CN101605909A - 使用质谱法的生物分子检测和定量 - Google Patents
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Abstract
本发明部分涉及使用可通过质谱法检测的检测用寡核苷酸来检测目标核酸的方法。这种方法使用核酸聚合酶的5’-3’核酸酶活性自杂交双螺旋解离复性寡核苷酸探针并释放质谱法检测标记。这种方法易于纳入PCR扩增分析中。这种方法也包括涉及目标核酸定量分析的实施例。
Description
技术领域
背景技术
在多重分析中检测并定量核酸的当前方法具有局限性,尤其是那些采用荧光染料进行检测的分析。例如,怀特(White)论述了使用分析方法进行多重分析的问题(生物技术的趋势(Trends in Biotechnology)(1996)14(12);478-483)。在各种问题中,荧光染料仅提供有限多重分析选择,并且试图克服这些限制(例如通过使用引物延伸和基于连接的SNP分析,之后对芯片阵列实施通用PCR和杂交)的当前可用的方法通常极为费时(例如1-2天)。
由于检测通道数增加,使用质谱法可提供解决方案来改良多重分析,但先前所揭示基于质谱的方法的实际应用仍可进一步改良。例如,罗斯(Ross)阐述使用肽核酸(PNA)探针与PCR扩增DNA高特异性杂交,并且随后通过质谱法来检测(分析化学(Anal.Chem)(1997)69:4197)。同样,哈弗(Haff)阐述引物延伸方法和通过质谱法检测引物延伸产物(核酸研究(Nucleic Acids Res.)(1997)25:3749)。朱林可(Jurinke)等人阐述其它基于质谱法的方法(生化工程/生物技术进展(Adv Biochem Eng Biotechnol)(2002)77:57-74)。
发明内容
本发明部分提供鉴定和定量目标生物分子(例如核酸)并检测目标生物分子序列(例如核酸序列或核苷酸序列)的方法。本发明方法可有利地用于同时检测单一样品或多个样品中的多种目标核酸,同时可避免实施PCR后酶促过程。可产生众多种独特的质量可区分产物(MDP),此使得可同时检测多种目标核酸。如本文中进一步所述,通过标准扩增方法扩增一或多种目标核酸,其中所述扩增方法解离并降解检测探针,此产生可通过质谱法检测到的特异性质量可区分产物。检测多种MDP使得可鉴定和/或定量多种目标核酸。
每一种质量可区分产物(MDP)都具有独特物理特征,此使得在与相同分析中所用其它质量可区分产物相比时可特异性地将其区分出来。质量可区分产物可根据此差异来分离和鉴定。例如,MDP可因其独特的预定质量而彼此不同,并且可通过质谱法来检测。因此,质谱分析通过质量可区分产物间接揭示目标核酸的存在。
本发明由此部分提供在扩增反应中检测并视情况定量目标核酸序列的方法,所述方法包含:提供一组寡核苷酸引物,其中第一引物含有与目标核酸序列一条链中的一个区域互补的序列,并且第二引物含有与目标核酸序列第二链中的一个区域互补的序列;提供至少一种检测用寡核苷酸,其含有与目标核酸中的一个区域互补的序列,其中所述检测用寡核苷酸在结合有第一步骤中的寡核苷酸引物的目标核酸序列内发生复性,由此产生复性双螺旋,且此外其中所选择每种寡核苷酸引物都与其互补模板发生复性,所述模板位于与所述相同核酸链发生复性的任一检测用寡核苷酸上游;在以下扩增循环步骤容许的条件下采用具有5’-3’核酸酶活性的酶作为模板依赖性聚合试剂来扩增目标核酸序列:(i)使寡核苷酸引物和检测用寡核苷酸与目标序列内所含模板核酸序列发生复性,和(ii)延伸引物寡核苷酸,其中所述核酸扩增酶合成引物延伸产物,而且核酸扩增酶的5’至3’核酸酶活性同时自包含检测用寡核苷酸和其互补模板核酸序列的复性双螺旋释放MDP,由此产生一或多种MDP;并且通过质谱法检测所述一或多种MDP,由此确定样品中是否存在目标序列。通常,扩增反应是聚合酶链式反应。扩增反应也可为鉴定多种目标的多重反应。在相关实施例中,可在单一多重反应中检测多于2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000(和各数字之间的所有数字)种或更多目标核酸。在另一实施例中,在多重反应中使用不止一种检测用寡核苷酸来检测不止一种目标核酸。
在某些实施例中,通过在目标扩增条件下组合目标核酸与一对试剂可同时确定多种多态性(例如单核苷酸多态性(SNP))或基因。每一对试剂都包括结合目标核酸的寡核苷酸引物和可经修饰或未经修饰的检测用寡核苷酸。在SNP基因分型情况下,检测用寡核苷酸与SNP位点结合,并且所述寡核苷酸在其随后的释放后具有可检测到的检测性质。在优选实施例中,检测性质可通过质谱法来检测。在基因表达分析中,检测用寡核苷酸结合基因特异性序列,并且所述寡核苷酸在其随后的释放后具有可检测到的检测性质。序列扩增条件可采用具有5’-3’核酸酶活性的聚合酶、dNTP和辅助试剂以容许有效序列扩增。辅助试剂的实例包括(但不限于)甜菜碱、用于富CG区域的DMSO、洗涤剂、和焦磷酸酶。实施序列扩增,藉此对结合目标核酸的检测用寡核苷酸实施解离和/或降解、释放,并随后通过质谱法来检测。通过使各SNP或基因与特定MDP相连,可确定存于样品中的SNP或基因。
在另一相关实施例中,提供在样品中检测目标核酸序列的聚合酶链式反应(PCR)扩增方法,其包含以下步骤:向含有样品的PCR反应物中提供一组寡核苷酸引物,其中第一PCR引物含有与目标核酸序列一条链中的一个区域互补的序列,并且第二PCR引物含有与目标核酸序列第二链中的一个区域互补的序列;提供至少一种含有与目标核酸中一个区域互补的序列的检测用寡核苷酸,其中所述检测用寡核苷酸在结合有第一步骤中PCR引物的目标核酸序列内发生复性,由此产生复性双螺旋,此外其中所选择每一PCR引物都可与其互补模板发生复性,所述模板位于与相同核酸链发生复性的任一检测用寡核苷酸上游;在以下PCR循环步骤容许的条件下采用具有5’-3’核酸酶活性的核酸聚合酶作为模板依赖性聚合试剂来扩增目标核酸序列:(i)使引物和检测用寡核苷酸与目标序列内所含模板核酸序列发生复性,和(ii)延伸引物,其中所述核酸聚合酶合成引物延伸产物,而且所述核酸聚合酶的5’-3’核酸酶活性同时自包含检测用寡核苷酸和其互补模板核酸序列的复性双螺旋释放MDP,由此产生一或多种MDP;并且通过质谱法检测所述一或多种MDP,由此确定样品中是否存在目标序列。在另一实施例中,容许PCR循环的条件可视情况包括各链的变性。
本发明也部分提供检测目标核酸的方法,其包含以下步骤:使寡核苷酸引物与目标核酸发生复性,使检测用寡核苷酸与相同目标核酸发生复性;引入酶以沿检测用寡核苷酸方向延伸寡核苷酸引物,其中所述酶解离并由此释放至少一部分检测用寡核苷酸,由此产生一或多种MDP;并通过质谱法来检测所述一或多种MDP。在一相关实施例中,可部分解离一部分检测用寡核苷酸并由此使其脱离目标核酸。因此,在此实施例中,MDP可包括脱离目标核酸的部分解离检测用寡核苷酸,并且随后通过质谱法对其实施检测。在另一实施例中,引入结合第一寡核苷酸合成产物的第二寡核苷酸,随后可藉此进行指数扩增。在一相关实施例中,初始目标核酸是单链核酸分子,例如cDNA。
本发明也部分提供在样品中检测目标核酸序列的并非基于扩增的方法,其包含以下步骤:使包含目标核酸的样品与以下物质接触:(i)寡核苷酸引物,其包含3’末端和5’末端,并且含有与目标核酸中一个区域互补的序列,和(ii)检测用寡核苷酸,其包含3’末端和5’末端,并且含有与目标核酸序列中第二区域互补的序列,由此在杂交条件下产生(iii)双螺旋混合物,其中所述双螺旋所包含目标核酸与寡核苷酸引物和检测用寡核苷酸发生复性,从而使得寡核苷酸引物的3’末端位于检测用寡核苷酸5’末端的上游;在足以解离并释放复性检测用寡核苷酸或其至少一个片段的条件下使第一步骤中的样品暴露于解离剂中,由此产生一或多种MDP;并通过质谱法来检测所述一或多种MDP,由此检测样品中是否存在目标核酸序列。
本发明另外部分提供检测目标核酸的方法,其包含以下步骤:使检测用寡核苷酸与目标核酸发生复性;引入解离剂以解离至少部分检测用寡核苷酸;和通过质谱法检测部分解离检测用寡核苷酸或其片段。
在某些实施例中,反应条件容许延伸寡核苷酸引物,其置换并降解检测用寡核苷酸,由此产生寡核苷酸片段和/或其附属的任何检测性质。在某些实施例中,在实施检测方法之前通过扩增反应扩增目标核酸。在另一实施例中,检测前的所有步骤都是在单一密闭反应容器中同时实施。在另一实施例中,重复实施所述方法的扩增或延伸步骤直至检测到信号。在一相关实施例中,确定扩增步骤数。
在某些实施例中,以相对于寡核苷酸引物较高的浓度引入检测用寡核苷酸。同样,在某些情况下,检测用寡核苷酸可能不能通过酶来延伸。在另一实施例中,使用不止一种检测用寡核苷酸来检测单一目标核酸,或不止一种检测用寡核苷酸在结合有寡核苷酸引物的目标核酸序列内发生复性。
在某些实施例中,解离剂是酶。在某些实施例中,酶具有5’-3’核酸酶活性。在其它实施例中,酶具有能扩增目标核酸的聚合酶活性。在某些实施例中,酶是DNA聚合酶,并且在其它实施例中,酶是RNA依赖性DNA聚合酶、DNA依赖性RNA聚合酶、RNA依赖性RNA聚合酶或DNA依赖性DNA聚合酶。实例性DNA聚合酶包括Taq聚合酶和大肠杆菌(E.coli)DNA聚合酶I。在另一实施例中,酶具有热稳定性。
本发明部分提供得自检测用寡核苷酸置换和/或降解的MDP的产生。在一实施例中,通过质谱法检测到不止一种来自相同检测用寡核苷酸的质量可区分产物(MDP),其产生对应于目标核酸的质量特异性检测谱特征。在另一实施例中,检测用寡核苷酸包含与目标核酸不互补的核苷酸序列。非互补区域可位于检测用寡核苷酸的5’末端、位于检测用寡核苷酸中部,在此情况下检测用寡核苷酸仍能与目标核酸发生复性;或其位于检测用寡核苷酸的3’末端。在其它实施例中,MDP能在释放后结合固体载体。例如,MDP可直接结合MALDI-TOF质谱法分析的基质。在另一实施例中,在释放一或多种MDP后通过(例如)使用通用引物系统对其进行扩增。
在某些实施例中,将检测用寡核苷酸纳入采用通用引物的核酸检测方法中以扩增得自酶促修饰的序列特异性引物或寡核苷酸,其中扩增过程产生可通过质谱法检测的质量可区分产物。更具体来说,本发明一实施例包括:提供多种目标核酸序列,其各自自3’至5’包含第一、第二和第三目标域,第一目标域包含检测位置,第二目标域是至少一个核苷酸;使目标核酸序列接触每一目标序列的探针组,每一组包含:第一探针(其自5’至3’包含含有第一通用引导序列的第一域、包含检测用寡核苷酸结合域的第二域、和包含与目标序列第一目标域基本互补的序列的第三域、和在3’端四个末端碱基内的询问位置),第二探针(其包含第一域,其包含与目标序列第三目标域基本互补的序列以形成一组第一杂交复合物、和包含第二通用引导序列的第二域);在一定条件下使第一杂交复合物至少接触与第一通用引导序列杂交的第一通用引物、延伸酶和dNTP,其中如果询问位置的碱基与检测位置的碱基互补,则第一探针通过第二目标域发生延伸以形成第二杂交复合物;使第二杂交复合物与连接酶接触以将延伸第一探针连接至第二探针从而形成扩增模板。所述实施例另外包括引入检测用寡核苷酸,其中特定检测用寡核苷酸与序列特异性扩增模板发生复性;引入酶来扩增扩增模板;和检测一或多种得自扩增反应的MDP,其中确定是否存在目标核酸序列。在另一实施例中,本发明方法是结合以下专利中所揭示的方法来使用:美国专利第6,797,470号、美国专利第6,890,741号、美国专利第6,812,005号、美国专利第6,890,741号、美国专利申请公开案第20020006617号、美国专利申请公开案第20030036064号、美国专利申请公开案第20030104434号、美国专利申请公开案第20030211489号、美国专利申请公开案第20030108900号、美国专利申请公开案第20030170684号、美国专利申请公开案第20040121364号、美国专利申请公开案第20040224352号、美国专利申请公开案第20040224352号,上述所有专利都是以引用方式并入本文中。
在某些实施例中,检测用寡核苷酸未经修饰,在此情况下通过质谱法检测包含寡核苷酸片段的未经修饰MDP。在其它实施例中,检测用寡核苷酸包含一或多个核苷修饰。核苷修饰包括对核苷酸、磷酸酯主链或糖部分的修饰。核苷修饰可发生在检测用寡核苷酸的非互补区域中、检测用寡核苷酸的5’末端、检测用寡核苷酸的3’末端、或检测用寡核苷酸的中部,此可确保检测用寡核苷酸与目标核酸的目标特异性杂交。在另一实施例中,核苷修饰选自由同位素富集、同位素贫化和卤素修饰组成的群组。在另一实施例中,通过引入氘或其它适宜同位素来达成同位素编码。
在某些实施例中,检测用寡核苷酸包含一或多种解离识别位点。在另一实施例中,检测用寡核苷酸包含一或多种不可降解核苷酸。在另一实施例中,检测用寡核苷酸包含一或多种解离识别位点和一或多种不可降解核苷酸。
在优选实施例中,检测用寡核苷酸包含一或多个锁核酸(LNA),其用作不可降解核苷酸且由此可控制解离点。LNA可与其互补体极稳定地结合并且具有相对于新生脱氧核苷酸显著降低的解离率。可通过置放两种或更多种彼此相邻的LNA来进一步增强此效应。此外,LNA可提高纳入其的寡核苷酸的解链温度。由此控制质量降解产物的解离位点以便可预测产物大小和进行适当鉴定。
在另一实施例中,检测用寡核苷酸包含一或多种肽核酸(PNA)。
在某些实施例中,检测用寡核苷酸包含一或多种检测部分。在一实施例中,检测部分可为以下物质中的任何一或多种:复合体、糖、肽、蛋白质、抗体、化合物(例如生物素)、质量标签(例如金属离子或化学基团)、荧光标签、电荷标签(例如聚胺或带电染料)和疏水标签。在一相关实施例中,检测部分是通过质谱法检测的质量可区分产物(MDP)或MDP的一部分。在一具体实施例中,检测部分是通过质谱法检测的荧光标签或标记。在某些实施例中,检测部分位于检测用寡核苷酸的5’末端,检测部分与检测用寡核苷酸的非互补区域相连,或检测部分位于非互补序列的5’末端。在另一实施例中,将检测部分纳入或连接至内部核苷酸或检测用寡核苷酸3’末端的核苷酸中。在另一实施例中,单独或组合使用一或多种检测部分。
在某些实施例中,检测部分是合成聚合物或生物聚合物或其某些组合,而在其它实施例中,检测部分是可通过质谱法检测的任何化合物。在具体实施例中,检测部分是包含单体单元的生物聚合物,其中各单体单元单独或独立地选自任何一或多种氨基酸、核酸、和糖类。氨基酸和核酸是优选单体单元。由于可单独并独立地选择各单体单元,因此生物聚合物检测部分可为多核酸、肽、肽核酸、寡核苷酸等等。
在某些实施例中,检测部分是合成聚合物,例如聚乙二醇、聚乙烯苯酚、聚丙二醇、聚甲基丙烯酸甲酯、和其衍生物。合成聚合物通常可含有选自主要由以下组成的群组的单体单元:乙二醇、乙烯苯酚、丙二醇、甲基丙烯酸甲酯、和其衍生物。更通常地,检测部分可为含有聚乙二醇单元的聚合物。
本发明部分提供检测用寡核苷酸,其用作与特定目标核酸序列结合的探针。在一实施例中,检测用寡核苷酸选择性地结合基因特异性序列,其藉此使得可实施基因表达分析。在另一实施例中,检测用寡核苷酸选择性地结合等位基因特异性序列。在一相关实施例中,检测用寡核苷酸的等位基因特异性核苷酸碱基包含检测部分或核苷修饰。在优选实施例中,检测用寡核苷酸的等位基因特异性核苷酸碱基位于检测用寡核苷酸中部或靠近检测用寡核苷酸的5’末端。
本发明也部分提供根据表观遗传差异(例如甲基化、乙酰化和其它非序列改变性修饰)检测目标核酸的方法。在一实施例中,检测用寡核苷酸根据目标核酸的甲基化状态选择性地结合甲基化特异性序列。在一相关实施例中,检测用寡核苷酸在亚硫酸氢盐处理之前或之后根据目标核酸的甲基化状态选择性地结合甲基化特异性序列。在另一实施例中,通过用能结合甲基化DNA的多肽涂布容器来针对甲基化DNA选择性富集目标核酸(在扩增之前或扩增之后);使所述多肽接触包含甲基化和/或未甲基化DNA的样品;并检测所述多肽与甲基化DNA的结合。检测甲基化DNA的方法阐述于PCT专利公开案第WO06056478A1号中,其是以引用方式并入本文中。
本发明部分提供检测目标核酸的方法。一般来说,所述方法包括获得多种检测用寡核苷酸,每种检测用寡核苷酸都针对所给分析加以特定设计(例如等位基因特异性、基因特异性、序列特异性、甲基化特异性等),如上所述。优选地,在所述多种检测用寡核苷酸中,每种都能产生一或多种与是否存在目标核酸相关的独特质量可区分产物。“独特质量可区分产物”意指多种检测用寡核苷酸中每种都可产生与所述复数种检测用寡核苷酸中所有其它核苷酸不同的质量可区分产物。多种一般应理解为包括两种或更多种检测用寡核苷酸。随后,在适合容许生成可通过质谱法分析的MDP的条件下使目标分子接触多种检测用寡核苷酸。通常,质量指示特定目标核酸。以此方式,可根据MDP的独特组合来鉴定目标分子。实例1提供使用序列特异性分析来检测恒河猴(Rhesus)D基因外显子10的实例。在另一实例中,针对目标核酸每一具体SNP来设计分析,其中所分析的检测用寡核苷酸根据所存在SNP种类产生独特MDP。如果欲在特定位置检测两种SNP,则使用两种具有独特MDP的等位基因特异性检测用寡核苷酸。对于基因表达分析,可使用基因特异性检测用寡核苷酸和竞争剂。例如,可参见美国专利申请案第20040081993号(康托尔(Cantor)等人),其是以引用方式并入本文中。
在某些实施例中,寡核苷酸引物选择性地结合等位基因特异性序列。在某些实施例中,寡核苷酸引物的3’末端位于检测用寡核苷酸5’末端上游至少一个碱基处。
本发明部分提供通过质谱法检测MDP的方法。在一实施例中,通过质谱仪来实施检测,质谱仪可为以下中的一种:MALDI-TOF MS、串联式MS、ESI-TOF、ESI-离子阱、LC-MS、GC-MS、离子迁移MS、激光解吸电离质谱法(LDI-MS)和四极MS。现有的或可研发的其它质谱法器件和方法在本发明范围内。
本发明也部分提供检测并定量生物分子(例如目标核酸)的方法,其中通过检测质量可区分产物(MDP)来监测PCR产物的生成。在一实施例中,检测是以实时方式来实施。在某些实施例中,实时检测是用电喷雾质谱仪或LC-MS来实施。在另一实施例中,在质谱法相关介质上使一或多种MDP定点在对应于扩增过程期间特定时刻的特定位置上。质谱法相关介质的一实例是适用于MALDI-TOF MS的基质。在另一实施例中,引入竞争模板核酸,其中所述模板核酸用作内部对照。在另一实施例中,确定扩增循环数以获得定量结果。可通过循环阈值(Ct)或业内已知的任何其它方法来定量存于反应混合物中的起始目标核酸量。
本文也提供检测目标核酸序列的方法,其包含通过质谱法分析含有质量可区分产物的核酸样品,其中所述质量可区分产物得自(a)使寡核苷酸引物与目标核酸发生复性;(b)使检测用寡核苷酸与相同目标核酸发生复性;和(c)使目标核酸接触沿检测用寡核苷酸方向延伸寡核苷酸引物的酶,其中:所述检测用寡核苷酸或其部分与目标核酸序列互补,并且所述酶解离并由此释放至少一部分检测用寡核苷酸,由此产生一或多种质量可区分产物;藉此通过以质谱鉴定质量可区分产物来检测目标核酸序列。在某些实施例中,引入结合第一寡核苷酸合成产物的第二寡核苷酸,随后可藉此实施指数扩增。
本文也提供检测目标核酸序列的方法,其包含通过质谱法分析含有质量可区分产物的核酸样品,其中所述质量可区分产物得自(a)在可检测探针特异性结合目标生物分子的条件下使目标生物分子接触含有用作模板核酸的寡核苷酸的可检测探针;(b)使寡核苷酸引物与所述模板核酸发生复性;(c)使检测用寡核苷酸与相同模板核酸发生复性;和(d)使模板核酸接触沿检测用寡核苷酸方向延伸寡核苷酸引物的酶,其中:所述检测用寡核苷酸或其部分与目标核酸序列互补,并且所述酶解离并由此释放至少一部分检测用寡核苷酸,由此产生一或多种质量可区分产物;藉此通过以质谱鉴定质量可区分产物来检测目标核酸序列。在某些实施例中,引入结合第一寡核苷酸合成产物的第二寡核苷酸,随后可藉此进行指数扩增。
附图说明
图1是绘示使用质谱法检测目标核酸的示意图。反应组份包括目标核酸、正向和反向PCR引物、检测用寡核苷酸、扩增酶、和诸如缓冲液等扩增试剂以及核苷酸。在步骤A中,进行引物延伸。在延伸期间,置换并降解检测用寡核苷酸(步骤B)。在每一扩增循环期间,通过酶的5’核酸酶活性(步骤C)来生成质量可区分产物(MDP)(在图中也称作降解产物)。在扩增后,可视情况调整MDP并随后通过质谱法对其实施检测。反应副产物尤其可包括PCR产物、残余引物、未降解寡核苷酸引物和MDP(步骤D)。步骤E展示实例性波谱图,其中y轴是任意强度(a.i.)并且x轴是质量(m)比z(电荷)。MDP的存在证实了目标核酸的存在。
图2是绘示使用质谱法检测目标核酸的示意图,其中检测用寡核苷酸包含5’非互补区域。在步骤B中,酶释放检测用寡核苷酸的5’非互补区域,并在步骤C中对其实施检测。图9提供实验性波谱图,其中生成并检测5’非互补MDP。在图底部术语“鉴定目标NS”是指“鉴定目标核苷酸序列”。
图3是绘示使用质谱法检测目标核酸的示意图,其中检测用寡核苷酸包含3’非互补区域。在步骤B中,酶释放检测用寡核苷酸的3’非互补区域,并在步骤C中对其实施检测。在图底部术语“鉴定目标NS”是指“鉴定目标核苷酸序列”。在一实施例中,本发明可部分包括经解离和检测的3’非互补区域。在另一相关实施例中,3’非互补区域上游的杂交寡核苷酸是不可解离或不可降解的,由此产生独特定义的解离产物。
图4是绘示检测多种目标核酸的多重分析的示意图。针对四种目标(1-4)中的每一目标设计分析,其中各目标具有独特检测用寡核苷酸,其具有特定长度(L1-L4)的5’非互补区域。在扩增后(步骤A),如果存在目标则生成5’非互补区域MDP。在此具体实例中,存在目标1和4,因此生成L1和L4 MDP并通过质谱法对其实施检测(如步骤B的波谱图中所示)。
图5是绘示本发明实时实施例的示意图。方案与图1中所示类似,然而在每一循环后或在给定时间点(例如在每5次循环后)实施质谱法分析。如果存在目标核酸,则降解产物(即MDP)信号强度随每一循环而增强,同时引物和未降解检测用寡核苷酸信号强度由于消耗和降解而减弱。
图6是示意图绘示分析的变化形式,其中采用通用引物来检测目标生物分子。在此具体图中,展示基因分型分析,其中每一单一核苷酸多态性(SNP)具有独特引物组。例如,使用具有序列区域5和6(S5和S6)的等位基因特异性引物来分析SNP3,所述序列区域分别对应于C等位基因和G等位基因。也引入名为CS3或通用引物3的下游引物。在步骤A中,引物与目标杂交,并且如果存在等位基因则发生等位基因特异性引物延伸。在延伸后,形成连接产物。引入与连接产物中分析特异性序列区域互补的名为cS5和cS6或互补引物5和6的检测用寡核苷酸用于SNP3分析。在使用通用引物扩增连接产物后,置换并降解检测用寡核苷酸(cS5和cS6)以产生MDP,并通过质谱法对其实施检测。实例性质谱图揭示存在具有SNP1的等位基因A,具有SNP2的等位基因T,和具有SNP3的等位基因C和G(杂合)。
图7是绘示可用于非核酸检测(例如蛋白质检测)的本发明实施例的示意图。每一适体含有目标结合域(A1-A3),在随后的扩增期间可结合有独特互补检测用寡核苷酸(CS)的独特序列(S)、和通用引物结合位点。在步骤A中,目标蛋白质结合固定抗体。在步骤B中,通过洗涤移除未结合试剂,并添加适体库。互补适体结合目标蛋白质,并洗涤除去非互补适体。添加通用引物和序列特异性检测用寡核苷酸(步骤C)。在扩增后,置换并降解检测用寡核苷酸以产生MDP,并通过质谱法对其实施检测(步骤D)。MDP1和MDP3的存在分别指示存在蛋白质1和蛋白质3。
图8是展示在PCR扩增期间自外显子10特异性检测用寡核苷酸生成的MDP(质量介于1900与3000Da范围内)的质谱图。在2123.6Da、2437.0Da和2726.2Da处的质量信号代表含有以下标签的5’MDP:在第一个杂交T核苷酸处解离的polyA标签(6腺嘌呤)(AAAAAAT)、在前两个杂交核苷酸后解离的polyA标签(AAAAAATA)、和在前三个杂交核苷酸后解离的polyA标签(AAAAAATAC)。Y轴是信号强度并且X轴是质荷比。
图9是展示在PCR扩增期间自外显子5特异性检测用寡核苷酸生成的MDP(质量介于2500与7000Da范围内)的质谱图。在5765和6335.9Da处的质量信号代表剩余未使用PCR引物。在2741.6Da和3032.6Da处的质量信号代表含有以下标签的5’MDP:在第一个杂交T核苷酸处解离的polyA标签(8腺嘌呤)(AAAAAAAAT)和在前两个杂交核苷酸后解离的polyA标签(AAAAAATC)。Y轴是信号强度并且X轴是质荷比。
具体实施方式
本发明提供多种优于当前核酸检测和定量方法的优势,例如多重分析能力增强、分析简易性、循环时间较短和无PCR后处理。当前方法经常需要多步骤反应,包括固相纯化、转移和洗涤步骤、和PCR后酶促反应,所有这些步骤都会增加总分析时间和成本,由此限制方法适用性。例如,基于TaqMan的QPCR方法受限于其对染料的使用,而本发明仅受限于针对每种分析所设计的独特检测性质数。此使得可明确检测有限质量范围内的MDP。
所述分析也较简单。在一实施例中,仅有一种在密闭管中实施的扩增或延伸步骤,因此未转移产物或未对其实施扩增后酶促反应。同样,扩增步骤容许快速循环(即分析在平台期结束),因此速度和运转时间仅受限于循环速率-并且可使用快速循环。最后,不实施扩增后处理。例如,不需要将任何产物固定在固体载体上或使其结合在捕获探针上并用酶进一步处理。
本发明提供同时鉴定并定量大量来自一或多种样品的序列以供众多种应用的优势,所述应用包括(但不限于)诊断学、法医学和诸如种体(例如航空旅客)身份验证等安全应用。在某些应用中,本发明提供分析一或多种样品中是否存在多种与具体疾病相关的多态性的优势,用以分析一或多种与具体疾病相关的基因的表达,或用以在可在数小时内而非数天内完成的简单快速多重分析中鉴定一或多种样品的来源。
本发明方法可用于实施多重分析来检测/分析生物分子目标,包括(但不限于)核酸检测,例如序列识别、SNP检测、转录分析或mRNA测定、等位基因测定、突变测定和甲基化分析。在另一实施例中,本发明方法可与基于邻位连接或免疫分析的方法组合用于检测和定量非核酸生物分子,例如蛋白质或肽。例如,在一实施例中,本发明检测用寡核苷酸与在初期邻位连接反应或免疫分析期间形成的连接复合物发生复性,随后将其用作模板用于核酸扩增反应。在连接复合物扩增后,产生质量可区分产物并如本文所述对其实施检测,由此容许增强多重分析能力。邻位连接和免疫分析另外阐述于以下文献中:美国专利第5,665,539号;美国专利第6,511,809号;美国专利第6,878,515号;美国专利申请案第20050233351号;美国专利申请案第20020064779号;以及罗杰布伦特(Roger Brent)和他的同僚,分子科学研究所(Molecular SciencesInstitute)(伯克利(Berkeley),CA),自然方法(Nat Methods.),2005年1月;2(1):31-7,所有这些文献都是以引用方式并入本文中。
使用产生质谱法可检测质量可区分产物的基于扩增的方法的优势在于能同时检测多种目标核酸。当前方法因通过基于荧光生色团的现有方法产生的重叠波谱较宽而受限。因此,荧光多重分析的上限最可能为约十种不同标记。基于质谱法的当前方法可用于最多约50重的多重反应。使用本文所揭示的基于质谱法的方法,可对大于约五十种或数百种、并且可能甚至数千种不同目标实施多重分析。由于此高水平多重分析能力,不仅可同时使用多种分析,而且可用多种不同检测性质来标记任何单独检测用寡核苷酸。
最后,所述分析可广泛用于任何需要快速运转和多重分析能力的领域中(例如公共安全)。所述分析快速稳定,并且检测平台较小,并且具有较高准确性和易使用性,此使得本发明方法称为众多应用中的理想方法,所述应用包括检测临床样品内的传染原、法医学、诊断学、研究(例如检测无性系内的基因(cDNA)插入物)、安全和野外应用。
A.定义
本文所用术语“样品”包括试样或培养物(例如微生物培养物),其包括核酸。术语“样品”也意欲包括生物和环境样品二者。样品可包括合成来源的试样。生物样品包括全血、血清、血浆、脐带血、绒毛膜绒毛、羊水、脑脊液、脊髓液、灌洗液(例如支气管肺泡、胃、腹膜、导管、耳、关节镜)、活组织检查样品、尿、粪便、痰、唾液、鼻粘液、前列腺液、精液、淋巴液、胆汁、泪液、汗液、母乳、乳液、胚胎细胞和胎儿细胞。在优选实施例中,生物样品为血液,并且更优选为血浆。本文所用术语“血液”涵盖全血或血液中的任一部分,例如通常所定义的血清和血浆。血浆是指对经抗凝剂处理的血液实施离心获得的全血部分。血清是指在血液样品凝固后剩余的水样流体部分。环境样品包括环境材料,例如地表物质、土壤、水和工业样品,以及自食品和牛奶加工仪器、装置、设备、器皿、可弃式和不可弃式物件获得的样品。不应将这些实例视为限制适用于本发明的样品类型。
本文所用术语“目标”或“目标核酸”欲意指任何欲检测或测量其存在或欲研究其功能、相互作用或特性的分子。因此,目标主要包括存在可检测探针(例如检测用寡核苷酸)或分析或可由所属领域技术人员制造的任何分子。例如,目标可为生物分子,例如核酸分子、多肽、脂质、或碳水化合物,其能结合或接触可检测探针(例如抗体),其中可检测探针也包含能通过本发明方法加以检测的核酸分子。本文所用“可检测探针”是指能与所关注目标生物分子发生杂交或复性并且使得可特异性检测本文所述目标生物分子的任何分子或试剂。在本发明一方面中,目标是核酸,并且可检测探针是检测用寡核苷酸。在整个本发明中术语“核酸”与“核酸分子”可互换使用。所述术语是指寡核苷酸、寡聚核苷酸、聚核苷酸、脱氧核糖核苷酸(DNA)、基因组DNA、线粒体DNA(mtDNA)、互补DNA(cDNA)、细菌DNA、病毒DNA、病毒RNA、RNA、信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、siRNA、催化RNA、无性系、质粒、M13、P1、粘粒、细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)、扩增核酸、扩增子、PCR产物和其它类型的扩增核酸、RNA/DNA杂合体和聚酰胺核酸(PNA),所有这些物质都可呈单螺旋或双螺旋形式,并且除非另外加以限制,否则其涵盖可以与天然存在核苷酸类似的方式发挥作用的天然核苷酸已知类似物和其组合和/或混合物。因此,术语“核苷酸”是指天然存在和经修饰/非天然存在核苷酸二者,其包括三、二和单磷酸核苷以及存于多核酸或寡核苷酸内的单磷酸酯单体。核苷酸也可为核糖核苷酸;2’-脱氧核苷酸;2’,3’-脱氧核苷酸以及众多种业内熟知的其它核苷酸模拟物。模拟物包括链终止核苷酸,例如3’-O-甲基卤代碱基或糖取代物;替代性糖结构,包括非糖物质、烷基环结构;替代碱基,包括肌苷;经脱氮(deaza)修饰的核苷酸;经χ和ψ连接体修饰的核苷酸;经质量标记修饰的核苷酸;磷酸二酯修饰或替换,包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、硼烷磷酸酯、酰胺、酯、醚;和基本或完全的核苷酸间替代,包括解离连接,例如光可解离硝基苯基部分。
可以定量或定性方式测量目标是否存在。目标可呈多种形式,包括(例如)简单或复杂混合物,或呈基本纯化形式。例如,目标可为含有其它组份的样品的一部分,或可为样品的唯一或主要组份。因此,目标可为完整细胞或组织的一种组份、细胞或组织提取物、其分级分离的裂解物、或基本纯化的分子。目标也可具有已知或未知序列或结构。
本文所用术语“氨基酸”是指天然存在的氨基酸以及可通过业内熟知方法合成或获得的任何经修饰氨基酸。
术语“扩增反应”是指任何增加核酸中目标序列的拷贝的体外方式。
“扩增”是指使溶液经受足以容许进行扩增的条件的步骤。扩增反应的组份可包括(但不限于)例如引物、聚核苷酸模板、聚合酶、核苷酸、dNTP和诸如此类。术语“扩增”通常是指目标核酸的“指数式”增加。然而,本文所用“扩增”也可指核酸中所选目标序列数量的线性增加,但与一次性单一引物延伸步骤不同。
“聚合酶链式反应”或“PCR”是指可以几何级数扩增目标双链DNA中特定区段或子序列的方法。PCR为所属领域技术人员所熟知;例如,参见美国专利第4,683,195号和第4,683,202号;以及PCR方案:方法与应用指南(PCR Protocols:A Guide toMethods and Applications),英尼斯(Innis)等人编辑,1990。
本文所用“寡核苷酸”是指通过磷酸二酯键或其类似物连接的天然或经修饰核苷单体的线性寡聚体。寡核苷酸包括能特异性结合目标核酸的脱氧核糖核苷、核糖核苷、其环口异构形式、肽核酸(PNA)、和诸如此类。通常通过磷酸二酯键或其类似物来连接各单体以形成大小在数种单体单元(例如3-4种)至数十种单体单元(例如40-60种)范围内的寡核苷酸。每当通过字母序列(例如“ATGCCTG”)来表示寡核苷酸时,应理解从左至右核苷酸呈5’-3’顺序,并且除非另外说明,否则“A”表示脱氧腺苷,“C”表示脱氧胞苷,“G”表示脱氧鸟苷,“T”表示脱氧胸苷,并且“U”表示核糖核苷(尿苷)。通常寡核苷酸包含四种天然脱氧核苷酸;然而,其也可包含核糖核苷或非天然核苷酸类似物。倘若酶活性需要特定寡核苷酸或聚核苷酸底物,例如单链DNA、RNA/DNA双螺旋或诸如此类,则所属领域技术人员熟知寡核苷酸或聚核苷酸底物适宜组成的选择。
本文所用“寡核苷酸引物”(或简写成“引物”)是指可与目标核酸模板上的序列杂交并且有助于检测检测用寡核苷酸的聚核苷酸序列。在本发明的扩增实施例中,使用寡核苷酸引物作为核酸合成中的起始点。在非扩增实施例中,寡核苷酸引物可用于产生能被解离剂解离的结构。引物可具有各种长度并且长度经常小于50个核苷酸,例如长度为12-25个核苷酸。可根据所属领域技术人员已知的原理来设计PCR中所用引物的长度和序列。
本文所用术语“检测用寡核苷酸”是指能与所关注目标核酸发生杂交或复性并且使得可特异性检测所述目标核酸的聚核苷酸序列。
“错配核苷酸”或“错配”是指在所述位置处与目标序列不互补的核苷酸。检测用寡核苷酸可具有至少一处错配,但也可具有2、3、4、5、6或7种或更多错配核苷酸。
本文所用术语“多态性”是指等位基因变体。多态性可包括单核苷酸多态性(SNP)以及简单序列长度多态性。多态性可能是由于在一种等位基因处相对于另一种等位基因有一或多个核苷酸发生取代所致,或可能是由于插入或缺失、重复、反转和业内已知的其它改变所致。
本文所用术语“质量可区分产物”可与“解离产物”、“降解产物”或“探针片段”互换使用。此外可使用缩写“MDP”。术语“质量可区分产物”是指通过本文方法解离并释放所述检测用寡核苷酸而获得的一或多种降解产物。质量可区分产物(MDP)可包括(但不限于)未经修饰检测用寡核苷酸片段、经修饰检测用寡核苷酸片段(例如同位素富集或贫化寡核苷酸片段)、包含检测部分的寡核苷酸片段、自检测用寡核苷酸释放的检测部分、和与目标核酸不互补的检测用寡核苷酸片段。质量可区分产物也可包括在检测用寡核苷酸部分降解后与目标核酸脱离的部分解离检测用寡核苷酸片段。
本文所用术语“质量特异性检测谱特征”是指以下情形:检测到不止一种质量可区分产物,由此获得每种目标核酸具有不止一个质量峰的波谱图。在检测用寡核苷酸解离后,可生成多种可通过质谱法检测的MDP。每一检测分析可具有其自身质量特异性检测谱特征,其包含多种对应于相同目标核酸的具有不同质量的解离产物。
本文所用术语“经修饰”是指已经改变而包括检测性质的检测用寡核苷酸。
本文所用术语“检测性质”是指已经引入以产生分离特征的修饰,所述分离特征可根据(例如)质量差异或大小差异通过质谱法或任何其它基于大小的分离方法(例如凝胶电泳(在包括丙烯酰胺或琼脂糖凝胶、纸等在内的各种载体上进行)、色谱或过滤)来检测。分离特征使得可自较大MDP组检测特定MDP或MDP亚组。检测性质包括(但不限于)检测部分和核苷修饰。
本文所用术语“检测部分”是指可用于提供可检测(优选地可定量)效应并且可连接或纳入核酸(例如检测用寡核苷酸)中的任何原子或分子。在一优选实施例中,检测部分是特征在于具有独特质量的部分,所述特征使得可在基于质量的分离(例如通过质谱法、凝胶电泳、色谱或过滤来分离)中进行特异性鉴定。检测部分包括(但不限于)核苷酸、复合体、糖、肽、蛋白质和抗体、化合物、金属化合物、吸电子物质、诸如生物素等结合部分、质量标签、荧光标签、电荷标签、挥发性标签和疏水标签。可结合本发明使用的检测部分的其它实例阐述于美国专利公开案第20030194717号(申请案第10/221,666号)中,其是以引用方式并入本文中。
本文所用术语“复合体”在目标检测分析中自复合体模板合成的分子,其用以间接指示所分析样品中特定目标分子的存在。复合体包括一或多种亚单元。复合体聚合的特别优选亚单元是核苷碱基亚单元。复合体更详细地阐述于美国专利申请案第20050287533号(序列号10/874898)中,其是全文以引用方式并入本文中。
本文所用术语“核苷修饰”是指检测用寡核苷酸在分子水平上(例如碱基部分、糖部分或磷酸酯主链)的改变。核苷修饰包括(但不限于)引入解离封阻剂或解离诱导剂、引入小沟结合剂、同位素富集、同位素贫化、引入氘、和卤素修饰。核苷修饰也可包括增加杂交严谨度或提高检测用寡核苷酸解链温度的部分。例如,核苷酸分子可用连接2’与4’碳的外部桥接来修饰,从而获得可抵抗核酸酶解离的锁核酸(LNA)核苷酸。
在提及一种分子与另一种分子(例如目标聚核苷酸的探针)的结合时,术语“特异性的”或“特异性”是指两种分子之间的识别、接触、和稳定复合物的形成,以及所述分子与其它分子之间显著较弱的识别、接触或复合物的形成。本文所用术语“复性”是指在两种分子之间形成稳定复合物。
如果探针中至少一种区域与核酸序列互补体中至少一种区域共有基本序列一致性,则探针“能与所述核酸序列发生杂交”。“基本序列一致性”是至少约80%、优选地至少约85%、更优选地至少约90%、95%或99%、并且最优选100%的序列一致性。出于确定DNA序列和RNA序列的序列一致性的目的,经常将U和T视为相同核苷酸。例如,包含序列ATCAGC的探针能与包含序列GCUGAU的目标RNA序列发生杂交。
本文所用术语“解离剂”是指能解离检测用寡核苷酸以产生质量可区分产物的任何手段,包括(但不限于)酶。在不发生扩增的方法中,解离剂可仅用于解离、降解或释放检测用寡核苷酸或其片段。解离剂可为酶。解离剂可为天然的、合成的、未经修饰的或经修饰的。
在发生扩增的方法中,解离剂优选地为具有合成(或聚合)活性和核酸酶活性的酶。此类酶经常为核酸扩增酶。核酸扩增酶的实例是核酸聚合酶,例如栖热水生菌(Thermus aquaticus)(Taq)DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶I。酶可为未经修饰或经修饰的天然存在的酶。
术语“聚合酶”是指通过使用DNA或RNA作为模板将核苷酸单元添加至核苷酸链中来催化聚核苷酸合成的酶。所述术语是指完整酶或催化结构域。
B.简介
本发明部分涉及采用欲通过质谱法检测的杂交探针的定量扩增方法和包含具有合成和核酸酶活性的单一酶的反应。相反,其它文献中所述某些定量扩增应用需要(a)含有可通过除质谱法以外的方法检测的可检测标记(例如荧光标签)的杂交探针(例如参见美国专利第5,210,015号)、或(b)用于在并非基于扩增的方法中解离解离结构的多种解离剂(例如参见美国专利第5,719,028号)。在本文所述实施例中,扩增反应中包括检测用寡核苷酸以及扩增模板的引物。此外,通过质谱法检测检测用寡核苷酸或其片段使得可提高多重分析水平。在某些实施例中,检测用寡核苷酸经修饰,并且在其它实施例中检测用寡核苷酸未经修饰。下文中更详细地阐述扩增条件、酶特性、检测用寡核苷酸特性、检测用寡核苷酸结合特性和质量可区分产物检测方法。
C.扩增条件
在一实施例中,本文所述方法采用经修改定量扩增方法,此使得可以多重分析方式进行准确灵敏的核酸分析。如颁予马利斯(Mullis)和马利斯等人的美国专利第4,683,195号和第4,683,202号中所述,聚合酶链式反应(PCR)阐述在基因组DNA混合物中不实施克隆或纯化即可提高具有目标序列的区段浓度的方法。可使用PCR来将目标浓度直接增加至易于检测的水平。此扩增目标序列的方法涉及将摩尔过量的两种与双链目标序列中各自链互补的寡核苷酸引物引入含有期望目标序列的DNA混合物中。使混合物变性然后使其发生杂交。在杂交后,用聚合酶使引物延伸以形成互补链。可将变性、杂交、和聚合酶延伸步骤重复实施所需要次数以获得相对高浓度的具有期望目标序列的区段。
本发明方法容许在单一密闭反应容器中同时实施扩增反应,其中可重复实施扩增步骤直至检测到信号。此合成的副产物是来自检测用寡核苷酸的寡核苷酸片段,其为单-、二-和较大核苷酸片段的混合物。检测用寡核苷酸可经修饰以包括可通过质谱法检测的检测性质,或寡核苷酸片段可经修饰以产生具有给定分子质量或大小的质量可区分产物。变性、检测用寡核苷酸与引物复性、以及引物延伸和检测用寡核苷酸解离的重复循环导致引物所界定的目标区域的指数式积累以及质量可区分产物的指数式生成。运行足够循环以获得可检测种类的MDP。
尤其与当前可用分析相比,本发明可提供多种优势,包括能更容易地设计并实施多重分析。在多重分析中,可同时检测若干目标核酸。在多重模式中,使用数组特别设计的检测用寡核苷酸从而使得所得质量可区分产物具有彼此相异的独特质量。可使用多重实验在同一分析中检测2种或更多种目标核酸、10种或更多种目标核酸、100种或更多种目标核酸、或1,000种或更多种目标核酸。在多重分析中所用检测用寡核苷酸数量等于或大于欲检测目标核酸数。例如,当使用多重实验来检测10种目标核酸时,使用10种或更多种检测用寡核苷酸以产生10种或更多种具有独特质量的质量可区分产物。单一分析中所检测分析物数量仅受限于单一分析中可检测的质量可区分产物数量。如本文所述,质谱法可分辨质量中的较小差异,从而使得可在单一分析中使用大量检测用寡核苷酸。
D.引物特性
可使用适宜方法来制备寡核苷酸引物和探针,例如所属领域技术人员熟知的使用磷酸三酯和磷酸二酯的方法。在某些实施例中,检测用寡核苷酸中包括一或多种检测部分。也可在碱基部分、糖部分、或磷酸酯主链处用(例如)小沟结合剂或嵌入剂修饰寡核苷酸。
根据已知算法来设计扩增反应引物。将引物设计为可与目标核酸两侧的序列发生杂交。通常,市售或常规软件可使用各种算法来设计引物从而使得复性温度接近解链温度。扩增引物的长度通常为至少12个碱基、更通常为约15、18或20个碱基。通常将引物设计为参与一个特定反应的所有引物的解链温度彼此相差在5℃内,并且最优选地相差在2℃内。另外应将引物设计为可避免在其自身上引导或相互引导。引物浓度通常足以结合所扩增数量的目标序列以提供对所扩增序列数量的准确评价。所属领域技术人员应了解,引物浓度可根据引物的结合亲和性以及欲结合序列的数量而变化。典型引物浓度可在0.01μM至1.0μM范围内。同样,引物浓度可相对于检测用寡核苷酸浓度而改变,其中检测用寡核苷酸浓度大于引物浓度。
在另一实施例中,正向和反向引物浓度可相对于彼此而改变(有时称作不对称PCR的条件)以藉此相对于模板DNA中的一条链优先扩增另一条链。在优选实施例中,优先扩增结合有检测用寡核苷酸的链。
在引物与目标序列模板杂交并用聚合酶使其延伸的条件下培养扩增反应。所述反应条件可根据所关注目标核酸以及引物的组成而改变。所选择扩增反应循环条件应使得引物可与目标模板序列发生特异性杂交并进行延伸。与所分析样品中可能存在的其它核酸相比,与目标模板发生特异性杂交的引物可优先扩增所述目标序列。
E.酶特性
本发明纳入解离剂的使用以降解并释放可检测质量可区分产物。可使用若干种业内已知核酸酶来解离不同类型的核酸。例如,可使用可解离双链DNA的核酸酶(例如DNA酶I和外切核酸酶III),或可解离单链DNA的核酸酶,例如核酸酶S1。核酸酶包括仅用作核酸酶的酶以及含有核酸酶活性的多功能酶,例如DNA聚合酶,例如具有5’核酸酶活性的Taq聚合酶。人们已知若干种得自不同细菌物种或经设计突变的Taq聚合酶衍生物,其可解离特定结构的核酸杂合体(凯瑟(Kaiser)等人,生物化学期刊(J. Biol.Chem.)274:21387-21394(1999);莱米车夫(Lyamichev)等人,美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)96:6143-6148(1999);马(Ma)等人,生物化学期刊,275:24693-24700(2000))。例如,已研发出CleavaseTM酶(三浪技术公司(Third WaveTechnologies)),其仅在特定核酸结构中引发解离。在优选实施例中,解离剂是具有聚合酶和核酸酶活性的酶,其中目标核酸以指数方式扩增同时生成质量可区分产物。
在某些实施例中,酶在与目标杂交的检测用寡核苷酸区域的5’末端处将检测用寡核苷酸解离为单个核苷酸。在另一实施例中,检测用寡核苷酸并非以逐核苷酸方式解离。相反,通过引入可产生具有不止一个核苷酸的质量可区分产物的检测部分或核苷修饰来调节解离。在优选实施例中,检测用寡核苷酸的解离方式应使得其可产生可复制并且可区分的MDP。
F.检测用寡核苷酸特性
本发明检测用寡核苷酸可具有任何适宜大小,并且通常在约6至约100个核苷酸范围内,更优选为约6至约80个核苷酸并且甚至更通常地为约10至约40个核苷酸。检测用寡核苷酸的确切序列和长度部分取决于其所结合目标聚核苷酸的性质。在具体实施例中,结合位置和长度可变以获得适宜复性和解链特性。作出此类设计选择的指导可参见许多业内认可的参考文献。通过检测用寡核苷酸的杂交以及引物对目标序列的扩增来扩增目标核酸可提供对样品中目标核酸序列数量的定量确定。在优选实施例中,检测用寡核苷酸是不可延伸的(例如通过引入3’双脱氧核苷酸),由此降低出现扩增伪迹的可能性。
检测用寡核苷酸与目标核酸序列之间也可含有错配,例如在目标核酸序列的不变(非多态)位置处。在某些实施例中,其它核苷酸(例如2、3、4、5、6、或7个或更多个核苷酸)也可与目标核酸发生错配。在某些实施例中,所述其它错配在与目标核酸序列杂交之前与上游检测用寡核苷酸序列形成茎-环结构。错配核苷酸可存于检测用寡核苷酸的5’末端、3’末端或内部。3’错配的实例阐述于美国专利申请案第20060024695号中,其是以引用方式并入本文中。在另一实施例中,检测用寡核苷酸互补区域的5’末端可含有GC夹。
检测用寡核苷酸可经修饰或未经修饰。经修饰寡核苷酸可含有检测部分或核苷修饰。检测部分和核苷修饰以及制备和使用其的方法的实例阐述于以下文献中:美国专利第5,174,962号;美国专利第5,360,819号;美国专利第5,516,931号;美国专利第6,268,129号;美国专利第6,635,452号;美国专利第6,322,980号;美国专利第6,514,700号;美国专利第6,649,351号;和美国专利第6,613,509号;和美国专利申请案第US20060172319号,所有上述文献都是以引用方式并入本文中。
术语“检测部分”是指质量标记、标签或信号。本发明各类检测部分的实例包括一组优选地共有类似质谱解析特性并且具有类似或相同偶合化学性质的化合物以简化多个检测部分变体的合成。本发明检测部分可通过质谱法来检测。质谱技术的代表类型包括基质辅助激光解吸电离、直接激光解吸、电喷雾电离、二次中性粒子质谱、和二次离子质谱法,其中优选者为激光解吸电离。一般可通过在信号处理和分析中使用对数放大器和/或可变衰减来扩展质谱测量的动态范围。
在其它相关实施例中,可用任一类型的容许检测用寡核苷酸的检测、解离、或抗解离的化学基团或部分来标记核苷酸,所述基团或部分包括(但不限于)放射性分子、荧光分子、抗体、抗体片段、半抗原、碳水化合物、生物素、生物素衍生物、磷光部分、发光部分、电化学发光部分、有色部分、和具有可检测电子自旋共振、电容、介电常数或电导率的部分。可用一类或不止一类化学基团或部分来标记核苷酸。各核苷酸可用相同化学基团或部分来标记。或者,各不同核苷酸可用不同化学基团或部分来标记。经标记核苷酸可为dNTP、ddNTP、或dNTP与ddNTP二者的混合物。未经标记核苷酸可为dNTP、ddNTP、或dNTP与ddNTP二者的混合物。
可使用核苷酸的任一组合来纳入核苷酸,包括(但不限于)未经标记脱氧核苷酸、经标记脱氧核苷酸、未经标记双脱氧核苷酸、经标记双脱氧核苷酸、经标记与未经标记脱氧核苷酸的混合物、经标记与未经标记双脱氧核苷酸的混合物、经标记脱氧核苷酸与经标记双脱氧核苷酸的混合物、经标记脱氧核苷酸与未经标记双脱氧核苷酸的混合物、未经标记脱氧核苷酸与未经标记双脱氧核苷酸的混合物、未经标记脱氧核苷酸与经标记双脱氧核苷酸的混合物、双脱氧核苷酸类似物、脱氧核苷酸类似物、双脱氧核苷酸类似物与脱氧核苷酸类似物的混合物、磷酸化核苷类似物、2’-脱氧核苷酸-5’-三磷酸酯、和经修饰2’-脱氧核苷酸-5’-三磷酸酯。
所有四种核苷酸都可用不同荧光基团来标记,此使得一个反应可在所有四种经标记核苷酸的存在下进行。或者,可在每个所关注基因座实施四个单独“填补”反应;四个反应中每个反应都含有一种不同的经标记核苷酸(例如ddATP*、ddTTP*、ddGTP*、或ddCTP*,其中*指示经标记核苷酸)。每种核苷酸都可经不同化学基团或相同化学基团标记。经标记核苷酸可为双脱氧核苷酸或脱氧核苷酸。
在另一实施例中,核苷酸可经荧光染料标记,包括(但不限于)荧光素、芘、7-甲氧基香豆素、瀑布蓝(Cascade Blue).TM.、埃里克撒荧光素(Alexa Flur)350、埃里克撒荧光素430、埃里克撒荧光素488、埃里克撒荧光素532、埃里克撒荧光素546、埃里克撒荧光素568、埃里克撒荧光素594、埃里克撒荧光素633、埃里克撒荧光素647、埃里克撒荧光素660、埃里克撒荧光素680、AMCA-X、二烷基氨基香豆素、太平洋蓝(Pacific Blue)、莫利纳蓝(Marina Blue)、BODIPY 493/503、BODIPY Fl-X、DTAF、俄勒冈绿(Oregon Green)500、丹酰(Dansyl)-X、6-FAM、俄勒冈绿488、俄勒冈绿514、罗丹明(Rhodamine)绿-X、罗德尔绿(Rhodol Green)、钙黄绿素(Calcein)、曙红(Eosin)、溴乙啶、NBD、TET、2’,4’,5’,7’四溴磺基荧光素、BODIPY-R6G、BODIPY-FI BR2、BODIPY 530/550、HEX、BODIPY 558/568、BODIPY-TMR-X.、PyMPO、BODIPY564/570、TAMRA、BODIPY 576/589、Cy3、罗丹明红-x、BODIPY 581/591、羧基X罗丹明、德克萨斯红(Texas Red)-X、BODIPY-TR-X.、Cy5、光谱蓝(SpectrumAqua)、光谱绿1号、光谱绿2号、光谱橙、光谱红、或萘并荧光素。
检测部分可包括大量不同类型化合物,包括生物聚合物和合成聚合物。可以单独或聚合形式用作检测部分的代表性生物单体单元包括肽核酸(PNA)氨基酸、非天然氨基酸、核酸、糖类、碳水化合物、肽模拟物和核酸模拟物。优选肽是天然存在的、稳定的并且相对较小的肽(例如神经肽物质P)。优选氨基酸也包括具有简单脂肪族侧链的氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)、具有芳香族侧链的氨基酸(例如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、和组氨酸)、具有含有氧和硫的侧链的氨基酸(例如丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸和半胱氨酸)、具有含有羧基或酰胺基的侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺)、和具有含有强碱性基团的侧链的氨基酸(例如赖氨酸和精氨酸)、以及脯氨酸。上述氨基酸的衍生物也可视作单体单元。本文所用氨基酸衍生物是任何结构内含有经氨基取代羧酸的碱性氨基酸核心的化合物,其中代表性实例包括(但不限于)偶氮丝氨酸、氟丙氨酸、GABA、鸟氨酸、正亮氨酸和环丝氨酸。也可使用衍生自上述氨基酸的肽作为单体单元。代表性实例包括分子量大于约500道尔顿的天然存在的肽和合成肽二者,其中优选者为约500-5000道尔顿的肽。糖类的代表性实例包括核糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖和其它由具有2-7个碳的碳链组成的糖衍生物。代表性多糖包括上文所列通过糖苷键连接的糖类单元的组合。一般来说,任何一个检测部分内聚合单元的序列并不重要;总质量才是标记的关键性质。在本发明一实施例中,使肽检测部分与核苷酸组合以产生MDP库。例如,使相同肽(例如物质P:具有以下序列的11氨基酸多肽:Arg ProLys Pro Gln Gln Phe Phe Gly Leu Met)与具有不同质量的核苷酸库(例如所有可能的四聚体)偶联。
本发明单体单元也可由核苷碱基化合物或核苷修饰组成。本文所用术语核苷碱基是指结构内包括以下物质的任一部分:嘌呤、嘧啶、核酸、核苷、核苷酸或这些物质中任一种的衍生物,例如经保护核苷碱基、嘌呤类似物、嘧啶类似物、亚叶酸类似物、甲基膦酸酯衍生物、磷酸三酯衍生物、磷酸硼衍生物或硫代磷酸酯衍生物。
本发明检测部分也可包括任何有机或无机聚合物,其具有所限定质量值,在生物分析期间保持水溶性并且可通过质谱法来检测。可以聚合形式用作质量单元的代表性合成单体单元包括聚乙二醇、聚乙烯苯酚、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙二醇、聚吡咯、和其衍生物。所属领域技术人员可容易地获得众多种聚合物。所述聚合物可由单一类型的单体单元或单体单元的组合组成以产生混合聚合物。任何一个检测部分内聚合单元的序列并不重要;总质量才是标记的关键性质。
对于质量低于约500Da的非挥发性检测部分来说,通常需要显著离子特征;代表性实例包括季铵盐的聚乙二醇寡聚体(例如R-(O-CH2-CH2)n-N(CH3)3 +.Cl-)和羧酸和盐的聚乙二醇寡聚体(例如R-(O-CH2-CH2)n-CO2--.Na+)。
不挥发性检测部分的实例通常包括分子量低于约500Da的较小聚乙二醇寡聚体和小肽(天然或经修饰)。在这些情况下,如同本文所考虑的所有情形一般,质量分析不是通过电子连接来进行的。
本发明检测部分也可包括多种非挥发性和不挥发性非聚合有机化合物。非挥发性有机化合物的代表性实例包括血红素基团、染料、有机金属化合物、类固醇、富勒烯(fullerene)、类视色素、类胡萝卜素和聚芳烃。
优选地在使用检测用寡核苷酸上的多个检测部分时避免信号重叠。除具有单电荷的检测部分呈现较大的主信号外,多电荷形式的检测部分以及二聚形式的检测部分也可能呈现较大的主信号。单一检测部分呈现的多个信号可能与第二检测部分的主峰信号重叠或使其变模糊。因此在给定分析所用检测部分的质量范围中通常多电荷或二聚体物质不会干扰所有检测部分的检测,例如在检测部分的质量范围中最小质量标记大于最大检测部分质量的一半。
其它检测部分包括业内熟知的碱基连接荧光素和猝灭剂。其可得自(例如)以下公司:生物技术公司(Life Technologies)(盖瑟斯堡(Gaithersburg),Md.)、西格玛-吉诺斯(Sigma-Genosys)(伍德兰兹(The Woodlands),Tex.)、英杰公司(Invitrogen)(卡尔斯巴德(Carlsbad),Ca.)、或合成遗传学公司(Synthetic Genetics)(圣地亚哥(SanDiego),Calif.)。在某些情况下,通过对寡核苷酸的合成后修饰将碱基连接荧光素纳入寡核苷酸中,所述寡核苷酸是用连接有碱基的反应性基团来合成。荧光素可连接至糖或碱基的3’OH。碱基连接荧光素和/或猝灭剂可用于产生具有特定质量的独特MDP,然后可通过质谱法来检测。
在另一实施例中,检测用寡核苷酸包含不可解离(即不可降解或抗核酸酶)核苷酸。如本文所述,本发明的酶可解离检测用寡核苷酸中对核酸酶敏感的任何键。然而,在目标结合部分(即检测用寡核苷酸中与目标核酸杂交或互补的部分)中具有至少一个抗核酸酶键的优势在于,检测用寡核苷酸可在解离后产生单粒级种类的质量可区分产物。特别优选的不可解离(或抗解离)核苷酸是锁核酸(LNA)。锁核酸(也称作不可接近RNA)是经修饰RNA核苷酸。LNA核苷酸的核糖部分通常经连接2’与4’碳的外部桥接修饰。在需要时可将LNA核苷酸与DNA或RNA碱基一起纳入检测用寡核苷酸中。在一实施例中,将一或多种LNA纳入检测用寡核苷酸互补(或目标结合部分)区域的5’末端中。
锁核糖构象可增强碱基堆积和主链预组装,并由此显著提高纳入LNA的检测用寡核苷酸的热稳定性(解链温度)。可通过置放两个或更多个彼此相邻的LNA进一步增强这种效应。参见下文实例3。
核酸酶可解离键可包括(例如)磷酸二酯键,并且抗核酸酶键可包括(例如)硫代磷酸酯、次膦酸酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯、或除亚磷酸衍生物以外的连接体,例如酰胺和硼酸酯连接或烷基甲硅烷基二酯和肽核酸。
在另一实施例中,检测用寡核苷酸包含可由酶解离的基团或连接。可酶促解离的释放基团包括磷酸二酯或酰胺连接以及限制性内切核酸酶识别位点。
在另一实施例中,检测用寡核苷酸包含小沟结合剂(MGB),其中MGB根据具体分析位于检测用寡核苷酸的5’末端、中部、或3’末端。小沟结合蛋白质和/或具有偶联小沟结合剂(MGB)基团的经修饰碱基DNA探针与单链DNA目标形成极稳定双螺旋,从而使得较短探针可用于基于杂交的分析中(例如美国专利第5,801,155号)。因此,在某些实施例中,在检测用寡核苷酸中(例如在探针3’末端处)也包括小沟结合剂基团。文献中已阐述多种适宜小沟结合剂。例如,参见美国专利第5,801,155号;威玛和德万(Wemmer & Dervan),结构生物学新见(Current Opinon in Structural Biology),7:355-361-(1997);沃克(Walker)等人,生物聚合物(Biopolymers)44:323-334(1997);齐默和华纳特(Zimmer & Wahnert),生物物理学与分子生物学进展(Prog.Biophys.Molec.Bio.),47:31-112(1986);以及雷迪(Reddy)等人,药理与治疗(Pharmacol.Therap.),84:1-111(1999)。通过连接体将MGB(以及其它部分)连接至寡核苷酸的适宜方法阐述于(例如)美国专利第5,512,677号;第5,419,966号;第5,696,251号;第5,585,481号;第5,942,610号和第5,736,626号中,所有这些文献都是以引用方式并入本文中。
在另一实施例中,检测用寡核苷酸包含同位素编码核苷酸。在一实例中,等位基因特异性检测用寡核苷酸包含与SNP等位基因杂交的同位素编码核苷酸。同位素编码检测用寡核苷酸继而产生同位素编码质量可区分产物。在一实施例中,仅生成单一同位素编码核苷酸或包含同位素编码核苷酸的短片段(例如2个、3个或4个碱基)并通过通过质谱法来检测。在仅检测到单一核苷酸时,由于不存在磷酸酯主链并且盐加合物形成降至最低,因此可简化纯化。例如,参见美国专利第6,613,509号(以引用方式并入本文中),其阐述将同位素纳入核酸中。
在另一实施例中,可修饰检测用寡核苷酸以提高其解链温度(Tm)。在一实施例中,引物解链温度经常在58-60℃左右,并且检测用寡核苷酸Tm经常比引物Tm高10℃。两种引物的Tm经常大致相等。
G.检测用寡核苷酸结合特性
在某些实施例中,在结构中一或多个核酸可脱离目标的条件下实施检测用寡核苷酸的降解。在一实施例中,检测用寡核苷酸的完全或部分脱离使得可形成多种质量可区分产物。在某些实施例中,通过提高温度来引发所述脱离,从而使得一或多个寡核苷酸可不再与目标链杂交。在其它实施例中,所述脱离的发生是由于寡核苷酸的解离仅产生在反应条件下不能结合目标链的解离产物。在优选实施例中,在所选择条件中不论是否解离,寡核苷酸皆可连接(即杂交)和脱离目标链。在特别优选的实施例中,所选择条件应使得可被解离的检测用寡核苷酸的拷贝数超过目标核酸链拷贝数的量足以使得在部分解离检测用寡核苷酸脱离时,目标链连接检测用寡核苷酸完整拷贝的可能性大于其连接检测用寡核苷酸解离拷贝的可能性。
H.质量可区分产物检测方法
质量可区分产物是通过具体物理属性或检测性质来区分,包括(但不限于)长度、质量、电荷、或荷质比。在优选实施例中,检测性质是质量。在另一相关实施例中,MDP可通过与物理属性相关的特征来区分,包括(但不限于)质量、在MALDI-TOF质谱法中的飞行时间。在一相关实施例中,来自一或多种检测用寡核苷酸的MDP是自质谱基质中释放并选择性解吸,从而使得非选择性引物和检测用寡核苷酸(即不存在目标核酸)不解吸。对于这些实施例,MDP应比存于反应混合物中的检测用寡核苷酸或其它非MDP更有效地自质谱基质解吸。优选质谱基质包括2,5-二羟基苯甲酸、α-氰基-4-羟基肉桂酸、3-羟基吡啶甲酸(3-HPA)、柠檬酸二铵(DAC)和其组合。在另一实施例中,质谱基质可设计为用于分析蛋白质。蛋白质分析的实例性基质包括(但不限于)DHB和CHCA。
所述方法可另外包括使一或多种检测用寡核苷酸片段(即MDP)与未解离或部分解离检测用寡核苷酸分离的额外步骤。分离可使用捕获配体(例如生物素或其它亲和性配体)和与捕获配体具有特异性结合活性的捕获剂(例如抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素、抗体、受体、与MDP互补的捕获探针、或其功能性片段)来完成。MDP可含有对捕获剂具有特异性结合活性的捕获配体。例如,可使用业内熟知的方法使MDP发生生物素化或与亲和性配体连接。参见下文实例4。也可使用捕获配体和捕获剂来增加MDP剩余部分的质量,从而使得可自质谱仪可检测的MDP质量范围中将其排除。在一实施例中,捕获探针可具有通用扩增解离产物的通用引物。
也可使用分离步骤自MDP移除盐、酶、或其它缓冲组份。可使用诸如色谱、凝胶电泳或沉淀等若干种业内熟知的方法来提纯样品。例如,可使用尺寸排阻色谱或亲和色谱自样品移除盐。分离方法的选择可取决于样品量。例如,在获得少量样品或使用小型化装置时,可使用微量亲和色谱分离步骤。此外,是否需要分离步骤以及分离方法的选择可取决于所用检测方法。例如,基质辅助激光解吸/电离和电喷雾电离的效率可通过自样品移除盐来改良。例如,盐可自基质辅助激光解吸/电离的激光中吸收能量并导致电离效率降低。
质谱法是检测本发明质量可区分产物并且由此鉴定和/或定量目标核酸的优选方法。质量可区分产物可在质谱仪中发生电离并且根据其质荷比在空间或时间上发生分离。然后质谱仪计算与各离子相关的质量。因此,在提及质谱法时,出于简洁目的可使用术语质量来描述质荷比。
质谱法是分离并鉴定分子的灵敏准确技术。通常,质谱仪具有两个主要组件:产生离子的离子源和测量离子质荷比的质量选择性分析仪,质荷比是这些离子质量的量度并且可换算为质量。业内已知若干种电离方法并将其阐述于本文中。质量可区分产物可在自检测用寡核苷酸解离之前、期间或之后荷电。因此,欲通过质谱法测量的质量可区分产物并非总是需要电荷,因为其可通过质谱法程序获得电荷。在质谱法分析中,可使用诸如电荷和检测部分等MDP的可选组份来使MDP的质量增加。
如本文所述,不同质谱方法(例如四极质谱、离子阱质谱、飞行时间质谱、气相色谱质谱和串联式质谱)可使用不同离子源与质量分析仪的组合,此使得可灵活设计定制检测方案。此外,可将质谱仪程序化以自离子源将所有离子依序或同时传递至质谱仪中。此外,可将质谱仪程序化以选择具有特定质量的离子并在封阻其它离子的同时将其传递至质谱仪中。
在质谱仪中精确控制离子移动的能力使得在检测方案中存在更多选择,此在分析(例如)来自多重实验的大量质量可区分产物时是有利的。例如,在具有大量MDP的多重实验中,有利地可自类似报道分子群组中选择个别报道分子,然后单独分析所述报道分子。基于控制质谱仪所检测质量范围的另一优势包括自所分析探针中排除未解离或部分解离的经标签探针,此可降低分析中的背景噪声。
质谱仪可分辨质量差异较小的离子并以高准确度测量离子质量。因此,由于质谱仪可区分甚至密切相关的标签的质量,所以具有类似质量的MDP可一起用于同一实验中。因为所得报道分子标签彼此之间是可区分的,因此使用质谱法达成的高分辨率和质量准确度容许使用众多种经标签探针。在设计多重实验时能够使用众多种经标签探针是一种优势。
使用质谱法来检测质量可区分产物的另一优势基于此类质量分析的高灵敏度。质谱仪通过采用离子源形成的大部分离子和将这些离子通过质量分析仪有效传递至检测器中来达成高灵敏度。由于此高度灵敏度,甚至有限量的样品也可使用质谱法来测量。这在多重实验中可能是有利的,其中每个MDP种类的量都可较小。
质谱方法为业内所熟知(参见柏林盖姆(Burlingame)等人,分析化学,70:647R-716R(1998);肯特(Kinter)和谢尔曼(Sherman),使用质谱的蛋白质测序和鉴定(ProteinSequencing and Identification Using Tandem Mass Spectrometry),韦利跨学科公司(Wiley-Interscience),纽约(New York)(2000))。与质谱法相关的基本方法是生成得自样品的气相离子,并测量其质量。
可使用质谱仪中生成的电磁场来精确控制气相离子的移动。离子在这些电磁场中的移动与离子的m/z成比例,并且此为测量m/z并由此测量样品质量的基础。离子在这些电磁场中的移动使得离子可被围控并集中于其中,因此质谱法具有高灵敏度。在m/z测量期间,以高效率将离子传递至记录这些离子到达的粒子检测器中。通过图上的峰来表示每种m/z下的离子数量,其中x轴是m/z并且y轴是相对丰度。不同质谱仪具有不同分辨率,也就是分辨质量密切相关的离子之间的峰的能力。分辨率定义为R=m/Δm,其中m是离子质量并且Δm是质谱中两峰之间的质量差异。例如,分辨率为1000的质谱仪可分辨m/z为100.0的离子与m/z为100.1的离子。
若干类质谱仪可购得或可以各种配置来制造。一般来说,质谱仪具有以下主要组件:样品入口、离子源、质量分析仪、检测器、真空系统、和仪器控制系统、以及数据系统。一般以样品入口、离子源、与质量分析仪的差异来定义仪器和其能力的类型。例如,入口可为毛细管柱液相色谱源或可为直接探头或平台,例如用于基质辅助激光解吸中者。例如,常用离子源为电喷雾(包括纳米喷雾和微喷雾)或基质辅助激光解吸。实例性质量分析仪包括四极质量过滤器、离子阱质量分析仪和飞行时间式质量分析仪。
离子形成过程是质谱分析的起点。可使用若干种电离方法并且电离方法的选择取决于欲分析的样品。例如,在分析多肽时,需要诸如电喷雾电离(ESI)等相对温和的电离程序。对于ESI,在产生强电场的高电势下使含有样品的溶液流经细针,从而产生可引导至质谱仪中的高度带电微滴细雾。其它电离程序包括(例如)快原子轰击(FAB),其使用高能中性原子束来撞击固体样品,从而引起解吸和电离。基质辅助激光解吸电离(MALDI)是使用激光脉冲撞击已在UV吸收化合物基质中结晶的样品的方法。业内已知其它电离程序包括(例如)等离子体和辉光放电、等离子体解吸电离、共振电离、和二次电离。质量可区分产物可在自经标签探针解离之前、期间或之后发生电离。
电喷雾电离(ESI)具有可用于本文所述本发明中的若干特性。例如,ESI可用于诸如多肽等难于电离或气化的生物分子中。此外,ESI的效率可极高,从而提供高灵敏度测量的基础。此外,ESI自溶液产生带电分子,这对于分析溶液中的质量可区分产物来说是很方便的。相反,诸如MALDI等电离程序需要在电离之前使样品结晶。
由于ESI可直接自溶液产生带电分子,因此其与来自液体色谱系统的样品相容。例如,质谱仪可具有诸如HPLC等液体色谱系统的入口以使流份自色谱管柱流至质谱仪中。此液体色谱系统与质谱仪的联机布置有时称作LC-MS。例如,可使用LC-MS系统在质谱分析之前分离未解离或部分解离MDP与解离MDP。此外,可使用色谱在质谱分析之前自MDP样品移除盐或其它缓冲组份。例如,使用联机或脱机反相HPLC管柱实施的样品除盐可用于提高电离过程的效率并由此改良通过质谱法检测的灵敏性。
可使用各种质量分析仪,其与不同离子源配对。如所属领域技术人员已知以及本文中所述,不同质量分析仪具有不同优势。质谱仪和检测方法的选择取决于具体分析,例如在生成少量离子用于检测时可使用灵敏度较高的质量分析仪。下文阐述若干类型的质量分析仪和质谱方法。
离子迁移质谱法(IM)是向质谱法(MS)添加新维度的气相分离方法。IM基于气相离子的碰撞截面将其分离并且可与飞行时间(TOF)质谱法偶联以产生可用于鉴定和表征蛋白质和肽的强效工具。因此,在质量可区分产物是蛋白质或肽时,IM-MS尤其可用于本发明中。IM-MS由弗毕克(Verbeck)等人更详细地论述于生物分子技术期刊(Journal of Biomolecular Techniques)(第13卷,第2期,56-61)中。
四极质谱法采用四极质量过滤器或分析仪。此类质量分析仪是由四根杆组成,其布置为两组,每组有两个电连接杆。将rf与dc电压的组合施用至每对杆上,此产生可使离子振荡运动的电场,其自质量过滤器的起始端移动至末端。这些电场导致在一对杆中产生高通质量过滤器,并在另一对杆中产生低通过滤器。高通与低通过滤器之间的重叠留下可通过所述两个过滤器并横跨四极杆长度的限定m/z。当所有其它m/z都具有不稳定轨迹并且不留于质量过滤器中时,选择此m/z并且其在四极质量过滤器中保持稳定。通过斜坡改变所施加电场使得所选择递增m/z通过质量过滤器并到达检测器而得到质谱。此外,四极杆也可设置为通过仅施加rf电场含有并传递所有m/z的离子。此使得四极杆可在质谱仪内需要离子传递但不使用质量过滤器的区域中用作透镜或聚焦系统。此可用于下文进一步阐述的串联式质谱法中。
可将四极质量分析仪以及本文所述其它质量分析仪程序化以分析限定m/z或质量范围。质谱仪的这种特性可用于本文所述本发明中。由于可在分析前获知所解离质量可区分产物的质量范围,因此可将质谱仪编程为传递具有预期正确质量范围的离子,同时排除具有较高或较低质量范围的离子。选择质量范围的能力可在分析中减少背景噪声并由此提高信号-噪声比。此外,可使用限定质量范围来排除对任何未解离检测用寡核苷酸的分析,其具有比质量可区分产物高的质量。因此,质谱仪可完成内在分离步骤以及质量可区分产物的检测和鉴定。
离子阱质谱法采用离子阱质量分析仪。在这些质量分析仪中,施加电场以使得首先陷获所有m/z的离子并使其在质量分析仪中振荡。离子通过诸如八极透镜系统等聚焦器件自离子源进入离子阱中。在陷获区域发生离子陷获,之后通过电极将其激发并喷射至检测器中。通过连续施加电压来完成质量分析,所述电压以将m/z递增的离子自阱喷射至检测器中的方式来增大振荡幅度。与四极质谱法相反,除具有所选m/z的离子外,所有离子都保持在质量分析仪电场中。离子阱的一个优势在于,其具有极高灵敏度,但应谨慎限制同时陷获的离子数。可通过改变将离子注入阱中的时间来达成对离子数的控制。离子阱的质量分辨率与四极质量过滤器类似,但离子阱具有较低m/z限制。
飞行时间质谱法采用飞行时间式质量分析仪。对于此m/z分析方法,首先通过在电场中加速给予离子以固定量的动能(通过高电压生成)。在加速后,离子进入无场区域或“漂移”区域,其中其以与其m/z成反比的速率移动。因此,具有低m/z的离子比具有高m/z的离子移动更快。测量离子移动穿过无场区域所需时间并使用其来计算离子的m/z。
在此类质量分析中一个考虑因素在于,所研究离子组是同时引入分析仪中。例如,此类质量分析非常适合用于电离技术,例如以明确限定的短脉冲产生离子的MALDI。另一考虑因素是控制动能量各异的离子产生的速度分布。使用较长飞行管、离子反射器、或较高加速电压可有助于将速度分布效应降至最低。飞行时间式质量分析仪具有高灵敏度和比四极质量分析仪或离子阱质量分析仪宽的m/z范围。由于不需要质量分析仪扫描,因此使用此类质量分析仪也可快速获得数据。
气相色谱质谱法为实时检测目标提供良好解决方案。系统中的气相色谱(GC)部分将化学混合物分离为分析物脉冲(例如MDP),并且质谱仪(MS)对所述分析物实施鉴定和定量。
串联式质谱法可采用上述质量分析仪的组合。串联式质谱仪可使用第一质量分析仪根据离子的m/z对其进行分离以分离出所关注离子以供进一步分析。然后将分离出的所关注离子分裂为片段离子(称为碰撞活化解离或碰撞诱导解离),并通过第二质量分析仪分析片段离子。这些类型的串联式质谱仪系统称作空间串联系统,因为两个质量分析仪通常通过碰撞室在空间上分离。串联式质谱仪系统也包括时间串联系统,其中使用一个质量分析仪,但依序使用所述质量分析仪来分离离子,诱导碎裂,之后实施质量分析。
在空间范畴内串联的质谱仪具有不止一个质量分析仪。例如,串联四极质谱仪系统可具有第一四极质量过滤器,之后是碰撞室,之后是第二四极质量过滤器,并且之后是检测器。另一种布置是在第一质量分析仪中使用四极质量过滤器并且在第二质量分析仪中使用飞行时间式质量分析仪,并以碰撞室分离两个质量分析仪。业内已知其它串联系统,包括反射-飞行时间、串联扇区和扇区-四极质谱法。
在时间范畴内串联的质谱仪具有一个质量分析仪,其在不同时间发挥不同功能。例如,可使用离子阱质谱仪来陷获所有m/z的离子。施用一系列rf扫描功能,其可自阱喷射除所关注m/z离子外的所有m/z的离子。在分离所关注m/z后,施加rf脉冲以造成离子与阱中气体分子的碰撞,从而诱导离子碎裂。然后通过质量分析仪测量碎裂离子的m/z值。离子回旋共振仪器(也称作傅里叶(Fourier)变换质谱仪)是时间串联系统的实例。
可通过控制在实验各阶段所选择的离子来实施若干类型的串联式质谱实验。不同类型的实验采用不同操作模式,有时称作质量分析仪的“扫描”。在称作质谱扫描的第一实例中,第一质量分析仪和碰撞室将用于质量分析的所有离子都传递至第二质量分析仪中。在称作产物离子扫描的第二实例中,在第一质量分析仪中根据质量选择所关注离子并随后在碰撞室中使其碎裂。然后通过扫描第二质量分析仪对所形成离子实施质量分析。在称作前体离子扫描的第三实例中,扫描第一质量分析仪以将经质量分析的离子依序传递至碰撞室中进行碎裂。第二质量分析仪根据质量选择所关注产物离子以供传递至检测器中。因此,检测器信号是可碎裂为共有产物离子的所有前体离子的结果。其它实验模式包括中性脱失扫描,其中在质量扫描中对恒定质量差异加以考虑。当在如同多重实验的单一实验中测量众多种报道分子标签时,可有利地使用这些不同串联式质谱法扫描程序。
在典型应用中,反应期间生成的质量可区分产物的数量是根据循环阈值(Ct)数值来确定的,其代表生成可检测量核酸所需要的循环数。Ct的测定为业内所熟知。简单来说,在PCR期间,随着所形成扩增子的数量增加,信号强度增加至可测量水平并在后续循环中当反应进入非对数期时到达平台期。通过在反应对数期期间相对于循环数绘制信号强度,可推断出获得可测量信号的特定循环,并且在开始PCR之前使用其来计算目标数量。测定Ct的实例性方法阐述于海德(Heid)等人,基因组方法(GenomeMethods),6:986-94,1996中,参照水解探针部分。
在定量中,可选择使用对照,其提供与存在或引入的目标数量有关的信号。容许将相对质量信号转换为绝对数量的对照是通过在质量可区分产物检测之前将已知数量的质量标签或质量标记添加至各样品中来达成。例如,参见丁(Ding)和康托尔,美国国家科学院学报,2003年3月18日;100(6):3059-64,其阐述实施定量基因表达分析的方法,其中对照核苷酸含有人工单一核苷酸多态性以使其有别于所关注基因。可使用不干扰MDP检测的任何质量标签来标准化质量信号。所述标准品优选地具有与样品中任一分子标签不同的分离特性,并且可具有相同或不同质量谱特征。
I.组合物和试剂盒
在另一方面中,本发明包括实施本发明方法的试剂盒,例如包含引物(例如通用引物)和检测用寡核苷酸以检测或测量一或多种目标核酸的试剂盒。所述试剂盒另外包含酶和适宜缓冲剂以实施扩增反应,实施扩增反应解离并释放检测用寡核苷酸或其片段以供检测。在某些实施例中,试剂盒可包括一或多种可产生一或多种质量可区分产物的检测用寡核苷酸、和一或多种与质谱法相关的试剂,后者可为(例如)一或多种质量标准品(例如用作内部标准)、基质辅助激光解吸电离(MALDI)质谱的基质(例如3-羟基吡啶甲酸)、核酸结合树脂(例如C18树脂)、和/或调节核酸的溶液(例如盐溶液)。
实例
下文所提供实例阐释而非限制本发明。
实例1:检测RhD基因的外显子10
实施检测分析以检测恒河猴D基因的外显子10区域。根据具体说明部分实施PCR引物和检测用寡核苷酸的设计。在具体分析中,检测用寡核苷酸携载由6个腺嘌呤组成的非互补5’突出端。由于样品中存在目标序列(RhD的外显子10),因此PCR引物和检测用寡核苷酸可与目标杂交。在扩增期间,检测用寡核苷酸通过自PCR引物上游延伸的DNA聚合酶的5’核酸酶活性发生降解。在降解期间,释放并通过质谱分析明确鉴定包括5’polyA标签的质量可区分产物(MDP)(参见图8)。这些质量信号的检测证实了目标核酸的存在。
引物和检测用寡核苷酸序列:
使用以下引物来扩增恒河猴D(RhD)基因外显子10内的部分序列:
正向PCR引物:5’CCTCTCACTGTTGCCTGCATT 3’
反向PCR引物:5’AGTGCCTGCGCGAACATT 3’
以下检测用寡核苷酸与目标杂交并降解而产生通过质谱法检测的MDP:
检测用寡核苷酸:5’AAAAAAATTGCTGTCTGATCTTTATCCTCCGTTCCCT 3’
PCR混合物:
以终浓度900nM的PCR引物和200nM的检测用寡核苷酸来使用PCR引物。
在96孔ABGene微量滴定板中实施反应。
循环条件:
在95℃下将PCR混合物活化10分钟,然后对其实施40次在95℃下保持15秒并在60℃下保持1分钟的循环。
质谱分析的样品制备:
质谱分析:
使用台式线性MALDI-TOF质谱仪(集成分析仪(Compact Analyzer),)来实施数据采集和分析。在每个波谱中积累至少20次激光照射。通过外显子10特异性检测用寡核苷酸的质量可区分产物(MDP)来鉴定目标核酸(在此处为RhD基因的外显子10)的存在。MALDI-TOF MS波谱例示RhD基因外显子10的检测(参见图8)。当在扩增期间存在目标序列(RhD基因的外显子10)时以及当在扩增期间检测用寡核苷酸可与目标核酸杂交时,仅生成三种MDP。
实例2:RhD基因外显子5的检测
实施检测分析以检测恒河猴D基因的外显子5区域。根据具体说明部分实施PCR引物和检测用寡核苷酸的设计。在具体分析中,检测用寡核苷酸携载由8个腺嘌呤组成的非互补5’突出端。由于样品中存在目标序列(RhD的外显子5),因此PCR引物和检测用寡核苷酸可与目标杂交。在扩增期间,检测用寡核苷酸通过自PCR引物上游延伸的DNA聚合酶的5’核酸酶活性发生降解。在降解期间,释放并通过质谱分析明确鉴定包括5’polyA标签的质量可区分产物(MDP)(参见图9)。这些质量信号的检测证实了目标核酸的存在。
引物和检测用寡核苷酸序列:
使用以下引物来扩增恒河猴D(RhD)基因外显子5内的部分序列:
正向PCR引物:5’CGCCCTCTTCTTGTGGATG 3’
反向PCR引物:5’GAACACGGCATTCTTCCTTTC 3’
以下检测用寡核苷酸与目标杂交并发生降解而产生通过质谱法检测的MDP:
检测用寡核苷酸:5’AAAAAAAATCTGGCCAAGTTTCAACTCTGCTCGCT 3’
PCR混合物:
以终浓度900nM的PCR引物和200nM的检测用寡核苷酸来使用PCR引物。
PCR混合物也含有20ng的基因组DNA(RhD+单个基因)、25μl 2x PCR预混合物(包括缓冲剂和AmpliTaq Gold酶的ABI TaqMan PCR预混合物)和水,终体积为50μl。
在96孔ABGene微量滴定板中实施反应。
循环条件:
在95℃下将PCR混合物活化10分钟,然后对其实施40次在95℃下保持15秒并在60℃下保持1分钟的循环。
质谱分析的样品制备:
质谱分析:
使用台式线性MALDI-TOF质谱仪(集成分析仪,SEQUENOM公)来实施数据采集和分析。在每个波谱中积累至少20次激光照射。通过外显子5特异性检测用寡核苷酸的质量可区分产物(MDP)来鉴定目标核酸(在此处为RhD基因的外显子5)的存在。MALDI-TOF MS波谱例示RhD基因外显子5的检测(参见图9)。当在扩增期间存在目标序列(RhD基因的外显子5)时以及当在扩增期间检测用寡核苷酸可与目标核酸杂交时,仅生成三种MDP。
实例3:10组使用含有LNA和3’延伸封阻剂的经修饰检测用寡核苷酸确定性别的Y
染色体标记
实施检测分析以检测对Y染色体的十个特定区域。使用业内熟知方法将PCR引物和检测用寡核苷酸设计为符合本发明所述标准。例如,将检测用寡核苷酸设计为具有比PCR引物高约10℃的解链温度。此外,将polyA/G尾添加至长度和序列可变的检测用寡核苷酸的5’末端以在MALDI-TOF MS上间隔并分辨在2000-6000Da范围内的解离产物。
在此特定多重分析中,检测用寡核苷酸携载由多个腺嘌呤和/或鸟嘌呤组成的非互补5’突出端。在存在Y染色体的样品中(例如雄性样品),PCR引物和检测用寡核苷酸与目标杂交。在扩增期间,检测用寡核苷酸通过自PCR引物上游延伸的DNA聚合酶的5’核酸酶活性发生降解。在降解期间,十次分析中成功九次,并且释放包括5’-polyA或polyA/G标签的质量可区分产物(MDP)并通过MALDI-TOF质谱分析明确鉴定。这些质量信号的检测证实了目标核酸的存在。
在不存在Y染色体模板的样品中(例如雌性样品或阴性对照(NTC)样品),PCR引物和检测用寡核苷酸不与目标杂交,并且未检测到5’-polyA或polyA/G标签。
引物和检测用寡核苷酸序列:
下文所提供的检测用寡核苷酸与目标杂交并降解而产生通过质谱法检测的MDP。所述各序列可含有代表锁核酸(LNA)的“+” 或分别代表引入磷酸酯基团和倒转脱氧胸腺嘧啶的“/3Phos/”和“/InvdT/”。
锁核酸(LNA)与其互补体极稳定地结合并且具有相对于新生脱氧核苷酸高度降低的解离率。此可用于控制解离点,并由此产生均一解离产物。可通过置放两个彼此相邻的LNA来进一步增强此效应。
引入一或多个磷酸酯基团或倒转脱氧胸腺嘧啶可用于封阻检测用寡核苷酸互补部分的3’末端,此可在循环期间阻止检测用寡核苷酸通过DNA聚合酶延伸。所述不期望延伸可具有若干种可能的负面效应,包括在5’尾解离发生后对目标的竞争性结合和诸如dNTP等PCR反应组份耗尽。
使用以下引物来扩增BPY2基因内的部分序列(BPY2-2分析):
正向PCR引物:5’-ACGTTGGATGATATTCTAGACTCTTCCAAGCC-3’
反向PCR引物:5’-ACGTTGGATGAAAAAGAGGAGTGTCACTCTAC-3’
检测用寡核苷酸(在不同分析中单独测试多种检测用寡核苷酸):
5’-AAAAAAAAAAAAAT+T+TGCAAAGCCCAGCACTGA-3’
其中+代表锁核酸(LNA)
或
5’-AAAAAAAAAAAAAT+T+TGCAAAGCCCAGCACTGA/3Phos/-3’
或
5’-AAAAAAAAAAAAAT+T+TGCAAAGCCCAGCACTGA/3lnvdT/-3’
使用以下引物来扩增CDY1基因内的第二部分序列(CDY1-1分析):
正向PCR引物:5’-ACGTTGGATGATGTTAGCCAGGATTGTCTCG-3’
反向PCR引物:5’-ACGTTGGATGACACCTGTAATCCCAGCATTTT-3’
检测用寡核苷酸:
5’-AAAAAAAAAG+C+TGAGGTGCTTGGATCACGA-3’
或
5’-AAAAAAAAAG+C+TGAGGTGCTTGGATCACGA/3Phos/-3’
或
5’-AAAAAAAAAG+C+TGAGGTGCTTGGATCACGA/3lnvdT/-3’
使用以下引物来扩增CDY1基因内的部分序列(CDY1-2分析):
正向PCR引物:5’-ACGTTGGATGCAATCCCGTGTCTTTCCT-3’
反向PCR引物:5’-ACGTTGGATGGAACCAAATACTGTGTATTCCC-3’
检测用寡核苷酸:
5’-AAAAAAAAA+T+GGCTTCCCAGGAGTTTGAGG-3’
或
5’-AAAAAAAAA+T+GGCTTCCCAGGAGTTTGAGG/3Phos/-3’
或
5’-AAAAAAAAA+T+GGCTTCCCAGGAGTTTGAGG/3lnvdT/-3’
使用以下引物来扩增Y染色体CYORF14区域内的部分序列(CYORF14-3分析):
正向PCR引物:5’-ACGTTGGATGTTTACATCAACAAACAAGGG-3’
反向PCR引物:5’-ACGTTGGATGCTACTGGGTCTAGCCTTATAAT-3’
检测用寡核苷酸:
5’-AAAAGGAAAAAA+G+AGGTTGACATGAAGTCATTTGCT-3’
或
5’-AAAAGGAAAAAA+G+AGGTTGACATGAAGTCATTTGCT/3Phos/-3’
或
5’-AAAAGGAAAAAA+G+AGGTTGACATGAAGTCATTTGCT/3lnvdT//-3’
使用以下引物来扩增PRY基因内的部分序列(PRY-2分析):
正向PCR引物:5’-ACGTTGGATGTCACTGGGATCAGGACAGAC-3’
反向PCR引物:5’-ACGTTGGATGAGAGGAAACTGCTTCCCAAAC-3’
检测用寡核苷酸:
5’-AAAAAAAAAAAAAAA+A+GCTGCCAGCAAGGAGCCT-3’
或
5’-AAAAAAAAAAAAAAA+A+GCTGCCAGCAAGGAGCCT/3Phos/-3’
或
5’-AAAAAAAAAAAAAAA+A+GCTGCCAGCAAGGAGCCT/3lnvdT/-3’
使用以下引物来扩增RBMY1A1基因内的部分序列(RBMY1A1-1分析):
正向PCR引物:5’-ACGTTGGATGGATGGGTTTTCTATGTGTGGG-3’
反向PCR引物:5’-ACGTTGGATGTGAGTCTCTTAATAGCACTGAG-3’
检测用寡核苷酸:
5’-AAAAAAAAAAA+C+GGGAGGAGTCAGTGGGGA-3’
或
5’-AAAAAAAAAAA+C+GGGAGGAGTCAGTGGGGA/3Phos/-3’
或
5’-AAAAAAAAAAA+C+GGGAGGAGTCAGTGGGGA/3lnvdT/-3’
使用以下引物来扩增RBMY1A1基因内的第二部分序列(RBMY1A1-2分析):
正向PCR引物:5’-ACGTTGGATGAGCTAATTACTCATTTCCCCAG-3’
反向PCR引物:5’-ACGTTGGATGAGACTCAACAGGACAAGAGAC-3’
检测用寡核苷酸:
5’-AAAAAAAAAAAAAAAT+G+AGGACTTGTTTTGATTGAACCAA-3’
或
5’-AAAAAAAAAAAAAAAT+G+AGGACTTGTTTTGATTGAACCAA/3Phos/-3’
或
5’-AAAAAAAAAAAAAAAT+G+AGGACTTGTTTTGATTGAACCAA/3lnvdT/-3’
使用以下引物来扩增RBMY2基因内的部分序列(RBMY2-1分析):
正向PCR引物:5’-ACGTTGGATGTGCAGAAAAGACCAAAGGAATC-3’
反向PCR引物:5’-ACGTTGGATGATAGATGCCACATAACTTGAGC-3’
检测用寡核苷酸:
5’-AAAAAAAAAAAA+C+GAGGATCAGGGAGCACCC-3’
或
5’-AAAAAAAAAAAA+C+GAGGATCAGGGAGCACCC/3Phos/-3’
或
5’-AAAAAAAAAAAA+C+GAGGATCAGGGAGCACCC/3lnvdT/-3’
使用以下引物来扩增XKRY基因内的部分序列(XKRY-1分析):
正向PCR引物:5’-ACGTTGGATGAACGTTTTACCGAAGTGTTGT-3’
反向PCR引物:5’-ACGTTGGATGAAGCCAAAGGCTAATATGTAGG-3’
检测用寡核苷酸:
5’-AAAAAAAAAAAAT+G+ATGAACTACACGGCAATTATTGA-3’
或
5’-AAAAAAAAAAAAT+G+ATGAACTACACGGCAATTATTGA/3Phos/-3’
或
5’-AAAAAAAAAAAAT+G+ATGAACTACACGGCAATTATTGA/3lnvdT/-3’
使用以下引物来扩增XKRY基因内的第二部分序列(XKRY-3分析):
正向PCR引物:5’-ACGTTGGATGAGGCAAAATGTACTATGCCTAC-3’
反向PCR引物:5’-ACGTTGGATGTCCTGTAGTCTCAACTATTCAG-3’
检测用寡核苷酸:
5’-AAAGGAAAAAA+T+GCTCACTTGGGCGAAGGAG-3’
或
5’-AAAGGAAAAAA+T+GCTCACTTGGGCGAAGGAG/3Phos/-3’
或
5’-AAAGGAAAAAA+T+GCTCACTTGGGCGAAGGAG/3lnvdT/-3’
PCR混合物:
以终浓度900nM的PCR引物和250nM的检测用寡核苷酸来使用PCR引物。
PCR混合物也含有25ng的基因组DNA(雄性或雌性)、25μl 2x PCR预混合物(包括缓冲剂和AmpliTaq Gold酶的ABI TaqMan PCR预混合物)和水,终体积为50μl。
在96孔ABGene微量滴定板中实施反应。
循环条件:
在95℃下将PCR混合物活化10分钟,然后对其实施55次在95℃下保持30秒、在60℃下保持30秒并在72℃下保持1分钟的循环。
质谱分析的样品制备:
质谱分析:
使用台式线性MALDI-TOF质谱仪(集成分析仪,SEQUENOM公)来实施数据采集和分析。在每个波谱中积累至少20次激光照射。通过每个引物组的特异性检测用寡核苷酸的质量可区分产物(MDP)来成功鉴定目标核酸(此处是存于Y染色体上的十个特定区域中的九个)的存在。MALDI-TOF MS波谱例示10重反应的90%检测率。当在扩增期间存在目标序列(Y染色体特定区域)时以及当在扩增期间检测用寡核苷酸可与目标核酸杂交时,成功生成十种MDP。
实例4:10组使用5’-生物素化检测用寡核苷酸和涂布有抗生蛋白链霉素的纯化用磁珠
确定性别的Y染色体标记
实施检测分析以检测对Y染色体的十个特定区域。分析包括额外提纯步骤,其使用生物素化检测用寡核苷酸和涂布有抗生蛋白链菌素的磁珠来捕获MDP。使用业内熟知方法将PCR引物和检测用寡核苷酸设计为符合本发明中所述标准。例如,将检测用寡核苷酸设计为解链温度比PCR引物高约10℃。
在此特定多重分析中,检测用寡核苷酸携载由多个腺嘌呤和/或鸟嘌呤组成的非互补5’突出端。在存在Y染色体的样品中(例如雄性样品),PCR引物和检测用寡核苷酸与目标杂交。在扩增期间,检测用寡核苷酸通过自PCR引物上游延伸的DNA聚合酶的5’核酸酶活性发生降解。在降解期间,释放十种包括5’-polyA或polyA/G标签的质量可区分产物(MDP)中的九种并通过MALDI-TOF质谱分析明确鉴定。这些质量信号的检测证实在十次分析中有九次存在目标核酸。
在不存在Y染色体模板的样品中(例如雌性样品或阴性对照(NTC)样品),PCR引物和检测用寡核苷酸不与目标杂交,并且未检测到5’-polyA或polyA/G标签。已证实,通过整个过程实施单一反应、并且随后汇集反应物同样可成功地在单一芯片元件上检测所有分析。
下文所提供的检测用寡核苷酸与目标杂交并降解而产生通过质谱法检测的MDP。所述各序列可含有代表锁核酸(LNA)的“ +” 或分别代表引入磷酸酯基团和倒转脱氧胸腺嘧啶的“/3Phos/”和“/InvdT/”。同样,检测用寡核苷酸也可含有代表生物素的“Biosg/”。
使用以下引物来扩增BPY2基因内的部分序列(BPY2-2分析):
正向PCR引物:5’-ACGTTGGATGATATTCTAGACTCTTCCAAGCC-3’
反向PCR引物:5’-ACGTTGGATGAAAAAGAGGAGTGTCACTCTAC-3’
检测用寡核苷酸(在不同分析中单独测试多种检测用寡核苷酸):
5’-5Biosg/AAAAAAAAAAAAAT+T+TGCAAAGCCCAGCACTGA-3’
或
5’-5Biosg/AAAAAAAAAAAAAT+T+TGCAAAGCCCAGCACTGA/3Phos/-3’
或
5’-5Biosg/AAAAAAAAAAAAAT+T+TGCAAAGCCCAGCACTGA/3lnvdT-3’
使用以下引物来扩增CDY1基因内的第二部分序列(CDY1-1分析):
正向PCR引物:5’-ACGTTGGATGATGTTAGCCAGGATTGTCTCG-3’
反向PCR引物:5’-ACGTTGGATGACACCTGTAATCCCAGCATTTT-3’
检测用寡核苷酸:
5’-5Biosg/AAAAAAAAAG+C+TGAGGTGCTTGGATCACGA-3’
或
5’-5Biosg/AAAAAAAAAG+C+TGAGGTGCTTGGATCACGA/3Phos/-3’
或
5’-5Biosg/AAAAAAAAAG+C+TGAGGTGCTTGGATCACGA/3lnvdT/-3’
使用以下引物来扩增CDY1基因内的部分序列(CDY1-2分析):
正向PCR引物:5’-ACGTTGGATGCAATCCCGTGTCTTTCCT-3’
反向PCR引物:5’-ACGTTGGATGGAACCAAATACTGTGTATTCCC-3’
检测用寡核苷酸:
5’-5Biosg/AAAAAAAAA+T+GGCTTCCCAGGAGTTTGAGG-3’
或
5’-5Biosg/AAAAAAAAA+T+GGCTTCCCAGGAGTTTGAGG/3Phos/-3’
或
5’-5Biosg/AAAAAAAAA+T+GGCTTCCCAGGAGTTTGAGG/3lnvdT/-3’
使用以下引物来扩增Y染色体CYORF14区域内的部分序列(CYORF14-3分析):
正向PCR引物:5’-ACGTTGGATGTTTACATCAACAAACAAGGG-3’
反向PCR引物:5’-ACGTTGGATGCTACTGGGTCTAGCCTTATAAT-3’
检测用寡核苷酸:
5’-5Biosg/AAAAGGAAAAAA+G+AGGTTGACATGAAGTCATTTGCT-3’
或
5’-5Biosg/AAAAGGAAAAAA+G+AGGTTGACATGAAGTCATTTGCT/3Phos/-3’
或
5’-5Biosg/AAAAGGAAAAAA+G+AGGTTGACATGAAGTCATTTGCT/3lnvdT/-3,
使用以下引物来扩增PRY基因内的部分序列(PRY-2分析):
正向PCR引物:5’-ACGTTGGATGTCACTGGGATCAGGACAGAC-3’
反向PCR引物:5’-ACGTTGGATGAGAGGAAACTGCTTCCCAAAC-3’
检测用寡核苷酸:
5’-5Biosg/AAAAAAAAAAAAAAA+A+GCTGCCAGCAAGGAGCCT-3’
或
5’-5Biosg/AAAAAAAAAAAAAAA+A+GCTGCCAGCAAGGAGCCT/3Phos/-3’
或
5’-5Biosg/AAAAAAAAAAAAAAA+A+GCTGCCAGCAAGGAGCCT/3lnvdT/-3’
使用以下引物来扩增RBMY1A1基因内的部分序列(RBMY1A1-1分析):
正向PCR引物:5’-ACGTTGGATGGATGGGTTTTCTATGTGTGGG-3’
反向PCR引物:5’-ACGTTGGATGTGAGTCTCTTAATAGCACTGAG-3’
检测用寡核苷酸:
5’-5Biosg/AAAAAAAAAAA+C+GGGAGGAGTCAGTGGGGA-3’
或
5’-5Biosg/AAAAAAAAAAA+C+GGGAGGAGTCAGTGGGGA/3Phos/-3’
或
5’-5Biosg/AAAAAAAAAAA+C+GGGAGGAGTCAGTGGGGA/3lnvdT/-3’
使用以下引物来扩增RBMY1A1基因内的第二部分序列(RBMY1A1-2分析):
正向PCR引物:5’-ACGTTGGATGAGCTAATTACTCATTTCCCCAG-3’
反向PCR引物:5’-ACGTTGGATGAGACTCAACAGGACAAGAGAC-3’
检测用寡核苷酸:
5’-5Biosg/AAAAAAAAAAAAAAAT+G+AGGACTTGTTTTGATTGAACCAA-3’
或
5’-5Biosg/AAAAAAAAAAAAAAAT+G+AGGACTTGTTTTGATTGAACCAA/3Phos/-3’
或
5’-5Biosg/AAAAAAAAAAAAAAAT+G+AGGACTTGTTTTGATTGAACCAA/3lnvdT/-3’
使用以下引物来扩增RBMY2基因内的部分序列(RBMY2-1分析):
正向PCR引物:5’-ACGTTGGATGTGCAGAAAAGACCAAAGGAATC-3’
反向PCR引物:5’-ACGTTGGATGATAGATGCCACATAACTTGAGC-3’
检测用寡核苷酸:
5’-/5Biosg/AAAAAAAAAAAA+C+GAGGATCAGGGAGCACCC-3’
或
5’-/5Biosg/AAAAAAAAAAAA+C+GAGGATCAGGGAGCACCC/3Phos/-3’
或
5’-/5Biosg/AAAAAAAAAAAA+C+GAGGATCAGGGAGCACCC/3lnvdT/-3’
使用以下引物来扩增XKRY基因内的部分序列(XKRY-1分析):
正向PCR引物:5’-ACGTTGGATGAACGTTTTACCGAAGTGTTGT-3’
反向PCR引物:5’-ACGTTGGATGAAGCCAAAGGCTAATATGTAGG-3’
检测用寡核苷酸:
5’-/5Biosg/AAAAAAAAAAAAT+G+ATGAACTACACGGCAATTATTGA-3’
或
5’-/5Biosg/AAAAAAAAAAAAT+G+ATGAACTACACGGCAATTATTGA/3Phos/-3’
或
5’-/5Biosg/AAAAAAAAAAAAT+G+ATGAACTACACGGCAATTATTGA/3lnvdT/-3’
使用以下引物来扩增XKRY基因内的第二部分序列(XKRY-3分析):
正向PCR引物:5’-ACGTTGGATGAGGCAAAATGTACTATGCCTAC-3’
反向PCR引物:5’-ACGTTGGATGTCCTGTAGTCTCAACTATTCAG-3’
检测用寡核苷酸:
5’-/5Biosg/AAAGGAAAAAA+T+GCTCACTTGGGCGAAGGAG-3’
或
5’-/5Biosg/AAAGGAAAAAA+T+GCTCACTTGGGCGAAGGAG/3Phos/-3’
或
5’-/5Biosg/AAAGGAAAAAA+T+GCTCACTTGGGCGAAGGAG/3lnvdT/-3’
PCR混合物:
以终浓度900nM的PCR引物和250nM的检测用寡核苷酸来使用PCR引物。
PCR混合物也含有25ng的基因组DNA(雄性或雌性)、25μl 2x PCR预混合物(包括缓冲剂和AmpliTaq Gold酶的ABI TaqMan PCR预混合物)和水,终体积为50μl。
在96孔ABGene微量滴定板中实施反应。
循环条件:
在95℃下将PCR混合物活化10分钟,然后对其实施55次在95℃下保持30秒、在60℃下保持30秒并在72℃下保持1分钟的循环。
磁珠制备:
1.混合磁珠与50μl等分试样-离心并移除上清液
2.添加75μl洗涤缓冲液(已提供)-离心并移除上清液
磁珠结合:
3.向磁珠添加25μl结合缓冲液(已提供)
4.向含有磁珠的管中添加35μl超纯水
5.向含有磁珠的管中添加15μl PCR/核酸酶反应物
6.在环境温度下旋转15分钟
磁珠洗涤:
7.旋转并移除上清液直至干燥
8.用1x洗涤缓冲液(已提供)洗涤
9.旋转并移除上清液
自磁珠洗脱产物:
10.向磁珠添加25μl 25%NH4OH(新制备)
11.在60℃下培养10分钟
12.旋转并将上清液移出至新管中(含有产物)
13.在环境温度下开盖振荡60分钟
质谱分析:
使用台式线性MALDI-TOF质谱仪(集成分析仪,SEQUENOM公)来实施数据采集和分析。在每个波谱中积累至少20次激光照射。通过每个引物组的特异性检测用寡核苷酸的质量可区分产物(MDP)来鉴定目标核酸(此处是存于Y染色体上的十个特定区域中的九个)的存在。MALDI-TOF MS波谱例示10重反应的90%检测率。当在扩增期间存在目标序列(Y染色体特定区域)时以及当在扩增期间检测用寡核苷酸可与目标核酸杂交时,仅生成九种MDP。实施单重扩增,之后汇集5μl的各反应物,获得类似结果。
* * *
每个专利、专利申请案、公开案和本文所引用文献都是全文以引用方式并入本文中。引用上述专利、专利申请案、公开案和文献并不代表认可上述任一文献都是相关的先前技术,也不代表对这些出版物或文献中的内容或日期的认可。
可在不背离本发明基本方面的情况下对上文加以修改。尽管已经参照一或多个具体实施例十分详细地阐述了本发明,但所属领域技术人员应了解,可对本申请案中具体揭示的实施例进行改变,而且这些修改和改良都在本发明范围和精神内。
可在不存在本文未具体揭示的任何要素的情况下以适宜方式实践本文说明性阐述的本发明。因此,例如,在本文中每一情形中,词语“包含”、“基本上由...组成”和“由...组成”中的任一者都可用其它两个词语中的任一个来替代。所用词语和表达是用作说明性词语而非限制性,并且使用所述词语和表达并不排除所示和所述性质或其部分的任何等效形式,并且可在本发明所主张范围内作出各种修改。除非上下文中明确阐述一种要素或不止一种要素,否则词语“一”是指其所修饰的一种或多种要素(例如“一种引物”可意指一或多种引物)。本文所用词语“约”是指数值有时在基础参数上下10%范围内(即加或减10%),数值有时在基础参数上下5%范围内(即加或减5%),数值有时在基础参数上下2.5%范围内(即加或减2.5%),或数值有时在基础参数上下1%范围内(即加或减1%),并且有时是指无变化的参数。例如,“约100个核苷酸”的长度可包括介于90个核苷酸与110个核苷酸之间的各个长度。因此应了解,尽管已通过代表性实施例和可选性质具体揭示本发明,但所属领域技术人员仍可采用本文所揭示概念的修改和变化形式,并且所述修改和变化形式视为在本发明范围内。
本发明实施例阐述于上文权利要求中。
Claims (36)
1、一种检测样品中目标核酸序列的方法,其包含以下步骤:
(a)使包含目标核酸的样品与以下物质接触:(i)寡核苷酸引物,其包含3’末端和5’末端并且含有与所述目标核酸中的一个区域互补的序列,和(ii)检测用寡核苷酸,其包含3’末端和5’末端并且含有与所述目标核酸序列第二区域互补的序列,由此在杂交条件下形成(iii)双螺旋混合物,其中所述双螺旋包含与所述寡核苷酸引物和所述检测用寡核苷酸发生复性的所述目标核酸,从而使得所述寡核苷酸引物的3’末端位于所述检测用寡核苷酸5’末端的上游;
(b)在足以解离并释放所述复性检测用寡核苷酸或其至少一个片段的条件下使步骤(a)的所述样品暴露于解离剂中,由此产生一或多种质量可区分产物;和
(c)通过质谱法检测所述一或多种质量可区分产物,由此检测在所述样品中是否存在所述目标核酸序列。
2、一种检测样品中目标核酸序列的扩增方法,其包含以下步骤:
(a)向含有所述样品的扩增反应物中提供一组寡核苷酸引物,其中第一引物含有与所述目标核酸序列一条链中的一个区域互补的序列,并且第二引物含有与所述目标核酸序列第二链中的一个区域互补的序列;
(b)提供至少一种检测用寡核苷酸,其含有与所述目标核酸中的一个区域互补的序列,其中所述检测用寡核苷酸在结合有步骤(a)的所述寡核苷酸引物的所述目标核酸序列内发生复性,由此产生复性双螺旋,且此外其中所选择每一寡核苷酸引物都与其互补模板发生复性,所述模板位于与所述相同核酸链发生复性的任一检测用寡核苷酸上游;
(c)在以下扩增循环步骤容许的条件下采用具有5’-3’核酸酶活性的酶作为模板依赖性聚合试剂来扩增所述目标核酸序列:(i)使寡核苷酸引物和检测用寡核苷酸与所述目标序列内所含模板核酸序列发生复性,和(ii)延伸所述引物寡核苷酸,其中所述核酸扩增酶合成引物延伸产物,而且所述核酸扩增酶的所述5’-3’核酸酶活性同时自所述包含检测用寡核苷酸和其互补模板核酸序列的复性双螺旋释放质量可区分产物,由此产生一或多种质量可区分产物;和
(d)通过质谱法检测所述一或多种质量可区分产物,由此确定在所述样品中是否存在所述目标序列。
3、一种检测目标核酸的方法,其包含以下步骤:
(a)使寡核苷酸引物与所述目标核酸发生复性,使检测用寡核苷酸与所述相同目标核酸发生复性;
(b)引入酶以沿所述检测用寡核苷酸方向延伸所述寡核苷酸引物,其中所述酶解离并由此释放至少一部分所述检测用寡核苷酸,由此产生一或多种质量可区分产物;和
(c)通过质谱法检测所述一或多种质量可区分产物。
4、如权利要求1或3所述的方法,其中步骤a)和b)是在单一密闭反应容器中同时实施。
5、如权利要求2所述的方法,其中步骤a)、b)和c)是在单一密闭反应容器中同时实施。
6、如权利要求2或3所述的方法,其中所述检测用寡核苷酸不能通过酶来延伸。
7、如权利要求1、2或3所述的方法,其中在单一多重反应中检测两种或更多种目标核酸。
8、如权利要求1、2或3所述的方法,其中在多重反应中使用不止一种检测用寡核苷酸来检测不止一种目标核酸。
9、如权利要求1、2或3所述的方法,其中所述目标核酸包含核酸混合物。
10、如权利要求9所述的方法,其中所述核酸混合物包含母源核酸和胎儿核酸,此外其中所述核酸混合物得自怀孕雌性样品。
11、如权利要求3所述的方法,其中引入结合所述第一寡核苷酸的合成产物的第二寡核苷酸,随后可藉此进行指数扩增。
12、如权利要求11所述的方法,其中所述目标核酸初始时为单链核酸分子。
13、如权利要求1所述的方法,其中所述解离剂具有5’-3’核酸酶活性。
14、如权利要求3所述的方法,其中所述酶具有5’-3’核酸酶活性。
15、如权利要求3所述的方法,其中所述酶具有能扩增目标核酸的聚合酶活性。
16、如权利要求1、2或3所述的方法,其中通过质谱法检测到不止一种来自所述相同检测用寡核苷酸的质量可区分产物,且此外其中所述不止一种质量可区分产物产生对应于目标核酸的质量特异性检测谱特征。
17、如权利要求1、2或3所述的方法,其中所述检测用寡核苷酸包含与所述目标核酸不互补的核苷酸序列。
18、如权利要求1、2或3所述的方法,其中所述检测用寡核苷酸包含一或多种核苷修饰。
19、如权利要求18所述的方法,其中所述核苷修饰是纳入一或多个锁核酸(LNA)。
20、如权利要求1、2或3所述的方法,其中所述检测用寡核苷酸包含检测部分。
21、如权利要求20所述的方法,其中所述检测部分选自由以下组成的群组:糖、蛋白质、抗体、化合物、质量标签、荧光标签、电荷标签和疏水标签。
22、如权利要求1、2或3所述的方法,其中所述一或多种质量可区分产物能在释放后结合固体载体。
23、如权利要求1、2或3所述的方法,其中所述一或多种质量可区分产物在其释放后进行扩增。
24、如权利要求1、2或3所述的方法,其中所述检测用寡核苷酸根据所述目标核酸的甲基化状态选择性地结合甲基化特异性序列。
25、如权利要求1、2或3所述的方法,其中所述检测是通过选自由以下组成的群组的质谱仪来实施:MALDI-TOF MS、串联MS、ESI-TOF、ESI-离子阱、LC-MS、GC-MS和LOI-MS。
26、如权利要求1、2或3所述的方法,其中所述检测是以实时方式进行。
27、如权利要求1、2或3所述的方法,其中引入竞争模板核酸,且此外其中所述竞争模板核酸用作内部对照。
28、如权利要求1、2或3所述的方法,其中测定所述样品中所述目标核酸的量。
29、如权利要求1、2或3所述的方法,其中所述检测用寡核苷酸包含小沟结合部分。
30、一种检测目标生物分子的方法,其包含以下步骤:
(a)将可检测探针引入含有目标生物分子的样品中,其中所述可检测探针结合或接触目标生物分子,此外其中所述可检测探针包含用作模板核酸的寡核苷酸;
(b)使寡核苷酸引物与所述模板核酸发生复性,使检测用寡核苷酸与所述相同模板核酸发生复性;
(c)引入酶以沿所述检测用寡核苷酸的方向延伸所述寡核苷酸引物,其中所述酶解离并由此释放至少一部分所述检测用寡核苷酸,由此产生一或多种质量可区分产物;和
(d)通过质谱法检测所述一或多种质量可区分产物。
31、如权利要求30所述的方法,其中在步骤(a)中引入不止一种可检测探针。
32、如权利要求30所述的方法,其中所述可检测探针特异性地结合所述目标生物分子。
33、如权利要求31所述的方法,其中所述不止一种可检测探针包含寡核苷酸,当所述可检测探针接触所述目标生物分子时所述寡核苷酸可发生连接以形成模板核酸。
34、一种检测目标核酸序列的方法,其包含通过质谱法分析含有质量可区分产物的核酸样品,其中所述质量可区分产物得自(a)使寡核苷酸引物与目标核酸发生复性;(b)使检测用寡核苷酸与所述相同目标核酸发生复性;和(c)使所述目标核酸接触沿所述检测用寡核苷酸方向延伸所述寡核苷酸引物的酶,其中:
所述检测用寡核苷酸或其部分与所述目标核酸序列互补,并且
所述酶解离并由此释放至少一部分所述检测用寡核苷酸,由此产生一或多种质量可区分产物;
由此通过以质谱法鉴定所述质量可区分产物来检测所述目标核酸序列。
35、一种检测目标核酸序列的方法,其包含通过质谱法分析含有质量可区分产物的核酸样品,其中所述质量可区分产物得自(a)在含有用作模板核酸的寡核苷酸的可检测探针可特异性结合目标生物分子的条件下使所述目标生物分子接触所述可检测探针;(b)使寡核苷酸引物与所述模板核酸发生复性;(c)使检测用寡核苷酸与所述相同模板核酸发生复性;和(d)使所述模板核酸接触沿所述检测用寡核苷酸方向延伸所述寡核苷酸引物的酶,其中:
所述检测用寡核苷酸或其部分与所述目标核酸序列互补,并且
所述酶解离并由此释放至少一部分所述检测用寡核苷酸,由此产生一或多种质量可区分产物;
由此通过以质谱法鉴定所述质量可区分产物来检测所述目标核酸序列。
36、如权利要求34或35所述的方法,其中引入结合所述第一寡核苷酸的合成产物的第二寡核苷酸,随后可藉此进行指数扩增。
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