KR20220140492A - 단순화된 폴리뉴클레오티드 서열 검출 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명에서는 개선된 폴리뉴클레오티드 검출 방법이 제공된다.
Description
본 발명은 암, 감염성 질환 및 이식 장기 거부의 식별에 사용되는 것을 포함하는, 다수의 진단 마커의 존재를 테스트하기에 적합한 단순화된 폴리뉴클레오티드 서열 검출 방법에 관한 것이다. 마커의 패널을 신뢰할 수 있고, 저렴한 비용으로 식별해야 하는 동반 진단 테스트에도 또한 유용하다.
폴리머라제 연쇄 반응(PCR)은 실험실 샘플 및 진단 샘플에 존재하는 DNA 또는 RNA를 신뢰성 있게 검출 및/또는 정량화할 수 있는 지점까지 증폭하기 위한 잘 알려져 있고 강력한 기술이다. 그러나, 이러한 분자들을 낮은 수준으로 포함하는 분석물 샘플을 조사할 목적으로 적용할 경우, 여러 가지의 제한을 격게 된다. 첫째, 이 기술은 단일 표적 분자만큼 작은 것을 검출할 수 있지만, 샘플에 존재하는 다른 핵산 서열의 원치 않는 증폭으로 인해 위양성 결과를 생성하는 경향이 있다. 이것은 반응 키를 시작하는 데 사용되는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 선택하게 하는데; 이는 결국 특이성 상대적 복합체의 요구되는 수준을 갖도록 프라이머를 디자인하게 만든다. 그 결과, 오늘날 시장에서 입수 가능한 많은 PCR-기반 테스트는 특이성이 제한적이다.
두 번째 단점은 PCR-기반 방법의 다중화가 실제로는 최대 10개의 표적 서열(대개 10개를 넘지 않음)로 제한되며 프라이머-프라이머 상호 작용을 피하여 상대적으로 좁은 작동 창을 필요로 하게 한다는 것이다.
다른 문제는 PCR 반응이 기하 급수적으로 순환하기 때문에, 표적의 정량화가 어렵고; 반응 효율의 작은 변화는 생성되는 검출 가능한 물질의 양에 큰 영향을 미친다. 적절한 제어 및 교정이 있더라도 정량화는 전형적으로 약 3배 이내의 정확도로 제한된다.
마지막으로, PCR 증폭 방법에 의한 조사 대상 영역에서의 돌연변이는 원치 않는 부작용을 일으킬 수 있다. 예를 들어, 표적 유기체가 시험 프라이머에 의해 표적화된 유전자 영역에서 돌연변이를 일으켜 많은 수의 위음성이 발생하기 때문에 FDA-승인 테스트를 철회해야 하는 경우가 있었다. 반대로, 특이적 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)이 증폭을 위해 표적화되는 경우, PCR 방법은 야생형 변이체가 존재할 때 종종 위양성을 제공할 것이다. 이를 방지하려면, 매우 신중한 프라이머 디자인이 필요하며, 멀티플렉싱의 효율성을 더욱 제한한다. 이것은 암 검사/검진 또는 동반 진단의 일반적인 요구 사항인 SNPs 패널을 검색할 때 특히 관련이 있다.
US2006/110765 A1(Wang et al)은 전형적으로 비효율적이고 특이성이 높은 반응이 아닌 미스매치에서의 효소적 절단을 교시한다. 더욱이, 샘플 중의 유사한 서열에 대한 Wang et al.,에 개시된 바와 같은 프로브의 오프 타겟 혼성화는 미스매치에서의 절단의 사용으로 인해 위양성 결과를 초래할 것이다. 또한, 동일하거나 거의 인접한 위치에 있는 두 개의 서로 다른 유전적 변이체 사이를 구별하는 것은 불가능한데, 이는 모두 동일한 프로브의 절단 및 증폭을 초래하기 때문이다. 따라서, Wang et al.,의 가르침은 반응 도식의 낮은 감도와 특이성을 초래할 것이다. 이에 반해, 본 발명에서 개시하는 방법의 기술적 효과는 미스매치에 의해 효과적으로 차단될 수 있는, dsDNA에 대한 높은 특이성을 갖는, 빠르고 효율적인 방법을 제공한다. 또한, 본 발명의 방법은 표적화된 유전자 변이체에 극도로 특이적이어서 동일하거나 거의 인접한 위치에 있는 상이한 변이체 사이를 식별할 수 있다.
US2009/239283 A1(Liu et al)은 3' 블로킹 변형을 제거할 수 있는 맞춤형 폴리머라제의 유전 공학을 필요로 하는 피로인산첨가분해에 의해 제거되는 연장 불가능한 3' 단부들의 사용을 교시한다. 이에 반해, 본 발명은 기존의 폴리머라제에 고유한 천연 피로인산첨가분해 활성을 이용하며, 3' 블로킹 변형을 사용하지 않는다. 리우 등(Liu et al)에 개시된 방법은 또한 프로브의 일부로부터 말단 염기만을 제거하여 후속 증폭을 가능하게 하는 것에 의존하며, 3' 블로킹 변형의 사용에 의해 이 구체예로 제한된다. 대조적으로, 본 발명에 개시된 방법은 반응을 개시하기 위해 프로브로부터 다수의 염기의 점진적인 제거가 요구되는 구체예를 가능하게 하고, 말단 염기의 원치 않는 제거를 초래할 수 있는 배경 DNA 또는 다른 프로브에 대한 일시적인 오프-타겟 어닐링에 대해 실질적으로 더 견고해지게 한다.
발명의 요약
본 발명자들은 이제 이러한 많은 제한 사항을 극복하기 위해 이전의 특허(PCT/GB2019/052017)에 사용된 피로인산첨가분해 방법을 사용한 경험을 바탕으로 새로운 단순화된 방법을 밝혀내었다. 그렇게 함으로써, 단일-가닥으로 된 올리고뉴클레오티드 기질 또는 차단기 또는 뉴클레오티드 미스매치를 포함하는 이중-가닥으로 된 기질로는 효율적으로 진행되지 않을 반응인 피로인산첨가분해의 이중-가닥 특이성을 이용한다. 새로운 방법은 PCT/GB2019/052017에 개시된 방법보다 더 빠르고 덜 복잡하며 실행 비용이 저렴하다. 따라서, 본 발명에 따르면, 주어진 핵산 분석물에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 검출하는 방법이 제공되며, 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다:
(a) 다음을 포함하는 제 1 반응 혼합물에 하나 또는 그 이상의 핵산 분석물을 도입하는 단계:
i. 단일-가닥으로 된 프로브 올리고뉴클레오티드 A0;
ii. 피로인산첨가분해 효소; 및
iii. 리가제;
여기서, A0는 3' 단부로부터 3'-5' 방향으로 피로인산첨가분해되어 적어도 부분적으로 분해된 가닥 A1을 생성하고, A1은 결찰을 거쳐 A2를 형성함.
(b) A2 또는 그의 일부, 또는 A2의 다수의 복사체 또는 그의 일부의 다수의 복사체인 이전 단계의 산물로부터 유래된 신호를 검출하고, 그로부터 상기 분석물 중에서 폴리뉴클레오티드 표적 서열의 존재 또는 부재를 유추하는 단계.
본 발명의 방법이 적용될 수 있는 분석물은 원하는 표적 폴리뉴클레오티드 서열(들)을 포함하는 자연 발생 또는 합성 DNA 또는 RNA 분자와 같은 핵산이다. 한 구체예에서, 상기 분석물은 전형적으로 그를 함유하는 수용액 및 다른 생물학적 물질에 존재할 것이고, 한 구체예에서 상기 분석물은 시험 목적에 관심 대상이 아닌 다른 배경 핵산 분자와 함께 존재할 것이다. 일부 구체예에서, 상기 분석물은 이들 다른 핵산 성분에 비해 적은 양으로 존재할 것이다. 바람직하게는, 예를 들면, 상기 분석물이 세포 물질을 포함하는 생물학적 표본으로부터 파생되는 경우, 당해 방법의 단계 (a)를 수행하기 전, 이러한 다른 핵산 및 외부 생물학적 물질의 일부 또는 전부는 샘플-준비 기술, 예를 들면, 여과, 원심 분리, 크로마토그래피 또는 전기영동을 사용하여 제거될 것이다. 적합하게는, 상기 분석물은 혈액, 혈장, 가래, 소변, 피부 또는 생검과 같은 포유동물 대상체(특히, 인간 환자)로부터 채취된 생물학적 샘플로부터 유래한다. 한 구체예에서, 상기 생물학적 샘플은 존재하는 임의의 세포를 파괴하여 당해 분석물이 방출되도록, 용해될 것이다. 다른 구체예에서, 상기 분석물은 샘플 자체 내에 이미 자유 형태로 존재할 수 있는데; 예를 들어 혈액이나 혈장에서 순환하는 무-세포 DNA로 존재할 수 있다.
도 1: 단순화된 폴리뉴클레오티드 서열 검출 방법에 대한 프로토콜.
도 2: 사전 증폭 단계 중에 5'-3' 엑소뉴클레아제 분해 단계가 발생할 때와, (프로토콜 3-5에서와 같이) 프로토콜의 피로인산첨가분해/결찰 단계로 이동할 때, 검출되는 형광 수준(특정 표적 분석물 서열의 존재를 나타냄)을 비교한 그래프. 이 예에서는 5'-3' 엑소뉴클레아제는 람다이다.
도 3: 본 발명자들은 일련의 상이한 PPL 효소를 사용하여 본 발명의 프로토콜 3의 방법을 테스트했다. 도 3(A)는 Mako(Mako), Klenow(Klenow) 및 Bsu를 사용하는 1% MAF T790M의 검출을 나타낸다. 도 3(B)는 다양한 Ppi 농도 범위에서 Bst LF를 사용하는 0.5% MAF T790M의 검출을 나타낸다. 4가지 효소 모두 연장된 최적화 없이도 매우 잘 수행되었다.
도 4: 4가지 상이한 피로인산첨가분해(PPL) 효소: Mako, Klenow, Bsu 및 Bst LF를 사용하여 본 발명의 프로토콜 4의 방법을 사용하여 1% MAF, T790M을 검출한 결과.
도 5: 프로토콜 1 및 프로토콜 4에 따른 방법을 사용하여 0.5%, 0.10% 및 0.05% MAF 엑손19 del_6223의 존재 하에 검출된 형광 수준(특정 표적 분석물 서열의 존재를 나타냄)을 보여주는 그래프.
도 6: 본 발명자들은 프로토콜 4에 따라 0.10%, 0.50% 및 1% MAF에서 EGFR 엑손 20 T790M을 검출했다.
도 7: RCA 단계에서 엑소뉴클레아제를 사용하거나 사용하지 않고 1% MAF에서 EGFR 엑손 20 돌연변이 T790M의 검출.
도 8: 본 발명자들은 PPL:RCA 믹스비가 0.5% MAF EGFR 엑손 20 T790M에 대해 검출된 신호의 강도에 미치는 영향을 조사했으며, 그 결과를 도 8에 나타낸다. 도시된 바와 같이, 1:2 PPL:RCA 믹스의 비는 신호 강도가 가장 낮지만 가장 빠른 시점에 나타난다. 이것에 이어서, 신호 강도가 더 큰 1:4 PPL:RCA 믹스가 시간적으로 가깝게 이어진다. 가장 큰 신호 강도는 반응의 가장 늦은 시점에서 1:8 PPL:RCA 믹스에 대해 나타난다.
도 9: SybrGreenI(50℃ 및 60℃) 및 Syto82(50℃ 및 60℃)를 사용하여 프로토콜 4에 따라 수행한 비교 실험의 결과를 나타낸다.
도 10: 본 발명자들은 프로토콜 4에 따라 RCA에 대해 두 가지 다른 효소인 BST L.F 및 BST 2.0 WS의 사용을 조사했다.
도 11: 본 발명자들은 상이한 PPL:RCA 반응 혼합물 비에서 RCA 반응에 대한 상이한 PPL 효소의 영향을 조사했다. 그 결과는 도 11(A) 1:4 PPL:RCA 및 도 11(B) 1:8 PPL:RCA에서 확인할 수 있다. BST L.F 이외의 모든 PPL 효소는 1:4 PPL:RCA 비에서 RCA 반응에 영향을 미친다. 1:8 PPL:RCA 비에서는 BST L.F 및 Klenow를 제외한 모든 효소가 RCA 반응에 영향을 미친다.
도 12: 올리고뉴클레오티드 3 및 4가 모두 존재할 때 형광 신호가 반응에서 더 빨리 나타나고, 올리고뉴클레오티드 3의 피로인산첨가분해 및 결찰이 제 1 반응 혼합물에서 발생했음을 보여주는 실시예 11에 대한 형광 측정 결과.
도 13: 동일한 반응에 있어서 1% 대립유전자 분획에서의 T790M 및 C797S_2389 돌연변이의 검출.
도 14: 0.5% 대립유전자 분획에서 하나의 웰에서 동시에 3개의 돌연변이: G719X_6239, G719X_6252, G719X_6253의 검출.
도 15: 분석물 표적 서열에 대해 A1을 원형화하여 A2를 형성하는 것의 개략도. A0는 A0의 3' 단부로부터 3'-5' 방향으로 표적에 대해 점진적으로 분해되어, 부분적으로 분해된 가닥 A1을 형성하며, 이는 단계 (A) 및 (B)로 도시되어 있다. 이 점진적인 분해에 의해 A0/A1의 5' 단부에 상보적인 표적 영역이 드러나고, 이어서 A1의 5' 단부가 이 영역에 혼성화되며, 이는 단계 (C)에 도시되어 있다. 이어서, 단계(D)에서, A1이 함께 결찰되어 원형화된 A2가 형성된다.
도 16: A1을 형성하기 위한 A0의 피로인산첨가분해가 일어난 후 표적 서열에 대해 A1을 원형화하여 A2를 형성하는 구체예의 결과를 보여주는 실시예 14에 대한 형광 측정 결과.
도 17: 단일-가닥으로 된 프로브 올리고뉴클레오티드 A0는 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 어닐링되어 적어도 부분적으로 이중-가닥으로 된 제 1 중간 산물을 생성하고, 여기서 A0의 3' 단부가 표적 폴리뉴클레오티드 서열과 함께 이중-가닥으로 된 복합체를 형성한다. 본 발명의 이 단순화된 구체예에서는, 어떻게 표적에 어닐링되지 않은 A0가 본 방법의 추가 단계에 참여하지 않는지를 설명하기 위해 2개의 A0 분자와 1개의 표적 폴리뉴클레오티드 서열이 존재한다. 이 예시적인 예에 있어서, A0의 3' 단부는 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 어닐링되지만 A0의 5' 단부는 그렇지 않다. A0의 5' 단부는 5' 화학적 차단기, 공통 프라이밍 서열 및 바코드 영역을 포함한다.
부분적으로 이중-가닥으로 된 제 1 중간 산물은 A0의 3' 단부로부터 3'-5' 방향으로 피로인산첨가분해 효소의 존재 하에 피로인산첨가분해를 거쳐 부분적으로 분해된 가닥 A1, 분석물, 및 표적에 어닐링되지 않은 미분해 A0 분자를 생성한다.
도 18: A1은 단일-가닥으로 된 트리거 올리고뉴클레오티드 B에 어닐링되고, A1 가닥은 B에 대해 5'-3' 방향으로 연장되어 올리고뉴클레오티드 A2를 생성한다. 이 예시적인 예에서, 트리거 올리고뉴클레오티드 B는 5' 화학적 블록을 가진다. 임의의 분해되지 않은 A0는 트리거 올리고뉴클레오티드 B에 어닐링되지만, B에 대해 5'-3' 방향으로 연장되어 본 방법의 나중 부분에 대한 표적이 되는 서열을 생성할 수는 없다. 이 예에서, A2는 적어도 하나의 단일-가닥으로 된 프라이머 올리고뉴클레오티드로 프라이밍되고, A2 또는 소정 영역의 A2의 다수의 복사체가 생성된다.
도 19: A1은 스플린트 올리고뉴클레오티드 D에 어닐링된 다음, 그의 3' 및 5' 단부들의 결찰에 의해 원형화된다. 이제 원형화된 A2는 적어도 하나의 단일-가닥으로 된 프라이머 올리고뉴클레오티드로 프라이밍되고 A2 또는 소정 영역의 A2의 다수의 복사체가 생성된다. 이 예시적인 예에서, 스플린트 올리고뉴클레오티드 D는 3'-변형(이 예시에서 화학적)으로 인하여 또는 D의 3' 단부와 A2의 상응하는 영역 사이의 뉴클레오티드 미스매치로 인해 A1에 대해 연장될 수 없다.
도 20: 스플린트 올리고뉴클레오티드 D의 3' 영역은 A1의 3' 영역에 어닐링되는 반면, 스플린트 올리고뉴클레오티드 D의 5' 영역은 결찰 프로브 C의 5' 영역에 어닐링된다. 따라서, 제 2 중간 산물 A2는 A1, C 및 임의로는 C의 5' 단부를 만나기 위해 5'-3' 방향으로 A1을 연장시킴으로써 형성된 중간 영역으로 구성된다. 이 예시적인 예에서, 결찰 프로브 C는 3' 화학적 차단기를 가져서, 3'-5' 엑소뉴클레아제가 임의의 결찰되지 않은 A1의 분해에 사용될 수 있다.
A2는 적어도 하나의 단일-가닥으로 된 프라이머 올리고뉴클레오티드로 프라이밍되고 A2 또는 소정 영역의 A2의 다수의 복사체가 생성된다.
도 2: 사전 증폭 단계 중에 5'-3' 엑소뉴클레아제 분해 단계가 발생할 때와, (프로토콜 3-5에서와 같이) 프로토콜의 피로인산첨가분해/결찰 단계로 이동할 때, 검출되는 형광 수준(특정 표적 분석물 서열의 존재를 나타냄)을 비교한 그래프. 이 예에서는 5'-3' 엑소뉴클레아제는 람다이다.
도 3: 본 발명자들은 일련의 상이한 PPL 효소를 사용하여 본 발명의 프로토콜 3의 방법을 테스트했다. 도 3(A)는 Mako(Mako), Klenow(Klenow) 및 Bsu를 사용하는 1% MAF T790M의 검출을 나타낸다. 도 3(B)는 다양한 Ppi 농도 범위에서 Bst LF를 사용하는 0.5% MAF T790M의 검출을 나타낸다. 4가지 효소 모두 연장된 최적화 없이도 매우 잘 수행되었다.
도 4: 4가지 상이한 피로인산첨가분해(PPL) 효소: Mako, Klenow, Bsu 및 Bst LF를 사용하여 본 발명의 프로토콜 4의 방법을 사용하여 1% MAF, T790M을 검출한 결과.
도 5: 프로토콜 1 및 프로토콜 4에 따른 방법을 사용하여 0.5%, 0.10% 및 0.05% MAF 엑손19 del_6223의 존재 하에 검출된 형광 수준(특정 표적 분석물 서열의 존재를 나타냄)을 보여주는 그래프.
도 6: 본 발명자들은 프로토콜 4에 따라 0.10%, 0.50% 및 1% MAF에서 EGFR 엑손 20 T790M을 검출했다.
도 7: RCA 단계에서 엑소뉴클레아제를 사용하거나 사용하지 않고 1% MAF에서 EGFR 엑손 20 돌연변이 T790M의 검출.
도 8: 본 발명자들은 PPL:RCA 믹스비가 0.5% MAF EGFR 엑손 20 T790M에 대해 검출된 신호의 강도에 미치는 영향을 조사했으며, 그 결과를 도 8에 나타낸다. 도시된 바와 같이, 1:2 PPL:RCA 믹스의 비는 신호 강도가 가장 낮지만 가장 빠른 시점에 나타난다. 이것에 이어서, 신호 강도가 더 큰 1:4 PPL:RCA 믹스가 시간적으로 가깝게 이어진다. 가장 큰 신호 강도는 반응의 가장 늦은 시점에서 1:8 PPL:RCA 믹스에 대해 나타난다.
도 9: SybrGreenI(50℃ 및 60℃) 및 Syto82(50℃ 및 60℃)를 사용하여 프로토콜 4에 따라 수행한 비교 실험의 결과를 나타낸다.
도 10: 본 발명자들은 프로토콜 4에 따라 RCA에 대해 두 가지 다른 효소인 BST L.F 및 BST 2.0 WS의 사용을 조사했다.
도 11: 본 발명자들은 상이한 PPL:RCA 반응 혼합물 비에서 RCA 반응에 대한 상이한 PPL 효소의 영향을 조사했다. 그 결과는 도 11(A) 1:4 PPL:RCA 및 도 11(B) 1:8 PPL:RCA에서 확인할 수 있다. BST L.F 이외의 모든 PPL 효소는 1:4 PPL:RCA 비에서 RCA 반응에 영향을 미친다. 1:8 PPL:RCA 비에서는 BST L.F 및 Klenow를 제외한 모든 효소가 RCA 반응에 영향을 미친다.
도 12: 올리고뉴클레오티드 3 및 4가 모두 존재할 때 형광 신호가 반응에서 더 빨리 나타나고, 올리고뉴클레오티드 3의 피로인산첨가분해 및 결찰이 제 1 반응 혼합물에서 발생했음을 보여주는 실시예 11에 대한 형광 측정 결과.
도 13: 동일한 반응에 있어서 1% 대립유전자 분획에서의 T790M 및 C797S_2389 돌연변이의 검출.
도 14: 0.5% 대립유전자 분획에서 하나의 웰에서 동시에 3개의 돌연변이: G719X_6239, G719X_6252, G719X_6253의 검출.
도 15: 분석물 표적 서열에 대해 A1을 원형화하여 A2를 형성하는 것의 개략도. A0는 A0의 3' 단부로부터 3'-5' 방향으로 표적에 대해 점진적으로 분해되어, 부분적으로 분해된 가닥 A1을 형성하며, 이는 단계 (A) 및 (B)로 도시되어 있다. 이 점진적인 분해에 의해 A0/A1의 5' 단부에 상보적인 표적 영역이 드러나고, 이어서 A1의 5' 단부가 이 영역에 혼성화되며, 이는 단계 (C)에 도시되어 있다. 이어서, 단계(D)에서, A1이 함께 결찰되어 원형화된 A2가 형성된다.
도 16: A1을 형성하기 위한 A0의 피로인산첨가분해가 일어난 후 표적 서열에 대해 A1을 원형화하여 A2를 형성하는 구체예의 결과를 보여주는 실시예 14에 대한 형광 측정 결과.
도 17: 단일-가닥으로 된 프로브 올리고뉴클레오티드 A0는 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 어닐링되어 적어도 부분적으로 이중-가닥으로 된 제 1 중간 산물을 생성하고, 여기서 A0의 3' 단부가 표적 폴리뉴클레오티드 서열과 함께 이중-가닥으로 된 복합체를 형성한다. 본 발명의 이 단순화된 구체예에서는, 어떻게 표적에 어닐링되지 않은 A0가 본 방법의 추가 단계에 참여하지 않는지를 설명하기 위해 2개의 A0 분자와 1개의 표적 폴리뉴클레오티드 서열이 존재한다. 이 예시적인 예에 있어서, A0의 3' 단부는 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 어닐링되지만 A0의 5' 단부는 그렇지 않다. A0의 5' 단부는 5' 화학적 차단기, 공통 프라이밍 서열 및 바코드 영역을 포함한다.
부분적으로 이중-가닥으로 된 제 1 중간 산물은 A0의 3' 단부로부터 3'-5' 방향으로 피로인산첨가분해 효소의 존재 하에 피로인산첨가분해를 거쳐 부분적으로 분해된 가닥 A1, 분석물, 및 표적에 어닐링되지 않은 미분해 A0 분자를 생성한다.
도 18: A1은 단일-가닥으로 된 트리거 올리고뉴클레오티드 B에 어닐링되고, A1 가닥은 B에 대해 5'-3' 방향으로 연장되어 올리고뉴클레오티드 A2를 생성한다. 이 예시적인 예에서, 트리거 올리고뉴클레오티드 B는 5' 화학적 블록을 가진다. 임의의 분해되지 않은 A0는 트리거 올리고뉴클레오티드 B에 어닐링되지만, B에 대해 5'-3' 방향으로 연장되어 본 방법의 나중 부분에 대한 표적이 되는 서열을 생성할 수는 없다. 이 예에서, A2는 적어도 하나의 단일-가닥으로 된 프라이머 올리고뉴클레오티드로 프라이밍되고, A2 또는 소정 영역의 A2의 다수의 복사체가 생성된다.
도 19: A1은 스플린트 올리고뉴클레오티드 D에 어닐링된 다음, 그의 3' 및 5' 단부들의 결찰에 의해 원형화된다. 이제 원형화된 A2는 적어도 하나의 단일-가닥으로 된 프라이머 올리고뉴클레오티드로 프라이밍되고 A2 또는 소정 영역의 A2의 다수의 복사체가 생성된다. 이 예시적인 예에서, 스플린트 올리고뉴클레오티드 D는 3'-변형(이 예시에서 화학적)으로 인하여 또는 D의 3' 단부와 A2의 상응하는 영역 사이의 뉴클레오티드 미스매치로 인해 A1에 대해 연장될 수 없다.
도 20: 스플린트 올리고뉴클레오티드 D의 3' 영역은 A1의 3' 영역에 어닐링되는 반면, 스플린트 올리고뉴클레오티드 D의 5' 영역은 결찰 프로브 C의 5' 영역에 어닐링된다. 따라서, 제 2 중간 산물 A2는 A1, C 및 임의로는 C의 5' 단부를 만나기 위해 5'-3' 방향으로 A1을 연장시킴으로써 형성된 중간 영역으로 구성된다. 이 예시적인 예에서, 결찰 프로브 C는 3' 화학적 차단기를 가져서, 3'-5' 엑소뉴클레아제가 임의의 결찰되지 않은 A1의 분해에 사용될 수 있다.
A2는 적어도 하나의 단일-가닥으로 된 프라이머 올리고뉴클레오티드로 프라이밍되고 A2 또는 소정 영역의 A2의 다수의 복사체가 생성된다.
구체예에 대한 설명.
본 발명의 한 측면에서, 샘플에 존재하는 주어진 핵산 분석물 중에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 검출하는 방법이 제공되며, 본 방법은 다음의 단계들을 포함한다:
(a) 다음을 포함하는 제 1 반응 혼합물에 하나 또는 그 이상의 핵산 분석물을 도입하는 단계:
i. 단일-가닥으로 된 프로브 올리고뉴클레오티드 A0;
ii. 피로인산첨가분해 효소; 및
iii. 리가제
여기서, A0는 3' 단부로부터 3'-5' 방향으로 피로인산첨가분해되어 적어도 부분적으로 분해된 가닥 A1을 생성시키고, A1은 결찰을 거쳐 A2를 형성함;
(b) A2 또는 그의 일부, 또는 A2의 다수의 복사체 또는 그의 일부의 다수의 복사체인 이전 단계의 산물로부터 유래된 신호를 검출하고, 그로부터 상기 분석물 중에서 폴리뉴클레오티드 표적 서열의 존재 또는 부재를 유추하는 단계.
일부 구체예에서, 제 1 반응 혼합물은 피로포스페이트 이온의 공급원을 더 포함한다.
일부 구체예에서, A0의 3' 단부는 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 완전히 상보적이다.
일부 구체예에서, 리가제는 단일-가닥 결찰 활성이 실질적으로 결여되어 있다.
일부 구체예에서, 제 1 반응 혼합물은 A0의 일부 및 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트(dNTP)에 실질적으로 상보적인 적어도 하나의 단일-가닥으로 된 프라이머 올리고뉴클레오티드를 더 포함한다.
일부 구체예에서, 제 1 반응 혼합물은 증폭 효소를 더 포함한다.
일부 구체예에서, 단계 (a)의 산물을 단계 (b) 전에 제 2 반응 혼합물에 도입하고, 상기 제 2 반응 혼합물은 적어도 하나의 단일-가닥으로 된 프라이머 올리고뉴클레오티드 및 dTNP들을 포함한다.
일부 구체예에서, 제 2 반응 혼합물은 증폭 효소를 더 포함한다.
일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 핵산 분석물이 제 1 반응 혼합물 및 제 2 반응 혼합물에 동시에 도입될 수 있다.
일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 핵산 분석물이 제 1 반응 혼합물 및 제 2 반응 혼합물에 연속적으로 도입될 수 있다.
일부 구체예에서, dNTP는 핫 스타트 dNTP이다.
핫 스타트 dNTP는 3' 단부에서 열불안정성 보호기로 변형된 dNTP이다. 이 변형의 존재는 뉴클레오티드 보호기가 열 활성화 단계를 사용하여 제거될 때까지 DNA 폴리머라제 뉴클레오티드의 혼입을 차단한다.
일부 구체예에서, 단계 (a) 동안 분석물은 단일-가닥으로 된 프로브 올리고뉴클레오티드 A0에 어닐링하여 적어도 부분적으로 이중-가닥으로 된 제 1 중간 산물을 생성시키고, 여기서 A0의 3' 단부가 분석물 표적 서열과 이중-가닥으로 된 복합체를 형성한다.
일부 구체예에서, 단계 (a) 동안 제 1 중간 산물은 A0의 3' 단부로부터 3'-5' 방향으로 피로인산첨가분해되어 부분적으로 분해된 가닥 A1 및 분석물을 생성한다.
일부 구체예에서, 제 1 반응 혼합물은 결찰 프로브 올리고뉴클레오티드 C를 더 포함하고, 부분적으로 분해된 가닥 A1은 3' 단부에서 C의 5' 단부에 결찰되어 올리고뉴클레오티드 A2를 생성한다.
일부 구체예에서, 부분적으로 분해된 가닥 A1은 그의 3' 및 5' 단부들의 결찰을 통해 원형화되어 올리고뉴클레오티드 A2를 생성한다.
일부 구체예에서, A1의 결찰은 다음에서 발생한다:
단계 (a) 동안; 또는
단계 (b) 동안; 또는
단계 (a)와 단계 (b) 사이에서.
일부 구체예에서, 제 1 반응 혼합물은 5'-3' 엑소뉴클레아제를 더 포함하고, A0의 5' 단부는 5'-3' 엑소뉴클레아제 분해에 대해 저항성이 된다.
일부 구체예에서, 주어진 핵산 분석물의 증폭 후 및 제 1 반응 혼합물의 첨가(단계 (a)) 전에, 샘플을 프로테이나제로 더 처리한다.
일부 구체예에서, 제 1 반응 혼합물은 포스파타제 또는 포스포하이드롤라제를 더 포함한다.
일부 구체예에서, 단계 (b) 전에 또는 단계 (b) 동안에 이전 단계의 산물을 피로포스파타제로 처리한다.
일부 구체예에서, 단계 (b) 전에 또는 단계 (b) 동안에 이전 단계의 산물을 엑소뉴클레아제로 처리한다.
일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 C는 3'-5' 엑소뉴클레아제 분해로부터 그를 보호하는 내부 변형 또는 3' 변형을 더 포함한다.
일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 C는 5'-3' 엑소뉴클레아제 분해로부터 그를 보호하는 5' 변형을 더 포함한다.
일부 구체예에서, 제 1 또는 제 2 반응 혼합물은 스플린트 올리고뉴클레오티드 D를 더 포함한다.
일부 구체예에서, D는 A1의 3' 단부에 상보적인 올리고뉴클레오티드 영역과 올리고뉴클레오티드 C의 5' 단부 또는 A1의 5' 단부에 상보적인 영역을 포함한다.
일부 구체예에서, D는 3' 변형으로 인해 또는 D의 3' 단부와 A1의 상응하는 영역 사이의 미스매치로 인해 A1에 대해 연장을 겪을 수 없다.
일부 구체예에서, A0의 피로인산첨가분해를 수행하여 부분적으로 분해된 가닥 A1을 형성하는 효소는 또한 A2를 증폭시킨다.
일부 구체예에서, 검출은 하나 또는 그 이상의 올리고뉴클레오티드 형광 결합 염료 또는 분자 프로브를 사용하여 달성된다.
일부 구체예에서, A2의 앰플리콘의 생성에 기인하는 시간 경과에 따른 신호 증가는 분석물 중의 표적 서열의 농도를 유추하는 데 사용된다.
일부 구체예에서, 다수의 프로브 A0가 이용되며, 각각은 상이한 표적 서열에 대해 선택성이고, 각각은 식별 영역을 포함하고, A2로부터 유도된 앰플리콘들이 이 식별 영역을 포함하고, 따라서 분석물 중에 존재하는 표적 서열들이 식별 영역(들)의 검출을 통해 유추되는 것을 추가 특징으로 한다.
일부 구체예에서, 식별 영역(들)의 검출은 분자 프로브를 사용하거나 시퀀싱을 통해 수행된다.
일부 구체예에서, 본 방법의 마지막 단계는 다음 단계를 더 포함한다:
i. 하나 또는 그 이상의 올리고뉴클레오티드 형광 결합 염료 또는 분자 프로브를 사용하여 단계 (b)의 산물을 라벨링하고;
ii. 산물의 형광 신호를 측정하고;
iii. 산물을 일련의 변성 조건에 노출시키고; 그리고
변성 조건에 노출되는 동안 산물의 형광 신호의 변화를 모니터링하여 분석물중에서 폴리뉴클레오티드 표적 서열을 식별한다.
일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 핵산 분석물은 다수의 반응 부피로 분할되며, 각각의 부피는 상이한 표적 서열을 검출하기 위해 도입된 하나 또는 그 이상의 프로브 올리고뉴클레오티드 A0를 갖는다.
일부 구체예에서, 상이한 프로브 A0는 공통 프라이밍 부위를 포함하여, 단일 프라이머 또는 단일 세트의 프라이머를 A2의 영역을 증폭하는 데 사용될 수 있도록 한다.
일부 구체예에서, 샘플에 존재하는 주어진 핵산 분석물 중에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 검출하는 방법이 제공되며, 본 방법은 다음 단계들을 포함한다:
(a) 샘플에 존재하는 주어진 핵산 분석물을 증폭하는 단계;
(b) 다음을 포함하는 제 1 반응 혼합물에 단계 (a)의 산물을 도입하는 단계:
i. 단일-가닥으로 된 프로브 올리고뉴클레오티드 A0;
ii. 피로인산첨가분해 효소; 및
iii. 리가제
여기서, A0는 3' 단부로부터 3'-5' 방향으로 피로인산첨가분해되어 적어도 부분적으로 분해된 가닥 A1을 생성시키고, A1은 결찰을 거쳐 A2를 형성함;
(c) A2 또는 그의 일부, 또는 A2의 다수의 복사체 또는 그의 일부의 다수의 복사체인 이전 단계의 산물로부터 유래된 신호를 검출하고, 그로부터 상기 분석물 중에서 폴리뉴클레오티드 표적 서열의 존재 또는 부재를 유추하는 단계.
본 발명에 따르면, 주어진 핵산 분석물 중에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 검출하는 방법이 제공된다. 본 발명의 다양한 방법이 적용될 수 있는 분석물은, 분석물을 증폭하고, 전형적으로 상당히 과량으로 존재하는 배경 게놈 DNA로부터 분리하도록 설계된 일련의 예비 단계에 의해, 위에서 언급된 생물학적 샘플로부터 제조될 수 있다. 이 방법은 일반적으로 단일-가닥으로 된 표적 분석물의 제조에 적용 가능하며, 따라서 본 발명의 제 1 측면의 방법과 통합되거나 그의 일부를 더 포함하는 경우 이외의 상황에서 유용하다. 따라서, 표적 폴리뉴클레오티드 영역으로 구성된 핵산의 적어도 하나의 단일-가닥으로 된 분석물을 제조하는 방법이 제공되며, 본 방법은 (1) 분석물(들) 및 임의로는 배경 게놈 DNA로 구성된 생물학적 샘플을 증폭의 사이클에 적용함으로써 분석물(들)의 앰플리콘을 생성하는 단계를 특징으로 한다. 한 바람직한 구체예에서, 폴리머라제, 뉴클레오시드 트리포스페이트, 및 프라이머 중의 하나는 5'-3' 엑소뉴클레아제 차단기를 포함하는 적어도 하나의 상응하는 프라이머 쌍의 존재 하에 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 사용하여 증폭을 수행하고, (2) 임의로는 단계 (1)의 산물을 5'-3' 엑소뉴클레오티드 활성을 갖는 엑소뉴클레아제로 분해한다. 한 구체예에서, 본 방법은 (3) 단계 (2)의 산물을 프로테이나제와 반응시켜 폴리머라제를 파괴한 후, (4) 단계 (3)의 산물을 50℃를 초과하는 온도로 가열하여 프로테이나제를 실활시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
한 바람직한 구체예에서, 단계 (1) 내지 (4)는 생물학적 샘플로부터 유래된 표적 서열을 검출하는 통합된 방법을 산출하기 위해 본 발명의 제 1 측면의 방법의 단계 (a) 전에 수행된다. 다른 구체예에서, 생물학적 샘플은 단계 (1)이 수행되기 전에 세포 용해를 거친다.
단계 (1)의 일부 구체예에서, 뉴클레오시드 트리포스페이트는 자연 발생 DNA의 특징인 4개의 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트의 혼합물이다. 바람직한 구체예에서, 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트의 혼합물은 데옥시티미딘 트리포스페이트(dTTP) 대신 데옥시우리딘 트리포스페이트(dUTP)를 포함하고, 단계 (1)은 dUTP-DNA 글리콜라제(UDG) 효소의 존재 하에 추가로 수행되어 이전 분석으로부터 임의의 오염성 앰플리콘을 제거한다. 또 다른 구체예에서, 고충실도 폴리머라제, 예를 들어 상표명 퓨전(Phusion®) 또는 Q5로 판매되는 것 중 하나가 단계 (1)에서 사용된다. 또 다른 구체예에서, 폴리머라제는 KAPA HiFi 우라실+ DNA 폴리머라제일 수 있다.
고충실도 DNA 폴리머라제에는 DNA를 복사하는 동안 실수를 범하고 전파하는 것으로부터 보호하기 위한 여러 안전 장치가 있다. 이러한 효소는 중합 동안 올바르지 않은 뉴클레오시드 트리포스페이트에 비하여 올바른 뉴클레오시드 트리포스페이트에 대해 상당한 결합 우선순위를 가지고 있다. 잘못된 뉴클레오티드가 폴리머라제 활성 부위에 결합하면, 활성 부위 복합체의 구조가 최적이 아니므로 혼입이 느려진다. 이 지연 시간은 폴리머라제 진행 전에 잘못된 뉴클레오티드가 해리될 기회를 증가시켜, 올바른 뉴클레오시드 트리포스페이트로 프로세스를 다시 시작할 수 있게 한다. 잘못된 뉴클레오티드가 삽입될 경우, 교정 DNA 폴리머라제에는 추가의 방어선이 있다. 미스페어링된 염기에 의해 야기되는 섭동이 검출되고, 폴리머라제는 성장 중인 DNA 사슬의 3' 단부를 교정용의 3'→5' 엑소뉴클레아제 도메인으로 이동시킨다. 거기서, 잘못된 뉴클레오티드는 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성에 의해 제거되고, 그 결과 사슬이 폴리머라제 도메인으로 되돌아가 가서 거기에서 중합을 계속할 수 있다.
일부 구체예에서, 뉴클레오시드 트리포스페이트는 합성 또는 변형된 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트의 혼합물이다.
일부 구체예에서, 뉴클레오시드 트리포스페이트는 4개의 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트와 합성 또는 변형된 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트의 혼합물이다.
일부 구체예에서, 단계 (1)은 제한된 양의 프라이머 및 과도한 증폭 사이클을 사용하여 수행된다. 이를 통해 분석물의 초기 양에 관계없이 고정된 양의 앰플리콘이 생성된다. 따라서, 후속 단계 전에 분석물 정량화가 필요하지 않게 된다. 단계 (2)의 필요성을 없애는 장점이 있는 단계 (1)의 다른 구체예에서, 2개의 프라이머 중 하나가 다른 프라이머보다 과도하게 존재하는 프라이머 쌍의 존재 하에 증폭이 수행되어, 하나의 프라이머가 완전히 활용되면 단일-가닥으로 된 앰플리콘이 생성된다.
단계 (2)의 한 바람직한 구체예에서, 5' 프라이머는 포스포로티오에이트 연결, 역염기, DNA 스페이서 및 당업계에 일반적으로 공지된 기타 올리고뉴클레오티드 변형으로부터 선택되는 엑소뉴클레아제 차단 그룹으로 차단된다. 다른 구체예에서, 쌍의 다른 프라이머는 그의 5' 단부에 포스페이트기가 있다.
일부 구체예에서, 단계 (3)에서 사용된 프로테이나제는 프로테이나제 K이고, 단계 (4)는 80 내지 100℃의 온도로 30분 이하 동안 가열함으로써 수행된다. 한 구체예에서, 단계 (3)에서 사용된 프로테이나제는 프로테이나제 K이고, 단계 (3)은 55℃의 온도로 5분 동안 가열함으로써 수행되고, 단계 (4)는 95℃의 온도로 10분 동안 가열함으로써 수행된다. 다른 구체예에서, 단계 (2) 이후의 어떤 시점에서, 존재할 수 있는 임의의 잔류 뉴클레오시드 트리포스페이트를 제거하기 위해 포스파타제 또는 포스포하이드롤라제로 반응 매질을 처리한다.
일부 구체예에서, 분석물 내의 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 암성 종양 세포의 DNA 또는 RNA 안에 있는 유전자 또는 염색체 영역일 것이고, 이는 하나 또는 그 이상의 돌연변이; 예를 들어, 하나 또는 그 이상의 단일 뉴클레오티드 다형성(SNPs)의 형태로 존재하는 것을 특징으로 할 것이다. 따라서, 본 발명은 질환의 재발을 모니터링 및/또는 치료하는 데에 유용할 것이다. 질환의 재발을 검출하기 위해 치료 후 질환이 없다고 선언된 환자를 시간 경과에 따라 모니터링할 수 있다. 이것은 비-침습적으로 수행될 필요가 있고, 혈액 샘플로부터 표적 서열의 세심한 검출을 필요로 한다. 마찬가지로, 일부 암의 경우, 치료 후 환자에게 남아 있는 잔류 암세포가 있다. 본 발명을 사용하여 환자의 혈액에 존재하는 이들 세포(또는 무-세포 DNA)의 수준을 모니터링하면 질환의 재발 또는 현재 치료법의 실패를 검출할 수 있게 되고, 대체 치료법으로 전환할 필요가 있게 된다.
일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 검출은 질환의 치료 동안 환자 샘플의 반복적 테스트를 허용하여 치료법에 대해 발달된 내성을 조기에 검출할 수 있게 할 것이다. 예를 들어, 게피티닙(gefitinib), 에를로티닙(erlotinib)과 같은 상피 성장 인자 수용체(EGFR) 억제제는 일반적으로 비-소 세포 폐암(NSCLC)의 1선 치료제로 사용된다. 치료 동안 종양은 종종 치료에 대한 내성을 부여하는 EGFR 유전자에서의 돌연변이(예: T790M, C797S)를 발생시킬 것이다. 이러한 돌연변이의 조기 검출은, 환자의 대체 치료법으로의 전환을 가능하게 한다.
일부 구체예에서, 분석물 내의 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 태아 기원의 DNA 또는 RNA 안의 유전자 또는 염색체 영역일 것이고, 하나 또는 그 이상의 돌연변이; 예를 들어, 하나 또는 그 이상의 단일 뉴클레오티드 다형성(SNPs)의 형태로 존재하는 것을 특징으로 할 것이다. 따라서, 본 발명은 다른 이용 가능한 테스팅 기술보다 임신 초기 단계에서 매우 낮은 대립 유전자 분획에서 돌연변이를 검출하는 데 사용될 수 있다.
다른 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 그렇지 않으면 건강한 개체로부터 유래된 유전자 또는 게놈 영역일 수 있지만, 획득된 유전 정보는 인간 집단 내에서 하나 또는 그 이상의 정의된 집단들에 걸쳐 의료 또는 치료적 결론이 도출되도록 하는 귀중한 동반 진단 정보를 생성하는 데 도움이 될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 감염성 질환의 특징 또는 특정 치료법에 의한 치료에 대한 감염성 질환의 내성의 특징일 수 있고; 예를 들어 박테리아 또는 바이러스의 유전자 또는 염색체 영역, 또는 치료법에 대해 내성을 부여하는 돌연변이의 폴리뉴클레오티드 서열 특징일 수 있다.
일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 기부자 DNA의 특징일 수 있다. 이식된 장기가 환자에 의해 거부되면, 이 장기로부터의 DNA가 환자의 혈류로 흘러 들어간다. 이 DNA를 조기에 검출하면 거부 반응을 조기에 검출할 수 있게 될 것이다. 이는 기부자-특이성 마커의 맞춤형 패널을 사용하거나, 집단에서 일반적인 것으로 알려진 변이체 패널을 사용하여 달성할 수 있으며, 그 중 일부는 기부자에게 존재하고 일부는 수혜자에게 존재할 것이다. 따라서, 장기(organ) 수혜자의 시간 경과에 따른 일상적인 모니터링은 특허청구된 본 방법에 의해 가능해진다.
또 다른 구체예에서, 프로브의 상이한 조합을 사용하는 본 방법의 다양한 버전(하기 참조)을 나란히 이용하여, 다수의 표적 서열, 예를 들어 암의 공급원, 암 지표물 또는 다수의 감염 공급원에 대해 분석물이 동시에 스크리닝될 수 있다. 이 접근법에서, 본 방법의 병렬 적용에 의해 수득된 증폭된 산물은 하나 또는 그 이상의 올리고뉴클레오티드 결합 염료 또는 서열 특이적 분자 프로브, 예를 들어 분자 비콘(beacon), 헤어핀 프로브 등으로 구성된 검출 패널과 접촉된다. 따라서, 본 발명의 다른 측면에서는, 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 선택적인 하나 또는 그 이상의 화학적 및 생물학적 프로브와 조합된 적어도 하나의 프로브와 임의로는 하나의 결찰 올리고뉴클레오티드의 용도, 또는 증폭된 프로브 영역을 식별하기 위한 시퀀싱의 용도가 제공된다.
일부 구체예에서, 단일-가닥으로 된 프로브 올리고뉴클레오티드 A0는 프라이밍 영역 및 검출될 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 상보적인 3' 단부를 포함한다. 이에 의해, 적어도 부분적으로 이중-가닥으로 된 제 1 중간 산물이 생성된다. 한 구체예에서, 이 단계는 과량의 A0의 존재 하에서, 그리고 분석물 및 임의의 다른 핵산 분자를 포함하는 수성 배지에서 수행된다.
단계 (a) 동안, 제 1 중간 산물의 이중-가닥으로 된 영역은 그의 A0 가닥의 3' 단부로부터 3'-5' 방향으로 피로인산첨가분해된다. 결과적으로, A0 가닥은 점진적으로 분해되어 부분적으로 분해된 가닥을 생성하고; 이하에서는 A1으로 지칭한다. 프로브 올리고뉴클레오티드가 비-표적 서열과 잘못 혼성화하는 경우, 피로인산첨가분해 반응은 어떠한 미스매치에서도 정지할 것이고, 본 방법의 후속 단계가 진행되는 것을 방지할 것이다. 다른 구체예에서, 이러한 분해는, A1이 안정한 듀플렉스를 형성하기에 충분한 분석물 또는 그 안의 표적 영역과의 상보성이 결여될 때까지 계속된다. 이 시점에서, 여러 가닥들이 용융에 의해 분리되어, 단일-가닥으로 된 형태로 A1이 생성된다. 전형적인 피로인산첨가분해 조건 하에서, 이러한 분리는 분석물과 A0 사이에 6 내지 20개의 상보적인 뉴클레오티드가 있을 때 발생한다.
다른 구체예에서, A1이, 피로인산첨가분해 효소가 결합하거나 피로인산첨가분해 반응이 계속하기에 충분한 분석물 또는 그 안의 표적 영역과의 상보성이 결여될 때까지 분해가 계속된다. 이는 전형적으로 분석물과 프로브 사이에 6 내지 20개의 상보적인 뉴클레오티드가 남아 있을 때 발생한다. 일부 구체예에서, 이는 6 내지 40개의 상보적인 뉴클레오티드가 남아 있을 때 발생한다.
A1의 5' 및 3' 단부들에 상보성을 갖는 스플린트 올리고뉴클레오티드 D가 사용되는 다른 구체예(하기 참조)에서, 올리고 D가 A1으로부터 분석물 분자를 대체하는 것이 에너지적으로 유리한 시점까지 A1과 표적 사이의 상보성의 길이가 감소될 때까지 분해가 계속된다. 이것은 전형적으로 A1과 분석물 분자 사이의 상보성의 영역이 올리고 D와 A1의 3' 단부 사이의 상보성 영역과 유사하거나 더 짧은 길이일 때 발생하지만, 이미 A1의 5' 단부에 혼성화되었을 수 있는 올리고 D의 분자내 혼성화에 대한 선호도 때문에, A1과 분석물 분자 사이의 상보성이 이보다 더 길 때에도 발생할 수 있다.
분석물 분자를 스플린트로서 사용하여 A1의 결찰이 수행되는 다른 구체예(도 16 참조)에서, A1의 5' 단부가 분석물 분자에 혼성화할 수 있을 때까지 분해가 계속되어, A1의 3' 및 5' 단부들이 인접하고 닉(nick)에 의해서만 분리되게 되며, 그 시점에서 이들은 리가제에 의해 함께 결찰되고, 분해는 더 이상 진행될 수 없게 된다.
적합하게는, 피로인산첨가분해는 적어도 피로인산첨가분해 활성을 나타내는 폴리머라제 및 피로포스페이트 이온 공급원의 존재 하에 20 내지 90℃ 범위의 온도에서 반응 배지에서 수행된다. 폴리뉴클레오티드의 분해에 적용되는 피로인산첨가분해 반응에 대한 추가 정보는 예를 들어 J. Biol. Chem. 244 (1969) pp. 3019-3028 또는 우리의 이전 특허 출원에서 찾아 볼 수 있다.
일부 구체예에서, 피로인산첨가분해 단계는 과량의 폴리피로포스페이트 공급원의 존재에 의해 구동되며, 적합한 공급원에는 3개 이상의 인 원자를 함유하는 화합물들이 포함된다.
일부 구체예에서, 제 1 반응 혼합물은 과량의 폴리피로포스페이트의 공급원을 포함한다.
일부 구체예에서, 피로인산첨가분해 단계는 과량의 변형된 피로포스페이트 공급원의 존재에 의해 구동된다. 적합한 변형된 피로포스페이트에는 가교 산소 대신에 치환된 다른 원자 또는 기를 갖는 것, 또는 다른 산소 상의 치환 또는 변형기를 갖는 피로포스페이트(또는 폴리-피로포스페이트)가 포함된다. 당업자는 본 발명에 사용하기에 적합한 변형된 피로포스페이트의 많은 그러한 예가 있고, 그중 비-제한적 선택은 다음과 같다는 것을 이해할 것이다:
일부 구체예에서, 제 1 반응 혼합물은 과량의 변형된 폴리피로포스페이트의 공급원을 포함한다.
한 바람직한 구체예에서, 피로포스페이트 이온의 공급원은 PNP, PCP 또는 트리폴리포스포산(PPPi)이다.
추가로, 피로인산첨가분해 단계 (b)에서 사용하기 위한 피로포스페이트 이온의 공급원의 예는 WO2014/165210 및 WO00/49180에서 찾아 볼 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
일부 구체예에서, 과량의 변형된 피로포스페이트의 공급원은 Y-H로 나타낼 수 있고, 여기서 Y는 일반식 (X-O)2P(=B)-(Z-P(=B)(O-X))n-에 상응하며, 여기서 n은 1 내지 4의 정수이고; Z-는 각각 독립적으로 -O-, -NH- 또는 -CH2-로부터 선택되고; B는 각각 독립적으로 O 또는 S이고; X기는 독립적으로 -H, -Na, -K, 알킬, 알케닐, 또는 헤테로사이클기로부터 선택되며, 단 Z 및 B 둘 모두가 -O-에 상응하고, n이 1인 경우, 적어도 하나의 X기는 H가 아니다.
일부 구체예에서, Y는 일반식 (X-O)2P(=B)-(Z-P(=B)(O-X))n-에 상응하며, 여기서 n은 1, 2, 3 또는 4이다. 다른 구체예에서, Y기는 일반식 (X-O)2P(=O)-Z-P(=O)(O-H)-에 상응하며, 여기서 X기 중 하나는 -H이다. 또 다른 바람직한 구체예에서, Y는 일반식 (X-O)2P(=O)-Z-P(=O)(O-X)--에 상응하며, 여기서 X기 중 적어도 하나는 메틸, 에틸, 알릴 또는 디메틸알릴로부터 선택된다.
대안적인 구체예에서, Y는, Z가 -NH- 또는 -CH2-인 일반식 (H-O)2P(=O)-Z-P(=O)(O-H)- 또는 X기가 모두 -Na 또는 -K이고 Z가 -NH- 또는 -CH2-인 (X-O)2P(=O)-Z-P(=O)(O-X)--에 상응한다.
다른 구체예에서, Y는 일반식 (H-O)2P(=B)-O-P(=B)(O-H)-에 상응하며, 여기서 B기는 각각 독립적으로 O 또는 S이고, 적어도 하나는 S이다.
Y의 바람직한 구체예의 특정예는 화학식 (X1-O)(HO)P(=O)-Z-P(=O)(O-X2)의 것들을 포함하며, 여기서 Z는 O, NH 또는 CH2이고, (a) X1는 γ,γ-디메틸알릴이고, X2는 -H이고; 또는 (b) X1 및 X2는 둘 다 메틸이고; 또는 (c) X1 및 X2는 둘 다 에틸이고; 또는 (d) X1은 메틸이고, X2는 에틸이거나 또는 그 반대의 경우도 된다.
일부 구체예에서, 분자 프로브가 검출에 사용되는 경우, 프로브 올리고뉴클레오티드 A0는 표적 서열에 상보적인 영역의 5' 측에 올리고뉴클레오티드 식별 영역을 포함하도록 구성되고, 사용되는 분자 프로브는 이 식별 영역에 어닐링되도록 설계된다. 한 구체예에서, A0의 3' 영역만이 표적에 어닐링할 수 있고; 즉, 다른 영역들은 피로인산첨가분해 단계가 수행되는 온도에서 안정한 듀플렉스(duplex)가 존재하기에 충분한 분석물과의 상보성이 부족하다. 여기에서 그리고 전체적으로 '충분한 상보성(sufficient complementarity)'이라는 용어는 주어진 영역이 분석물에서 주어진 영역과 상보성을 갖는 한, 상보성 영역이 10개 초과의 뉴클레오티드 길이임을 의미한다.
본 발명의 방법의 추가 측면에서, 임의의 이전 구체예의 인산첨가분해 단계가 이중-가닥 특이적 엑소뉴클레아제를 사용하는 엑소뉴클레아제 분해 단계로 대체되는 대안 구체예가 제공된다. 당업자는 이중-가닥 특이적 엑소뉴클레아제에 3'-5' 방향으로 판독하는 것들, 예를 들어 ExoIII, 그리고 5'-3' 방향으로 판독하는 것들, 그 중에서도 예를 들어 람다 엑소(Lambda Exo)가 포함됨을 이해할 것이다.
엑소뉴클레아제 분해 단계가 이중 가닥-특이적 5'-3' 엑소뉴클레아제를 이용하는 본 발명의 일부 구체예에서, 그것은 표적 분석물에 상보적인 A0의 5' 단부이고, 공통 프라이밍 서열 및 차단기는 표적에 상보적인 영역의 3' 측에 위치한다. 추가의 구체예에서, 분자 프로브가 검출에 사용되는 경우, 프로브 올리고뉴클레오티드 A0는 표적 서열에 상보적인 영역의 3' 측에 올리고뉴클레오티드 식별 영역을 포함하도록 구성되고, 사용되는 분자 프로브는 이 식별 영역에 어닐링되도록 설계된다.
엑소뉴클레아제 분해 단계가 이중 가닥-특이적 5'-3' 엑소뉴클레아제를 이용하는 본 발명의 구체예에서, 3'에서 5'로의 엑소뉴클레오티드 활성을 갖는 엑소뉴클레아제는, A0 및 부분적으로 분해된 가닥 A1을 포함하는 임의의 물질을 온전하게 남기면서, 존재하는 임의의 다른 핵산 분자들을 분해할 목적으로 제 1 반응 혼합물에 임의로 첨가될 수 있다. 적합하게는, 외핵분해에 대한 이러한 저항성은 본 출원의 다른 곳에서 기술된 바와 같이 달성된다.
본 발명의 바람직한 한 구체예에서, A0의 5' 단부 또는 프라이밍 영역의 5' 측에 있는 내부 부위는 외핵분해에 대해 저항성이 부여된다. 이러한 수단에 의해 그리고 피로인산첨가분해 단계 후에 또는 동시에, 5'-3' 엑소뉴클레오티드 활성을 갖는 엑소뉴클레아제는 A0 및 부분적으로 분해된 가닥 A1을 포함하는 임의의 물질을 온전하게 남기면서, 존재하는 임의의 다른 핵산 분자들을 분해할 목적으로 반응 배지에 임의로 첨가될 수 있다. 적합하게는, 외핵분해에 대한 이러한 저항성은 요구되는 지점에서 올리고뉴클레오티드 A0에 하나 또는 그 이상의 차단기를 도입함으로써 달성된다. 한 구체예에서, 이러한 차단기는 포스포로티오에이트 연결 및 당업계에서 일반적으로 사용되는 기타 백본 변형, C3 스페이서, 포스페이트기, 변형된 염기 등으로부터 선택될 수 있다.
일부 구체예에서, 식별 영역은, 고유한 서열을 갖고 증폭된 성분 A2에 적용되는 서열-특이적 분자 프로브를 사용하여 간접적으로 또는 이들 성분의 시퀀싱에 의해 직접적으로 식별되도록 적응된 바코딩 영역을 포함하거나 그 안에 내장될 것이다. 사용될 수 있는 분자 프로브의 예는 분자 비콘, TaqMan® 프로브, Scorpion® 프로브 등을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
일부 구체예에서, A2 가닥 또는 그의 원하는 영역이 증폭을 거치게 되어서, 다수의, 전형적으로는 수백만개의 복사체가 만들어진다. 이것은 A2의 영역 및 후속적으로 그로부터 유래된 임의의 앰플리콘을 예를 들어 그에 대해 상보적인 영역에 어닐링될 수 있는 정방향/역방향 또는 센스/안티센스 쌍의 형태로 제공되는 단일-가닥으로 된 프라이머 올리고뉴클레오티드로 프라이밍함으로써 달성된다. 그 다음 프라이밍된 가닥이 증폭의 원점이 된다. 증폭 방법에는 열 순환 및 등온 방법, 예를 들어 폴리머라제 연쇄 반응, 재조합 효소 폴리머라제 증폭 및 롤링 서클 증폭이 포함되지만 이에 한정되지 않으며; 이들 중 마지막 방법은 A2가 원형화될 때 적용된다. 이러한 임의의 수단을 통해, A2 영역의 많은 앰플리콘 복사체와, 일부 경우에는 그의 서열 상보체가 신속하게 생성될 수 있다. 이러한 증폭 방법들 중 어느 하나를 수행하기 위한 정확한 방법론은 당업자에게 잘 알려져 있을 것이며, 사용되는 정확한 조건 및 온도 체계는 독자를 향한 일반 문헌에서 쉽게 이용할 수 있다. 구체적으로, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)의 경우, 이 방법론은 일반적으로 폴리머라제 및 다양한 단일 뉴클레오시드 트리포스페이트의 공급원을 사용하여 A2 가닥에 대해 5'-3' 방향으로 프라이머 올리고뉴클레오티드를 상보적 가닥이 생성될 때까지 연장시키고; 생성된 이중-가닥으로 된 산물을 탈혼성화시켜 A2 가닥 및 상보적 가닥을 재생시키고; A2 가닥 및 그의 임의의 앰플리콘을 재-프라이밍시키고, 그 다음 이러한 연장/탈혼성화/재프라이밍 단계를 여러 번 반복하여 A2 앰플리콘이 확실하게 검출될 수 있는 수준까지 A2 앰플리콘의 농도를 축적시키는 것을 포함한다.
대안적인 구체예에서, 제 1 또는 제 2 반응 혼합물은 혼성화 연쇄 반응(HCR)을 위한 성분을 더 포함한다.
일부 구체예에서, 제 1 반응 혼합물은 5' 포스페이트를 갖는 결찰 프로브 올리고뉴클레오티드 C, A1의 3' 단부 및 C의 5' 단부에 상보적인 스플린트 올리고뉴클레오티드 D를 더 포함하고, 부분적으로 분해된 가닥 A1은 3' 단부에서 C의 5' 단부에 결찰되어 올리고뉴클레오티드 A2를 형성한다. 일부 구체예에서, 제 2 반응 혼합물은 헤어핀 올리고뉴클레오티드 1(HO1) 및 헤어핀 올리고뉴클레오티드 2(HO2)를 더 포함하고, 이들 각각은 형광단 및 소광제를 포함하여, 각각의 올리고뉴클레오티드가 헤어핀 배열로 남아 있을 때, 형광단 및 소광제가 서로 접촉하도록 한다. HO1은 A2가 그것에 어닐링되어서 '헤어핀' 구조를 열고 소광제로부터 형광단을 분리하도록 설계되어 있다. 이제 '열린' HO1은 이제 HO2에 어닐링할 수 있어 '헤어핀' 구조를 열고 소광제로부터 형광단을 분리한다.
일부 구체예에서, 하나의 A2의 존재가 헤어핀 올리고뉴클레오티드 개방의 연쇄 반응을 일으켜서 검출 가능한 형광 신호의 생성이 일어날 수 있도록 복수의 헤어핀 올리고뉴클레오티드가 존재한다. 이 방법론은 문헌에서 혼성화 연쇄 반응(HCR)으로 알려져 있다.
일부 구체예에서, 형광단-소광제 쌍의 형광단은 플루오레세인 계열, 카르복시로다민 계열, 시아닌 계열 및 로다민 계열의 염료로부터 선택되지만 그에 한정되지 않는다. 사용될 수 있는 다른 계열의 염료에는, 예를 들어 폴리할로플루오레세인-계열 염료, 헥사클로로플루오레세인-계열 염료, 쿠마린-계열 염료, 옥사진-계열 염료, 티아진-계열 염료, 스쿠아레인-계열 염료, 킬레이트된 란타니드-계열 염료, 몰레큘러 프로브즈(Molecular Probes)로부터 상표명 Alexa Fluor J로 입수 가능한 염료 계열, ATTO-TEC(독일 지겐)으로부터 상표명 Atto로 입수가능한 염료 계열 및 Invitrogen(미국 캘리포니아주 칼즈베드)으로부터 상표명 Bodipy J로 입수가능한 염료 계열이 포함된다. 플루오레세인 계열의 염료에는, 예를 들어 6-카르복시플루오레세인(FAM), 2',4',1,4,-테트라클로로플루오레세인(TET), 2',4',5',7',1,4-헥사클로로플루오레세인(HEX), 2',7'-디메톡시-4',5'-디클로로-6-카르복시로다민(JOE), 2'-클로로-5'-플루오로-7',8'-융합 페닐-1,4-디클로로-6-카르복시플루오레세인(NED), 2'-클로로-7'-페닐-1,4-디클로로-6-카르복시플루오레세인(VIC), 6-카르복시-X-로다민(ROX), 및 2',4',5',7'-테트라클로로-5-카르복시-플루오레세인(ZOE)이 포함된다. 카르복시로다민 계열의 염료에는 테트라메틸-6-카르복시로다민(TAMRA), 테트라프로파노-6-카르복시로다민(ROX), 텍사스 레드, R110 및 R6G가 포함된다. 시아닌 계열의 염료에는, Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5 및 Cy7이 포함된다. 형광단은, 예를 들어 Perkin-Elmer (미국 캘리포니아주 포스터 시티), Molecular Probes, Inc.(미국 오리건주 유진) 및 Amersham GE Healthcare(미국 뉴저지주 피스카타웨이)로부터 상업적으로 용이하게 입수할 수 있다.
일부 구체예에서, 형광단-소광제 쌍의 소광제는 형광 소광제 또는 비-형광 소광제일 수 있다. 형광 소광제에는 TAMRA, ROX, DABCYL, DABSYL, 니트로티아졸 블루(NTB)를 포함하는 시아닌 염료, 안트라퀴논, 말라카이트 그린, 니트로티아졸, 및 니트로이미다졸 화합물이 포함되지만, 그에 한정되지 않는다. 형광단로부터 흡수된 에너지를 소산시키는 예시적인 비-형광 소광제에는 Biosearch Technologies, Inc.; 미국 캘리포니아주 노바토)로부터 상표명 Black Hole™로 입수 가능한 것들, Epoch Biosciences (미국 워싱턴주 보텔)로부터 상표명 Eclipse™. Dark로 입수 가능한 것들, Anaspec, Inc.(미국 캘리포니아주 샌호세)로부터 상표명 Qx1J로 입수가능한 것들, Integrated DNA Technologies(미국 아이오와주 코럴빌)로부터 상표명 ZEN 및 TAO로 입수가능한 것들, 및 Integrated DNA Technologies(미국 아이오와주 코럴빌)로부터 상표명 Iowa Black™으로 입수가능한 것들이 포함된다.
일부 구체예에서, 형광단-소광제 쌍의 형광단은 플루오레세인, 루시퍼 옐로우, B-피코에리트린, 9-아크리딘이소티오시아네이트, 루시퍼 옐로우 VS, 4-아세트아미도-4'-이소티오-시아나토스틸벤-2,2'-디설폰산, 7-디에틸아미노-3-(4'-이소티오시아나토페닐)-4-메틸쿠마린, 숙신임딜 1-피렌부티레이트, 및 4-아세트아미도-4'-이소티오시아나토스틸벤-2-,2'-디설폰산 유도체일 수 있다.
일부 구체예에서, 형광단-소광제 쌍의 형광단은 LC-Red 640, LC-Red 705, Cy5, Cy5.5, 리사민(Lissamine) 로다민 B 설포닐 클로라이드, 테트라메틸 로다민 이소티오시아네이트, 로다민 x 이소티오시아네이트, 에리트로신 이소티오시아네이트, 플루오레세인, 디에틸렌트리아민 펜타아세테이트 또는 란타나이드 이온(예: 유로퓸 또는 테르븀)의 다른 킬레이트일 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명은 이중 소광되는 형광 라벨링된 올리고뉴클레오티드를 이용한다. 제 2 내부 소광제를 포함하면 염료와 소광제 사이의 거리가 단축되고, 제 1 소광제와 함께 전체 염료 소광이 더 향상되고 배경이 낮아지고 신호 검출이 증가한다. 제 2 및 제 1 소광제는 이전에 기술된 소광제들 중 임의의 소광제일 수 있다.
일부 구체예에서, 제 1 반응 혼합물은 5' 포스페이트를 갖는 결찰 프로브 올리고뉴클레오티드 C, A1의 3' 단부 및 C의 5' 단부에 상보적인 스플린트 올리고뉴클레오티드 D를 더 포함하고, 부분적으로 분해된 가닥 A1은 3' 단부에서 C의 5' 단부에 결찰되어 올리고뉴클레오티드 A2를 형성한다.
일부 구체예에서, A1의 5' 및 3' 단부들은 함께 결찰되어 원형화된 A2를 형성한다.
일부 구체예에서, A1은 결찰 프로브 올리고뉴클레오티드 C에 대해 원형화되어 A2를 형성한다.
일부 구체예에서, A1은 표적 서열에 대해 원형화되어 A2를 형성한다.
일부 구체예에서, A1은 이전에 또는 이후에 기술된 바와 같이 원형화되어 A2를 형성한다.
일부 구체예에서, A2는 이전에 또는 이후에 기술된 바와 같이 부분적으로 분해된 가닥 A1로부터 형성된다.
일부 구체예에서, 제 2 반응 혼합물은 다음을 더 포함한다:
- 기질 암(substrate arm), 부분 촉매 코어 및 센서 암(sensor arm)을 포함하는 올리고뉴클레오티드 A;
- 기질 암, 부분 촉매 코어 및 센서 암을 포함하는 올리고뉴클레오티드 B; 그리고
- 형광단-소광제 쌍을 포함하는 기질;
여기서, 올리고뉴클레오티드 A 및 B의 센서 암은 A2의 측면 영역에 상보적이 어서 A2의 존재 하에 올리고뉴클레오티드 A 및 B가 결합되어 촉매적 다성분 핵산 효소(MNAzyme)를 형성한다. 이 구체예에서, MNAzyme은 A2의 존재 하에서만 형성되고, 검출 가능한 형광 신호가 생성되도록 형광단-소광제 쌍을 포함하는 기질을 절단한다.
일부 구체예에서, 형광단-소광제 쌍은 이전에 기술된 바와 같을 수 있다. 일부 구체예에서, 제 1 반응 혼합물 및 제 2 반응 혼합물이 배합된다.
일부 구체예에서, 피로인산첨가분해, 결찰 및 검출가능한 형광 신호의 생성이 추가 시약의 첨가 없이 발생하도록 제 1 반응 혼합물 및 제 2 반응 혼합물이 배합된다.
대안적인 구체예에서, 제 2 반응 혼합물은 하나 또는 그 이상의 DNA자임을 더 포함한다.
일부 구체예에서, 제 2 반응 혼합물은 부분적으로 이중-가닥으로 된 핵산 구조체를 더 포함하며, 여기서:
- 한 가닥은 적어도 하나의 RNA 염기, 적어도 하나의 형광단을 포함하고, 여기서 이 가닥의 영역은 A2의 영역에 상보적이고, 여기서 이 가닥은 '기질' 가닥으로 지칭될 수 있고;
- 다른 가닥은 적어도 하나의 소광제를 포함하고, 여기서 이 가닥의 영역은 기질 가닥이 그에 상보적인 영역에 인접한 A2의 영역에 상보적이어서, A2의 존재 하에 부분 가닥 핵산 구조체가 실질적으로 보다 이중 가닥으로 되고;
여기서, 실질적으로 보다 이중 가닥으로 되는 과정에서, 이중-가닥으로 된 핵산 구조체의 기질 가닥은 RNA 염기에서 절단되어, '다른' 가닥의 적어도 하나의 소광제가 더 이상 기질 가닥의 적어도 하나의 형광단에 대해 충분한 근접성을 이루고 있지 않기 때문에 형광이 발생한다.
즉, 부분적으로 이중-가닥으로 된 핵산 구조체는, A2의 존재 하에, 더 큰 크기의 이중-가닥으로 된 부분을 갖는다.
일부 구체예에서, 형광단-소광제 쌍은 이전에 기술된 바와 같을 수 있다.
일부 구체예에서, 적합한 완충제 및/또는 이온과 같은 추가 시약이 제 2 반응 혼합물에 존재한다.
일부 구체예에서, 제 2 반응 혼합물은 Mg2+ 이온을 더 포함한다.
일부 구체예에서, 제 2 반응 혼합물은 Zn2+ 이온을 더 포함한다.
일부 구체예에서, 제 2 반응 혼합물은 X2+ 이온을 더 포함하며, 여기서 X는 금속이다.
일부 구체예에서, 제 2 반응 혼합물은 하나 또는 그 이상의 X2+ 이온을 더 포함하며, 여기서 X는 금속이다.
대안적인 구체예에서, 제 1 반응 혼합물은 리가제 연쇄 반응(LCR)을 위한 시약을 더 포함한다.
이러한 구체예에서, 제 1 반응 혼합물은 다음을 더 포함한다:
- 하나 또는 그 이상의 리가제; 그리고
- A2 상의 인접 서열에 상보적인 2개 이상의 LCR 프로브 올리고뉴클레오티드, 여기서 프로브가 A2에 성공적으로 어닐링되면 하나의 LCR 프로브의 5' 포스페이트가 다른 LCR 프로브의 3'OH에 직접 인접한다.
일부 구체예에서, A2의 존재 하에 2개의 LCR 프로브는 A2에 성공적으로 어닐링되고 함께 결찰되어 하나의 올리고뉴클레오티드 분자를 형성하고, 이는 후속적으로 2회차 공유 결찰을 위한 새로운 표적으로 작용하여 관심 표적, 이 경우에 A2의 기하학적 증폭을 유도할 것이다. 결찰된 산물 또는 앰플리콘은 A2에 상보적이고, 다음 증폭 사이클에서 표적으로 기능한다. 따라서, 특이적 표적 DNA 서열의 지수적 증폭은 과량의 LCR 프로브가 있는 상태에서 변성, 혼성화 및 결찰의 반복된 사이클을 통해 달성된다. 이로부터, A2의 존재 및 따라서 표적 폴리뉴클레오티드 서열이 유추된다.
일부 구체예에서, A2의 존재 하에 2개의 LCR 프로브는 A2에 성공적으로 어닐링되고 함께 결찰되어 하나의 올리고뉴클레오티드 분자를 형성하고, 그 다음, 이 분자는 2회차 공유 결찰을 위한 새로운 표적으로 작용하여 관심 표적의 기하학적 증폭을 유도할 것이고, 그 다음 이 경우에 A2가 검출될 것이다.
일부 구체예에서, 결찰된 올리고뉴클레오티드 분자는 삽입 염료 또는 분자 프로브를 사용하여 실시간으로 검출된다.
일부 구체예에서, 결찰된 올리고뉴클레오티드 분자는 겔 전기영동을 사용하여 검출된다.
당업자는 결찰된 올리고뉴클레오티드 분자의 검출을 가능하게 하는 수많은 기술이 있음을 이해할 것이다.
일부 구체예에서, dNTP는 핫 스타트 dNTP 이다.
일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 리가제는 열안정성이다.
일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 리가제는 자연적으로 발생한다.
다른 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 리가제가 조작된다.
일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 리가제는 이전에 또는 이후에 개시된 임의의 리가제로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 폴리머라제는 열안정성이다.
일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 폴리머라제는 이전에 또는 이후에 개시된 임의의 폴리머라제로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 폴리머라제는 자연적으로 발생한다.
일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 폴리머라제가 조작된다.
일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 폴리머라제는 피로인산첨가분해에 사용된 것과 동일하다.
일부 구체예에서, 본 발명의 하나 또는 그 이상의 효소는 핫 스타트 효소이다.
일부 구체예에서, 본 발명의 하나 또는 그 이상의 효소는 열안정성이다.
대안적인 구체예에서, 이는 단계 (a)의 산물이 단계 (b) 전에 도입되는 제 2 반응 혼합물이며, 이는 리가제 연쇄 반응(LCR)을 위한 시약을 더 포함한다.
이 구체예에서, 제 2 반응 혼합물은 다음을 포함한다.
- 하나 또는 그 이상의 리가제;
- 임의로는 하나 또는 그 이상의 폴리머라제;
- A2 상의 인접한 서열에 상보적인 2개 이상의 LCR 프로브 올리고뉴클레오티드, 여기서 프로브가 A2에 성공적으로 어닐링되면 하나의 LCR 프로브의 5' 포스페이트가 다른 LCR 프로브의 3'OH에 직접 인접함;
- 임의로는, 성공적으로 결찰된 LCR 프로브의 증폭을 위한 하나 또는 그 이상의 프라이머; 그리고
- 임의로는, dNTP.
일부 구체예에서, A2의 존재 하에 2개의 LCR 프로브는 A2에 성공적으로 어닐링되고 함께 결찰되어 하나의 올리고뉴클레오티드 분자를 형성하고, 이는 후속적으로 2회차 공유 결찰을 위한 새로운 표적으로 작용하여 관심 표적, 이 경우에 A2의 기하학적 증폭을 유도할 것이다. 결찰된 산물 또는 앰플리콘은 A2에 상보적이고, 다음 증폭 사이클에서 표적으로 기능한다. 따라서, 특이적 표적 DNA 서열의 지수적 증폭은 과량의 LCR 프로브가 있는 상태에서 변성, 혼성화 및 결찰의 반복된 사이클을 통해 달성된다. 이로부터, A2의 존재 및 따라서 표적 폴리뉴클레오티드 서열이 유추된다.
일부 구체예에서, A2의 존재 하에 2개의 LCR 프로브는 A2에 성공적으로 어닐링되고 함께 결찰되어 하나의 올리고뉴클레오티드 분자를 형성하고, 그 다음, 이 분자는 2회차 공유 결찰을 위한 새로운 표적으로 작용하여 관심 표적의 기하학적 증폭을 유도할 것이고, 그 다음 이 경우에 A2가 검출될 것이다.
일부 구체예에서, 결찰된 올리고뉴클레오티드 분자는 삽입 염료 또는 분자 프로브를 사용하여 실시간으로 검출된다.
일부 구체예에서, 결찰된 올리고뉴클레오티드 분자는 겔 전기영동을 사용하여 검출된다.
당업자는 결찰된 올리고뉴클레오티드 분자의 검출을 가능하게 하는 수많은 기술이 있음을 이해할 것이다.
일부 구체예에서, dNTP는 핫 스타트 dNTP이다.
일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 리가제는 열안정성이다.
일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 리가제는 자연적으로 발생한다.
다른 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 리가제가 조작된다.
일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 리가제는 이전에 또는 이후에 개시된 임의의 리가제로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 폴리머라제는 열안정성이다.
일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 폴리머라제는 이전에 또는 이후에 개시된 임의의 폴리머라제로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 폴리머라제는 자연적으로 발생한다.
다른 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 폴리머라제가 조작된다.
일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 폴리머라제는 피로인산첨가분해에 사용된 것과 동일하다.
일부 구체예에서, 제 2 반응 혼합물은 하나 또는 그 이상의 폴리머라제에 더하여 피로인산첨가분해 효소를 더 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 하나 또는 그 이상의 효소는 핫 스타트 효소이다.
일부 구체예에서, 본 발명의 하나 또는 그 이상의 효소는 열안정성이다.
대안적인 구체예에서, 제 1 반응 혼합물은 다음을 더 포함한다:
- 결찰 부위를 포함하는 A2의 영역에 상보적인 올리고뉴클레오티드, 이들의 형광이 서로 근접하는 것에 의해 소광되거나 또는 하나 또는 그 이상의 형광 소광제에 의해 소광되도록 배열된 하나 또는 다수의 형광단을 포함함;
- 이중 가닥의 특이적 DNA 분해 효소;
여기서, A2의 존재 하에, 형광단이 서로 또는 상응하는 소광제로부터 분리되도록 라벨링된 올리고뉴클레오티드가 분해되고, 형광 신호와, 그에 따라서 A2의 존재가 검출될 수 있다.
일부 구체예에서, 형광단 및 소광제는 이전에 기술된 바와 같을 수 있다.
일부 구체예에서, 이중 가닥의 특이적 DNA 분해 효소는 엑소뉴클레아제이다. 다른 구체예에서, 이는 교정 활성을 갖는 폴리머라제이다. 다른 구체예에서, 제 2 반응 혼합물은 엑소뉴클레아제 또는 교정 활성을 갖는 폴리머라제 중 하나 또는 그 이상의 혼합물을 포함한다.
일부 구체예에서, 이중 가닥의 특이적 DNA 분해 효소는 핫 스타트 효소이다.
일부 구체예에서, 이중 가닥의 특이적 DNA 분해 효소는 본 방법의 피로인산첨가분해 반응이 일어나는 온도에서 감소된 활성을 갖는다.
일부 구체예에서, 이중 가닥의 특이적 DNA 분해 효소는 본 방법의 피로인산첨가분해 반응이 일어나는 온도에서 활성을 갖지 않는다.
대안 구체예에서, 제 2 반응 혼합물은 다음을 더 포함한다:
- 결찰 부위를 포함하는 A2의 영역에 상보적인 올리고뉴클레오티드, 이들의 형광이 서로 근접하는 것에 의해 소광되거나 또는 하나 또는 그 이상의 형광 소광제에 의해 소광되도록 배열된 하나 또는 다수의 형광단을 포함함;
- 이중 가닥의 특이적 DNA 분해 효소;
여기서, A2의 존재 하에, 형광단이 서로 또는 상응하는 소광제로부터 분리되도록 라벨링된 올리고뉴클레오티드가 분해되고, 형광 신호와, 그에 따라서 A2의 존재가 검출될 수 있다.
일부 구체예에서, 형광단 및 소광제는 이전에 기술된 바와 같을 수 있다.
일부 구체예에서, 이중 가닥의 특이적 DNA 분해 효소는 엑소뉴클레아제이다. 다른 구체예에서, 이는 교정 활성을 갖는 폴리머라제이다. 다른 구체예에서, 제 2 반응 혼합물은 엑소뉴클레아제 또는 교정 활성을 갖는 폴리머라제 중 하나 또는 그 이상의 혼합물을 포함한다.
일부 구체예에서, 이중 가닥의 특이적 DNA 분해 효소는 핫 스타트 효소이다.
일부 구체예에서, 이중 가닥의 특이적 DNA 분해 효소는 본 방법의 피로인산첨가분해 반응이 일어나는 온도에서 감소된 활성을 갖는다.
일부 구체예에서, 이중 가닥의 특이적 DNA 분해 효소는 본 방법의 피로인산첨가분해 반응이 일어나는 온도에서 활성을 갖지 않는다.
일부 구체예에서, 제 1 또는 제 2 반응 혼합물은 하나 또는 그 이상의 부분적으로 이중 가닥으로 된 DNA 구조체를 더 포함하며, 여기서 각각의 구조체는 하나 또는 그 이상의 형광단 및 하나 또는 그 이상의 소광제를 포함한다. 일부 구체예에서, 구조체가 부분적으로 이중-가닥으로 된 경우, 하나 또는 그 이상의 형광단 및 하나 또는 그 이상의 소광제는 하나 또는 그 이상의 형광단의 충분한 소광이 발생하도록 서로에 대해 충분히 근접하여 위치한다.
일부 구체예에서, 구조체는 그 자체로 루프백되는 자가-상보성 영역을 갖는 DNA의 한 가닥이다.
일부 구체예에서, 구조체는 프라이머 쌍의 하나의 프라이머를 포함한다.
일부 구체예에서, 제 1 또는 제 2 반응 혼합물은 프라이머 쌍의 다른 프라이머를 더 포함한다.
일부 구체예에서, 구조체의 단일 가닥으로 된 섹션의 부분은 A2에 혼성화되고 DNA 폴리머라제에 의해 그에 대해 연장된다. 일부 구체예에서, 프라이머 쌍의 다른 프라이머는 그 다음에 연장된 구조체에 혼성화된다. 그 다음, 이 프라이머는 구조체에 대해 연장되어 자가-상보적인 영역을 대체한다. 따라서, 하나 또는 그 이상의 형광단와 하나 또는 그 이상의 염료는, 반응 혼합물 중의 A2의 존재를 나타내는, 형광 신호가 검출될 만큼 충분히 분리된다.
그러한 구체예에서, 구조체는 Sunrise Primer로 알려져 있을 수 있다.
일부 구체예에서, 구조체는 2개의 별개의 DNA 가닥을 포함한다.
일부 구체예에서, 구조체의 단일 가닥으로 된 섹션의 부분은 A2에 혼성화되고 DNA 폴리머라제에 의해 그에 대해 연장된다. 일부 구체예에서, 프라이머 쌍의 다른 프라이머는 그 다음에 연장된 구조체에 혼성화된다. 그 다음, 이 프라이머는 이중-가닥으로 된 섹션의 방향으로 구조체에 대해 연장되어 DNA 가닥 중 더 짧은 가닥을 대체하고, 따라서 하나 또는 그 이상의 형광단와 하나 또는 그 이상의 염료는, 반응 혼합물 중의 A2의 존재를 나타내는, 형광 신호가 검출될 만큼 충분히 분리된다.
그러한 구체예에서, 구조체는 분자 지퍼(Molecular Zipper)로 알려져 있을 수 있다.
당업자는 Sunrise Primer 및 분자 지퍼 둘 다에 대해 하나 또는 그 이상의 형광단 및 하나 또는 그 이상의 소광제 쌍이 각각의 구조체 내의 다양한 위치에 위치하는 것이 가능하다는 것을 이해할 것이다. 핵심 특징은 A2가 없는 경우, 즉 연장 및 가닥 변위가 발생하지 않은 경우 형광 신호가 방출되지 않도록, 각 쌍이 서로에 대해 충분히 근접하여 위치한다는 것이다.
일부 구체예에서, 본 방법의 단계 (a) 전에, 샘플에 존재하는 임의의 RNA 주형을 사용하여 상응하는 DNA 서열을 형성한다.
일부 구체예에서, 이는 역전사효소 및 적절한 뉴클레오티드의 사용을 통해 달성된다.
일부 구체예에서, 존재하는 임의의 RNA 주형으로부터 DNA의 형성은 샘플에 존재하는 핵산의 PCR을 통한 임의의 사전 증폭과 동시에 발생한다.
일부 구체예에서, 존재하는 임의의 RNA 주형으로부터 DNA의 형성은 샘플에 존재하는 핵산의 PCR을 통한 임의의 사전 증폭과 별도의 단계에서 발생한다.
이전에 또는 이후에 기술된 방법 중 임의의 것의 일부 구체예에서, 샘플에 존재하는 RNA는 상응하는 DNA 서열로 전환되지 않는다. 이러한 구체예에서, A0는 RNA 서열에 대해 피로인산첨가분해를 거쳐 부분적으로 분해된 가닥 A1을 형성하고, 그 다음 본 방법은 이전에 또는 이후에 기술된 바와 같이 진행된다.
이전에 또는 이후에 기술된 방법 중 임의의 것의 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 반응 혼합물이 배합될 수 있다.
일부 구체예에서, 제 1 반응 혼합물은 결찰 프로브 올리고뉴클레오티드 C를 더 포함하고, 부분적으로 분해된 가닥 A1은 3' 단부에서 C의 5' 단부에 결찰되는 반면, 다른 구체예에서, A1은 그의 3' 및 5' 단부들의 결찰을 통해 원형화된다;
각 경우에 올리고뉴클레오티드 A2를 생성한다.
한 구체예에서, A1의 결찰은 다음에서 발생한다:
단계 (a) 동안; 또는
단계 (b) 동안; 또는
단계 (a)와 단계 (b) 사이에서.
한 구체예에서, A1은 임의로는 결찰 전에 5'-3' 방향으로 연장된다.
일부 구체예에서, 이 임의의 연장 및 결찰은 표적 올리고뉴클레오티드에 대해 수행되지만, 다른 구체예에서는 연장 및/또는 결찰 전에 A1이 어닐링되는 추가의 스플린트 올리고뉴클레오티드 D의 첨가를 통해 수행된다. 한 구체예에서, D는 A1의 3' 단부에 상보적인 올리고뉴클레오티드 영역 및 올리고뉴클레오티드 C의 5' 단부 또는 A1의 5' 단부에 상보적인 영역을 포함한다. 다른 구체예에서, D는 3'-단부 변형으로 인하여 또는 D의 3' 단부와 A1의 상응하는 영역 사이의 뉴클레오티드 미스매치로 인해 A1에 대해 연장될 수 없다.
일부 구체예에서, 결찰 프로브 C는 스플린트 올리고뉴클레오티드 D의 5' 단부 영역의 적어도 일부분에 상보적이거나 또는 표적 올리고뉴클레오티드에 상보적인 5' 영역을 갖는다. 이러한 수단에 의해, 제 2 중간 산물이 형성되는데, 이때 A2 가닥은 A1, C, 그리고 임의로는 C의 5' 단부와 만나기 위해 5'-3' 방향으로 A1의 연장에 의해 형성된 중간 영역으로 구성된다. 이러한 구체예에서, 단계 (c)(하기 참조)에서 사용되는 프라이머는 A1에서 C로의 결찰이 발생한 부위를 포함하는 A2의 영역이 적어도 증폭되도록 선택된다. 이 구체예에서, 우리는 3'-5' 엑소뉴클레아제가 증폭 전에 임의의 결찰되지 않은 A1을 분해하는 데 사용될 수 있도록 C 상에 3' 차단기를 포함하는 것이 유리하다는 것을 밝혀내었다. 결찰 전 연장에 사용될 수 있는 적합한 폴리머라제에는 Hemo KlenTaq, Mako 및 Stoffel Fragment가 포함되지만 이에 한정되지는 않는다.
일부 구체예에서, 제 1 반응 혼합물은 피로인산첨가분해 반응에 의해 생성된 뉴클레오시드 트리포스페이트를 가수분해에 의해 제거하기 위해 포스파타제 또는 포스포하이드롤라제를 더 포함함으로써, 피로인산첨가분해 반응이 계속될 수 있고 정중합 반응에 의해 뒤쳐지지 않도록 보장한다.
일부 구체예에서, 단계 (b) 전 또는 도중에, 이전 단계의 산물을 피로포스파타제로 처리하여 피로포스페이트 이온을 가수분해하여 추가의 피로인산첨가분해가 발생하는 것을 방지하고 정중합 반응을 촉진한다.
일부 구체예에서, 단계 (b) 전 또는 도중에, 이전 단계의 산물을 엑소뉴클레아제로 처리한다.
일부 구체예에서, A0의 피로인산첨가분해를 수행하여 부분적으로 분해된 가닥 A1을 형성하는 효소는 또한 A2를 증폭시킨다. 당업자는 그러한 효소가 많이 존재한다는 것을 이해할 것이다.
앰플리콘을 검출하고, 얻은 정보를 사용하여 폴리뉴클레오티드 표적 서열이 원래의 분석물 및/또는 이와 관련된 특성에 존재하는지 여부를 유추한다. 예를 들면, 이 수단을 통해, 암성 종양 세포의 특징적인 표적 서열은 찾고자 하는 특이적 SNP들을 참고하여 검출될 수 있다. 다른 구체예에서, 바이러스 또는 박테리아 게놈(이의 새로운 돌연변이 포함)의 특징적인 표적 서열이 검출될 수 있다. 예를 들어 올리고뉴클레오티드 결합 염료, 서열-특이적 분자 프로브 이를 테면, 형광-라벨링된 분자 비콘 또는 헤어핀 프로브를 비롯하여, 앰플리콘 또는 식별 영역을 검출하는 많은 방법이 이용될 수 있다. 대안적으로, 당업계에 사용되거나 또는 보고된 직접 시퀀싱 방법 중 하나를 사용하여 A2 앰플리콘의 직접적인 시퀸싱이 수행될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 결합 염료, 형광 라벨링된 비콘 또는 프로브가 사용되는 경우, 자극 전자기 방사선 소스(레이저, LED, 램프 등), 및 방출된 형광을 검출하고 특별히 설계된 알고리즘을 사용하여 마이크로프로세서 또는 컴퓨터에 의해 분석될 수 있는 데이터 스트림을 포함하는 신호를 이로부터 생성시키기 위해 배열된 광 검출기로 구성된 배열을 사용하여 앰플리콘을 검출하는 것이 편리하다.
일부 구체예에서, 검출은 하나 또는 그 이상의 올리고뉴클레오티드 형광 결합 염료 또는 분자 프로브를 사용하여 달성된다. 이러한 구체예에서, A2의 앰플리콘의 생성에 기인하는 시간 경과에 따른 신호의 증가는 분석물 중의 표적 서열의 농도를 유추하는 데 사용된다. 한 구체예에서, 본 방법의 마지막 단계는 다음 단계를 더 포함한다:
i. 하나 또는 그 이상의 올리고뉴클레오티드 형광 결합 염료 또는 분자 프로브를 사용하여 단계 (b)의 산물을 라벨링하고;
ii. 산물의 형광 신호를 측정하고;
iii. 산물을 일련의 변성 조건에 노출시키고; 그리고
변성 조건에 노출되는 동안 산물의 형광 신호의 변화를 모니터링하여 분석물중에서 폴리뉴클레오티드 표적 서열을 식별한다.
일부 구체예에서, 다수의 프로브 A0가 이용되며, 각각은 상이한 표적 서열에 대해 선택성이고, 각각은 식별 영역을 포함하고, A2의 앰플리콘이 이 식별 영역을 포함하고, 따라서 분석물 중에 존재하는 표적 서열들이 식별 영역(들)의 검출을 통해 유추되는 것을 추가 특징으로 한다. 이러한 구체예에서, 식별 영역(들)의 검출은 분자 프로브를 사용하거나 시퀀싱을 통해 수행된다.
일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 핵산 분석물이 다수의 반응 부피로 분할되며, 각각의 부피에는 상이한 표적 서열을 검출하기 위해 도입된 하나 또는 그 이상의 프로브 올리고뉴클레오티드 A0가 있다.
상이한 프로브 A0가 사용되는 일부 구체예에서, 상이한 프로브 A0는 하나 또는 그 이상의 공통 프라이밍 부위를 포함하여, 단일 프라이머 또는 단일 세트의 프라이머를 증폭에 사용할 수 있게 한다.
본 발명의 다른 측면에서, 본 발명의 임의의 이전의 구체예의 단계들을 특징으로 하는, 주어진 핵산 분석물 중에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 식별하는 방법이 제공되며, 여기서 하나 또는 그 이상의 올리고뉴클레오티드 형광 결합 염료 또는 분자 프로브를 사용하여 A2 또는 소정 영역의 A2의 다수의 복사체를 라벨링한다. 이러한 다수의 복사체의 형광 신호를 측정하고 다수의 복사체를 일련의 변성 조건에 노출시킨다. 변성 조건에 노출되는 동안 다수의 복사체의 형광 신호 변화를 모니터링하여, 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 식별해낸다.
일부 구체예에서, 변성 조건은 온도를 변화시킴으로써, 예를 들어 이중 가닥이 해리되기 시작하는 지점까지 온도를 증가시킴으로써 제공될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 변성 조건은 또한 조건이 산성 또는 알칼리성이 되도록 pH를 변화시키거나, 강산 또는 염기, 농축 무기염 또는 유기 용매, 예를 들어 알코올과 같은 첨가제 또는 제제를 첨가함으로써 제공될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서, 감염성 질환, 암의 존재 확인, 또는 동반 진단 정보를 생성하기 위한 목적으로 포유동물 대상체, 특히 인간 환자를 스크리닝하기 위한 상기 기재된 방법의 용도가 제공된다.
본 발명의 추가 측면에서, 상기에서 기술된 방법에 사용하기 위한 대조군 프로브가 제공된다. 본 발명의 구체예들은 특정 표적 서열 또는 서열들의 존재는 형광 신호의 생성에 의해 확인되는 것을 포함한다. 그러한 구체예들에서, 불가피하게 샘플에 존재하는 비-표적 DNA로부터 생성된 신호 수준이 있을 수 있다. 주어진 샘플에 대해 이 배경 신호는 '참(true)' 신호보다 나중에 시작되지만, 이러한 시작(onset)은 샘플마다 다를 수 있다. 따라서, 낮은 농도의 표적 서열 또는 서열들의 존재를 정확하게 검출하려면 그의 부재시 어떤 신호가 예상되는지에 대한 지식이 필요하다. 연출된 참조 샘플도 이용 가능하지만, 환자로부터의 실제 '블라인드(blind)' 샘플의 경우에는 그렇지 않다. 대조군 프로브(E0)를 활용하여 각 검정 프로브에 대한 예상 배경 신호 프로파일을 결정한다. 대조군 프로브는 샘플에 존재하는 것으로 예상되지 않는 서열을 표적으로 삼고, 이 프로브로부터 생성된 신호를 사용하여 표적 서열이 없는 경우 샘플로부터 예상되는 신호 생성율을 유추할 수 있다.
따라서, 다음 단계들을 특징으로 하는 주어진 핵산 분석물 중에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 검출하는 이전에 기술된 방법들 중 어느 것에 따른 방법이 제공된다:
a. 표적 서열에 적어도 부분적으로 미스매치되는 3' 단부 영역을 갖는 제 2 단일-가닥으로 된 프로브 올리고뉴클레오티드 E0를 사용하고, 샘플의 별도 분획을 사용하거나 또는 동일 분획에서 그리고 제 2 검출 채널을 사용하여 본 방법의 단계들을 후속적으로 또는 동시에 반복하고;
b. 샘플 안에 어떠힌 표적 분석물도 없는 경우, A0로부터 생성될 것으로 예상되는 배경 신호를 유추하고; 그리고
c. (a)에서 유추된 예상 배경 신호와 표적 분석물의 존재 하에 관찰된 실제 신호를 비교하여, 분석물 중에서 폴리뉴클레오티드 표적 서열의 존재 여부를 유추한다.
일부 구체예에서, 대조군 프로브(E0) 및 A0는 샘플의 개별 부분에 추가되는 반면, 다른 구체예에서 E0 및 A0는 샘플의 동일한 부분에 추가되고, 상이한 검출 채널(예, 상이한 색 염료)이 그의 각 신호의 측정에 사용된다. E0에 의해 생성된 신호는 그 다음 샘플에 폴리뉴클레오티드 표적 서열이 없는 경우 A0에 의해 생성될 것으로 예상되는 배경 신호를 유추하고, 수정하는 데 이용될 수 있다. 예를 들면, 배경 신호의 보정은 A0로부터 관찰된 신호에서 E0로부터 관찰된 신호를 빼거나, 또는 조건을 변화시키면서 A0 및 E0에 의해 생성된 상대적 신호의 보정 곡선을 사용하여 A0로부터 관찰된 신호 보정을 통하는 것을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 단일 E0를 이용하여 생성될 수 있는 모든 검정 프로브를 보정할 수 있다.
일부 구체예에서, 별도 E0를 사용하여 초기 증폭 단계에서 생성된 샘플 DNA의 각 앰플리콘을 보정할 수 있다. 각 앰플리콘에는 관심 대상의 다수 돌연변이/표적 서열이 포함될 수 있지만, 단일 E0는 단일 앰플리콘에 대한 모든 검정 프로브를 보정하기에 충분할 것이다.
추가 구체예에서, 각 표적 서열에 대해 별도 E0를 사용할 수 있다. 예를 들면, C>T 돌연변이가 표적이 되는 경우, 환자에게 발생하는 것으로 알려지지 않은 동일한 부위에서의 C>G 돌연변이를 표적으로 하도록 E0를 설계할 수 있다. 다양한 조건 하에 E0에 의해 생성된 신호 프로파일을 보정 반응에서 평가할 수 있고, 이러한 데이터는 이 변이체가 존재하지 않을 때, C>T 변이체를 표적으로 하는 검정 프로브로부터 예상되는 신호를 유추하는 데 사용된다.
본 발명의 방법의 일부 구체예는 도 17 내지 20에서 확인할 수 있다.
도 17에서, 단일-가닥으로 된 프로브 올리고뉴클레오티드 A0는 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 어닐링되어, 제 1 중간 산물이 생성되는데, 이는 적어도 부분적으로 이중-가닥으로 되어 있고, 이때 A0의 3' 단부는 표적 폴리뉴클레오티드 서열과 함께 이중-가닥으로 된 복합체를 형성한다. 본 발명의 이러한 단순화된 구체예에서, 표적에 어닐링되지 않은 A0가 어떻게 본 방법의 추가 단계에 참여하지 않는지를 설명하기 위해, A0의 두 개 분자와 하나의 표적 폴리뉴클레오티드 서열이 존재한다. 이러한 예시적인 예에서, A0의 3' 단부는 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 어닐링되는 반면, A0의 5' 단부는 그렇지 않다. A0의 5' 단부는 5' 화학적 차단기, 공통 프라이밍 서열 및 바코드 영역을 포함한다.
부분적으로 이중-가닥으로 된 제 1 중간 산물은 A0의 3' 단부로부터 3'-5' 방향으로 피로인산첨가분해 효소의 존재 하에 피로인산첨가분해되어 부분적으로 분해된 가닥 A1, 분석물, 그리고 표적에 어닐링되지 않은 미분해 A0 분자가 생성된다.
도 18에서, A1은 단일-가닥으로 된 트리거 올리고뉴클레오티드 B에 어닐되며, A1 가닥은 B에 대해 5'-3' 방향으로 연장되어 올리고뉴클레오티드 A2가 생성된다. 이러한 예시적인 예에서, 트리거 올리고뉴클레오티드 B는 5' 화학적 블록을 갖는다. 임의의 미분해 A0는 트리거 올리고뉴클레오티드 B에 어닐링되지만, 본 방법의 후속 부분에 대한 표적인 서열을 생성하기 위해 B에 대해 5'-3' 방향으로 연장될 수 없다. 이 예에서, A2는 적어도 하나의 단일-가닥으로 된 프라이머 올리고뉴클레오티드로 프라이밍되고, A2 또는 소정 영역의 A2의 다수의 복사체가 생성된다.
도 19에서, A1은 스플린트 올리고뉴클레오티드 D에 어닐링되고, 그 다음 그의 3' 및 5' 단부들의 결찰에 의해 원형화된다. 이제 원형화된 A2는 적어도 하나의 단일-가닥으로 된 프라이머 올리고뉴클레오티드로 프라이밍되고, A2 또는 소정 영역의 A2의 다수의 복사체가 생성된다. 이러한 예시적인 예에서, 스플린트 올리고뉴클레오티드 D는 3'-변형(이 예시에서 화학적)으로 인해, 또는 D의 3' 단부와 A2의 상응하는 영역 사이의 뉴클레오티드 미스매치로 인해 A1에 대해 연장될 수 없다.
도 20에서, 스플린트 올리고뉴클레오티드 D의 3' 영역은 A1의 3' 영역에 어닐링되는 반면, 스플린트 올리고뉴클레오티드 D의 5' 영역은 결찰 프로브 C의 5' 영역에 어닐링된다. 따라서, 제 2 중간 생성물 A2는 A1, C 및 임의로는 C의 5' 단부를 만나기 위해 5'-3' 방향으로 A1을 연장시킴으로써 형성된 중간 영역으로 구성된다. 이 예시적인 예에서, 결찰 프로브 C는 3' 화학적 차단기를 가져서, 3'-5' 엑소뉴클레아제를 사용하여 임의의 결찰되지 않은 A1을 분해할 수 있다.
A2는 적어도 하나의 단일-가닥으로 된 프라이머 올리고뉴클레오티드로 프라이밍되어 A2 또는 소정 영역의 A2의 다수의 복사체가 생성된다.
본 발명의 방법의 특이성은 차단 올리고뉴클레오티드의 도입에 의해 개선될 수 있다. 예를 들면, 차단 올리고뉴클레오티드는 야생형 DNA의 적어도 일부에 혼성화하도록 도입될 수 있고, 야생형이 아니라 표적 폴리뉴클레오티드 서열에만 A0의 어닐링을 촉진한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)의 특이성을 개선하여, 존재하는 임의의 야생형 서열의 증폭을 방지하기 위해, 차단 올리고뉴클레오티드가 사용될 수 있다. 사용되는 일반적인 기술은 PCR 프라이머 사이에서 어닐링되고, PCR 폴리머라제에 의해 대체 또는 분해될 수 없는 올리고뉴클레오티드를 설계하는 것이다. 올리고뉴클레오티드는 비-표적(일반적으로, 건강한) 서열에 어닐링하도록 설계되는 반면, 표적(돌연변이) 서열에 미스매치된다(종종 단일 염기에 의해). 이러한 미스매치는 두 서열에 대해 상이한 용융 온도를 야기하며, 올리고뉴클레오티드는 PCR 연장 온도에서 비-표적 서열에 어닐링된 상태를 유지하는 반면, 표적 서열로부터 해리되도록 설계된다.
차단 올리고뉴클레오티드는 종종 PCR 폴리머라제의 엑소뉴클레아제 활성에 의한 그의 분해를 방지하거나, 또는 표적 서열과 비-표적 서열 사이의 용융 온도 차이를 강화시키는 변형을 가질 수 있다.
잠긴 핵산(LNA) 또는 다른 용융 온도 변경 변형을 차단 올리고뉴클레오티드에 혼입시키면, 표적 서열과 비-표적 서열에 대한 올리고뉴클레오티드의 용융 온도 차이를 상당히 증가시킬 수 있다.
따라서, 차단 올리고뉴클레오티드를 사용하는 본 발명의 구체예가 제공된다. 차단 올리고뉴클레오티드는 이들이 분해되거나 또는 대체되지 않도록 피로인산첨가분해(PPL) 반응에 저항성이 있어야 한다. 이것은 예를 들어, 그의 3' 단부들에서의 미스매치를 통해, 또는 포스포로티오에이트 결합 또는 스페이서와 같은 변형을 통해 다수의 상이한 방식으로 달성될 수 있다.
차단 올리고뉴클레오티드가 사용되는 본 발명의 이러한 구체예 또는 측면에서, 주어진 핵산 분석물에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 검출하는 방법은, 분석물 표적 서열이 단일-가닥으로 된 프로브 올리고뉴클레오티드 A0에 어닐링되어, 적어도 부분적으로 이중 가닥으로 되고 A0의 3' 단부가 분석물 표적 서열과 함께 이중-가닥으로 된 복합체를 형성하는 제 1 중간 산물을 생성하는 동일한 단계 전에 또는 그 동안, 단일-가닥으로 된 차단 올리고뉴클레오티드를 비-표적 폴리뉴클레오티드 서열의 적어도 서브세트에 어닐링하는 것을 특징으로 한다.
일부 구체예에서, 차단 올리고뉴클레오티드는 그의 3' 단부들에서 미스매치를 통해 피로인산첨가분해 반응에 저항성이 되도록 만들어진다. 다른 구체예에서, 차단 올리고뉴클레오티드는 3'-차단기의 존재를 통해 저항성이 되도록 만들어진다. 다른 구체예에서, 차단 올리고뉴클레오티드는 스페이서의 존재 또는 다른 내부 변형을 통해 저항성이 되도록 만들어진다. 추가 구체예에서, 차단 올리고뉴클레오티드는 용융 온도 증가 변형 또는 변형된 뉴클레오티드 염기 둘 다를 포함하고 피로인산첨가분해에 저항성이 된다.
본원에서 '포스파타제 효소'에 대한 언급은, 본 발명의 방법에 의해 생성된 뉴클레오시드 트리포스페이트를 가수분해에 의해 제거하는 능력이 있는, 임의의 효소, 또는 그의 기능적 단편을 지칭한다. 여기에는 인산 모노에스테르를 포스페이트 이온과 알코올로 분해하는 능력이 있는, 임의의 효소, 또는 그의 기능적 단편이 포함된다.
본원에서 '피로포스파타제 효소'에 대한 언급은, 피로포스페이트의 1개 이온을 2개의 포스페이트 이온으로의 전환을 촉매하는 능력이 있는, 임의의 효소, 또는 그의 기능적 단편을 지칭한다.
여기에는 또한 무기 피로포스파타제와 무기 디포스파타제도 포함된다. 비-제한적인 예는 열안정성 무기 피로포스페이트(TIPP)이다.
일부 구체예에서, 피로포스파타제의 사용이 선택적인 임의의 이전에 기술된 또는 이후에 기술되는 구체예의 변형된 버전이 제공된다.
한 구체예에서, A1은 분석물 표적 서열에 대해 원형화된다. 이 구체예에서, A1을 형성하기 위해 A0의 3' 단부로부터 3'-5' 방향으로 A0의 점진적 분해에 의해 드러난 표적의 영역은 A0/A1의 5' 단부에 상보적이다. 이 구체예에서, 리가제를 사용하여 A1의 3' 및 5' 단부들을 결찰시켜 원형화된 올리고뉴클레오티드 A2를 형성할 수 있다. 이것은 예를 들어 도 15에 도시되어 있다. 한 구체예에서, A0/A1의 5' 단부는 5 내지 50개 뉴클레오티드 길이인 영역에 걸쳐 표적에 상보적이다. 한 구체예에서, 5 내지 25개 뉴클레오티드 길이이다. 한 구체예에서, 5 내지 20개 뉴클레오티드 길이이다. 한 구체예에서, 5 내지 15개 뉴클레오티드 길이이다. 한 구체예에서, 5 내지 12개 뉴클레오티드 길이이다. 한 구체예에서, 5 내지 10개 뉴클레오티드 길이이다.
한 구체예에서, 다음을 포함하는 환자의 암을 진단 또는 모니터링하는 방법이 제공된다:
- 환자 혈액의 혈장 또는 혈청에서 DNA 또는 RNA를 추출하고;
- 다음을 포함하는 제 1 반응 혼합물에 하나 또는 그 이상의 DNA 또는 RNA 분석물을 도입하고:
i. 단일-가닥으로 된 프로브 올리고뉴클레오티드 A0;
ii. 피로인산첨가분해 효소; 그리고
iii. 리가제;
여기서, 상기 분석물은 단일-가닥으로 된 프로브 올리고뉴클레오티드 A0에 어닐링하여, 적어도 부분적으로 이중-가닥으로 된 제 1 중간 산물을 생성시키고, 여기서 A0의 3' 단부가 이중-가닥으로 된 복합체를 형성하고, A0는 3' 단부로부터 3'-5' 방향으로 피로인산첨가분해되어 적어도 부분적으로 분해된 가닥 A1을 생성시키고, A1은 결찰을 거쳐 A2를 형성하고;
- A2 또는 그의 일부, 또는 A2의 다수의 복사체 또는 그의 일부의 다수의 복사체인 이전 단계의 산물로부터 유래된 신호를 검출하고, 그로부터 환자에서 암의 존재 또는 부재를 유추한다.
한 구체예에서, 다음을 포함하는 환자의 암을 모니터링하는 방법이 제공된다:
- 환자 혈액의 혈장 또는 혈청에서 DNA 또는 RNA를 추출하고;
- 다음을 포함하는 제 1 반응 혼합물에 하나 또는 그 이상의 DNA 또는 RNA 분석물을 도입하고:
i. 단일-가닥으로 된 프로브 올리고뉴클레오티드 A0;
ii. 피로인산첨가분해 효소; 그리고
iii. 리가제;
여기서, 상기 분석물은 단일-가닥으로 된 프로브 올리고뉴클레오티드 A0에 어닐링하여, 적어도 부분적으로 이중-가닥으로 된 제 1 중간 산물을 생성시키고, 여기서 A0의 3' 단부가 이중-가닥으로 된 복합체를 형성하고, A0는 3' 단부로부터 3'-5' 방향으로 피로인산첨가분해되어 적어도 부분적으로 분해된 가닥 A1을 생성시키고, A1은 결찰을 거쳐 A2를 형성하고;
- A2 또는 그의 일부, 또는 A2의 다수의 복사체 또는 그의 일부의 다수의 복사체인 이전 단계의 산물로부터 유래된 신호를 검출하고, 그로부터 환자에서 암의 진행 또는 완화를 유추한다.
한 구체예에서, 다음을 포함하는 환자에서 하나 또는 그 이상의 암 치료에 대한 반응을 모니터링하는 방법이 제공된다:
- 하나 또는 그 이상의 암 치료를 받는 환자의 혈액의 혈장 또는 혈청에서 DNA 또는 RNA를 추출하고;
- 다음을 포함하는 제 1 반응 혼합물에 하나 또는 그 이상의 DNA 또는 RNA 분석물을 도입하고:
i. 단일-가닥으로 된 프로브 올리고뉴클레오티드 A0;
ii. 피로인산첨가분해 효소; 그리고
iii. 리가제;
여기서, 상기 분석물은 단일-가닥으로 된 프로브 올리고뉴클레오티드 A0에 어닐링하여, 적어도 부분적으로 이중-가닥으로 된 제 1 중간 산물을 생성시키고, 여기서 A0의 3' 단부가 이중-가닥으로 된 복합체를 형성하고, A0는 3' 단부로부터 3'-5' 방향으로 피로인산첨가분해되어 적어도 부분적으로 분해된 가닥 A1을 생성시키고, A1은 결찰을 거쳐 A2를 형성하고;
- A2 또는 그의 일부, 또는 A2의 다수의 복사체 또는 그의 일부의 다수의 복사체인 이전 단계의 산물로부터 유래된 신호를 검출하고, 그로부터 하나 또는 그 이상의 암 치료에 대한 환자 반응을 유추한다.
한 구체예에서, 다음을 포함하는 환자를 스크리닝하는 방법이 제공된다:
- 환자 혈액의 혈장 또는 혈청에서 DNA 또는 RNA를 추출하고;
- 다음을 포함하는 제 1 반응 혼합물에 하나 또는 그 이상의 DNA 또는 RNA 분석물을 도입하고:
i. 단일-가닥으로 된 프로브 올리고뉴클레오티드 A0;
ii. 피로인산첨가분해 효소; 그리고
iii. 리가제;
여기서, 상기 분석물은 단일-가닥으로 된 프로브 올리고뉴클레오티드 A0에 어닐링하여, 적어도 부분적으로 이중-가닥으로 된 제 1 중간 산물을 생성시키고, 여기서 A0의 3' 단부가 이중-가닥으로 된 복합체를 형성하고, A0는 3' 단부로부터 3'-5' 방향으로 피로인산첨가분해되어 적어도 부분적으로 분해된 가닥 A1을 생성시키고, A1은 결찰을 거쳐 A2를 형성하고;
- A2 또는 그의 일부, 또는 A2의 다수의 복사체 또는 그의 일부의 다수의 복사체인 이전 단계의 산물로부터 유래된 신호를 검출하고, 그로부터 환자에서 하나 또는 그 이상의 암의 존재 또는 부재를 유추한다.
한 구체예에서, 다음을 포함하는 비-침습적 산전 검사(NIPT) 방법이 제공된다:
- 임신한 환자의 모혈의 혈장 또는 혈청에서 DNA 또는 RNA를 추출하고;
- 다음을 포함하는 제 1 반응 혼합물에 하나 또는 그 이상의 DNA 또는 RNA 분석물을 도입하고:
i. 단일-가닥으로 된 프로브 올리고뉴클레오티드 A0;
ii. 피로인산첨가분해 효소; 그리고
iii. 리가제;
여기서, 상기 분석물은 단일-가닥으로 된 프로브 올리고뉴클레오티드 A0에 어닐링하여, 적어도 부분적으로 이중-가닥으로 된 제 1 중간 산물을 생성시키고, 여기서 A0의 3' 단부가 이중-가닥으로 된 복합체를 형성하고, A0는 3' 단부로부터 3'-5' 방향으로 피로인산첨가분해되어 적어도 부분적으로 분해된 가닥 A1을 생성시키고, A1은 결찰을 거쳐 A2를 형성하고;
- A2 또는 그의 일부, 또는 A2의 다수의 복사체 또는 그의 일부의 다수의 복사체인 이전 단계의 산물로부터 유래된 신호를 검출하고, 그로부터 하나 또는 그 이상의 태아 기형의 존재 또는 부재를 유추한다.
한 구체예에서, 다음을 포함하는 환자를 스크리닝하는 방법이 제공된다:
- 환자 혈액의 혈장 또는 혈청에서 DNA 또는 RNA를 추출하고;
- 다음을 포함하는 제 1 반응 혼합물에 하나 또는 그 이상의 DNA 또는 RNA 분석물을 도입하고:
i. 단일-가닥으로 된 프로브 올리고뉴클레오티드 A0;
ii. 피로인산첨가분해 효소; 그리고
iii. 리가제;
여기서, 상기 분석물은 단일-가닥으로 된 프로브 올리고뉴클레오티드 A0에 어닐링하여, 적어도 부분적으로 이중-가닥으로 된 제 1 중간 산물을 생성시키고, 여기서 A0의 3' 단부가 이중-가닥으로 된 복합체를 형성하고, A0는 3' 단부로부터 3'-5' 방향으로 피로인산첨가분해되어 적어도 부분적으로 분해된 가닥 A1을 생성시키고, A1은 결찰을 거쳐 A2를 형성하고;
- A2 또는 그의 일부, 또는 A2의 다수의 복사체 또는 그의 일부의 다수의 복사체인 이전 단계의 산물로부터 유래된 신호를 검출하고, 그로부터 환자에서 하나 또는 그 이상의 암의 존재 또는 부재를 유추한다.
한 구체예에서, 다음을 포함하는 이식 수혜자 환자를 모니터링하는 방법이 제공된다:
- 이식 수혜자 환자의 혈액의 혈장 또는 혈청에서 DNA 또는 RNA를 추출하고;
- 다음을 포함하는 제 1 반응 혼합물에 하나 또는 그 이상의 DNA 또는 RNA 분석물을 도입하고:
i. 단일-가닥으로 된 프로브 올리고뉴클레오티드 A0;
ii. 피로인산첨가분해 효소; 그리고
iii. 리가제;
여기서, 상기 분석물은 단일-가닥으로 된 프로브 올리고뉴클레오티드 A0에 어닐링하여, 적어도 부분적으로 이중-가닥으로 된 제 1 중간 산물을 생성시키고, 여기서 A0의 3' 단부가 이중-가닥으로 된 복합체를 형성하고, A0는 3' 단부로부터 3'-5' 방향으로 피로인산첨가분해되어 적어도 부분적으로 분해된 가닥 A1을 생성시키고, A1은 결찰을 거쳐 A2를 형성하고;
- A2 또는 그의 일부, 또는 A2의 다수의 복사체 또는 그의 일부의 다수의 복사체인 이전 단계의 산물로부터 유래된 신호를 검출하고, 그로부터 이식된 장기로부터 DNA 또는 RNA의 존재 또는 부재를 유추한다.
본 발명의 일부 구체예에서, 샘플에 존재하는 주어진 핵산 분석물 중에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 검출하는 방법에 사용하기 위한 키트가 제공되며, 키트는 다음을 포함한다:
(a) 표적 폴리뉴클레오티드 서열과 함께 적어도 부분적으로 이중-가닥으로 된 제 1 중간 산물을 형성할 수 있는 단일-가닥으로 된 프로브 올리고뉴클레오티드 A0;
(b) 리가제;
(c) 부분적으로 분해된 가닥 A1을 생성하기 위해 A0의 단부로부터 3'-5' 방향으로 제 1 중간 산물을 분해할 수 있는 피로인산첨가분해 효소;
(d) A0의 부분에 실질적으로 상보적인 적어도 하나의 단일-가닥으로 된 프라이머 올리고뉴클레오티드;
(e) 증폭 효소; 그리고
(f) 적절한 완충제.
한 구체예에서 키트는 피로포스페이트 이온의 공급원을 더 포함한다.
피로포스페이트 이온의 적합한 공급원(들)은 이전에 기술된 바와 같다.
일부 구체예에서, 키트는 적합한 양성 및 음성 대조군을 더 포함한다.
일부 구체예에서, 키트는 이전에 기술된 바와 같은 하나 또는 그 이상의 대조군 프로브(E0)를 더 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 키트는 이전에 기술된 바와 같은 하나 또는 그 이상의 차단 올리고뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 키트는 하나 또는 그 이상의 대조군 프로브(E0) 및 하나 또는 그 이상의 차단 올리고뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, A0의 5' 단부는 5'-3' 엑소뉴클레아제 분해에 대해 저항성이 되도록 할 수 있고, 키트는 5'-3' 엑소뉴클레아제를 더 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 키트는 결찰 프로브 올리고뉴클레오티드 C를 더 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 키트는 스플린트 올리고뉴클레오티드 D를 더 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 키트는 C 및 D를 모두 포함할 수 있다.
결찰 프로브 C는 3'-5' 엑소뉴클레아제 분해로부터 이를 보호하는 내부 변형 또는 3' 변형을 포함할 수 있다.
D는 A1의 3' 단부에 상보적인 올리고뉴클레오티드 영역 및 올리고뉴클레오티드 C의 5' 단부 또는 A1의 5' 단부에 상보적인 영역을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, D는 3' 변형으로 인하여 또는 D의 3' 단부와 A1 또는 C의 상응하는 영역 사이의 미스매치로 인해 A1에 대한 연장을 겪을 수 없을 수 있다.
일부 구체예에서, 키트는 dNTP, 폴리머라제, 및 샘플에 존재하는 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 초기 증폭을 위한 적합한 완충제를 더 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 키트는 dUTP 혼입 고충실도 폴리머라제, dUTP들 및 우라실-DNA N-글리코실라제(UDG)를 더 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 키트는 포스파타제 또는 포스포하이드롤라제를 더 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 키트는 피로포스파타제를 더 포함할 수 있다. 피로포스파타제는 핫 스타트일 수 있다.
일부 구체예에서, 키트는 프로테이나제를 더 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 키트는 하나 또는 그 이상의 올리고뉴클레오티드 결합 염료 또는 분자 프로브를 더 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 키트는, 각각 상이한 표적 서열에 대해 선택적이고, 각각 식별 영역을 포함하는 다수의 A0를 더 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, (e)의 증폭 효소 및 피로인산첨가분해 효소는 동일하다.
키트는 본원에 기재된 바와 같은 처리 후에 폴리뉴클레오티드의 부분를 단리 및/또는 정제하기 위한 정제 장치 및 시약을 더 포함할 수 있다. 적합한 시약은 당업계에 잘 알려져 있으며, 겔 여과 컬럼 및 세척 완충제를 포함한다. 추가로 적합한 시약은 자기 비드 및 실리카 컬럼을 포함한다.
본 발명의 한 구체예에서, 다음을 포함하는 장치가 제공된다:
적어도 제 1 영역, 제 2 영역 및 제3 영역 사이의 유체 경로; 여기서 상기 제 1 영역은 하나 또는 그 이상의 웰을 포함하고, 각 웰은 다음을 포함한다:
dNTP들;
적어도 하나의 단일-가닥으로 된 프라이머 올리고뉴클레오티드;
샘플에 존재하는 DNA의 초기 증폭을 위한 증폭 효소; 그리고
여기서 상기 제 2 영역은 하나 또는 그 이상의 웰을 포함하고, 각각의 웰은 다음을 포함한다:
표적 폴리뉴클레오티드 서열과 함께 적어도 부분적으로 이중-가닥으로 된 제 1 중간 산물을 형성할 수 있는 단일-가닥으로 된 프로브 올리고뉴클레오티드 A0;
부분적으로 분해된 가닥 A1을 생성하기 위해 A0의 단부로부터 3'-5' 방향으로 제 1 중간 산물을 분해할 수 있는 피로인산첨가분해 효소; 그리고
여기서 상기 제3 영역은 하나 또는 그 이상의 웰을 포함하고, 각각의 웰은 다음을 포함한다:
dNTP들;
완충제;
증폭 효소;
A2 또는 그의 일부, 또는 A2의 다수의 복사체 또는 그의 일부의 다수의 복사체에서 유래된 신호를 검출하기 위한 수단; 그리고
여기서 제 2 영역의 웰 또는 제3 영역의 웰은 A0의 일부에 실질적으로 상보적인 적어도 하나의 단일-가닥으로 된 프라이머 올리고뉴클레오티드를 더 포함한다.
일부 구체예에서, 신호를 검출하기 위한 수단은 제3 영역의 하나 또는 그 이상의 웰 내에 위치한다.
일부 구체예에서, 신호를 검출하기 위한 수단은 장치의 제3 영역 내에 위치한다.
일부 구체예에서, 신호를 검출하기 위한 수단은 장치의 인접 영역 내에 위치한다.
일부 구체예에서, 제 1 영역의 각 웰의 dNTP들은 dUTP, dGTP, dATP 및 dCTP 일 수 있고, 각각의 웰은 dUTP 혼입 고충실도 폴리머라제 및 우라실-DNA N-글리코실라제(UDG)를 더 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 제3 영역의 각 웰의 dNTP들은 dUTP, dGTP, dATP 및 dCTP 일 수 있고, 각각의 웰은 dUTP 혼입 고충실도 폴리머라제 및 우라실-DNA N-글리코실라제(UDG)를 더 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 제 2 영역의 각각의 웰은 피로포스페이트 이온의 공급원을 더 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, A0의 5' 단부는 5'-3' 엑소뉴클레아제 분해에 대해 저항성이 될 수 있고, 제 2 영역의 웰은 5'-3' 엑소뉴클레아제를 더 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 제 2 또는 제3 영역의 각각의 웰은 리가제 및 결찰 프로브 올리고뉴클레오티드 C 또는 스플린트 올리고뉴클레오티드 D를 더 포함할 수 있다.
결찰 프로브 C는 3'-5' 엑소뉴클레아제 분해로부터 이를 보호하는 내부 변형 또는 3' 변형을 포함할 수 있다.
스플린트 올리고뉴클레오티드 D는 A1의 3' 단부에 상보적인 올리고뉴클레오티드 영역 및 올리고뉴클레오티드 C의 5' 단부 또는 A1의 5' 단부에 상보적인 영역을 포함할 수 있다.
D는 3' 변형으로 인해 또는 D의 3' 단부와 A1 또는 C의 상응하는 영역 사이의 미스매치로 인해 A1에 대한 연장을 겪지 못할 수 있다.
일부 구체예에서, dNTP는 핫 스타트일 수 있고, 제 2 영역의 각각의 웰은 포스파타제 또는 포스포하이드롤라제를 더 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 제 2 영역의 각각의 웰은 피로포스파타제를 더 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 제3 영역의 각각의 웰은 피로포스파타제를 더 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 피로포스파타제는 핫 스타트일 수 있다.
일부 구체예에서, 제3 영역의 각각의 웰은 하나 또는 그 이상의 올리고뉴클레오티드 결합 염료 또는 분자 프로브를 더 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 제 2 영역의 각각의 웰은, 식별 영역을 포함하는 표적 서열에 대해 선택적인, 적어도 하나 또는 그 이상의 상이한 A0를 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 제 2 영역의 증폭 효소 및 피로인산첨가분해 효소는 동일할 수 있다.
일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 웰을 포함하는 제4 영역이 있을 수 있고, 여기서 각각의 웰은 프로테이나제를 포함할 수 있고, 상기 제4 영역은 제 1 영역과 제 2 영역 사이에 위치할 수 있다.
일부 구체예에서, 장치의 제 2 및 제3 영역은 제 2 영역의 웰이 다음을 더 포함하도록 조합될 수 있다:
dNTP들;
완충제;
증폭 효소; 그리고
A1 또는 그의 일부, 또는 A1의 다수의 복사체 또는 그의 일부의 다수의 복사체에서 유래된 신호를 검출하기 위한 수단.
일부 구체예에서, 신호를 검출하기 위한 수단은 제 2 영역의 하나 또는 그 이상의 웰 내에 위치한다.
일부 구체예에서, 신호를 검출하기 위한 수단은 장치의 제 2 영역 내에 위치한다.
일부 구체예에서, 신호를 검출하기 위한 수단은 장치의 인접 영역 내에 위치한다.
일부 구체예에서, 제 1 영역은 유체 인터페이스를 통해 샘플 용기에 유체적으로 연결될 수 있다.
일부 구체예에서, 가열 및/또는 냉각 요소는 장치의 하나 또는 그 이상의 영역에 존재할 수 있다.
일부 구체예에서, 가열 및/또는 냉각은 장치의 하나 또는 그 이상의 영역에 적용될 수 있다.
일부 구체예에서, 장치의 각 영역은 독립적으로 적어도 100개 또는 적어도 200개의 웰을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 장치의 각 영역은 독립적으로 약 100 내지 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500개 이상의 웰을 포함할 수 있다. 웰은 임의의 모양일 수 있으며, 그 위치는 기재 상의 임의의 포맷 또는 패턴으로 배열될 수 있다.
일부 구체예에서, 웰-기질은 금속(예를 들어, 비제한적인 예로서 금, 백금, 또는 니켈 합금), 세라믹, 유리, 또는 기타 PCR 호환 가능한 중합체 재료, 또는 복합 재료로부터 구성될 수 있다. 웰-기질은 복수의 웰을 포함한다.
일부 구체예에서, 웰은 블라인드-홀 또는 관통-홀로서 웰-기질에 형성될 수 있다. 웰은 예를 들어 레이저 드릴링(예: 엑시머 또는 고체-상태 레이저), 초음파 엠보싱, 고온 엠보싱 리소그래피, 니켈 몰드 전기주조, 사출 성형 및 사출 압축 성형에 의해 웰-기질 내에 생성될 수 있다.
일부 구체예에서, 개별 웰 부피는 0.1 내지 1500nl의 범위일 수 있다. 한 구체예에서, 0.5 내지 50nL이다. 각 웰은 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475 또는 500nL의 부피를 가질 수 있다.
일부 구체예에서, 웰 차원은 임의의 형상, 예를 들어 원형, 타원형, 정사각형, 직사각형, 난형, 육각형, 팔각형, 원추형, 및 당업자에게 잘 알려진 기타 형상을 가질 수 있다.
일부 구체예에서, 웰 형상은 축을 따라 변하는 단면적을 가질 수 있다. 예를 들어, 정사각형 구멍은 제 1 크기로부터 제 1 크기의 일부인 제 2 크기로까지 가늘어질 수 있다.
일부 구체예에서, 웰 차원은 직경 및 깊이가 대략 동일한 정사각형일 수 있다.
일부 구체예에서, 웰을 한정하는 벽은 평행하지 않을 수 있다.
일부 구체예에서, 웰을 한정하는 벽은 한 점으로 수렴될 수 있다. 웰 차원은 웰-기질의 총 부피 용량에서 유래될 수 있다.
일부 구체예에서, 웰 깊이는 25㎛ 내지 1000㎛ 범위일 수 있다.
한 구체예에서, 웰은 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 또는 1000㎛의 깊이를 가질 수 있다.
일부 구체예에서, 웰의 직경은 약 25㎛ 내지 약 500㎛의 범위일 수 있다.
일부 구체예에서, 웰의 너비는 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475 또는 500㎛일 수 있다.
일부 구체예에서, 장치의 하나 또는 그 이상의 영역의 일부는 유체 부착을 촉진하거나 차단하도록 변형될 수 있다. 웰을 한정하는 표면은 친수성 물질로 코팅(또는 친수성으로 변형)될 수 있으며, 따라서 유체의 보유를 촉진한다.
일부 구체예에서, 장치의 하나 또는 그 이상의 영역의 일부는 소수성 물질로 코팅(또는 소수성으로 변형)될 수 있고, 따라서 그 위의 유체의 보유를 차단할 수 있다. 당업자는 유체가 바람직하게는 웰 내에 유지되지만 초과량의 유체의 배수를 촉진하기 위해 상부 표면에는 유지되지 않도록, 다른 표면 처리가 수행될 수 있는다는 것을 이해할 것이다.
일부 구체예에서, 웰-기질의 웰은 정렬된 행 및 열의 단순한 기하학적 패턴, 또는 대각선 또는 육각형으로 배열된 패턴을 갖도록 패터닝될 수 있다. 한 구체예에서, 웰-기질의 웰은 혼돈 패턴 또는 등기하학적 디자인 패턴과 같은 복잡한 기하학적 패턴을 갖도록 패터닝될 수 있다.
일부 구체예에서, 웰은 서로 기하학적으로 분리될 수 있고/있거나 시약의 교차 오염을 방지하는 데 도움이 되도록 깊이 대 너비 비가 큰 것을 특징으로 할 수 있다.
일부 구체예에서, 장치는 장치의 하나 또는 그 이상의 영역에 오일 또는 다른 화학 용액과 같은 공정 유체를 제공하는 데 사용될 수 있는 하나 또는 그 이상의 보조 영역을 포함할 수 있다. 이러한 보조 영역은 하나 또는 그 이상의 멤브레인, 밸브 및/또는 압력 분리 가능한 기재(즉, 보조 영역 또는 유체 경로의 인접 부분 내의 유체로부터 미리 결정된 양의 압력을 받을 때 파손되는 재료), 예를 들어 금속 호일 또는 박막을 통해 장치의 하나 또는 그 이상의 영역에 유체적으로 연결될 수 있다.
일부 구체예에서, 장치의 유체 경로는 광범위하게 구불구불한 부분을 포함할 수 있다. 상기 장치의 유체 경로의 입구 통로와 하나 또는 그 이상의 영역 사이의 구불구불한 경로는 유체 프로세스의 제어 및 취급에 도움이 될 수 있다. 구불구불한 경로는 유체 경로를 통한 오일 흐름을 방해할 수 있는 기포의 형성을 줄이는 데 도움이 될 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 장치는 유체가 통과하는 것을 허용하지 않으면서, 이 장치의 하나 또는 그 이상의 영역의 웰로부터 기체를 배출할 수 있게 하는 기체 투과성 멤브레인을 더 포함할 수 있다. 기체 투과성 멤브레인은 기체 투과성 접착제에 의해 장치의 웰-기질에 접착될 수 있다. 한 구체예에서, 멤브레인은 폴리디메틸실록산(PDMS)으로 구성될 수 있고, 20 내지 1000㎛ 범위의 두께를 갖는다. 일부 구체예에서, 멤브레인은 100 내지 200㎛ 범위의 두께를 가질 수 있다.
일부 구체예에서, 웰-기질의 전부 또는 일부는 금속으로부터 웰로의 열 전달을 가능하게 하는 전도성 금속 부분(예를 들어, 금)을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 웰의 내부 표면은 열 전달을 가능하게 하기 위해 금속으로 코팅될 수 있다.
일부 구체예에서, 적절한 시약이 상기 장치의 하나 또는 그 이상의 영역의 웰을 채운 후, 크로스톡(cross-talk)을 방지하기 위해 절연 오일 또는 열 전도성 액체가 장치에 적용될 수 있다.
일부 구체예에서, 장치의 하나 또는 그 이상의 영역의 웰은 원추와 유사하게 더 큰 직경에서 더 작은 직경으로 가늘어지도록 형상화될 수 있다. 경사진 벽이 있는 원추 모양의 웰은 시약에 대한 비-접촉 증착 방법 (예: 잉크 젯)을 사용할 수 있게 한다. 원추 모양은 또한 건조를 돕고, 기체 투과성 멤브레인이 있을 때 기포와 누출을 방지하는 것으로 밝혀졌다.
일부 구체예에서, 장치의 하나 또는 그 이상의 영역의 웰은 장치의 유체 경로를 따라 (예를 들어, 압력을 통해) 샘플 유체를 전진시킴으로써 충전될 수 있다. 유체가 상기 장치의 하나 또는 그 이상의 영역의 웰을 지나갈 때 각 웰은 유체로 충전되며, 이는 주로 표면 장력을 통해 웰 내에 보유된다. 앞서 설명한 바와 같이, 장치의 웰-기질 부분은 요구되는 대로 친수성/소수성 물질로 코팅되어 샘플 유체가 지나갈 때 웰이 완전하고 균일하게 충전되도록 촉진할 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 장치의 하나 또는 그 이상의 영역의 웰은 충전 후 오일로 '캡핑'될 수 있다. 이에 의해, 웰-기질이 열 순환을 받을 때 증발을 줄이는 데 도움이 될 수 있다. 한 구체예에서, 오일 캡핑 후, 열 전도성을 개선하기 위해 수용액이 상기 장치의 하나 또는 그 이상의 영역을 채울 수 있다.
일부 구체예에서, 유체 및 임의의 기포의 이동을 정지시키기 위해 장치의 하나 또는 그 이상의 영역 내에서 비유동성(stationary) 수용액이 가압될 수 있다.
일부 구체예에서, 광유와 같은 오일이 상기 장치의 하나 또는 그 이상의 영역의 웰을 격리하고 열전도성을 제공하는 데 사용될 수 있다. 그러나, 플루오르화 액체(예: 3M FC-40)와 같은 임의의 열전도성 액체가 사용될 수 있다. 본 개시내용에서 오일에 대한 언급은 당업자가 적용 가능하다고 인식할 수 있는 그러한 대안들을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
일부 구체예에서, 상기 장치는 하나 또는 그 이상의 센서 어셈블리를 더 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 하나 또는 그 이상의 센서 어셈블리는 광섬유 페이스 플레이트 (FOFP)에 결합된 전하 결합 소자 (CCD)/상보형 금속-산화물-반도체 (CMOS) 검출기를 포함할 수 있다. 필터는 FOPF의 상부에 적층되어서 웰-기질에 대해 배치되거나 그에 인접하여 배치될 수 있다. 한 구체예에서, 상기 필터는 FOPF가 상부에 배치된 상태에서 CCD의 상부에 직접 적층(결합)될 수 있다.
일부 구체예에서, 증류수와 같은 수화 유체는 장치의 하나 또는 그 이상의 영역이 최대 100% 습도, 또는 적어도 열 순환 중의 과증발을 방지하기에 충분한 습도를 갖도록 제 1 영역 또는 보조 영역들 중 하나의 영역 내에서 가열될 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 장치의 충전이 완료된 후, 웰-기질은 PCR을 위한 열 순환을 수행하기 위해 장치와 열 접촉하는 외부 장치에 의해 가열될 수 있다.
일부 구체예에서, RFID, 퀴리 포인트, 유도 가열 또는 마이크로파 가열과 같은 비-접촉 가열 방법이 이용될 수 있다. 이들 비-접촉 가열 방법 및 다른 비-접촉 가열 방법은 당업자에게 잘 알려져 있을 것이다. 열 순환 동안, 상기 장치는 이전에 기술된 센서 배열을 통해 화학 반응에 대해 모니터링될 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 장치의 하나 또는 그 이상의 영역의 하나 또는 그 이상의 웰에 침착되는 시약은 사전-결정된 배열로 침착된다.
일부 구체예에서, 다음을 포함하는 방법이 제공된다:
제 1 영역, 제 2 영역 및 제3 영역이 독립적으로 하나 또는 그 이상의 웰을 포함하는, 상기 제 1 영역, 제 2 영역 및 제3 영역 사이에 적어도 한 유체 경로를 포함하는 장치의 유체 경로에 샘플 유체를 제공하고;
제 2 영역의 하나 또는 그 이상의 웰이 증폭된 유체로 피복되도록 제 1 영역으로부터의 증폭된 유체로 제 2 영역을 충전하고;
하나 또는 그 이상의 웰이 증폭된 유체의 적어도 일부 유체에 의해 습윤된 상태로 유지되도록 제 2 영역으로부터 증폭된 유체를 배출시키고;
제3 영역의 하나 또는 그 이상의 웰이 이 유체로 피복되도록 제 2 영역으로부터 배출된 유체로 제3 영역을 충전하고; 그리고
하나 또는 그 이상의 웰이 이 유체의 적어도 일부 유체에 의해 습윤된 상태로 유지되도록 제3 챔버로부터 유체를 배출시킨다.
본 방법의 일부 구체예에서, 유체 경로는 밸브가 없을 수 있다.
본 방법의 일부 구체예에서, 비워진 제 2 영역은 소수성 물질로 충전될 수 있다.
본 방법의 일부 구체예에서, 비워진 제3 영역은 소수성 물질로 충전될 수 있다.
본 방법의 일부 구체예에서, 소수성 물질은 제 2 영역 및 제3 영역과 유체 연통하는 오일 챔버로부터 공급될 수 있다.
본 방법의 일부 구체예에서, 샘플 유체는 구불구불한 방식으로 유체 경로를 따라 전송될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 방법은 가열 및 냉각 사이클을 제 1 영역, 제 2 영역 또는 제3 영역 중 하나 또는 그 이상의 영역에 적용하는 것을 더 포함할 수 있다.
당업자는 용어 '유추'가 사용되는 경우, 예를 들어 '특정 서열의 부재의 존재를 유추한다'는 A2, 또는 A2의 복사체, 또는 A2의 영역 또는 A2 영역의 복사체의 부재의 존재에 기초하여 특정 특징의 존재 또는 부재를 결정하는 것을 지칭한다는 것을 이해할 것이다.
본 발명의 다양한 추가 측면 및 구체예가 본 개시내용을 고려하여 당업자에게 명백할 것이다.
본 명세서에서 사용되는 "및/또는"은 서로를 포함하거나 또는 포함하지 않는 2개의 특정된 특징 또는 구성요소 각각의 특정 개시로 간주되어야 한다. 예를 들어, "A 및/또는 B"는 각각이 본원에서 개별적으로 설명된 것처럼, 각각의 (i) A, (ii) B 및 (iii) A와 B의 특정 개시로 간주되어야 한다.
문맥에서 달리 지시되지 않는 한, 위에 기재된 특징들의 설명 및 정의는 본 발명의 임의의 특정 측면 또는 구체예로 한정되지 않고, 기재되는 모든 측면 및 구체예에 동일하게 적용된다.
본 발명이 여러 구체예를 참조하여 예로서 설명되었지만, 개시된 구체예로 한정되지 않고 대안적인 구체예가 첨부된 청구범위에 정의된 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 구성될 수 있다는 것이 당업자에 의해 추가로 이해될 것이다.
실시예 1 - 단순화된 프로토콜
이를 위해, 그리고 다음 섹션에서, 본 발명의 구체예가 예시되고, 각각 프로토콜 1 내로 5로 지칭된다.
도 1은 상이한 프로토콜들의 개요를 제공한다.
아래 표는 각 프로토콜을 수행하는 데 걸리는 시간의 개요를 나타낸다:
한 구체예에서, TIPP는 본 발명의 프로토콜, 방법, 키트 및/또는 장치 중 어느 하나에 존재하지 않는다.
한 구체예에서, 5'-3' 엑소뉴클레아제는 본 발명의 프로토콜, 방법, 키트 및/또는 장치 중 어느 하나에도 존재하지 않는다.
아래 표는 각 프로토콜에 사용된 효소의 개요를 나타낸다:
한 구체예에서, 피로포스파타제의 존재는 선택적이다.
한 구체예에서, 5'-3' 엑소뉴클레아제의 존재는 선택적이다.
한 구체예에서, UDG의 존재는 선택적이다.
나타난 바와 같이, 본 발명자들은 필요한 효소의 총 수를 줄임으로써 본 방법의 비용과 복잡성을 저감하였다. 놀랍게도, 본 발명자들은 5'-3' 엑소뉴클레아제 첨가를 사전-증폭 단계로부터 프로토콜의 피로인산첨가분해/결찰 단계로 이동하면(프로토콜 3-5에서와 같이), 도 2에 나타낸 바와 같이, 더 높은 형광 신호가 발생한다(특정 표적 분석물 시퀀스의 검출을 나타냄)는 것을 밝혀내었다.
실시예 2: 피로인산첨가분해 (PPL) 효소
본 발명자들은 일련의 상이한 PPL 효소를 사용하여 본 발명의 프로토콜 3의 방법을 테스트했으며, 그 결과는 도 3에서 확인할 수 있으며, 도 3(A)는 Mako, Klenow 및 Bsu를 사용하는 1% MAF T790M의 검출을 나타낸다. 도 3(B)는 다양한 PPi 농도 범위에서 Bst LF를 사용하는 0.5% MAF T790M의 검출을 나타낸다.
본 발명자들은 다양한 범위의 PPL 효소를 사용하여 본 발명의 프로토콜 4의 방법을 테스트했으며, 그 결과는 도 4에서 확인할 수 있다.
실시예 3: 프로토콜 1 대 프로토콜 4
본 발명자들은 프로토콜 1 및 프로토콜 4를 모두 사용하여, 도 5에서 확인할 수 있는, 0.5%, 0.10% 및 0.05% MAF에서 Exon19 del_6223을 검출했다. 도시된 바와 같이, 형광 피크는 프로토콜 4를 사용할 때 더 크다.
실시예 4: 프로토콜 4 - 감도
본 발명자들은 프로토콜 4에 따라 도 6에 도시된 바와 같이 0.10%, 0.50% 및 1% MAF에서 EGFR 엑손 20 T790M 돌연변이를 검출하였다.
실시예 5: 프로토콜 4 - RCA 동안 엑소뉴클레아제 분해 단계가 필요한가?
본 발명자들은 RCA 동안 엑소뉴클레아제 분해 단계가 필수적이지 않다는 것을 입증하였다. 그러나, 엑소뉴클레아제 분해 단계가 생략되면, RCA에서 검출 가능한 신호가 나중에 검출된다. 도 7은 RCA 단계에서 엑소뉴클레아제의 존재 하 및 부재 하에 1% MAF에서 EGFR 엑손 20 T790M의 검출을 나타낸다.
실시예 6: 프로토콜 4 - PPL:RCA 혼합 비율
본 발명자들은 PPL:RCA 혼합 비율이 0.5% MAF EGFR 엑손 20 T790M에 대해 검출된 신호의 강도에 어떤 영향을 미치는지 조사하였으며, 그 결과는 도 8에 나타낸다. 도시된 바와 같이, 1:2 PPL:RCA 믹스의 비는 신호 강도가 가장 낮지만 가장 빠른 시점에 나타난다. 이것에 이어서, 신호 강도가 더 큰 1:4 PPL:RCA 믹스가 시간적으로 밀접하게 이어진다. 가장 큰 신호 강도는 반응의 가장 늦은 시점에서 1:8 PPL:RCA 믹스에 대해 나타난다.
실시예 7: 프로토콜 4 - 염료 선택
본 발명자들은 RCA 동안 사용된 염료가 최적화될 수 있는지 여부를 조사하였다. 도 9는 SybrGreenI(50℃ 및 60℃) 및 Syto82(50℃ 및 60℃)를 사용하여 프로토콜 4에 따라 수행한 비교 실험 결과를 나타낸다. Syto82 염료를 사용하면 RCA를 50℃의 더 낮은 온도에서 실행할 수 있는 반면, SybrGreenI는 60℃의 더 높은 온도를 필요로 한다. 반응 혼합물에 프로테이나제 K의 첨가하는 것을 제거하는 프로토콜 5에는 더 낮은 RCA 온도가 필요하다. 본 발명의 방법을 사용하는 검출을 위해, 표적 폴리뉴클레오티드 영역으로 구성된 핵산의 적어도 하나의 단일-가닥으로 된 분석물을 제조하는 데 사용되는 증폭 효소는 작동하려면 50℃ 초과의 온도를 필요로 한다. SybrGreenI의 사용은 60℃의 반응 온도를 필요로 하므로, RCA 전에 증폭 효소를 실활시키기 위해 본 방법 동안 특정 시점에 프로테이나제 K를 첨가해야 한다.
더 낮은 RCA 온도는 본 발명의 방법이 qPCR 대신 플레이트 판독기에서 수행되도록 할 수 있다.
Syto82를 이용하는 반응은, 도 9에서 확인할 수 있듯이, 더 빠르며, Syto82의 경우 형광의 총량이 더 낮지만 - 이는 더 높은 농도의 Syto82 염료를 사용함으로써 완화될 수 있다.
실시예 8: 프로토콜 4 - BST L.F. 대 BST 2.0 WS
본 발명자들은 0.5% MAF EGFR 엑손 20 T790M 돌연변이를 검출하는 프로토콜 4에 따라 RCA에 대해 2개의 상이한 효소, BST L.F. 및 BST 2.0 WS의 사용을 조사하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었으며, BST 2.0 WS에서 반응이 가장 빠른 것을 확인할 수 있다. BST 2.0 WS는 반응 속도에 도움이 되는 dUTP를 통합하도록 설계되어 있다. BST L.F.와 BST 2.0 WS 간에는 달성된 총 신호 강도에서 무시해도 될 정도의 차이가 있다. 뉴 일글랜드 바이오랩스(New England Biolabs; NEB)에서 제공한 설명에 따르면 BST 2.0 WS는 45℃ 초과에서만 더 안정적이고 활성적일 것이다.
실시예 9: 신호 검출에 대한 PPL 효소의 영향
본 발명자들은 상이한 PPL:RCA 반응 혼합물 비율에서 RCA 반응에 대한 상이한 PPL 효소의 영향을 조사하였다. 그 결과는 도 11(A) 1:4 PPL:RCA 및 도 11(B) 1:8 PPL:RCA에서 확인할 수 있다. BST를 제외한, 모든 PPL 효소는 1:4 PPL:RCA 비율에서 RCA 반응에 영향을 미친다. 1:8의 PPL:RCA 비율에서 BST와 Klenow는 RCA 반응에 영향을 미치지 않는다.
실시예 10: 단일 뉴클레오티드 미스매치에 대항하는 피로인산첨가분해, 결찰 특이성
하기 뉴클레오티드 서열을 갖는 단일-가닥으로 된 제 1 올리고뉴클레오티드 1(서열 식별 번호: 1)을 준비하였다:
5'-/5Phos/A*T*G*TTCGATGAGCTTTGACAATACTTGAAGCTCGCAGATATAGGATGTTGCGATAGTCCAGGAGGCTGC-3'
하기 뉴클레오티드 서열을 갖는 단일-가닥으로 된 결착 올리고뉴클레오티드 2(서열 식별 번호: 2)를 준비하였다:
5'-TGTCAAAGCTCATCGAACATCCTGGACTATGTCTCC-3'
여기서, A, C, G, 및 T는 DNA의 관련 특징적인 핵염기를 보유하는 뉴클레오티드를 나타내고,
/5Phos/는 5' 단부 포스페이트를 나타냄
*는 포스포로티오에이트 결합을 나타냄
또한, 5' 에서 3' 방향으로 하기 뉴클레오티드 서열을 갖는 한세트의 단일-가닥으로 된 올리고뉴클레오티드 3-4(서열 식별 번호: 3-4)도 준비하였다:
서열 식별 번호: 3: TGCTGGGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCATCACGCAGCTCATGCCCTTCGGCAGCCTCCTGGACTATG
서열 식별 번호: 4: TGCTGGGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCATCACGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATG
여기서, 올리고뉴클레오티드 3은 올리고뉴클레오티드 1의 3' 단부에서 17개 염기에 상보적인 17개 염기 영역을 포함하고, 올리고뉴클레오티드 4는 위치 3에서 단일 뉴클레오티드 미스매치가 있는 동일한 영역을 포함한다. 서열 식별 번호: 3 및 4는 각각 C797S 돌연변이가 있는/없는 인간 EGFR 유전자의 일부분이다.
이어서, 하기 제형으로부터 유래된 것에 상응하는 조성을 갖는 제 1 반응 혼합물을 준비하였다:
0.5uL 20x 완충제 pH 7.0
0.25 uL 5x 완충제 pH 8.0
0.25 uL 5x HF 완충제
0.2uL 올리고뉴클레오티드 1, 1000 nM
0.3 uL 올리고뉴클레오티드 2, 1000 nM
1uL 올리고뉴클레오티드 2(500 nM) 또는 올리고 2 및 올리고 3(각각 500 nM 및 0.5 nM)의 혼합물,
0.3U Klenow 단편 엑소-(NEB)
0.01uL 무기 피로포스페이트, 10mM
0.0132 U 아피라제(예: NEB)
1 U 대장균(E. coli) DNA 리가제(예: NEB)
물로 10uL를 채움
여기서 상기 20x 완충제는 다음 혼합물을 포함하였다:
200uL Tris 아세테이트, 1M, pH 7.0
342.5uL 수성 마그네슘 아세테이트, 1M
120uL 수성 칼륨 아세테이트, 5M
50uL 트리톤 X-100 계면활성제(10%)
물로 1mL를 채움
여기서 상기 5x 완충제는 다음 혼합물을 포함하였다:
50uL 트리즈마(Trizma) 아세테이트, 1M, pH 8.0
25uL 수성 마그네슘 아세테이트, 1M
25uL 수성 칼륨 아세테이트, 5M
50uL 트리톤 X-100 계면활성제(10%)
물로 1mL를 채움
이어서 올리고뉴클레오티드 1의 피로인산첨가분해, 그 다음 결찰을 통한, 원형화를, 혼합물을 45℃에서 15분 동안 배양함으로써 수행하며, 생성된 생성물 혼합물을 증폭 반응에 사용하였다(실시예 11).
실시예 11: 원형화된 프로브의 증폭
하기 뉴클레오티드 서열을 갖는 한 쌍의 단일-가닥으로 된 올리고뉴클레오티드 프라이머 1(서열 식별 번호: 5) 및 2(서열 식별 번호: 6)를 준비하였다:
1: TCGCAACATCCTATATCTGC
2: TGAGCTTTGACAATACTTGA
여기서 A, C, G 및 T는 DNA의 관련 특징적인 핵염기를 보유하는 뉴클레오티드를 나타낸다.
이어서, 하기 제형으로부터 유래된 것에 상응하는 조성을 갖는 제 2 반응 혼합물을 준비하였다:
3 uL 10x Thermopol 완충제
3.2 U BST 2.0 WS
0.32 uL 올리고뉴클레오티드 1, 10uM
0.32 uL 올리고뉴클레오티드 2, 10uM
1.125 uL Syto82, 30 uM
0.165 U 무기 피로포스파타제
1.2 uL dNTPs 믹스, 10 mM
1.25 uL 실시예 10의 반응 혼합물
물로 11.25 uL를 채움
여기서 10x Thermopol 완충제는 다음 혼합물을 포함하였다:
200 uL 트리스-HCl pH=8.8, 1M
100 uL NH4)2SO4, 1M
100 uL mM KCl, 1M
20 mM MgSO4, 1M
10 uL 트리톤(Triton®) X-100, 10%
물로 1mL를 채움
이어서, 반응 믹스를 50℃에서 40분 동안 배양한 다음, 생성된 반응 생성물을 실시간 형광에 의해 분석하였다. 그 결과는 도 12에 나타내었다. 이 분석으로부터 올리고뉴클레오티드 3 및 4가 모두 존재할 때, 형광 신호가 반응에서 더 빨리 나타났음을 확인할 수 있고, 이는 올리고뉴클레오티드 3의 피로인산첨가분해 및 결찰이 제 1 반응 혼합물에서 발생했음을 나타낸다.
실시예 12: Sunrise Primer를 사용하는 다색 검출
1. 표적 올리고 희석액
WT 올리고 희석액은 다음 성분으로 구성된다:
0.5x A7 완충제
0.5x Phusion U 완충제
200 nM WT 올리고뉴클레오티드(서열 식별 번호: 7)
총 부피: 5 uL
T790M 및 C797S 1% AF 돌연변이 올리고 믹스:
0.5x A7 완충제
0.5x 퓨전 U 완충제
100 nM WT 올리고뉴클레오티드(서열 식별 번호: 7)
2 nM T790M 올리고뉴클레오티드(서열 식별 번호: 8)
2 nM C797S_2389 올리고(서열 식별 번호: 9)
총 부피: 5 uL
WT 올리고뉴클레오티드(서열 식별 번호: 7):
5'-CATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCATCACGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACACAAAGACAATAT-3'
T790M 올리고뉴클레오티드(서열 식별 번호: 8):
5'-CATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCATCATGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACACAAAGACAATAT-3'
C797S_2389 올리고뉴클레오티드(서열 식별 번호: 9):
5'-CATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCATCACGCAGCTCATGCCCTTCGGCAGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACACAAAGACAATAT-3'
1xA7 조성
트리스 아세테이트 pH=8.0 10mM
칼륨 아세테이트 25mM
마그네슘 아세테이트 5mM
트리톤-X 0.01%
PhusionU 완충제
PhusionU 완충제 조성은 공개적으로 입수할 수 없다.
2. PPL
다음에 상응하는 혼합물을 준비하였다:
1xBFF1
37.5 U/mL Mako DNA 폴리머라제(3' → 5' 엑소-)
100 U/mL 대장균(E.coli) 리가제
1.2 U/mL 아피라제
0.6 mM PPi
20 nM T790M 프로브
20 nM C797S_2389 프로브
30 nM T790M 스플린트 올리고뉴클레오티드
30 nM C797S_2389 스플린트 올리고뉴클레오티드
5 uL의 WT 또는 1% AF 돌연변이 희석액 항목 1.
총 부피 10 uL
그런 다음 이 혼합물을 41℃에서 30분 동안 항온처리했다.
1xBFF1 조성
트리스 아세테이트 pH=7.0 10mM
칼륨 아세테이트 30mM
마그네슘 아세테이트 17.125mM
Triton-X 0.01%
T790M 프로브(서열 식별 번호 : 10):
5'-/5Phos/A*T*G*TTCGATGAGCTTTGACAATACTTGAGCACGGCAGATATAGGATGTTGCGAAGGGCATGAGCTGCATGATGAGCTG-3'
C797S_2389 프로브(서열 식별 번호 : 11 ):
5'-/5Phos/A*T*G*TTCGATGAGCTTTGACAATACTTGAAGCTCGCAGATATAGGATGTTGCGATAGTCCAGGAGGCTGC-3'
여기서 *는 포스포로티오에이트 결합을 나타낸다.
3. TIPP
다음에 상응하는 혼합물을 준비하였다:
1xA7
66.6 U/mL TIPP
10 uL 항목 2.로부터의 혼합물
총 부피: 20 uL
그런 다음 이 혼합물을 25℃에서 5분, 95℃에서 5분 동안 항온처리했다.
4. 결찰
다음에 상응하는 혼합물을 준비하였다:
1xA7
100 U/mL E.콜리 리가제
20 uL 항목 3.으로부터의 혼합물
10 nM T790M 스플린트 올리고뉴클레오티드
10 nM C797S_2389 스플린트 올리고뉴클레오티드
총 부피: 30 uL
그런 다음 이 혼합물을 37℃에서 10분, 95℃에서 10분 동안 배양했다.
T790M 스플린트 올리고뉴클레오티드(서열 식별 번호: 12):
5'- TGTCAAAGCTCATCGAACATGCCCTTCGCAACATCT-3'
C797S_2389 스플린트 올리고뉴클레오티드(서열 식별 번호: 13):
5'- TGTCAAAGCTCATCGAACATTCCTGGACTATCGCAT-3'
5. 엑소뉴클레아제 처리
다음에 상응하는 혼합물을 준비하였다:
1xA7
100 U/mL 대장균 리가제
30 uL 항목 4.로부터의 혼합물
625 U/mL의 엑소뉴클레아제 III
62.5 U/mL T5 엑소뉴클레아제
총 부피: 40 uL
그런 다음 이 혼합물을 30℃에서 5분, 95℃에서 5분 동안 항온처리했다.
6. RCA
다음에 상응하는 혼합물을 준비하였다:
1x Thermopol 완충제(53.2 mM 트리스-HCl, 26.6 mM (NH4)2SO4, 26.6 mM KCl, 5.32 mM MgSO4, 0.266% Triton® X-100, pH 8.8)
0.2 uM 프라이머 믹스 1
0.4 uM 리버스 프라이머
533.3 U/mL BST L.F.
0.4 mM dNTPs
10 uL의 항목 5.로부터의 반응 혼합물
총 부피 15 uL
프라이머 믹스 1:
Cy5 프라이머(서열 식별 번호: 14):
5'-/Qusar670/ACGCCTGGTTACCGAGCCAGGTTCGCACATGTAGGCTCGGTAACCAGGCG/BHQ2/ACATCCTATATCTGCCGTGC-3'
TexasRed 프라이머(서열 식별 번호: 15):
5'-/TexasRed/ACGCCTGGTTACAGGTTCGCACATGTAGTAACCAGGCG/BHQ2/CAACATCCTATATCTGCGAG-3'
여기서 /BHQ2/는 Black Hole Quencher를 나타낸다.
리버스 프라이머(서열 식별 번호: 16):
5'-ATGTTCGATGAGCTTTGACA-3'
그런 다음 혼합물을 60℃에서 90분 동안 항온처리하였다. 형광 판독값을 매 1분마다 취했다. Cq는 Bio-rad 기계에서 제공한 자동 임계값을 기준으로 하여 얻었다. 그 결과는 도 13에서 확인할 수 있다.
실시예 13: Molecular Zippers를 사용하는 다색 검출
1. 표적 올리고 희석액
WT 올리고 희석액은 다음 성분으로 구성된다
0.5x A7 완충제
0.5x Q5U 완충제
100 nM WT 올리고뉴클레오티드(서열 식별 번호: 17)
총 부피: 1.25 uL
G719X_6239, G719X_6252, G719X_6253 0.5% AF 돌연변이 올리고뉴클레오티드 믹스:
0.5x A7 완충제
0.5x Q5U 완충제
100 nM WT 올리고뉴클레오티드(서열 식별 번호: 17)
0.5 nM G719X _6239 올리고뉴클레오티드(서열 식별 번호: 18)
0.5 nM G719X _6252 올리고뉴클레오티드(서열 식별 번호: 19)
0.5 nM G719X _6253 올리고뉴클레오티드(서열 식별 번호: 20)
총 부피: 1.25uL
WT 올리고뉴클레오티드(서열 식별 번호: 17):
5'-CCCAACCAAGCTCTCTTGAGGATCTTGAAGGAAACTGAATTCAAAAAGATCAAAGTGCTGGGCTCCGGTGCGTTCGGCACGGTGTATAAGGTAAGGTCCC-3'
G719X_6239 올리고뉴클레오티드(서열 식별 번호: 18):
5'-CCCAACCAAGCTCTCTTGAGGATCTTGAAGGAAACTGAATTCAAAAAGATCAAAGTGCTGGCCTCCGGTGCGTTCGGCACGGTGTATAAGGTAAGGTCCC-3'
G719X_6252 올리고뉴클레오티드(서열 식별 번호: 19):
5'-CCCAACCAAGCTCTCTTGAGGATCTTGAAGGAAACTGAATTCAAAAAGATCAAAGTGCTGAGCTCCGGTGCGTTCGGCACGGTGTATAAGGTAAGGTCCC-3'
G719X_6253 올리고뉴클레오티드(서열 식별 번호: 20):
5'-CCCAACCAAGCTCTCTTGAGGATCTTGAAGGAAACTGAATTCAAAAAGATCAAAGTGCTGTGCTCCGGTGCGTTCGGCACGGTGTATAAGGTAAGGTCCC-3'
1xA7 조성
트리스 아세테이트 pH=8.0 10mM
칼륨 아세테이트 25mM
마그네슘 아세테이트 5mM
Triton-X 0.01%
Q5U 완충제
Q5U 완충제 조성은 공개적으로 입수할 수 없다.
2. 피로인산첨가분해(PPL) 및 결찰
다음에 상응하는 혼합물을 준비하였다:
1xBFF1
10 U/mL Klenow(엑소-)
100 U/mL 대장균 리가제
1.2 U/mL 아피라제
100 U/mL 람다 엑소
0.25 mM PPi
6.6 nM G719X_6239 프로브 올리고뉴클레오티드(서열 식별 번호: 21)
6.6 nM G719X_6252 프로브 올리고뉴클레오티드(서열 식별 번호: 22)
6.6 nM G719X_6253 프로브 올리고뉴클레오티드(서열 식별 번호: 23)
30 nM 스플린트 올리고 뉴클레오티드(서열 식별 번호: 24)
1.25 uL의 항목 2.로부터의 혼합물
총 부피 10 uL
그런 다음 이 혼합물을 45℃에서 15분 동안 항온처리했다.
1xBFF1 조성
트리스 아세테이트 pH=7.0 10mM
칼륨 아세테이트 30mM
마그네슘 아세테이트 17.125mM
트리톤-X 0.01%
G719X_6239 프로브 올리고뉴클레오티드(서열 식별 번호: 21):
5'-/5Phos/A*T*G*TTCGATGAGCTTTGACAATACTTGACATGCGCAGATATAGGATGTTGCGAAACGCACCGGAGGCCAGCACTTTG-3'
G719X_6252 프로브 올리고뉴클레오티드(서열 식별 번호: 22):
5'-/5Phos/A*T*G*TTCGATGAGCTTTGACAATACTTGACATGCCGAGTAATGAGAGTTTCGCAAACGCACCGGAGCTCAGCACTTTG-3'
G719X_6253 프로브 올리고뉴클레오티드(서열 식별 번호: 23):
5'-/5Phos/A*T*G*TTCGATGAGCTTTGACAATACTTGACATGCGAGCAATTAGGTAGTGTCGTAACGCACCGGAGCACAGCACTTTG-3'
스플린트 올리고뉴클레오티드(서열 식별 번호: 24):
5'-TGTCAAAGCTCATCGAACATCCGGTGCGTTCGGCAA-5'
여기서 *는 포스포로티오에이트 결합을 나타낸다.
3. 검출 - RCA
다음에 상응하는 혼합물을 준비하였다:
2.66x Thermopol 완충제(53.2 mM 트리스-HCl, 26.6 mM (NH4)2SO4, 26.6 mM KCl, 5.32 mM MgSO4, 0.266% 트리톤® X-100, pH 8.8)
0.28 uM 염료 프라이머 믹스 1
0.56 uM 소광제 프라이머 1
0.28 uM 소광제 프라이머 2
0.84 uM 리버스 프라이머
568.8 U/mL BST 2.0 WarmStart
14.67 U/mL TIPP
1.06 mM dNTPs
1.25 uL의 항목 2.로부터의 반응 혼합물
총 부피 11.25 uL
염료 프라이머 믹스 1은 다음으로 구성된다.
염료 프라이머 1(서열 식별 번호: 25):
5'-/5Cy5/A*CTGACCAGCTCCATGACAATCGCTGTCGCCATGATCGATCGCAACATCCTATATCTGC-3'
염료 프라이머 2(서열 식별 번호: 26):
5'-/5TEX615/A*CTGACCAGCTCCATGACAATCGCTGTCGCCATGATCGATGCGAAACTCTCATTACTCG-3'
염료 프라이머 3(서열 식별 번호: 27):
5'- /5HEX615/T*ACGACCGACTCACTCCTTACAGCAGTCCGCAGTATGCTACGACACTACCTAATTGCTC-3'
여기서 *는 포스포로티오에이트 결합을 나타내고, /5Cy5/는 5' 단부의 Cy5 염료를 나타내고, /5TEX615는 5' 단부의 TEX 염료를 나타내고, /5HEX/는 5' 단부의 Hex 염료를 나타낸다.
소광제 프라이머 1(서열 식별 번호: 28):
5'-TCGATCATGGCGACAGCGATTGTCATGGAGCTGGTCAGT/3IAbRQSp/-3'
여기서 /3IAbRQSp/는 3' Iowa Black® RQ 소광제를 나타낸다.
소광제 프라이머 2(서열 식별 번호: 29):
5'-AGCATACTGCGGACTGCTGTAAGGAGTGAGTCGGTCGTA/3IABkFQ/-3'
여기서 /3IAbkFQ/는 3' Iowa Black® FQ 소광제를 나타낸다.
리버스 프라이머(서열 식별 번호: 30):
5'-T*G*AGCTTTGACAATACTTGA-3'
여기서 *는 포스포로티오에이트 결합을 나타낸다.
그런 다음 혼합물을 58℃에서 150분 동안 항온처리하였다. 형광 판독값을 매 1분마다 취했다. 그 결과는 도 14에서 확인할 수 있다.
실시예 14: 피로인산첨가분해 및 표적에 대한 결찰
1. 올리고뉴클레오티드 희석 제제
0.5xA7 및 0.5xQ5 완충제에서 올리고뉴클레오티드의 희석액을 준비했다:
WT 올리고뉴클레오티드 200nM
+/-돌연변이 올리고뉴클레오티드 500pM
총 부피 1.25 uL
WT 올리고뉴클레오티드(서열 식별 번호 31):
5'-CTGCTGGGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCATCACGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGG-3'
돌연변이 올리고뉴클레오티드(서열 식별 번호 32):
5'-CTGCTGGGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCATCATGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGG-3'
2. 피로인산첨가분해 및 결찰
다음으로 구성된 PPL 혼합물을 준비했다:
1xBFF1
10 U/mL Klenow(엑소-)
100 U/mL 대장균 리가제
1.2 U/mL 아피라제
100 U/mL 람다 엑소
0.25 mM PPi
20 nM 프로브 A0
1.25 uL의 항목 1.로부터의 올리고
총 부피 10 uL
프로브 A0(서열 식별 번호 33):
5'-/5Phos/A*G*C*TGCATCTGAGCTTTGACAATACTTGAGCACGGCAGATATAGGATGTTGCGAAGGGCATGAGCTGCATGATG -3'
여기서 * 포스포로티오에이트 결합
1xBFF1 조성
트리스 아세테이트 pH=7.0 10mM
칼륨 아세테이트 30mM
마그네슘 아세테이트 17.125mM
트리톤-X 0.01%
1xA7 조성
트리스 아세테이트 pH=8.0 10mM
칼륨 아세테이트 25mM
마그네슘 아세테이트 5mM
트리톤-X 0.01%
Q5 완충제
Q5 완충제 조성은 공개적으로 입수할 수 없다.
생성된 혼합물을 45℃에서 15분 동안 항온처리하였다.
3. 검출 - RCA
다음으로 이루어진 RCA 혼합물을 준비하였다:
2.66x 써모폴 완충제(53.2 mM 트리스-HCl, 26.6 mM (NH4)2SO4, 26.6 mM KCl, 5.32 mM MgSO4, 0.266% 트리톤-X, pH 8.8)
0.28 uM 프라이머 믹스
284.4 U/mL BST 2.0 WarmStart
14.67 U/mL TIPP
1.06 mM dNTPs
Syto82 염료 3uM
1.25 uL의 항목 2로부터의 반응물
총 부피 11.25uL
프라이머 믹스:
Fwd(서열 식별 번호 34): 5'-T*C*GCAACATCCTATATCTGC-3'
Rev(서열 식별 번호 35): 5'-ATGTTGCGAAGGGCATATGT-3'
생성된 혼합물을 50℃에서 70분 동안 항온처리하였다.
형광 판독값을 매 1분마다 취했다. 그 결과는 도 16에서 확인할 수 있다.
실시예 15: 본 발명 및 구체예의 추가로 선택된 적용
KRAS 검출
KRAS 유전자는 세포 증식을 조절하는데, 여기에 돌연변이가 발생하면 음성 신호 전달이 방해되어 세포가 계속적으로 증식할 수 있고, 종종 암으로 발전한다. 단일 아미노산 치환, 및 특히 단일 뉴클레오티드 치환은 폐선암, 점액선종, 췌장관암 및 결장직장암과 같은 다양한 암과 관련된 활성화 돌연변이의 원인이다. KRAS 돌연변이는 예를 들어 폐암에서 전조성(prognostic) 바이오마커로 사용되어 왔다.
KRAS의 드라이버 돌연변이는 인간 암의 최대 20%와 관련이 있으며, 이 돌연변이 및 관련 질환(들)에 대항하여 개발 중인 표적 치료법이 있는데, 이러한 치료법의 일부 비-제한적 목록은 아래 표에서 확인할 수 있다.
KRAS 돌연변이의 존재는 EGFR 억제제인 파니투무맙(panitumumab; Vectibix) 및 세툭시맙(cetuximab; Erbitux)에 대한 반응이 매우 나쁘다는 것을 반영하는 것으로 밝혀졌다. KRAS를 인코딩하는 유전자에서의 활성화 돌연변이는 결장직장암의 30 ~ 50%에서 발생하며, 연구에 따르면 KRAS 유전자의 이 돌연변이 버전을 발현하는 종양의 환자는 파니투무맙 및 세툭시맙에 반응하지 않을 것으로 나타난다. 야생형 KRAS 유전자의 존재는 환자가 이러한 약물에 반응할 것이라고 보장하지는 않지만, 연구에 따르면 세툭시맙은 야생형 KRAS 종양이 있는 전이성 결장직장암 환자에게 상당한 효능이 있는 것으로 나타났다. KRAS 돌연변이(야생형 EGFR)에 대해 양성인 폐암 환자는, KRAS 돌연변이를 보유하지 않는 환자의 60% 응답률과 비교하여, EGFR 길항제인 에를로티닙 또는 게피티닙에 대해 응답률이 5% 이하로 추정된다.
결장직장암에서 세툭시맙 치료법(항-EGFR 치료법)에 대한 획득 내성의 빈번한 추진요인인 KRAS 돌연변이의 출현(활성화 또는 과발현)을 조기에 검출하면, 치료의 변경(예를 들어, 미토겐-활성화된 단백질 키나제 키나제 [MEK] 억제제의 조기 개시)이 내성을 지연시키거나 역전시키는 것이 가능해지므로, 본 발명의 방법은 환자의 KRAS 상태를 빠르고 저렴하게 검출할 수 있게 한다는 장점이 있다.
돌연변이의 비-제한적 목록은 G12D, G12A, G12C, G13D, G12V, G12S, G12R, A59T/E/G, Q61H, Q61K, Q61R/L, K117N 및 A146P/T/V이다.
돌연변이의 추가의 비제한적 목록을 아래 표에 나타낸다:
BRAF 검출
BRAF는 세포 성장의 지시에 관여하는 세포 내의 신호의 전송에 관련된 B-Raf라고 불리는 단백질을 인코딩하는 인간 유전자이다. 이것은 일부 인간 암에서 돌연변이가 되는 것으로 나타났다. B-Raf는 성장 신호 전달 단백질 키나제의 Raf 키나제 패밀리의 구성원이며, 다른 무엇보다도 세포 분열에 영향을 미치는 MAP 키나제/ERK 신호 전달 경로를 조절하는 역할을 한다.
다른 특정의 유전된 BRAF 돌연변이는 선천적 기형을 유발한다.
인간 암과 관련된 BRAF 유전자의 30개를 넘는 돌연변이가 확인되었다. 이들 사례의 90%에서, 티민은 뉴클레오티드 1799에서 아데닌으로 대체된다. 이것은 인간 암에서 발견되는 활성화 세그먼트에서 코돈 600에서 발린(V)이 글루타메이트(E)로 대체되도록 한다(이제 V600E로 지칭됨). 이 돌연변이는 다음에서 폭넓게 관찰되었다:
- 결장직장암
- 흑색종
- 유두상 갑상선암
- 비-소 세포 폐암
- 법랑모 세포종(Ameloblastoma)
발견된 다른 돌연변이의 비-제한적인 목록은 다음과 같다: R461I, I462S, G463E, G463V, G465A, G465E, G465V, G468A, G468E, N580S, E585K, D593V, F594L, G595R, L596V, T598I, V599D, V599E, V599K, V599R, V600K 및 A727V.
BRAF 돌연변이에 의해 유발된 암을 치료하는 약물이 개발되었고, 베무라페닙(vemurafenib)과 다브라페닙(dabrafenib)이 말기 흑색종 치료제로 FDA 승인되어 있다. 이전의 최고의 화학요법제인 다카르바진(dacarbazine)의 응답률 7-12%에 비교하여, 전이성 흑색종에 대하여 부메라페닙(vumerafenib) 치료에 대한 응답률은 53%이었다.
ERBB2/HER2 검출
CD340(분화 클러스터 340)로도 알려진 인간 상피 성장 인자 수용체 2(HER2), 프로토-종양 유전자 Neu, Erbb2(설치류) 또는 ERBB2(인간)는 ERBB2 유전자에 의해 인코딩되는 단백질이다. 이 종양 유전자의 증폭 또는 과발현은 공격적인 유형의 유방암의 진행에 중요한 역할을 한다. ERBB2 유전자의 과발현은 또한 난소암, 위암, 폐선암, 그리고 공격적인 형태의 자궁암 및 타액선 도관암의 30%에서 발생하는 것으로 알려져 있다. 과발현이 없을 때 수용체의 리간드-비의존성 파이어링(firing)을 일으키는 구조적 변화도 확인되었다.
이 돌연변이 및 그와 관련된 질환(들)에 대항하여 승인 및 개발 중인 수많은 표적 치료법이 있으며, 이러한 일부 치료법의 비-제한적 목록은 아래 표에서 확인할 수 있다:
HER2 검사는 예후를 평가하고, 치료에 대한 반응을 감시하며, 표적 치료법(트라스투주맙 등)에 대한 적합성을 결정하기 위해 유방암 환자에서 일상적으로 수행된다. 트라스투주맙은 고가이고 심각한 부작용(심장독성)과 관련이 있기 때문에, HER2+ 환자만 이를 수용하도록 선택되는 것이 중요하고, 따라서 본 발명의 방법은 환자의 HER2 상태를 신속하고 저렴하게 검출할 수 있게 한다는 장점이 있다.
한 구체예에서, ERRB2 엑손 20 삽입 돌연변이의 부재의 존재는 본 발명의 방법을 사용하여 검출된다.
ERBB2 돌연변이의 추가의 비-제한적 목록을 아래 표에 나타낸다:
EML4-ALK 검출
EML4-ALK는 극피동물(echinoderm) 미세소관 관련 단백질-유사 4(EML4) 유전자와 역행성 림프종 키나제(ALK) 유전자의 비정상적인 유전자 융합이다. 이 유전자 융합은, 암세포의 악성 거동을 촉진하고 유지하는 것으로 보이는 EML4-ALK 단백질의 생산으로 이어진다. EML4-ALK 양성 폐암은 세포에 이 돌연변이가 포함된 원발성 악성 폐 종양이다.
이 돌연변이 및 그와 관련된 질환(들)에 대항하여 승인 및 개발 중인 수많은 표적 치료법이 있으며, 이러한 일부 치료법의 비제한적 목록은 아래 표에서 확인할 수 있다.
EML4-ALK 유전자 융합은 비-소 세포 폐암(NSCLC)의 약 5%의 원인이며, 미국에서는 연간 약 9,000건, 세계적으로는 약 45,000건의 신규 사례가 있었다.
EML4-ALK의 수많은 변이체가 있는데, 모든 변이체는 활성 변형에 필요한 EML4 N-말단 부분 및 ALK 엑손 20의 키나제 도메인에서 필수적인 코일드-코일(coiled-coil) 도메인을 갖는다. EML4의 엑손 13과 ALK의 엑손 20의 융합(변이체 1: V1)(이의 검출은 도 20에서 확인할 수 있음), EML4의 엑손 20과 ALK의 엑손 20의 융합(V2), 및 EML4의 엑손 6과 ALK의 엑손 20의 융합(V3)은 보다 일반적인 변이체 중 일부이다. 이러한 상이한 변이체의 임상적 중요성은 최근에야 더 명확해졌다.
V3는 화학요법 및 방사선 치료법과 같은 비-티로신 키나제 억제제(TKI) 치료 후 더 짧은 무진행 생존기간(PFS)을 가질 가능성이 있는 환자의 선택에 적합한 마커로 부상했다. V3가 EML4-ALK의 V1 및 V2에 비해, 1세대 및 2세대 치료 라인을 받은 환자의 더 짧은 PFS 및 더 나쁜 전체 생존기간(OS)과 관련이 있다는 추가 증거가 있다.
또한, V3-양성 환자는 내성 돌연변이의 발달을 통해 1차 및 2차 치료 라인에 대한 내성을 발현하고, 야생형 V3의 더 높은 IC50으로 인해 종양 세포 억제가 불완전해짐으로써 촉진될 가능성이 있는 것으로 밝혀졌다. 불리한 V3의 검출은 보다 적극적인 감시 및 치료 전략이 필요한 환자를 선택하는 데 사용될 수 있다. 3세대 로를라티닙(Lorlatinib)을 V3가 있는 환자에게 투여하면 V1이 있는 환자에 비해 PFS가 더 길어질 수 있으므로, 본 발명의 방법은 환자가 가질 수 있는 변이체를 빠르고 저렴하게 검출할 수 있게 한다는 잠정이 있는 것으로 이해된다.
본 발명의 방법은 내성 돌연변이, 이를 테면, G1202R, G1269A, E1210K, D1203, S1206C, L1196M, F1174C, I1171T, I1171N/S, V1180L, T1151K 및 C1156Y (이에 국한되지 않음) 검출을 추가로 허용한다.
예를 들어, G1202R은 약물 결합의 방해를 일으키고 1세대 및 2세대 ALK 억제제에 대해 높은 수준의 내성을 부여하는 용매-프론트 돌연변이이다. 따라서, 본 발명의 방법은, 이러한 돌연변이를 가질 수 있고, 1세대 또는 2세대가 아닌 3세대 치료의 치료 개시로부터 이익을 얻을 수 있는 환자의 확인을 가능하게 하는 장점이 있다.
EML4-ALK 돌연변이의 추가의 비-제한적 목록을 아래 표에 나타낸다:
EGFR 검출
상피 성장 인자 수용체(EGFR)가 종양 유전자로 확인되면서 폐암에는 게피티닙, 에를로티닙, 아파티닙(afatinib), 브리가티닙(brigatinib), 및 이코티닙(icotinib), 결장암에는 세툭시맙과 같은 표적 치료제가 개발되었다. 그러나, 많은 사람들이 이러한 치료제에 내성을 갖게 된다. 내성의 두 가지 주요 원인은 T790M 돌연변이와 MET 종양 유전자이다.
EGFR 돌연변이는 EGFR 엑손 18-21에서 발생하고 엑손 18, 19 및 21에서 돌연변이가 발생하며 EGFR-TKI(티로신 키나제 억제제)로 치료하기에 적합함을 나타낸다. 엑손 20의 돌연변이(일부 돌연변이 제외)는 종양이 EGFR-TKI 내성이고 EGFR-TKI로 치료하기에 적합하지 않음을 나타낸다.
가장 흔한 두 가지 EGFR 돌연변이는 엑손 19의 짧은 프레임 내 결실과 뉴클레오티드 2573에서 엑손 21의 점 돌연변이(CTG에서 CGG로)이며, 이로 인해 코돈 858(L858R)에서 류신이 아르기닌으로 대체되고, 함께 이 두 돌연변이는 비-소 세포 폐암(NSCLC)에서 모든 EGFR 돌연변이의 ∼90%를 차지한다. NSCLC 환자에서 이러한 돌연변이에 대한 스크리닝은 어떤 환자가 TKIs에 반응할지를 예측하는 데 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 방법은 이러한 돌연변이를 가질 수 있고 TKIs의 치료 개시로부터 이익을 얻을 수 있는 환자의 확인을 가능하게 한다는 장점이 있다. 당업자는 본 발명의 방법이 EGFR 돌연변이 범위의 식별을 가능하게 하며, 이러한 돌연변이의 비포괄적인 목록은 G719X, Ex19Del, S768I, Ex20Ins 및 L861Q임을 이해할 것이다.
돌연변이의 추가의 비제한적 목록을 아래 표에 나타낸다:
ROS1
ROS1은 역형성 림프종 키나제(ALK) 단백질과 구조적으로 유사한 수용체 티로신 키나제(유전자 ROS1에 의해 인코딩됨)이고; 그것은 c-ros 종양 유전자에 의해 인코딩된다.
ROS1 돌연변이의 비-제한적 목록을 아래 표에 나타낸다:
RET 프로토-종양 유전자
RET 프로토-종양 유전자는 세포외 신호 전달 분자의 신경교 세포주-유래 신경영양 인자(GDNF) 패밀리의 구성원에 대한 수용체 티로신 키나제를 인코딩한다.
RET 돌연변이의 비제한적 목록을 아래 표에 나타낸다:
MET 엑손 14
MET 엑손 14 스키핑(skipping)은 NSCLC에서 약 5% 빈도로 발생하며 편평 상피암 및 선암 조직학 모두에서 나타난다.
MET 돌연변이의 비-제한적 목록을 아래 표에 나타낸다:
NTRK 프로토-종양 유전자
NTRK 유전자 융합은 TRK 융합 단백질이라 불리우는 비정상 단백질을 유발하여 암 세포의 성장을 유발할 수 있다. NTRK 유전자 융합은 뇌암, 두경부암, 갑상선암, 연조직암, 폐암, 및 결장암을 포함한 일부 유형의 암에서 발견될 수 있다. 신경영양성 티로신 수용체 키나제 유전자 융합이라고도 한다.
NTRK 돌연변이의 비-제한적 목록을 아래 표에 나타낸다:
패널
본 발명의 한 구체예에서, 각각의 A0가 표적 돌연변이에 상보적인 복수의 프로브 분자(A0)를 포함하는 패널이 제공된다. 상기 돌연변이는 이전에, 또는 이후에 기술되거나 공지된 임의의 돌연변이로부터 선택될 수 있다. 따라서, 당업자는 본 발명의 범위 내에서 이전에 또는 이후에 기술되거나 공지된 임의의 프로토-종양 유전자 또는 종양 유전자에 대한 하나 또는 그 이상의 돌연변이의 검출에 유용할 수 있는 패널이 포함된다는 것을 이해할 것이다.
한 구체예에서, 패널은 각각 특정 표적 돌연변이에 상보적인 5 내지 500개의 개별 프로브 분자를 포함한다. 한 구체예에서, 패널은 각각 특정 표적 돌연변이에 상보적인 5 ~ 400개의 개별 프로브 분자를 포함한다. 한 구체예에서, 패널은 각각 특정 표적 돌연변이에 상보적인 5 ~ 300개의 개별 프로브 분자를 포함한다. 한 구체예에서, 패널은 각각 특정 표적 돌연변이에 상보적인 5 ~ 200개의 개별 프로브 분자를 포함한다. 한 구체예에서, 패널은 각각 특정 표적 돌연변이에 상보적인 5 ~ 100개의 개별 프로브 분자를 포함한다. 한 구체예에서, 패널은 각각 특정 표적 돌연변이에 상보적인 5 ~ 50개의 개별 프로브 분자를 포함한다.
한 구체예에서, 동일한 돌연변이에 특이적인 복수의 프로브 분자가 있을 수 있다. 한 구체예에서, 패널의 각 돌연변이에 특이적인 단지 하나의 프로브 분자가 있을 수 있다.
한 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 프로브가 EGFR 돌연변이에 대해 상보적이고, 하나 또는 그 이상의 프로브가 KRAS 돌연변이에 대해 상보적이며, 하나 또는 그 이상의 프로브가 ERBB2/HER2 돌연변이에 상보적이고, 하나 또는 그 이상의 프로브가 EML4-ALK 돌연변이에 상보적이며, 하나 또는 그 이상의 프로브가 ROS1 돌연변이에 상보적이고, 하나 또는 그 이상의 프로브가 RET 돌연변이에 상보적이며, 하나 또는 그 이상의 프로브가 MET 돌연변이에 상보적인, 복수의 프로브 분자를 포함하는 패널이 제공된다.
한 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 프로브가 EGFR 돌연변이에 대해 상보적일 수 있고, 하나 또는 그 이상의 프로브가 KRAS 돌연변이에 대해 상보적일 수 있고, 하나 또는 그 이상의 프로브가 ERBB2/HER2 돌연변이에 상보적일 수 있고, 하나 또는 그 이상의 프로브가 EML4-ALK 돌연변이에 상보적일 수 있고, 하나 또는 그 이상의 프로브가 ROS1 돌연변이에 상보적일 수 있고, 하나 또는 그 이상의 프로브가 RET 돌연변이에 상보적일 수 있고, 하나 또는 그 이상의 프로브가 MET 돌연변이에 상보적일 수 있는, 복수의 프로브 분자를 포함하는 패널이 제공된다.
한 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 EGFR, KRAS, BRAF, ERBB2/HER2, EML4-ALK, ROS1, RET, MET 돌연변이에 대해 선택적인 프로브의 패널이 제공된다.
한 구체예에서, EGFR 돌연변이에 대해 선택적인 프로브 분자의 패널이 제공된다.
한 구체예에서, KRAS 돌연변이에 대해 선택적인 프로브 분자의 패널이 제공된다.
한 구체예에서, BRAF 돌연변이에 대해 선택적인 프로브 분자의 패널이 제공된다.
한 구체예에서, ERBB2/HER2 돌연변이에 대해 선택적인 프로브 분자의 패널이 제공된다.
한 구체예에서, EML4-ALK 돌연변이에 대해 선택적인 프로브 분자의 패널이 제공된다.
한 구체예에서, ROS1 돌연변이에 대해 선택적인 프로브 분자의 패널이 제공된다.
한 구체예에서, RET 돌연변이에 대해 선택적인 프로브 분자의 패널이 제공된다.
한 구체예에서, NTRK 돌연변이에 대해 선택적인 프로브 분자의 패널이 제공된다.
한 구체예에서, ROS1 돌연변이에 대해 선택적인 프로브 분자의 패널이 제공된다.
한 구체예에서, MET 엑손 14 돌연변이에 대해 선택적인 프로브 분자의 패널이 제공된다.
한 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 코딩 서열(CDSs)에 대해 선택적인 복수의 프로브 분자를 포함하는 패널이 제공된다.
한 구체예에서, 이전에 기술된 패널 중 하나 이상을 사용하여 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 검출하는 방법이 제공된다.
한 구체예에서, 이전에 기술된 패널 중 하나 이상을 사용하여 하나 또는 그 이상의 돌연변이 또는 부재 또는 존재를 검출하는 방법이 제공된다.
한 구체예에서, 이전에 또는 이후에 기술될 수 있는 하나 또는 그 이상의 시약과 배합하여, 이전에 또는 이후에 기술될 수 있는 패널을 포함하는 키트가 제공된다.
당업자는 A0를 개시하는 키트의 구체예가 그들의 범위 내에 복수의 A0를 포함하는 패널이 있는 구체예를 포함한다는 것을 이해할 것이다.
동반 진단
본 발명의 방법은 적절한 치료법의 선택을 안내하는 데 사용될 수 있는 샘플에서 특정 유전자 마커를 검출하는 데 사용될 수 있다. 이러한 마커들은 종양-특이적 돌연변이이거나 또는 야생형 게놈 서열일 수 있으며, 조직, 혈액 또는 임의의 다른 환자 샘플 유형을 사용하여 검출될 수 있다.
내성 모니터링
질환을 치료하는 동안 환자 샘플을 반복적으로 검사하면 치료에 대해 발생한 내성을 조기에 검출할 수 있게 된다. 이 적용의 예로서 비-소 세포 폐암(NSCLC)에서 상피 성장 인자 수용체(EGFR) 억제제(예: 게피티닙, 에르로티닙)가 일반적으로 제 1 선 치료에 사용된다. 치료 동안 종양은 약물에 대한 내성을 부여하는 EGFR 유전자에서의 돌연변이(예: T790M, C797S)를 종종 발생시킬 수 있다. 이러한 돌연변이의 조기 검출은 환자를 대체 치료법(예, Tagrisso)으로 전환시키는 것을 허용할 수 있다.
전형적으로 내성 발생에 대해 모니터링되고 있는 환자는 반복적인 조직 생검을 수행하기에는 너무 아플 수 있다. 반복적인 조직 생검은 또한 비용이 많이 들고, 침습적이며 관련된 위험을 수반할 수 있다. 혈액으로부터 검사하는 것이 바람직하지만, 적절한 혈액 채취 샘플에서 관심대상 돌연변이의 복사체가 매우 적을 수 있다. 따라서, 모니터링은 본 발명의 방법을 사용하여 혈액 샘플로부터의 고감도 테스트를 필요로 하며, 이 방법은 정기적으로 수행될 수 있도록 실행하는데 간단하고 비용 효율적인 방법이다.
재발 모니터링
이 적용 예에서, 치료 후 질환이 없다고 선언된 환자는 질환의 재발을 검출하기 위해, 시간 경과에 따라 모니터링 될 수 있다. 이것은 비-침습적으로 수행되어야 하며, 혈액 샘플로부터 표적 서열의 고감도 검출을 요한다. 본 발명의 방법을 사용함으로써, 정기적으로 수행할 수 있는 간단하고 저렴한 방법을 제공한다. 표적화된 서열은 관심 질환에서 흔한 것으로 알려진 일반 돌연변이일 수 있거나, 또는 완화 이전에 종양 조직에서 변이체의 검출에 기초하여 특정 환자를 위해 설계된 표적의 맞춤형 패널일 수 있다.
최소 잔류 질환(MRD) 모니터링
일부 암의 경우, 치료 후 환자에게 남아있는 잔여 암세포가 있으며, 이는 암 및 백혈병 재발의 주요 원인이다. MRD 모니터링 및 검사에는 다음을 결정하는데 몇 가지 중요한 역할을 한다: 치료를 통해 암이 박멸되었는지 결정할 때, 또는 다른 치료의 효능과 비교하여, 흔적이 남는지를 결정할 때, 환자의 완화 상태 모니터링 뿐만 아니라 백혈병 재발 검출에, 그리고 이러한 요구에 가장 적합한 치료법을 선택할 때.
스크리닝
질환의 조기 검출을 위한 집단 선별 검사는 특히 암 진단에서 오랜 목표였다. 도전은 두-가지다: 너무 많은 위음성 없이, 질환을 확실하게 검출할 수 있는 마커 패널의 식별, 그리고 충분한 감도와 충분히 낮은 비용을 가진 방법의 개발. 본 발명의 방법은 PCR-기반 테스트보다 더 큰 돌연변이 패널을 처리하는데 사용될 수 있지만, 시퀀싱-기반 진단보다 훨씬 더 간단한 작업 흐름과 낮은 비용으로 사용될 수 있다.
장기 이식 거부
이식된 장기가 수혜자에 의해 거부되면, 이 장기의 DNA가 수혜자의 혈류로 흘러 들어간다. 이 DNA를 조기에 검출하면, 거부 반응을 조기에 검출할 수 있다. 이는 기부자-특이성 마커의 맞춤형 패널을 사용하거나 또는 집단에서 일반적인 것으로 알려진 변이체 패널을 사용하여 달성할 수 있으며, 그중 일부는 기부자에게, 일부는 수혜자에게 존재할 것이다. 장기 수혜자의 일상적인 모니터링은 여기에 개시된 본 발명의 저비용 및 간단한 작업 흐름에 의해 가능해질 수 있다.
비-침습적 산전 검사 (NIPT)
태아 DNA가 모체 혈액에 존재한다는 것은 오랫동안 알려져 왔으며, NIPT 시장은 현재 태아 이상을 검출할 수 있도록 특정 염색체의 돌연변이 식별 및 복제수를 확인하는 시퀀싱을 사용하는 회사로 포화 상태에 있다. 본원에 개시된 바와 같은 본 발명의 방법은 매우 낮은 대립 유전자 분획에서 돌연변이를 검출하는 능력을 가지며, 잠재적으로 태아 DNA의 조기 검출을 가능하게 한다. 주어진 집단에서 일반적인 돌연변이를 식별하면, 모체 또는 태아 DNA에 존재할 수 있는 돌연변이를 표적으로 삼거나 또는 임신 초기 단계에서 이상을 검출할 수 있는 분석법을 개발할 수 있다.
본 발명의 다양한 추가 측면 및 구체예들은 본 개시 내용을 고려하여 당업자에게 명백할 것이다.
본 명세서에서 사용되는 "및/또는"은 서로를 포함하거나 또는 포함하지 않는 2개의 특정된 특징 또는 구성요소 각각의 특정 개시로 간주되어야 한다. 예를 들어, "A 및/또는 B"는 각각이 본원에서 개별적으로 제시된 것처럼, 각각의 (i) A, (ii) B 및 (iii) A와 B의 특정 개시로 간주되어야 한다.
문맥에서 달리 지시하지 않는 한, 위에 기재된 특징들의 설명 및 정의는 본 발명의 임의의 특정 측면 또는 구체예로 한정되지 않고, 기재된 모든 측면 및 구체예들에 동일하게 적용된다.
본 발명이 여러 구체예들을 참조하여 예로서 설명되었지만, 개시된 구체예들에 한정되지 않고, 대안적인 구체예들이 첨부된 청구범위에 정의된 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 구성될 수 있다는 것이 당업자에 의해 추가로 이해될 것이다.
당업자는 '부분적으로 분해된 가닥 A1'에 대한 언급이, 가닥이 상보성 부족으로 인해 해리될 때까지, 3'-5' 방향으로 표적 분석물 서열에 혼성화될 때 A0의 점진적 분해에 의해 형성된 단일-가닥으로 된 올리고뉴클레오티드를 지칭할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
당업자는 '부분적으로 이중-가닥으로 된' 핵산에 대한 언급이 하나 또는 그 이상의 부분이 이중-가닥으로 되고 하나 또는 그 이상의 부분이 단일-가닥으로 된 핵산을 지칭할 수 있음을 이해할 것이다.
당업자는 '실질적으로 이중-가닥으로 된' 핵산에 대한 언급이 하나 또는 그 이상의 부분이 이중-가닥으로 되고 하나 또는 그 이상의 더 작은 부분이 단일-가닥으로 된 핵산을 지칭할 수 있음을 이해할 것이다.
SEQUENCE LISTING
<110> Biofidelity Ltd
<120> SIMPLIFIED POLYNUCLEOTIDE SEQUENCE DETECTION METHOD
<130> P32007WO1
<160> 35
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A at position 1 has a 5' phosphate.
A, T, G and T (positions 1-4) are all linked by phosphorothioate bonds.
<400> 1
atgttcgatg agctttgaca atacttgaag ctcgcagata taggatgttg cgatagtcca 60
ggaggctgc 69
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA sequence
<400> 2
tgtcaaagct catcgaacat cctggactat gtctcc 36
<210> 3
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Part of human EGFR gene
<400> 3
tgctgggcat ctgcctcacc tccaccgtgc agctcatcac gcagctcatg cccttcggca 60
gcctcctgga ctatg 75
<210> 4
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Part of human EGFR gene with C797S mutation
<400> 4
tgctgggcat ctgcctcacc tccaccgtgc agctcatcac gcagctcatg cccttcggct 60
gcctcctgga ctatg 75
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA sequence
<400> 5
tcgcaacatc ctatatctgc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA Sequence
<400> 6
tgagctttga caatacttga 20
<210> 7
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> WT oligonucleotide
<400> 7
catctgcctc acctccaccg tgcagctcat cacgcagctc atgcccttcg gctgcctcct 60
ggactatgtc cgggaacaca aagacaatat 90
<210> 8
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T790M oligonucleotide
<400> 8
catctgcctc acctccaccg tgcagctcat catgcagctc atgcccttcg gctgcctcct 60
ggactatgtc cgggaacaca aagacaatat 90
<210> 9
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> C797S_2389 oligonucleotide
<400> 9
catctgcctc acctccaccg tgcagctcat cacgcagctc atgcccttcg gcagcctcct 60
ggactatgtc cgggaacaca aagacaatat 90
<210> 10
<211> 78
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T790M probe. 5' phosphate. Phosphorothioate bonds between A, T, G
and T at positions 1-4.
<400> 10
atgttcgatg agctttgaca atacttgagc acggcagata taggatgttg cgaagggcat 60
gagctgcatg atgagctg 78
<210> 11
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> C797S_2389 probe. 5' phosphate. Phosphorothioate bonds between A,
T, G and T at positions 1-4.
<400> 11
atgttcgatg agctttgaca atacttgaag ctcgcagata taggatgttg cgatagtcca 60
ggaggctgc 69
<210> 12
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T790M splint oligonucleotide.
<400> 12
tgtcaaagct catcgaacat gcccttcgca acatct 36
<210> 13
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> C797S_2389 splint oligonucleotide.
<400> 13
tgtcaaagct catcgaacat tcctggacta tcgcat 36
<210> 14
<211> 70
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cy5 primer. 3' Qusar670 dye, Quencher between G at position 50
and A at position 51.
<400> 14
acgcctggtt accgagccag gttcgcacat gtaggctcgg taaccaggcg acatcctata 60
tctgccgtgc 70
<210> 15
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TexasRed primer. 5' TexasRed dye. Quencher between G at position
38 and C at position 39.
<400> 15
acgcctggtt acaggttcgc acatgtagta accaggcgca acatcctata tctgcgag 58
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer.
<400> 16
atgttcgatg agctttgaca 20
<210> 17
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> WT oligonucleotide.
<400> 17
cccaaccaag ctctcttgag gatcttgaag gaaactgaat tcaaaaagat caaagtgctg 60
ggctccggtg cgttcggcac ggtgtataag gtaaggtccc 100
<210> 18
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G719X_6239 oligonucleotide.
<400> 18
cccaaccaag ctctcttgag gatcttgaag gaaactgaat tcaaaaagat caaagtgctg 60
gcctccggtg cgttcggcac ggtgtataag gtaaggtccc 100
<210> 19
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G719X_6252 oligonucleotide.
<400> 19
cccaaccaag ctctcttgag gatcttgaag gaaactgaat tcaaaaagat caaagtgctg 60
agctccggtg cgttcggcac ggtgtataag gtaaggtccc 100
<210> 20
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G719X_6253 oligonucleotide.
<400> 20
cccaaccaag ctctcttgag gatcttgaag gaaactgaat tcaaaaagat caaagtgctg 60
tgctccggtg cgttcggcac ggtgtataag gtaaggtccc 100
<210> 21
<211> 77
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G719X_6239 probe oligonucleotide. 5' phosphate. Phosphorothioate
bonds between A, T, G and T at positions 1-4.
<400> 21
atgttcgatg agctttgaca atacttgaca tgcgcagata taggatgttg cgaaacgcac 60
cggaggccag cactttg 77
<210> 22
<211> 77
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G719X_6252 probe oligonucleotide. 5' phosphate. Phosphorothioate
bonds between A, T, G and T at positions 1-4.
<400> 22
atgttcgatg agctttgaca atacttgaca tgccgagtaa tgagagtttc gcaaacgcac 60
cggagctcag cactttg 77
<210> 23
<211> 77
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G719X_6253 probe oligonucleotide. 5' phosphate. Phosphorothioate
bonds between A, T, G and T at positions 1-4.
<400> 23
atgttcgatg agctttgaca atacttgaca tgcgagcaat taggtagtgt cgtaacgcac 60
cggagcacag cactttg 77
<210> 24
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Splint oligonucleotide.
<400> 24
tgtcaaagct catcgaacat ccggtgcgtt cggcaa 36
<210> 25
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Dye primer 1. 5' Cy5 dye, phosphorothioate bond between A at
position 1 and C at position 2.
<400> 25
actgaccagc tccatgacaa tcgctgtcgc catgatcgat cgcaacatcc tatatctgc 59
<210> 26
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Dye primer 2. 5' TEX dye, phosphorothioate bond between A at
position 1 and C at position 2.
<400> 26
actgaccagc tccatgacaa tcgctgtcgc catgatcgat gcgaaactct cattactcg 59
<210> 27
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Dye primer 3. 5' TEX dye, phosphorothioate bond between T at
position 1 and A at position 2.
<400> 27
tacgaccgac tcactcctta cagcagtccg cagtatgcta cgacactacc taattgctc 59
<210> 28
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Quencher primer 1. 3' Iowa Black RQ quencher.
<400> 28
tcgatcatgg cgacagcgat tgtcatggag ctggtcagt 39
<210> 29
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Quencher primer 2. 3' Iowa Black FQ quencher.
<400> 29
agcatactgc ggactgctgt aaggagtgag tcggtcgta 39
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer. Phosphorothioate bonds between T, G and A at
positions 1-3.
<400> 30
tgagctttga caatacttga 20
<210> 31
<211> 81
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Wildtype oligo
<400> 31
ctgctgggca tctgcctcac ctccaccgtg cagctcatca cgcagctcat gcccttcggc 60
tgcctcctgg actatgtccg g 21
<210> 32
<211> 81
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Wildtype oligo
<400> 32
ctgctgggca tctgcctcac ctccaccgtg cagctcatca tgcagctcat gcccttcggc 60
tgcctcctgg actatgtccg g 21
<210> 33
<211> 74
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5'phosphate.Phosphorothioate bonds betweeen a,g,c,t at
positions 1-4.
<400> 33
agctgcatct gagctttgac aatacttgag cacggcagat ataggatgtt gcgaagggca 60
tgagctgcat gatg 14
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Phosphorothioate bonds betweeen t,c and g at positions 1-3.
<400> 34
tcgcaacatc ctatatctgc 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>
<400> 35
atgttgcgaa gggcatatgt 20
Claims (30)
- 샘플에 존재하는 주어진 핵산 분석물 중에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 검출하는 방법으로서, 상기 방법은 다음의 단계들을 포함하는 방법:
(a) 다음을 포함하는 제 1 반응 혼합물에 하나 또는 그 이상의 핵산 분석물을 도입하는 단계:
i. 단일-가닥으로 된 프로브 올리고뉴클레오티드 A0;
ii. 피로인산첨가분해 효소; 및
iii. 리가제;
여기서, 상기 분석물은 단일-가닥으로 된 프로브 올리고뉴클레오티드 A0에 어닐링하여, 적어도 부분적으로 이중-가닥으로 된 제 1 중간 산물을 생성시키고, 여기서 A0의 3' 단부가 이중-가닥으로 된 복합체를 형성하고, A0는 3' 단부로부터 3'-5' 방향으로 피로인산첨가분해되어 적어도 부분적으로 분해된 가닥 A1을 생성시키고, A1은 결찰을 거쳐 A2를 형성함;
(b) A2 또는 그의 일부, 또는 A2의 다수의 복사체 또는 그의 일부의 다수의 복사체인 이전 단계의 산물로부터 유래된 신호를 검출하고, 그로부터 상기 분석물 중에서 폴리뉴클레오티드 표적 서열의 존재 또는 부재를 유추하는 단계. - 청구항 1에 있어서, 제 1 반응 혼합물이 피로포스페이트 이온의 공급원을 더 포함하는 것을 추가 특징으로 하는 방법.
- 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 제 1 반응 혼합물이 A0의 일부 및 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트(dNTP)에 실질적으로 상보적인 적어도 하나의 단일-가닥으로 된 프라이머 올리고뉴클레오티드를 더 포함하는 것을 추가 특징으로 하는 방법.
- 청구항 3에 있어서, 제 1 반응 혼합물이 증폭 효소를 더 포함하는 것을 추가 특징으로 하는 방법.
- 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 단계 (a)의 산물을 단계 (b) 전에 제 2 반응 혼합물에 도입하고, 상기 제 2 반응 혼합물은 적어도 하나의 단일-가닥으로 된 프라이머 올리고뉴클레오티드 및 dNTP들을 포함하는 것을 추가 특징으로 하는 방법.
- 청구항 5에 있어서, 제 2 반응 혼합물이 증폭 효소를 더 포함하는 것을 추가 특징으로 하는 방법.
- 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 제 1 반응 혼합물이 다음을 더 포함하는 것을 추가 특징으로 하는 방법:
하나 또는 그 이상의 리가제; 및
A2 상의 인접 서열에 상보적인 2개 이상의 LCR 프로브 올리고뉴클레오티드를 더 포함하고, 여기서 프로브가 A2에 성공적으로 어닐링되면 하나의 LCR 프로브의 5' 포스페이트가 다른 LCR 프로브의 3'OH에 직접 인접하며;
여기서, A2의 존재 하에 2개의 LCR 프로브는 A2에 성공적으로 어닐링되고 함께 결찰되어 하나의 올리고뉴클레오티드 분자를 형성하고, 그 다음, 이 분자는 2회차 공유 결찰을 위한 새로운 표적으로 작용하여 관심 표적의 기하학적 증폭을 유도할 것이고, 그 다음 이 경우에 A2가 검출될 것이다. - 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 단계 (a)의 산물을 단계 (b) 전에 제 2 반응 혼합물에 도입하고, 상기 제 2 반응 혼합물이 다음을 포함하는 것을 추가 특징으로 하는 방법:
하나 또는 그 이상의 리가제; 및
A2 상의 인접 서열에 상보적인 2개 이상의 LCR 프로브 올리고뉴클레오티드를 더 포함하고, 여기서 프로브가 A2에 성공적으로 어닐링되면 하나의 LCR 프로브의 5' 포스페이트가 다른 LCR 프로브의 3'OH에 직접 인접하며;
여기서, A2의 존재 하에 2개의 LCR 프로브는 A2에 성공적으로 어닐링되고 함께 결찰되어 하나의 올리고뉴클레오티드 분자를 형성하고, 그 다음, 이 분자는 2회차 공유 결찰을 위한 새로운 표적으로 작용하여 관심 표적의 기하학적 증폭을 유도할 것이고, 그 다음 이 경우에 A2가 검출될 것이다. - 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 제 1 반응 혼합물이 다음을 더 포함하는 것을 추가 특징으로 하는 방법:
하나 또는 다수의 형광단이 서로 근접하는 것에 의해 소광되거나 또는 하나 또는 그 이상의 형광 소광제에 의해 소광되도록 배열된 하나 또는 다수의 형광단을 포함하는, 결찰 부위를 포함하는 A2의 영역에 상보적인 올리고뉴클레오티드;
이중 가닥의 특이적 DNA 분해 효소를 더 포함하고;
여기서, A2의 존재 하에, 형광단이 서로 또는 상응하는 소광제로부터 분리되도록 라벨링된 올리고뉴클레오티드가 분해되고, 형광 신호와, 그에 따라서 A2의 존재가 검출될 수 있다. - 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 단계 (a)의 산물을 단계 (b) 전에 제 2 반응 혼합물에 도입하고, 상기 제 2 반응 혼합물이 다음을 포함하는 것을 추가 특징으로 하는 방법:
하나 또는 다수의 형광단이 서로 근접하는 것에 의해 소광되거나 또는 하나 또는 그 이상의 형광 소광제에 의해 소광되도록 배열된 하나 또는 다수의 형광단을 포함하는, 결찰 부위를 포함하는 A2의 영역에 상보적인 올리고뉴클레오티드;
이중 가닥의 특이적 DNA 분해 효소를 더 포함하고;
여기서, A2의 존재 하에, 형광단이 서로 또는 상응하는 소광제로부터 분리되도록 라벨링된 올리고뉴클레오티드가 분해되고, 형광 신호와, 그에 따라서 A2의 존재가 검출될 수 있다. - 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서, 부분적으로 분해된 가닥 A1이 그의 3' 및 5' 단부들의 결찰을 통해 원형화되어 올리고뉴클레오티드 A2를 생성하는 것을 추가 특징으로 하는 방법.
- 청구항 1 내지 청구항 6 또는 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 반응 혼합물이 결찰 프로브 올리고뉴클레오티드 C를 더 포함하고, 부분적으로 분해된 가닥 A1이 3' 단부에서 C의 5' 단부에 결찰되어 올리고뉴클레오티드 A2를 생성하는 것을 추가 특징으로 하는 방법.
- 청구항 12에 있어서, 올리고뉴클레오티드 C가 3'-5' 엑소뉴클레아제 분해로부터 그를 보호하는 내부 변형 또는 3' 변형을 더 포함하는 것을 추가 특징으로 하는 방법.
- 청구항 11 내지 청구항 13 중 어느 한 항에 있어서, 결찰이 다음에서 발생하는 것을 추가 특징으로 하는 방법:
단계 (a) 동안; 또는
단계 (b) 동안; 또는
단계 (a)와 단계 (b) 사이에서. - 청구항 1 내지 청구항 6 또는 청구항 11 내지 청구항 14 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 또는 제 2 반응 혼합물이 스플린트 올리고뉴클레오티드 D를 더 포함하는 것을 추가 특징으로 하는 방법.
- 청구항 15에 있어서, D가 A1의 3' 단부에 상보적인 올리고뉴클레오티드 영역과 올리고뉴클레오티드 C의 5' 단부 또는 A1의 5' 단부에 상보적인 영역을 포함하는 것을 추가 특징으로 하는 방법.
- 청구항 15 또는 청구항 16에 있어서, D가 3' 변형으로 인해 또는 D의 3' 단부와 A1의 상응하는 영역 사이의 미스매치로 인해 A1에 대해 연장을 겪을 수 없는 것을 추가 특징으로 하는 방법.
- 청구항 1 내지 청구항 17 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 반응 혼합물이 5'-3' 엑소뉴클레아제를 더 포함하고, 여기서 A0의 5' 단부는 5'-3' 엑소뉴클레아제 분해에 대해 저항성이 되는 것을 추가 특징으로 하는 방법.
- 청구항 1 내지 청구항 18 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a) 전에 샘플 중에 존재하는 핵산 분석물을 증폭시키고, 주어진 핵산 분석물의 증폭 후 및 제 1 반응 혼합물의 첨가 전에 샘플을 프로테이나제로 더 처리하는 것을 추가 특징으로 하는 방법.
- 청구항 1 내지 청구항 19 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 반응 혼합물이 포스파타제 또는 포스포하이드롤라제를 더 포함하는 것을 추가 특징으로 하는 방법.
- 청구항 1 내지 청구항 20 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b) 전에 또는 단계 (b) 동안에 이전 단계의 산물을 피로포스파타제로 처리하는 것을 추가 특징으로 하는 방법.
- 청구항 1 내지 청구항 21 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b) 전에 또는 단계 (b) 동안에 이전 단계의 산물을 엑소뉴클레아제로 처리하는 것을 추가 특징으로 하는 방법.
- 청구항 1 내지 청구항 22 중 어느 한 항에 있어서, A0의 피로인산첨가분해를 수행하여 부분적으로 분해된 가닥 A1을 형성하는 효소가 또한 A2를 증폭하는 것을 추가 특징으로 하는 방법.
- 청구항 1 내지 청구항 23 중 어느 한 항에 있어서, 하나 또는 그 이상의 올리고뉴클레오티드 형광 결합 염료 또는 분자 프로브를 사용하여 검출을 달성하는 것을 추가 특징으로 하는 방법.
- 청구항 24에 있어서, A2의 앰플리콘의 생성에 기인하는 시간 경과에 따른 신호 증가를 분석물 중의 표적 서열의 농도를 유추하는 데 사용하는 것을 추가 특징으로 하는 방법.
- 청구항 1 내지 청구항 25 중 어느 한 항에 있어서, 다수의 프로브 A0가 이용되며, 각각은 상이한 표적 서열에 대해 선택성이고, 각각은 식별 영역을 포함하는 것을 추가 특징으로 하고, A2의 앰플리콘이 이 식별 영역을 포함하고, 따라서 분석물 중에 존재하는 표적 서열들이 식별 영역(들)의 검출을 통해 유추되는 것을 추가 특징으로 하는 방법.
- 청구항 26에 있어서, 식별 영역(들)의 검출이 분자 프로브를 사용하거나 시퀀싱을 통해 수행되는 것을 추가 특징으로 하는 방법.
- 청구항 24에 있어서, 방법의 마지막 단계가 다음 단계를 더 포함하는 것을 추가 특징으로 하는 방법:
i. 하나 또는 그 이상의 올리고뉴클레오티드 형광 결합 염료 또는 분자 프로브를 사용하여 단계 (b)의 산물을 라벨링하고;
ii. 산물의 형광 신호를 측정하고;
iii. 산물을 일련의 변성 조건에 노출시키고; 그리고
변성 조건에 노출되는 동안 산물의 형광 신호의 변화를 모니터링하여 분석물중에서 폴리뉴클레오티드 표적 서열을 식별한다. - 청구항 1 내지 청구항 28 중 어느 한 항에 있어서, 하나 또는 그 이상의 핵산 분석물이 다수의 반응 부피로 분할되며, 각각의 부피에는 상이한 표적 서열을 검출하기 위해 도입된 하나 또는 그 이상의 프로브 올리고뉴클레오티드 A0가 있는 것을 추가 특징으로 하는 방법.
- 청구항 1 내지 청구항 29 중 어느 한 항에 있어서, 상이한 프로브 A0가 공통 프라이밍 부위를 포함하여, 단일 프라이머 또는 단일 세트의 프라이머를 증폭에 사용할 수 있게 하는 것을 추가 특징으로 하는 방법.
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