CN110621786A - 单核苷酸检测方法及相关探针 - Google Patents

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Abstract

对核酸进行测序的方法，其特征在于以下步骤：(1)通过核酸的渐进酶促消化产生单核苷三磷酸流；(2)通过在聚合酶存在下使至少一个单核苷三磷酸与相应的生物探针反应来产生至少一个寡核苷酸使用的探针，所述相应的生物探针包含(a)第一单链寡核苷酸，其包括核酸外切酶封闭位点，位于所述封闭位点5'侧并包括用于捕获该单核苷三磷酸的单核苷酸捕获位点的限制性核酸内切酶识别位点，和位于所述识别位点5'侧并被布置为使荧光团被猝灭的至少一个荧光团区域，和(b)第二和任选的第三单链寡核苷酸，它们分别与第一寡核苷酸分离，并能够与位于捕获位点3'和5'侧翼的第一寡核苷酸上的互补区域杂交；(3)用限制性核酸内切酶在识别位点切割所述经使用的探针的第一寡核苷酸链，以产生带有荧光团的第一寡核苷酸组分；(4)用具有3'‑5'核酸外切活性的酶消化该第一寡核苷酸组分，以产生可检测状态的荧光团，以及(5)检测步骤(4)中释放的荧光团。还提供了与具有5'‑3'核酸外切活性的酶一起使用的相应方法，以及新的生物探针和由其得到的试剂盒。

Description

单核苷酸检测方法及相关探针
本发明涉及用于检测和表征单核苷酸的方法和相关的生物探针。它特别适合用于DNA或RNA的测序。
遗传物质的下一代测序已经总体上对生物科学和特别是对药物产生了重大影响，因为测序的单位成本与越来越快的测序机器的上市相关。
在我们先前的申请WO2014/053853、WO2014/053854、WO2014/167323、WO2014/167324、WO2014/111723、WO2015/121675和WO2017/005789中，我们已经描述了一种新的测序方法，其涉及渐进消化多核苷酸分析物以产生有序的单核苷酸流，优选单核苷三磷酸流，其中每个都可以逐个地被捕获到微滴流中的相应液滴中。此后，可以对每个液滴进行化学和/或酶促操作以显示其最初包含的特定单核苷酸。在一个实施方案中，这些化学和/或酶促操作包括涉及使用一种或多种双组分寡核苷酸探针类型的方法，每种探针类型适于能够选择性地捕获构成分析物的单核苷酸类型之一。通常，在每种这样的探针类型中，两种寡核苷酸组分中的一种包含特征荧光团，并且在探针的未使用状态下，这些荧光团发荧光的能力由于存在靠近的猝灭剂或通过自猝灭而保持消失。在使用中，当探针捕获其相应的单核苷酸时，使其易于随后的核酸外切，从而从猝灭剂和/或彼此释放荧光团使其能够自由发荧光。通过这种方式，每个液滴中存在的原始单核苷酸可以通过光谱手段间接推断。
该方法的变形已在我们的其他待审批申请中描述，包括WO201405385和WO2016012789；后者涉及使用三组分探针。特别地，WO2016012789描述了一种改进的方法，其特征在于以下步骤：(1)通过渐进消化核酸产生单核苷三磷酸流；(2)通过在聚合酶和连接酶存在下使至少一个单核苷三磷酸与相应探针反应，产生至少一个基本上双链的寡核苷酸经使用的探针，该探针包含(a)用例如特征荧光团标记的不可检测状态的第一单链寡核苷酸和(b)能够与第一寡核苷酸上的互补区杂交的第二和第三单链寡核苷酸；(3)用具有双链核酸外切活性的酶消化经使用的探针以产生可检测状态的荧光团和至少部分是第一寡核苷酸的互补序列的单链第四寡核苷酸；(4)使第四寡核苷酸与另一个第一寡核苷酸反应，产生对应于经使用的探针的基本上双链的寡核苷酸产物；(5)在一个循环中重复步骤(3)和(4)；和(6)检测在步骤(3)的每次迭代中释放的荧光团。该方法的优点在于，通过在一个循环中迭代步骤(3)和(4)，可以使荧光信号强烈增强，从而提高整体灵敏度，因此提高核苷酸检测的可靠性。在一个实施方案中，第二和第三寡核苷酸相连，这使得在核苷酸捕获后，它们形成闭环单链寡核苷酸组分，其有利地抵抗核酸外切。
关于其他现有技术，Fan等人已在Nature Reviews Genetics 7(8)632-644(2006)中提供了对能够进行用于基因分型、拷贝数测量、测序、检测杂合性缺失、等位基因特异性表达和甲基化的高度平行基因组测定的方法和平台的进展的综述。该综述的图2a示意性地显示了具有3'和5'末端的可环化探针的使用，其使分析物上单核苷酸多态性(SNP)位点的上游和下游退火，从而留下随后利用作为所述SNP的互补序列的核苷酸填充的缺口，以便形成完整的环状探针，其可以在释放后进行扩增。然而，与我们的方法不同，在填充过程中捕获的核苷酸不是直接从分析物本身获得的。
WO03080861公开了一种方法，其中核酸分析物在核苷酸特异性反应性标记物存在下经历渐进焦磷酸解，所述标记物在释放时直接附着于所述核苷酸。这不仅与我们采用的方法完全不同，而且在实践中，当标记的核苷酸随后被检测时测量的荧光信号可能太弱而不能在相关的背景噪声之上进行可靠的识别。
最后，WO9418218教导了一种DNA测序方法，其中分析物经历渐进核酸外切以产生单核苷酸二磷酸或单核苷酸单磷酸流，然后在检测前将其加入荧光增强基质中。这不仅是与我们描述的方法完全不同的方法，而且所产生的任何信号可能太弱而无法可靠地检测和识别。
上述基于核酸外切的方法的一个缺点是荧光信号的产生速率受到消化阶段速度的限制，并且核酸外切酶的特异性限制了可达到的信噪比水平。尽管这对于该方法的应用绝不是致命的，但从技术角度来看，仍然非常希望缩短与荧光增长有关的温育期并改善信噪比，以实现更快、更准确的测序；特别是在预期要进行长测序读取的情况下。现在，我们通过将经使用的探针的核酸外切消化与带有猝灭荧光团的链的选择性核酸内切裂解相结合来实现。因此，根据本发明的第一方面，提供了一种对核酸进行测序的方法，其特征在于以下步骤：(1)通过核酸的渐进酶促消化产生单核苷三磷酸流；(2)通过在聚合酶存在下使至少一个单核苷三磷酸与相应的生物探针反应来产生至少一个寡核苷酸经使用的探针，所述相应的生物探针包含(a)第一单链寡核苷酸，其包括核酸外切酶封闭位点，位于所述封闭位点5'侧并包括用于捕获该单核苷三磷酸的单核苷酸捕获位点的限制性核酸内切酶识别位点，和位于所述识别位点5'侧的至少一个荧光团区域，其被布置为使荧光团被猝灭，和(b)第二和任选的第三单链寡核苷酸，它们分别与第一寡核苷酸分离，并能够与位于捕获位点3'和5'侧翼的第一寡核苷酸上的互补区域杂交；(3)用限制性核酸内切酶在识别位点切割经使用的探针的第一寡核苷酸链，以产生带有荧光团的第一寡核苷酸组分；(4)用具有3'-5'核酸外切活性的酶消化该第一寡核苷酸组分，以产生可检测状态的荧光团，以及(5)检测步骤(4)中释放的荧光团。
根据本发明的第二方面，提供了一种对核酸进行测序的方法，其特征在于以下步骤：(1)通过核酸的渐进酶促消化产生单核苷三磷酸流；(2)通过在聚合酶存在下使至少一个单核苷三磷酸与相应的生物探针反应来产生至少一个寡核苷酸使用的探针，所述相应的生物探针包含(a)第一单链寡核苷酸，其包括核酸外切酶封闭位点，位于所述封闭位点3'侧并包括用于捕获该单核苷三磷酸的单核苷酸捕获位点的限制性核酸内切酶识别位点，以及位于所述识别位点3'侧的至少一个荧光团区域，其被布置为使荧光团被猝灭，和(b)第二和任选的第三单链寡核苷酸，它们分别与第一寡核苷酸分离，并能够与位于捕获位点3'和5'侧翼的第一寡核苷酸上的互补区域杂交；(3)用限制性核酸内切酶在识别位点切割经使用的探针的第一寡核苷酸链，以产生带有荧光团的第一寡核苷酸组分；(4)用具有5'-3'核酸外切活性的酶消化第一寡核苷酸组分，以产生可检测状态的荧光团，以及(5)检测步骤(4)中释放的荧光团。
在一个优选的实施方案中，如下所述迭代步骤(2)和(3)以显著增加释放的用于在步骤(5)中检测的荧光团的数目。
本发明方法的步骤(1)包括通过渐进酶促消化从核酸分析物产生单核苷三磷酸流。在一个实施方案中，这可以通过分析物的渐进核酸外切和随后激酶对获得的单核苷一磷酸的作用来实现(参见例如Bao和Ryu的Biotechnology and Bioengineering(DOI10.1002/bit.21498))。然而，优选地，通过渐进焦磷酸解直接从分析物产生核苷三磷酸。在该步骤中合适地使用的分析物是双链多核苷酸，其长度原则上可以是无限制的；例如，包括在人类基因或染色体片段中发现的多达数百万个核苷酸。然而，通常多核苷酸的长度至少为50，优选至少150个核苷酸对；合适地，其大于500，大于1000并且在许多情况下长数千个核苷酸对。分析物本身优选是天然来源的RNA或DNA(例如源自植物、动物、细菌或病毒)，尽管该方法也可用于对合成产生的RNA或DNA、或完全或部分地由核苷酸组成的其他核酸进行测序，其中所述核苷酸的核碱基在自然界中通常不会遇到，即除腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)以外的核碱基。这种核碱基的实例包括4-乙酰基胞苷、5-(羧基羟甲基)尿苷、2-O-甲基胞苷、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿苷、二氢尿苷、2-O-甲基假尿苷、2-O-甲基鸟苷、肌苷、N6-异戊基腺苷、1-甲基腺苷、1-甲基假尿苷、1-甲基鸟苷、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟苷、2-甲基腺苷、2-甲基鸟苷、3-甲基胞苷、5-甲基胞苷、N6-甲基腺苷、7-甲基鸟苷、5-甲基氨基甲基尿苷、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿苷、5-甲氧基尿苷、5-甲氧基羰基甲基-2-硫尿苷、5-甲氧基羰基甲基尿苷、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺苷、尿苷-5-羟基乙酸-甲酯、尿苷-5-羟基乙酸、wybutoxosine、怀丁苷(wybutosine)、假尿苷、Q苷(queuosine)、2-硫胞苷、5-甲基-2-硫尿苷、2-硫尿苷、4-硫尿苷、5-甲基尿苷、2-O-甲基-5-甲基尿苷和2-O-甲基尿苷。在DNA的情况下，产生的单核苷三磷酸是脱氧核糖核苷三磷酸，而在RNA的情况下它们是核糖核苷三磷酸。
在该方法的一个实施方案中，步骤(1)还包括将分析物附着到基质上的第一子步骤。通常，该基质包括微流体表面、微珠或可渗透膜，例如，由玻璃或不可降解的聚合物制成的基质。优选地，基质还包括特别适于接收分析物的表面。有许多方法可以将分析物附着到这样的表面上，其中原则上任何一种都可以用在这个子步骤中。例如，一种涉及用官能化硅烷(例如环氧硅烷、氨基烃基硅烷或巯基硅烷)涂覆(priming)玻璃表面的方法。然后可以用分析物的衍生物处理如此产生的反应位点，所述分析物的衍生物被修饰以包括末端胺、琥珀酰基或硫醇基。
在步骤(1)的另一个实施方案中，将分析物焦磷酸解以产生单核苷三磷酸流，其顺序对应于分析物序列的顺序。这种焦磷酸解可以在20-90℃的温度下进行；例如，在包含合适聚合酶的反应介质存在下。优选地，它在连续流动的条件下进行，以便单核苷三磷酸在被释放时被连续地从反应区中除去。最优选地，通过使含有酶和其它典型添加剂的含水缓冲介质连续流过分析物所结合的表面来进行焦磷酸解。
在另一个实施方案中，所用的酶是能够引起分析物的渐进3'-5'焦磷酸解消化以产生具有高保真度和合理反应速率的核苷三磷酸流的酶。优选地，消化速率尽可能快，并且在一个实施方案中，其为每秒1-50个核苷三磷酸。
关于应用于多核苷酸消化的焦磷酸解反应的进一步信息可以在例如J.Biol.Chem.，244(1969)第3019-3028页中找到，读者可对其进行参考。合适地，焦磷酸解消化在介质存在下进行，该介质还包含例如焦磷酸根阴离子和镁阳离子；优选以毫摩尔浓度。
在本发明方法的步骤(2)中，在聚合酶和任选的连接酶存在下，使至少一个单核苷三磷酸分子(优选流中的每个单核苷三磷酸)与探针反应，以产生经使用的探针双链体，在额外使用连接酶的一个实施方案中，该双链体是分离的基本上双链的寡核苷酸。优选地，在进行该步骤之前，用焦磷酸酶处理步骤(1)的产物，以将任何残留的焦磷酸盐水解成磷酸根阴离子。
步骤(1)中使用的聚合酶合适地选自由在反应条件下基本上不显示外切核酸酶或核酸内切酶活性的那些聚合酶组成的组。可以有利地使用的聚合酶的实例包括但不限于从细菌获得的原核pol 1酶或酶衍生物，如大肠杆菌(Escherichia coli)(如Klenow片段聚合酶)、水生栖热菌(Thermus aquaticus)(如Taq Pol)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、热溶芽孢杆菌(Bacillus caldovelox)和热坚芽孢杆菌(Bacilluscaldotenax)。如果需要，原则上可以在该步骤中使用任何合适的连接酶。
步骤(2)中使用的生物探针包含两种或优选三种组分；(a)用不可检测状态的特征荧光团标记的第一单链寡核苷酸，和(b)第二和任选的第三未标记的单链寡核苷酸，其各自与第一寡核苷酸分离并且能够与第一寡核苷酸上的互补区域杂交。在一个三组分的实施方案中，第二和第三寡核苷酸是分离的实体，而在另一个实施方案中，它们是通过接头区连接的寡核苷酸区域。在后一种情况下，在一个实施方案中，接头区连接第二和第三寡核苷酸区域的末端。接头区原则上可以是任何二价基团，但是其本身便利地是另一个寡核苷酸区域。在一个实施方案中，该寡核苷酸接头区不能基本上与第一寡核苷酸杂交。
选择分离的第一、第二和第三寡核苷酸，以使得在步骤(2)中，第二和第三寡核苷酸可以分别与第一寡核苷酸上的3'侧和5'侧侧翼区域杂交，所述区域本身并列于包括捕获位点的限制性核酸内切酶识别位点的任一侧，该捕获位点包含单核苷酸，所述单核苷酸的核碱基与由该探针检测的核苷三磷酸所携带的核碱基互补。这使得探针对该特定的核苷三磷酸具有高度选择性。因此，例如，如果分析物源自DNA，并且第一、第二和第三寡核苷酸包含脱氧核糖核苷酸，则如果捕获位点包含带有胸腺嘧啶核碱基的核苷酸，捕获位点将对脱氧腺苷三磷酸具有高度选择性。因此，在本发明的一个有用的实施方案中，步骤(2)可以在存在包含多种探针类型的探针系统的情况下进行；例如，一种，两种，三种，四种或更多种探针类型，每种探针类型都包含第一寡核苷酸，该第一寡核苷酸具有所探寻的各种不同核碱基的集合的不同捕获位点特征以及与其附着的不同可检测元件。
通常，第一寡核苷酸长达150个核苷酸，优选10-100个核苷酸。在一个实施方案中，第二寡核苷酸比第一寡核苷酸的互补3'侧侧翼区短至少一个核苷酸。在另一个实施方案中，第一寡核苷酸的3'末端与第二寡核苷酸上与其相对的核苷酸之间存在至少单个核苷酸错配，以防止核苷三磷酸在该位点被捕获。类似地，在一个实施方案中，第三寡核苷酸比第一寡核苷酸的互补5'侧侧翼区长至少一个核苷酸，而在另一个实施方案中，第三寡核苷酸的3'末端与第一寡核苷酸中与其相对的核苷酸之间存在至少单个核苷酸错配，用于防止单核苷三磷酸在该位点被捕获。
第一寡核苷酸的特征在于其被荧光团区域标记，该荧光团区域包括其自身的独特和/或特征类型的荧光团，并且这些荧光团被布置为当探针处于未使用状态下时这些荧光团基本上不可检测到。优选地，它们被设置成在这些荧光团被设计为被检测的那些波长处基本上不发荧光。因此，尽管荧光团可以在大部分电磁光谱中显示出一般的低水平背景荧光，但通常会有一个或少量荧光强度最大的特定波长或波长包络。在一个或多个这些最大值处，可以特征性地检测到基本上不应发荧光的荧光团。在该专利的上下文中，术语“基本上不发荧光”或等同措辞是指在相关特征波长或波长包络处，附着于第一寡核苷酸的荧光团总数的荧光强度小于等同数量的游离荧光团的相应荧光强度的25％，优选小于10％，更优选小于1％，最优选小于0.1％。
原则上，可以使用任何方法来确保在第一寡核苷酸的未使用状态下，荧光团基本上不发荧光。在一个实施方案中，这是通过将荧光团彼此紧邻布置以使它们彼此猝灭(自猝灭布置)来实现的。在另一个实施方案中，荧光团区域还包括紧邻荧光团的单独的猝灭剂，通过其可以实现相同的结果。在该专利的上下文中，荧光团之间或荧光团与猝灭剂之间的“紧密接近”构成取决于特定荧光团和可能的第一寡核苷酸的结构特征。因此，该术语旨在参考所要求的结果而不是两个区域中各种成分的任何特定结构设置来解释。然而，仅出于提供示例的目的，指出当相邻的荧光团以对应于特征距离(通常小于5nm)的距离分开时，通常可以实现足够的猝灭。
关于荧光团本身，它们原则上可以选自本领域常规使用的任何一种，包括但不限于氧杂蒽部分(例如荧光素)、罗丹明及其衍生物，如异硫氰酸荧光素、罗丹明B等；香豆素部分(例如羟基-、甲基-和氨基香豆素)和青色素部分，例如Cy2、Cy3、Cy5和Cy7。具体实例包括源自以下常用染料的荧光团：Alexa染料、青色素染料、Atto Tec染料和罗丹明染料。实例还包括：Atto 633(ATTO-TEC GmbH)、Texas RedTM、Atto 740(ATTO-TEC GmbH)、孟加拉玫瑰红(Rose Bengal)、Alexa FluorTM 750 C5-马来酰亚胺(Invitrogen)、Alexa FluorTM 532C2-马来酰亚胺(Invitrogen)和罗丹明红C2-马来酰亚胺和罗丹明绿以及亚磷酰胺染料如Quasar 570。或者，可以使用量子点或近红外染料，例如由LI-COR Biosciences提供的那些，并且应看作是用于解释本专利意图的“荧光团”。荧光团通常使用本领域已知的化学方法通过核碱基与第一寡核苷酸连接。
合适的猝灭剂包括通过共振能量转移(FRET)机理起作用的猝灭剂。可与上述荧光团结合使用的市售猝灭剂的实例包括但不限于DDQ-1、Dabcyl、Eclipse、IowaBlack FQ和RQ、IR Dye-QCl、BHQ-0、BHQ-1、-2和-3以及QSY-7和-21。
第一寡核苷酸的另一个特征是，它包括在识别位点3'或5'侧的核酸外切酶封闭位点，这取决于采用上述两种方法中的哪一种。在一个实施方案中，第一寡核苷酸可在任一端或两端附近包括此类封闭位点。原则上，封闭位点可以是任何区域，由于其化学组成，该区域在该位点上使第一寡核苷酸抗核酸外切。这样的区域可以例如包括硫代磷酸酯接头、寡核苷酸间隔子(例如Spacer3，Spacer 9，Spacer 18，dSpacer等)、2'-O-甲基RNA碱基、反向碱基、脱硫生物素-TEG、二硫醇、己二醇和猝灭剂(例如BHQ)。
在一个实施方案中，核酸外切酶封闭位点可通过使第一寡核苷酸呈环形(即闭环)来实现。在另一个实施方案中，第二和/或第三寡核苷酸也将提供有类似的核酸外切酶封闭位点。
第一寡核苷酸的另一个特征是它包括限制性核酸内切酶识别位点，该位点包括上面提到的捕获位点。所述识别位点位于(1)核酸外切酶封闭位点的5'侧和荧光团区域的3'侧，或(2)核酸外切酶封闭位点的3'侧和荧光团区域的5'侧，这取决于采用上述两种方法中的哪一种。在一个实施方案中，当使用多于一种的第一寡核苷酸类型时，优选地，每个不同标记的第一寡核苷酸仍然包括相同的识别位点，使得仅需要使用一种限制性核酸内切酶。因此，对于许多应用而言，视情况而定，识别位点优选包含含有RNA或DNA的每个特征核苷酸中的至少一个的序列。
步骤(2)合适地通过使流中的每个单核苷三磷酸与如上所述的酶和一个或多个探针在20至80℃的温度下接触来进行。
如上所述，步骤(2)的产物是经使用的探针，其通常是基本上双链的双链体，其组成成分分别是(i)第一寡核苷酸和(ii)第二寡核苷酸，其具有源自单核苷三磷酸的另外的核苷酸，以及(iii)任选的第三寡核苷酸。步骤(2)在连接酶和第三寡核苷酸的存在下进行时，(ii)和(iii)将共同包括分离的第四寡核苷酸，并且经使用的探针将在识别位点附近是双链的。如果第二和第三寡核苷酸先前已经通过接头区连接在一起，那么很明显这将导致第四寡核苷酸，其是闭环的并且对核酸外切具有高度抗性。
在步骤(3)中，在20至100℃的温度下用限制性核酸内切酶处理经使用的探针。在一个实施方案中，该限制性核酸内切酶是切口核酸内切酶，其被设计为仅在识别位点切割源自第一寡核苷酸的链。在另一个实施方案中，限制性核酸内切酶可以是能够切割两条链的限制性核酸内切酶，并且可以通过限制性核酸内切酶使第二和/或第三寡核苷酸对切割具有抗性，例如通过在第二和第三寡核苷酸中的一个或两个中包含核酸内切封闭基团。在一个实施方案中，这些封闭基团可以选自本领域中通常使用的硫代磷酸酯键和其他骨架修饰、寡核苷酸间隔子、磷酸基团等。在第三实施方案中，在不使用连接酶的情况下，限制性核酸内切酶是一种能够切割两条链的限制性核酸内切酶，并且在捕获的核苷酸的3'侧具有切割位点(即在捕获核苷酸后保留在第二和第三寡核苷酸之间的切口处)。
可以与本发明的方法和探针一起使用的合适的限制性核酸内切酶(包括切口核酸内切酶)的细节可以在http://rebase.neb.com上与其相关的数据库中找到。
步骤(3)导致源自第一寡核苷酸的链被切割成两个分离的组分，其中一个带有荧光团和猝灭剂(如果使用的话)。此后，在步骤(4)中，根据将采用上述特定方法中的哪一种，将现在易于核酸外切的该组分用展示3'-5'或5'-3'核酸外切活性的酶消化。因此，当发生核酸内切和随后的核酸外切时，观察者看到荧光信号的发生和快速增长。然后，该荧光的特征间接反映了最初由相关探针捕获的单核苷三磷酸的性质。步骤(4)可以在30至100℃的温度范围内最有效地实现。
在一个实施方案中，优选的是，步骤(3)在比步骤(2)更高的温度下进行，和/或步骤(4)在比步骤(3)更高的温度下进行。
之后，在步骤(5)中，检测在步骤(4)中释放出来的荧光团，例如，通过步骤(2)和(3)的各种迭代，并通过推理确定附着于单核苷三磷酸的核碱基的性质。通过对步骤(1)中产生的流中的所有单核苷三磷酸系统地实施本发明的方法，可以产生和分析原始核酸分析物的序列的特征数据。这样做的方法在本领域中是众所周知的，例如，可以用来自激光或高强度电磁辐射的类似光源的光检查反应介质，并使用调节到各种荧光团的特征荧光波长或波长包络的光电检测器或等效装置检测任何产生的荧光。这又使光电检测器产生可以使用已知算法在计算机中处理和分析的特征电信号。
如上所述，在一个优选的实施方案中，在步骤(3)的最后，使具有其相关捕获核苷酸的第二寡核苷酸和任选的第三寡核苷酸，或者源自经使用探针的第四寡核苷酸(如果使用连接酶)与另一相应的第一寡核苷酸分子杂交或以其他方式复合，从而产生新的寡核苷酸双链体，其与原始经使用的探针相对应，即具有相同的化学和物理结构。然后使该产物经受重复的步骤(3)，从而释放可检测状态的另外的荧光团，并再次再生第四寡核苷酸或具有捕获的核苷酸的第二寡核苷酸和任选地相关的第三寡核苷酸。通过这种方式，允许迭代进行步骤(2)和(3)，从而进一步增强荧光信号；原则上直到基本上所有相关的第一寡核苷酸被消耗。在一个实施方案中，步骤(4)与步骤(2)和(3)的每次迭代同时进行，而在另一实施方案中，首先迭代步骤(2)和(3)以产生多个带切口的第一寡核苷酸，然后在步骤(4)中同时进行核酸外切。作为这些实施例中的任何一个的结果，观察者看到荧光信号的增强比其他方式所获得的更大。
在一个特别优选的实施方案中，本发明的方法全部或部分地在微滴流中进行，其中至少一些微滴包含单核苷三磷酸；适当地是其顺序反映分析物的原始核苷酸序列的流。例如，这种方法可以通过将步骤(1)中产生的核苷三磷酸逐个地插入相应的含水微滴流中而保持在不混溶的载体溶剂(例如烃或硅油)中以帮助保持有序化而开始。或者，这可以通过在消化(焦磷酸解)区下游直接产生微滴来实现；例如，通过使反应介质从适当尺寸的微滴头出现到溶剂的流动流中。或者，可以将来自步骤(1)的小等份反应介质定期并依次注入悬浮在溶剂中的预先存在的含水微滴流中。如果采用后一种方法，则每个微滴可能已经包含探针的各种组分以及实现步骤(2)至(4)所需的酶和任何其他试剂(例如缓冲液)。在另一种方法中，可以使在前一实施方案中产生的微滴随后与这种预先存在的微滴流结合以实现类似的结果。在这些微滴方法中，步骤(5)优选包括将微滴输送到储存区并检查每个微滴以识别释放的荧光团。此后，将从每个微滴获得的结果组合成原始核酸分析物序列的数据特征流。
为了避免给定的微滴含有多于一个核苷三磷酸的风险，优选在步骤(1)中以一速率释放每个核苷三磷酸，使得每个填充的微滴平均分成1-20个，优选2-10个空的微滴。此后，使溶剂中填充和未填充的微滴流沿着流动路径(合适地是微流体流动路径)以一定的速率和方式流动，使得它们保持在分离状态并且没有机会彼此结合。合适地，所用微滴的有限直径小于100微米，优选小于50微米，更优选小于20微米，甚至更优选小于15微米。最优选地，它们的直径在2-20微米的范围内。在一个实施方案中，通过整个系统的微滴流速为每秒50-3000个微滴，优选100-2000个微滴。
在本发明的第三方面，还提供了一种多组分生物探针，其特征在于包括(a)第一单链寡核苷酸，其包括核酸外切酶封闭位点，位于所述封闭位点5'侧并包括用于捕获单核苷三磷酸的单核苷酸捕获位点的限制性核酸内切酶识别位点，以及位于所述识别位点5'侧并被布置为使荧光团被猝灭的至少一个荧光团区域，和(b)第二和任选的第三单链寡核苷酸，其能够与该捕获位点任一侧的第一寡核苷酸上的互补区杂交。
在一个实施方案中，核酸外切酶封闭位点位于第一寡核苷酸的3'末端附近。在另一个实施方案中，核酸外切酶封闭位点通过使第一寡核苷酸呈环形(即闭环)来实现。
在本发明的第四方面，还提供了一种多组分生物探针，其特征在于包括(a)第一单链寡核苷酸，其包括核酸外切酶封闭位点，位于所述封闭位点3'侧并包括用于捕获单核苷三磷酸的单核苷酸捕获位点的限制性核酸内切酶识别位点，以及位于所述识别位点3'侧并被布置为使荧光团被猝灭的至少一个荧光团区域，和(b)第二和任选的第三单链寡核苷酸，其能够与该捕获位点任一侧的第一寡核苷酸上的互补区杂交。
在一个实施方案中，核酸外切酶封闭位点位于第一寡核苷酸的5'末端附近。在另一个实施方案中，核酸外切酶封闭位点通过使第一寡核苷酸呈环形(即闭环)来实现。
优选地，在第二和第三实施方案中都存在第二和第三寡核苷酸。
在这些第三方面和第四方面的一个实施方案中，第一寡核苷酸上的荧光团彼此紧密布置以便自猝灭。在另一个实施方案中，第一寡核苷酸包括猝灭剂以猝灭荧光团区域中的荧光团。合适的荧光团和猝灭剂包括但不限于上述那些。在另一个实施方案中，第二和第三寡核苷酸通过如上所述的接头区连接；接头区本身优选是另一个寡核苷酸区域。
如上所述，出于DNA或RNA测序的目的，本文所述的生物探针可以组装成相应的生物探针系统，该系统包含多个不同的第一寡核苷酸类型，所述第一寡核苷酸类型仅在捕获位点的核碱基特征和使用的荧光团上不同。在一个实施方案中，可以使用仅在捕获位点的核碱基特征和荧光团上不同的一种、两种、三种、四种或更多种不同的第一寡核苷酸类型。对于天然存在的DNA或RNA，这些核碱基包含A、G、C和T或U。在另一个实施方案中，使生物探针系统表现为试剂盒，其进一步包含连接酶、聚合酶、限制性核酸内切酶和表现出3'-5'或5'-3'核酸外切活性的酶中的至少一种，视情况而定。
上述测序方法中使用的检测方法通常还适用于通过仅将上述方法的步骤(2)至(5)应用到一个或每个单核苷三磷酸成分来分析、表征或定量生物样品或由其得到的核酸分析物中的单核苷三磷酸。在这种另外的应用中，这些步骤(2)至(5)的性质以及所采用的生物探针将适当地如本文所述。
现在参考以下实施例说明本发明。
实施例1-探针的制备和使用
制备具有以下核苷酸序列的单链第一寡核苷酸1：
5’-GCTGTGCCGGGCTCGTGTCTCTGCGTTTCTTGFFQGTGTGCATTGCATAGGTTCACGATAX-3’
其中A、C、G和T代表带有DNA相关特征核碱基的核苷酸；F代表使用常规胺连接化学方法用Atto700染料标记的脱氧胸苷核苷酸(T)；Q代表用BHQ-2猝灭剂标记的脱氧胸苷核苷酸；X代表反向3'dT核苷酸。它在其5'末端的第42个碱基处还包含捕获区域(A核苷酸)(可选择性捕获脱氧核苷三磷酸(dNTPs)混合物中的脱氧胸苷三磷酸核苷酸(dTTPs))以及切口限制性核酸内切酶Nb.BsrDI，“NNCATTGC”的识别序列。
还制备了另一单链寡核苷酸2(其包含具有与第一寡核苷酸的捕获位点侧翼的3'区域互补的序列的寡核苷酸区域)以及单链寡核苷酸3(其包含具有与第一寡核苷酸的捕获位点侧翼的5'区域互补并且具有单个碱基错配的序列的寡核苷酸区域，5'磷酸基团和3'反向dT核苷酸的区域)。它们具有以下核苷酸序列：
寡核苷酸2：5'-CGTGAACCTATGCAA-3'
寡核苷酸3：5'-PGCGAACGTAAAATGTCATGGX-3'
其中P代表5'磷酸基团，X代表反向3'dT核苷酸。
然后制备包含探针的反应混合物。它具有对应于源自以下配方的成分：
20uL 5x缓冲液pH 8.0
10uL寡核苷酸1，100nM
10uL寡核苷酸2，10nM
10uL寡核苷酸3，1000nM
10uL精胺溶液，10mM
10U Nb.BsrDI切口核酸内切酶(例如，New England Biolabs Inc.)
3.5U大肠杆菌连接酶
2.9U Bst大片段聚合酶
2.7U Platinum Pfx聚合酶
6.7U耐热无机焦磷酸酶
dNTP的10uL混合物，0.25nM
加水至100uL
其中5x缓冲液包含以下混合物：
25uL三羟甲基氨基甲烷醋酸盐(Trizma Acetate)，1M，pH 8.0
50uL醋酸镁水溶液，1M
25uL醋酸钾水溶液，1M
50uL Triton X-100表面活性剂(10％)
500μg BSA
加水至1ml
然后通过将混合物在37℃下温育10分钟来进行dTTP的捕获和寡核苷酸2与寡核苷酸3的连接以形成经使用的探针，然后将温度升高至56℃保持120分钟以允许第一寡核苷酸的迭代切割。然后将温度升高到72℃，保持15分钟，以消化带有荧光团和猝灭剂的切割的第一寡核苷酸组分。随着反应的进行，使用CLARIOStar酶标仪(例如BMG Labtech)测量反应混合物中Atto700染料的荧光强度。
在存在和不存在反应的dNTP成分的情况下，监测最后15分钟消化步骤中荧光强度的增长，结果如图1所示。由此可见，探针可有效捕获dTTP，并且本发明方法的循环性质导致荧光信号的快速增长。相反，在比较实验(在反应混合物中不存在dNTP)中，寡核苷酸1上的Atto700染料没有展示任何显著程度的荧光。
实施例2-使用探针的液滴微流体方法
图2示意性地示出了微流体测序装置，其中使每个含有单核苷酸碱基的微滴与上述类型的探针进行反应。
使包含通过源自人DNA的100个核苷酸碱基多核苷酸分析物的渐进焦磷酸解获得的单核苷酸三磷酸流的水性介质1流过由PDMS聚合物制成的10微米直径的微流体管。焦磷酸解反应本身通过在72℃下使含水并缓冲(pH 7.5)的反应介质流(该反应介质包含Bst聚合酶和浓度均为每升2毫摩尔的焦磷酸钠和氯化镁的溶液)通过玻璃微珠来进行，其中，分析物预先通过琥珀酰桥附着在玻璃微珠上。在微珠下游的1中的单个核苷酸的顺序对应于分析物的序列。1从液滴头2出现进入第一室3，在那里它与不混溶的轻质硅油4的一个或多个流接触。选择这些流的速度以避免湍流混合并产生悬浮在油中、每个直径约为8微米的水性球形液滴5。通常，调节速率以使得在相邻的填充液滴之间平均存在10个空液滴。然后将5的流沿着相同直径的第二微流体管向前传送到第二室6，5微米的水性球形液滴7的第二流也通过第二液滴头8进料到第二室6中。使液滴5和7以顺序方式结合以形成直径约9微米的增大的水性液滴9。每个7中含有无机焦磷酸酶，以破坏每个5中存在的任何残留的焦磷酸根阴离子。
然后通过微流体管以相同的速率将9的流送入第三室10，在第三室10中，这些液滴与通过相应的液滴头12进料到其中的5微米的水性球形液滴11的第三流接触。每个9在室6和10之间移动的时间c.2分钟。
然后使液滴9和11在10中结合以产生液滴13(直径约10微米)。每个11中含有嗜温连接酶、具有3'-5'核酸外切酶活性的嗜热聚合酶、切口限制性核酸内切酶Nb.BsrDI(例如New England Biolabs Inc.)和探针系统，其中所述探针系统包含四组与实施例1中所述的那些相似的单链寡核苷酸(分别具有用如上所述的不同的荧光团标记的不同的第一寡核苷酸，)。
然后将如此形成的结合微滴13的流在37℃下温育10分钟，然后在56℃下温育120分钟，然后在72℃下温育15分钟。在该时间结束时，将13传输到检测系统14。
检测系统(未示出)通常包括检测窗口，其中每个液滴用来自激光器的入射光进行检查。然后，该光的作用使得每个液滴中释放的荧光团以单核苷酸碱基的特征方式发荧光，所述单核苷酸碱基最初结合到完整探针中(或者如果液滴最初是空的，则基本上完全没有)。然后在与上述四种寡核苷酸组相关的四个荧光团的四个特征波长处检测荧光的存在或不存在。因此，当依次检查液滴时，原始的多核苷酸分析物中的核苷酸碱基序列可以被有效地读出。

Claims (23)

1.对核酸进行测序的方法，其特征在于以下步骤：(1)通过核酸的渐进酶促消化产生单核苷三磷酸的流；(2)通过在聚合酶存在下使至少一个所述单核苷三磷酸与相应的生物探针反应来产生至少一个寡核苷酸使用的探针，所述相应的生物探针包含(a)第一单链寡核苷酸，其包括核酸外切酶封闭位点，位于所述封闭位点5'侧并包括用于捕获所述单核苷三磷酸的单核苷酸捕获位点的限制性核酸内切酶识别位点，和位于所述识别位点5'侧的至少一个荧光团区域，其被布置为使所述荧光团被猝灭，和(b)第二和任选的第三单链寡核苷酸，它们分别与第一寡核苷酸分离，并能够与位于所述捕获位点3'和5'侧翼的第一寡核苷酸上的互补区域杂交；(3)用限制性核酸内切酶在所述识别位点切割所述经使用的探针的第一寡核苷酸链，以产生带有所述荧光团的第一寡核苷酸组分；(4)用具有3'-5'核酸外切活性的酶消化所述第一寡核苷酸组分，以产生可检测状态的荧光团，以及(5)检测步骤(4)中释放的所述荧光团。
2.对核酸进行测序的方法，其特征在于以下步骤：(1)通过核酸的渐进酶促消化产生单核苷三磷酸的流；(2)通过在聚合酶存在下使至少一个所述单核苷三磷酸与相应的生物探针反应来产生至少一个寡核苷酸使用的探针，所述相应的生物探针包含(a)第一单链寡核苷酸，其包括核酸外切酶封闭位点，位于所述封闭位点3'侧并包括用于捕获所述单核苷三磷酸的单核苷酸捕获位点的限制性核酸内切酶识别位点，以及位于所述识别位点3'侧的至少一个荧光团区域，其被布置为使所述荧光团被猝灭，和(b)第二和任选的第三单链寡核苷酸，它们分别与第一寡核苷酸分离，并能够与位于所述捕获位点3'和5'侧翼的第一寡核苷酸上的互补区域杂交；(3)用限制性核酸内切酶在所述识别位点切割所述经使用的探针的第一寡核苷酸链，以产生带有所述荧光团的第一寡核苷酸组分；(4)用具有5'-3'核酸外切活性的酶消化所述第一寡核苷酸组分，以产生可检测状态的荧光团，以及(5)检测步骤(4)中释放的所述荧光团。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)在连接酶的存在下进行，以在所述识别位点附近产生基本上双链的经使用的探针。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，通过使所述第一寡核苷酸为闭环或通过在其中包括双链区来实现所述核酸外切酶封闭位点。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述限制性核酸内切酶是适于仅切割所述第一寡核苷酸的切口核酸内切酶。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，迭代步骤(2)和(3)，并且在所述迭代之后或与所述迭代同时进行步骤(4)。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述经使用的探针包括第四寡核苷酸，所述第四寡核苷酸包含第二寡核苷酸、核苷三磷酸和第三寡核苷酸。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述第二寡核苷酸和所述第三寡核苷酸通过接头区连接。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述第四寡核苷酸包含闭环。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其特征在于，所述第二和/或第三寡核苷酸对所述限制性核酸内切酶的切割具有抗性。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其特征在于，所述荧光团区域包括猝灭剂以猝灭所述荧光团。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)在比步骤(2)更高的温度下进行，和/或步骤(4)在比步骤(3)更高的温度下进行。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其特征在于，所述探针包括多达四种不同的第一寡核苷酸类型的系统，每种类型的寡核苷酸具有对天然存在的或合成的DNA或RNA的不同的特征核碱基之一具有选择性的不同捕获位点和不同的特征荧光团。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其特征在于，所述生物探针包括第二和第三寡核苷酸。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(1)进一步包括在相应的微滴中包含每个单核苷三磷酸，并且在每个微滴中进行步骤(2)至(5)。
16.分析、表征或定量生物学样品或核酸分析物的单核苷酸三磷酸成分的方法，其特征在于基本上由权利要求1至15中任一项所述的方法的步骤(2)至(5)组成。
17.多组分生物探针，其特征在于包括(a)第一单链寡核苷酸，其包括核酸外切酶封闭位点，位于所述封闭位点5'侧并包括用于捕获单核苷三磷酸的单核苷酸捕获位点的限制性核酸内切酶识别位点，和位于所述识别位点5'侧并被布置为使荧光团被猝灭的至少一个荧光团区域，和(b)分离的第二和任选的分离的第三单链寡核苷酸，其能够与位于所述捕获位点任一侧的第一寡核苷酸上的互补区域杂交。
18.多组分生物探针，其特征在于包括(a)第一单链寡核苷酸，其包括核酸外切酶封闭位点，位于所述封闭位点3'侧并包括用于捕获单核苷三磷酸的单核苷酸捕获位点的限制性核酸内切酶识别位点，和位于所述识别位点3'侧并被布置为使荧光团被猝灭的至少一个荧光团区域，和(b)分离的第二和任选的分离的第三单链寡核苷酸，其能够与位于所述捕获位点任一侧的第一寡核苷酸上的互补区域杂交。
19.根据权利要求17或权利要求18所述的多组分生物探针，其特征在于，通过使所述第一寡核苷酸为闭环来实现所述核酸外切酶封闭位点。
20.根据权利要求17至19中任一项所述的多组分生物探针，其特征在于，所述第一寡核苷酸包括猝灭剂以猝灭所述荧光团区域中的荧光团，和/或所述第二寡核苷酸和第三寡核苷酸通过寡核苷酸接头区连接。
21.多组分生物探针试剂盒，其特征在于包括权利要求17至20中任一项所述的多个不同类型的第一寡核苷酸的组合，所述组合中的每个第一寡核苷酸具有对不同特征核碱基具有选择性的不同捕获位点和不同的特征荧光团。
22.根据权利要求21所述的多组分生物探针试剂盒，其特征在于，所述第一寡核苷酸是权利要求17、19或20之一所述的类型，包括第三寡核苷酸，并且所述试剂盒进一步包括聚合酶、连接酶、限制性核酸内切酶和具有3'-5'核酸外切活性的酶中的一种或多种。
23.根据权利要求21所述的多组分生物探针试剂盒，其特征在于，所述第一寡核苷酸是权利要求18、19或20中任一项所述的类型，包括第三寡核苷酸，并且所述试剂盒进一步包括聚合酶、连接酶、限制性核酸内切酶和具有5'-3'核酸外切活性的酶中的一种或多种。
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