정 인자 (FAF)를 적용함으로써 39℃에 절단된 기질 X로부터 발생하는 신호 (SXD1)를 사용하여 외삽될 수 있다. FAF는 종점 EX1 및 EX2의 비율 (FAF = EX2 / EX1)이다. 72℃에 증폭 곡선에서 총 형광 신호 (SXYD2)는, 존재한다면, 양쪽 절단된 선형 서브스테이트 X (SXD2), 및 존재한다면, 분할된 LOCS-Y (SYD2)로부터 발생하는 신호를 포함한다. 이것으로부터, LOCS-Y 단독으로부터 발생하는 72℃에 신호 (SYD2)는 하기에 의해 외삽될 수 있다:
SXYD2 = SXD2 + SYD2 = (SXD1 * FAF) + SYD2
SYD2 = SXYD2 - (SXD1 * FAF)
각 주기에서 계산된 SYD2 값으로부터 구성된 증폭 곡선으로부터 수득된 Cq 값은 그래서 표적 Y에 대하여 정량적 데이터를 제공할 수 있다. 공식은 샘플이 표적 X, Y, 양쪽 X 및 Y를 함유하든 표적이 없든 샘플에서 표적 Y의 양을 올바르게 결정하도록 적용될 수 있다.
올리고뉴클레오티드
본 실험에 대해 특이적인 올리고뉴클레오티드는 선형 MNA자임 기질 1 (SEQ ID: 13), LOCS-1 (SEQ ID: 14), 파트자임 A1 (SEQ ID: 3), 파트자임 B1 (SEQ ID: 4), 파트자임 A2 (SEQ ID: 7), 파트자임 B2 (SEQ ID: 8), 순방향 프라이머 1 (SEQ ID: 1), 역방향 프라이머 1 (SEQ ID: 2), 순방향 프라이머 2 (SEQ ID: 5) 및 역방향 프라이머 2 (SEQ ID: 6)를 포함한다. 서열은 서열 목록에서 열거된다. 표적 X (CTcry) 증폭 및 정량화에 특이적인 올리고뉴클레오티드는 기질 1, 파트자임 A1 및 B1 (MNA자임 1; MNA자임 X) 순방향 프라이머 1 및 역방향 프라이머 1이다. 표적 Y (NGopa) 증폭 및 정량화에 특이적인 올리고뉴클레오티드는 LOCS-1, 파트자임 A2 및 B2 (MNA자임 2; MNA자임 Y), 순방향 프라이머 2 및 역방향 프라이머 2이다.
반응 조건
표적 서열의 실시간 검출은 BioRad® CFX96 서모사이클러를 사용하여 20 μL의 총 반응 부피에서 수행되었다. 주기화 파라미터는 2 분 동안 95℃ 이어서 5 초 동안 95℃ 및 30 초 동안 61℃의 10 터치다운 주기 (주기당 0.5℃ 점감) 및 5 초 동안 95℃, 40 초 동안 52℃, 5 초 동안 39℃ 및 5 초 동안 72℃의 40 주기이었다 (양쪽 39℃ 및 72℃ 단계에 수집된 데이터). 모든 반응은 이중으로 실행되었고 40　nM의 각 순방향 프라이머, 200　nM의 각 역방향 프라이머, 200 nM의 각 파트자임, 100 nM의 선형 MNA자임 기질 1, 200 nM의 LOCS-1및 1x PlexMastermix (Bioline)를 함유하였다. 반응은 어느 한쪽 무 표적 (NF H2O), 합성 G-Block CTcry (20,000, 4,000, 800, 160 또는 32 카피), NGopa 유전자 (20,000, 4,000, 800, 160 또는 32 카피)의 합성 G-Block, NGopa 유전자 (20,000, 4,000, 800, 160 또는 32 카피)의 합성 G-Block의 배경에서 CTcry 유전자 (20,000, 4,000, 800, 160 또는 32 카피)의 합성 G-Block의 다양한 농도 또는 CTcry 유전자 (20,000, 4,000, 800, 160 또는 32 카피)의 합성 G-Block의 배경에서 NGopa 유전자 (20,000, 4,000, 800, 160 또는 32 카피)의 합성 G-Block의 다양한 농도를 함유하였다.
결과
PCR 동안, 2개 MNA자임 (MNA자임 1 및 MNA자임 12는 선형 MNA자임 기질 1 및 LOCS 1, 각각의 절단을 통해 실시간으로 표적 핵산의 증폭을 모니터링하는데 사용된다. MNA자임 1은 클라미디아 트라코마티스의 검출을 위하여 CTcry (표적 X)에 상동인 서열을 검출하도록 그리고 기질 1을 절단하도록 설계되었다. MNA자임 2는 임균의 검출을 위하여 NGopa (표적 Y)에 상동인 서열을 검출하도록 그리고 LOCS-1을 절단 및 분할하도록 설계되었다.
도 16에서 도시된 결과는 39℃ (D1) (도 16a) 및 72℃ (D2) (도 16b), 각각에 측정된, 어느 한쪽 CTcry 또는 NGopa의 20,000 카피 또는 양쪽 유전자 표적의 20,000 카피를 함유하는 반응으로부터 JOE 채널에서 수득된 비교 증폭 곡선을 실례한다. 증폭 곡선은 이중 반응으로부터 평균이고 마이크로소프트 엑셀 (버전 14)을 사용하여 플롯팅되었다. Cq 값은 D1 (39℃) 및 D2 (68℃) 각각에 대하여 400 RFU 및 500 RFU에서 설정된 단일 임계값 방법을 사용하여 결정되었다 (Baseline Subtracted Curve Fit). 39℃에, CTcry 템플레이트의 20,000 카피 (흑색 실선)를 함유하는 샘플은 임계값 X (흑색 수평선)를 능가하고 종점 (EX1) (EX1로서 표시된 흑색 수평선)에 도달하는 형광 수준이 있는 증폭 곡선을 보여준다. 39℃에, 양쪽 CTcry 및 NGopa 템플레이트의 20,000 카피 (회색 실선)를 함유하는 샘플은 임계값 X를 능가하고 EX1에 도달하는 형광 수준이 있는 증폭 곡선을 또한 보여준다. 39℃에, NGopa 템플레이트만 (흑색 파선)을 함유하는 또는 CTcry 템플레이트 (NTC; 회색 파선)를 함유하지 않는 샘플은 임계값 X를 능가하지 않고 EX1에 도달하지 않는다. 그러므로, EX1에서 안정기에 드는 39℃에 증폭 곡선은 샘플에서 CTcry의 존재를 확증한다. 그래프는 CTcry만의 20,000 카피 (흑색 실선) 및 양쪽 CTcry 및 NGopa의 20,000 카피 (회색 실선)를 함유하는 샘플이 비슷한 Cq 값을 가짐을 보여준다. NGopa만 (흑색 파선), 또는 무 표적 (회색 파선)을 함유하는 반응은 PCR 동안 형광에서의 증가를 보여주지 않았다.
39℃에 Cq 값이 NGopa의 존재에 의해 영향받지 않으므로, 샘플에서 CTcry의 양의 정량화에 사용될 수 있다. NGopa 유전자 표적의 0, 32, 160, 800, 4,000 및 20,000 카피와 함께 CTcry의 0, 32, 160, 800, 4,000 및 20,000 카피의 모든 조합의 샘플에서 CTcry의 정량화에 대한 결과는 N/A가 39℃에 결정된 Cq 값이 없고 그러므로 샘플에서 존재하는 CTcry가 없는 경우를 지칭하는 표 8에서 요약된다.
Figure pct00008
도 16B는 임계값 Y (흑색 수평선)를 능가하고 제1 종점 Y (EY1) (EY1로서 표시된 흑색 수평선)에서 안정기에 드는 형광 수준이 있는 NGopa 템플레이트의 20,000 카피 (흑색 점선)를 함유하는 샘플에 대하여 72℃에 증폭 곡선을 도시한다. 72℃에, 양쪽 CTcry 및 NGopa의 20,000 카피 (회색 실선)를 함유하는 샘플은 임계값 Y를 능가하고 제2 종점 Y (EY2) (EY2로서 표시된 흑색 수평선)에서 안정기에 드는 형광 수준이 있는 증폭 곡선을 보여준다. 72℃에, NGopa 템플레이트 (흑색 실선)를 함유하지 않지만 CTcry를 함유하는 샘플은 임계값 Y를 능가하지 않고 EY1 및 EY2에 도달하지 않지만, 대신에 종점 EX2 (종점 EX2로서 표시된 흑색 수평선)에서 안정기에 든다. 72℃에, 어느 한쪽 NGopa 또는 CTcry 템플레이트 (NTC; 회색 파선)를 함유하지 않는 샘플은 임의의 증폭 곡선을 보여주지 않고 그러므로 임계값 Y를 능가하지 않고 EY1 및 EY2에 도달하지 않는다. 그러므로, EX2에서 안정기에 드는 72℃에 증폭 곡선은 표적 CTcry의 존재를 확증하지만, 샘플에서 NGopa를 확증하지 않고; EY1에서 안정기에 들기는 NGopa의 존재를 확증하지만, 샘플에서 CTcry를 확증하지 않고; EY2에서 안정기에 들기는 샘플에서 양쪽 CTcry 및 NGopa의 존재를 확증한다.
72℃에, 양쪽 CTcry 및 NGopa의 20,000 카피 (회색 실선)를 함유하는 샘플의 Cq 값은 NGopa 템플레이트만의 20,000 카피 (흑색 파선)를 함유하는 샘플의 Cq 값과 동일하지 않다. 그러므로, 정규화 없이 72℃에 Cq 값의 사용은 CTcry가 또한 존재하는 경우 샘플에서 NGopa의 농도를 정확하게 결정하는데 사용될 수 없다.
도 17에서 도시된 결과는 39℃ (도 17A, 17D 및 17G) 및 72℃ (도 17B, 17E 및 17H) 각각에 측정된, CTcry의 0, 32 및 20,000 카피 및 NGopa 유전자 표적의 0, 32 및 20,000 카피의 모든 가능한 조합을 함유하는 반응으로부터 JOE 채널에서 수득된 비교 증폭 곡선을 실례한다. 결과는 이중 반응으로부터 평균으로서 플롯팅되고 마이크로소프트 엑셀 (버전 14)을 사용하여 플롯팅되었다. Cq 값은 D1 (39℃) 및 D2 (72℃) 각각에 대하여 400 RFU 및 500 RFU에서 설정된 단일 임계값 방법을 사용하여 결정되었다 (Baseline Subtracted Curve Fit). CTcry의 20,000 카피를 함유하는 샘플은 흑색 파선으로 제시되고, CTcry의 32 카피를 함유하는 샘플은 회색 실선으로 제시되고 CTcry의 0 카피를 함유하는 샘플은 흑색 실선으로 제시된다.
도 17A, 17D 및 17G는 20,000 카피 (도 17A), 32 카피 (도 17D) 또는 무 카피 (도 17G)에서 NGopa (흑색 실선)를 함유하는 반응에 대하여 39℃ (D1)에 형광을 도시한다. 결과는 NGopa (도 17A & 17D)의 존재 하에서 39℃에 신호에서의 증가가 없음 그리고 신호가 NGopa 또는 CTry (NTC; 도 17G)를 함유하지 않는 반응과 비슷함을 도시하여서, 39℃ (D1)에 실시간 검출이 샘플에서 CTcry의 존재 결정하기에 사용될 수 있음을 입증한다.
도 17B, 17E 및 17H는 20,000 카피 (도 17B), 32 카피 (도 17E) 또는 무 카피 (도 17H)에서 NGopa (흑색 실선)를 함유하는 반응에 대하여 74℃ (D2)에 형광을 도시한다. 결과는 CTcry의 20,00 카피 (흑색 파선) 또는 32 카피 (회색 선)가 샘플 내에서 존재하는 경우 비-정규화된 NGopa 증폭 곡선 (도 17B 및 17E)이 시프트됨을 보여준다.
도 17C, 17F 및 17I는 20,000 카피 (도 17C), 32 카피 (도 17F) 또는 무 카피 (도 17I)에서 NGopa (흑색 실선)를 함유하는 반응에 대하여 FAF로 정규화 후 74℃ (D2)에 형광을 도시한다. 결과는 72℃ (D2)에 정규화된 증폭 곡선이 동일한 수의 NGopa 템플레이트가 샘플에서 CTcry의 양과 관계없이 존재하는 경우 유사한 Cq 값을 표시함을 보여준다 (도 17C 및 17F). 도 17I는 샘플이 임의의 NGopa 템플레이트를 함유하지 않는 경우 72℃에 외삽된 증폭 곡선이 임의의 유의미한 증폭을 보여주지 않음을 입증한다. 상기언급된 FAF 정규화 방법의 효과는, SYD2 = SXYD2 - SxD2FAF으로 뺄셈에 의해 정규화하기 후 CTcry의 0, 32, 160, 800, 4,000 및 20,000 카피 및 NGopa 유전자 표적의 0, 32, 160, 800, 4,000 및 20,000 카피의 모든 조합의 샘플의 72℃ (D2)에 증폭의 분석인, 표 9 (SYD2= SXYD2 - SxD2FAF인 경우 SYD2 Cq 값) 및 표 10 (SYD2= SXYD2 - SxD2FAF 정규화 후 NGopa의 정량화)에서 추가로 입증된다. 해당 없음 (N/A)은 72℃에 결정된 Cq 값이 없고 그러므로 샘플에서 존재하는 NGopa가 없는 경우이다.
Figure pct00009
Figure pct00010
이론적 실시예 5: 분자성 비콘 및 LOCS의 조합을 사용하여 단일 파장에서 여러 표적의 검출 및 구별.
비-절단가능한 분자성 비콘은, MNA자임에 의해 절단가능한, LOCS 프로브와 조합되어 여러 표적을 단일 파장에서 검출 및 구별할 수 있다. 도 5에서 실례된 대로, 양쪽 분자성 비콘 및 LOCS 프로브는 동일한 검출 모이어티, 예를 들어 동일한 형광단으로 표지될 수 있다. 분자성 비콘은 Tm A가 있는 스템 영역 그리고 Tm B가 있는 제1 표적 1과 특이적으로 혼성화할 수 있는 루프 영역을 가질 수 있고; 여기에서 Tm B는 Tm A보다 크다 (Tm B > Tm A). 이것은 Tm C가 있는 스템 영역 그리고 제2 표적 2 존재 하에서 MNA자임에 의해 절단되어서, Tm D가 있는 분할된 LOCS를 생성할 수 있는 루프 영역을 가질 수 있는 온전한 LOCS 프로브와 조합될 수 있고; 여기에서 Tm D는 Tm C보다 적다 (Tm D < Tm C). 표적 1 및/또는 표적 2의 존재는 어느 한쪽 실시간으로; 또는 어느 한쪽 증폭의 시작에서, 또는 근처에서 및 증폭 이후 획득된 단일 측정을 사용하여 2개 온도 (D1 및 D2)에 형광을 측정함으로써 구별될 수 있다. 종점에 대한 옵션, 또는 형광성 출력의 실시간 측정, 및 결과의 해석을 위한 전략은 서로에 관련하여, 그리고 D1 및 D2에 관하여 Tm A, Tm B, Tm C, Tm D의 상대 온도에 의존적이다.
하기 시나리오는 분자성 비콘 및 LOCS에 대하여 예시적 Tm, 및 시나리오 1 - 4를 위한 획득 온도를, 기대된 성과와 함께 제공하는 표 1에서 요약된다.
시나리오 1
제1 프로토콜에서, Tm A는 65℃일 수 있고, Tm B는 70℃일 수 있고, Tm C는 65℃일 수 있고 Tm D는 55℃일 수 있다 (Tm A > Tm D 및 Tm B > Tm C, Tm B > Tm D). PCR 증폭은 표적 1 및/또는 표적 2를, 존재한다면, 증폭시키기 위해 수행될 수 있고 형광 측정은 증폭의 시작에서 또는 근처에서 그리고 재차 증폭 이후 2개 온도에서 이루어질 수 있다. 표적 1 및/또는 표적 2의 존재 하에서, Tm A, Tm B 및 Tm D보다 적은 (D1 < Tm A, D1 < Tm B, D1 < Tm D), 제1 온도 (D1 50℃)에 형광에서의 증가는 표적 1만의 존재를 나타낼 것이다. 이 온도에서, 분자성 비콘은 표적 1에 대한 혼성화에 반응하여 형광할 것이거나 이의 부재에서 퀀칭될 것이고 내부적으로 혼성화된 스템을 유지할 것이다. 동일한 온도 D1에서, 양쪽 온전한 및/또는 분할된 LOCS 종은, 반응에서 어느 한쪽 표적 1 또는 표적 2의 존재 또는 부재와 관계없이, 이 온도에서 그들의 각자의 스템의 혼성화로 인해 퀀칭될 것이다. 추가로, 양쪽 제1 온도 D1 및 Tm D보다 크지만, 양쪽 Tm B 및 Tm C보다 적은 (D2 > D1, D2 > Tm D, D2 < Tm B, D2 < Tm C) 제2 온도 (D2 60℃)에 형광에서의 증가는 표적 1 및/또는 표적 2의 존재를 나타낼 것이다. 이 제2 온도에서 분자성 비콘은 표적 1에 대한 혼성화에 반응하여 형광할 것이거나 표적 1의 부재 하에서 퀀칭될 것이고 내부적으로 혼성화된 스템을 유지할 것이다. 분자성 비콘은 표적 2의 존재 또는 부재에 의해 영향받지 않을 것이다. 추가적으로, D2에 표적 2가 부재이었다면, LOCS 프로브는 온전한 및 퀀칭된 채로 남아있을 것이다. 표적 2가 존재하였다면, 표적 2에 특이적인 MNA자임에 의한 절단이 이 온도에서 해리하는 스템 영역이 있는 분할된 LOCS를 생성할 것이므로 형광은 증가할 것이다. 이와 같이, 온도 1에 관찰된 형광에서의 증가보다 큰 PCR 동안 온도 2에 형광에서의 증가는 표적 2의 존재를 나타낼 것이다 (ΔF D2 > ΔF D1).
시나리오 2
제2 프로토콜에서, Tm A는 60℃일 수 있고, Tm B는 70℃일 수 있고, Tm C는 70℃일 수 있고 Tm D는 60℃일 수 있다 (Tm A
Figure pct00011
Tm D, Tm B
Figure pct00012
Tm C, 및 Tm B > Tm D). PCR 증폭은 표적 1 및/또는 표적 2를 존재한다면 동시에 증폭시키기 위해 수행될 수 있고 형광 측정은 어느 한쪽 실시간으로, 또는 증폭의 시작에서/근처에서 그리고 재차 증폭 이후 2개 온도에서 이루어질 수 있다. 표적 1 및/또는 표적 2의 존재 하에서, Tm A, Tm B 및 Tm D보다 적은 (D1< Tm A, D1< Tm B, D1> Tm D), 제1 온도 (D1 500C)에 형광에서의 증가는 표적 1만의 존재를 나타낼 것이다. 이 온도에서, 분자성 비콘은 표적 1에 대한 혼성화에 반응하여 형광할 것이거나 이의 부재에서 퀀칭될 것이고 내부적으로 혼성화된 스템을 유지할 것이다. 동일한 온도 D1에서, 양쪽 온전한 및/또는 분할된 LOCS 종은, 반응에서 어느 한쪽 표적 1 또는 표적 2의 존재 또는 부재와 관계없이, 이 온도에서 그들의 각자의 스템의 혼성화로 인해 퀀칭될 것이다. 추가로, 양쪽 제1 온도 D1 및 Tm A 및 Tm D보다 크지만, Tm B 및 Tm C보다 적은 (D2 > D1, D2 > Tm A, D2 > Tm B, D2 > Tm C, D2 < Tm D) 제2 온도 (D2 65℃)에 형광에서의 증가는 표적 1 및/또는 표적 2의 존재를 나타낼 것이다. 이 제2 온도에서 분자성 비콘은 표적 1에 대한 혼성화에 반응하여 형광할 것이거나 반응에서 표적 2의 존재 또는 부재와 관계없이 이 온도에서 이의 스템의 해리로 인해 형광성일 것이다. 이와 같이, 분자성 비콘의 형광은 증폭 이전, 동안 및 이후 이 온도에서 배경 형광 수준을 제공할 것이다. 추가적으로, D2에 표적 2가 부재하였다면, LOCS 프로브는 온전한 및 퀀칭된 채로 남아있을 것이다. 표적 2가 존재하였다면, 표적 2에 특이적인 MNA자임에 의한 절단이 이 온도에서 해리된 스템 영역이 있는 분할된 LOCS를 생성할 것이므로 형광은 PCR 동안 배경 수준 위에 증가할 것이다. 이와 같이, PCR 동안 온도 2에 형광에서의 증가는 표적 2의 존재를 나타낼 것이다. 전반적으로, PCR 동안 D1에 형광의 증가는 분자성 비콘에 의해 검출된 표적 1의 존재를 나타내고 D2에 PCR 동안 형광의 증가는 LOCS 프로브에 의해 검출된 표적 2의 존재를 나타낸다.
시나리오 3
제3 프로토콜에서, Tm A는 600C일 수 있고, Tm B는 700C일 수 있고, Tm C는 800C일 수 있고 Tm D는 700C일 수 있다 (Tm A < Tm D, Tm A < Tm C 및 Tm B ~ Tm D). PCR 증폭은 표적 1 및/또는 표적 2를 존재한다면 증폭시키기 위해 수행될 수 있고 형광 측정은 어느 한쪽 실시간으로; 또는 증폭의 시작에서/근처에서 그리고 재차 증폭 이후 2개 온도에서 이루어질 수 있다. 표적 1 및/또는 표적 2의 존재 하에서, Tm A 및 Tm B 및 Tm C 및 Tm D보다 적은 (D1< Tm A, D1< Tm B, D1< Tm C, D1 <Tm D), 제1 온도 (D1 500C)에 형광에서의 증가는 표적 1만의 존재를 나타낼 것이다. 이 온도에서, 분자성 비콘은 표적 1에 대한 혼성화에 반응하여 형광할 것이거나 이의 부재에서 퀀칭될 것이고 내부적으로 혼성화된 스템을 유지할 것이다. 동일한 온도 D1에서, 양쪽 온전한 및/또는 분할된 LOCS 종은, 반응에서 어느 한쪽 표적 1 또는 표적 2의 존재 또는 부재와 관계없이, 이 온도에서 그들의 각자의 스템의 혼성화로 인해 퀀칭될 것이다. 추가로, 양쪽 제1 온도 D1 및 Tm A, 및 Tm B 및 Tm D보다 크지만 Tm C보다 적은 (D2 > D1, D2 > Tm A, D2 > Tm B, D2 > Tm D, D2 < Tm C) 제2 온도 (D2 750C)에 형광에서의 증가는 표적 2의 존재를 나타낼 것이다. 이 제2 온도에서 분자성 비콘은 표적 1에 혼성화할 수 없을 것이지만 반응에서 어느 한쪽 표적 1 또는 표적 2의 존재 또는 부재와 관계없이 이 온도에서 이의 스템의 해리로 인해 형광할 것이다. 이와 같이, 분자성 비콘의 형광은 증폭 이전, 동안 및 이후 이 온도에서 배경 형광 수준을 제공할 것이다. 추가적으로, D2에 표적 2가 부재하였다면, LOCS 프로브는 온전한 및 퀀칭된 채로 남아있을 것이다. 표적 2가 존재하였다면, 표적 2에 특이적인 MNA자임에 의한 절단이 이 온도에서 해리된 스템 영역이 있는 분할된 LOCS를 생성할 것이므로 형광은 PCR 동안 배경 수준 위에 증가할 것이다. 이와 같이, PCR 동안 온도 2에 형광에서의 증가는 표적 2의 존재를 나타낼 것이다. 전반적으로, PCR 동안 D1에 형광의 증가는 분자성 비콘에 의해 검출된 표적 1의 존재를 나타내고 D2에 PCR 동안 형광의 증가는 LOCS 프로브에 의해 검출된 표적 2의 존재를 나타낸다.
시나리오 2처럼 본 구현예는 여러 온도에서 측정을 이용하는 당업계에서 알려진 다른 방법보다 주요 이점을 제공한다. 본 특정 구현예는 복합 PCR후 분석에 대하여 필요를 부정하는 방법에서 분자성 비콘 및 LOCS 프로브를 조합한다. 양식은 제1 온도에서 생성된 제1 증폭 곡선으로부터 제1 표적의 직접 정량화 그리고 제2 온도에서 생성된 제2 증폭 곡선으로부터 제2 표적의 직접 정량화를 허용한다.
시나리오 4
제4 프로토콜에서, Tm A는 75℃일 수 있고, Tm B는 80℃일 수 있고, Tm C는 65℃일 수 있고 Tm D는 55℃일 수 있다 (Tm A > Tm C, Tm A > Tm D 및 Tm B > Tm C). PCR 증폭은 표적 1 및/또는 표적 2를 존재한다면 증폭시키기 위해 수행될 수 있고 형광 측정은 증폭의 시작에서/근처에서 그리고 재차 증폭 이후 2개 온도에서 이루어질 수 있다. 표적 1 및/또는 표적 2의 존재 하에서, Tm A 및 Tm B보다 적지만 Tm C 및 Tm D보다 큰 (D1 < Tm A, D1 < Tm B, D1 > Tm C, D1 > Tm D), 제1 온도 (D1 70℃)에 형광에서의 증가는 표적 1의 존재를 나타낼 수 있다. 이 온도에서, 분자성 비콘은 표적 1의 혼성화에 반응하여 형광할 것이거나 표적 1의 부재 하에서 퀀칭될 것이고 내부적으로 혼성화된 스템을 유지할 것이다. 동일한 온도 D1에서, 양쪽 온전한 및/또는 분할된 LOCS는 이 온도에서 그들의 각자의 스템 영역의 해리로 인해 형광할 것이다. 추가로, Tm D보다 크지만, 제1 온도, Tm A, Tm B 및 Tm C보다 적은 (D2 < D1, D2 < Tm A D2 < Tm B, D2 < Tm C, D2 > Tm D), 제2 온도 (D2 60℃)에 형광에서의 증가는 표적 1 및/또는 표적 2의 존재를 나타낼 것이다. 이 제2 온도에서, 온전한 LOCS 종은 이 온도에서 이의 스템의 혼성화로 인해 퀀칭될 것이다. 표적 2가 존재하였다면, 표적 2에 특이적인 MNA자임에 의한 절단이 이 온도에서 해리된 스템 영역이 있는 분할된 LOCS를 생성할 것이므로 형광은 PCR 동안 증가할 것이다. 분자성 비콘은 표적 1의 존재 하에서 표적 1의 혼성화에 반응하여 이 온도에서 형광할 것이거나 표적 1의 부재 하에서 퀀칭될 것이고 내부적으로 혼성화된 스템을 유지할 것이다. 분자성 비콘은 표적 2의 존재 또는 부재에 의해 영향받지 않을 것이다. 이와 같이, 온도 1에 형광에서 관찰된 증가보다 큰 PCR 동안 온도 2에 형광에서 관찰된 증가 (ΔSD2 > ΔSD1)는 표적 2의 존재를 나타낼 것이다.
실시예 6: 1개 표적의 동시 실시간 정량화 및 제2 표적의 정성적 종점 검출, 또는 채널당 2개 표적의 동시 정성적 종점 분석 어느 한쪽을 허용하는 양식으로 1개 TaqMan 프로브 및 1개 LOCS 프로브를 사용하여 단일 파장에서 여러 표적의 분석 방법.
하기 실시예는 1개 TaqMan 프로브 및 1개 LOCS 리포터가 용융 곡선 분석에 대한 필요 없이 단일 형광성 채널에서 1개 표적 (GAPDH)의 Cq 결정과 2개 유전자 표적 (GAPDH 및 MgPa)의 검출 및 차별에 함께 사용되는 접근법을 입증한다. 검정은 GAPDH 유전자가 TaqMan 프로브를 사용하여 실시간으로 검출될 수 있고, MgPa 유전자가 LOCS 리포터를 사용하여 종점에서 검출 및 차별될 수 있도록 설계된다.
PCR 동안, TaqMan 프로브는 GAPDH의 존재 하에서 절단되어 형광단 및 퀀처를 분리시켜 넓은 범위의 온도에 걸쳐서 검출될 수 있는 신호에서의 증가를 생산한다. 본 실시예에서, GAPDH의 실시간 검출 및 Cq 결정은 온도 1 (52℃)에 PCR 동안 각 주기에서 형광을 획득함으로써 달성된다. 양쪽 온전한 및 분할된 구성에서 LOCS 프로브의 스템은 온도 1 (52℃)보다 높은 용융 온도 (Tm)를 갖고 그러므로 LOCS 리포터는 샘플에서 MgPa의 존재 또는 부재와 관계없이 온도 1에 신호를 제공하지 않는다.
MgPa의 존재 하에서, MNA자임 5는 PCR 동안 LOCS 프로브를 절단시킬 수 있다. MgPa의 정성적 검출은 양쪽 증폭 이전 및 이후 더 높은 온도 2 (70℃)에 형광을 측정함으로써 달성된다. 온전한 LOCS 스템의 Tm이 온도 2보다 높고 (Tm >70℃) 분할된 LOCS의 스템의 Tm이 온도 2보다 낮으므로 (Tm < 70℃), 형광에서의 증가는 분할된 및 해리된 LOCS와 결합되고 MgPa의 존재를 나타낸다. 형광에서 이 증가는 MgPa 표적의 존재를 나타내는 것으로 간주되도록 이 온도에서 분해된 TaqMan 프로브에 의해 야기된 임의의 배경 형광 위이어야 한다.
본 실시예는 단일 형광성 채널 (FAM)에서 제2 표적의 정성적 별개 온도 검출과 제1 표적의 혼합된 정량적 실시간 측정을 입증한다. 추가로, 본 실시예는 실시예 1에서 설명된 대로 종점 분석 방법 1 내지 3을 사용하여 별개 형광 측정의 측정에 의해 동일한 2개 표적의 정성적 분석을 입증한다.
올리고뉴클레오티드
본 실험에 대해 특이적인 올리고뉴클레오티드는, MgPa의 증폭 및 검출에 특이적인, 순방향 프라이머 5 (서열번호: 20), 역방향 프라이머 5 (서열번호: 21), 파트자임 A5 (서열번호: 22), 파트자임 B5 (서열번호: 23), LOCS-2 (서열번호: 25)를 포함한다. GAPDH의 증폭 및 검출에 특이적인 올리고뉴클레오티드는 독점적 TaqMan™ Gene Expression Assay (FAM) Human GAPDH (Applied Biosystems) 내에서 포함된다.
반응 조건
실시간 증폭 및 검출은 BioRad® CFX96 서모사이클러를 사용하여 20 μL의 총 반응 부피에서 수행되었다. 주기화 파라미터, 및 형광성 데이터 획득 (DA) 지점은 다음이었다: 2 분 동안 95℃, 15 초 동안 52℃ (DA), 15 초 동안 70℃ (DA)의 1 주기; 5 초 동안 95℃ 및 30 초 동안 61℃의 10 주기 (주기당 0.5℃ 점감); 5 초 동안 95℃ 및 40 초 동안 52℃의 40 주기 (52℃에 각 주기에서 DA); 및 15 초 동안 70℃의 1 주기 (DA). 모든 반응은 삼중으로 실행되었고 40 nM의 순방향 프라이머 5, 200 nM의 역방향 프라이머 5, 200 nM의 파트자임 A5, 200 nM의 파트자임 B5, 300 nM LOCS-2, 1x TaqMan™ Gene Expression Assay (FAM) Human GAPDH (Applied Biosystems), 및 1x SensiFast Buffer (Bioline)를 함유하였다. 반응은 어느 한쪽 무 표적 (NF H2O), 또는 인간 게놈성 DNA (10,000 또는 100 카피), 또는 MgPa 유전자의 한 영역을 함유하는 합성 G-Block (10,000 또는 100 카피), 또는 양쪽 인간 게놈성 DNA 및 합성 MgPa G-Block (10,000 또는 100 카피 각각)을 함유하였다.
결과
본 실시예에서, 1개 TaqMan 프로브, 및 MNA자임 5에 의해 절단가능한 1개 LOCS 프로브는 단지 단일 형광성 채널 (FAM)을 사용하여 2개 표적 GAPDH 및 MgPa 각각을 동시에 검출 및 차별하기 위해 단일 PCR 반응에서 조합되었다. GAPDH 유전자의 존재는 FAM 채널에서 52℃에 형광 신호에서의 증가에 의해 실시간으로 검출되었고 PCR 주기화 이전 및 이후 52℃에 별개 시점에서 형광의 분석에 의해 또한 검출되었다. MgPa의 존재는 동일한 채널에서 PCR 주기화 이전 및 이후 70℃에 별개 시점에서 형광의 분석을 통해서 LOCS-2의 절단을 모니터링함으로써 검출되었다.
도 18A에서 도시된 결과는 인간 GAPDH 템플레이트 단독의 10,000 (회색 선) 및 100 (파선) 카피 (도　18A); MgPa 단독의 10,000 (회색 선) 및 100 (파선) 카피 (도 18B); 및 인간 GAPDH 및 MgPa 템플레이트의 10,000 (회색 선) 및 100 (파선) 카피 각각 (도 18C)을 함유하는 반응 혼합물로부터 52℃의 획득 온도에 FAM 채널에서 수득된 PCR 증폭 곡선을 실례한다. 무 표적 대조군 (NF H2O)은 도 18A 내지 C (흑색 실선)에서 도시된다.
상기 반응으로부터 수득된 Cq 값은 표 11에서 나타나고, 여기에서 해당 없음 (N/A)은, 인간 GAPDH의 부재와 일치하는, 52℃에 결정된 Cq 값이 없는 경우를 지칭한다. Cq 값은 200 RFU에서 단일 역치를 사용하여 결정되었다. 결과는 인간 GAPDH에 대하여 Cq 값이 MgPa의 존재 또는 부재와 관계없이 비슷함을 나타낸다. 그러므로, FAM 채널에서 수득된 Cq 값은 샘플에서 인간 GAPDH의 직접 정량적 분석에 사용될 수 있다.
Figure pct00013
도 19에서 결과는 FAM 채널에서 GAPDH 및 MgPa 유전자의 정성적 검출의 결과를 실례한다. 종점 분석 방법 1에 대한 결과는, 2개 상이한 온도에 수득된 형광성 신호에서의 변화를 실례하는 도　19A에 있다. (52℃에 측정된) ΔSD1은 흑색 및 백색 패턴으로 표시되고 (70℃에 측정된) ΔSD2는 회색으로 표시된다. 결과는 GAPDH가 반응에서 존재하는 경우 ΔSD1이 임계값 X1을 넘지만 GAPDH가 부재하는 경우 임계값을 넘지 않음을 나타낸다. 그러므로, 임계값 X1보다 큰 ΔSD1은 GAPDH의 존재를 나타낸다. 결과는 또한 MgPa가 존재하는 경우, ΔSD2가 임계값 X1을 넘고, 반응에서 ΔSD1보다 큼 (ΔSD2 > ΔSD1)을 보여준다.
도 19B에서 결과는 MgPa만의 검출을 위하여 종점 분석 방법 2 (ΔΔSD2ΔSD1)를 사용하여 온도 2 및 온도 1에 FAM 채널에서 수득된 형광성 신호에서의 차이를 실례한다. 결과는 MgPa가 반응 내에서 존재하는 경우 ΔΔSD2ΔSD1이 임계값 X2를 넘지만 MgPa가 샘플로부터 부재인 경우 이 임계값을 넘지 않음을 보여준다. 그러므로, 임계값 X2보다 큰 ΔΔSD2ΔSD1은 MgPa의 존재를 나타낸다.
도 19C 및 19D에서 결과는 종점 분석 방법 3을 사용하여 2개 상이한 온도에 FAM 채널에서 수득된 형광성 신호에서의 변화를 실례한다. 도　19C에서, ΔSD2가 임계값 X1보다 큰 경우, 이는 GAPDH 및/또는 MgPa가 반응에서 존재함을 나타낸다. ΔSD2가 임계값 X1보다 낮은 경우, 이는 GAPDH도 MgPa도 반응에서 존재하지 않음을 나타낸다. 도 19D는 비율 ΔSD1:ΔSD2가 표적이 반응에서 존재함을 나타내는데 사용될 수 있음을 보여준다. 비율이 임계값 R1보다 높은 경우, 이는 GAPDH가 존재하지만 MgPa가 존재하지 않음을 나타낸다. 비율이 임계값 R2보다 낮은 경우, 이는 MgPa가 존재하지만 GAPDH가 존재하지 않음을 나타낸다. 비율이 임계값 R1과 R2 사이인 경우, 이는 양쪽 GAPDH 및 MgPa가 존재함을 나타낸다. GAPDH도 MgPa도 (도 19C로부터 결정된) 반응에서 존재하지 않는 경우, 비율의 계산에 대하여 필요는 부정되고 도 19D에서 도시된 대로 N/A로서 표시된다.
전반적으로, 본 실시예는, 1개 TaqMan 프로브 및 1개 LOCS 프로브 각각을 사용하여, 1개 표적이 정량화될 수 있고, 다른 표적이 종점에서 검출될 수 있는 2개 상이한 온도에 단일 형광성 채널에서 2개 표적이 검출될 수 있음을 입증한다. 이 간단한 방법은 용융 곡선 분석을 요구하지 않는다. 본 실시예는 또한 정성적 데이터가 여러 별개 온도에 PCR전 및 PCR후 형광 값의 비교에 의해 단일 파장에서 여러 표적에 대하여 수득될 수 있음 그리고 몇몇 대안적 방법이 이 데이터의 분석에 적용될 수 있음을 입증한다. 본 실시예는 추가 이점, 즉 다른 기술 예컨대 TaqMan 프로브를 사용하여 기존의 상업적 키트와 하나 이상의 LOCS 프로브를 조합시키고 그래서 그들의 다중화 능력을 확장시키는 능력을 입증한다.
실시예 7: 분자성 비콘 및 LOCS의 조합을 사용하여 단일 파장에서 2개 표적의 실시간 검출 및 정량화.
하기 실시예는 1개 비-절단가능한 분자성 비콘 및 1개 LOCS 리포터의 조합이 PCR 동안 실시간으로 2개 온도에서 형광 판독을 획득함으로써 단일 형광성 채널에서 2개 표적의 동시 검출 및 정량화를 허용하는 접근법을 입증한다. 이 전략은 실시예 4에서 입증된 대로 전문화된 증폭후 분석 방법에 대하여 요건을 제거한다. 도 5에서 실례된 대로, 양쪽 분자성 비콘 및 LOCS 프로브는 동일한 형광 채널에서 동시 검출을 위하여 동일한 형광단 및 퀀처 모이어티로 표지된다. 분자성 비콘은 Tm A가 있는 스템 영역 및 표적 1 (TVbtub)과 특이적으로 혼성화할 수 있는 Tm B가 있는 루프 영역을 함유하고; 여기에서 Tm B는 Tm A보다 크다 (Tm B > Tm A). 본 실시예에서, 온전한 LOCS 프로브는 Tm C (82℃)가 있는 스템 영역 및, 제2 표적 2 (MgPa) 존재 하에서 MNA자임에 의해 절단된 때, Tm D (62℃)가 있는 분할된 LOCS를 생성하는 루프 영역을 갖고; 여기에서 Tm D는 Tm C보다 적다 (Tm D < Tm C). 표적 1 (TVbtub) 및/또는 표적 2 (MgPa)의 존재는 어느 한쪽 각 PCR 주기 후 실시간으로; 또는 어느 한쪽 증폭의 시작에서, 또는 근처에서 및 증폭 이후 획득된 단일 측정을 사용하여 2개 온도 (D1 및 D2; 52℃ 및 74℃)에서 형광을 측정함으로써 구별될 수 있다. 하기 실시예에서, D1 < Tm A < Tm B < D2 및 D1 < Tm D < D2 < Tm C인 실시예 5에서 기재된 시나리오 3과 일치하는 Tm A는 ~60℃이고, Tm B는 ~68℃이고, Tm C는 ~82℃이고 Tm D는 ~62℃이다.
올리고뉴클레오티드
본 실험에 대해 특이적인 올리고뉴클레오티드는 표적 1 (TVbtub)의 증폭 및 정량화를 위하여 순방향 프라이머 12 (SEQ ID: 63), 역방향 프라이머 12 (SEQ ID: 64) 및 분자성 비콘 1 (SEQ ID: 68). 표적 2 (MgPa)의 증폭 및 정량화를 위하여 순방향 프라이머 5 (SEQ ID: 20) 및 역방향 프라이머 5 (SEQ ID: 21), 파트자임 A5 (SEQ ID: 22), 파트자임 B5 (SEQ ID: 23) 및 LOCS-2 (SEQ ID: 25)를 포함한다. 서열은 서열 목록에서 열거된다.
반응 조건
표적 서열의 실시간 검출은 BioRad® CFX96 서모사이클러를 사용하여 20 μL의 총 반응 부피에서 수행되었다. 주기화 파라미터는 2 분 동안 95℃, 15 초 동안 52℃, 15 초 동안 74℃ (52℃ 및 74℃ 단계에서 수집된 데이터), 이어서 5 초 동안 95℃ 및 30 초 동안 61℃의 10 터치다운 주기 (주기당 0.5℃ 점감) 및 5 초 동안 95℃, 40 초 동안 52℃, 및 5 초 동안 74℃ (양쪽 52℃ 및 74℃ 단계에서 수집된 데이터)의 40 주기이었다. 각 반응은 20nM의 순방향 프라이머 12, 40　nM의 순방향 프라이머 5, 200　nM의 각 역방향 프라이머, 200 nM의 각 파트자임, 200 nM의 분자성 비콘 1, 200 nM의 LOCS-1 리포터 및 1x PlexMastermix (Bioline)를 함유하였다.
반응은 어느 한쪽 무 표적 (NF H2O), TVbtub 유전자의 한 영역을 함유하는 합성 G-Block (25600, 6400,1600, 400 또는 100 카피), MgPa 유전자의 한 영역을 함유하는 합성 G-Block (25600, 6400, 1600, 400 또는 100 카피), 합성 MgPa G-Block (25600 카피)의 배경에서 합성 TVbtub G-Block (25600, 6400,1600, 400 또는 100 카피)의 다양한 농도 또는 합성 MgPa G-Block (25600 카피)의 배경에서 합성 TVbtub G-Block (25600, 6400, 1600, 400 또는 100 카피)의 다양한 농도를 함유하였다. 4개 반응은 가변 농도로 양쪽 표적을 함유하였다: MgPa의 200 카피와 TVbtub의 12800 카피, MgPa의 12800 카피와 TVbtub의 200 카피, MgPa의 800 카피와 TVbtub의 3200 카피 및 MgPa의 3200 카피와 TVbtub의 800 카피.
결과
PCR 증폭 동안, 형광은 표적 1 (TVbtub) 및/또는 표적 2 (MgPa)의 존재를 검출 및 정량화하기 위해 실시간으로 2개 온도에서 측정되었다. 분자성 비콘은 질 편모충(Trichomonas vaginalis) (TV)의 검출을 위하여 TVbtub와 상동인 서열을 검출하도록 설계되었다. MNA자임은 마이코플라즈마 제니탈리움 (Mycoplasma genitalium)의 검출을 위하여 MgPa와 상동인 서열의 존재 하에서 LOCS-2를 절단하도록 설계되었다. PCR 동안 특정 신호의 존재 또는 부재는 표 12에서 요약되고 전반적 체계는 실시예 5의 시나리오 3 (표 1)에서 기재된 것과 유사하다.
Figure pct00014
도 20에서 도시된 결과는 어느 한쪽 TVbtub (흑색 점선) 또는 MgPa (흑색 파선)의 25600 카피, 양쪽 유전자 표적 (회색 실선)의 혼합물의 25600 카피, 또는 무 유전자 표적 (NF H2O; 흑색 실선)을 함유하는 반응으로부터 FAM 채널에서 측정된 52℃ (D1, 도 20A) 및 74℃ (D2, 도 20B)에 형광의 비교 증폭 곡선을 실례한다. 결과는 삼중 반응으로부터 평균으로서 플롯팅된다.
도 20A는 52℃ (D1)에, 반응에서 TVbtub (흑색 점선), 또는 양쪽 TVbtub 및 MgPa (회색 실선)의 존재 하에 형광에서의 증가가 있고, 반면에 MgPa만 (흑색 파선)을 함유하는 반응을 포함하여, TVbtub의 부재 하에 형광에서의 증가가 없음을 도시한다. 이 온도에서, 분자성 비콘은 존재하는 경우 TVbtub 유전자 표적에 대한 혼성화에 반응하여 형광하거나 이의 표적 부재 하에서 퀀칭되고 내부적으로 혼성화된 스템을 유지한다. 동일한 온도 D1에서, 양쪽 온전한 및/또는 분할된 LOCS 종은, 반응에서 어느 한쪽 TVbtub 또는 MgPa의 존재 또는 부재와 관계없이, 이 온도에서 그들의 각자의 스템의 혼성화로 인해 퀀칭된다. 형광이 기하급수적으로 증가하기 시작하는 주기 수는 TVbtub만, 및 TVbtub 더하기 MgPa를 함유하는 반응에서 비슷하여, MgPa의 존재가 D1에 TVbtub의 정량화에 영향을 미치지 않음을 나타낸다. 그러므로, 52oC (D1)에 형광에서의 증가는 TVbtub의 존재를 나타내고, D1에 수득된 Cq 값은 반응에서 MgPa의 존재 또는 부재와 관계없이, TVbtub의 직접 정량화에 사용될 수 있다.
도 20B는 74℃ (D2)에, 반응에서 MgPa (흑색 파선), 또는 양쪽 TVbtub 및 MgPa (회색 실선)의 존재 하에 형광에서의 증가가 있고, 반면에 TVbtub만 (흑색 점선) 함유하는 반응을 포함하여, MgPa의 부재 하에 형광에서의 증가가 없음을 도시한다. D2에서, 분자성 비콘은, 존재하더라도, TVbtub에 혼성화할 수 없고, 반응에서 어느 한쪽 표적의 존재 또는 부재와 관계없이, 이 온도에서 이의 스템의 해리로 인해 항상 형광하고 있다. 이와 같이, 분자성 비콘의 형광은 증폭 이전, 동안 및 이후 이 온도에서 배경 형광 수준을 제공한다. 추가적으로, MgPa가 부재인 D2에서, LOCS 프로브는 온전한 및 퀀칭된 채로 남아있다. MgPa가 반응에서 존재하는 경우, MgPa-특이적 MNA자임에 의한 절단이 이 온도에서 해리된 스템 영역을 가진 분할된 LOCS를 생성하므로 형광은 PCR 동안 배경 수준 위에 증가한다. 이와 같이, PCR 동안 D2에 형광에서의 증가는 MgPa의 존재를 나타낸다. 형광이 기하급수적으로 증가하기 시작하는 주기 수는 MgPa만의 존재 하에서 및 양쪽 MgPa 및 TVbtub를 함유하는 동시감염의 존재 하에서 비슷하여, TVbtub의 존재가 D2에서 MgPa의 정량화에 영향을 미치지 않음을 나타낸다. 그러므로, 72oC (D2)에 형광에서의 증가는 MgPa의 존재를 나타내고, D2에서 수득된 Cq 값은 반응에서 TVbtub의 존재와 관계없이, MgPa의 직접 정량화에 사용될 수 있다.
TVbtub의 25600, 6400, 1600, 400 및 100 카피를 함유하는 표준 반응은 MgPa의 존재 또는 부재 하에서 TVbtub를 함유하였던 샘플에서 52oC (D1)에 TVbtub의 시작하는 농도를 정량화하는데 사용된 표준 곡선 (도 21A)을 구성하는데 사용되었다. 표 13은 MgPa의 25600 카피의 존재가 52oC에 검출된 TVbtub의 정량화에 유의미하게 영향을 미치지 않았음을 보여준다 (짝짓기된 스튜던트 t-검사, p-값 = 0.418). 유사하게, MgPa의 25600, 6400, 1600, 400 및 100 카피를 함유하는 표준은 TVbtub의 존재 또는 부재 하에서 MgPa를 함유하였던 샘플에서 74oC (D2)에 MgPa의 시작하는 농도를 정량화하는데 사용된 표준 곡선 (도 21B)을 구성하는데 사용되었다. 표 13은 TVbtub의 25600 카피의 존재가 74oC에 검출된 MgPa의 정량화에 유의미하게 영향을 미치지 않았음을 보여준다 (짝짓기된 스튜던트 t-검사, p-값 = 0.150). TVbtub 및 MgPa 유전자 표적의 무작위 농도를 함유하는 샘플은 또한 정량화되었고, 생성된 추정된 카피 수는 샘플에 첨가된 TVbtub의 알려진 농도와 비슷하였다 (표 14). 이것은 TVbtub가 MgPa의 존재와 관계없이 D1 (52oC)에서 정확하게 정량화될 수 있고 마찬가지로, MgPa가 TVbtub의 존재와 관계없이 D2 (74℃)에서 정확하게 정량화될 수 있음을 나타낸다.
Figure pct00015
Figure pct00016
본 방법은 단일 파장에서 여러 표적을 구분하기 위해 여러 온도에서 측정 이어서 형광 조정 인자 (FAF) (예를 들면 TOCE)를 사용하는 분석을 이용하는 당업계에서 알려진 다른 방법보다 주요 이점을 제공한다. 본 실시예 내에서 구현예는 동일한 분자의 형광 출력에서 온도 관련된 차이를 설명하기 위한 조정을 요구하지 않는다. 제1 온도에서 1개 표적 및 제2 온도에서 2개 표적을 검출하는 다른 방법과 달리, LOCS 및 분자성 비콘을 조합하는 여기에 나타난 실시예는 제1 표적의 간섭 없이 1개 온도에서 1개 표적의 검출 및 정량화, 그리고 제2 온도에서 제2 표적의 검출 및 정량화를 허용한다 (그리고 그 반대의 경우도 마찬가지). 유사하게, 실시간 모니터링의 부재 하에서, 별개 시점 (PCR후 빼기 PCR전)에서 측정된 형광에서의 관찰된 증가는 제1 온도에서 표적 1만 그리고 제2 온도에서 표적 2만의 존재를 나타낸다.
이론적 실시예 8: 이중 혼성화 프로브 및 LOCS의 조합을 사용하여 단일 파장에서 2개 표적의 실시간 검출 및 정량화.
하기 실시예는 이중 혼성화 프로브의 1개 쌍 및 1개 LOCS 리포터의 조합이 PCR 동안 실시간으로 2개 온도에서 형광 판독을 획득함으로써 단일 형광성 채널에서 2개 표적의 동시 검출 및 정량화를 허용할 수 있는 접근법을 실례한다. 대안적으로, 실시간 모니터링의 부재 하에서 본 접근법은 별개 시점에서, 예를 들어 증폭의 시작 근처에서 또는 시작에서 및 증폭 이후 수집된 형광성 데이터에 적용될 수 있다. 이 전략은 실시예 4에서 개괄된 대로 전문화된 증폭후 분석 방법에 대하여 요건을 제거할 것이다.
도 22에서 실례된 대로, 양쪽 이중 혼성화 프로브 및 LOCS 프로브는 동일한 형광 채널 내에서 동시 검출을 위하여 동일한 형광단 및 퀀처 모이어티로 표지될 수 있다. 이중 혼성화 프로브는 Tm A가 있는 제1 프로브 및 Tm B가 있는 제2 프로브를 함유할 수 있고, 여기서 Tm A 및 Tm B는 동일할 수 있거나, Tm A 및 Tm B는 상이할 수 있다. 1개 프로브는 이의 3' 말단에서 형광단으로 표지될 수 있고 다른 프로브는 이의 5' 말단에서 퀀처로 표지될 수 있다. (대안적으로, 1개 프로브는 이의 3' 말단에서 퀀처로 표지될 수 있고 다른 프로브는 이의 5' 말단에서 형광단으로 표지될 수 있다). 이중 혼성화 프로브는, 예를 들어, 60℃의 Tm A 및, 예를 들어, 60℃의 Tm B가 있는 표적 1 상에 인접해서 혼성화하도록 설계될 수 있다. 이 시나리오에서, 이중 혼성화 프로브는 증폭에 앞서 형광성일 것이지만 표적 1이 존재하였고 검출의 온도가 Tm A 및 Tm B 미만이었다면 증폭 이후 퀀칭될 것이다. 이와 같이, 제1 온도 (D1)에, 예를 들어 50℃에 형광에서의 관찰된 감소는 표적 1의 존재를 나타낼 것이다.
추가적으로, 반응은, 예를 들어, 80℃의 Tm C가 있는 스템 영역 및, 제2 표적 2 존재 하에서 MNA자임에 의해 절단된 경우, 예를 들어, 60℃의 Tm D (Tm D < Tm C)가 있는 분할된 LOCS를 생성할 수 있는 루프 영역을 갖는 온전한 LOCS 프로브를 함유할 수 있다. 이 시나리오에서, 온전한 LOCS는 증폭에 앞서 퀀칭될 것이지만 표적 2가 존재하였고 검출 온도가 Tm D 초과 그러나 Tm C 미만, 그리고 Tm A 및 Tm B 초과이었던 경우만 증폭 이후 형광에서 증가할 것이다. 이와 같이, 제2 온도 (D2)에, 예를 들어 70℃에 형광에서의 관찰된 증가는 표적 2의 존재를 나타낼 것이다.
이와 같이, 조합은 제1 온도 (D1)에 형광에서의 감소로서 결정된, 이중 혼성화 프로브를 사용하여 표적 1만의 검출; 및 제2 온도 (D2)에 형광에서의 증가에 의해 결정된, LOCS 프로브를 사용하여 표적 2만의 검출을 허용할 것이다.
Figure pct00017
이론적 실시예 9: 스콜피온 프로브 및 LOCS 프로브의 조합을 사용하여 단일 파장에서 2개 표적의 실시간 검출 및 정량화.
하기 실시예는 1개 스콜피온 프로브 및 1개 LOCS 리포터의 조합이 PCR 동안 실시간으로 2개 온도에서 형광 판독을 획득함으로써 단일 형광성 채널에서 2개 표적의 동시 검출 및 정량화를 허용할 수 있는 접근법을 실례한다. 대안적으로, 실시간 모니터링의 부재 하에서 본 접근법은 별개 시점에서, 예를 들어 증폭의 시작 근처에서 또는 시작에서 그리고 증폭 이후 수집된 형광성 데이터에 적용될 수 있다. 이 전략은 실시예 4에 기재된 대로 전문화된 증폭후 분석 방법에 대하여 요건을 제거할 것이다.
본 구현예에서 양쪽 스콜피온 프로브 및 LOCS 프로브는 동일한 형광 채널에서 동시 검출을 위하여 동일한 형광단 및 퀀처 모이어티로 표지될 수 있다. 스콜피온 프로브의 2개 유형, 즉 스콜피온 유니-프로브 및 스콜피온 비-프로브는 이 전략에서 사용될 수 있다. 스콜피온 유니-프로브는 차단제를 통해 PCR 프라이머의 5' 단부에 직접적으로 연결된 내부 퀀처 및 5' 단부 리포터가 있는 스템-루프 입체구조에서 고정된 단일-가닥 이중-표지된 형광성 프로브 서열로 이루어질 수 있다. PCR 동안, 프라이머 부분은 표적 1에 혼성화하고 이를 확장시키도록 설계될 수 있되, 여기서 스템 루프의 스템 영역은, 예를 들어, 55℃의 Tm A를 가질 수 있고 스템 루프의 루프 영역은, 예를 들어, 60℃의 Tm B가 있는 표적 1 앰플리콘에 결합할 수 있다. PCR 동안, 헤어핀-루프는 언폴딩할 수 있고 유니-프로브의 루프-영역은 새롭게 합성된 표적 1 서열에 분자내로 혼성화하여서, 형광단 및 퀀처를 분리시킬 수 있다. 이와 같이, PCR 동안 제1 온도 (D1)에, 예를 들어 50℃에 형광에서의 관찰된 증가는 표적 1의 존재를 나타낼 것이다.
추가적으로, 반응은, 예를 들어, 80℃의 Tm C가 있는 스템 영역 및, 제2 표적 2 존재 하에서 MNA자임에 의해 절단된 경우, 예를 들어, 60℃의 Tm D (Tm D < Tm C)가 있는 분할된 LOCS를 생성할 수 있는 루프 영역을 갖는 온전한 LOCS 프로브를 함유할 수 있다. 이 시나리오에서, 온전한 LOCS는 증폭에 앞서 퀀칭될 것이지만, 표적 2가 존재하였고 검출 온도가 Tm D 초과 그러나 Tm C 미만, 그리고 Tm A 및 Tm B 초과이었던 경우, 증폭 이후 형광에서 증가할 것이다. 이와 같이, 제2 온도 (D2)에, 예를 들어 65℃에 형광에서의 관찰된 증가는 표적 2의 존재를 나타낼 것이다.
이와 같이, 조합은 제1 온도 (D1)에 형광에서의 증가에 의해 모니터링된 경우, 스콜피온 유니-프로브를 사용하여 표적 1만의 검출; 및 제2 온도 (D2)에 형광에서의 증가에 의해 모니터링된 경우, LOCS 프로브를 사용하여 표적 2만의 검출을 허용할 것이다.
Figure pct00018
유사하게, 스콜피온 비-프로브는 LOCS 프로브와 조합될 수 있다. 스콜피온 비-프로브는 차단제를 통해 PCR 프라이머의 5' 단부에 직접적으로 연결된 단일-가닥 형광성 프로브 서열로 이루어질 수 있다. 추가적으로, 프로브에 상보적인 그리고 퀀처로 표지되는 서열은 Tm A가 있는 프라이머/프로브 분자에 결합하여, PCR에 앞서 또는 표적의 부재 하에서 퀀칭되는 듀플렉스를 형성할 수 있다. PCR 동안, 프라이머 부분은 표적 1에 혼성화하고 이를 확장시키도록 설계될 수 있되, 여기서 프로브 영역 및 상보적 퀀처 서열은, 예를 들어, 55℃의 Tm A를 가질 수 있고 프로브 영역은, 예를 들어, 60℃의 Tm B가 있는 표적 1 앰플리콘에 결합할 수 있다. PCR 동안, 상보적 퀀처 서열은 해리할 수 있고 비-프로브의 프로브는 새롭게 합성된 표적 1 서열에 분자내로 혼성화하므로, 상보적 퀀처 서열의 결합하기를 차단시킬 수 있고 그래서 형광을 생성할 수 있다. 이와 같이, PCR 동안 제1 온도 (D1)에, 예를 들어 50℃에 형광에서의 관찰된 증가는 표적 1의 존재를 나타낼 것이다.
추가적으로, 반응은, 예를 들어, 80℃의 Tm C가 있는 스템 영역 및, 제2 표적 2 존재 하에서 MNA자임에 의해 절단된 경우, 예를 들어, 60℃의 Tm D (Tm D < Tm C)가 있는 분할된 LOCS를 생성할 수 있는 루프 영역을 갖는 온전한 LOCS 프로브를 함유할 수 있다. 이 시나리오에서, 온전한 LOCS는 증폭에 앞서 퀀칭될 것이지만, 표적 2가 존재하였고 검출 온도가 Tm D 초과 그러나 Tm C 미만, 그리고 Tm A 및 Tm B 초과이었던 경우, 증폭 이후 형광에서 증가할 것이다. 이와 같이, 제2 온도 (D2)에, 예를 들어 65℃에 형광에서의 관찰된 증가는 표적 2의 존재를 나타낼 것이다.
이와 같이, 조합은, 제1 온도 (D1)에 형광에서의 증가에 의해 모니터링된 경우, 스콜피온 비-프로브를 사용하여 표적 1만의 검출; 및 제2 온도 (D2)에 형광에서의 증가에 의해 모니터링된 경우, LOCS 프로브를 사용하여 표적 2만의 검출을 허용할 것이다.
Figure pct00019
실시예 10: 내부 형광 교정이 있든 없든 1개의 분자성 비콘 및 1개 LOCS 리포터를 사용하여 단일 파장에서 여러 표적의 분석 방법.
하기 실시예는 2개 온도에서 증폭전 및 증폭후 형광 판독을 획득함으로써 1개 비-절단가능한 분자성 비콘 및 1개 LOCS 리포터를 사용하여 단일 파장에서 여러 표적의 분석 방법을 입증한다. 이 전략은 실시예 1에서 입증된 전문화된 종점 분석 방법에 대하여 요건을 제거한다. 더욱이, 이 전략은 실시간 검출에 대하여 요구된 매 주기 데이터 획득에 대한 필요를 부정하고 그러므로 전반적으로 결과에 이르는 시간을 줄이는데 도움이 된다. 도　5에서 실례된 대로, 양쪽 분자성 비콘 및 LOCS 프로브는 동일한 형광 채널에서 동시 검출을 위하여 동일한 형광단 및 퀀처 모이어티로 표지된다. 분자성 비콘은 Tm A가 있는 스템 영역 및 Tm B가 있는 표적 1 (TVbtub)로 특이적으로 혼성화할 수 있는 루프 영역을 함유하고; 여기에서 Tm B는 Tm　A보다 크다 (Tm B > Tm A). 본 실시예에서, 온전한 LOCS 프로브는 Tm C (82℃)가 있는 스템 영역 및 표적 2 (MgPa) 존재 하에서 MNA자임에 의해 절단된 경우, Tm D (62℃)가 있는 분할된 LOCS를 생성하는 루프 영역을 갖고; 여기에서 Tm D는 Tm C보다 적다 (Tm D < Tm C). 표적 1 (TVbtub) 및/또는 표적 2 (MgPa)의 존재는 어느 한쪽 증폭의 시작에서, 또는 근처에서 및 증폭 이후 획득된 단일 측정을 사용하여 2개 온도 (D1 및 D2; 52℃ 및 74℃)에 형광에서의 증가를 측정함으로써 차별될 수 있다. 하기 실시예에서, D1 < Tm A < Tm B < D2 및 D1 < Tm D < D2 < Tm C인 실시예 5에서 기재된 시나리오 3과 일치하는 Tm A는 ~60℃이고, Tm B는 ~68℃이고, Tm C는 ~82℃이고 Tm D는 ~62℃이다.
올리고뉴클레오티드
본 실험에 대해 특이적인 올리고뉴클레오티드는 표적 1 (TVbtub)의 증폭 및 정량화를 위하여 순방향 프라이머 12 (서열번호: 63), 역방향 프라이머 12 (SEQ ID: 64) 및 분자성 비콘 1 (SEQ ID: 68); 표적 2 (MgPa)의 증폭 및 정량화를 위하여 순방향 프라이머 5 (서열번호: 20), 역방향 프라이머 5 (서열번호: 21), 파트자임 A5 (서열번호: 22), 파트자임 B5 (서열번호: 23), 기질 3 (서열번호: 24), LOCS-2 (서열번호: 25)를 포함한다. 서열은 서열 목록에서 열거된다.
반응 조건
표적 서열의 실시간 검출은 BioRad® CFX96 서모사이클러를 사용하여 20 μL의 총 반응 부피에서 수행되었다. 주기화 파라미터, 및 형광성 데이터 획득 (DA) 지점은 다음이었다: 2　분 동안 95℃, 15 초 동안 52℃ (DA) 및 15 초 동안 74℃ (DA)의 1 주기; 1 초 동안 95℃ 및 20 초 동안 60℃의 50 주기; 및 5 분 동안 52℃ (DA) 및 15 초 동안 74℃ (DA)의 1 주기. 모든 반응은, 6 반복실험이 사용된, 10 카피의 템플레이트를 함유하는 반응을 제외하고 삼중으로 수행되었다. 각 반응은 40 nM의 각 순방향 프라이머, 200　nM의 각 역방향 프라이머, 200 nM의 각 파트자임, 200 nM의 분자성 비콘 1, 300 nM의 LOCS-2 리포터 및 1x PlexMastermix (Bioline)를 함유하였다. 제1 플레이트 상에서 반응은 어느 한쪽 무 표적 (NF H2O), TVbtub (10000 또는 200 카피)의 합성 G-Block, MgPa 유전자 (10000 또는 200 카피)의 합성 G-Block 또는 MgPa 유전자 (10000 또는 200 카피)의 합성 G-Block의 배경에서 TVbtub 유전자 (10000 또는 200 카피)의 합성 G-Block의 다양한 조합을 함유하였다. 제2 플레이트 상에서 반응은 어느 한쪽 무 표적 (NF H2O), TVbtub (200, 100, 50, 25 또는 10 카피)의 합성 G-Block, MgPa 유전자 (200, 100, 50, 25 또는 10 카피)의 합성 G-Block 또는 TVbtub 및 MgPa 유전자 (200, 100, 50, 25 또는 10 카피 각)의 합성 G-Block의 양쪽을 함유하였다.
결과
형광에서의 증가는, 표적 1 (TVbtub) 및 표적 2 (MgPa), 각각의 존재를 결정하기 위해, 2개 온도 (D1 및 D2; 52℃ 및 74℃)에서, PCR전과 PCR후 측정 사이 차이 (ΔS)를 계산함으로써 결정되었다. 분자성 비콘은 트리코모나스 바지날리스 (TV)의 검출을 위하여 TVbtub와 상동인 서열을 검출하도록 설계되었다. MNA자임은 마이코플라즈마 제니탈리움의 검출을 위하여 MgPa의 존재 하에서 LOCS-1을 절단하도록 설계되었다. PCR 동안 특정 신호의 존재 또는 부재는 실시예 5의 시나리오 3에서 기재된 것과 유사하다.
도 23은, 제1 96-웰 플레이트를 사용하여 측정된 삼중 반응의 평균으로서, 52℃ (ΔSD1, 도 23A) 및 74℃ (ΔSD2, 도 23B), 각각에 형광에서의 증가를 결정함으로써 TVbtub 및 MgPa의 종점 검출의 요약을 실례한다. ΔSD1이 도 23A에서 특정된 임계값 (임계값 1) 초과인 경우, 이는 반응에서 TVbtub의 존재를 나타낸다. TVbtub의 어느 한쪽 10,000 또는 200 카피를 함유하는 모든 반응은 반응에서 MgPa의 존재 또는 부재와 관계없이 TVbtub에 대하여 양성으로 올바르게 결정되었다. TVbtub가 부재인 모든 반응에서, ΔSD1은 특정된 임계값 미만으로 유지하고 무 템플레이트 대조군 (NTC)과 유사하다. 유사하게, ΔSD2가 도 23B에서 특정된 임계값 (임계값 2) 초과인 경우, 이는 반응에서 MgPa의 존재를 나타낸다. MgPa의 어느 한쪽 10,000 또는 200 카피를 함유하는 모든 반응은 반응에서 TVbtub의 존재 또는 부재와 관계없이 MgPa에 대하여 양성으로 올바르게 결정되었다. MgPa가 부재인 모든 반응에서, ΔSD2는 특정된 임계값 미만으로 유지하고 무 템플레이트 대조군 (NTC)과 유사하다.
도 24는, 제2 96-웰 플레이트 상에서 측정된, TVbtub 및 MgPa의 종점 검출의 요약을 실례한다. 결과는 반복실험의 평균이고 52℃ (ΔSD1/C, 도 24A) 및 74℃ (ΔSD2/C, 도 24B)에 교정된 신호에서의 증가를 보여준다. 교정 인자는 밀폐형 및 개방형 입체구조에서 비콘의 스템의 해리로부터 발생하는 형광을 나타내는, 52℃와 74℃ 사이 PCR전 형광에서의 차이 (C = SD2-PCR전 - SD1-PCR전)로서 결정되었다. D2에서 분자성 비콘으로부터 발생하는 이 신호는 모든 반응에서 동일한 양으로 존재하고 어느 한쪽 표적의 존재에 의해 영향받지 않는다. 그러므로, 웰들 사이 D1 및 D2 (C)에 신호에서의 PCR전 변동은 사용된 채널에서 진정한 웰-대-웰 변동을 반영한다. 측정된 신호 ΔSD1 및 ΔSD2는 각각을 교정 인자 (C)에 의해 나눔으로써 (ΔSD1/C 및 ΔSD2/C) 교정되었다. 도 24A는 TVbtub가 존재하는 경우 모든 반응에서 교정된 신호 ΔSD1/C가 특정된 임계값 (임계값 1) 초과이거나, TVbtub가 부재인 경우 그 미만임을 도시한다. TVbtub가 부재인 모든 반응에서, ΔSD1/C는 특정된 임계값 미만으로 유지하고 무 템플레이트 대조군 (NTC)과 유사하다. 도 24B는 MgPa가 존재하는 경우 모든 반응에서 교정된 신호 ΔSD2/C가 특정된 임계값 (임계값 2) 초과이거나, MgPa가 부재인 경우 그 미만임을 도시한다. MgPa가 부재인 모든 반응에서, ΔSD2/C는 특정된 임계값 미만으로 유지하고 무 템플레이트 대조군 (NTC)과 유사하다. 도 24는 이들이 반응당 10 카피로 검출가능하였기 때문에 양쪽 표적을 향한 검정의 높은 민감도를 입증한다.
본 실시예는 ΔSD1 (표적 1만을 표시함) 및 ΔSD2 (표적 2만을 표시함)를 결정함으로써 단일 형광 채널에서 2개 표적의 신속 정성적 종점 검출에 대하여 1개 분자성 비콘 및 1개 LOCS 리포터의 사용을 입증한다. 이 접근법은 전문화된 종점 분석 방법에 대하여 필요를 부정한다. 본 실시예에서 신호 ΔSD1 및 ΔSD2가 공식 ΔSD1/C 및 ΔSD2/C를 사용하여 추가의 교정기 시약 요구함 없이 동일한 채널에서 교정될 수 있음이 또한 입증되었다. 이 접근법은 실행-대-실행 및 기계-대-기계 변동이 더욱 일관된 형광 출력을 위하여 정규화될 수 있다는 점에서 유리하다. 더욱이, 실행 시간을 줄이는, 본 실시예에서 총 54 분 측정된, 본 실시예에서 실시간 획득은 요구되지 않았다.
이론적 실시예 11: 캐처 및 피처 그리고 LOCS 프로브의 조합을 사용하여 단일 파장에서 2개 표적의 실시간 검출 및 정량화.
하기 실시예는 1개 캐처 및 피처 쌍 그리고 1개 LOCS 리포터의 조합이 PCR 동안 실시간으로 2개 온도에서 형광 판독을 획득함으로써 단일 형광성 채널에서 2개 표적의 동시 검출 및 정량화를 허용할 수 있는 접근법을 실례한다. 대안적으로, 실시간 모니터링의 부재에서 접근법은 별개 시점에서, 예를 들어 증폭의 시작 근처에서 또는 시작에서 그리고 증폭 이후 수집된 형광성 데이터에 적용될 수 있다. 이 전략은 전문화된 증폭후 분석 방법 예컨대 실시예 4에서 입증된 것들에 대하여 요건을 제거할 것이다.
본 구현예에서 양쪽 캐처 및 LOCS 프로브는 동일한 형광 채널에서 동시 검출을 위하여 동일한 형광단 및 퀀처 모이어티로 표지될 수 있다. 피처는 캐처에 상보적인 5' 태깅 영역 및 제1 표적 1에 상보적인 3' 센서 영역을 포함하는 단일-가닥 올리고뉴클레오티드로 이루어질 수 있다. 캐처는 5' 단부에서 퀀처 및 그 퀀처에 대한 형광단 다운스트림으로 표지된 단일-가닥 올리고뉴클레오티드로 이루어질 수 있고 피처에 상보적인 3' 태깅 영역을 포함할 수 있다. 캐처가 단일-가닥 입체구조인 경우, 형광단은 퀀처에 가까이 근접할 것이고 퀀칭된 채로 남아있을 것이다. PCR 동안, 피처의 프라이머 및 3' 센서 영역은 표적에 혼성화할 수 있다. 프라이머 확장 동안, 피처는 DNA 폴리머라제의 엑소뉴클레아제 활성에 의해 분해될 수 있고 피처의 태깅 부분을 방출시킬 수 있다. 방출된 태깅 부분은 그 다음 캐처의 상보적 3' 태깅 부분에 혼성화할 수 있다. PCR 동안 DNA 폴리머라제에 의한 태깅 부분의 확장은 형광단 및 퀀처가 분리되는 이중-가닥 캐처 듀플렉스를 생성할 수 있다. 형광단 및 퀀처의 분리는 표적 1의 존재를 나타낼 수 있는 형광에서의 증가를 초래할 수 있다. 예를 들어, 이중-가닥 캐처 듀플렉스의 Tm (Tm A, 60℃)보다 낮은 50℃의 제1 검출 온도 (D1)에, 형광에서의 증가가 관찰될 수 있는 것은 형광단 및 퀀처가 캐처 듀플렉스 입체구조인 때 분리되기 때문이다. 예를 들어, 이중 가닥 캐처 듀플렉스의 Tm (Tm A, 60℃)보다 높은 70℃의 제2 검출 온도 (D2)에서, 캐처 및 피처는 이들이 양쪽 단일-가닥 입체구조이도록 해리할 수 있다. 이것은 형광단 및 퀀처가 더이상 분리되지 않기 때문에 형광에서의 감소를 초래할 수 있다. 그러므로, D1에 PCR 동안 형광에서의 증가는 이중-가닥 캐처 듀플렉스의 존재 및 그러므로 표적 1의 존재를 나타내는데 사용될 수 있다. 표적 1의 부재 하에서, 캐처는 단일-가닥 및 퀀칭된 채로 남아있을 수 있고, 그러므로 D1에 형광에서의 증가에 기여하지 않을 것이다. D2에서 형광이 표적 1의 존재 또는 부재에 의해 영향받지 않을 것은 캐처가 항상 이중 가닥 캐처 듀플렉스의 Tm (Tm A, 60℃) 초과의 온도에서 단일-가닥 및 퀀칭된 채로 남아있을 것이기 때문이다.
추가적으로, 반응은 예를 들어, 80℃의 Tm B가 있는 스템 영역 및, 제2 표적 2 존재 하에서 MNA자임에 의해 절단된 경우, 예를 들어, 60℃의 Tm C (Tm C < Tm B)가 있는 분할된 LOCS를 생성할 수 있는 루프 영역을 가질 수 있는 온전한 LOCS 프로브를 함유할 수 있다. 이 시나리오에서, 온전한 LOCS는 증폭에 앞서 퀀칭될 것이지만 표적 2가 존재하였고 검출 온도가 Tm C 및 Tm A 초과 그러나 Tm B 미만이었다면 증폭 이후 형광에서 증가할 것이다. 이와 같이, 제2 온도 (D2)에, 예를 들어 70℃에 형광에서의 관찰된 증가는 표적 2의 존재를 나타낼 것이다. 그들의 Tm이 더 높으므로 (D1 < Tm B 및 D1 < Tm C), 양쪽 온전한 및 분할된 LOCS는 제1 검출 온도 (D1)에 퀀칭된 채로 남아있을 것이고, 그러므로 표적 2의 존재는 제1 온도에 신호에서의 변화에 기여하지 않을 것이다.
이와 같이, LOCS 및 캐처-피처 프로브의 조합은, 제1 온도에 형광에서의 증가에 의해 모니터링된 경우, 캐처-피처 프로브를 사용하여 표적 1만의 검출; 및 제2 온도에 형광에서의 증가에 의해 모니터링된 경우, LOCS 프로브를 사용하여 표적 2만의 검출을 허용할 수 있다.
Figure pct00020
실시예 12: 기계-대 기계 가변성을 최소화하기 위해 교정기로서 동일한 LOCS 프로브를 사용하는 1개 LOCS 프로브 및 1개 선형 MNA자임 기질을 사용하여 단일 파장에서 여러 표적의 종점 분석 방법.
하기 실시예는 1개 선형 MNA자임 기질 및 1개 LOCS 리포터가 용융 곡선 분석에 대한 필요 없이 단일 형광성 채널에서 2개 유전자 표적 (CTcry 및 NGopa)의 검출 및 차별에 사용되는 접근법을 입증한다. 여기에서, 교정 인자는 2개 상이한 온도에 LOCS 리포터로부터 증폭전 신호로부터 결정되고 데이터를 정규화시켜 실행-대-실행 및 기계-대-기계 변동을 최소화하는데 사용된다.
PCR 동안, 선형 MNA자임 기질은 CTcry의 존재 하에서 절단되어 형광단 및 퀀처를 분리시켜 넓은 범위의 온도에 걸쳐서 검출될 수 있는 신호에서의 증가를 생산한다. 본 실시예에서, CTcry의 실시간 검출 및 Cq 결정은 온도 1 (52℃, D1)에 PCR 동안 각 주기에서 형광을 획득함으로써 달성된다. CTcry의 정성적 검출은 양쪽 증폭 이전 및 이후 D1에 형광을 측정함으로써 또한 달성된다. 양쪽 온전한 및 분할된 구성에서 LOCS 프로브는 D1 (52℃)보다 높은 용융 온도 (Tm)를 갖고 그러므로 LOCS 리포터는 샘플에서 NGopa의 존재 또는 부재와 관계없이 D1에 신호를 제공하지 않는다.
NGopa의 존재 하에서, MNA자임 2는 PCR 동안 LOCS 프로브를 절단시킬 수 있다. NGopa의 정성적 검출은 양쪽 증폭 이전 및 이후 더 높은 온도 2 (70℃, D2)에 형광을 측정함으로써 달성된다. 온전한 LOCS 스템의 Tm이 D2보다 높고 (Tm > 70℃) 분할된 LOCS의 스템의 Tm이 D2보다 낮으므로 (Tm < 70℃), 형광에서의 증가는 분할된 및 해리된 LOCS와 결합되고 NGopa의 존재를 나타낸다. 형광에서의 이 증가는 NGopa 표적의 존재를 나타내는 것으로 간주되도록 이 온도에서 선형 MNA자임 기질의 절단에 의해 야기된 임의의 배경 형광 위이어야 한다.
본 실시예에서, 형광 신호 (ΔS)는 온전한 LOCS (즉 D1에서 온전한, 혼성화된 LOCS 및 D3에서 온전한, 해리된 LOCS)의 2개 상이한 입체구조적 상태로부터 발생하는 신호에서의 차이를 설명하는 2개 상이한 온도에 증폭전 형광 신호 (SD1-PCR전 및 SD3-PCR전)에 대해 교정된다. 본 실시예에서, 온전한 LOCS의 해리는 온전한 LOCS의 Tm보다 높은 (Tm < 85℃), 온도 3, (D3; 85℃)에서 발생한다. 교정 인자 (C)는, 온전한 LOCS의 스템은 해리되고 형광하는, D3에서 증폭전 신호 (SD3-PCR전)와, 온전한 LOCS의 스템이 혼성화되고 퀀칭되는, D1에서 신호 (SD1-PCR전) 사이 차이 (C = SD3-PCR전 - SD1-PCR전)로서 계산된다. 교정 인자 (C)는 임의의 표적의 존재에 의해 영향받지 않고 남아있을 수 있는 각 반응에 대하여 음성 및 양성 신호 (즉 동적 범위) 사이 상대 관계를 대표한다. 교정 인자 (C)에서 관찰된 임의의 변동은 그 다음 각 특정 채널에서 임의의 웰-대-웰 변동을 반영할 수 있다. 그러므로 이 교정 인자 (C)는 실행-대-실행 및 기계-대-기계 변동을 최소화하는데 사용될 수 있다. 본 실시예에서, 각 반응으로부터 수득된 형광 신호는 각 온도에서 ΔS (ΔSD1 및 ΔSD2)를 교정 인자로 나눔으로써 교정된다 (ΔSD1/C 및 ΔSD2/C).
본 실시예는 실행-대-실행 및 기계-대-기계 변동을 최소화하기 위해 교정기의 역할을 하는 LOCS의 추가의 기능을 입증한다. 교정기로서 LOCS 리포터로부터 발생하는 PCR전 측정을 사용하는 동안, 본 실시예는 PCR 이전 및 이후 이루어진 별개 온도에서 형광의 측정에 의해 단일 채널에서 2개 표적의 동시 정성적 분석 및 1개 표적의 Cq 결정을 입증한다.
올리고뉴클레오티드
본 실험에 대해 특이적인 올리고뉴클레오티드는 순방향 프라이머 1 (서열번호: 1), 역방향 프라이머 1 (서열번호: 2), 파트자임 A1 (서열번호: 3), 파트자임 B1 (서열번호: 4), 순방향 프라이머 2 (서열번호: 5), 역방향 프라이머 2 (서열번호: 6), 파트자임 A2 (서열번호: 7), 파트자임 B2 (서열번호: 8), 기질 1 (서열번호: 13) 및 LOCS-1 (서열번호: 14)을 포함한다. 서열은 서열 목록에서 열거된다.
표적 1 (CTcry) 증폭 및 검출에 특이적인 올리고뉴클레오티드는 기질 1, 파트자임 A1, 파트자임 B1 (MNA자임 1), 순방향 프라이머 1 및 역방향 프라이머 1이다. 표적 2 (NGopa) 증폭 및 검출에 특이적인 올리고뉴클레오티드는 LOCS-1, 파트자임 A2, 파트자임 B2 (MNA자임 2), 순방향 프라이머 2 및 역방향 프라이머 2이다.
반응 조건
실시간 PCR 증폭 및 검출은 3개 플레이트 상에서 3개 상이한 BioRad® CFX96 서모사이클러 장치 (기계 1 내지 3)를 사용하여 20　μL의 총 반응 부피에서 수행되었다. 주기화 파라미터, 및 형광성 데이터 획득 (DA) 지점은 다음이었다: 2 분 동안 95℃, 15 초 동안 52℃ (DA), 15 초 동안 70℃ (DA), 15 초 동안 85℃ (DA)의 1 주기; 5 초 동안 95℃ 및 30 초 동안 61℃의 10 주기 (주기당 0.5℃ 점감); 5 초 동안 95℃ 및 40 초 동안 52℃의 40 주기 (각 주기에서 DA); 및 15 초 동안 70℃ (DA)의 1 주기. 각 플레이트 상에서 모든 반응은 삼중으로 실행되었고 40 nM의 각 순방향 프라이머, 200 nM의 각 역방향 프라이머, 200 nM의 각 파트자임 A, 200 nM의 각 파트자임 B, 200 nM의 각 기질, 200 nM LOCS-1 및 1x SensiFast Buffer (Bioline)를 함유하였다. 반응은 어느 한쪽 무 표적 (NF H2O), 또는 CTcry (10,000 또는 40 카피)의 합성 G-Block; 또는 NGopa (10,000 또는 40 카피); 또는 양쪽 CTcry 및 NGopa 유전자 (10,000 또는 40 카피 각)를 함유하였다. 무 표적 대조군 (NF H2O)을 제외한 모든 반응은 34.5 ng (10,000 유전자 카피)의 인간 게놈성 DNA의 배경을 추가로 함유하였다.
결과
본 실시예에서, MNA자임 1에 의해 절단가능한 1개 선형 MNA자임 기질, 및 MNA자임 2에 의해 절단가능한 1개 LOCS 프로브는 단일 PCR 반응에서 조합되어 단지 단일 형광성 채널 (HEX)을 사용하여 2개 표적 CTcry 및 NGopa 각각을 동시에 검출 및 차별하였다. CTcry 유전자의 존재는 HEX 채널에서 PCR 주기화 이전 및 이후 (ΔSD1) 52℃에 별개 시점에서 형광의 분석을 통해서 선형 기질-1의 절단을 모니터링함으로써 검출되었다. 또한, 52℃에 실시간 데이터 획득으로부터 수득된 Cq 값은 반응에서 CTcry 정량을 나타낸다 (데이터 표시되지 않음). NGopa의 존재는 동일한 채널에서 PCR 주기화 이전 및 이후 (ΔSD2) 70℃에 별개 시점에서 형광의 분석을 통해서 LOCS-1의 절단을 모니터링함으로써 검출되었다. 교정 인자 (C)는 52℃ (D1) 및 85℃ (D3)에 PCR전 형광 신호들 사이 차이로서 결정되었다.
3개 Bio-Rad CFX96 기계에 걸쳐서 CTcry 및 NGopa 템플레이트의 가변 양을 함유하는 삼중 반응으로부터 평균 ΔSD1 및 ΔSD2는 표 19 및 표 20 각각에 표시된다. 추가로, 이들 값은 결과가 삼중 반응의 평균인 표 21 (ΔSD1/C) 및 표 22 (ΔSD2/C)에서 표시된 대로 교정 인자를 사용하여 정규화되었다. 표 19 및 표 20은, 변동 (CV) 값의 높은 계수 (CV ≥ 23.05%)로 명백하듯이, 검사된 3개 기계에 걸쳐서 동일한 템플레이트를 함유하는 반응에 대하여 ΔSD1 및 ΔSD2 값에서 큰 변동을 보여준다. 이들 실행-대-실행 및/또는 기계-대-기계 변동은 3개 기계의 각각에 대하여 표적의 존재 또는 부재를 결정하기 위하여 단일 역치를 배치하기 어렵게 만든다. 하지만, 교정 인자를 이용하는 정규화 후, 표 21 및 표 22에서 표시된 대로 CV 값 (CV ≤ 4.13%)에서 축소에 의해 입증된 대로, 3개 상이한 기계로부터 수득된 결과에서 훨씬 더 적은 변동이 있다. 결과는 C를 사용하는 정규화가 실행-대-실행 또는 기계-대-기계 변동을 축소하기 위한 효과적 방법임을 입증한다.
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
C를 사용하는 정규화는 모든 기계에 걸쳐서 사용된 고정된 역치를 가진 샘플에서 CTcry, NGopa 또는 양쪽 CTcry 및 NGopa의 존재 또는 부재를 정확하게 결정하기 위하여 대안적 방법을 허용한다. 도 25는 검사된 3개 Bio-Rad CFX96 기계 (삼중반복실험의 평균; 흑색 스트립의 기계 1, 회색의 기계 2 및 백색의 기계 3)에 걸쳐서 ΔSD1 (도 21A), ΔSD2 (도 25B), ΔSD1/C (도 25C) 및 ΔSD2/C (도 25D)를 실례한다. 도 25C는 0.4 (임계값 C1)보다 큰 ΔSD1/C가 모든 3개 기계에서의 반응에서 CTcry의 존재를 나타냄을 도시한다. 도 25D는 0.4 (임계값 C2)와 0.9 (임계값 C3) 사이 ΔSD2/C 값이 모든 3개 기계에서의 반응에서 존재하는 CTcry 또는 NGopa 중 단 1개의 존재를 나타냄을 도시한다. ΔSD2/C가 0.9 (임계값 C3) 초과이면, 이는 양쪽 CTcry 및 NGopa가 모든 3개 기계에서의 반응에서 존재함을 나타낸다. ΔSD2/C가 0.4 미만이면, 이는 CTcry 또는 NGopa 중 어느 것도 모든 3개 기계에서의 반응에서 존재하지 않음을 나타낸다. 이들 결과는 표 21 및 표 22에서 요약된다. ΔSD1/C 및 ΔSD2/C로부터 조합된 정보는 그 다음 반응에서 CTcry 및/또는 NGopa의 존재를 올바르게 결정하는데 사용될 수 있다. 정규화 없는 ΔSD1 값의 경우, 도 25A는, 표 19에서 요약된 대로, 기계들 사이 변동에도 불구하고 CTcry의 존재의 결정을 위하여 동일한 임계값 C1 (2000 RFU)을 사용하는 것이 가능함을 도시한다. 하지만, ΔSD2에서 관찰된 실행-대-실행 또는 기계-대-기계 변동으로 인해, 도 25B는 상이한 임계값 C3 값이 상이한 기계에 요구되고 추가 분석이 고정된 역치를 사용하여 가능하지 않음을 도시한다. 그러므로, C를 사용하는 정규화는, 기계-대-기계 또는 실행-대-실행 변동과 관계없이, 표적의 존재 또는 부재의 정확한 결정을 위하여 고정된 역치의 사용을 허용한다.
본 실시예는, 고정된 역치를 사용하여 PCR 전 및 후 이루어진 별개 형광의 측정 및 1개 표적의 Cq 결정에 의해 단일 채널에서 2개 표적의 존재 또는 부재를 정확하게 결정할 수 있는 대안적 분석 방법을 차례로 허용하는, 실행-대-실행 및 기계-대-기계 가변성을 최소화하기 위한 교정기의 역할을 하는 LOCS의 추가의 기능을 입증한다.
본 실시예에서 입증된 교정기 방법은 반응에 첨가되어야 하는 추가의 시약의 사용을 요구하지도 않고 다른 웰들로부터 수득된 데이터의 사용을 요구하지도 않는 것을 포함하는 몇몇 이점을 갖는다. 본 방법은 존재할 수 있는 웰-대-웰 변동에 대하여 교정 및 수정하는 기능을 한다. 더욱이, 교정은 동일한 채널에서 획득된 데이터를 사용하여 가공되고 그러므로 기구들 사이 존재할 수 있는 임의의 채널-대-채널 변동에 의해 영향받지 않는다. 여러 채널이 멀티플렉스 반응에 활용되는 경우, 각 채널은 각 채널내 LOCS 교정 신호에 대해 독립적으로 교정될 수 있다. 채널들 사이 예상된 신호 강도의 비율이 기구들 사이 상당히 상이한 경우 교정이 불리하게 영향받아, 채널-대-채널 변동을 야기시키기 때문에, 이것은 신호가 상이한 채널에서 신호에 대해 교정되는 시나리오, 예컨대 내부 대조군 또는 내인성 대조군으로부터의 것에 유리하다.
이론적 실시예 13: 1개 선형 MNA자임 기질 및 1개 LOCS 프로브를 사용하여 2개 표적의 동시 비색계 검출 방법.
하기 실시예는 1개 온도 (D1)에 검출된 1개 선형 MNA자임 기질, 및 제2 온도 (D2)에 검출된 1개 LOCS 리포터를 사용하여 달성될 수 있는 단일 반응에서 2개 표적의 동시 비색계 검출 및 차별을 위하여 금 나노입자의 사용을 입증한다.
양쪽 선형 MNA자임 기질 및 LOCS 리포터는 기질 및 LOCS 리포터가 온전한 및 미절단된 상태로 남아있는 경우 GNP가 응집된 상태일 금 나노입자 (GNP)로 각 단부에 표지될 수 있다. 응집된 상태에서, GNP는 그들의 개별 국소화된 플라즈몬의 커플링으로 인해 더 긴 파장에서 흡광도를 나타낼 것이고 보라색 색상으로 시각화될 것이다. 이 보라색 색상은 양쪽 육안에 의해 및 또한 UV/VIS 흡광도 영역에서 분광계에 의해 관찰될 수 있다. 특정 표적 1의 존재 하에서 그들의 각자의 MNA자임에 의한 선형 기질의 절단은 넓은 범위의 온도에 걸쳐서 관찰될 수 있는 보라색부터 적색까지 색상 변화를 생산할 GNP의 분리를 야기시킬 것이다. 본 실시예에서, 선형 MNA자임 기질로부터 색상 변화는 증폭에 앞서, 및 이후 온도 1 (D1 = 52℃)에 흡광도의 UV/VIS 분광 시프트 (ΔSD1)를 측정함으로써 검출될 수 있되, 여기서 더 짧은 파장에서 흡광도가 표적 1의 존재를 나타낸다. 온도 1 (D1)에, 제2 표적 (표적 2)에 대하여 양쪽 분할된 및 온전한 LOCS 리포터는, 이의 스템 영역의 Tm이 온도 1 (D1)보다 높으므로, 흡광도의 검출가능한 분광 시프트 또는 임의의 색상 변화를 생산하지 않을 것이다. 그러므로, PCR 이후 온도 1 (D1)에서 수득된 흡광도의 분광 시프트 또는 임의의 색상 변화는 표적 2의 존재 또는 부재와 관계없이, 반응에서 표적 1의 존재를 반영할 것이다.
이의 각자의 MNA자임에 의한 LOCS 리포터의 표적-매개 절단은 색상 변화 (보라색에서 적색) 및/또는 흡광도의 분광 시프트를 또한 생산할 것이지만, 이것은 LOCS 스템 영역의 Tm보다 높은 특정 범위의 온도 내에서 단지 발생할 것이다. 본 실시예에서, 색상 변화 및/또는 흡광도의 분광 시프트는, 분할된 LOCS 리포터의 Tm보다 높지만, 온전한 LOCS 리포터의 Tm보다 낮은 (온전한 LOCS 리포터 Tm > 온도 2 > 분할된 LOCS 리포터 Tm), 증폭에 앞서, 및 이후 온도 2 (D2 = 70℃)에 측정될 수 있다 (ΔSD2). 그러므로, 온전한 LOCS 리포터는 온도 2 (D2)에 임의의 색상 변화 및/또는 흡광도의 분광 시프트를 생산하지 않을 것이고 그래서 (존재한다면) 이 온도에서 절단된 선형 기질 1에 관련되는 임의의 것 위에, PCR 동안 흡광도의 증가된 시프트는 분할된 LOCS-1과 결합될 것이고 표적 2의 존재를 나타낼 것이다.
이론적 실시예 14: 1개 선형 MNA자임 기질 및 1개 LOCS 프로브를 사용하여 2개 표적의 동시 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 검출 방법.
하기 실시예는 1개 온도 (D1)에 검출된 1개 선형 MNA자임 기질, 및 제2 온도 (D2)에 검출된 1개 LOCS 리포터를 사용하여 달성될 수 있는 단일 반응에서 2개 표적의 동시 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 검출 및 차별을 위하여 금 나노입자의 사용을 입증한다.
양쪽 선형 MNA자임 기질 및 LOCS 리포터는 하나의 단부에서 금 표면에 부착될 수 있고 다른 단부에서 금 나노입자 (GNP)로 표지될 수 있다. 선형 MNA자임 기질 및 LOCS가 미절단되고 온전한 경우, GNP는 금 표면에 가까이 근접하여 남아있을 것이고 측정가능한 기준선 SPR 신호를 나타낼 것이다. 특정 표적 1의 존재 하에서 그들의 각자의 MNA자임에 의한 선형 기질의 절단은 SPR 신호에서 측정가능한 시프트를 생산할 금 표면으로부터 GNP의 분리를 야기시킬 것이다. 본 실시예에서, 선형 MNA자임 기질로부터 SPR 신호에서 시프트는 증폭에 앞서, 및 이후 제1 온도 1 (D1 = 52℃)에서 검출될 수 있되 (ΔSD1), 여기서 SPR 신호에서 측정가능한 시프트는 표적 1의 존재를 나타낸다. 온도 1 (D1)에, 제2 표적 (표적 2)에 대하여 양쪽 분할된 및 온전한 LOCS 리포터는, 이의 스템 영역의 Tm이 온도 1 (D1)보다 높고 GNP가 금 표면에 혼성화된 채로 남아있을 것이므로, SPR 신호에서 임의의 측정가능한 시프트를 생산하지 않을 것이다. 그러므로, PCR 이후 온도 1 (D1)에 수득된 임의의 측정가능한 SPR 시프트는, 표적 2의 존재 또는 부재와 관계없이, 반응에서 표적 1의 존재를 반영할 것이다.
예를 들어 MNA자임에 의한 LOCS 리포터의 표적-매개 절단은 SPR 신호에서 측정가능한 시프트를 또한 생산할 수 있지만, 이것은 LOCS 스템 영역의 Tm보다 높은 특정 범위의 온도 내에서 단지 발생할 것이다. 본 실시예에서, SPR 신호에서 추가 측정가능한 시프트는, 분할된 LOCS 리포터의 Tm보다 높지만, 온전한 LOCS 리포터의 Tm보다 낮은 (온전한 LOCS 리포터 Tm > 온도 2 > 분할된 LOCS 리포터 Tm), 증폭에 앞서, 및 이후 (예를 들어 D2 = 70℃로) 온도 2에서 측정될 수 있다 (ΔSD2). 그러므로, 온전한 LOCS 리포터는 온도 2 (D2)에 SPR 신호에서의 임의의 측정가능한 시프트를 생산하지 않을 것이고 그래서 (존재한다면) 이 온도에서 절단된 선형 기질 1에 관련되는 임의의 것 위에, PCR 동안 SPR 신호에서의 증가된 측정가능한 시프트는 분할된 LOCS-1과 결합될 것이고 표적 2의 존재를 나타낼 것이다.
이론적 실시예 15: 1개 선형 MNA자임 기질 및 1개 LOCS 프로브를 사용하여 2개 표적의 동시 전기화학적 검출 방법.
하기 실시예는 1개 온도 (D1)에 검출된 1개 선형 MNA자임 기질, 및 제2 온도 (D2)에 검출된 1개 LOCS 리포터를 사용하여 달성될 수 있는 단일 반응에서 2개 표적의 동시 전기화학적 검출 및 차별을 위하여 산화환원 활성 종, 예컨대 메틸렌 블루의 사용을 입증한다.
양쪽 선형 MNA자임 기질 및 LOCS 리포터는 하나의 단부에서 Au-S 결합에 의해 전극 표면, 예컨대 금 전극 상에서 부동화될 수 있고 다른 단부에서 전기화학적으로 활성 분자인 메틸렌 블루로 표지될 수 있다. 선형 MNA자임 기질 및 LOCS가 미절단되고 온전한 경우, 메틸렌 블루 분자는 전극 표면에 가까이 근접하여 제한될 것이고 전기화학적 판독기에 의해 검출될 수 있는 큰 전류를 생성할 것이다.
특정 표적 1의 존재 하에서 그들의 각자의 MNA자임에 의한 선형 기질의 절단은 전류에서 상당한 감소를 야기시킬 전극 표면으로부터 메틸렌 블루 분자의 분리를 야기시킬 것이다. 본 실시예에서, 절단된 선형 MNA자임 기질로부터 전류에서의 감소는 증폭에 앞서, 및 이후 제1 온도 1 (D1 = 52℃)에서 검출될 수 있되 (ΔSD1), 여기서 전류에서의 이 감소는 표적 1의 존재를 나타내는데 사용될 수 있다. 온도 1 (D1)에, 제2 표적 (표적 2)에 대하여 양쪽 분할된 및 온전한 LOCS 리포터는, 이의 스템 영역의 Tm이 온도 1 (D1)보다 높고 메틸렌 블루 분자가 혼성화된 채로 전극 표면에 가까이 근접하여 남아있을 것이므로, 전류에서의 임의의 측정가능한 감소를 생산하지 않을 것이다. 그러므로, PCR 이후 온도 1 (D1)에 수득된 전류에서의 임의의 측정가능한 감소는 표적 2의 존재 또는 부재와 관계없이, 반응에서 표적 1의 존재를 반영할 것이다.
이의 각자의 MNA자임에 의한 LOCS 리포터의 표적-매개 절단은 전류에서의 측정가능한 감소를 또한 생산할 수 있지만, 이것은 LOCS 스템 영역의 Tm보다 높은 특정 범위의 온도 내에서 단지 발생할 것이다. 본 실시예에서, 전류에서의 추가 측정가능한 감소는, 분할된 LOCS 리포터의 Tm보다 높지만, 온전한 LOCS 리포터의 Tm보다 낮은 (온전한 LOCS 리포터 Tm > 온도 2 > 분할된 LOCS 리포터 Tm) 증폭에 앞서, 및 이후 온도 2 (D2 = 70℃)에서 측정될 수 있다 (ΔSD2). 그러므로, 온전한 LOCS 리포터는 온도 2 (D2)에 전류에서의 임의의 측정가능한 감소를 생산하지 않을 것이고 그래서 (존재한다면) 이 온도에서 절단된 선형 기질 1에 관련되는 임의의 것 위에, PCR 동안 전류에서의 추가 감소는 분할된 LOCS-1과 결합될 것이고 표적 2의 존재를 나타낼 것이다.
실시예 16: 1개 분자성 비콘 및 1개 LOCS 리포터 및 5'에서 3' 엑소뉴클레아제 활성이 부족한 폴리머라제를 대신하는 가닥을 사용하여 단일 파장에서 여러 표적의 동시 검출 및 정량화 방법.
하기 실시예는 1개 비-절단가능한 분자성 비콘 및 1개 LOCS 리포터를 사용하여 PCR 동안 실시간으로 2개 온도에서 형광 판독을 획득함으로써 단일 형광성 채널에서 2개 표적의 동시 검출 및 정량화 방법을 입증한다. 본 실험은 표적의 존재 하에서 분자성 비콘의 분해를 제거하기 위해 5' 엑소뉴클레아제 활성이 부족한 폴리머라제를 대신하는 가닥의 사용을 입증한다. 이 전략은 실시예 4에서 입증된 전문화된 분석 방법의 사용을 요구하지 않는다. 도　5에서 실례된 대로, 양쪽 분자성 비콘 및 LOCS 프로브는 동일한 형광 채널에서 동시 검출을 위하여 동일한 형광단 및 퀀처 모이어티로 표지된다. 분자성 비콘은 Tm A가 있는 스템 영역 및 표적 1 (TVbtub)로 특이적으로 혼성화할 수 있는 Tm B가 있는 루프 영역을 함유하고; 여기에서 Tm B는 Tm　A보다 크다 (Tm B > Tm A). 본 실시예에서, 온전한 LOCS 프로브는 Tm C (82℃)가 있는 스템 영역 및 표적 2 (MgPa) 존재 하에서 MNA자임에 의해 절단된 경우, Tm D (62℃)가 있는 분할된 LOCS를 생성하는 루프 영역을 갖고; 여기에서 Tm D는 Tm C (Tm D < Tm C)보다 적다. 표적 1 (TVbtub) 및/또는 표적 2 (MgPa)의 존재는 각 PCR 주기 후 실시간으로 어느 한쪽 2개 온도 (D1 및 D2; 50℃ 및 72℃)에 형광을 측정함으로써 구별될 수 있다. 하기 실시예에서, D1 < Tm A < Tm B < D2 및 D1 < Tm D < D2 < Tm C인 실시예 5에서 기재된 시나리오 3과 일치하는 Tm A는 ~60℃이고, Tm B는 ~68℃이고, Tm C는 ~82℃이고 Tm D는 ~62℃이다.
올리고뉴클레오티드
본 실험에 대해 특이적인 올리고뉴클레오티드는 표적 1 (TVbtub)의 증폭 및 정량화를 위하여 순방향 프라이머 12 (서열번호: 63), 역방향 프라이머 12 (SEQ ID: 64) 및 분자성 비콘 1 (SEQ ID: 68); 표적 2 (MgPa)의 증폭 및 정량화를 위하여 순방향 프라이머 5 (서열번호: 20), 역방향 프라이머 5 (서열번호: 21), 파트자임 A5 (서열번호: 22), 파트자임 B5 (서열번호: 23), LOCS-2 (서열번호: 25)를 포함한다. 서열은 서열 목록에서 열거된다.
반응 조건
표적 서열의 실시간 검출은 BioRad® CFX96 서모사이클러를 사용하여 20 μL의 총 반응 부피에서 수행되었다. 주기화 파라미터, 및 형광성 데이터 획득 (DA) 지점은 다음이었다: 2　분 동안 92℃, 15 초 동안 50℃ (DA) 및 15 초 동안 72℃ (DA)의 1 주기; 5 초 동안 92℃, 40 초 동안 50℃ (DA) 및 5 초 동안 72℃ (DA)의 50 주기. 모든 반응은 삼중으로 수행되었다. 각 반응은 40 nM의 각 순방향 프라이머, 200　nM의 각 역방향 프라이머, 200 nM의 각 파트자임, 200 nM의 분자성 비콘 1, 200 nM의 LOCS-2 리포터, 2 단위의 SD 폴리머라제 Hotstart (Bioron), 800 μM dNTP Mix (Bioline), 8 mM MgCl2 (Bioron) 및 1x NH4 완충액 (Bioline)을 함유하였다. 제1 플레이트 상에서 반응은 어느 한쪽 무 표적 (NF H2O), MgPa 유전자의 0 또는 25600 카피의 배경에서 TVbtub (25600, 6400, 1600, 400 또는 100 카피)의 합성 G-Block 또는 TVbtub 유전자의 0 또는 25600 카피의 배경에서 MgPa 유전자 (25600, 6400, 1600, 400 또는 100 카피)의 합성 G-Block의 다양한 농도를 함유하였다.
결과
PCR 증폭 동안, 형광은 표적 1 (TVbtub) 및/또는 표적 2 (MgPa)의 존재를 검출 및 정량화하기 위해 실시간으로 2개 온도에서 측정되었다. 분자성 비콘은 트리코모나스 바지날리스 (TV)의 검출을 위하여 TVbtub와 상동인 서열을 검출하도록 설계되었다. MNA자임은 마이코플라즈마 제니탈리움의 검출을 위하여 MgPa의 존재 하에서 LOCS-2를 절단하도록 설계되었다. 형광이 (최대 형광의 20%로 설정된) 동적 임계값을 넘는 주기 수 (Cq)는 TVbtub 및 MgPa, 각각을 검출하기 및 정량화하기 위하여 50℃ 및 72℃에서 실시간 형광 획득으로부터 결정되었다. PCR 동안 특정 신호의 존재 또는 부재는 실시예 5의 시나리오 3에서 기재된 것과 유사하다.
TVbtub의 25600, 6400, 1600, 400 및 100 카피를 함유하는 표준 반응은 MgPa의 존재 또는 부재 하에서 TVbtub를 함유하였던 샘플에서 50℃ (D1)에 시작하는 농도의 TVbtub를 정량화하기 위해 표준 곡선 (R2 = 0.989; E = 139.14%)을 구성하는데 사용되었다. 표 23은 50℃에 획득된 실시간 데이터로부터 수득된 표준 곡선으로부터 결정된 TVbtub의 카피 수를 요약한다. TVbtub의 계산된 카피 수는, 0.297의 p-값이 통계적 무의미를 확증하기 때문에 (스튜던트 짝짓기된 t-검사), 반응에서 MgPa의 25,600 카피의 존재에 의해 영향받지 않는다. 유사하게, MgPa의 25600, 6400, 1600, 400 및 100 카피를 함유하는 표준은 TVbtub의 존재 또는 부재 하에서 MgPa를 함유하였던 샘플에서 72℃ (D2)에 시작하는 농도의 MgPa를 정량화하기 위해 표준 곡선 (R2 = 0.990; E = 116.49%)을 구성하는데 사용되었다. 표 24는 72℃에 획득된 실시간 데이터로부터 수득된 표준 곡선으로부터 결정된 MgPa의 카피 수를 요약한다. MgPa의 계산된 카피 수는, 0.319의 p-값이 통계적 무의미를 확증하기 때문에 (스튜던트 짝짓기된 t-검사), 반응에서 TVbtub의 25,600 카피의 존재에 의해 영향받지 않는다.
Figure pct00025
Figure pct00026
실시예 17: 배경 신호가 어느 한쪽 실험적 반응에서 또는 표적이 부족한 등가 대조군 반응에서 측정되는; 증폭에 앞서, 또는 이후 획득된 하나 이상의 측정(들)을 사용하여 배경 신호를 결정하는 방법.
하기 실시예는 단일 파장에서 여러 표적의 정성적 분석을 허용하는 다양한 전략을 입증한다. 본 실시예에서 표시된 분석 방법은 실시예 1에서 표시된 종점 분석 방법 2와 유사하지만, 본 실시예는 배경 신호가 동일한 반응 웰에서 D1 및 D2에 단지 증폭전 판독을 사용하기 보다는 상이한 방법에 의해 결정될 수 있음을 입증한다.
검정은 표적 1 (CTcry)이 선형 MNA자임 기질을 사용하여 검출 및 차별될 수 있고, 표적 2 (NGopa)가 이의 루프 내에서 상이한 MNA자임 기질을 포함하는 LOCS 리포터를 사용하여 검출 및 차별될 수 있도록 설계된다. PCR 동안, MNA자임 1은 CTcry의 존재 하에서 선형 기질 1을 절단하여 형광단 및 퀀처를 분리시켜 넓은 범위의 온도에 걸쳐서 검출될 수 있는 신호에서의 증가를 생산할 수 있다. 본 실시예에서, CTcry의 종점 검출은, 실시예 1에서 ΔSD1과 유사한 기능의 역할을 하고, 아래 표 25에서 요약된 대로 몇몇 상이한 접근법을 사용하여 결정된, 온도 1 (D1; 52℃)에 PCR후 신호와 배경 신호 사이 차이로서 결정되는, 정규화된 형광 신호 (NSD1)를 결정함으로써 달성될 수 있다. 양쪽 온전한 및 분할된 구성에서 LOCS-1의 스템은 D1 위에 Tm을 갖고, 그러므로 NSD1은 LOCS-1의 절단에 의해 영향받지 않은 채로, 그리고 따라서 샘플에서 NGopa의 존재 또는 부재에 의해 영향받지 않은 채로 남아있다. 이와 같이, NSD1이 임계값 (X1)보다 큰 경우, 이것은 절단된 선형 MNA자임 기질 1 및 따라서 표적 1, CTcry의 존재를 나타낸다.
NGopa의 존재 하에서, MNA자임 2는 PCR 동안 LOCS-1을 절단할 수 있다. 온도 2 (D2, 70℃)에 정규화된 형광 신호 (NSD2)는, 표 25에 따라 재차 측정된, 온도 2에서 PCR후 신호와 배경 신호 사이 차이로서 계산될 수 있다. NSD2는 실시예 1에서 ΔSD2와 유사한 기능을 갖는다. PCR 동안 LOCS-1의 절단이 온도 2에서 증가된 정규화된 형광 신호 (NSD2)에 기여하지만, NSD1에 영향을 미치지 않으므로, NSD2와 NSD1 사이 차이 (NSD2 - NSD1)가 제2 임계값 (X2)을 넘는 경우; NSD2 - NSD1 = ΔNSD2NSD1 > X2는 분할된 LOCS-1의 존재를 나타낸다. 대조적으로, 기질 1 단독의 절단은 양쪽 NSD2 및 NSD1 값에서 증가에 기여하고, 여기서 이들 2개 값들 사이 차이 (ΔNSD2NSD1)는 제2 임계값 (X2)보다 적다. 그러므로 NSD2와 NSD1 사이 차이 (ΔNSD2NSD1 = NSD2 - NSD1)가 제2 임계값 (X2)보다 큰 경우 이것은 분할된 LOCS-1 및 따라서 표적 2, NGopa의 특정 검출을 나타낸다.
Figure pct00027
하기 실시예는 동일한 웰 내에 제3 온도 (D3)에서 PCR 전에 측정된 배경 신호 (SD3)가 NSD1 및 NSD2를 계산하는데 사용될 수 있음을 입증한다. 3개 상이한 PCR전 온도 즉 D3A = 40℃; D3B/D1 = 52℃ 및 D3C = 60℃는 검사되었다 (표 25). 이 전략은 여러 PCR전 데이터 획득 지점에 대하여 필요를 부정하고 (즉 D1 및 D2에서 2회 대신에 D3에서 1회) 실험의 시간 및 복잡성을 축소시킨다. 더욱이, 하기 실시예는 배경 신호가 템플레이트가 부족한 별도 음성 대조군 반응에서 측정될 수 있음을 입증한다. 1개 사례에서 D3B = 52℃ = D1에서 이루어진 단일 PCR전 배경 측정은 양쪽 NSD1 및 NSD2를 계산하는데 사용되었고; 한편 다른 사례에서 2개 배경 판독은 별도 음성 대조군 반응으로부터 PCR 이전, 또는 이후 어느 한쪽 이루어진 획득으로 D1 (52℃) 및 D2 (70℃)에서 이루어졌다.
올리고뉴클레오티드
본 실험에 대해 특이적인 올리고뉴클레오티드는 표적 1 (CTcry)의 증폭 및 검출을 위하여 순방향 프라이머 1 (서열번호: 1), 역방향 프라이머 1 (SEQ ID: 2), 파트자임 A1 (SEQ ID: 3), 파트자임 B1 (서열번호: 4) 및 선형 MNA자임 기질 1 (SED ID: 13); 표적 2 (NGopa)의 증폭 및 검출을 위하여 순방향 프라이머 2 (서열번호: 5), 역방향 프라이머 2 (서열번호: 6), 파트자임 A5 (서열번호: 7), 파트자임 B5 (서열번호: 8) 및 LOCS-1 (서열번호: 14)을 포함한다. 서열은 서열 목록에서 열거된다.
반응 조건
표적 서열의 실시간 검출은 BioRad® CFX96 서모사이클러를 사용하여 20 μL의 총 반응 부피에서 수행되었다. 주기화 파라미터, 및 형광성 데이터 획득 (DA) 지점은 다음이었다: 2　분 동안 95℃, 15 초 동안 40℃ (DA), 15 초 동안 52℃ (DA), 15 초 동안 62℃ (DA) 및 15 초 동안 70℃ (DA)의 1 주기; 5 초 동안 95℃ 및 30 초 동안 61℃의 10 주기 (주기당 0.5℃ 점감); 5 초 동안 95℃ 및 40 초 동안 52℃의 40 주기; 및 15 초 동안 52℃ (DA) 및 15 초 동안 70℃ (DA)의 1 주기. 모든 반응은 삼중으로 수행되었고 각 반응은 40 nM의 각 순방향 프라이머, 200　nM의 각 역방향 프라이머, 200 nM의 각 파트자임, 200 nM의 선형 MNA자임 기질 1, 200 nM의 LOCS-1 리포터 및 1x PlexMastermix (Bioline)를 함유하였다. 반응은 어느 한쪽 무 표적 (NF H2O), 또는 CTcry (10,000 또는 40 카피)의 합성 G-Block; 또는 NGopa 유전자 (10,000 또는 40 카피); 또는 NGopa 유전자 (10,000 및 40 카피)의 배경에서 CTcry 유전자 (10,000 또는 40 카피)의 다양한 농도를 함유하였다. 음성 (무 표적) 대조군 (NF H2O)을 제외한 모든 반응은 34.5 ng (10,000 카피)의 인간 게놈성 DNA의 배경을 추가로 함유하였다.
결과
도 26에서 결과는 40℃ (도 26A 내지 B); 52℃ (도 26C 내지 D) 및 62℃ (도 26E 내지 F)에서 동일한 반응 웰 내로부터 PCR전 형광 측정 (SD3)을 사용하여 결정된 배경 신호를 사용하여, CTcry 및 NGopa, 각각의 검출을 위하여 NSD1 (LHS) 및 ΔNSD2NSD1 (RHS)에 대하여 계산된 값을 실례한다. 도 27에서 결과는 별도 음성 대조군 반응으로부터 결정된 배경 신호 값을 사용하여, CTcry 및 NGopa, 각각의 검출을 위하여 NSD1 (LHS) 및 ΔNSD2NSD1 (RHS)에 대하여 계산된 값을 실례한다. 배경 신호는 PCR에 앞서 D3B/D1에서 (도 27A 내지 B) 및 PCR에 앞서 D1 및 D2에서 (도 27C 내지 D) 및 PCR 이후 (도 27E 내지 F) 측정된 무 템플레이트 대조군 신호의 평균으로서 결정되었다.
도 26A, 도 26C, 도 26E, 도 27A, 도 27C 및 도 27E에서 결과는 모든 시나리오의 경우, NGopa가 존재하는지 또는 부재하는지와 관계없이 샘플 내에서 CTcry가 존재하는 경우 온도 1에 정규화된 신호 (NSD1)가 임계값 1 (X1)보다 크지만, NGopa 단독 존재 하에서 및/또는 CTcry가 샘플로부터 부재인 경우 이 임계값을 넘지 않음을 보여준다. 그러므로, 온도 1에 임계값 1보다 큰 정규화된 종점 신호는 CTcry의 존재를 나타낸다. 도 26B, 도 26D, 도 26F, 도 27B, 도 27D 및 도 27F에서 결과는 모두 6개 시나리오의 경우, NGopa가 샘플 내에서 존재하는 경우 ΔNSD2NSD1이 임계값 2 (X2)보다 크지만, CTcry 단독이 샘플 내에서 존재하는 경우 및/또는 NGopa가 샘플로부터 부재인 경우 (NTC) 이 임계값을 넘지 않음을 실례한다. 그러므로, 임계값 2보다 큰 (ΔNSD2NSD1>X2), 정규화된 종점 형광성 신호, NSD2 및 NSD1에서의 차이는 NGopa의 존재를 나타낸다.
본 실시예는 제3 온도에서 및/또는 별도 음성 대조군 반응에서 데이터로부터 측정되어야 하는 배경 신호 결정하기의 유연성으로 단일 형광 채널에서 2개 표적의 종점 검출 및 차별에 대하여 1개 선형 MNA자임 기질 및 1개 LOCS 리포터의 사용을 입증한다.
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
표 26에서 올리고 서열의 설명
올리고뉴클레오티드 서열은 5'에서 3'로 열거된다. 대문자 염기는 DNA를 나타내고 소문자 염기는 RNA를 나타낸다. /56-FAM/은 FAM 형광단의 자리를 표시하고, /56-JOEN/은 JOE 형광단의 자리를 표시하고, /5RHO101N/은 ATTO Rho101 형광단의 자리를 표시하고, /5Atto680N/은 ATTO 680 형광단의 자리를 표시하고 /5Cy5/는 cy5.5 형광단의 자리를 표시한다. /3IABkFQ/는 420 - 620 nm의 범위에서 형광을 흡수할 수 있는 Iowa Black FQ 퀀처의 자리를 나타내고 /3IAbRQSp/는 500 - 700 nm의 범위에서 형광을 흡수하는데 사용된 Iowa Black RQ 퀀처의 자리를 나타낸다. /3Phos/는 3' 포스페이트 기를 표시한다.

Claims (193)

  1. 샘플에서 제1 및 제2 표적의 존재 또는 부재를 결정하는 방법으로서,
    (a) 상기 제1 및 제2 표적을 추정적으로 포함하는 상기 샘플 또는 이의 유도체를
    - 상기 제1 표적의 검출을 위한, 그리고 제1 검출가능한 신호를 생성할 수 있는 제1 검출 모이어티를 포함하는 제1 올리고뉴클레오티드;
    - 상기 제2 표적의 검출을 위한, 그리고 혼성화된 뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분을 포함하고, 이의 대향 가닥은 미혼성화된 뉴클레오티드의 끊어지지 않은 단일-가닥 루프 부분에 의해 연결되며, 상기 스템 부분이 제2 검출가능한 신호를 생성할 수 있는 제2 검출 모이어티를 포함하는, 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드,
    여기서 상기 제1 및 제2 검출 모이어티는 단일 유형의 검출기를 사용하여 단일 온도에서 차별될 수 없는 검출가능한 신호를 생성할 수 있음; 및
    - 상기 제2 표적이 상기 샘플에서 존재하는 때만 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 미혼성화된 뉴클레오티드의 하나 이상을 소화시킬 수 있는 제1 효소
    와 접촉시킴으로써 반응을 위한 혼합물을 제조하는 단계;
    (b) 다음에 적합한 조건 하에 상기 혼합물을 처리하는 단계:
    - 상기 제1 올리고뉴클레오티드에 대한 변형을 유도하여 이에 의해 상기 제1 검출 모이어티가 제1 검출가능한 신호를 생성할 수 있게 하는 상기 제1 표적,
    - 상기 단일-가닥 루프 부분을 끊고 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드를 제공하기 위해, 상기 제2 표적이 상기 샘플에서 존재하는 때만, 상기 제1 효소에 의해 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 미혼성화된 뉴클레오티드의 하나 이상의 소화;
    (c) 다음을 측정하는 단계:
    - 상기 혼합물에서, 또는, 대조군 혼합물에서 상기 제1 및 상기 제2 검출 모이어티에 의해 제공된 배경 신호;
    (d) 상기 처리 동안 또는 후에 하나 이상의 시점에서 다음 여부를 결정하는 단계:
    - 상기 변형으로부터 발생하는 제1 검출가능한 신호가 상기 배경 신호와 상이한 제1 온도에서 생성되고 상기 샘플에서 상기 제1 표적의 존재를 나타내는지;
    - 제2 검출가능한 신호가 상기 배경 신호와 상이한 제2 온도에서 생성되고 상기 샘플에서 상기 제2 표적의 존재를 나타내는지
    를 포함하되,
    - 상기 제1 온도에서 상기 제2 검출가능한 신호는 상기 배경 신호와 상이하지 않고,
    상기 제2 온도에서,
    존재한다면, 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분의 가닥은 부분적으로 또는 완전히 해리되어 상기 제2 검출 모이어티가 상기 제2 검출가능한 신호를 제공할 수 있게 하고;
    존재한다면, 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분의 가닥은 해리할 수 없어 이에 의해 상기 제2 검출가능한 모이어티가 상기 제2 검출가능한 신호를 제공하는 것을 방지하는,
    방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 파트 (d)에서 상기 결정하는 단계는,
    - 미리결정된 역치를 사용하여 상기 변형으로부터 발생하는 상기 제1 검출가능한 신호가 상기 제1 온도에서 임의의 배경 신호와 상이한지를 결정하는 단계; 및/또는
    - 미리결정된 역치를 사용하여 상기 제2 검출가능한 신호가 상기 제2 온도에서 임의의 배경 신호와 상이한지를 결정하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 대조군 혼합물이
    - 상기 제1 표적; 또는
    - 상기 제2 표적; 또는
    - 상기 제1 및 제2 표적
    을 포함하지 않지만, 그렇지 않으면 상기 혼합물과 동등한 것인, 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대조군 혼합물이 미리결정된 양의
    - 상기 제1 표적; 또는
    - 상기 제2 표적; 또는
    - 상기 제1 및 제2 표적
    을 포함하지만, 그렇지 않으면 상기 혼합물과 동등한 것인, 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 제1 올리고뉴클레오티드에 대한 상기 변형이 상기 제1 검출 모이어티가 상기 제1 온도에서 또는 미만에서 상기 제1 검출가능한 신호를 제공하게 할 수 있고;
    - 상기 제1 검출가능한 신호의 생성이 가역적인,
    방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    - 파트 (c)가 상기 혼합물에서, 또는, 상기 대조군 혼합물에서 상기 제1 및 상기 제2 검출 모이어티에 의해 제공된; 제1 온도의 1℃, 2℃, 3℃, 4℃, 또는 5℃에서 또는 그 온도 내에서 제1 배경 신호, 및 제2 온도의 1℃, 2℃, 3℃, 4℃, 또는 5℃에서 또는 그 온도 내에서 제2 배경 신호를 측정하는 단계를 포함하고;
    - 파트 (d)가 상기 처리 동안 또는 후에 하나 이상의 시점에서:
    상기 변형으로부터 발생하는 제1 검출가능한 신호가 상기 제1 배경 신호와 상이한 상기 제1 온도에서 생성되고 상기 샘플에서 상기 제1 표적의 존재를 나타내는지;
    제2 검출가능한 신호가 상기 제2 배경 신호와 상이한 상기 제2 온도에서 생성되고 상기 샘플에서 상기 제2 표적의 존재를 나타내는지
    여부를 결정하는 단계를 포함하는,
    방법.
  7. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서,
    - 상기 제1 표적이 핵산 서열이고;
    - 상기 제1 올리고뉴클레오티드가 모두 또는 한 부분이 상기 제1 표적에 상보적인 미혼성화된 뉴클레오티드의 끊어지지 않은 단일-가닥 루프 부분에 의해 연결되는 대향 가닥 상에 혼성화된 뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분을 포함하는 스템-루프 올리고뉴클레오티드이고;
    - 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 변형이 상보적 염기 짝짓기에 의해 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 단일-가닥 루프 부분에 상기 표적의 혼성화로부터 발생하는 입체구조적 변화인,
    방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    - 상기 입체구조적 변화가 상보적 염기 짝짓기에 의해 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 단일-가닥 루프 부분에 상기 표적의 혼성화로부터 발생하는 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분에서 가닥의 해리인,
    방법.
  9. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서,
    - 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 스템 부분이 용융 온도 (Tm)를 가지되, 제1 올리고뉴클레오티드의 단일-가닥 루프 부분에 상기 표적의 혼성화로부터 형성된 이중-가닥 듀플렉스의 Tm 미만, 및 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고;
    - 상기 이중-가닥 듀플렉스가 Tm을 가지되, 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과, 및 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고;
    - 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분이 Tm을 가지되, 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고;
    - 상기 제1 온도가 상기 이중-가닥 듀플렉스, 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 스템 부분, 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분, 및 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고;
    - 상기 제2 온도가 상기 이중-가닥 듀플렉스, 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 스템 부분, 및 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고; 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고;
    - 상기 제1 온도가 상기 제2 온도 미만인,
    방법.
  10. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서,
    - 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 스템 부분이 용융 온도 (Tm)를 가지되, 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 단일-가닥 루프 부분에 상기 표적의 혼성화로부터 형성된 이중-가닥 듀플렉스의 Tm 미만, 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고;
    - 상기 이중-가닥 듀플렉스가 Tm을 가지되, 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고;
    - 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분이 Tm을 가지되, 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고;
    - 상기 제1 온도가 상기 이중-가닥 듀플렉스, 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 스템 부분, 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분, 및 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고;
    - 상기 제2 온도가 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 스템 부분, 및 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고; 상기 이중-가닥 듀플렉스, 및 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고;
    - 상기 제1 온도가 상기 제2 온도 미만인,
    방법.
  11. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서,
    - 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 스템 부분이 용융 온도 (Tm)를 가지되, 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 단일-가닥 루프 부분에 상기 표적의 혼성화로부터 형성된 이중-가닥 듀플렉스의 Tm 미만, 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만, 및 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고;
    - 상기 이중-가닥 듀플렉스가 Tm을 가지되, 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고;
    - 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분이 Tm을 가지되, 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고;
    - 상기 제1 온도가 상기 이중-가닥 듀플렉스, 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 스템 부분, 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분, 및 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고;
    - 상기 제2 온도가 상기 이중-가닥 듀플렉스, 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 스템 부분, 및 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고; 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고;
    - 상기 제1 온도가 상기 제2 온도 미만인,
    방법.
  12. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서,
    - 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 스템 부분이 용융 온도 (Tm)를 가지되, 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 단일-가닥 루프 부분에 상기 표적의 혼성화로부터 형성된 이중-가닥 듀플렉스의 Tm 미만, 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과, 및 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고;
    - 상기 이중-가닥 듀플렉스가 Tm을 가지되, 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과, 및 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고;
    - 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분이 Tm을 가지되, 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고;
    - 상기 제1 온도가 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 스템 부분 및 상기 이중-가닥 듀플렉스의 Tm 미만이고; 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분 및 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고;
    - 상기 제2 온도가 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 스템 부분, 상기 이중-가닥 듀플렉스, 및 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고; 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고;
    - 상기 제1 온도가 상기 제2 온도 초과인,
    방법.
  13. 제 7 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm이 상기 이중-가닥 듀플렉스의 Tm보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 낮고/낮거나;
    - 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm이 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 높고/거나;
    - 상기 제1 온도가 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 스템 부분, 및/또는 상기 이중-가닥 듀플렉스의 Tm보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 낮고/거나;
    - 상기 제2 온도가 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 낮고/거나;
    - 상기 제2 온도가 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 높은,
    방법.
  14. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서,
    - 상기 제1 표적이 핵산 서열이고;
    - 상기 제1 올리고뉴클레오티드가
    혼성화된 뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분으로서, 이의 대향 가닥이, 이의 전부 또는 한 부분이 상기 제1 표적에 상보적인, 미혼성화된 뉴클레오티드의 단일-가닥 루프 부분, 및 3' 방향으로 상기 대향 가닥들 중 하나로부터 확장하고 상기 제1 표적의 한 부분에 상보적인 서열로 종결하는 제2 단일-가닥 부분에 의해 연결되는, 혼성화된 뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분, 그리고
    상기 제1 표적의 부분에 상보적인 상기 서열에 선행하는 차단제 분자
    를 포함하는 스템-루프 올리고뉴클레오티드이고;
    - 상기 혼합물이 추가로 폴리머라제를 포함하고;
    - 상기 혼합물 상기 처리가
    상보적 염기 짝짓기에 의해 상기 제1 표적에 상기 제2 단일-가닥 부분을 혼성화하는 단계;
    상기 차단제 분자는 상기 폴리머라제가 템플레이트로서 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 스템 부분을 사용하여 상기 제1 표적을 확장시키는 것을 방지하는, 템플레이트 서열로서 상기 제1 표적 및 상기 폴리머라제를 사용하여 상기 제2 단일-가닥 부분을 확장시켜 이중-가닥 핵산을 제공하는 단계; 및
    상기 이중-가닥 핵산을 변성시키고 상보적 염기 짝짓기에 의해 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 단일-가닥 루프 부분에 상기 폴리머라제에 의해 확장된 상기 제2 단일-가닥 부분을 혼성화하여 신호전달 듀플렉스를 생산하고 이에 의해 상기 변형을 상기 제1 올리고뉴클레오티드에 제공하여 상기 제1 검출 모이어티가 상기 제1 검출가능한 신호를 제공하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  15. 제 14 항에 있어서,
    - 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 스템 부분이 용융 온도 (Tm)를 가지되, 상기 신호전달 듀플렉스의 Tm 미만 및 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고;
    - 상기 신호전달 듀플렉스가 Tm을 가지되, 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과, 및 상기 분할된 스템-루프 올리고 뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고;
    - 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분이 Tm을 가지되, 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고;
    - 상기 제1 온도가 상기 신호전달 듀플렉스, 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 스템 부분, 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분, 및 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고;
    - 상기 제2 온도가 상기 신호전달 듀플렉스, 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 스템 부분, 및 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고; 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고;
    - 상기 제1 온도가 상기 제2 온도 미만인,
    방법.
  16. 제 14 항에 있어서,
    - 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 스템 부분이 용융 온도 (Tm)를 가지되, 상기 신호전달 듀플렉스의 Tm 미만, 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고;
    - 상기 신호전달 듀플렉스가 Tm을 가지되, 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고;
    - 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분이 Tm을 가지되, 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고;
    - 상기 제1 온도가 상기 신호전달 듀플렉스, 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 스템 부분, 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분, 및 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고;
    - 상기 제2 온도가 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 스템 부분, 및 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고; 상기 신호전달 듀플렉스, 및 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고;
    - 상기 제1 온도가 상기 제2 온도 미만인,
    방법.
  17. 제 14 항에 있어서,
    - 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 스템 부분이 용융 온도 (Tm)를 가지되, 상기 신호전달 듀플렉스의 Tm 미만, 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만, 및 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고;
    - 상기 신호전달 듀플렉스가 Tm을 가지되, 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고,
    - 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분이 Tm을 가지되, 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고;
    - 상기 제1 온도가 상기 신호전달 듀플렉스, 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 스템 부분, 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분, 및 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고;
    - 상기 제2 온도가 상기 신호전달 듀플렉스, 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 스템 부분, 및 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고; 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고;
    - 상기 제1 온도가 상기 제2 온도 미만인,
    방법.
  18. 제 14 항에 있어서,
    - 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 스템 부분이 용융 온도 (Tm)를 가지되, 상기 신호전달 듀플렉스의 Tm 미만, 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과, 및 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고;
    - 상기 신호전달 듀플렉스가 Tm을 가지되, 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과, 및 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고;
    - 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분이 Tm을 가지되, 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고;
    - 상기 제1 온도가 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 스템 부분 및 상기 신호전달 듀플렉스의 Tm 미만이고; 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분 및 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고;
    - 상기 제2 온도가 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 스템 부분, 상기 신호전달 듀플렉스, 및 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고; 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고;
    - 상기 제1 온도가 상기 제2 온도 초과인,
    방법.
  19. 제 14 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm이 상기 신호전달 듀플렉스의 Tm보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 낮고/거나;
    - 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm이 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 높고/거나;
    - 상기 제1 온도가 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 스템 부분, 및/또는 상기 신호전달 듀플렉스의 Tm보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 낮고/거나;
    - 상기 제2 온도가 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 낮고/거나;
    - 상기 제2 온도가 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 높은,
    방법.
  20. 제 5 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 제1 검출 모이어티가 형광단이고 상기 변형이 퀀처 분자로부터 이의 거리를 증가시키는,
    방법.
  21. 제 20 항에 있어서,
    - 상기 제1 올리고뉴클레오티드가 상기 퀀처 분자를 포함하는,
    방법.
  22. 제 21 항에 있어서,
    - 상기 형광단 및 상기 퀀처 분자가 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분의 대향 가닥 상에 위치해 있는,
    방법.
  23. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서,
    - 상기 제1 표적이 핵산 서열이고;
    - 상기 제1 올리고뉴클레오티드가
    이의 제1 가닥이 상기 제1 표적의 한 부분에 혼성화할 수 있는 상보적 서열로 종결하는 단일-가닥 부분으로 확장하되, 상기 제1 가닥이 상기 상보적 서열에 선행하는 차단제 분자를 포함하는, 혼성화된 뉴클레오티드의 제1 이중-가닥 부분
    을 포함하고;
    - 상기 혼합물이 추가로 폴리머라제를 포함하고;
    - 상기 혼합물 상기 처리가
    상보적 염기 짝짓기에 의해 상기 제1 표적의 한 부분에 상기 단일-가닥 부분의 상보적 서열을 혼성화하기;
    상기 차단제 분자는 상기 폴리머라제가 템플레이트로서 상기 제1 이중-가닥 부분의 제1 가닥을 사용하여 상기 제1 표적을 확장시키는 것을 방지하는, 템플레이트 서열로서 상기 제1 표적 및 상기 폴리머라제를 사용하여 상기 상보적 서열을 확장시켜 제2 이중-가닥 부분을 제공하기;
    상기 제1 및 제2 이중-가닥 부분을 변성시키기; 및
    상보적 염기 짝짓기에 의해 상기 제1 이중-가닥 부분의 제1 가닥에 상기 폴리머라제에 의해 확장된 상기 상보적 서열을 혼성화하여 신호전달 듀플렉스를 생산하고 이에 의해 상기 변형을 상기 제1 올리고뉴클레오티드에 제공하여 상기 제1 검출 모이어티가 상기 제1 검출가능한 신호를 제공하게 하기
    를 포함하는, 방법.
  24. 제 23 항에 있어서,
    - 상기 제1 이중-가닥 부분이 용융 온도 (Tm)를 가지되, 상기 신호전달 듀플렉스의 Tm 미만, 및 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고;
    - 상기 신호전달 듀플렉스가 Tm을 가지되, 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과, 및 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고;
    - 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분이 Tm을 가지되, 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고;
    - 상기 제1 온도가 상기 신호전달 듀플렉스, 상기 제1 이중-가닥 부분, 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분, 및 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고;
    - 상기 제2 온도가 상기 신호전달 듀플렉스, 상기 제1 이중-가닥 부분, 및 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고; 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고;
    - 상기 제1 온도가 상기 제2 온도 미만인,
    방법.
  25. 제 23 항에 있어서,
    - 상기 제1 이중-가닥 부분이 용융 온도 (Tm)를 가지되, 상기 신호전달 듀플렉스의 Tm 미만, 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고;
    - 상기 신호전달 듀플렉스가 Tm을 가지되, 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고;
    - 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분이 Tm을 가지되, 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고;
    - 상기 제1 온도가 상기 신호전달 듀플렉스, 상기 제1 이중-가닥 부분, 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분, 및 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고;
    - 상기 제2 온도가 상기 제1 이중-가닥 부분, 및 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고; 상기 신호전달 듀플렉스, 및 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고;
    - 상기 제1 온도가 상기 제2 온도 미만인,
    방법.
  26. 제 23 항에 있어서,
    - 상기 제1 이중-가닥 부분이 용융 온도 (Tm)를 가지되, 상기 신호전달 듀플렉스의 Tm 미만, 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만, 및 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고;
    - 상기 신호전달 듀플렉스가 Tm을 가지되, 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고;
    - 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분이 Tm을 가지되, 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고;
    - 상기 제1 온도가 상기 신호전달 듀플렉스, 상기 제1 이중-가닥 부분, 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분, 및 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고;
    - 상기 제2 온도가 상기 신호전달 듀플렉스, 상기 제1 이중-가닥 부분, 및 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고; 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고;
    - 상기 제1 온도가 상기 제2 온도 미만인,
    방법.
  27. 제 23 항에 있어서,
    - 상기 제1 이중-가닥 부분이 용융 온도 (Tm)를 가지되, 상기 신호전달 듀플렉스의 Tm 미만, 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과, 및 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고;
    - 상기 신호전달 듀플렉스가 Tm을 가지되, 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과, 및 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고;
    - 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분이 Tm을 가지되, 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고;
    - 상기 제1 온도가 상기 제1 이중-가닥 부분 및 상기 신호전달 듀플렉스의 Tm 미만이고; 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분 및 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고;
    - 상기 제2 온도가 상기 제1 이중-가닥 부분, 상기 신호전달 듀플렉스, 및 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고; 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고;
    - 상기 제1 온도가 상기 제2 온도 초과인,
    방법.
  28. 제 23 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 제1 이중-가닥 부분의 Tm이 상기 신호전달 듀플렉스의 Tm보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 낮고/거나;
    - 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm이 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 높고/거나;
    - 상기 제1 온도가 상기 제1 이중-가닥 부분, 및/또는 상기 신호전달 듀플렉스의 Tm보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 낮고/거나;
    - 상기 제2 온도가 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 낮고/거나;
    - 상기 제2 온도가 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 높은,
    방법.
  29. 제 23 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 제1 검출 모이어티가 형광단이고 상기 변형이 퀀처 분자로부터 이의 거리를 증가시키는,
    방법.
  30. 제 29 항에 있어서,
    - 상기 제1 올리고뉴클레오티드가 상기 퀀처 분자를 포함하는,
    방법.
  31. 제 30 항에 있어서,
    - 상기 형광단 및 상기 퀀처 분자가 상기 제1 이중-가닥 부분의 대향 가닥 상에 위치해 있는,
    방법.
  32. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서,
    - 상기 제1 표적이 핵산 서열이고;
    - 상기 혼합물이 추가로
    상기 제1 표적에서 제1 서열에 상보적인 제1 프라이머,
    상기 제1 서열과 상이한 상기 제1 표적에서 제2 서열에 상보적인 구성요소, 및 상기 제1 표적에 상보적이지 않은 태그 부분을 포함하는 제2 올리고뉴클레오티드,
    엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 제1 폴리머라제, 및
    임의로 제2 폴리머라제
    를 포함하고,
    - 상기 혼합물 상기 처리가
    상기 제1 표적에 상기 제1 프라이머 및 상기 제2 올리고뉴클레오티드를 혼성화하기에 적합한 조건,
    템플레이트로서 상기 표적 및 상기 제1 폴리머라제를 사용하여 상기 제1 프라이머를 확장시켜 이에 의해 상기 태그 부분을 절단 제거하기,
    상보적 염기 짝짓기에 의해 상기 제1 올리고뉴클레오티드에 상기 절단된 태그 부분을 혼성화하기,
    그리고, 템플레이트로서 상기 제1 올리고뉴클레오티드 및 상기 제1 또는 제2 폴리머라제를 사용하여 상기 태그 부분을 확장시켜 상기 제1 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중-가닥 서열을 생성하여 이에 의해 상기 제1 올리고뉴클레오티드에 상기 변형을 제공하고 상기 제1 검출 모이어티가 상기 제1 검출가능한 신호를 제공하게 하기
    를 포함하는, 방법.
  33. 제 32 항에 있어서,
    - 상기 이중-가닥 서열이 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과, 및 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과인 Tm을 갖고;
    - 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분이 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과인 Tm을 갖고;
    - 상기 제1 온도가 상기 이중-가닥 서열, 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분, 및 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고;
    - 상기 제2 온도가 상기 이중-가닥 서열, 및 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고; 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고;
    - 상기 제1 온도가 상기 제2 온도 미만인,
    방법.
  34. 제 32 항에 있어서,
    - 상기 이중-가닥 서열이 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과인 Tm을 갖고;
    - 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분이 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과인 Tm을 갖고;
    - 상기 제1 온도가 상기 이중-가닥 서열, 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분, 및 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고;
    - 상기 제2 온도가 그리고 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고; 상기 이중-가닥 서열, 및 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고;
    - 상기 제1 온도가 상기 제2 온도 미만인,
    방법.
  35. 제 32 항에 있어서,
    - 상기 이중-가닥 서열이 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만인 Tm을 갖고;
    - 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분이 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과인 Tm을 갖고;
    - 상기 제1 온도가 상기 이중-가닥 서열, 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분, 및 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고;
    - 상기 제2 온도가 상기 이중-가닥 서열, 및 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고; 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고;
    - 상기 제1 온도가 상기 제2 온도 미만인,
    방법.
  36. 제 32 항에 있어서,
    - 상기 이중-가닥 서열이 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과, 및 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과인 Tm을 갖고;
    - 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분이 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과인 Tm을 갖고;
    - 상기 제1 온도가 상기 이중-가닥 서열의 Tm 미만이고; 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분 및 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고;
    - 상기 제2 온도가 상기 이중-가닥 서열 및 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고; 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고;
    - 상기 제1 온도가 상기 제2 온도 초과인,
    방법.
  37. 제 32 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm이 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 높고/거나;
    - 상기 제1 온도가 상기 이중-가닥 서열의 Tm보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 낮고/거나;
    - 상기 제2 온도가 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 낮고/거나;
    - 상기 제2 온도가 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 높은,
    방법.
  38. 제 32 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 제1 올리고뉴클레오티드가 형광단 및 퀀처 분자를 포함하고,
    - 상기 태그 부분 상기 확장이 상기 형광단과 상기 퀀처 분자 사이 거리를 증가시키는,
    방법.
  39. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서,
    - 상기 제1 표적이 핵산 서열이고;
    - 상기 제1 올리고뉴클레오티드가 상기 표적의 제1 부분에 상보적이고;
    - 상기 혼합물이 추가로, 상기 제1 표적의 제1 및 제2 부분이 서로 측접하지만 중첩하지 않는, 상기 제1 표적 제2 부분에 상보적인 추가 올리고뉴클레오티드를 포함하고;
    - 상기 혼합물 상기 처리가
    (iii) 상보적 염기 짝짓기에 의해 상기 표적에 상기 제1 올리고뉴클레오티드를 혼성화시킴으로써 제1 이중-가닥 구성요소, 및
    (iv) 상보적 염기 짝짓기에 의해 상기 표적에 상기 추가 올리고뉴클레오티드를 혼성화시킴으로써 제2 이중-가닥 구성요소
    를 포함하는 듀플렉스 구조를 형성하기,
    이에 의해 상기 제1 및 추가 올리고뉴클레오티드를 근접시키고, 상기 제1 올리고뉴클레오티드에 상기 변형을 제공하여 상기 제1 검출 모이어티가 상기 제1 검출가능한 신호를 제공하게 하기
    를 포함하는, 방법.
  40. 제 39 항에 있어서,
    - 상기 듀플렉스 구조가 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만인 Tm을 갖고;
    - 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분이 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과인 Tm을 갖고;
    - 상기 제1 온도가 상기 듀플렉스 구조, 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분, 및 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고;
    - 상기 제2 온도가 상기 듀플렉스 구조, 및 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고; 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고;
    - 상기 제1 온도가 상기 제2 온도 미만인,
    방법.
  41. 제 39 항 또는 제 40항에 있어서,
    - 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm이 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 높고/거나;
    - 상기 제1 온도가 상기 듀플렉스 구조의 Tm보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 낮고/거나;
    - 상기 제2 온도가 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 낮고/거나;
    - 상기 제2 온도가 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 높은,
    방법.
  42. 제 39 항 내지 제 41 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 제1 검출가능한 모이어티가 형광단이고 상기 추가 올리고뉴클레오티드가 퀀처를 포함하고;
    - 상기 듀플렉스 구조의 형성이 추가로 상기 형광단 및 퀀처를 근접시키고;
    - 상기 검출가능한 신호가 상기 제1 검출 모이어티에 의해 제공된 형광에서의 감소인,
    방법.
  43. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서,
    - 상기 제1 표적이 핵산 서열이고;
    - 상기 제1 검출 모이어티가 나노입자, 금속성 나노입자, 귀금속 나노입자, 알칼리 금속 나노입자, 금 나노입자, 또는 은 나노입자이고; 여기에 상기 제1 올리고뉴클레오티드가 결합되고;
    - 상기 혼합물 상기 처리가
    상기 제1 올리고뉴클레오티드에 상기 제1 표적을 혼성화시켜 이에 의해 상기 제1 올리고뉴클레오티드에 상기 변형을 유도하여 상기 제1 검출 모이어티가 상기 샘플에서 상기 제1 표적의 존재를 나타내는 제1 검출가능한 신호를 제공하게 하기를 포함하되;
    상기 제1 검출가능한 신호가, 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 변형 이후 상기 제1 검출 모이어티로부터 발생하는,
    (i) 굴절률에서의 변화,
    (ii) 색에서의 변화; 및/또는
    (iii) 흡수 스펙트럼에서의 변화인,
    방법.
  44. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서,
    - 상기 제1 표적이 핵산 서열이고;
    - 상기 제1 검출 모이어티가 상기 제1 올리고뉴클레오티드가 결합되는 전기화학적 제제이고;
    - 상기 혼합물 상기 처리가
    상기 제1 올리고뉴클레오티드에 상기 제1 표적을 혼성화시켜 이에 의해 상기 제1 올리고뉴클레오티드에 상기 변형을 유도 또는 촉진하여 상기 제1 검출 모이어티가 상기 샘플에서 상기 제1 표적의 존재를 나타내는 제1 검출가능한 신호를 제공하도록 하기를 포함하되;
    상기 제1 검출가능한 신호가 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 변형 이후 상기 제1 검출 모이어티로부터 발생하는 전기화학적 신호에서의 변화인,
    방법.
  45. 제 44 항에 있어서,
    - 상기 전기화학적 제제가 나노입자, 메틸렌 블루, 톨루엔 블루, 오라세트 블루, Hoechst 33258, [Ru(phen)3]2+, 페로센, 및/또는 다우노마이신 중 어느 하나 이상으로부터 선택되는,
    방법.
  46. 제 5 항 내지 제 19 항, 제 23 항 내지 제 28 항, 제 32 항 내지 제 37 항, 및 제 39 항 내지 제 41 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 제1 검출 모이어티가 나노입자, 금속성 나노입자, 귀금속 나노입자, 알칼리 금속 나노입자, 금 나노입자, 또는 은 나노입자이고; 여기에 상기 제1 올리고뉴클레오티드가 결합되고;
    - 상기 제1 검출가능한 신호가, 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 변형 이후 상기 제1 검출 모이어티로부터 발생하는,
    (i) 굴절률에서의 변화,
    (ii) 색에서의 변화; 및/또는
    (iii) 흡수 스펙트럼에서의 변화인,
    방법.
  47. 제 5 항 내지 제 19 항, 제 23 항 내지 제 28 항, 제 32 항 내지 제 37 항, 및 제 39 항 내지 제 41 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 제1 검출 모이어티가 상기 제1 올리고뉴클레오티드가 결합되는 전기화학적 제제이고;
    - 상기 제1 검출가능한 신호가 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 변형 이후 상기 제1 검출 모이어티로부터 발생하는 전기화학적 신호에서의 변화인,
    방법.
  48. 제 47 항에 있어서,
    - 상기 전기화학적 제제가 나노입자, 메틸렌 블루, 톨루엔 블루, 오라세트 블루, Hoechst 33258, [Ru(phen)3]2+, 페로센, 및/또는 다우노마이신 중 어느 하나 이상으로부터 선택되는,
    방법.
  49. 제 43 항 내지 제 48 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 제2 검출 모이어티가 나노입자, 금속성 나노입자, 귀금속 나노입자, 알칼리 금속 나노입자, 금 나노입자, 또는 은 나노입자이고; 여기에 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드가 결합되고;
    - 상기 제2 검출가능한 신호가, 해리하는 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분의 가닥으로부터 발생하는,
    (i) 굴절률에서의 변화,
    (ii) 색에서의 변화; 및/또는
    (iii) 흡수 스펙트럼에서의 변화인,
    방법.
  50. 제 43 항 내지 제 48 항 중 어느 한 항 중 어느 하나에 있어서,
    - 상기 제2 검출 모이어티가 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드가 결합되는 전기화학적 제제이고;
    - 상기 제2 검출가능한 신호가 해리하는 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분의 가닥으로부터 발생하는 전기화학적 신호에서의 변화인,
    방법.
  51. 제 50 항에 있어서,
    - 상기 전기화학적 제제가 나노입자, 메틸렌 블루, 톨루엔 블루, 오라세트 블루, Hoechst 33258, [Ru(phen)3]2+, 페로센, 및/또는 다우노마이신 중 어느 하나 이상으로부터 선택되는,
    방법.
  52. 제 20 항 내지 제 22 항, 제 29 항 내지 제 31 항, 제 38 항, 및 제 42 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 제2 검출 모이어티가 형광단이고,
    - 해리하는 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분의 가닥에 의해 제공된 상기 제2 검출가능한 신호가 퀀처 분자로부터 상기 형광단의 거리를 증가시키는,
    방법.
  53. 제 52 항에 있어서,
    - 상기 형광단 및 퀀처 분자가 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분의 대향 가닥 상에 위치해 있는,
    방법.
  54. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 제1 검출가능한 신호의 생성이 가역적이지 않고;
    - 상기 제1 올리고뉴클레오티드에 대한 상기 변형이 상기 제1 검출 모이어티가 상기 제1 온도에서 또는 미만에서 상기 제1 검출가능한 신호를 제공하게 하고;
    - 상기 제1 온도에서 또는 미만에서 제공된 상기 제1 검출가능한 신호가 상기 제2 온도에서 검출가능하게 유지하는,
    방법.
  55. 제 54 항에 있어서,
    - 파트 (c)가 상기 혼합물에서, 또는, 대조군 혼합물에서 상기 제1 및 상기 제2 검출 모이어티에 의해 제공된
    (i) 제1 온도의 1℃, 2℃, 3℃, 4℃, 또는 5℃에서 또는 내에서 제1 배경 신호, 및 제2 온도의 1℃, 2℃, 3℃, 4℃, 또는 5℃에서 또는 내에서 제2 배경 신호, 및/또는
    (ii) 제3 온도에서 제3 배경 신호
    를 측정하는 단계를 포함하고;
    - 파트 (d)가 상기 처리 동안 또는 후에 하나 이상의 시점에서
    (i) 상기 변형으로부터 발생하는 제1 검출가능한 신호가 상기 제1 또는 제3 배경 신호와 상이한 상기 제1 온도에서 생성되되,
    상기 제1 온도에서 상기 제2 검출가능한 신호가 상기 제1 또는 제3 배경 신호와 상이하지 않고,
    상기 제1 검출가능한 신호와 상기 제1 또는 제3 배경 신호 사이 차이의 검출이 상기 샘플에서 상기 제1 표적의 존재 및 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 변형을 나타내는지; 그리고
    (ii) 제2 검출가능한 신호가 상기 제2 또는 제3 배경 신호와 상이한 상기 제2 온도에서 생성되고 상기 샘플에서 상기 제2 표적의 존재를 나타내는지
    여부를 결정하는 단계를 포함하는,
    방법.
  56. 제 55 항에 있어서,
    - 제1 표적이 상기 샘플에서 존재하는 때, 제2 검출가능한 신호가 상기 제2 온도에서 생성되는지 여부의 결정하기가 상기 제2 검출가능한 신호를 측정하는 때 존재하는 상기 제1 검출가능한 신호 보상하기를 포함하는,
    방법.
  57. 제 55 항 또는 제 56 항에 있어서,
    - 상기 제1 배경 신호와 상이한 상기 제1 신호가 생성되고,
    - 상기 제2 배경 신호와 상이한 상기 제2 신호가 생성되고,
    - 상기 제1 검출가능한 신호가 상기 제1 배경 신호와 상이한 것보다 큰 정도로 상기 제2 검출가능한 신호가 상기 제2 배경 신호와 상이하여,
    이에 의해 상기 제2 표적이 상기 샘플에서 존재함을 나타내는,
    방법.
  58. 제 57 항에 있어서,
    - 상기 제1 온도가 상기 제2 온도, 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분의 Tm, 및 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만인,
    방법.
  59. 제 57 항에 있어서,
    - 상기 제1 온도가 상기 제2 온도, 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm, 및 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm보다 높은,
    방법.
  60. 제 55 항에 있어서,
    - 상기 제3 배경 신호와 상이한 상기 제1 신호가 생성되고,
    - 상기 제3 배경 신호와 상이한 상기 제2 신호가 생성되고,
    - 상기 제1 신호가 상기 제3 배경 신호와 상이한 것보다 큰 정도로 상기 제2 신호가 상기 제3 배경 신호와 상이하여,
    이에 의해 상기 제2 표적이 상기 샘플에서 존재함을 나타내는,
    방법.
  61. 제 55 항에 있어서,
    - 상기 제2 온도가 상기 제1 온도보다 높고,
    - 상기 제3 온도가 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분의 Tm보다 낮고,
    - 상기 제3 배경 신호와 상이한 상기 제1 검출가능한 신호가 생성되고,
    - 상기 제3 배경 신호와 상이한 상기 제2 검출가능한 신호가 생성되고,
    - 상기 제1 신호가 상기 제3 배경 신호와 상이한 것보다 큰 정도로 상기 제2 검출가능한 신호가 상기 제3 배경 신호와 상이하여,
    이에 의해 상기 제2 표적이 상기 샘플에서 존재함을 나타내는,
    방법.
  62. 제 55 항 내지 제 61 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm이 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고;
    - 상기 제1 온도가 상기 제2 온도 미만이고, 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만이고;
    - 상기 제2 온도가 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과 및 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만인,
    방법.
  63. 제 62 항에 있어서,
    - 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm이 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 높고/거나;
    - 상기 제1 온도가 상기 제2 온도보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 낮고/거나;
    - 상기 제1 온도가 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 낮고/거나;
    - 상기 제2 온도가 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 높고/거나;
    - 상기 제2 온도가 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 낮은,
    방법.
  64. 제 62 항 또는 제 63 항에 있어서,
    - 상기 제3 온도가 상기 제2 온도 미만인, 상기 제3 배경 신호를 측정하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  65. 제 64 항에 있어서,
    - 상기 제3 온도가 상기 제2 온도보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 낮은,
    방법.
  66. 제 55 항 내지 제 61 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm이 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고;
    - 상기 제1 온도가 상기 제2 온도 초과이고, 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고, 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고;
    - 상기 제2 온도가 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 초과이고 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm 미만인,
    방법.
  67. 제 66 항에 있어서,
    - 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm이 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 높고/거나;
    - 상기 제1 온도가 상기 제2 온도보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 높고/거나;
    - 상기 제1 온도가 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 높고/거나;
    - 상기 제1 온도가 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 높고/거나;
    - 상기 제2 온도가 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 높고/거나;
    - 상기 제2 온도가 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 스템 부분의 Tm보다 1℃ 내지 10℃, 1℃ 내지 5℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 10℃ 초과 낮은,
    방법.
  68. 제 54 항 내지 제 67 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 제1 올리고뉴클레오티드가 다-구성요소 핵산 효소 (MNA자임)를 위한 기질이고;
    - 상기 혼합물이 추가로
    상기 제1 표적이 상기 샘플에서 존재하는 때 상기 제1 올리고뉴클레오티드를 절단시킬 수 있는 MNA자임
    을 포함하고;
    - 상기 혼합물 상기 처리가 추가로
    상기 제1 표적에 상기 MNA자임을 결합시키고 상보적 염기 짝짓기에 의해 상기 제1 올리고뉴클레오티드에 상기 MNA자임의 기질 아암을 혼성화하여 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 절단을 촉진시켜 이에 의해 상기 제1 올리고뉴클레오티드에 상기 변형을 제공하고 상기 제1 검출 모이어티가 상기 제1 검출가능한 신호를 제공하게 하기를 포함하는,
    방법.
  69. 제 68 항에 있어서,
    - 상기 제1 표적이 핵산 서열이고;
    - 상기 반응 혼합물 상기 처리가 추가로
    상보적 염기 짝짓기에 의해 상기 MNA자임의 센서 아암에 상기 제1 표적을 혼성화하여 이에 의해 상기 MNA자임의 조립을 촉진시키기를 포함하는,
    방법.
  70. 제 54 항 내지 제 67 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 제1 올리고뉴클레오티드가 압타자임을 위한 기질이고;
    - 상기 제1 표적이 분석물, 단백질, 화합물 또는 분자이고;
    - 상기 혼합물이 추가로 상기 제1 표적에 결합할 수 있는 압타머를 포함하는 압타자임을 포함하고;
    - 상기 혼합물 상기 처리가 추가로
    상기 제1 표적 및 상기 제1 올리고뉴클레오티드에 상기 압타자임을 결합하여 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 절단을 촉진시켜 이에 의해 상기 제1 올리고뉴클레오티드에 상기 변형을 제공하고 상기 제1 검출 모이어티가 상기 제1 검출가능한 신호를 생성하게 하기를 포함하는,
    방법.
  71. 제 54 항 내지 제 67 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 제1 표적이 핵산 서열이고;
    - 상기 제1 올리고뉴클레오티드가 상기 제1 표적에 상보적인 서열을 포함하고,
    - 상기 혼합물이 추가로
    상기 제1 표적의 한 부분에 상보적인 프라이머, 및
    엑소뉴클레아제 활성이 있는 폴리머라제
    를 포함하고;
    - 상기 혼합물 상기 처리가
    상보적 염기 짝짓기에 의해 상기 제1 표적에 상기 프라이머를 혼성화하기,
    상보적 염기 짝짓기에 의해 상기 제1 표적에 상기 제1 올리고뉴클레오티드를 혼성화하기
    템플레이트 서열로서 상기 제1 표적 및 상기 폴리머라제를 사용하여 상기 프라이머를 확장시켜 이에 의해 상기 제1 올리고뉴클레오티드를 소화시키고 상기 제1 올리고뉴클레오티드에 상기 변형을 제공하여 상기 제1 검출 모이어티가 상기 제1 검출가능한 신호를 생성하게 하기
    를 포함하는, 방법.
  72. 제 54 항 내지 제 67 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 제1 표적이 핵산 서열이고;
    - 상기 혼합물이 추가로
    상기 제1 표적을 포함하는 이중-가닥 듀플렉스를 소화시킬 수 있는 제한 엔도뉴클레아제
    를 포함하고;
    - 상기 혼합물 상기 처리가
    상보적 염기 짝짓기에 의해 상기 제1 표적에 상기 제1 올리고뉴클레오티드를 혼성화하여 이에 의해 이중-가닥 듀플렉스를 형성하기,
    상기 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 상기 듀플렉스를 소화시켜 이에 의해 상기 제1 올리고뉴클레오티드에 상기 변형을 제공하고 상기 제1 검출 모이어티가 상기 제1 검출가능한 신호를 제공하게 하기
    를 포함하는, 방법.
  73. 제 72 항에 있어서,
    - 상기 제한 엔도뉴클레아제가 상기 이중-가닥 듀플렉스의 가닥과 결합할 수 있고 이를 절단시킬 수 있는 니킹 엔도뉴클레아제이고, 상기 가닥이 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 전부 또는 한 부분을 포함하는, 방법.
  74. 제 54 항 내지 제 67 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 혼합물이 추가로 촉매적 활성을 위한 보조-인자를 필요로 하는 DNA자임 또는 리보자임을 포함하고;
    - 상기 혼합물의 처리가
    이것을 촉매적으로 활성으로 만들기 위해 상기 DNA자임 또는 리보자임에 상기 보조인자의 결합하기,
    상보적 염기 짝짓기에 의해 상기 제1 올리고뉴클레오티드에 상기 DNA자임 또는 리보자임의 혼성화, 및
    상기 DNA자임 또는 리보자임의 촉매적 활성에 적합한 조건 사용하기를 포함하여 이에 의해 상기 제1 올리고뉴클레오티드를 소화시키고 이에 의해 상기 제1 올리고뉴클레오티드에 상기 변형을 제공하여 상기 제1 검출 모이어티가 상기 제1 검출가능한 신호를 제공하게 하는 방법으로서.
    상기 제1 표적이 상기 보조-인자인,
    방법.
  75. 제 74 항에 있어서, 상기 보조-인자가 금속 이온, 또는 Mg2+, Mn2+, Ca2+, Pb2+로부터 선택된 금속 이온인, 방법.
  76. 제 54 항 내지 제 75 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 제1 검출 모이어티가 형광단이고 상기 제1 올리고뉴클레오티드에 대한 상기 변형이 퀀처 분자로부터 상기 형광단의 거리를 증가시키는,
    방법.
  77. 제 76 항에 있어서,
    - 상기 제1 올리고뉴클레오티드가 상기 퀀처 분자를 포함하는,
    방법.
  78. 제 76 항 또는 제 77 항에 있어서,
    - 상기 제2 검출 모이어티가 형광단이고,
    - 해리하는 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분의 가닥에 의해 제공된 상기 제2 검출가능한 신호가 퀀처 분자로부터 상기 형광단의 거리를 증가시키는,
    방법.
  79. 제 78 항에 있어서,
    - 상기 형광단 및 퀀처 분자가 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분의 대향 가닥 상에 위치해 있는,
    방법.
  80. 제 54 항 내지 제 79 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 제1 검출 모이어티가 나노입자, 금속성 나노입자, 귀금속 나노입자, 알칼리 금속 나노입자, 금 나노입자, 또는 은 나노입자이고; 여기에 상기 제1 올리고뉴클레오티드가 결합되고;
    - 상기 제1 검출가능한 신호가, 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 변형 이후 상기 제1 검출 모이어티로부터 발생하는,
    (i) 굴절률에서의 변화,
    (ii) 색에서의 변화; 및/또는
    (iii) 흡수 스펙트럼에서의 변화인,
    방법.
  81. 제 54 항 내지 제 79 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 제1 검출 모이어티가 상기 제1 올리고뉴클레오티드가 결합되는 전기화학적 제제이고;
    - 상기 제1 검출가능한 신호가 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 변형 이후 상기 제1 검출 모이어티로부터 발생하는 전기화학적 신호에서의 변화인,
    방법.
  82. 제 81 항에 있어서,
    - 상기 전기화학적 제제가 나노입자, 메틸렌 블루, 톨루엔 블루, 오라세트 블루, Hoechst 33258, [Ru(phen)3]2+, 페로센, 및/또는 다우노마이신 중 어느 하나 이상으로부터 선택되는,
    방법.
  83. 제 80 항 내지 제 82 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 제2 검출 모이어티가 나노입자, 금속성 나노입자, 귀금속 나노입자, 알칼리 금속 나노입자, 금 나노입자, 또는 은 나노입자이고; 여기에 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드가 결합되고;
    - 상기 제2 검출가능한 신호가, 해리하는 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분의 가닥으로부터 발생하는,
    (i) 굴절률에서의 변화,
    (ii) 색에서의 변화; 및/또는
    (iii) 흡수 스펙트럼에서의 변화인,
    방법.
  84. 제 80 항 내지 제 82 항 중 어느 한 중 어느 하나에 있어서,
    - 상기 제2 검출 모이어티가 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드가 결합되는 전기화학적 제제이고;
    - 상기 제2 검출가능한 신호가 해리하는 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분의 가닥으로부터 발생하는 전기화학적 신호에서의 변화인,
    방법.
  85. 제 84 항에 있어서,
    - 상기 전기화학적 제제가 나노입자, 메틸렌 블루, 톨루엔 블루, 오라세트 블루, Hoechst 33258, [Ru(phen)3]2+, 페로센, 및/또는 다우노마이신 중 어느 하나 이상으로부터 선택되는,
    방법.
  86. 제 1 항 내지 제 85 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드가 상기 제1 효소에 의한 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 하나 이상의 미혼성화된 뉴클레오티드의 소화 동안 상기 제2 표적에 혼성화되지 않는, 방법.
  87. 제 1 항 내지 제 86 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 제1 효소가 제1 MNA자임이고,
    - 상기 혼합물 상기 처리가
    상기 제2 표적에 상기 제1 MNA자임을 결합시키고 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 루프 부분에 상기 제1 MNA자임의 기질 아암을 혼성화하여, 이에 의해 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 하나 이상의 미혼성화된 뉴클레오티드를 소화시키고 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드를 제공하기
    를 포함하는, 방법.
  88. 제 87 항에 있어서,
    - 상기 제2 표적이 핵산 서열이고;
    - 상기 혼합물 상기 처리가 추가로 상보적 염기 짝짓기에 의해 상기 제1 MNA자임의 센서 아암에 상기 제2 표적을 혼성화시켜 이에 의해 상기 제1 MNA자임의 조립을 촉진시키기
    를 포함하는, 방법.
  89. 제 1 항 내지 제 86 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 제2 표적이 분석물, 단백질, 화합물 또는 분자이고;
    - 상기 제1 효소가 상기 제2 표적에 결합할 수 있는 압타머를 포함하는 압타자임이고;
    - 상기 압타머에 상기 제2 표적의 결합하기가 상기 제1 효소를 촉매적으로 활성으로 만들 수 있는,
    방법.
  90. 제 89 항에 있어서,
    - 상기 제1 효소가 압타-DNA자임, 압타-리보자임, 압타-MNA자임 중 어느 하나인,
    방법.
  91. 제 1 항 내지 제 86 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 제2 표적이 분석물, 단백질, 화합물 또는 분자이고;
    - 상기 제1 올리고뉴클레오티드가 압타자임을 위한 기질이고;
    - 상기 제1 효소가 상기 제2 표적에 결합할 수 있는 압타머 부분, 및 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 하나 이상의 미혼성화된 뉴클레오티드를 소화시킬 수 있는 핵산 효소 부분을 포함하는 압타자임이고
    - 상기 혼합물 상기 처리가 추가로
    상기 압타자임의 압타머 부분에 상기 제2 표적을 결합시켜 상기 핵산 효소 부분의 촉매적 활성의 활성화를 촉진시키고, 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드를 상기 활성 핵산 효소 부분에 혼성화시켜 이에 의해 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 하나 이상의 미혼성화된 뉴클레오티드를 소화시키기
    를 포함하는, 방법.
  92. 제 1 항 내지 제 85 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 제2 표적이 핵산 서열이고;
    - 상기 제1 효소가 제1 제한 엔도뉴클레아제이고, 상기 혼합물 상기 처리가
    상보적 염기 짝짓기에 의해 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 단일-가닥 루프 부분에 상기 제2 표적의 혼성화에 적합한 조건을 사용하여 상기 제1 제한 엔도뉴클레아제를 위한 이중-가닥 서열을 형성하여 상기 단일-가닥 루프 부분의 하나 이상의 미혼성화된 뉴클레오티드와 결합하고 이를 소화시켜 이에 의해 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드를 형성하기
    를 포함하는, 방법.
  93. 제 92 항에 있어서,
    - 상기 제1 제한 엔도뉴클레아제가 상기 제1 제한 엔도뉴클레아제를 위한 상기 이중-가닥 서열의 가닥과 결합할 수 있고 이를 절단시킬 수 있는 제1 니킹 엔도뉴클레아제이고, 상기 가닥이 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 단일-가닥 루프 부분의 전부 또는 한 부분을 포함하는,
    방법.
  94. 제 1 항 내지 제 85 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 제1 효소가 엑소뉴클레아제 활성이 있는 폴리머라제를 포함하고,
    - 상기 혼합물 상기 처리가
    상기 제2 표적의 한 부분을 포함하는 제1 이중-가닥 서열을 형성하기 위해 상보적 염기 짝짓기에 의해 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 단일-가닥 루프 부분에 상기 제2 표적의 혼성화,
    상기 제2 표적의 부분을 포함하는 상기 제1 이중-가닥 서열에 비하여 업스트림 위치해 있는 제2 이중-가닥 서열을 형성하기 위한 상기 제2 표적에 제1 프라이머 올리고뉴클레오티드의 혼성화,
    엑소뉴클레아제 활성이 있는 상기 폴리머라제를 사용하고 템플레이트 서열로서 상기 제2 표적을 사용하여 상기 프라이머 확장하기
    에 적합한 조건 사용하기를 포함하되,
    엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 상기 제1 폴리머라제가 상기 제1 이중-가닥 서열의 단일-가닥 루프 부분을 소화시키고 이에 의해 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드를 형성하는,
    방법.
  95. 제 1 항 내지 제 85 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 제1 효소가 엑소뉴클레아제이고,
    - 상기 혼합물 상기 처리가
    상기 제2 표적의 한 부분을 포함하는 제1 이중-가닥 서열을 형성하기 위해 상보적 염기 짝짓기에 의해 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 단일-가닥 루프 부분에 상기 제2 표적의 혼성화,
    엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 상기 제1 효소의 제2 표적을 포함하는 상기 이중-가닥 서열과의 결합, 및
    상기 제2 표적을 포함하는 상기 제1 이중-가닥 서열의 단일-가닥 루프 부분을 소화시키고 이에 의해 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드를 형성하게 하는 엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 상기 제1 효소의 촉매적 활성
    에 적합한 조건 사용하기를 포함하는,
    방법.
  96. 제 1 항 내지 제 85 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 제1 효소가 촉매적 활성을 위한 보조-인자를 필요로 하는 DNA자임 또는 리보자임이고, 상기 혼합물 상기 처리가
    - 촉매적으로 활성으로 만들기 위해 상기 제1 효소에 상기 보조인자의 결합하기,
    - 상보적 염기 짝짓기에 의해 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 단일-가닥 루프 부분에 상기 DNA자임 또는 리보자임의 혼성화,
    - 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 단일-가닥 루프 부분의 하나 이상의 미혼성화된 뉴클레오티드를 소화시키고 이에 의해 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드를 형성하기 위한 상기 DNA자임 또는 리보자임의 촉매적 활성
    에 적합한 조건 사용하기를 포함하되,
    상기 제2 표적이 상기 보조-인자인,
    방법.
  97. 제 96 항에 있어서, 상기 보조-인자가 금속 이온, 또는 Mg2+, Mn2+, Ca2+, Pb2+로부터 선택된 금속 이온인, 방법.
  98. 제 1 항 내지 제 97 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 제1 표적이 상기 제2 표적과 상이하고/거나;
    - 상기 제1 올리고뉴클레오티드가 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 단일-가닥 루프 부분 내에 없는 서열을 포함하거나 이로 이루어지는,
    방법.
  99. 제 1 항 내지 제 98 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 제1 효소가 상기 제2 표적을 소화시키지 않는,
    방법.
  100. 제 1 항 내지 제 71 항, 제 74 항 내지 제 91 항, 또는 제 94 항 내지 제 99 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 임의의 효소가 상기 제1 표적 및/또는 상기 제2 표적을 소화시키지 않는,
    방법.
  101. 제 1 항 내지 제 100 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 제1 온도가 1℃, 2℃, 3℃, 4℃, 5℃, 6℃, 7℃, 8℃, 9℃, 10℃, 11℃, 12℃, 13℃, 14℃, 15℃, 16℃, 17℃, 18℃, 19℃, 20℃, 25℃, 30℃, 35℃, 40℃, 45℃, 50℃, 55℃, 또는 60℃ 초과만큼 상기 제2 온도와 상이한,
    방법.
  102. 제 1 항 내지 제 101 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결정하기가 상기 제1 검출가능한 신호 및/또는 임의의 배경 신호(들)의 검출을
    - 상기 처리 동안 하나 이상의 시점에서; 또는
    - 상기 처리 동안 하나 이상의 시점에서 그리고 상기 처리 후에 하나 이상의 시점에서
    포함하는, 방법.
  103. 제 1 항 내지 제 101 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결정하기가 상기 제1 검출가능한 신호 및/또는 임의의 배경 신호(들)의 검출을
    - 상기 처리 후에 하나 이상의 시점에서
    포함하는, 방법.
  104. 제 1 항 내지 제 101 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결정하기가 상기 제2 검출가능한 신호 및/또는 임의의 배경 신호(들)의 검출을
    - 상기 처리 동안 하나 이상의 시점에서; 또는
    - 상기 처리 동안 하나 이상의 시점에서 그리고 상기 처리 후에 하나 이상의 시점에서
    포함하는, 방법.
  105. 제 1 항 내지 제 101 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결정하기가 상기 제2 검출가능한 신호 및/또는 임의의 배경 신호(들)의 검출을
    - 상기 처리 후에 하나 이상의 시점에
    포함하는, 방법.
  106. 제 1 항 내지 제 105 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 제1 및 제2 표적의 존재 또는 부재 상기 결정하기가 용융 곡선 분석을 포함하는,
    방법.
  107. 제 6 항에 있어서,
    - 상기 제1 및 제2 표적의 존재 또는 부재 상기 결정하기가 상기 제1 및 제2 검출가능한 신호 및 상기 임의로 상기 제1 및 제2 배경 신호를 포함하는 용융 곡선 분석을 포함하는,
    방법.
  108. 제 55 항에 있어서,
    - 상기 제1 및 제2 표적의 존재 또는 부재 상기 결정하기가 상기 제1 및 제2 검출가능한 신호 및 상기 임의로 상기 제1 및 제2 배경 신호; 또는
    - 상기 제1 및 제2 검출가능한 신호 및 임의로 상기 제3 배경 신호
    를 포함하는 용융 곡선 분석을 포함하는,
    방법.
  109. 제 1 항 내지 제 108 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 제1 표적 및/또는 상기 제2 표적이 핵산의 앰플리콘인,
    방법.
  110. 제 1 항 내지 제 109 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 제1 표적이 핵산이고/거나 상기 제2 표적이 핵산이고,
    - 상기 혼합물이 추가로 상기 제1 및/또는 제2 표적의 증폭을 위한 시약을 포함하고,
    - 상기 혼합물 상기 처리가 추가로 상기 제1 및/또는 제2 표적의 증폭 실행하기에 적합한 조건을 포함하는,
    방법.
  111. 제 110 항에 있어서,
    - 상기 증폭이 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR), 가닥 변위 증폭 (SDA), 니킹 효소 증폭 반응 (NEAR), 헬리카제 의존적 증폭 (HDA), 리콤비나제 폴리머라제 증폭 (RPA), 루프-매개 등온 증폭 (LAMP), 회전 환 증폭 (RCA), 전사-매개 증폭 (TMA), 자가-지속 서열 복제 (3SR), 핵산 서열 기반된 증폭 (NASBA), 리가제 연쇄 반응 (LCR) 또는 분지화 증폭 방법 (RAM), 및/또는 역전사 폴리머라제 연쇄 반응 (RT-PCR) 중 어느 하나 이상인,
    방법.
  112. 제 110 항 또는 제 111 항에 있어서, 상기 결정하기가
    - 상기 증폭에 앞서 또는 상기 증폭 시작하기의 1, 2, 3, 4, 또는 5 주기 내에 발생하고/거나;
    - 상기 증폭의 완료 후에 발생하는,
    방법.
  113. 제 110 항 내지 제 112 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결정하기가
    - 상기 증폭에 앞서 또는 상기 증폭 시작하기의 1, 2, 3, 4, 또는 5 분 내에 발생하고/거나;
    - 상기 증폭의 완료 후에 발생하는,
    방법.
  114. 제 110 항 내지 제 113 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결정하기가
    - 상기 증폭에 앞서 제1 시점에서; 및
    - 상기 증폭의 완료 후에 제2 시점에서
    발생하는, 방법.
  115. 제 110 항 내지 제 114 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 증폭 방법이 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)이고;
    - 상기 결정하기가 임의로 각 주기에서 여러 주기로 발생하는,
    방법.
  116. 제 110 항 또는 제 111 항에 있어서,
    - 상기 증폭에 앞서 및/또는 상기 반응 상기 처리에 앞서 상기 제1 온도에서 생성된 양성 대조군 신호를 사용하여 상기 증폭 동안 또는 후에 한 시점에서 측정된 상기 제1 온도에서 상기 제1 검출가능한 신호; 및/또는
    - 상기 증폭에 앞서 및/또는 상기 반응 상기 처리에 앞서 상기 제2 온도에서 생성된 양성 대조군 신호를 사용하여 상기 증폭 동안 또는 후에 한 시점에서 측정된 상기 제2 온도에서 상기 제2 검출가능한 신호
    를 정규화하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  117. 제 110 항 또는 제 111 항에 있어서,
    - 상기 증폭에 앞서 및/또는 상기 반응 상기 처리에 앞서 상기 제1 온도에서 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드에 의해 생성된 검출가능한 신호를 사용하는 상기 제1 검출가능한 신호; 및/또는
    - 상기 증폭에 앞서 및/또는 상기 반응 상기 처리에 앞서 추가의 온도에서 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드에 의해 생성된 검출가능한 신호를 사용하는 상기 제2 검출가능한 신호
    를 정규화하는 단계를 추가로 포함하되;
    상기 추가의 온도가 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 Tm 초과인,
    방법.
  118. 제 1 항 내지 제 117 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 변형 후에 상기 제1 표적의 알려진 농도 및/또는 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 알려진 농도를 사용하여 제1 표적 양성 대조군 신호를 생성하는 단계
    를 추가로 포함하는, 방법.
  119. 제 1 항 내지 제 118 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 제1 표적을 포함하는 별도 대조군 샘플 상에서 상기 방법을 반복함으로써 제1 표적 양성 대조군 신호를 생성하는 단계를 추가로 포함하는,
    방법.
  120. 제 119 항에 있어서,
    - 상기 제1 표적을 포함하는 상기 별도 대조군 샘플이 상기 제1 표적의 알려진 농도를 포함하는,
    방법.
  121. 제 119 항 또는 제 120 항에 있어서,
    - 상기 제1 표적을 포함하는 상기 별도 대조군 샘플이 상기 제2 표적을 추가로 포함하는,
    방법.
  122. 제 1 항 내지 제 121 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 변형 후에 상기 제2 표적의 알려진 농도 및/또는 상기 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 알려진 농도를 사용하여 제2 표적 양성 대조군 신호를 생성하는 단계
    를 추가로 포함하는, 방법.
  123. 제 1 항 내지 제 122 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 제2 표적을 포함하는 별도 대조군 샘플 상에서 상기 방법을 반복함으로써 제2 표적 양성 대조군 신호를 생성하는 단계
    를 추가로 포함하는, 방법.
  124. 제 123 항에 있어서,
    - 상기 제2 표적을 포함하는 상기 대조군 샘플이 상기 제2 표적의 알려진 농도를 포함하는,
    방법.
  125. 제 123 항 또는 제 124 항에 있어서,
    - 상기 제2 표적을 포함하는 상기 대조군 샘플이 상기 제1 표적을 추가로 포함하는,
    방법.
  126. 제 1 항 내지 제 125 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 제1 표적 및 상기 제2 표적을 포함하는 별도 대조군 샘플 상에서 상기 방법을 반복함으로써 조합된 양성 대조군 신호를 생성하는 단계
    를 추가로 포함하는, 방법.
  127. 제 126 항에 있어서,
    - 상기 조합된 대조군 샘플이 상기 제1 표적의 알려진 농도 및/또는 상기 제2 표적의 알려진 농도를 포함하는,
    방법.
  128. 제 116 항 내지 제 127 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 임의의 양성 대조군 신호를 사용하여 상기 제1 검출가능한 신호 및/또는 상기 제2 검출가능한 신호를 정규화하는 단계
    를 추가로 포함하는, 방법.
  129. 제 116 항 내지 제 128 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 제 1 항 내지 제 115 항 중 어느 한 항의 방법을
    (i) 상기 제1 표적; 또는
    (ii) 상기 제2 표적; 또는
    (iii) 상기 제1 표적 또는 상기 제2 표적
    을 함유하지 않는 별도 음성 대조군 샘플 상에서 반복함으로써 음성 대조군 신호의 수준을 평가하는 단계를 추가로 포함하는,
    방법.
  130. 제 129 항에 있어서,
    - 상기 음성 대조군 신호를 사용하여 상기 제1 검출가능한 신호 및/또는 상기 제2 검출가능한 신호를 정규화하는 단계
    를 추가로 포함하는,
    방법.
  131. 제 116 항 내지 제 130 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 임의의 대조군 신호가 형광성 대조군 신호인,
    방법.
  132. 제 1 항 내지 제 131 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 검출가능한 신호를 역치와 비교하는 단계를 추가로 포함하되:
    - 상기 역치가 제 1 항 내지 제 115 항 중 어느 한 항의 방법에 따라 검사된 일련의 샘플 또는 이의 유도체로부터 유래된 검출가능한 신호를 사용하여, 그리고
    (i) 무 템플레이트 대조군 및 상기 제1 표적
    (ii) 무 템플레이트 대조군 및 상기 제2 표적
    (iii) 무 템플레이트 대조군, 상기 제1 표적, 및 상기 제2 표적
    중 어느 하나 이상을 포함하여 생성되어 이에 의해 상기 샘플에서 상기 제1 및 제2 표적의 존재 또는 부재를 결정하는,
    방법.
  133. 제 132 항에 있어서,
    - 상기 일련의 샘플 또는 이의 유도체가 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 알려진 농도 및/또는 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 알려진 농도를 사용하여 검사되는,
    방법.
  134. 제 1 항 내지 제 133 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 샘플이 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플인,
    방법.
  135. 제 1 항 내지 제 133 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 방법이 시험관내 수행되는,
    방법.
  136. 제 1 항 내지 제 133 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 방법이 생체외 수행되는,
    방법.
  137. 제 1 항 내지 제 136 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 제1 및 제2 검출가능한 모이어티가 상기 가시 스펙트럼의 동일한 색 영역에서 방사하는,
    방법.
  138. - 상기 제1 표적이 핵산이고 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 적어도 한 부분에 상보적인, 제1 표적의 검출을 위한 제1 올리고뉴클레오티드, 및
    - 제1 검출 모이어티, 여기서:
    상기 제1 검출 모이어티는 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 변형시 제1 검출가능한 신호를 생성할 수 있고,
    상기 변형은 상보적 염기 짝짓기에 의해 상기 제1 올리고뉴클레오티드에 상기 제1 표적의 혼성화에 의해 유도됨;
    - 상기 이중-가닥 스템 부분의 적어도 하나의 가닥이 제2 검출 모이어티를 포함하는, 상기 제2 표적의 검출을 위한, 그리고 미혼성화된 뉴클레오티드의 끊어지지 않은 단일-가닥 루프 부분에 의해 연결되는 대향 가닥에 혼성화된 뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분을 포함하는 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드; 및
    - 상기 제2 표적이 상기 샘플에서 존재하는 때에만 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 미혼성화된 뉴클레오티드의 하나 이상을 소화시켜, 이에 의해 상기 단일-가닥 루프 부분을 끊고 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드를 제공할 수 있는 제1 효소
    를 포함하되;
    - 상기 제2 검출 모이어티가 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분의 해리시 제2 검출가능한 신호를 생성할 수 있고,
    - 상기 제1 및 제2 검출 모이어티가 단일 유형의 검출기를 사용하여 단일 온도에서 차별될 수 없는 검출가능한 신호를 생성할 수 있는,
    조성물.
  139. 제 138 항에 있어서,
    - 상기 제1 표적에 상보적인 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 영역이 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분의 각 가닥에 상이한 용융 온도 (Tm)를 갖는,
    조성물.
  140. 제 138 항 또는 제 139 항에 있어서, 상기 제1 올리고뉴클레오티드가
    상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분의 각 가닥; 및
    상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 단일-가닥 루프 부분
    과 서열에서 상이한, 조성물.
  141. 제 138 항 내지 제 140 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 제1 올리고뉴클레오티드가 전부 또는 한 부분이 상기 제1 표적에 상보적인 미혼성화된 뉴클레오티드의 끊어지지 않은 단일-가닥 루프 부분에 의해 연결되는 대향 가닥 상에 혼성화된 뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분을 포함하는 스템-루프 올리고뉴클레오티드인,
    조성물.
  142. 제 141 항에 있어서,
    - 상기 제1 표적이 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분에서 가닥의 해리를 야기시키는 상보적 염기 짝짓기에 의해 상기 제1 올리고뉴클레오티드에 혼성화되어 이에 의해 상기 제1 검출 모이어티가 상기 제1 검출가능한 신호를 제공하게 하는,
    조성물.
  143. 제 138 항 내지 제 140 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 제1 올리고뉴클레오티드가
    이의 대향 가닥이 미혼성화된 뉴클레오티드의 단일-가닥 루프 부분에 의해 연결되고, 이의 전부 또는 한 부분이 상기 제1 표적에 상보적인, 혼성화된 뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분, 및
    3' 방향으로 상기 대향 가닥들 중 하나로부터 확장하고 상기 제1 표적의 한 부분에 상보적인 서열로 종결하는 제2 단일-가닥 부분, 및
    상기 제1 표적의 부분에 상보적인 상기 서열에 선행하는 차단제 분자
    를 포함하는 스템-루프 올리고뉴클레오티드인,
    조성물.
  144. 제 143 항에 있어서,
    - 상기 제1 표적이 상보적 염기 짝짓기에 의해 이의 제2 단일-가닥 부분에 혼성화되고;
    상기 조성물이 이중-가닥 핵산을 제공하기 위해 템플레이트 서열로서 상기 제1 표적을 사용하여 상기 제2 단일-가닥 부분을 확장시킬 수 있는 폴리머라제를 추가로 포함하되, 상기 차단제 분자는 템플레이트로서 상기 1개 대향 가닥을 사용하여 상기 제1 표적을 확장시키는 상기 폴리머라제를 방지할 수 있고,
    상기 이중-가닥 핵산 변성 시, 상기 폴리머라제에 의해 확장된 상기 제2 단일-가닥 부분이 상보적 염기 짝짓기에 의해 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 단일-가닥 루프 부분에 혼성화하여 신호전달 듀플렉스를 생산할 수 있고 이에 의해 상기 제1 검출 모이어티가 제1 검출가능한 신호를 제공하게 하는,
    조성물.
  145. 제 141 항 내지 제 144 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 제1 검출 모이어티가 형광단인,
    조성물.
  146. 제 145 항에 있어서,
    - 상기 제1 올리고뉴클레오티드가 퀀처 분자를 포함하고, 상기 형광단 및 상기 퀀처 분자가 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분의 대향 가닥 상에 위치해 있는,
    조성물.
  147. 제 138 항 내지 제 140 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 제1 올리고뉴클레오티드가
    상기 제1 가닥이 상기 상보적 서열에 선행하는 차단제 분자를 포함하는, 이의 제1 가닥이 상기 제1 표적의 한 부분에 혼성화할 수 있는 상보적 서열로 종결하는 단일-가닥 부분으로 확장하는, 혼성화된 뉴클레오티드의 제1 이중-가닥 부분
    을 포함하고.
    - 상기 조성물이 폴리머라제를 추가로 포함하는,
    조성물.
  148. 제 147 항에 있어서,
    상기 제1 표적의 한 부분이 상보적 염기 짝짓기에 의해 상기 단일-가닥 부분의 상보적 서열에 혼성화되고;
    상기 조성물이 제2 이중-가닥 부분을 제공하기 위해 템플레이트 서열로서 상기 제1 표적을 사용하여 상기 상보적 서열을 확장시킬 수 있는 폴리머라제를 추가로 포함하되, 상기 차단제 분자는 템플레이트로서 상기 단일-가닥 부분을 사용하여 상기 제1 표적을 확장시키는 상기 폴리머라제를 방지하고;
    상기 제1 및 제2 이중-가닥 부분이 변성되는 때, 상기 폴리머라제에 의해 확장된 상기 상보적 서열이 상보적 염기 짝짓기에 의해 상기 제1 이중-가닥 부분의 제1 가닥에 혼성화하여 신호전달 듀플렉스를 생산할 수 있고 이에 의해 상기 제1 검출 모이어티가 상기 제1 검출가능한 신호를 제공하게 하는,
    조성물.
  149. 제 147 항 또는 제 148 항에 있어서,
    - 상기 제1 검출 모이어티가 형광단이고 상기 변형이 퀀처 분자로부터 이의 거리를 증가시키는,
    조성물;
  150. 제 149 항에 있어서,
    - 상기 제1 올리고뉴클레오티드가 퀀처 분자를 포함하고, 상기 형광단 및 상기 퀀처 분자가 상기 제1 이중-가닥 부분의 대향 가닥 상에 위치해 있는,
    조성물.
  151. 제 138 항 내지 제 140 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 제1 올리고뉴클레오티드가 상기 표적의 제1 부분에 상보적이고;
    - 상기 조성물이 상기 제1 표적 제2 부분에 상보적인 추가의 올리고뉴클레오티드를 추가로 포함하되, 상기 제1 표적의 제1 및 제2 부분은 서로 측접하지만 중첩하지 않고, 각각 상기 제1 표적에 혼성화하여
    (iii) 상기 표적에 상기 제1 올리고뉴클레오티드 혼성화에 의해 또는 상보적 염기 짝짓기에 의해 제1 이중-가닥 구성요소, 및
    (iv) 상보적 염기 짝짓기에 의해 상기 표적에 상기 추가의 올리고뉴클레오티드를 혼성화시킴으로써 제2 이중-가닥 구성요소
    를 포함하는 듀플렉스 구조를 형성할 수 있고,
    이에 의해 상기 제1 및 추가의 올리고뉴클레오티드를 근접시키고, 상기 제1 검출 모이어티가 상기 제1 검출가능한 신호를 제공하게 하는,
    조성물.
  152. 제 151 항에 있어서,
    - 상기 제1 검출가능한 모이어티가 형광단이고 상기 추가의 올리고뉴클레오티드가 퀀처를 포함하고;
    - 상기 듀플렉스 구조의 형성이 상기 형광단 및 퀀처를 추가로 근접시키고;
    - 상기 검출가능한 신호가 상기 제1 검출 모이어티에 의해 제공된 형광에서의 감소인,
    조성물.
  153. 제 138 항 내지 제 140 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 제1 올리고뉴클레오티드가 상보적 염기 짝짓기에 의해 상기 제1 표적에 혼성화되고,
    - 상기 조성물이
    상보적 염기 짝짓기에 의해 상기 제1 표적의 한 부분에 혼성화된 프라이머, 및
    템플레이트 서열로서 상기 제1 표적을 사용하여 상기 프라이머를 확장시켜 이에 의해 상기 제1 올리고뉴클레오티드를 소화시키고 상기 제1 올리고뉴클레오티드를 변형시켜 상기 제1 검출 모이어티가 상기 제1 검출가능한 신호를 제공하게 할 수 있는 엑소뉴클레아제 활성이 있는 폴리머라제
    를 추가로 포함하는, 방법.
  154. 제 138 항 내지 제 140 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 제1 표적이 상보적 염기 짝짓기에 의해 상기 제1 올리고뉴클레오티드에 혼성화되어 이에 의해 이중-가닥 듀플렉스를 형성하고,
    - 상기 조성물이 상기 제1 표적을 포함하는 이중-가닥 듀플렉스를 소화시켜 이에 의해 상기 제1 올리고뉴클레오티드를 변형시키고 상기 제1 검출 모이어티가 상기 제1 검출가능한 신호를 제공하게 할 수 있는 제한 엔도뉴클레아제를 추가로 포함하는,
    조성물.
  155. 제 154 항에 있어서,
    - 상기 제한 엔도뉴클레아제가 상기 이중-가닥 듀플렉스의 가닥과 결합할 수 있고 이를 절단시킬 수 있는 니킹 엔도뉴클레아제이고, 상기 가닥이 상기 제1 올리고뉴클레오티드를 포함하는,
    조성물.
  156. 제 153 항 내지 제 155 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 제1 검출 모이어티가 형광단이고 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 변형이 퀀처 분자로부터 상기 형광단의 거리를 증가시키는,
    조성물.
  157. 제 156 항에 있어서,
    - 상기 제1 올리고뉴클레오티드가 상기 퀀처 분자를 포함하는,
    조성물.
  158. - 제1 검출 모이어티를 포함하는 제1 표적의 검출을 위한 제1 올리고뉴클레오티드, 여기서:
    상기 제1 검출 모이어티는 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 변형시 제1 검출가능한 신호를 생성할 수 있고,
    상기 변형은 상기 제1 표적에 의해 유도됨;
    - 상기 이중-가닥 스템 부분의 적어도 하나의 가닥이 제2 검출 모이어티를 포함하는, 상기 제2 표적의 검출을 위한, 그리고 미혼성화된 뉴클레오티드의 끊어지지 않은 단일-가닥 루프 부분에 의해 연결되는 대향 가닥에 혼성화된 뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분을 포함하는 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드; 및
    - 상기 제2 표적이 상기 샘플에서 존재하는 때에만 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 미혼성화된 뉴클레오티드의 하나 이상을 소화시켜, 이에 의해 상기 단일-가닥 루프 부분을 끊고 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드를 제공할 수 있는 제1 효소
    를 포함하되;
    - 상기 제2 검출 모이어티가 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분의 해리시 제2 검출가능한 신호를 생성할 수 있고,
    - 상기 제1 및 제2 검출 모이어티가 단일 유형의 검출기를 사용하여 단일 온도에서 차별될 수 없는 검출가능한 신호를 생성할 수 있는,
    조성물.
  159. 제 158 항에 있어서, 상기 제1 올리고뉴클레오티드가
    상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분의 각 가닥; 및
    상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 단일-가닥 루프 부분
    과 서열에서 상이한, 조성물.
  160. 제 158 항 또는 제 159 항에 있어서,
    - 상기 제1 표적이 핵산 서열이고;
    - 상기 조성물이
    상기 제1 표적에서 제1 서열에 상보적인 제1 프라이머,
    상기 제1 서열과 상이한 상기 제1 표적에서 제2 서열에 상보적인 구성요소, 및 상기 제1 표적에 상보적이지 않은 태그 부분을 포함하는 제2 올리고뉴클레오티드,
    엑소뉴클레아제 활성이 있는 제1 폴리머라제, 및
    임의로 제2 폴리머라제
    를 추가로 포함하는,
    조성물.
  161. 제 160 항에 있어서,
    - 상기 제1 프라이머 및 상기 제2 올리고뉴클레오티드가 상보적 염기 짝짓기에 의해 상기 제1 표적에 각 혼성화되고,
    상기 제1 폴리머라제가 템플레이트로서 상기 표적을 사용하여 상기 제1 프라이머를 확장시켜 이에 의해 상기 태그 부분을 절단 제거하여, 상기 절단된 태그 부분이 상보적 염기 짝짓기에 의해 상기 제1 올리고뉴클레오티드에 혼성화할 수 있게 하고,
    상기 제1 폴리머라제 또는 상기 임의적 제2 폴리머라제가 템플레이트로서 상기 제1 올리고뉴클레오티드를 사용하여 상기 태그 부분을 확장시켜 상기 제1 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중-가닥 서열을 생성하여 이에 의해 상기 제1 올리고뉴클레오티드를 변형시킬 수 있고 상기 제1 검출 모이어티가 상기 제1 검출가능한 신호를 제공할 수 있게 하는,
    조성물.
  162. 제 160 항 또는 제 161 항에 있어서,
    - 상기 제1 올리고뉴클레오티드가 형광단 및 퀀처 분자를 포함하는,
    조성물.
  163. 제 162 항에 있어서,
    - 상기 제1 올리고뉴클레오티드가 형광단 및 퀀처 분자를 포함하고,
    - 상기 태그 부분 상기 확장이 상기 형광단과 상기 퀀처 분자 사이 거리를 증가시키는,
    조성물.
  164. 제 158 항 또는 제 159 항에 있어서,
    - 상기 제1 표적이 효소 촉매적 활성을 위한 보조-인자이고;
    - 상기 조성물이 촉매적 활성을 위한 상기 보조-인자를 필요로 하는 DNA자임 또는 리보자임을 추가로 포함하고,
    - DNA자임 또는 리보자임이 상기 제1 표적에 결합할 수 있고 상보적 염기 짝짓기에 의해 상기 제1 올리고뉴클레오티드에 혼성화하여, 이에 의해 상기 제1 올리고뉴클레오티드를 소화 및 변형시켜 상기 제1 검출 모이어티가 상기 제1 검출가능한 신호를 생성하게 할 수 있는,
    조성물.
  165. 제 164 항에 있어서, 상기 보조-인자가 금속 이온, 또는 Mg2+, Mn2+, Ca2+, Pb2+로부터 선택된 금속 이온인, 조성물.
  166. 제 158 항 또는 제 159 항에 있어서,
    - 상기 제1 올리고뉴클레오티드가 다-구성요소 핵산 효소 (MNA자임)를 위한 기질이고;
    - 상기 제1 표적이 상기 샘플에서 존재하는 때 상기 조성물이 상기 제1 올리고뉴클레오티드를 절단시킬 수 있는 MNA자임을 추가로 포함하고;
    - 상기 MNA자임이 상기 제1 표적에 결합할 수 있고 이의 기질 아암을 통해 상보적 염기 짝짓기에 의해 상기 제1 올리고뉴클레오티드에 혼성화할 수 있고, 상기 혼성화가 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 절단을 용이하게 하여 이에 의해 이를 변형시키고 상기 제1 검출 모이어티가 상기 제1 검출가능한 신호를 제공하게 하는,
    방법.
  167. 제 166 항에 있어서,
    - 상기 제1 표적이 핵산 서열이고;
    - 상기 제1 표적이 상보적 염기 짝짓기에 의해 상기 MNA자임의 센서 아암에 혼성화되어 이에 의해 상기 MNA자임의 조립을 촉진시키는,
    조성물.
  168. 제 158 항 또는 제 159 항에 있어서,
    - 상기 제1 표적이 분석물, 단백질, 화합물 또는 분자이고;
    - 상기 제1 올리고뉴클레오티드가 압타자임을 위한 기질이고;
    - 상기 조성물이 상기 제1 표적에 결합할 수 있는 압타머 부분, 및 상기 제1 올리고뉴클레오티드를 소화시키고 이에 의해 이를 변형시켜 상기 제1 검출 모이어티가 상기 제1 검출가능한 신호를 제공하게 할 수 있는 핵산 효소 부분을 포함하는 압타자임을 추가로 포함하는,
    조성물.
  169. 제 168 항에 있어서,
    - 상기 제1 표적이 상기 압타자임의 압타머 부분에 결합되고 상기 제1 올리고뉴클레오티드가 상보적 염기 짝짓기에 의해 상기 활성 핵산 효소 부분에 혼성화되어 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 소화를 촉진시키고 이에 의해 이를 변형시켜 상기 제1 검출 모이어티가 상기 제1 검출가능한 신호를 제공하게 하는,
    조성물.
  170. 제 166 항 내지 제 169 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 제1 검출 모이어티가 형광단이고 상기 제1 올리고뉴클레오티드 상기 변형이 퀀처 분자로부터 상기 형광단의 거리를 증가시키는,
    조성물.
  171. 제 170 항에 있어서,
    - 상기 제1 올리고뉴클레오티드가 상기 퀀처 분자를 포함하는,
    조성물.
  172. 제 138 항 내지 제 144 항, 제 147 항, 제 148 항, 제 151 항, 제 153 항 내지 제 155 항, 제 158 항 내지 제 161 항, 및 제 164 항 내지 제 169 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 제1 검출 모이어티가 나노입자, 금속성 나노입자, 귀금속 나노입자, 알칼리 금속 나노입자, 금 나노입자, 또는 은 나노입자이고; 여기에 상기 제1 올리고뉴클레오티드가 결합되고;
    - 상기 제1 검출가능한 신호가, 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 변형 이후 상기 제1 검출 모이어티로부터 발생하는,
    (i) 굴절률에서의 변화,
    (ii) 색에서의 변화; 및/또는
    (iii) 흡수 스펙트럼에서의 변화인,
    조성물.
  173. 제 172 항에 있어서,
    - 상기 제1 검출 모이어티가 상기 제1 올리고뉴클레오티드가 결합되는 전기화학적 제제이고;
    - 상기 제1 검출가능한 신호가 전기화학적 신호에서의 변화인,
    조성물.
  174. 제 173 항에 있어서,
    - 상기 전기화학적 제제가 나노입자, 메틸렌 블루, 톨루엔 블루, 오라세트 블루, Hoechst 33258, [Ru(phen)3]2+, 페로센, 및/또는 다우노마이신 중 어느 하나 이상으로부터 선택되는,
    조성물.
  175. 제 172 항 내지 제 174 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 제2 검출 모이어티가 나노입자, 금속성 나노입자, 귀금속 나노입자, 알칼리 금속 나노입자, 금 나노입자, 또는 은 나노입자이고; 여기에 상기 제2 올리고뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분의 적어도 하나의 가닥이 결합되고
    - 상기 제2 검출가능한 신호가, 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분의 해리시 발생하는,
    (i) 굴절률에서의 변화,
    (ii) 색에서의 변화; 및/또는
    (iii) 흡수 스펙트럼에서의 변화인,
    조성물.
  176. 제 172 항 내지 제 174 항 중 어느 한 항에,
    - 상기 제2 검출 모이어티가 상기 제2 올리고뉴클레오티드가 결합되는 전기화학적 제제이고;
    - 상기 제2 검출가능한 신호가 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분의 해리시 발생하는 전기화학적 신호에서의 변화인,
    조성물.
  177. 제 176 항에 있어서,
    - 상기 전기화학적 제제가 나노입자, 메틸렌 블루, 톨루엔 블루, 오라세트 블루, Hoechst 33258, [Ru(phen)3]2+, 페로센, 및/또는 다우노마이신 중 어느 하나 이상으로부터 선택되는,
    조성물.
  178. 제 145 항, 제 146 항, 제 149 항, 제 150 항, 제 152 항, 제 156 항, 제 157 항, 제 162 항, 제 163 항, 제 170 항, 및 제 171 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 제2 검출 모이어티가 형광단이고,
    - 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분의 해리시 상기 제2 검출 모이어티에 의해 제공된 상기 제2 검출가능한 신호가 퀀처 분자로부터 상기 형광단의 거리를 증가시키는,
    조성물.
  179. 제 178 항에 있어서,
    - 상기 형광단 및 퀀처 분자가 상기 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 이중-가닥 스템 부분의 대향 가닥 상에 위치해 있는,
    조성물.
  180. 제 138 항 내지 제 179 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 제1 효소가 제1 MNA자임이고,
    - 상기 제1 MNA자임이 상기 제2 표적에 결합되고,
    - 상기 제1 MNA자임의 기질 아암이 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 단일 루프 부분에 상보적 염기 짝짓기에 의해 혼성화되어, 이에 의해 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 하나 이상의 미혼성화된 뉴클레오티드의 소화를 촉진시키고 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드를 제공하는,
    조성물.
  181. 제 180 항에 있어서,
    - 상기 제2 표적이 또는 핵산 서열이고;
    - 상기 제2 표적이 상보적 염기 짝짓기에 의해 상기 제1 MNA자임의 센서 아암에 혼성화되어 이에 의해 상기 제1 MNA자임의 조립을 촉진시키는,
    조성물.
  182. 제 138 항 내지 제 179 항 중 어느 한 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 제2 표적이 분석물, 단백질, 화합물 또는 분자이고;
    - 상기 제1 효소가 상기 제2 표적에 결합할 수 있는 압타머를 포함하는 압타자임이고;
    - 상기 압타머가 상기 제2 표적에 결합되어 이에 의해 상기 제1 효소를 촉매적으로 활성으로 만드는,
    조성물.
  183. 제 182 항에 있어서,
    - 상기 제1 효소가 압타-DNA자임, 압타-리보자임, 압타-MNA자임 중 어느 하나인,
    조성물.
  184. 제 138 항 내지 제 179 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 제2 표적이 분석물, 단백질, 화합물 또는 분자이고;
    - 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 단일-가닥 루프 부분이 압타자임을 위한 기질이고;
    - 상기 조성물이 상기 제2 표적에 결합할 수 있는 압타머 부분, 및 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 하나 이상의 미혼성화된 뉴클레오티드를 소화시켜 이에 의해 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드를 형성할 수 있는 핵산 효소 부분을 포함하는 압타자임을 추가로 포함하는,
    조성물.
  185. 제 184 항에 있어서,
    - 상기 제2 표적이 상기 압타자임의 압타머 부분에 결합되고 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 단일-가닥 루프 부분이 상보적 염기 짝짓기에 의해 상기 활성 핵산 효소 부분에 혼성화되어, 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 하나 이상의 미혼성화된 뉴클레오티드의 소화를 촉진시켜 이에 의해 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드를 형성하는,
    조성물.
  186. 제 138 항 내지 제 179 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 제2 표적이 핵산 서열이고;
    - 상기 제1 효소가 제1 제한 엔도뉴클레아제이고,
    - 상기 제2 표적이 상보적 염기 짝짓기에 의해 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 단일-가닥 루프 부분에 혼성화되어 상기 제1 제한 엔도뉴클레아제를 위한 이중-가닥 서열을 형성하여 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 하나 이상의 미혼성화된 뉴클레오티드와 결합하고 이를 소화시켜 이에 의해 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드를 형성하는,
    조성물.
  187. 제 186 항에 있어서,
    - 상기 제1 제한 엔도뉴클레아제가 상기 제1 제한 엔도뉴클레아제를 위한 상기 이중-가닥 서열의 가닥과 결합할 수 있고 이를 절단시킬 수 있는 제1 니킹 엔도뉴클레아제이고, 상기 가닥이 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드를 포함하는,
    조성물.
  188. 제 138 항 내지 제 179 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 제1 효소가 엑소뉴클레아제 활성이 있는 폴리머라제를 포함하고,
    - 상기 제2 표적이 상보적 염기 짝짓기에 의해 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 단일-가닥 루프 부분에 혼성화되어 상기 제2 표적의 한 부분을 포함하는 제1 이중-가닥 서열을 형성하고,
    - 상기 조성물이 상기 제2 표적에 상보적 염기 짝짓기에 의해 혼성화된 제1 프라이머 올리고뉴클레오티드를 추가로 포함하여 상기 제2 표적의 부분을 포함하는 상기 제1 이중-가닥 서열에 비하여 업스트림 위치해 있는 제2 이중-가닥 서열을 형성하고,
    - 상기 프라이머가 템플레이트 서열로서 상기 제2 표적 및 엑소뉴클레아제 활성이 있는 상기 폴리머라제를 사용하여 확장되어, 상기 제1 이중 가닥 서열의 단일-가닥 루프 부분을 소화시키고 이에 의해 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드를 형성하는,
    조성물.
  189. 제 138 항 내지 제 179 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 제1 효소가 엑소뉴클레아제이고,
    - 상기 제2 표적이 상기 제2 표적의 한 부분을 포함하는 제1 이중-가닥 서열을 형성하는 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 단일-가닥 루프 부분에 상보적 염기 짝짓기에 의해 혼성화되고, 여기에 엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 상기 제1 효소가 결합할 수 있고 이에 의해 상기 제2 표적을 포함하는 상기 제1 이중 가닥 서열의 단일-가닥 루프 부분을 소화시켜 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드를 형성할 수 있는,
    조성물.
  190. 제 138 항 내지 제 179 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 제1 효소가 촉매적 활성을 위한 보조-인자를 필요로 하는 DNA자임 또는 리보자임이고,
    - 상기 제2 표적이 상기 보조-인자이고 상기 DNA자임 또는 리보자임에 결합되고,
    - 상기 DNA자임 또는 리보자임이 상보적 염기 짝짓기에 의해 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 단일-가닥 루프 부분에 혼성화되어, 상기 온전한 스템-루프 올리고뉴클레오티드의 단일-가닥 루프 부분의 하나 이상의 미혼성화된 뉴클레오티드를 소화시키고 이에 의해 상기 분할된 스템-루프 올리고뉴클레오티드를 형성하게 하는,
    조성물.
  191. 제 190 항에 있어서, 상기 보조-인자가 금속 이온, 또는 Mg2+, Mn2+, Ca2+, Pb2+로부터 선택된 금속 이온인, 조성물.
  192. 제 138 항 내지 제 150 항, 제 153 항, 제 156 항 내지 제 158 항, 제 166 항 또는 제 167 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 제1 올리고뉴클레오티드가 Molecular Beacon®, Scorpions® 프라이머, TaqMan® 프라이머, 또는 MNA자임 기질 중 어느 하나 이상으로부터 선택되는,
    조성물.
  193. 제 138 항 내지 제 192 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 제1 표적 및/또는 상기 제2 표적이 핵산의 앰플리콘인,
    조성물.
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