CN115176031A

CN115176031A - 简化的多核苷酸序列检测方法

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Publication number: CN115176031A
Application number: CN202080097442.6A
Authority: CN
Inventors: 宝琳娜·克劳迪娜·波瓦罗斯卡; 安娜·路易莎·布拉斯·道斯·桑托斯·里贝罗·达席尔瓦-韦瑟利; 马格达莱纳·斯托拉雷克-雅努什凯维奇; 巴纳比·威廉·巴姆福思
Original assignee: Bio Fidelity Ltd
Current assignee: Bio Fidelity Ltd
Priority date: 2019-12-23
Filing date: 2020-12-23
Publication date: 2022-10-11
Also published as: US20210189478A1; JP2023509876A; EP3842549B1; EP4081659A1; CA3165731A1; EP3842549A1; KR20220140492A; IL293937A; US11332780B2; GB201919186D0; AU2020414435A1; ES2924953T3; WO2021130494A1

Abstract

本文提供了改进的多核苷酸检测的方法。

Description

简化的多核苷酸序列检测方法

本发明涉及一种简化的多核苷酸序列检测方法，该方法适用于检测大量诊断标志物，包括用于鉴定癌症、感染性疾病和移植器官排斥的那些标志物的存在。它对于伴随诊断测试(companion diagnostic testing)也有用，在伴随诊断测试中，必须可靠和低成本地鉴定一组标志物。

聚合酶链式反应(PCR)是一种众所周知的强有力的技术，用于将实验室和诊断样品中存在的DNA或RNA扩增到可以被可靠检测和/或定量的程度。然而，当用于研究含有低水平的这样的分子的分析物样品时，它受到许多限制。首先，虽然该技术可以检测少至单个靶分子，但由于样品中存在的其他核酸序列的不希望的扩增，它容易产生假阳性结果。这使得选择用于启始反应的寡核苷酸引物成为关键；这继而使得设计具有所需特异性水平的引物变得相对复杂。因此，目前市场上许多基于PCR的测试具有有限的特异性。

第二个缺点是，基于PCR的方法的多路复用在实践中被限制在最多几十个靶序列(通常不超过10个)以避免引物-引物相互作用，导致需要相对狭窄的操作窗口。

另一个问题是，由于PCR反应以指数方式循环，靶的定量很困难；反应效率的微小变化对生成的可检测物质的量有巨大影响。因此即使有适当的控制和适当的校准，定量通常限于3倍左右的精确度。

最后，通过PCR扩增方法进行研究的目标区域中的突变可能具有不必要的副作用。例如，有这样的实例，其中因为目标生物体在测试引物所靶向的遗传区域发生突变，导致大量假阴性，FDA批准的测试不得不撤销。相反，如果特定的单核苷酸多态性(SNP)是扩增的目标，那么当野生型变体存在时，PCR方法通常会产生假阳性。避免这种情况需要非常仔细的引物设计，并进一步限制了多路复用的功效。这在搜索SNP的组时尤其重要，因为这是癌症测试/筛查或伴随诊断的常见要求。

US2006/110765 A1(Wang等人)教导了在错配处的酶促裂解，这通常是低效且不是高度特异性的反应。此外，如在Wang等人中所公开的，因为在错配处使用裂解，探针与样品中相似序列的脱靶杂交会导致假阳性结果。也不可能区分相同或邻近位置上的两个不同的遗传变体，因为它们都将导致相同探针的裂解和扩增。因此，Wang等人的教导将导致反应方案的低灵敏度和低特异性。相比之下，本发明所公开的方法的技术效果提供了快速、高效的方法，对dsDNA具有高特异性，可以通过错配有效地被阻断。此外，本发明的方法对被靶向的遗传变体极其特异，能够在相同或邻近位置的不同变体之间进行区分。

US2009/239283 A1(Liu等人)教导了使用通过焦磷酸解去除的不可延伸的3'末端，使得能够去除3'封闭修饰的定制聚合酶的基因工程成为必要。相比之下，本发明利用了现有聚合酶固有的天然焦磷酸解活性，并且不使用3'封闭修饰。在Liu等人中公开的方法还依赖于从探针的一部分中仅移除末端碱基以实现后续的扩增，并且通过使用3'封闭修饰而限制于这个实施方案。相比之下，本发明公开的方法实现了这样的实施方案，其中需要从探针上逐步移除多于一个碱基来启动反应，使其对背景DNA或其他探针的瞬时脱靶退火实质上更鲁棒，背景DNA或其他探针的瞬时脱靶可能导致末端碱基的不必要的移除。

发明内容

我们现在已经开发了新的简化方法，该方法建立在使用在我们早期专利(PCT/GB2019/052017)中使用的焦磷酸解(pyrophosphorolysis)方法的经验基础上，以克服这些限制中的许多限制。为此，它利用了焦磷酸解(一种将不能在单链寡核苷酸底物或包含封闭基团或核苷酸错配的双链底物上有效进行的反应)的双链特异性。新方法比在PCT/GB2019/052017中公开的方法运行更快、复杂度更低和成本更低。因此，根据本发明，提供了一种检测给定核酸分析物中的靶多核苷酸序列的方法，该方法包括以下步骤：

(a)将一种或更多种核酸分析物引入到第一反应混合物，该第一反应混合物包含：

i.单链探针寡核苷酸A₀；

ii.焦磷酸解酶；和

iii.连接酶

其中A₀从3’末端在3’-5’方向上焦磷酸解，以产生至少部分消化的链A₁并且A₁经历连接以形成A₂；

(b)检测来源于前一步骤的产物的信号，其中产物是A₂或其部分，或者A₂的多于一个拷贝或其部分的多于一个拷贝，并由此推断分析物中存在或不存在该多核苷酸靶序列。

可应用本发明的方法的分析物是包括被寻找的靶多核苷酸序列的那些核酸，诸如天然存在的或合成的DNA或RNA分子。在一种实施方案中，分析物通常存在于含有分析物和其他生物材料的水性溶液中，并且在一种实施方案中，分析物将与其他背景核酸分子一起存在，这些背景核酸分子并不是测试目的所关注的。在一些实施方案中，相对于这些其他核酸组分，分析物将以低的量存在。优选地，例如，当分析物来源于含有细胞物质的生物样品时，在执行方法的步骤(a)之前，将使用样品制备技术诸如过滤、离心、色谱或电泳，除去一些或所有这些其他核酸和外来生物物质。合适地，分析物来源于取自哺乳动物受试者(尤其是人类患者)的生物样品，诸如血液、血浆、痰、尿液、皮肤或活组织检查。在一种实施方案中，将对生物样品进行裂解，以便通过破坏任何存在的细胞来释放分析物。在其他实施方案中，分析物可能已经以游离形式存在于样品本身中；例如在血液或血浆中循环的无细胞DNA。

附图简述

图1：用于简化的多核苷酸序列检测方法的方案。

图2：比较当5’-3’核酸外切酶消化步骤发生在预扩增步骤期间和当它移到方案的焦磷酸解/连接步骤(如在方案3-5中)时检测到的荧光水平(代表特定靶分析物序列的存在)的图。在这个实例中，5’-3’核酸外切酶是Lambda。

图3：发明人已经使用一系列不同的PPL酶测试了本发明方案3的方法。图3(A)显示使用Mako、Klenow和Bsu的1％MAF T790M的检测。图3(B)显示，在不同的Ppi浓度范围，使用Bst LF的0.5％MAF T790M的检测。即使没有扩展的优化，所有四种酶都表现得非常好。

图4：使用本发明的方案4的方法，使用四种不同的焦磷酸解(PPL)酶Mako、Klenow、Bsu和Bst LF的1％MAF T790M的检测结果。

图5：显示使用根据方案1和方案4的方法在0.5％、0.10％和0.05％MAF外显子19del_6223存在下检测到的荧光水平(代表特定靶分析物序列的存在)的图。

图6：发明人根据方案4检测了0.10％、0.50％和1％MAF的EGFR外显子20T790M。

图7：在RCA步骤中使用和不使用核酸外切酶对1％MAF的EGFR外显子20突变T790M的检测。

图8：发明人研究了PPL:RCA混合比例对0.5％MAF EGFR外显子20T790M检测到的信号强度的影响，其结果显示在图8。可以看到，1:2的PPL:RCA混合的比例导致最低的信号强度，但处在最早的时间点。在时间上紧随其后的是具有更大的信号强度的1:4PPL:RCA混合。在反应的最晚时间点，对1:8PPL:RCA混合观察到最大的信号强度。

图9：显示了根据方案4使用SybrGreenI(50℃和60℃)和Syto82(50℃和60℃)进行的对比实验的结果。

图10：发明人研究了根据方案4使用两种不同酶BST L.F.和BST 2.0WS进行RCA。

图11：发明人研究了不同PPL酶在不同PPL:RCA反应混合物比例对RCA反应的影响。其结果可见于图11(A)1:4PPL:RCA和图11(B)1:8PPL:RCA。除BST L.F.外，所有PPL酶在1:4PPL:RCA比例都影响RCA反应。在1:8PPL:RCA比例，除BST L.F.和Klenow外的所有酶都影响RCA反应。

图12：实施例11的荧光测量结果表明，当寡核苷酸3和4都存在时，反应中荧光信号出现得更快，表明在第一反应混合物中已经发生了寡核苷酸3的焦磷酸解和连接。

图13：在同一反应中检测1％等位基因分数的T790M和C797S_2389的突变。

图14：在一个孔中同时检测三个突变(0.5％等位基因分数)：G719X_6239,G719X_6252,G719X_6253。

图15：针对分析物靶序列将A₁环化以形成A₂的示意图。A₀相对靶在3’-5’方向上从A₀的3’末端被逐步消化，以形成部分消化的链A₁，这显示为步骤(A)和(B)。这种逐步消化使与A₀/A₁的5’末端互补的靶区显露，并且A₁的5’末端然后杂交到这个区域，这在步骤(C)中显示。然后A₁被连接在一起形成环化的A₂，步骤(D)。

图16：实施例14的荧光测量结果显示来自其中A₀发生焦磷酸解形成A₁，随后A₁环化形成针对靶序列的A₂的实施方案的结果。

图17：单链探针寡核苷酸A₀退火至靶多核苷酸序列，以产生为至少部分双链并且其中A₀的3’末端与靶多核苷酸序列形成双链复合物的第一中间产物。在本发明的这个简化实施方案中，存在两个A₀分子和一个靶多核苷酸序列，以说明未退火至靶的A₀如何不参与该方法的另外步骤。在这个说明性实例中，A₀的3’末端与靶多核苷酸序列退火，而A₀的5’末端不与靶多核苷酸序列退火。A₀的5’末端包括5’化学封闭基团、共同引发序列和条形码区域。

部分双链的第一中间产物在焦磷酸解酶的存在下，从A₀的3’末端在3’-5’方向上进行焦磷酸解，以产生部分消化的链A₁、分析物和没有与靶退火的未消化的A₀分子。

图18：A₁退火至单链触发寡核苷酸B，并且A₁链针对B在5’-3’方向延伸以产生寡核苷酸A₂。在这个说明性的实例中，触发寡核苷酸B具有5’化学封闭。任何未消化的A₀退火到触发寡核苷酸B，但是它不能针对B在5’-3’方向上延伸以产生为方法的后续部分的靶的序列。在这个实例中，A₂用至少一种单链引物寡核苷酸引发，并且产生A₂或A₂的区域的多于一个拷贝。

图19：A₁退火到夹板寡核苷酸D，并且然后通过连接其3’末端和5’末端而环化。现在环化的A₂用至少一种单链引物寡核苷酸引发，并且产生A₂或A₂的区域的多于一个拷贝。在这个说明性的实例中，由于3’-修饰(在这个实例中是化学修饰)或通过D的3’末端和A₂的相应区域之间的核苷酸错配，夹板寡核苷酸D不能针对A₁延伸。

图20：夹板寡核苷酸D的3’区域退火到A₁的3’区域，而夹板寡核苷酸D的5’区域退火到连接探针C的5’区域。因此，第二中间产物A₂由A₁、C和任选地由A₁在5’-3’方向上延伸以与C的5’末端相接而形成的中间区域组成。在这个说明性实例中，连接探针C具有3’化学封闭基团，以便3’-5’核酸外切酶可用于消化任何未连接的A₁。

A₂用至少一种单链引物寡核苷酸引发，并且产生A₂或A₂的区域的多于一个拷贝。

实施方案的描述

在本发明的一个方面，提供了检测样品中存在的给定核酸分析物中的靶多核苷酸序列的方法，方法包括以下步骤：

(a)将一种或更多种核酸分析物引入到第一反应混合物，所述第一反应混合物包含：

i.单链探针寡核苷酸A₀；

ii.焦磷酸解酶；和

iii.连接酶

(b)检测来源于前一步骤的产物的信号，其中产物是A₂或其部分，或者A₂的多于一个拷贝或其部分的多于一个拷贝，并由此推断分析物中存在或不存在多核苷酸靶序列。

在一些实施方案中，第一反应混合物还包含焦磷酸根离子源(source ofpyrophosphate ions)。

在一些实施方案中，A₀的3’末端与靶多核苷酸序列完全互补。

在一些实施方案中，连接酶基本上缺乏单链连接活性。

在一些实施方案中，第一反应混合物还包含至少一种与A₀的一部分基本上互补的单链引物寡核苷酸，和三磷酸脱氧核糖核苷酸(dNTP)。

在一些实施方案中，第一反应混合物还包含扩增酶。

在一些实施方案中，步骤(a)的产物在步骤(b)之前被引入到第二反应混合物，所述第二反应混合物包含至少一种单链引物寡核苷酸和dTNP。

在一些实施方案中，第二反应混合物还包含扩增酶。

在一些实施方案中，一种或更多种核酸分析物可以被同时引入到第一反应混合物和第二反应混合物。

在一些实施方案中，一种或更多种核酸分析物可以被连续地引入到第一反应混合物和第二反应混合物。

在一些实施方案中，dNTP是热启动dNTP。

热启动dNTP是在3’末端用不耐热保护基团修饰的dNTP这种修饰的存在阻止DNA聚合酶核苷酸掺入，直到使用热激活步骤除去核苷酸保护基团。

在一些实施方案中，在步骤(a)期间，分析物退火到单链探针寡核苷酸A₀，以产生为至少部分双链并且其中A₀的3’末端与分析物靶序列形成双链复合物的第一中间产物。

在一些实施方案中，在步骤(a)期间，第一中间产物从A₀的3’末端在3’-5’方向上被焦磷酸解以产生部分消化的链A₁和分析物。

在一些实施方案中，第一反应混合物还包含连接探针寡核苷酸C，并且部分消化的链A₁在3’末端与C的5’末端连接以产生寡核苷酸A₂。

在一些实施方案中，部分消化的链A₁通过其3’末端和5’末端的连接环化以产生寡核苷酸A₂。

在一些实施方案中，A₁的连接发生于：

步骤(a)期间；或

步骤(b)期间；或

步骤(a)和(b)之间。

在一些实施方案中，第一反应混合物还包含5’-3’核酸外切酶，并且A₀的5’末端被赋予对5’-3’核酸外切酶消化的抗性。

在一些实施方案中，在给定的核酸分析物的扩增之后和在加入第一反应混合物(步骤(a))之前，样品还用蛋白酶处理。

在一些实施方案中，第一反应混合物还包含磷酸酶或磷酸水解酶。

在一些实施方案中，在步骤(b)之前或步骤(b)期间，用焦磷酸酶处理前一步骤的产物。

在一些实施方案中，在步骤(b)之前或步骤(b)期间，用核酸外切酶处理前一步骤的产物。

在一些实施方案中，寡核苷酸C还包括保护其免受3'-5'核酸外切酶消化的3'修饰或内部修饰。

在一些实施方案中，寡核苷酸C还包括保护其免受5'-3'核酸外切酶消化的5'修饰。

在一些实施方案中，第一反应混合物或第二反应混合物还包含夹板寡核苷酸D。

在一些实施方案中，D包含与A₁的3’末端互补的寡核苷酸区域和与寡核苷酸C的5’末端或A₁的5’末端互补的区域。

在一些实施方案中，由于3’修饰或通过D的3’末端和A₁的相应区域之间的错配，D不能针对A₁进行延伸。

在一些实施方案中，执行A₀的焦磷酸解以形成部分消化的链A₁的酶也扩增A₂。

在一些实施方案中，使用一种或更多种寡核苷酸荧光结合染料或分子探针实现检测。

在一些实施方案中，由生成A₂的扩增子导致的信号随时间的增加用于推断分析物中靶序列的浓度。

在一些实施方案中，使用了多于一种探针A₀，每种探针A₀对不同的靶序列有选择性，并且每种探针A₀包含识别区，并且特征还在于源于A₂的扩增子包含这个识别区，并且因此通过检测识别区来推断分析物中存在的靶序列。

在一些实施方案中，使用分子探针或通过测序进行识别区的检测。

在一些实施方案中，方法的最后步骤还包括以下步骤：

i.使用一种或更多种寡核苷酸荧光结合染料或分子探针标记步骤(b)的产物；

ii.测量产物的荧光信号；

iii.将产物暴露于一组变性条件下；和

通过监测暴露于变性条件期间产物的荧光信号的变化来鉴定分析物中的多核苷酸靶序列。

在一些实施方案中，将一种或更多种核酸分析物拆分为多于一个反应体积，每个体积具有一种或更多种被引入以检测不同的靶序列的探针寡核苷酸A₀。

在一些实施方案中，不同的探针A₀包含共同的引发位点，允许使用单个引物或单组引物来扩增A₂的区域。

在一些实施方案中，提供了检测样品中存在的给定核酸分析物中的靶多核苷酸序列的方法，方法包括以下步骤：

(a)扩增样品中存在的给定核酸分析物；

(b)将步骤(a)的产物引入到第一反应混合物，该混合物包含：

i.单链探针寡核苷酸A₀；

ii.焦磷酸解酶；和

iii.连接酶

其中A₀从3’末端在3’-5’方向上被焦磷酸解，以产生至少部分消化的链A₁并且A₁经历连接以形成A₂；

(c)检测来源于前一步骤的产物的信号，其中产物是A₂或其部分，或者A₂的多于一个拷贝或其部分的多于一个拷贝，并由此推断分析物中存在或不存在多核苷酸靶序列。

根据本发明，提供了检测给定核酸分析物中的靶多核苷酸序列的方法。可以应用本发明的各种方法的分析物可以通过一系列初步步骤从上述生物样品中制备，这些步骤旨在扩增分析物并且将其与通常显著过量存在的背景基因组DNA分离。该方法通常可适用于产生单链靶分析物，并且因此方法在除了与本发明第一方面的方法整合或还包括该方法的一部分的情况下也是有用的。因此，提供了一种用于制备包含靶多核苷酸区域的核酸的至少一种单链分析物的方法，其特征在于以下步骤：(1)通过对包含分析物和任选地背景基因组DNA的生物样品进行扩增循环来产生分析物的扩增子。在一种优选的实施方案中，在聚合酶、核苷三磷酸和至少一种相应的引物对的存在下，使用聚合酶链式反应(PCR)进行扩增，其中一种引物包括5’-3’核酸外切酶封闭基团，和(2)任选地用具有5’-3’核酸外切活性的核酸外切酶消化步骤(1)的产物。在一种实施方案中，该方法还可以包括(3)使步骤(2)的产物与蛋白酶反应以破坏聚合酶，并且然后(4)通过将步骤(3)的产物加热至超过50℃的温度来使蛋白酶失活。

在一种优选实施方案中，步骤(1)至(4)在本发明第一方面的方法的步骤(a)之前进行，以产生检测来源于生物样品的靶序列的整合方法。在另一种实施方案中，在进行步骤(1)之前，生物样品已经经历细胞裂解。

在步骤(1)的一些实施方案中，核苷三磷酸是天然存在的DNA特有的四种脱氧核苷三磷酸的混合物。在优选的实施方案中，脱氧核苷三磷酸的混合物包含脱氧尿苷三磷酸(deoxyuridine triphosphate，dUTP)而不是脱氧胸苷三磷酸(deoxythymidinetriphosphate，dTTP)，并且步骤(1)还在dUTP-DNA糖基化酶(UDG)的存在下进行，以去除来自先前的测定的任何污染的扩增子。在又另一种实施方案中，在步骤(1)中使用高保真聚合酶，例如以商品名

或Q5出售的那些聚合酶之一。在又另一种实施方案中，聚合酶可以是KAPA HiFi尿嘧啶+DNA聚合酶。

高保真DNA聚合酶有几种保护措施来防止复制DNA时制造错误和传播错误。在聚合过程中，这些酶对正确的核苷三磷酸和不正确的核苷三磷酸之间有明显的结合偏好。如果不正确的核苷酸确实结合在聚合酶活性位点上，由于活性位点复合物的次优结构，掺入会减慢。这种滞后时间增加了不正确的核苷酸在聚合酶进展之前解离的机会，从而允许该过程以正确的核苷三磷酸重新开始。如果插入了不正确的核苷酸，校对DNA聚合酶具有额外的防线。检测到由错配的碱基引起的干扰，并且聚合酶将生长的DNA链的3’末端移动到校对的3’→5’核酸外切酶结构域。在那里，不正确的核苷酸被3’→5’核酸外切酶活性去除，然后链被移回聚合酶结构域，在那里聚合可以继续。

在一些实施方案中，核苷三磷酸是合成的或修饰的脱氧核苷三磷酸的混合物。

在一些实施方案中，核苷三磷酸是四种脱氧核苷三磷酸和合成或修饰的三磷酸脱氧核苷酸的混合物。

在一些实施方案中，步骤(1)使用有限数量的引物和过量的扩增循环进行。通过这种方式，不管分析物的初始量如何，产生固定量的扩增子。因此，避免了在后续步骤之前进行分析物定量的需要。在步骤(1)的另一种实施方案中(其优点是不需要步骤(2))，扩增在引物对的存在下进行，其中两个引物中的一个过量于另一个存在，一旦一个引物被充分利用，则导致产生单链扩增子。

在步骤(2)的一种优选实施方案中，5’引物被选自以下的核酸外切酶封闭基团封闭：硫代磷酸酯键、倒位碱基(inverted base)、DNA间隔基和本领域周知的其他寡核苷酸修饰。在另一种实施方案中，该对引物中的另一个引物在其5’末端具有磷酸基团。

在一些实施方案中，在步骤(3)中使用的蛋白酶是蛋白酶K，并且步骤(4)通过加热到80℃至100℃的温度持续长达30分钟来进行。在一种实施方案中，在步骤(3)中所使用的蛋白酶是蛋白酶K，通过加热到55℃的温度持续5分钟进行步骤(3)，并且通过加热到95℃的温度持续10分钟进行步骤(4)。在另一种实施方案中，在步骤(2)之后的一些时间点，用磷酸酶或磷酸水解酶处理反应介质，以除去可能存在的任何残余核苷三磷酸。

在一些实施方案中，分析物中的靶多核苷酸序列将是癌性肿瘤细胞的DNA或RNA中的基因或染色体区域，并且其特征在于存在一个或更多个突变；例如以一种或更多种单核苷酸多态性(SNP)的形式。因此，本发明将可用于监测和/或治疗疾病复发。治疗后被宣布无疾病的患者可能会随着时间的推移受到监测，以检测疾病的复发。这需要非侵入性地进行，并且要求从血液样品灵敏地检测靶序列。同样，对于某些癌症，治疗后患者体内仍有残留的癌细胞。使用本发明监测患者血液中存在的这些细胞(或无细胞DNA)的水平，允许检测疾病的复发或当前治疗的失败和切换到替代方案的需求。

在一些实施方案中，对靶多核苷酸序列的检测将允许在疾病治疗期间重复测试患者样品，以允许对产生的治疗抗性进行早期检测。例如，表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂，诸如吉非替尼、埃罗替尼，通常用作非小细胞肺癌(NSCLC)的一线治疗。在治疗过程中，肿瘤通常会在EGFR基因中产生突变(例如T790M、C797S)，这产生对治疗的抗性。对这些突变的早期检测允许患者转向替代疗法。

在一些实施方案中，分析物中的靶多核苷酸序列将是胎儿来源的DNA或RNA中的基因或染色体区域，并且其特征在于存在一个或更多个突变；例如以一种或更多种单核苷酸多态性(SNP)的形式。因此，与其他可用的检测技术相比，本发明可用于在妊娠的更早阶段检测非常低等位基因分数的突变。

在另一种实施方案中，靶多核苷酸序列可以是来源于其他方面健康个体的基因或基因组区域，但是获得的遗传信息可以有助于在人类群体中的一个或更多个确定的群体中生成允许得出医学或治疗结论的有价值的伴随诊断信息。

在又另一种实施方案中，靶多核苷酸序列可以是感染性疾病特有的，或者是感染性疾病对用某些疗法进行治疗的抗性特有的；例如，细菌或病毒的基因或染色体区域特有的多核苷酸序列，或其中赋予对疗法的抗性的突变。

在一些实施方案中，靶多核苷酸序列可以是供体DNA特有的。当移植的器官被患者排斥时，来自该器官的DNA脱落进入患者的血流中。该DNA的早期检测将允许早期检测排斥。这可以使用供体特异性标志物的定制组，或者通过使用已知在群体中常见的变体的组来实现，其中一些将存在于供体中，并且一些存在于接受者中。因此，通过请求保护的方法能够随时间对器官接受者进行常规监测。

在又另一种实施方案中，使用探针的不同组合的方法的不同版本(见下文)被并行使用，使得可以同时筛选分析物的多于一个靶序列；例如癌症源、癌症指示物或多于一种感染源。在该方法中，通过并行应用该方法获得的扩增产物与包括一种或更多种寡核苷酸结合染料或序列特异性分子探针诸如分子信标、发夹探针等的检测组接触。因此，在本发明的另一个方面，提供了至少一种探针和任选地一种连接寡核苷酸与一种或更多种对靶多核苷酸序列有选择性的化学和生物探针组合的使用，或者至少一种探针和任选地一种连接寡核苷酸与使用测序来鉴定扩增的探针区域组合的使用。

在一些实施方案中，单链探针寡核苷酸A₀包含引发区域和与待检测的靶多核苷酸序列互补的3’末端。通过这种方式，产生了为至少部分双链的第一中间产物。在一种实施方案中，该步骤在过量A₀的存在下和在含有分析物和任何其他核酸分子的水性介质中进行。

在步骤(a)期间，第一中间产物的双链区从其A₀链的3’末端在3’-5’方向上被焦磷酸解。因此，A₀链被逐步消化，产生部分消化的链；以下称为A₁。当探针寡核苷酸错误地与非靶序列杂交时，焦磷酸解反应将在任何错配处停止，阻止该方法的后续步骤继续进行。在另一种实施方案中，这种消化继续，直到A₁缺乏与分析物或其中的靶区域形成稳定的双链体的充分的互补性。此时，各个链然后通过解链分离，从而产生单链形式的A₁。在典型的焦磷酸解条件下，这种分离发生在分析物和A₀之间有6至20个互补核苷酸时。

在另一种实施方案中，消化继续直到A₁与分析物或其中的靶区域缺乏使焦磷酸解酶结合或焦磷酸解反应继续进行的足够的互补性。这通常发生在分析物和探针之间剩余6至20个互补核苷酸时。在一些实施方案中，这种情况发生在剩余6至40个互补核苷酸时。

在其中使用与A₁的5’末端和3’末端具有互补性的夹板寡核苷酸D(见下文)的另一种实施方案中，消化继续进行，直到A₁和靶之间的互补长度减少到在能量上有利于寡核苷酸D从A₁置换分析物分子的点。这通常发生在A₁和分析物分子之间的互补性区域与寡核苷酸D和A₁的3’末端之间的互补性区域的长度相似或更短时，但也可能发生在A₁和分析物分子之间的互补性比寡核苷酸D和A₁的3’末端之间的互补性区域更长时，因为寡核苷酸D的分子内杂交的有利性，它可能已经与A₁的5'末端杂交。

在另一种实施方案中，其中使用分析物分子作为夹板进行A₁的连接(见图16)，消化持续到A₁的5’末端能够与分析物分子杂交，使得A₁的3’末端和5’末端是相邻的并且仅被一个切口(nick)分开，在切口处，它们被连接酶连接在一起，并且消化不再能够进行。

合适地，焦磷酸解在反应介质中、在20℃至90℃的温度范围内、在至少一种显示焦磷酸解活性的聚合酶和焦磷酸根离子源的存在下进行。关于应用于多核苷酸消化的焦磷酸解反应的进一步信息可以在例如J.Biol.Chem.244(1969)pp.3019-3028或我们早期的专利申请中找到。

在一些实施方案中，焦磷酸解步骤由过量聚焦磷酸(polypyrophosphate)源的存在驱动，合适的源包括含有3个或更多个磷原子的那些化合物。

在一些实施方案中，第一反应混合物包含过量聚焦磷酸源。

在一些实施方案中，焦磷酸解步骤由过量的修饰的焦磷酸源的存在驱动。合适的修饰的焦磷酸包括用其他原子或基团取代桥接氧的那些，或在其他氧上用取代或修饰基团取代的焦磷酸(或聚焦磷酸)。本领域技术人员将会理解，存在许多这样的适用于本发明的修饰的焦磷酸的实例，它们的非限制性选择是：

在一些实施方案中，第一反应混合物包含过量修饰的聚焦磷酸源。

在一种优选的实施方案中，焦磷酸根离子源是PNP、PCP或三聚磷酸(PPPi)。

此外，但不限于，焦磷酸解步骤(b)中使用的焦磷酸根离子源的实例可以在WO2014/165210和WO00/49180中找到。

在一些实施方案中，过量的修饰的焦磷酸源可以表示为Y-H，其中Y对应于通式(X-O)₂P(＝B)-(Z-P(＝B)(O-X))_n-，其中n是1至4的整数；每个Z-独立地选自-O-、-NH-或-CH₂-；每个B独立地是O或S；X基团独立地选自-H、-Na、-K、烷基、烯基或杂环基团，条件是当Z和B都对应于-O-时，并且当n为1时，至少一个X基团不是H。

在一些实施方案中，Y对应于通式(X-O)₂P(＝B)-(Z-P(＝B)(O-X))_n-，其中n是1、2、3或4。在另一种实施方案中，Y基团对应于通式(X-O)₂P(＝O)-Z-P(＝O)(O-H)-，其中X基团之一是-H。在又另一种优选实施方案中，Y对应于通式(X-O)₂P(＝O)-Z-P(＝O)(O-X)-，其中X基团中的至少一个选自甲基、乙基、烯丙基或二甲基烯丙基。

在替代实施方案中，Y对应于通式(H-O)₂P(＝O)-Z-P(＝O)(O-H)-，其中Z是-NH-或-CH₂-或(X-O)₂P(＝O)-Z-P(＝O)(O-X)-，其中X基团都是-Na或-K，并且Z是-NH-或-CH₂-。

在另一种实施方案中，Y对应于通式(H-O)₂P(＝B)-O-P(＝B)(O-H)-，其中每个B基团独立地是O或S，且至少一个是S。

Y的优选实施方案的具体实例包括式(X1-O)(HO)P(＝O)-Z-P(＝O)(O-X2)的那些，其中Z是O、NH或CH₂，并且(a)X1是γ,γ-二甲基烯丙基，并且X2是-H；或者(b)X1和X2都是甲基；或者(c)X1和X2都是乙基；或者(d)X1是甲基且X2是乙基，或反之亦然。

在一些实施方案中，当将使用分子探针进行检测时，探针寡核苷酸A₀被配置为在与靶序列互补的区域的5’侧包括寡核苷酸识别区域，并且所使用的分子探针被设计为退火至该识别区域。在一种实施方案中，只有A₀的3’区域能够退火至靶；即，任何其他区域缺乏与分析物的使得稳定的双链体在进行焦磷酸解步骤的温度存在的充分的互补性。这里和全文中，术语“充分的互补性”是指，就给定区域与分析物上的给定区域具有互补性而言，互补性的区域超过10个核苷酸长。

在本发明的方法的另一方面，提供了替代实施方案，其中用使用双链特异性核酸外切酶的核酸外切酶消化步骤代替任何前述实施方案的磷酸解步骤。本领域技术人员将理解，双链特异性核酸外切酶包括那些在3’-5’方向上阅读的核酸外切酶，诸如ExoIII，以及那些在5’-3’方向上阅读的核酸外切酶，诸如Lambda Exo，等等。

在本发明的一些实施方案中，其中核酸外切酶消化步骤利用双链特异性5’-3’核酸外切酶，A₀的5’末端与靶分析物互补，并且共同的引发序列和封闭基团位于与靶互补的区域的3’侧。在另一种实施方案中，当将使用分子探针进行检测时，探针寡核苷酸A₀被配置为在与靶序列互补的区域的3’侧包括寡核苷酸识别区域，并且所使用的分子探针被设计为退火至该识别区域。

在其中核酸外切酶消化步骤利用双链特异性5’-3’核酸外切酶的本发明的实施方案中，具有3’至5’核酸外切活性的核酸外切酶可以任选地被加入到第一反应混合物中，以消化存在的任何其他核酸分子，同时使A₀和包含部分消化的链A₁的任何材料保持完整。适当地，这种对核酸外切的抗性如本申请中其他地方所述实现。

在本发明的一种优选的实施方案中，A₀的5’末端或引发区5’侧的内部位点被赋予对核酸外切酶解的抗性。通过这种方式，并且在焦磷酸解步骤之后或同时，可以任选地将具有5’-3’核酸外切活性的核酸外切酶添加到反应介质中，以消化存在的任何其他核酸分子，同时使A₀和包含部分消化的链A₁的任何材料完整。合适地，这种对核酸外切酶解的抗性通过在寡核苷酸A₀的所需位点引入一个或更多个封闭基团来实现。在一种实施方案中，这些封闭基团可以选自硫代磷酸酯键(phosphorothioate linkages)和本领域常用的其他骨架修饰、C3间隔基、磷酸基团(phosphate group)、修饰的碱基等。

在一些实施方案中，识别区域将包含条形码编码区(barcoding region)或嵌入在条形码编码区，该条形码编码区具有独特的序列，并适于使用应用于扩增的组分A₂的序列特异性分子探针间接鉴定，或通过这些组分的测序来直接鉴定。可以使用的分子探针的实例包括但不限于分子信标、

探针、

探针等。

在一些实施方案中，使A₂链或其期望区域经历扩增，从而产生多于一个拷贝，通常是数百万个拷贝。这通过用单链引物寡核苷酸引发A₂的区域和随后由A₂衍生的任何扩增子来实现，所述单链引物寡核苷酸例如以正向/反向或有义/反义对的形式提供，其可以退火至A₂的区域和随后A₂衍生的任何扩增子上的互补区域。然后引发的链成为扩增的起点。扩增方法包括但不限于热循环和等温方法，诸如聚合酶链式反应、重组酶聚合酶扩增和滚环扩增；当A₂被环化时，最后一项适用。通过这些方法中的任何一种，A₂的区域的许多扩增子拷贝和在某些情况下它的序列互补物可以被快速产生。执行这些扩增方法中的任何一种的确切方法对于普通技术人员来说是熟知的，并且所采用的确切条件和温度模式在读者所阅读的一般文献中是容易获得的。具体地，在聚合酶链式反应(PCR)的情况下，该方法通常包括使用聚合酶和多种单核苷三磷酸的源在5’-3’方向上针对A₂链延伸引物寡核苷酸，直到产生互补链；将产生的双链产物去杂交以再生A₂链和互补链；重新引发A₂链及其任何扩增子，并且然后多次重复这些延伸/去杂交/重新引发步骤，以将A₂扩增子的浓度建立到其可以被可靠检测的水平。

在替代的实施方案中，第一反应混合物或第二反应混合物还包含用于杂交链式反应(HCR)的组分。

在一些实施方案中，第一反应混合物还包含具有5’磷酸的连接探针寡核苷酸C、与A₁的3’末端和C的5’末端互补的夹板寡核苷酸D，并且部分消化的链A₁在3’末端处与C的5’末端连接以产生寡核苷酸A₂。在一些实施方案中，第二反应混合物还包含发夹寡核苷酸1(HO1)和发夹寡核苷酸2(HO2)，它们中的每一个都包括荧光团和猝灭剂，使得当每个寡核苷酸保持在发夹构型时，荧光团和猝灭剂彼此接触。HO1被设计为使得A₂退火到其上，打开“发夹”结构并使荧光团与猝灭剂分离。现在“打开的”HO1现在能够退火到HO2，打开“发夹”结构并且使荧光团与猝灭剂分离。

在一些实施方案中，存在多于一个发夹寡核苷酸，使得一个A₂的存在能够引起发夹寡核苷酸打开的链式反应，导致产生可检测的荧光信号。这种方法在文献中被称为杂交链式反应(HCR)。

在一些实施方案中，荧光团-猝灭剂对的荧光团选自但不限于荧光素家族、羧基罗丹明家族、花青家族和罗丹明家族的染料。可使用的其他染料家族包括，例如，多卤荧光素家族染料、六氯荧光素家族染料、香豆素家族染料、噁嗪家族染料、噻嗪家族染料、方酸(squaraine)家族染料、螯合镧系染料、从Molecular Probes可获得的商品名称为AlexaFluor J的染料家族、从ATTO-TEC(Siegen，Germany)可获得的商品名称为Atto的染料家族和从Invitrogen(Carlsbad，Calif.)可获得的商品名称为Bodipy J的染料家族。荧光素家族的染料包括例如6-羧基荧光素(FAM)、2’,4’,1,4-四氯荧光素(TET)、2’,4’,5’,7’,1,4-六氯荧光素(HEX)、2’,7’-二甲氧基-4’,5’-二氯-6-羧基罗丹明(JOE)、2’-氯-5’-氟-7’,8’-稠合苯基-1,4-二氯-6-羧基荧光素(NED)、2’-氯-7’-苯基-1,4-二氯-6-羧基荧光素(VIC)、6-羧基-X-罗丹明(ROX)和2’,4’,5’,7’-四氯-5-羧基-荧光素(ZOE)。羧基罗丹明家族的染料包括四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、四丙酮-6-羧基罗丹明(ROX)、德克萨斯红、R110和R6G。花青家族的染料包括Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7。荧光团在商业上是容易获得的，例如从Perkin-Elmer(Foster City,Calif.)、Molecular Probes,Inc.(Eugene,Oreg.)和Amersham GE Healthcare(Piscataway,N.J.)获得。

在一些实施方案中，荧光团-猝灭剂对的猝灭剂可以是荧光猝灭剂或非荧光猝灭剂。荧光猝灭剂包括但不限于TAMRA、ROX、DABCYL、DABSYL、花青染料包括硝基噻唑蓝(NTB)、蒽醌、孔雀石绿、硝基噻唑和硝基咪唑化合物。消散从荧光团吸收的能量的示例性非荧光猝灭剂包括从Biosearch Technologies,Inc.(Novato,Calif.)以商品名称Black Hole^TM可获得的那些，从Epoch Biosciences(Bothell,Wash.)以商品名称Eclipse^TM Dark可获得的那些，从Anaspec,Inc.(San Jose,Calif.)以商品名称Qx1J可获得的那些，从Integrated DNATechnologies(Coralville,Iowa)以商品名称ZEN和TAO可获得的那些，以及从IntegratedDNA Technologies(Coralville,Iowa)以商品名称Iowa Black^TM可获得的那些。

在一些实施方案中，荧光团-猝灭剂对的荧光团可以是荧光素、Lucifer Yellow、B-藻红蛋白、9-吖啶异硫氰酸酯、Lucifer Yellow VS、4-乙酰氨基-4’-异硫氰基二苯乙烯-2,2’-二磺酸、7-二乙氨基-3-(4’-异硫氰基苯基)-4-甲基香豆素、1-芘丁酸琥珀酰亚胺酯和4-乙酰氨基-4'-异硫氰基二苯乙烯-2,2'-二磺酸衍生物。

在一些实施方案中，荧光团-猝灭剂对的荧光团可以是LC-Red 640、LC-Red 705、Cy5、Cy5.5、丽丝胺罗丹明B磺酰氯、四甲基罗丹明异硫氰酸酯、罗丹明x异硫氰酸酯、赤藓红异硫氰酸酯、荧光素、五乙酸二乙烯三胺或其它镧系离子螯合物(例如铕或铽)。

在一些实施方案中，本发明使用双猝灭的荧光标记的寡核苷酸。第二内部猝灭剂的包含缩短了染料和猝灭剂之间的距离，并且与第一猝灭剂协同提供更大的整体染料猝灭，降低了背景并增加了信号检测。第二猝灭剂和第一猝灭剂可以是先前描述的任何猝灭剂。

在一些实施方案中，第一反应混合物还包含具有5’磷酸的连接探针寡核苷酸C、与A₁的3’末端和C的5’末端互补的夹板寡核苷酸D，并且部分消化的链A₁在3’末端处与C的5’末端连接以产生寡核苷酸A₂。

在一些实施方案中，A₁的5’和3’末端连接在一起以形成环化的A₂。

在一些实施方案中，A₁被环化以形成针对连接探针寡核苷酸C的A₂。

在一些实施方案中，A₁被环化以形成针对靶序列的A₂。

在一些实施方案中，A₁被环化以形成如先前或随后所述的A₂。

在一些实施方案中，A₂是由如先前或随后所述的部分消化的链A₁形成的。

在一些实施方案中，第二反应混合物还包含：

-寡核苷酸A，包括底物臂、部分催化核心和传感器臂；

-寡核苷酸B，包括底物臂、部分催化核心和传感器臂；和

-包括荧光团-猝灭剂对的底物；

其中寡核苷酸A和B的传感器臂与A₂的侧翼区域互补，使得在A₂的存在下寡核苷酸A和B结合形成催化的多组分核酸酶(MNAzyme)。在此实施方案中，MNAzyme仅在A₂存在下形成并切割包含荧光团-猝灭剂对的底物，从而产生可检测的荧光信号。

在一些实施方案中，荧光团-猝灭剂对可以如先前所述。在一些实施方案中，将第一反应混合物和第二反应混合物合并。

在一些实施方案中，将第一反应混合物和第二反应混合物合并，使得焦磷酸解、连接以及产生可检测的荧光信号在不添加其他试剂的情况下发生。

在替代的实施方案中，第二反应混合物还包含一种或更多种DNAzyme。

在一些实施方案中，第二反应混合物还包含部分双链的核酸构建体，其中：

-一条链包含至少一个RNA碱基、至少一个荧光团，并且其中该链的区域与A₂的区域互补，并且其中该链可以称为“底物”链；

-另一条链包含至少一个猝灭剂，并且其中该链的区域与A₂的和底物链互补的区域相邻的区域互补，使得在A₂存在的情况下，部分双链的核酸构建体变得基本上更加双链化；

其中在变得基本上更加双链化的过程中，双链核酸构建体的底物链在RNA碱基处被切割，由于“另一”链的至少一个猝灭剂不再与底物链的至少一个荧光团足够接近而产生荧光。

换句话说，在A₂存在下，部分双链的核酸构建体具有尺寸更大的双链部分。

在一些实施方案中，荧光团-猝灭剂对可以如先前所述。

在一些实施方案中，在第二反应混合物中存在另外的试剂，诸如合适的缓冲液和/或离子。

在一些实施方案中，第二反应混合物还包含Mg²⁺离子。

在一些实施方案中，第二反应混合物还包含Zn²⁺离子。

在一些实施方案中，第二反应混合物还包含X²⁺离子，其中X是金属。

在一些实施方案中，第二反应混合物还包含一种或更多种X²⁺离子，其中X是金属。

在替代实施方案中，第一反应混合物还包含用于连接酶链式反应(LCR)的试剂。

在这样的实施方案中，第一反应混合物还包含：

-一种或更多种连接酶；和

-与A₂上相邻序列互补的两个或更多个LCR探针寡核苷酸，其中当探针成功退火到A₂时，一个LCR探针的5’磷酸与另一个LCR探针的3’OH直接相邻。

在一些实施方案中，在A₂的存在下两个LCR探针将成功地退火到A₂并且被连接在一起形成一个寡核苷酸分子，然后该寡核苷酸分子充当第二轮共价连接的新的靶，导致感兴趣的靶，在这种情况下A₂的几何扩增。连接的产物或扩增子与A₂互补，并且在下一个扩增循环中充当靶。因此，在过量LCR探针的存在下，通过变性、杂交和连接的重复循环来实现特定靶DNA序列的指数扩增。由此推断A₂的存在，并因此推断靶多核苷酸序列的存在。

在一些实施方案中，在A₂的存在下两个PCR探针将成功地退火到A₂并且被连接在一起形成一个寡核苷酸分子，然后该寡核苷酸分子充当第二轮共价连接的新的靶，导致感兴趣的靶，在这种情况下A₂的几何扩增，然后感兴趣的靶，在这种情况下A₂被检测到。

在一些实施方案中，使用嵌入染料或分子探针实时检测连接的寡核苷酸分子。

在一些实施方案中，使用凝胶电泳检测连接的寡核苷酸分子。

本领域技术人员将认识到，存在许多允许检测连接的寡核苷酸分子的技术。

在一些实施方案中，dNTP是热启动dNTP。

在一些实施方案中，一种或更多种连接酶是热稳定的。

在一些实施方案中，一种或更多种连接酶是天然存在的。

在另一种实施方案中，一种或更多种连接酶是工程化的。

在一些实施方案中，一种或更多种连接酶选自先前或随后公开的任何连接酶。

在一些实施方案中，一种或更多种聚合酶是热稳定的。

在一些实施方案中，一种或更多种聚合酶选自先前或随后公开的任何聚合酶。

在一些实施方案中，一种或更多种聚合酶是天然存在的。

在一些实施方案中，一种或更多种聚合酶是工程化的。

在一些实施方案中，一种或更多种聚合酶与用于焦磷酸解的聚合酶相同。

在一些实施方案中，本发明的一种或更多种酶是热启动酶。

在一些实施方案中，本发明的一种或更多种酶是热稳定的。

在替代的实施方案中，在步骤(b)之前将步骤(a)的产物引入到第二反应混合物，该第二反应混合物还包含用于连接酶链式反应(LCR)的试剂。

在这种实施方案中，第二反应混合物包含

-一种或更多种连接酶；

-任选地一种或更多种聚合酶；

-与A₂上相邻序列互补的两个或更多个LCR探针寡核苷酸，其中当探针成功退火到A₂时，一个LCR探针的5’磷酸与另一个LCR探针的3’OH直接相邻；

-任选地用于扩增成功连接的LCR探针的一种或更多种引物；和

-任选地dNTP。

在一些实施方案中，在A₂的存在下两个LCR探针将成功地退火到A₂并且被连接在一起形成一个寡核苷酸分子，然后该寡核苷酸分子充当第二轮共价连接的新的靶，导致感兴趣的靶，在这种情况下A₂的几何扩增。连接的产物或扩增子与A₂互补，并在下一个扩增循环中充当靶。因此，在过量LCR探针存在的情况下，通过变性、杂交和连接的重复循环来实现特定靶DNA序列的指数扩增。由此推断A₂的存在，并因此推断靶多核苷酸序列的存在。

在一些实施方案中，在A₂的存在下两个PCR探针将成功地退火到A₂并被连接在一起形成一个寡核苷酸分子，然后该寡核苷酸分子充当第二轮共价连接的新的靶，导致感兴趣的靶，在这种情况下A₂的几何扩增，然后感兴趣的靶，在这种情况下A₂被检测到。

在一些实施方案中，dNTP是热启动dNTP。

在一些实施方案中，一种或更多种连接酶是热稳定的。

在一些实施方案中，一种或更多种连接酶是天然存在的。

在另一种实施方案中，一种或更多种连接酶是工程化的。

在一些实施方案中，一种或更多种聚合酶是热稳定的。

在一些实施方案中，一种或更多种聚合酶是天然存在的。

在另一种实施方案中，一种或更多种聚合酶是工程化的。

在一些实施方案中，除了一种或更多种聚合酶之外，第二反应混合物还包含焦磷酸解酶。

在一些实施方案中，本发明的一种或更多种酶是热启动酶。

在一些实施方案中，本发明的一种或更多种酶是热稳定的。

在替代的实施方案中，第一反应混合物还包含：

-与A₂的包含连接位点的区域互补的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括一个或多于一个荧光团，所述一个或多于一个荧光团被排列成使得它们的荧光通过它们彼此接近猝灭或被一个或更多个荧光猝灭剂猝灭；

-双链特异性DNA消化酶；

其中，在A₂的存在下将标记的寡核苷酸消化，使得荧光团彼此分离或与其相应的猝灭剂分离，并且荧光信号，以及因此A₂的存在是可检测的。

在一些实施方案中，荧光团和猝灭剂可以如先前所述。

在一些实施方案中，双链特异性DNA消化酶是核酸外切酶。在另一种实施方案中，它是具有校对活性的聚合酶。在另一种实施方案中，第二反应混合物包含以下一种或更多种的混合物：核酸外切酶或具有校对活性的聚合酶。

在一些实施方案中，双链特异性DNA消化酶是热启动酶。

在一些实施方案中，双链特异性DNA消化酶在该方法的焦磷酸解反应发生的温度具有降低的活性。

在一些实施方案中，双链特异性DNA消化酶在该方法的焦磷酸解反应发生的温度没有活性。

在替代的实施方案中，第二反应混合物还包含：

-双链特异性DNA消化酶；

在一些实施方案中，荧光团和猝灭剂可以如先前所述。

在一些实施方案中，双链特异性DNA消化酶是热启动酶。

在一些实施方案中，第一反应混合物或第二反应混合物还包含一个或更多个部分双链的DNA构建体，其中每个构建体包含一个或更多个荧光团和一个或更多个猝灭剂。在一些实施方案中，当构建体是部分双链时，一个或更多个荧光团和一个或更多个猝灭剂位于彼此足够接近的位置，使得一个或更多个荧光团发生充分的猝灭。

在一些实施方案中，构建体是一条具有在其自身上返回成环(looped back)的自身互补区域的DNA链。

在一些实施方案中，构建体包括引物对中的一个引物。

在一些实施方案中，第一反应混合物或第二反应混合物还包含引物对中的另一个引物。

在一些实施方案中，构建体的单链区段的部分与A₂杂交并通过DNA聚合酶针对A₂延伸。在一些实施方案中，引物对的另一个引物然后杂交到延伸的构建体。然后针对构建体延伸该引物，置换自身互补区域。因此，一个或更多个荧光团和一个或更多个染料被充分分离，以检测荧光信号，表明反应混合物中A₂的存在。

在这样的实施方案中，构建体可以称为日出引物(Sunrise Primer)。

在一些实施方案中，构建体包含两条单独的DNA链。

在一些实施方案中，构建体的单链区段的部分与A₂杂交并通过DNA聚合酶针对A₂延伸。在一些实施方案中，引物对的另一个引物然后杂交到延伸的构建体。然后，该引物在双链区段的方向上针对构建体延伸，置换DNA链中较短的链，并且因此一个或更多个荧光团和一个或更多个染料被充分分离，以检测荧光信号，表明反应混合物中A₂的存在。

在这样的实施方案中，构建体可以称为分子拉链(Molecular Zipper)。

本领域技术人员将理解，对于日出引物和分子拉链两者，一种或更多种荧光团和一种或更多种猝灭剂对可能位于每个相应构建体内的不同位置。关键特征是每一对彼此位于足够接近的位置，以至于在不存在A₂时，即当不发生延伸和链置换时，不发出荧光信号。

在一些实施方案中，在方法的步骤(a)之前，样品中存在的任何RNA模板用于形成相应的DNA序列。

在一些实施方案中，这是通过使用逆转录酶和适当的核苷酸来实现的。

在一些实施方案中，从存在的任何RNA模板形成DNA与通过PCR对存在于样品中的核酸进行任何预扩增同时发生。

在一些实施方案中，从存在的任何RNA模板形成DNA与通过PCR对存在于样品中的核酸进行任何预扩增发生在单独的步骤中。

在任一先前或随后描述的方法的一些实施方案中，样品中存在的RNA不被转换为相应的DNA序列。在这样的实施方案中，A₀针对RNA序列进行焦磷酸解，以形成部分消化的链A₁，并且该方法然后如先前或随后描述的进行。

在任一先前或随后描述的方法的一些实施方案中，一种或更多种反应混合物可以合并。

在一些实施方案中，第一反应混合物还包含连接探针寡核苷酸C，并且部分消化的链A₁在3’末端处与C的5’末端连接，而在另一种实施方案中，A₁通过连接其3’末端和5’末端而环化；

在每种情况下产生寡核苷酸A₂。

在一种实施方案中，A₁的连接发生于：

步骤(a)期间；或

步骤(b)期间；或

步骤(a)和(b)之间。

在一种实施方案中，A₁任选地在连接之前在5’-3’方向上延伸。

在一些实施方案中，这种任选的延伸和连接针对靶寡核苷酸进行，而在另一种实施方案中，它们通过添加另一种夹板寡核苷酸D来进行，A₁在延伸和/或连接之前退火至夹板寡核苷酸D。在一些实施方案中，D包含与A₁的3’末端互补的寡核苷酸区域和与寡核苷酸C的5’末端或A₁的5’末端互补的区域。在另一种实施方案中，由于3’末端修饰或通过D的3’末端和A₁的相应区域之间的核苷酸错配，D不能针对A₁延伸。

在一些实施方案中，连接探针C具有与夹板寡核苷酸D的5’末端区域的至少一部分或与靶寡核苷酸互补的5’区域。通过这种方法，形成第二中间产物，其中A₂链包括A₁、C和任选的由A₁在5'-3'方向延伸以与C的5'末端相接而形成的中间区域。在这样的实施方案中，选择步骤(c)中使用的引物(见下文)以扩增A₂的至少一个区域，包括发生A₁与C连接的位点。在这种实施方案中，我们发现在C上包含3’封闭基团是有利的，这样3’-5’核酸外切酶可以用于在扩增前消化任何未连接的A₁。可用于连接前延伸的合适的聚合酶包括但不限于HemoKlenTaq、Mako和Stoffel片段。

在一些实施方案中，第一反应混合物还包含磷酸酶或磷酸水解酶，以通过水解除去由焦磷酸解反应产生的核苷三磷酸，从而确保焦磷酸解反应可以继续，并且不会竞争不过(out-competed)正向聚合反应。

在一些实施方案中，在步骤(b)之前或期间，前一步骤的产物用焦磷酸酶处理以水解焦磷酸根离子，防止进一步的焦磷酸解发生并有利于正向聚合反应。

在一些实施方案中，在步骤(b)之前或期间，用核酸外切酶处理前一步骤的产物。

在一些实施方案中，执行A₀的焦磷酸解以形成部分消化的链A₁的酶也扩增A₂。本领域技术人员将认识到存在许多这样的酶。

检测扩增子，并且获得的信息用于推断多核苷酸靶序列是否存在于原始分析物中和/或与其相关的性质。例如，通过这种方式，可以参照正在寻找的特定SNP来检测癌性肿瘤细胞特有的靶序列。在另一种实施方案中，可以检测病毒或细菌基因组(包括其新突变)特有的靶序列。可以使用许多检测扩增子或识别区的方法，包括例如寡核苷酸结合染料、序列特异性分子探针诸如荧光标记的分子信标或发夹探针。可选地，A₂扩增子的直接测序可以使用本领域采用或报道的直接测序方法之一来进行。当使用寡核苷酸结合染料、荧光标记的信标或探针时，使用包括刺激电磁辐射的源(激光、LED、灯等)和光电检测器的布置来检测扩增子是方便的，所述光电检测器被布置成检测发射的荧光并从其生成包括数据流的信号，所述数据流可以由微处理器或计算机使用专门设计的算法进行分析。

在一些实施方案中，使用一种或更多种寡核苷酸荧光结合染料或分子探针实现检测。在这样的实施方案中，由A₂的扩增子的生成导致的信号随时间的增加用于推断分析物中靶序列的浓度。在一种实施方案中，方法的最后步骤还包括以下步骤：

ii.测量产物的荧光信号；

iii.将产物暴露于一组变性条件下；和

在一些实施方案中，使用了多于一种探针A₀，每种探针A₀对不同的靶序列有选择性，并且每种探针A₀包含识别区，并且特征还在于A₂的扩增子包含这个识别区，并且因此分析物中存在的靶序列通过检测识别区来推断。在这样的实施方案中，使用分子探针或通过测序进行识别区的检测。

在一些实施方案中，其中使用不同的探针A₀，不同的探针A₀包含一种或更多种共同的引发位点，允许使用单个引物或单组引物进行扩增。

在本发明的另一方面，提供了鉴定给定核酸分析物中的靶多核苷酸序列的方法，其特征在于本发明的任何先前实施方案的步骤，其中使用一种或更多种寡核苷酸荧光结合染料或分子探针标记多于一个拷贝的A₂或A₂的区域。测量这些多于一个拷贝的荧光信号，并且将多于一个拷贝暴露于一组变性条件下。通过监测暴露于变性条件期间多于一个拷贝的荧光信号的变化来鉴定靶多核苷酸序列。

在一些实施方案中，变性条件可以通过改变温度来提供，例如将温度升高到双链开始解离的点。另外地或可选地，变性条件也可以通过改变pH以使条件为酸性或碱性来提供，或通过加入添加剂或试剂诸如强酸或强碱、浓缩无机盐或有机溶剂例如醇来提供。

在本发明的另一个方面，提供了上述方法来筛查哺乳动物受试者，尤其是人类患者中感染性疾病、癌症的存在或生成伴随诊断信息的用途。

在本发明的另一方面，提供了用于上述方法的对照探针。本发明的实施方案包括那些通过生成荧光信号来阐明一个或更多个特定靶序列的存在的实施方案。在这样的实施方案中，可能不可避免地存在由样品中存在的非靶DNA生成的信号水平。对于给定的样品，该背景信号比“真实”信号的开始时间晚，但是这样的开始在样品之间可能不同。因此，准确检测低浓度的一种或多于一种靶序列的存在，依赖于知晓在靶序列的不存在下预期什么信号。对于人为样品(contrived sample)，参照物是可用的，但是对于来自患者的真正“盲”样本，情况并非如此。对照探针(E₀)用于确定每种测定探针的预期背景信号特征。对照探针靶向样品中不期望存在的序列，并且然后从该探针生成的信号可用于推断在靶序列的不存在下来自样品的信号生成的预期速率。

因此，提供了根据任何前述方法的检测给定核酸分析物中的靶多核苷酸序列的方法，其特征在于以下步骤：

a.使用样品的单独等分试样或者在同一等分试样中并使用第二检测通道，使用第二单链探针寡核苷酸E₀随后或同时地重复方法的步骤，第二单链探针寡核苷酸E₀具有与靶序列至少部分错配的3’末端区域；

b.在样品中不存在任何靶分析物的情况下，推断预期从A₀产生的背景信号；和

c.通过比较(a)中推断的预期的背景信号和存在靶分析物时观察到的实际信号，推断分析物中存在或不存在多核苷酸靶序列。

在一些实施方案中，对照探针(E₀)和A₀被添加到样品的不同部分，而在另一种实施方案中，E₀和A₀被添加到样品的相同部分并且不同检测通道(例如，不同的彩色染料)用于测量它们各自的信号。然后可以利用E₀生成的信号来推断和校正在样品中不存在多核苷酸靶序列时预期由A₀生成的背景信号。例如，背景信号的校正可以包括从A₀观察到的信号减去从E₀观察到的信号，或者通过使用A₀和E₀在不同条件下生成的相对信号的校准曲线来校准从A₀观察到的信号。

在一些实施方案中，可以使用一种E₀来校准可能产生的所有测定探针。

在一些实施方案中，可以使用单独的E₀来校准在初始扩增步骤中生成的样品DNA的每个扩增子。每个扩增子可以包含多于一个感兴趣的突变/靶序列，但是单个E₀足以校准针对单个扩增子的所有的测定探针。

在另一种实施方案中，可以对每种靶序列使用单独的E₀。例如，如果C>T突变是被靶向的，那么可以设计一种E₀，其靶向在患者体内是未知存在的同一位点的C>G突变。E₀在多种条件下生成的信号曲线可以在校准反应中进行评估，并且这些数据用于推断当该变体不存在时，来自靶向C>T变体的测定探针的预计的信号。

在图17至图20中可以看到本发明方法的一些实施方案。

在图17中，单链探针寡核苷酸A₀退火至靶多核苷酸序列，以产生为至少部分双链并且其中A₀的3’末端与靶多核苷酸序列形成双链复合物的第一中间产物。在本发明的这个简化实施方案中，存在两个A₀分子和一个靶多核苷酸序列，以说明未退火至靶的A₀如何不参与该方法的另外步骤。在这个说明性实例中，A₀的3’末端与靶多核苷酸序列退火，而A₀的5’末端不与靶多核苷酸序列退火。A₀的5’末端包括5’化学封闭基团、共同的引发序列和条形码区域。

部分双链的第一中间产物在焦磷酸解酶的存在下，从A₀的3’末端在3’-5’方向上经历焦磷酸解，以产生部分消化的链A₁、分析物和没有退火至靶的未消化的A₀分子。

在图18中，A₁退火至单链触发寡核苷酸B，并且A₁链针对B在5’-3’方向延伸以产生寡核苷酸A₂。在这个说明性的实例中，触发寡核苷酸B具有5’化学封闭。任何未消化的A₀退火到触发寡核苷酸B，然而它不能针对B在5’-3’方向延伸以产生为方法的后续部分的靶的序列。在这个实例中，A₂用至少一种单链引物寡核苷酸引发，并且产生A₂或A₂的区域的多于一个拷贝。

在图19中，A₁退火到夹板寡核苷酸D，然后通过连接其3’末端和5’末端而环化。现在环化的A₂用至少一种单链引物寡核苷酸引发，并且产生A₂或A₂的区域的多于一个拷贝。在这个说明性的实例中，由于3’-修饰(在这个实例中是化学修饰)或通过D的3’末端和A₂的相应区域之间的核苷酸错配，夹板寡核苷酸D不能针对A₁延伸。

在图20中，夹板寡核苷酸D的3’区域退火至A₁的3’区域，同时夹板寡核苷酸D的5’区域退火至连接探针C的5’区域。因此，形成了包括A₁、C和任选地由A₁在5’-3’方向延伸以与C的5’末端相接而形成的中间区域的第二中间产物A₂。在这个说明性实例中，连接探针C具有3’化学封闭基团，以便3’-5’核酸外切酶可用于消化任何未连接的A₁。

本发明方法的特异性可通过引入封闭寡核苷酸来改进。例如，可以引入封闭寡核苷酸以与至少一部分野生型DNA杂交，促进A₀仅与靶多核苷酸序列而非野生型退火。可选地或另外地，封闭寡核苷酸可用于改进聚合酶链式反应(PCR)的特异性，以防止存在的任何野生型序列的扩增。常用的技术是设计一种寡核苷酸，该寡核苷酸在PCR引物之间退火，并且不能被PCR聚合酶代替或消化。寡核苷酸被设计成与非靶(通常是健康的)序列退火，而与靶(突变的)序列错配(通常相差单个碱基)。这种错配导致针对两个序列的解链温度不同，寡核苷酸被设计成在PCR延伸温度保持与非靶序列退火，同时与靶序列解离。

封闭寡核苷酸通常可以具有修饰，以防止其被PCR聚合酶的核酸外切酶活性消化，或者增加靶序列和非靶序列之间的解链温度差异。

在封闭寡核苷酸中掺入锁核酸(LNA)或其他改变解链温度的修饰可以显著增加寡核苷酸针对靶序列和非靶序列的解链温度差异。

因此，提供了本发明的实施方案，其中使用了封闭寡核苷酸。封闭寡核苷酸必须耐受焦磷酸解(PPL)反应，以确保它们不会被消化或代替。这可以通过多种不同的方式实现，例如通过在3’末端的错配或通过修饰诸如硫代磷酸酯键或间隔基。

在使用封闭寡核苷酸的本发明的这样的实施方案或方面中，检测给定核酸分析物中的靶多核苷酸序列的方法的特征在于，在将分析物靶序列与单链探针寡核苷酸A₀退火以产生至少部分双链并且其中A₀的3’末端与分析物靶序列形成双链复合物的第一中间产物的同一步骤之前或期间，将单链封闭寡核苷酸与非靶多核苷酸序列的至少一个子集退火。

在一些实施方案中，封闭寡核苷酸通过在其3’末端的错配变得耐受焦磷酸解反应。在另一种实施方案中，封闭寡核苷酸通过3’-封闭基团的存在变得耐受。在另一种实施方案中，封闭寡核苷酸通过间隔基或其他内部修饰的存在变得耐受。在另一种实施方案中，封闭寡核苷酸既包括增加解链温度的修饰或修饰的核苷酸碱基，又变得耐受焦磷酸解。

本文提及的“磷酸酶”是指具有通过水解去除由本发明的方法产生的核苷三磷酸的能力的任何酶或其功能片段。这包括具有将磷酸单酯裂解成磷酸根离子和醇的能力的任何酶或其功能片段。

本文提及的“焦磷酸酶”是指具有催化一个焦磷酸根离子转化为两个磷酸根离子的能力的任何酶或其功能片段。

这也包括无机焦磷酸酶和无机双磷酸酶。非限制性实例是耐热无机焦磷酸酶(TIPP)。

在一些实施方案中，提供了任何先前描述或随后描述的实施方案的修改版本，其中焦磷酸酶的使用是任选的。

在一种实施方案中，A₁针对分析物靶序列环化。在这种实施方案中，通过A₀从A₀的3’末端在3’-5’方向上以形成A₁的逐步消化显露的靶的区域与A₀/A₁的5’末端互补。在这种实施方案中，连接酶可用于连接A₁的3’末端和5’末端以形成环化的寡核苷酸A₂。这在例如图15中示出。在一种实施方案中，A₀/A₁的5’末端在5-50个核苷酸长的区域内与靶互补。在一种实施方案中，其为5-25个核苷酸长。在一种实施方案中，其为5-20个核苷酸长。在一种实施方案中，其为5-15个核苷酸长。在一种实施方案中，其为5-12个核苷酸长。在一种实施方案中，其为5-10个核苷酸长。

在实施方案中，提供了用于诊断或监测患者的癌症的方法，包括：

-从患者的血液的血浆或血清中提取DNA或RNA；

-将一种或更多种DNA或RNA分析物引入到第一反应混合物，该第一反应混合物包含：

i.单链探针寡核苷酸A₀；

ii.焦磷酸解酶；和

iii.连接酶；

其中分析物与单链探针寡核苷酸A₀退火以产生第一中间产物，所述第一中间产物为至少部分双链的并且其中A₀的3’末端形成双链复合物并且A₀从3’末端在3’-5’方向上焦磷酸解，以产生至少部分消化的链A₁并且A₁经历连接以形成A₂；

-检测来源于前一步骤的产物的信号，其中产物是A₂或其部分，或者A₂的多于一个拷贝或其部分的多于一个拷贝，并由此推断患者的癌症的存在或不存在。

在实施方案中，提供了用于监测患者的癌症的方法，包括：

-从患者的血液的血浆或血清中提取DNA或RNA；

i.单链探针寡核苷酸A₀；

ii.焦磷酸解酶；和

iii.连接酶；

-检测来源于前一步骤的产物的信号，其中产物是A₂或其部分，或者A₂的多于一个拷贝或其部分的多于一个拷贝，并由此推断患者的癌症的进展或缓解。

在实施方案中，提供了用于监测患者对一种或更多种癌症治疗的响应的方法，包括：

-从接受一种或更多种癌症治疗的患者的血液的血浆或血清中提取DNA或RNA；

i.单链探针寡核苷酸A₀；

ii.焦磷酸解酶；和

iii.连接酶；

-检测来源于前一步骤的产物的信号，其中产物是A₂或其部分，或者A₂的多于一个拷贝或其部分的多于一个拷贝，并由此推断患者对一种或更多种癌症治疗的响应。

在实施方案中，提供了用于筛查患者的方法，包括：

-从患者的血液的血浆或血清中提取DNA或RNA；

i.单链探针寡核苷酸A₀；

ii.焦磷酸解酶；和

iii.连接酶；

-检测来源于前一步骤的产物的信号，其中产物是A₂或其部分，或者A₂的多于一个拷贝或其部分的多于一个拷贝，并由此推断患者中一种或更多种癌症的存在或不存在。

在实施方案中，提供了用于无创产前检测(NIPT)的方法，包括：

-从妊娠患者的母体血液的血浆或者血清中提取DNA或者RNA；

i.单链探针寡核苷酸A₀；

ii.焦磷酸解酶；和

iii.连接酶；

其中分析物与单链探针寡核苷酸A₀退火产生第一中间产物，所述第一中间产物为至少部分双链的并且其中A₀的3’末端形成双链复合物并且A₀从3’末端在3’-5’方向上焦磷酸解，以产生至少部分消化的链A₁并且A₁经历连接以形成A₂；

-检测来源于前一步骤的产物的信号，其中产物是A₂或其部分，或者A₂的多于一个拷贝或其部分的多于一个拷贝，并由此推断一种或更多种胎儿异常的存在或不存在。

在实施方案中，提供了用于筛查患者的方法，包括：

-从患者的血液的血浆或血清中提取DNA或RNA；

i.单链探针寡核苷酸A₀；

ii.焦磷酸解酶；和

iii.连接酶；

在实施方案中，提供了用于监测移植受体患者的方法，包括：

-从移植受体患者的血液的血浆或血清中提取DNA或RNA；

i.单链探针寡核苷酸A₀；

ii.焦磷酸解酶；和

iii.连接酶；

-检测来源于前一步骤的产物的信号，其中产物是A₂或其部分，或者A₂的多于一个拷贝或其部分的多于一个拷贝，并由此推断来自移植器官的DNA或RNA的存在或不存在。

在本发明的一些实施方案中，提供了用于检测样品中存在的给定核酸分析物中的靶多核苷酸序列的方法的试剂盒，包括：

(a)单链探针寡核苷酸A₀，单链探针寡核苷酸A₀能够与靶多核苷酸序列形成第一中间产物，所述中间产物为至少部分双链的；

(b)连接酶；

(c)焦磷酸解酶，焦磷酸解酶能够从A₀的末端在3’-5’方向上消化第一中间产物以产生部分消化的链A₁；

(d)至少一种与A₀的一部分基本上互补的单链引物寡核苷酸；

(e)扩增酶；和

(f)合适的缓冲液。

在一种实施方案中，试剂盒还包括焦磷酸根离子源。

焦磷酸根离子的合适来源如先前所述。

在一些实施方案中，试剂盒还包括合适的阳性和阴性对照。

在一些实施方案中，试剂盒还可以包括一种或更多种如先前所述的对照探针(E₀)。

在一些实施方案中，试剂盒还可以包括一种或更多种如先前所述的封闭寡核苷酸。

在一些实施方案中，试剂盒还可以包括一种或更多种对照探针(E_o)和一个或更多个封闭寡核苷酸。

在一些实施方案中，A₀的5’末端被赋予对5’-3’核酸外切酶消化的抗性，并且试剂盒还可以包括5’-3’核酸外切酶。

在一些实施方案中，试剂盒还可以包括连接探针寡核苷酸C。

在一些实施方案中，试剂盒还可以包括夹板寡核苷酸D。

在一些实施方案中，试剂盒可以包括C和D二者。

连接探针C可以包含保护其免受3'-5'核酸外切酶消化的3'修饰或内部修饰。

D可以包含与A₁的3’末端互补的寡核苷酸区域和与寡核苷酸C的5’末端或A₁的5’末端互补的区域。

在一些实施方案中，由于3’修饰或通过D的3’末端与A₁或C的相应区域之间的错配，D可能不能针对A₁进行延伸。

在一些实施方案中，试剂盒还可以包括dNTP、聚合酶和用于样品中存在的靶多核苷酸序列的初始扩增的合适缓冲液。

在一些实施方案中，试剂盒还可以包括掺入dUTP的高保真聚合酶、dUTP和尿嘧啶-DNA N-糖基化酶(UDG)。

在一些实施方案中，试剂盒还可以包括磷酸酶或磷酸水解酶。

在一些实施方案中，试剂盒还可以包括焦磷酸酶。焦磷酸酶可以是热启动的。

在一些实施方案中，试剂盒还可以包括蛋白酶。

在一些实施方案中，试剂盒还可以包括一种或更多种寡核苷酸结合染料或分子探针。

在一些实施方案中，试剂盒还可以包括多于一种A₀，每一种A₀对不同的靶序列有选择性，并且每一种A₀包含识别区。

在一些实施方案中，(e)的扩增酶和焦磷酸解酶是相同的。

试剂盒还可以包括用于在如本文所述的处理之后分离和/或纯化一部分多核苷酸的纯化设备和试剂。合适的试剂是本领域熟知的并且包括凝胶过滤柱和洗涤缓冲液。另外的合适的试剂包括磁珠和二氧化硅柱。

在本发明的一种实施方案中，提供了一种设备，该设备包括：

在第一区域、第二区域和第三区域之间的至少一个流体通道，其中第一区域包括一个或更多个孔，其中每个孔包括：

dNTP；

至少一种单链引物寡核苷酸；

用于初始扩增样品中存在的DNA的扩增酶；和

其中第二区域包括一个或更多个孔，其中每个孔包括：

单链探针寡核苷酸A₀，单链探针寡核苷酸A₀能够与靶多核苷酸序列形成第一中间产物，所述中间产物为至少部分双链的；

焦磷酸解酶，焦磷酸解酶能够从A₀的末端在3’-5’方向上消化第一中间产物以产生部分消化的链A₁；和

其中第三区域包括一个或更多个孔，其中每个孔包括：

dNTP；

缓冲液；

扩增酶；

用于检测源自A₂或其部分，或A₂的多于一个拷贝或其部分的多于一个拷贝的信号的装置(means)；和

其中第二区域的孔或第三区域的孔还包括至少一种与A₀的部分基本上互补的单链引物寡核苷酸。

在一些实施方案中，用于检测信号的装置位于第三区域的一个或更多个孔内。

在一些实施方案中，用于检测信号的装置位于设备的第三区域内。

在一些实施方案中，用于检测信号的装置位于设备的相邻区域内。

在一些实施方案中，第一区域的每个孔的dNTP可以是dUTP、dGTP、dATP和dCTP，并且每个孔还可以包括掺入dUTP的高保真聚合酶和尿嘧啶-DNA N-糖基化酶(UDG)。

在一些实施方案中，第三区域的每个孔的dNTP可以是dUTP、dGTP、dATP和dCTP，并且每个孔还可以包括掺入dUTP的高保真聚合酶和尿嘧啶-DNA N-糖基化酶(UDG)。

在一些实施方案中，第二区域的每个孔还可以包括焦磷酸根离子源。

在一些实施方案中，A₀的5’末端被赋予对5’-3’核酸外切酶消化的抗性，并且第二区域的孔还可以包括5’-3’核酸外切酶。

在一些实施方案中，第二区域或第三区域的每个孔还可以包括连接酶和连接探针寡核苷酸C或夹板寡核苷酸D。

连接探针C可以包含保护其免受3’-5’核酸外切酶消化的3’修饰或内部修饰。

夹板寡核苷酸D可以包含与A₁的3’末端互补的寡核苷酸区域和与寡核苷酸C的5’末端或A₁的5’末端互补的区域。

由于3’修饰或通过D的3’末端与A₁或C的相应区域之间的错配，D可能不能针对A₁延伸。

在一些实施方案中，dNTP可以是热启动的，并且第二区域的每个孔还可以包括磷酸酶或磷酸水解酶。

在一些实施方案中，第二区域的每个孔还可以包括焦磷酸酶。

在一些实施方案中，第三区域的每个孔还可以包括焦磷酸酶。

在一些实施方案中，焦磷酸酶可以是热启动的。

在一些实施方案中，第三区域的每个孔还可以包括一种或更多种寡核苷酸结合染料或分子探针。

在一些实施方案中，第二区域的每个孔可以包括至少一种或更多种对包括识别区域的靶序列具有选择性的不同的A₀。

在一些实施方案中，第二区域中的扩增酶和焦磷酸解酶可以是相同的。

在一些实施方案中，可以存在包括一个或更多个孔的第四区域，其中每个孔可以包括蛋白酶，并且其中所述第四区域可以位于第一区域和第二区域之间。

在一些实施方案中，设备的第二区域和第三区域可以组合，使得第二区域的孔还包括：

dNTP；

缓冲液；

扩增酶；和

用于检测源自A₂或其部分，或A₂的多于一个拷贝或其部分的多于一个拷贝的信号的装置。

在一些实施方案中，用于检测信号的装置位于第二区域的一个或更多个孔内。

在一些实施方案中，用于检测信号的装置位于设备的第二区域内。

在一些实施方案中，第一区域可以通过流体接口与样品容器流体连接。

在一些实施方案中，加热和/或冷却元件可以存在于设备的一个或更多个区域。

在一些实施方案中，加热和/或冷却可应用于设备的一个或更多个区域。

在一些实施方案中，设备的每个区域可以独立地包含至少100或200个孔。

在一些实施方案中，设备的每个区域可以独立地包含约100个和300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、1100个、1200个、1300个、1400个、1500个之间或更多的孔。孔可以是任何形状的，并且它们的位置可以以任何格式或图案布置在基底上。

在一些实施方案中，孔基底可以由金属(例如，作为非限制性实例，金、铂或镍合金)、陶瓷、玻璃或其他PCR相容的聚合物材料或复合材料构成。孔基底包括多于一个孔。

在一些实施方案中，孔可以在孔基底中作为盲孔或通孔形成。例如，孔可以通过激光打孔(例如准分子激光器或固态激光器)、超声波压印、热压印光刻、电铸镍模具、注射成型和注射模压成型在孔基底内产生。

在一些实施方案中，单个孔容积可以在0.1nl至1500nl的范围内。在一种实施方案中，0.5nL至50nL。每个孔可以具有约0.1nL、0.2nL、0.3nL、0.4nL、0.5nL、0.6nL、0.7nL、0.8nL、0.9nL、1nL、1.5nL、2nL、2.5nL、3nL、3.5nL、4nL、4.5nL、5nL、5.5nL、6nL、6.5nL、7nL、7.5nL、8nL、8.5nL、9nL、9.5nL、10nL、11nL、12nL、13nL、14nL、15nL、16nL、17nL、18nL、19nL、20nL、25nL、30nL、35nL、40nL、45nL、50nL、55nL、60nL、65nL、70nL、75nL、80nL、85nL、90nL、95nL、100nL、110nL、120nL、130nL、140nL、150nL、160nL、170nL、180nL、190nL、200nL、225nL、250nL、275nL、300nL、325nL、350nL、375nL、400nL、425nL、450nL、475nL或500nL的容积。

在一些实施方案中，孔维度(dimension)可以具有任何形状，例如，圆形、椭圆形、正方形、矩形、卵形、六边形、八边形、圆锥形以及本领域技术人员熟知的其他形状。

在一些实施方案中，孔形状可以具有沿轴线变化的横截面区域。例如，正方形孔可以从第一尺寸逐渐缩小至为第一尺寸的分数的第二尺寸。

在一些实施方案中，孔维度可以是正方形的，直径和深度大致相等。

在一些实施方案中，限定孔的壁可以是非平行的。

在一些实施方案中，限定孔的壁可以会聚到一点。孔维度可以从孔基底的总容积得出。

在一些实施方案中，孔深度可以在25μm至1000μm的范围内。

在一种实施方案中，孔可以具有25μm、50μm、75μm、100μm、150μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm、450μm、500μm、550μm、600μm、650μm、700μm、750μm、800μm、850μm、900μm、950μm或1000μm的深度。

在一些实施方案中，孔直径可以在约25μm至约500μm的范围内。

在一些实施方案中，孔可以具有25μm、50μm、75μm、100μm、125μm、150μm、175μm、200μm、225μm、250μm、275μm、300μm、325μm、350μm、375μm、400μm、425μm、450μm、475μm或500μm的宽度。

在一些实施方案中，设备的一个或更多个区域的部分可以被修改以促进或阻止流体粘附。限定孔的表面可以涂覆亲水性材料(或被改性为亲水性的)，并从而促进流体的保留。

在一些实施方案中，设备的一个或更多个区域的部分可以涂覆疏水材料(或被改性为疏水性的)，并从而阻止流体在其上保留。本领域技术人员将理解，可以执行其他表面处理，使得流体优选地保持在孔内，而不是保持在上表面，以便促进多余流体的排出。

在一些实施方案中，孔基底的孔可以被图案化以具有对齐的行和列的简单几何图案，或者以对角线或六边形排列的图案。在一种实施方案中，孔基底的孔可以被图案化以具有复杂的几何图案，诸如混沌图案或等几何设计图案。

在一些实施方案中，孔可以在几何上彼此分离和/或具有大的深宽比(depth towidth ratio)，以帮助防止试剂的交叉污染。

在一些实施方案中，设备可以包括一个或更多个辅助区域，其可用于向该设备的一个或更多个区域提供加工流体(process fluid)，诸如油或其他化学溶液。这样的辅助区域可以通过一种或更多种膜、阀和/或压力可分离基底(即，当受到来自辅助区域或流体路径的邻近部分内的流体的预定压力量时破裂的材料)诸如金属箔或薄膜与设备的一个或更多个区域流体连接。

在一些实施方案中，设备的流体通道可包括广泛的曲折部分。在流体通道的入口通道和设备的一个或更多个区域之间的曲折路径有助于控制和处理流体加工。曲折的路径可以帮助减少气泡的形成，气泡会干扰流动的油通过流体通道。

在一些实施方案中，设备还可以包括气体可渗透膜，其使得气体能够从设备的一个或更多个区域的孔排出，而不允许流体通过。气体可渗透膜可以通过气体可渗透粘合剂粘附到设备的孔基底上。在一种实施方案中，该膜可以由聚二甲基硅氧烷(PDMS)制成，并且具有范围为20μm-1000μm的厚度。在一些实施方案中，膜可以具有范围为100μm-200μm的厚度。

在一些实施方案中，全部或部分孔基底可以包含传导性(conductive)金属部分(例如，金)，以使热能够从金属传递到孔。在一种实施方案中，孔的内表面可以涂覆金属以实现热传递。

在一些实施方案中，在适当的试剂已填充设备的一个或更多个区域的孔之后，隔离油或导热液体可以施加到设备以防止串扰。

在一些实施方案中，设备的一个或更多个区域的孔可以被成形为从大直径逐渐缩小到较小直径，类似于圆锥。具有倾斜壁的锥形孔能够使用试剂的非接触沉积方法(例如，喷墨)。圆锥形也有助于干燥，并且已发现在气体可渗透膜存在时防止气泡和泄漏。

在一些实施方案中，设备的一个或更多个区域的孔可以通过沿着设备的流体通道推进样品流体(例如通过压力)来填充。当流体经过设备的一个或更多个区域的孔时，每个孔都变得充满流体，流体主要通过表面张力保留在孔内。如先前所述，设备的孔基底的部分可以根据需要涂覆亲水性/疏水性物质，以在样品流体经过时促进孔的完全和均匀填充。

在一些实施方案中，设备的一个或更多个区域的孔可以在填充后用油“盖住”。然后，当孔基底经历热循环时，这可以帮助减少蒸发。在一种实施方案中，在油覆盖之后，水性溶液可以填充设备的一个或更多个区域以改进导热性。

在一些实施方案中，可在设备的一个或更多个区域内对静止的水性溶液加压，以阻止流体和任何气泡的运动。

在一些实施方案中，诸如矿物油的油可用于设备的一个或更多个区域的孔的隔离并提供导热性。然而，可以使用任何导热液体，诸如氟化液体(例如3M FC-40)。本公开内容中提及油应理解为包括本领域技术人员将理解的可应用的替代方案。

在一些实施方案中，设备还可以包括一个或更多个传感器组件。

在一些实施方案中，一个或更多个传感器组件可以包括耦合到光纤面板(FOFP)的电荷耦合设备(CCD)/互补金属氧化物半导体(CMOS)检测器。滤光片可以层叠在FOPF的顶部，并且贴靠或邻近孔基底放置。在一种实施方案中，滤光片可以直接层放(粘合)在CCD的顶部，而FOPF放置在顶部。

在一些实施方案中，可以在第一区域或辅助区域之一内加热水合流体，诸如蒸馏水，使得设备的一个或更多个区域具有高达100％的湿度，或至少足够的湿度以防止热循环期间的过度蒸发。

在一些实施方案中，在完成设备的填充之后，可以通过与设备热接触的外部设备加热孔基底，以执行PCR的热循环。

在一些实施方案中，可采用非接触加热方法，诸如RFID、居里点、感应加热或微波加热。这些和其他非接触加热方法将是本领域技术人员熟知的。在热循环期间，可以通过先前描述的传感器布置来监测设备的化学反应。

在一些实施方案中，沉积在设备的一个或更多个区域的一个或更多个孔中的试剂以预定的布置沉积。

在一些实施方案中，提供了一种方法，包括：

向设备的流体通道提供样品流体，其中设备包括在第一区域、第二区域和第三区域之间的至少一个流体通道，其中第一区域、第二区域和第三区域独立地包括一个或更多个孔；

用来自第一区域的扩增流体填充第二区域，使得第二区域的一个或更多个孔被扩增流体覆盖；

从第二区域抽取扩增流体，使得一个或更多个孔保持被至少一些扩增流体润湿；

用从第二区域抽取的流体填充第三区域，使得第三区域的一个或更多个孔被该流体覆盖；和

从第三室抽取流体，使得一个或更多个孔保持被至少一些流体润湿。

在该方法的一些实施方案中，流体通道可以是无阀的。

在该方法的一些实施方案中，抽取的第二区域可以用疏水性物质填充。

在该方法的一些实施方案中，抽取的第三区域可以用疏水性物质填充。

在该方法的一些实施方案中，可以从与第二区域和第三区域流体连通的油室供应疏水性物质。

在该方法的一些实施方案中，样品流体可以以蜿蜒的方式沿着流体通道行进。

在一些实施方案中，该方法还可以包括对第一区域、第二区域或第三区域中的一个或更多个应用加热和冷却循环。

本领域技术人员将理解，当使用术语“推断”时，例如，“推断特定序列的存在或不存在”是指基于A₂、或A₂的拷贝、或A₂的区域、或A₂的区域的拷贝的存在或不存在来确定存在或不存在特定特征。

鉴于本公开内容，本发明的各种其他方面和实施方案对于本领域技术人员而言将是明显的。

在本文中使用的“和/或”被认为是两个指定的特征或组分中的每一个与或不与另一个的具体公开。例如“A和/或B”被认为是(i)A、(ii)B和(iii)A和B中的每一个的具体公开，如同每一个在本文中单独列出一样。

除非上下文另有指示，否则上文列出的特征的描述和定义不限于本发明的任何特定方面或实施方案，并且同样适用于所描述的所有方面和实施方案。

本领域技术人员将进一步理解，尽管已经参照若干实施方案通过示例的方式描述了本发明，但是本发明不限于所公开的实施方案，并且在不脱离如所附权利要求中限定的本发明的范围的情况下，可以建立替代实施方案。

实施例1-简化的方案

为了本部分和以下各部分的目的，举例说明本发明的实施方案并将其分别称为方案1-5。

图1提供了不同方案的概述。

下表示出了执行每个方案所需的时间的概述：

在一种实施方案中，TIPP不存在于本发明的任何一个方案、方法、试剂盒和/或设备中。

在一种实施方案中，5’-3’核酸外切酶不存在于本发明的任何一个方案、方法、试剂盒和/或设备中。

下表示出了每种方案中使用的酶的概述：

在一种实施方案中，焦磷酸酶的存在是任选的。

在一种实施方案中，5’-3’核酸外切酶的存在是任选的。

在一种实施方案中，UDG的存在是任选的。

可以看出，发明人减少了所需酶的总数，从而降低了方法的成本和复杂性。令人惊讶的是，发明人发现，将5’-3’核酸外切酶添加从预扩增步骤移到方案的焦磷酸解/连接步骤(如在方案3-5中)导致如图2所示的更高的荧光信号(代表特定靶分析物序列的检测)。

实施例2:焦磷酸解(PPL)酶

发明人已经使用一系列不同的PPL酶测试了本发明方案3的方法，其结果可见于图3。图3(A)显示了使用Mako、Klenow和Bsu检测1％MAF T790M。图3(B)显示了在不同的PPi浓度范围，使用Bst LF检测0.5％MAF T790M。

发明人已经使用一系列不同的PPL酶测试了本发明方案4的方法，其结果可见于图4。

实施例3:方案1对比方案4

发明人使用方案1和方案4检测了0.5％、0.10％和0.05％MAF的外显子19del_6223，这可见于图5。可以看出，当使用方案4时，荧光峰更大。

实施例4:方案4-灵敏度

发明人根据方案4检测了0.10％、0.50％和1％MAF的EGFR外显子20T790M突变，如图6所示。

实施例5:方案4-在RCA过程中是否需要核酸外切酶消化步骤？

发明人已经展示，在RCA期间核酸外切酶消化步骤不是必要的。然而，如果省略核酸外切酶消化步骤，在RCA中会更晚检测到可检测的信号。图7显示在RCA步骤中存在和不存在核酸外切酶的情况下1％MAF的EGFR外显子20T790M的检测。

实施例6:方案4-PPL:RCA混合比例

发明人研究了PPL:RCA混合比例对针对0.5％MAF EGFR外显子20T790M检测的信号强度的影响，其结果显示于图8。可以看到，1:2PPL:RCA混合比例导致最低的信号强度，但在最早的时间点。在时间上紧随其后的是具有更大的信号强度的1:4PPL:RCA混合。在反应的最晚时间点，对1:8PPL:RCA混合观察到最大的信号强度。

实施例7:方案4-染料选择

发明人研究了在RCA期间使用的染料是否可以优化。图9显示了根据方案4使用SybrGreenI(50℃和60℃)和Syto82(50℃和60℃)进行的比较实验的结果。Syto82染料允许RCA在50℃的较低温度运行，而SybrGreenI要求更高的60℃温度。方案5需要较低的RCA温度，它去除了向反应混合物中添加蛋白酶K。用于制备包含靶多核苷酸区域的核酸的至少一种单链分析物以使用本发明的方法进行检测的扩增酶需要大于50℃的温度去工作。使用SybrGreenI需要60℃的反应温度，且因此必须在方法期间的某个时间点添加蛋白酶K，以在RCA之前使扩增酶失活。

较低的RCA温度可以允许本发明的方法在读板器而不是qPCR中进行。

利用Syto82的反应更快，正如在图9中可以看到的，并且尽管Syto82的荧光总量更低——这可以通过使用更高浓度的Syto82染料来缓解。

实施例8:方案4-BST L.F.对比BST 2.0WS

发明人研究了根据方案4使用两种不同的酶BST L.F.和BST 2.0WS进行RCA以检测0.5％MAF EGFR外显子20T790M突变。这一结果显示在图10中，从中可以看出使用BST 2.0WS的反应最快。BST 2.0WS被设计为掺入dUTP，这有助于反应的速度。BST L.F.和BST 2.0WS实现的总信号强度之间存在可以忽略不计的差异。根据其描述，由New England Biolabs(NEB)提供的BST 2.0WS仅在45℃以上时才会更加稳定和活跃。

实施例9:PPL酶对信号检测的影响

发明人研究了不同PPL酶在不同PPL:RCA反应混合物比例对RCA反应的影响。其结果可见于图11(A)1:4PPL:RCA和图11(B)1:8PPL:RCA。除BST外，所有PPL酶在1:4PPL:RCA的比例都影响RCA反应。在1:8PPL:RCA比例，BST和Klenow对RCA反应没有影响。

实施例10:焦磷酸解，针对单核苷酸错配的连接特异性

制备单链第一寡核苷酸1(SEQ ID NO:1)，其具有以下核苷酸序列：

制备单链连接寡核苷酸2(SEQ ID NO:2)，其具有以下核苷酸序列：

其中A、C、G和T代表携带DNA的相关特征核苷碱基的核苷酸。

/5Phos/代表5'末端磷酸

*代表硫代磷酸酯键

还制备了一组单链寡核苷酸3-4(SEQ ID No:3-4)，其在5’至3’方向具有如下核苷酸序列：

3

4

其中寡核苷酸3包括与寡核苷酸1的3’末端的17个碱基互补的17个碱基的区域，并且寡核苷酸4包括在位置3具有单核苷酸错配的相同区域。SEQ ID 3和SEQ ID 4分别是具有/不具有C797S突变的人EGFR基因的一部分。

然后制备第一反应混合物，其具有的组成对应于由以下配方得到的组合物：

0.5ul 20x缓冲液pH 7.0

0.25uL 5x缓冲液pH 8.0

0.25uL 5x HF缓冲液

0.2ul寡核苷酸1，1000nM

0.3uL寡核苷酸2，1000nM

1ul寡核苷酸2(500nM)或寡核苷酸2和3的混合物(分别为500nM和0.5nM)，

0.3U Klenow片段exo-(NEB)

0.01ul无机焦磷酸，10mM

0.0132U腺三磷酸双磷酸酶(ex.NEB)

1U大肠杆菌DNA连接酶(ex.NEB)

水至10ul

其中20x缓冲液包括以下混合物：

200uL Tris乙酸，1M，pH 7.0

342.5ul乙酸镁水溶液，1M

120ul乙酸钾水溶液，5M

50ul Triton X-100表面活性剂(10％)

水至1mL

其中，5x缓冲液包括以下混合物：

50ul Trizma乙酸，1M，pH 8.0

25ul乙酸镁水溶液，1M

25ul乙酸钾水溶液，5M

50ul Triton X-100表面活性剂(10％)

水至1mL

然后通过将混合物在45℃孵育15分钟来进行焦磷酸解，然后是寡核苷酸1经由连接进行的环化，并将所得产物混合物用于扩增反应(实施例11)。

实施例11:环化探针的扩增

制备了一对单链寡核苷酸引物1(SEQ ID NO:5)和2(SEQ ID NO:6)，其具有以下核苷酸序列：

1：

2：

其中A、C、G和T代表携带DNA的相关特征核苷碱基的核苷酸。

然后制备第二反应混合物，其具有对应于由以下配方得到的组合物：

3uL 10x Thermopol缓冲液

3.2U BST 2.0WS

0.32uL寡核苷酸1，10uM

0.32uL寡核苷酸2，10uM

1.125uL Syto82，30uM

0.165U无机焦磷酸酶

1.2uL dNTP混合物，10mM

1.25uL实施例10中的反应混合物

水至11.25uL

其中，10x Thermopol缓冲液包括以下混合物：

200uL Tris-HCl pH＝8.8，1M

100uL(NH4)2SO4，1M

100uL KCl，1M

20mM MgSO4，1M

10uL

10％

水至1mL

然后将反应混合物在50℃孵育40分钟，并且然后通过实时荧光分析所得反应产物。其结果如图12所示。从这个分析可以看出，当寡核苷酸3和4都存在时，反应中荧光信号出现得更快，表明在第一反应混合物中已经发生了寡核苷酸3的焦磷酸解和连接。

实施例12:用Sunrise引物进行多色检测

1.靶寡核苷酸稀释液

WT寡核苷酸稀释液由以下成分组成；

0.5x A7缓冲液

0.5x Phusion U缓冲液

200nM WT寡核苷酸(SEQ ID NO:7)

总体积：5uL

T790M与C797S 1％AF突变体寡核苷酸混合物；

0.5x A7缓冲液

0.5x Phusion U缓冲液

100nM WT寡核苷酸(SEQ ID NO:7)

2nM T790M寡核苷酸(SEQ ID NO:8)

2nM C797S_2389寡核苷酸(SEQ ID NO:9)

总体积：5uL

WT寡核苷酸(SEQ ID NO:7):

T790M寡核苷酸(SEQ ID NO:8):

C797S_2389寡核苷酸(SEQ ID NO:9):

1x A7组合物

Tris乙酸pH＝8.0 10mM

乙酸钾25mM

乙酸镁5mM

Triton-X 0.01％

PhusionU缓冲液

PhusionU缓冲组合物不是可公开获取的。

2.PPL

制备了对应于以下的混合物：

1xBFF1

37.5U/mL Mako DNA聚合酶(3'→5'exo-)

100U/mL大肠杆菌连接酶

1.2U/mL腺三磷酸双磷酸酶

0.6mM PPi

20nM T790M探针

20nM C797S_2389探针

30nM T790M夹板寡核苷酸

30nM C797S_2389夹板寡核苷酸

5uL第1点的WT或1％AF突变体稀释液。

总体积10uL

然后将这种混合物在41℃孵育30分钟。

1xBFF1组合物

Tris乙酸pH＝7.0 10mM

乙酸钾30mM

乙酸镁17.125mM

Triton-X 0.01％

T790M探针(SEQ ID NO:10):

C797S_2389探针(SEQ ID NO:11):

其中*代表硫代磷酸酯键

3.TIPP

制备了对应于以下的混合物：

1xA7

66.6U/mL TIPP

来自第2点的10uL混合物。

总体积：20uL

然后将这种混合物在25℃孵育5分钟，95℃5分钟。

4.连接

制备了对应于以下的混合物：

1xA7

100U/mL大肠杆菌连接酶20uL来自第3点的混合物。

10nM T790M夹板寡核苷酸

10nM C797S_2389夹板寡核苷酸

总体积：30uL

然后将这种混合物在37℃孵育10分钟，95℃10分钟。

T790M夹板寡核苷酸(SEQ ID NO:12):

C797S_2389夹板寡核苷酸(SEQ ID NO:13):

5.核酸外切酶处理

制备了对应于以下的混合物：

1xA7

100U/mL大肠杆菌连接酶

30uL来自第4点的混合物。

625U/mL核酸外切酶III

62.5U/mL T5核酸外切酶

总体积：40uL

然后将这种混合物在30℃孵育5分钟，95℃5分钟。

6.RCA

制备了对应于以下的混合物：

1x Thermopol缓冲液(53.2mM Tris-HCl、26.6mM(NH₄)₂SO₄、26.6mM KCl、5.32mMMgSO₄,、0.266％

pH 8.8)

0.2uM引物混合物1

0.4uM反向引物

533.3U/mL BST L.F.

0.4mM dNTP

10uL来自第5点的反应混合物。

总体积15uL

引物混合物1：

Cy5引物(SEQ ID NO:14):

TexasRed引物(SEQ ID NO:15):

其中/BHQ2/代表Black Hole猝灭剂；

反向引物(SEQ ID NO:16):

然后将混合物在60℃孵育90分钟。每1分钟进行一次荧光测量。Cq是根据Bio-rad机器给出的自动阈值得到的。其结果可见于图13。

实施例13:使用分子拉链进行多色检测

1.靶寡核苷酸稀释液

WT寡核苷酸稀释液由以下成分制成

0.5x A7缓冲液

0.5x Q5U缓冲液

100nM WT寡核苷酸(SEQ ID NO:17)

总体积：1.25uL

G719X_6239,G719X_6252,G719X_6253 0.5％AF突变体寡核苷酸混合物：

0.5x A7缓冲液

0.5x Q5U缓冲液

100nM WT寡核苷酸(SEQ ID NO:17)

0.5nM G719X_6239寡核苷酸(SEQ ID NO:18)

0.5nM G719X_6252寡核苷酸(SEQ ID NO:19)

0.5nM G719X_6253寡核苷酸(SEQ ID NO:20)

总体积：1.25uL

WT寡核苷酸(SEQ ID NO:17):

G719X_6239寡核苷酸(SEQ ID NO:18):

G719X_6252寡核苷酸(SEQ ID NO:19):

G719X_6253寡核苷酸(SEQ ID NO:20):

1xA7组合物

Tris乙酸pH＝8.0 10mM

乙酸钾25mM

乙酸镁5mM

Triton-X 0.01％

Q5U缓冲液

Q5U缓冲组合物不是可公开获取的。

2.焦磷酸解(PPL)和连接

制备了对应于以下的混合物：

1xBFF1

10U/mL Klenow(exo-)

100U/mL大肠杆菌连接酶

1.2U/mL腺三磷酸双磷酸酶

100U/mL Lambda exo

0.25mM PPi

6.6nM G719X_6239探针寡核苷酸(SEQ ID NO:21)

6.6nM G719X_6252探针寡核苷酸(SEQ ID NO:22)

6.6nM G719X_6253探针寡核苷酸(SEQ ID NO:23)

30nM夹板寡核苷酸(SEQ ID NO:24)

1.25uL来自第1点的混合物。

总体积10uL

然后将这种混合物在45℃孵育15分钟。

1xBFF1组合物

Tris乙酸pH＝7.0 10mM

乙酸钾30mM

乙酸镁17.125mM

Triton-X 0.01％

G719X_6239探针寡核苷酸(SEQ ID NO:21):

G719X_6252探针寡核苷酸(SEQ ID NO:22):

G719X_6253探针寡核苷酸(SEQ ID NO:23):

夹板寡核苷酸(SEQ ID NO:24):

其中*代表硫代磷酸酯键

3.检测-RCA

制备了对应于以下的混合物：

2.66x Thermopol缓冲液(53.2mM Tris-HCl、26.6mM(NH₄)₂SO₄、26.6mM KCl、5.32mM MgSO₄、0.266％

pH 8.8)

0.28uM染料引物混合物1

0.56uM猝灭剂引物1

0.28uM猝灭剂引物2

0.84uM反向引物

568.8U/mL BST 2.0WarmStart

14.67U/mL TIPP

1.06mM dNTP

1.25uL来自第2点的反应混合物。

总体积11.25uL

染料引物混合物1由以下组成：

染料引物1(SEQ ID NO:25):

染料引物2(SEQ ID NO:26):

染料引物3(SEQ ID NO:27):

其中*代表硫代磷酸酯键，/5Cy5/代表5’末端上的Cy5染料，/5TEX615代表5'末端上的TEX染料，/5HEX/代表5'末端上的Hex染料

猝灭剂引物1(SEQ ID NO:28)：

其中/3IAbRQSp/代表3’Iowa

RQ猝灭剂

猝灭剂引物2(SEQ ID NO:29)：

其中/3IAbkFQ/代表3’Iowa

FQ猝灭剂

反向引物(SEQ ID NO:30):

其中*代表硫代磷酸酯键

然后将混合物在58℃孵育150分钟。每1分钟进行一次荧光测量。其结果可见于图14。

实施例14:焦磷酸解和针对靶的连接

1.寡核苷酸稀释液制备

在0.5xA7和0.5xQ5缓冲液中制备寡核苷酸稀释液：

WT寡核苷酸200nM

+/-突变体寡核苷酸500pM

总体积1.25uL

WT寡核苷酸(SEQ ID NO 31)：

突变体寡核苷酸(SEQ ID NO 32)：

2.焦磷酸解和连接

制备了由以下组成的PPL混合物：

1xBFF1

10U/mL Klenow(exo-)

100U/mL大肠杆菌连接酶

1.2U/mL腺三磷酸双磷酸酶

100U/mL Lambda exo

0.25mM PPi

20nM探针A₀

来自第1点的1.25uL寡核苷酸

总体积10uL

探针A₀(SEQ ID NO 33)：

其中*硫代磷酸酯键

1xBFF1组合物

Tris乙酸pH＝7.0 10mM

乙酸钾30mM

乙酸镁17.125mM

Triton-X 0.01％

1xA7组合物

Tris乙酸pH＝8.0 10mM

乙酸钾25mM

乙酸镁5mM

Triton-X 0.01％

Q5缓冲液

Q5缓冲组合物不是可公开获取的。

所得混合物在45℃孵育15分钟。

3.检测-RCA

制备了由以下组成的RCA混合物：

2.66x Thermopol缓冲液(53.2mM Tris-HCl、26.6mM(NH₄)₂SO₄、26.6mM KCl、5.32mM MgSO₄,、0.266％Triton-X，pH 8.8)

0.28uM引物混合物

284.4U/mL BST 2.0WarmStart

14.67U/mL TIPP

1.06mM dNTP

Syto82染料3uM

1.25uL来自第2点的反应

总体积11.25uL

引物混合物：

Fwd(SEQ ID NO 34)：

Rev(SEQ ID NO 35)：

将所得混合物在50℃孵育70分钟。

每1分钟取一次荧光读数。结果可见于图16。

实施例15:本发明和实施方案的进一步选择的应用

KRAS检测

KRAS基因控制细胞增殖，当它发生突变时，这种负信号传导(negativesignalling)被破坏，并且细胞能够持续增殖，通常发展成癌症。单个氨基酸取代，并且特别是单个核苷酸取代，是造成参与多种癌症的激活突变的原因：肺腺癌、粘液腺瘤、胰腺导管上皮癌和结肠直肠癌。KRAS突变已被用作例如肺癌的预后生物标志物。

KRAS中的驱动突变与多达20％的人类癌症相关，并且目前正在开发针对这种突变及其相关疾病的靶向治疗方法，下表列出了一些此类疗法的非限制性列表：

已发现KRAS突变的存在反映了对EGFR抑制剂帕尼单抗(Vectibix)和西妥昔单抗(Erbitux)的非常差的响应。编码KRAS的基因的激活突变发生在30％-50％的结肠直肠癌中，并且研究表明，其肿瘤表达这种突变形式的KRAS基因的患者对帕尼单抗和西妥昔单抗没有响应。野生型KRAS基因的存在并不能保证患者对这些药物有响应，然而，研究已经表明西妥昔单抗对患有野生型KRAS肿瘤的转移性结肠直肠癌患者有显著效力。KRAS突变阳性(野生型EGFR)的肺癌患者对EGFR拮抗剂埃罗替尼或吉非替尼的应答率估计为5％或更低，相比之下，不具有KRAS突变的患者的应答率为60％。

早期检测KRAS突变(激活或过度表达)的出现(结肠直肠癌对西妥昔单抗疗法(抗EGFR疗法)产生获得性抗性的常见驱动因素)允许对治疗进行修改(例如，丝裂原激活蛋白激酶激酶[MEK]抑制剂的早期启动)以延迟或逆转抗性，并且因此本发明的方法允许快速且廉价地检测患者的KRAS状态是有利的。

突变的非限制性列表是：G12D、G12A、G12C、G13D、G12V、G12S、G12R、A59T/E/G、Q61H、Q61K、Q61R/L、K117N和A146P/T/V。

下表显示了突变的进一步的非限制性列表：

外显子	突变名称	COSM编号	突变序列
				2	G12A	COSM522	c.35G＞C
2	G12C	COSM516	c.34G＞T
				2	G12D	COSM521	c.35G＞A
2	G12F	COSM512	c.34_35delinsTT
				2	G12R	COSM518	c.34G＞C
2	G12S	COSM517	c.34G＞A
				2	G12V	COSM520	c.35G＞T
2	G12V	COSM515	c.35_36delinsTC
				2	G13A	COSM533	c.38G＞C
2	G13C	COSM527	c.37G＞T
				2	G13D	COSM532	c.38G＞A
2	G13R	COSM529	c.37G＞C
				2	G13S	COSM528	c.37G＞A
3	Q61E	COSM550	c.181C＞G
				3	Q61H	COSM1146992	c.183A＞T
3	Q61H	COSM554/COSM1135364	c.183A＞C
				3	Q61K	COSM549/COSM1159597	c.181C＞A
3	Q61L	COSM553	c.182A＞T
				3	Q61R	COSM552	c.182A＞G

BRAF检测

BRAF是编码叫做B-Raf的蛋白的人类基因，B-Raf蛋白参与在细胞内发送参与指导细胞生长的信号。它已经被显示在一些人类癌症中发生了突变。B-Raf是生长信号转导蛋白激酶中Raf激酶家族的成员，并在调节MAP激酶/ERKs信号传导途径中起作用，该途径，除其他外，影响细胞分裂。

某些其他遗传性的BRAF突变导致出生缺陷。

已经鉴定与人类癌症相关的BRAF基因的超过30个突变。在90％的情况中，在核苷酸1799处胸腺嘧啶被腺嘌呤取代。这导致在人类癌症中发现的激活区段的密码子600处的缬氨酸(V)被谷氨酸(E)取代(现在称为V600E)。这种突变在以下中被广泛观察到：

-结肠直肠癌

-黑色素瘤

-乳头状甲状腺癌

-非小细胞肺癌

-成釉细胞瘤(ameloblastoma)

已经发现的其他突变的非限制性列表是：R461I、I462S、G463E、G463V、G465A、G465E、G465V、G468A、G468E、N580S、E585K、D593V、F594L、G595R、L596V、T598I、V599D、V599E、V599K、V599R、V600K和A727V。

已经开发了治疗由BRAF突变驱动的癌症的药物；维莫非尼和达拉非尼被FDA批准用于治疗晚期黑色素瘤。对于转移性黑色素瘤，维莫非尼治疗的应答率为53％，相比之下，以前最好的化疗药物达卡巴嗪的应答率为7％-12％。

ERBB2/HER2检测

人表皮生长因子受体2(HER2)(又称CD340(分化簇340)、原癌基因Neu、Erbb2(啮齿动物)或ERBB2(人))是由ERBB2基因编码的蛋白。这个癌基因的扩增或过度表达在侵袭性类型的乳腺癌的进展中起着重要作用。也已知ERBB2基因的过度表达发生在卵巢癌、胃癌、肺腺癌、侵袭性子宫癌和30％的涎腺导管癌中。还确定了在没有过度表达的情况下导致受体不依赖配体的激发(firing)的结构改变。

存在许多针对这种突变及其相关疾病的已经批准的以及正在开发的靶向疗法，下表中列出了一些此类疗法的非限制性列表：

HER2测试在乳腺癌患者中常规地进行，以评估预后、监测对治疗的应答以及确定靶向疗法(曲妥珠单抗等)的适用性。由于曲妥珠单抗昂贵且与严重的副作用(心脏毒性)相关，重要的是仅选择HER2+患者来接受它，并且因此本发明的方法允许快速和廉价地检测患者的HER2状态是有利的。

在一种实施方案中，使用本发明的方法检测存在或不存在ERRB2外显子20插入突变。

下表显示了ERBB2突变的进一步的非限制性列表：

EML4-ALK检测

EML4-ALK是棘皮动物微管相关蛋白样4(EML4)基因和间变性淋巴瘤激酶(ALK)基因的异常基因融合。这种基因融合导致产生蛋白EML4-ALK，它显示出促进和维持癌细胞的恶性行为。EML4-ALK阳性肺癌是细胞中含有这种突变的原发恶性肺肿瘤。

EML4-ALK基因融合导致了约5％的非小细胞肺癌(NSCLC)，美国每年约有9,000例新病例，全球约有45,000例。

存在转化活性所需的许多EML4-ALK变体，所有变体在EML4 N-末端部分和ALK外显子20的激酶结构域中都有必需的卷曲螺旋结构域。EML4的外显子13与ALK的外显子20的融合(变体1：V1)(其检测可见于图20)，EML4的外显子20与ALK的外显子20的融合(V2)，以及EML4的外显子6与ALK的外显子20的融合(V3)是一些更常见的变体。这些不同变体的临床意义最近才变得更加清晰。

V3已成为适用于选择在非酪氨酸激酶抑制剂(TKI)治疗(诸如化疗和放疗)后可能具有较短无进展生存期(PFS)的患者的标志物。有进一步的证据表明，与EML4-ALK的V1和V2相比，V3与接受第一代和第二代治疗线的患者的更短的PFS和更差的总生存时间(OS)有关。

还发现V3阳性患者通过发展抗性突变而对第一和第二治疗线产生抗性，并且该抗性可能由于野生型V3的较高IC50而导致不完全的肿瘤细胞抑制而促进。对不利V3的检测可用于选择需要更积极监测和治疗策略的患者。显示将第三代洛拉替尼施用于具有V3的患者可能赋予比具有V1的患者更长的PFS，并且因此本发明的方法允许快速和廉价地检测患者可能具有的变体是有利的。

本发明的方法还允许检测抗性突变，诸如但不限于：G1202R、G1269A、E1210K、D1203、S1206C、L1196M、F1174C、I1171T、I1171N/S、V1180L、T1151K和C1156Y。

例如，G1202R是溶剂前沿突变(solvent-front mutation)，它会干扰药物结合，并赋予对第一代和第二代ALK抑制剂的高水平抗性。因此，本发明的方法允许鉴定可能具有这种突变并从第三代治疗开始的治疗而不是第一代或第二代治疗中受益的那些患者是有利的。

下表显示了EML4-ALK突变的进一步非限制性列表：

EGFR检测

鉴定表皮生长因子受体(EGFR)作为癌基因导致了靶向疗法的发展，诸如用于肺癌的吉非替尼、埃罗替尼、阿法替尼、布格替尼和埃克替尼，以及用于结肠癌的西妥昔单抗。然而，许多人对这些疗法产生了抗性。抗性的两个主要来源是T790M突变和MET癌基因。

EGFR突变发生在EGFR外显子18-21和外显子18、19和21中，并且指示用EGFR-TKI(酪氨酸激酶抑制剂)进行治疗的适用性。外显子20的突变(少数突变除外)表明肿瘤是EGFR-TKI抗性的，并且不适合用EGFR-TKI进行治疗。

两种最常见的EGFR突变是外显子19的短框内缺失(short in-frame deletions)和外显子21在核苷酸2573处的点突变(CTG到CGG)，它们导致密码子858处的亮氨酸被精氨酸取代(L858R)。这两个突变一起占非小细胞肺癌(NSCLC)中所有EGFR突变的～90％。在NSCLC患者中筛查这些突变可以用来预测哪些患者会对TKI有响应。

因此，本发明的方法允许鉴定可能具有这些突变并受益于以TKI开始治疗的那些患者是有利的。本领域技术人员将理解，本发明的方法允许鉴定一系列EGFR突变，这类突变的非穷尽列表是：G719X、Ex19Del、S768I、Ex20Ins和L861Q。

下表显示了突变的进一步的非限制性列表：

ROS1

ROS1是一种与间变性淋巴瘤激酶(ALK)蛋白(它由c-ros癌基因编码)具有结构相似性的受体酪氨酸激酶(由基因ROS1编码)。

下表示出了ROS1突变的非限制性列表：

RET原癌基因

RET原癌基因编码神经胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)家族成员的受体酪氨酸激酶。

下表示出了RET突变的非限制性列表：

MET外显子14

MET外显子14跳读(skipping)以约5％的频率发生在NSCLC中，并且在鳞癌和腺癌组织学中都可见。

下表显示了MET突变的非限制性列表：

外显子	突变名称	COSM编号	突变序列
				跳读14	MET-MET	COSM29312	M13_M15

NTRK原癌基因

NTRK基因融合导致被称为TRK融合蛋白的异常蛋白，TRK融合蛋白可能导致癌细胞生长。NTRK基因融合可能存在于某些类型的癌症中，包括脑癌、头颈癌、甲状腺癌、软组织癌、肺癌和结肠癌。又称神经营养酪氨酸受体激酶基因融合。

下表显示了NTRK突变的非限制性列表：

组(panel)

在本发明的一种实施方案中，提供了包含多于一种探针分子(A₀)的组，其中每种A₀与靶突变互补。突变可以选自先前或随后描述的或已知的任何突变。因此，本领域技术人员将理解，在本发明的范围内包括可用于检测先前或随后描述的或已知的任何原癌基因或癌基因的一个或更多个突变的组。

在一种实施方案中，组包括5-500种单独的探针分子，每种探针分子与特定的靶突变互补。在一种实施方案中，组包括5-400种单独的探针分子，每种探针分子与特定的靶突变互补。在一种实施方案中，组包括5-300种单独的探针分子，每种探针分子与特定的靶突变互补。在一种实施方案中，组包括5-200种单独的探针分子，每种探针分子与特定的靶突变互补。在一种实施方案中，组包括5-100种单独的探针分子，每种探针分子与特定的靶突变互补。在一种实施方案中，组包括5-50种单独的探针分子，每种探针分子与特定的靶突变互补。

在一种实施方案中，可以存在多于一种对同一突变特异的探针分子。在一种实施方案中，可能只有一种探针分子对组的每个突变有特异性。

在一种实施方案中，提供了组，其中组包括多于一种探针分子，其中一种或更多种探针与EGFR突变互补，一种或更多种探针与KRAS突变互补，一种或更多种探针与ERBB2/HER2突变互补，一种或更多种探针与EML4-ALK突变互补，一种或更多种探针与ROS1突变互补，一种或更多种探针与RET突变互补，以及一种或更多种探针与MET突变互补。

在一种实施方案中，提供了组，其中组包括多于一种探针分子，其中一种或更多种探针可以与EGFR突变互补，一种或更多种探针可以与KRAS突变互补，一种或更多种探针可以与ERBB2/HER2突变互补，一种或更多种探针可以与EML4-ALK突变互补，一种或更多种探针可以与ROS1突变互补，一种或更多种探针可以与RET突变互补，以及一种或更多种探针可以与MET突变互补。

在一种实施方案中，提供了对一种或更多种EGFR、KRAS、BRAF、ERBB2/HER2、EML4-ALK、ROS1、RET、MET突变具有选择性的探针的组。

在一种实施方案中，提供了对EGFR突变具有选择性的探针分子的组。

在一种实施方案中，提供了对KRAS突变具有选择性的探针分子的组。

在一种实施方案中，提供了对BRAF突变具有选择性的探针分子的组。

在一种实施方案中，提供了对ERBB2/HER2突变具有选择性的探针分子的组。

在一种实施方案中，提供了对EML4-ALK突变具有选择性的探针分子的组。

在一种实施方案中，提供了对ROS1突变具有选择性的探针分子的组。

在一种实施方案中，提供了对RET突变具有选择性的探针分子的组。

在一种实施方案中，提供了对NTRK突变具有选择性的探针分子的组。

在一种实施方案中，提供了对MET外显子14突变具有选择性的探针分子的组。

在一种实施方案中，提供了包括对一个或更多个编码序列(CDS)具有选择性的多于一种探针分子的组。

在一种实施方案中，提供了一种使用先前描述的组中的的一个或更多个组来检测一个或更多个突变的方法。

在一种实施方案中，提供了一种使用先前描述的组中的一个或更多个组来检测存在或不存在一个或更多个突变的方法。

在一种实施方案中，提供了试剂盒，所述试剂盒包含可以如先前或随后描述的组，与一种或更多种可以如先前或随后描述的试剂组合。

本领域技术人员将理解，公开A₀的试剂盒的实施方案包括在其范围内的实施方案，其中存在包括多于一个A₀的组。

伴随诊断

本发明的方法可用于检测样品中的特定遗传标志物，该标志物可用于帮助指导选择合适的疗法。这些标志物可以是肿瘤特异性突变，或者可以是野生型基因组序列，并且可以使用组织、血液或任何其他患者样品类型来检测。

抗性监测

在疾病治疗过程中对患者样品的重复检测可以允许早期检测对治疗产生的抗性。这种应用的一个实例是非小细胞肺癌(NSCLC)，其中表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂(例如吉非替尼、埃罗替尼)通常用作一线治疗。在治疗过程中，肿瘤通常可能在EGFR基因中产生突变(例如T790M、C797S)，这些突变赋予对药物的抗性。这些突变的早期检测可以允许患者转向替代疗法(如塔格瑞斯(Tagrisso))。

通常，正在被监测抗性发生的患者可能病情过于严重而无法进行重复的组织活检。重复的组织活检也可能是昂贵的、侵入性的、并带有相关的风险。最好从血液检测，但在合理的抽血样品中可能存在非常低拷贝数的感兴趣的突变。因此，监测要求使用本发明的方法从血液样品中进行灵敏的测试，其中该方法实施起来简单且成本有效，从而可以定期进行。

复发监测

在本应用实例中，治疗后被宣布无疾病的患者可能会随着时间的推移受到监测，以检测疾病的复发。这需要非侵入性地进行，并且要求从血液样品灵敏地检测靶序列。通过使用本发明的方法，它提供了一种可以定期进行的简单且低成本的方法。被靶向的序列可以是已知在感兴趣的疾病中常见的通用突变，或者可以是基于缓解前肿瘤组织中变体的检测为特定患者设计的定制靶的组。

微小残留病(MRD)监测

对于某些癌症，残留癌细胞会在治疗后留在患者体内，这是癌症和白血病复发的主要原因。MRD监测和检测有几个重要作用：确定治疗是否已经根除了癌症或是否留下了残留，比较不同治疗的效力，监测患者的缓解状态以及检测白血病的复发，并选择最能满足这些需求的治疗。

筛查

群体筛查以早期检测疾病是一个长期的目标，尤其是在癌症诊断方面。挑战是双重的：鉴定允许可信的疾病检测而没有太多的假阴性的一组标志物，以及开发具有足够灵敏度和足够低成本的方法。与基于PCR的检测相比，本发明的方法可用于处理更大的突变组，但与基于测序的诊断相比，本发明的方法的工作流程更简单且成本更低。

器官移植排斥

当移植的器官被接受者排斥时，来自该器官的DNA脱落进入接受者的血流中。这种DNA的早期检测将允许早期检测排斥。这可以使用供体特异性标志物的定制组，或者通过使用已知在群体中常见的变体(其中一些将存在于供体中，并且一些存在于接受者中)的组来实现。通过本文公开的本发明的低成本和简单的工作流程，可以实现随时间推移对器官接受者的例行监测。

无创产前检测(NIPT)

长期以来已知，胎儿DNA存在于母亲的血液中，并且NIPT市场现在已经被使用测序来鉴定突变并计数特定染色体的拷贝数以使得能够检测胎儿异常的公司饱和。本文公开的本发明的方法具有检测非常低的等位基因分数的突变的能力，潜在地允许更早地检测胎儿DNA。鉴定给定群体中的常见突变将允许开发靶向母体或胎儿DNA中可能存在的突变的测定，或者允许在妊娠更早期检测异常。

本领域技术人员将进一步理解，尽管已经参照若干实施方案通过示例的方式描述了本发明，但是本发明不限于所公开的实施方案，并且在不脱离如所附权利要求中限定的本发明的范围的情况下，可以构造替代实施方案。

本领域技术人员将理解，提及“部分消化的链A₁”可以指当与靶分析物序列杂交时，A₀在3’-5’方向上逐步消化形成的单链寡核苷酸，直到链因为缺乏互补性而解离。

本领域技术人员将理解，提及“部分双链的”核酸可以指其中一个或更多个部分为双链且一个或更多个部分为单链的核酸。

本领域技术人员将理解，提及“基本上双链的”核酸可以指其中一个或更多个部分为双链且一个或更多个较小部分为单链的核酸。

序列表

<110> 生物保真有限公司

<120> 简化的多核苷酸序列检测方法

<130> P32007WO1

<160> 35

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 位置1处的A具有5'磷酸。

A、T、G和T (位置 1-4)全部由硫代磷酸酯键连接。

<400> 1

atgttcgatg agctttgaca atacttgaag ctcgcagata taggatgttg cgatagtcca 60

ggaggctgc 69

<210> 2

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> DNA序列

<400> 2

tgtcaaagct catcgaacat cctggactat gtctcc 36

<210> 3

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人EGFR基因的一部分

<400> 3

tgctgggcat ctgcctcacc tccaccgtgc agctcatcac gcagctcatg cccttcggca 60

gcctcctgga ctatg 75

<210> 4

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 具有C797S突变的人EGFR基因的一部分

<400> 4

tgctgggcat ctgcctcacc tccaccgtgc agctcatcac gcagctcatg cccttcggct 60

gcctcctgga ctatg 75

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> DNA序列

<400> 5

tcgcaacatc ctatatctgc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> DNA序列

<400> 6

tgagctttga caatacttga 20

<210> 7

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> WT寡核苷酸

<400> 7

catctgcctc acctccaccg tgcagctcat cacgcagctc atgcccttcg gctgcctcct 60

ggactatgtc cgggaacaca aagacaatat 90

<210> 8

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> T790M寡核苷酸

<400> 8

catctgcctc acctccaccg tgcagctcat catgcagctc atgcccttcg gctgcctcct 60

ggactatgtc cgggaacaca aagacaatat 90

<210> 9

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> C797S_2389寡核苷酸

<400> 9

catctgcctc acctccaccg tgcagctcat cacgcagctc atgcccttcg gcagcctcct 60

ggactatgtc cgggaacaca aagacaatat 90

<210> 10

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> T790M探针。5'磷酸。位置1-4处的A、T、G和T之间的硫代磷酸酯键。

<400> 10

atgttcgatg agctttgaca atacttgagc acggcagata taggatgttg cgaagggcat 60

gagctgcatg atgagctg 78

<210> 11

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> C797S_2389探针。5'磷酸。位置1-4处的A、T、G和T之间的硫代磷酸酯键。

<400> 11

atgttcgatg agctttgaca atacttgaag ctcgcagata taggatgttg cgatagtcca 60

ggaggctgc 69

<210> 12

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> T790M夹板寡核苷酸。

<400> 12

tgtcaaagct catcgaacat gcccttcgca acatct 36

<210> 13

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> C797S_2389夹板寡核苷酸。

<400> 13

tgtcaaagct catcgaacat tcctggacta tcgcat 36

<210> 14

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Cy5引物。3' Qusar670染料，位置50处的G与位置51处的A之间的猝灭剂。

<400> 14

acgcctggtt accgagccag gttcgcacat gtaggctcgg taaccaggcg acatcctata 60

tctgccgtgc 70

<210> 15

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 德克萨斯红引物。5'德克萨斯红染料。位置38处的G与位置39处的C之间的猝灭剂。

<400> 15

acgcctggtt acaggttcgc acatgtagta accaggcgca acatcctata tctgcgag 58

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 反向引物。

<400> 16

atgttcgatg agctttgaca 20

<210> 17

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> WT寡核苷酸。

<400> 17

cccaaccaag ctctcttgag gatcttgaag gaaactgaat tcaaaaagat caaagtgctg 60

ggctccggtg cgttcggcac ggtgtataag gtaaggtccc 100

<210> 18

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> G719X_6239寡核苷酸。

<400> 18

cccaaccaag ctctcttgag gatcttgaag gaaactgaat tcaaaaagat caaagtgctg 60

gcctccggtg cgttcggcac ggtgtataag gtaaggtccc 100

<210> 19

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> G719X_6252寡核苷酸。

<400> 19

cccaaccaag ctctcttgag gatcttgaag gaaactgaat tcaaaaagat caaagtgctg 60

agctccggtg cgttcggcac ggtgtataag gtaaggtccc 100

<210> 20

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> G719X_6253寡核苷酸。

<400> 20

cccaaccaag ctctcttgag gatcttgaag gaaactgaat tcaaaaagat caaagtgctg 60

tgctccggtg cgttcggcac ggtgtataag gtaaggtccc 100

<210> 21

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> G719X_6239探针寡核苷酸。5'磷酸。位置1-4处的A、T、G和T之间的硫代磷酸酯键。

<400> 21

atgttcgatg agctttgaca atacttgaca tgcgcagata taggatgttg cgaaacgcac 60

cggaggccag cactttg 77

<210> 22

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> G719X_6252探针寡核苷酸。5'磷酸。位置1-4处的A、T、G和T之间的硫代磷酸酯键。

<400> 22

atgttcgatg agctttgaca atacttgaca tgccgagtaa tgagagtttc gcaaacgcac 60

cggagctcag cactttg 77

<210> 23

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> G719X_6253探针寡核苷酸。5'磷酸。位置1-4处的A、T、G和T之间的硫代磷酸酯键。

<400> 23

atgttcgatg agctttgaca atacttgaca tgcgagcaat taggtagtgt cgtaacgcac 60

cggagcacag cactttg 77

<210> 24

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 夹板寡核苷酸。

<400> 24

tgtcaaagct catcgaacat ccggtgcgtt cggcaa 36

<210> 25

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 染料引物1。5' Cy5染料，位置1处的A和位置2处的C之间的硫代磷酸酯键。

<400> 25

actgaccagc tccatgacaa tcgctgtcgc catgatcgat cgcaacatcc tatatctgc 59

<210> 26

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 染料引物2。5' TEX染料，位置1处的A和位置2处的C之间的硫代磷酸酯键。

<400> 26

actgaccagc tccatgacaa tcgctgtcgc catgatcgat gcgaaactct cattactcg 59

<210> 27

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 染料引物3。5' TEX染料，位置1处的T和位置2处的A之间的硫代磷酸酯键。

<400> 27

tacgaccgac tcactcctta cagcagtccg cagtatgcta cgacactacc taattgctc 59

<210> 28

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 猝灭剂引物1。3' Iowa Black RQ猝灭剂。

<400> 28

tcgatcatgg cgacagcgat tgtcatggag ctggtcagt 39

<210> 29

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 猝灭剂引物2。3' Iowa Black FQ猝灭剂。

<400> 29

agcatactgc ggactgctgt aaggagtgag tcggtcgta 39

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 反向引物。位置1-3处的T、G和A之间的硫代磷酸酯键。

<400> 30

tgagctttga caatacttga 20

<210> 31

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 野生型寡核苷酸

<400> 31

ctgctgggca tctgcctcac ctccaccgtg cagctcatca cgcagctcat gcccttcggc 60

tgcctcctgg actatgtccg g 21

<210> 32

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 野生型寡核苷酸

<400> 32

ctgctgggca tctgcctcac ctccaccgtg cagctcatca tgcagctcat gcccttcggc 60

tgcctcctgg actatgtccg g 21

<210> 33

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 5'磷酸。位置1-4处的a、g、c、t之间的硫代磷酸酯键。

<400> 33

agctgcatct gagctttgac aatacttgag cacggcagat ataggatgtt gcgaagggca 60

tgagctgcat gatg 14

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 位置1-3的处t、c和g之间的硫代磷酸酯键。

<400> 34

tcgcaacatc ctatatctgc 20

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>

<400> 35

atgttgcgaa gggcatatgt 20

Claims

1.一种检测样品中存在的给定核酸分析物中的靶多核苷酸序列的方法，所述方法包括以下步骤：

i.单链探针寡核苷酸A₀；

ii.焦磷酸解酶；和

iii.连接酶；

其中所述分析物退火到所述单链探针寡核苷酸A₀以产生第一中间产物，所述第一中间产物为至少部分双链的并且其中A₀的3’末端形成双链复合物且A₀从3’末端在3’-5’方向上焦磷酸解，以产生至少部分消化的链A₁并且A₁经历连接以形成A₂；

(b)检测来源于前一步骤的产物的信号，其中所述产物是A₂或其部分，或者A₂的多于一个拷贝或其部分的多于一个拷贝，并由此推断所述分析物中存在或不存在多核苷酸靶序列。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征还在于，所述第一反应混合物还包含焦磷酸根离子源。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其特征还在于，所述第一反应混合物还包含至少一种与A₀的一部分基本互补的单链引物寡核苷酸和三磷酸脱氧核糖核苷酸(dNTP)。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征还在于，所述第一反应混合物还包含扩增酶。

5.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其特征还在于，在步骤(b)之前将步骤(a)的产物引入到第二反应混合物，所述第二反应混合物包含至少一种单链引物寡核苷酸和dNTP。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征还在于，所述第二反应混合物还包含扩增酶。

7.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其特征还在于，所述第一反应混合物还包含：

一种或更多种连接酶；和

与A₂上相邻序列互补的两个或更多个LCR探针寡核苷酸，其中当所述探针成功地退火到A₂时，一个LCR探针的5'磷酸与另一个LCR探针的3'OH直接相邻；

其中在A₂的存在下，所述两个LCR探针将成功地退火到A₂并且被连接在一起以形成一个寡核苷酸分子，然后该寡核苷酸分子充当第二轮共价连接的新的靶，导致感兴趣的靶，在这种情况下A₂的几何扩增，然后感兴趣的靶，在这种情况下A₂被检测到。

8.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其特征还在于，在步骤(b)之前将步骤(a)的产物引入到第二反应混合物，所述第二反应混合物包含：

一种或更多种连接酶；和

与A₂上相邻序列互补的两个或更多个LCR探针寡核苷酸，其中当所述探针成功退火到A₂时，一个LCR探针的5’磷酸与另一个LCR探针的3’OH直接相邻；

其中在A₂的存在下所述两个LCR探针将成功地退火到A₂并且被连接在一起以形成一个寡核苷酸分子，然后该寡核苷酸分子充当第二轮共价连接的新的靶，导致感兴趣的靶，在这种情况下A₂的几何扩增，然后感兴趣的靶，在这种情况下A₂被检测到。

9.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其特征还在于，所述第一反应混合物还包含：

与A₂的包含连接位点的区域互补的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含一个或多于一个荧光团，所述一个或多于一个荧光团被布置为使得它们的荧光通过它们彼此接近来猝灭或通过它们与一个或更多个荧光猝灭剂接近来猝灭；

双链特异性DNA消化酶；

其中，在A₂的存在下，标记的寡核苷酸被消化，使得所述荧光团彼此分离或与其相应的猝灭剂分离，并且荧光信号，以及因此A₂的存在是可检测的。

10.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其特征还在于，在步骤(b)之前将步骤(a)的产物引入到第二反应混合物中，所述第二反应混合物包含：

双链特异性DNA消化酶；

11.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征还在于，所述部分消化的链A₁是通过其3’和5’末端的连接来环化以产生寡核苷酸A₂。

12.根据权利要求1至6或权利要求11中任一项所述的方法，其特征还在于，所述第一反应混合物还包含连接探针寡核苷酸C，并且所述部分消化的链A₁在3’末端与C的5’末端连接以产生寡核苷酸A₂。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征还在于，所述寡核苷酸C还包括保护其免受3’-5’核酸外切酶消化的3’修饰或内部修饰。

14.根据权利要求11至13中任一项所述的方法，其特征还在于，连接发生于：

步骤(a)期间；或

步骤(b)期间；或

步骤(a)和(b)之间。

15.根据权利要求1至6或11至14中任一项所述的方法，其特征还在于，所述第一反应混合物或第二反应混合物还包含夹板寡核苷酸D。

16.根据权利要求15所述的方法，其特征还在于，D包含与A₁的3’末端互补的寡核苷酸区域和与寡核苷酸C的5’末端或A₁的5’末端互补的区域。

17.根据权利要求15或权利要求16所述的方法，其特征还在于，由于3’修饰或通过D的3’末端和A₁的相应区域之间的错配，D不能针对A₁进行延伸。

18.根据任一前述权利要求所述的方法，其特征还在于，所述第一反应混合物还包含5’-3’核酸外切酶，并且其中A₀的5’末端被赋予对5’-3’核酸外切酶消化的抗性。

19.根据任一前述权利要求所述的方法，其特征还在于，在步骤(a)之前，样品中存在的所述核酸分析物经过扩增，并且其中在扩增所述给定的核酸分析物之后且在加入所述第一反应混合物之前，所述样品还用蛋白酶处理。

20.根据任一前述权利要求所述的方法，其特征还在于，所述第一反应混合物还包含磷酸酶或磷酸水解酶。

21.根据任一前述权利要求所述的方法，其特征还在于，在步骤(b)之前或步骤(b)期间，用焦磷酸酶处理前一步骤的产物。

22.根据任一前述权利要求所述的方法，其特征还在于，在步骤(b)之前或步骤(b)期间，用核酸外切酶处理前一步骤的产物。

23.根据任一前述权利要求所述的方法，其特征还在于，对A₀进行焦磷酸解以形成部分消化的链A₁的酶也扩增A₂。

24.根据前述权利要求中任一项所要求的方法，其特征还在于，使用一种或更多种寡核苷酸荧光结合染料或分子探针实现检测。

25.根据权利要求24所述的方法，其特征还在于，由生成A₂的扩增子导致的信号随时间的增加用于推断所述分析物中所述靶序列的浓度。

26.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征还在于，使用了多于一种探针A₀，每种探针A₀对不同的靶序列有选择性，并且每种探针A₀包含识别区，并且其特征还在于A₂的扩增子包含该识别区，并且因此通过检测所述识别区来推断所述分析物中存在的所述靶序列。

27.根据权利要求26所述的方法，其特征还在于，使用分子探针或通过测序进行所述识别区的检测。

28.根据权利要求24所述的方法，其特征还在于，所述方法的最后步骤还包括以下步骤：

ii.测量所述产物的荧光信号；

iii.将所述产物暴露于一组变性条件；和

通过监测暴露于所述变性条件期间所述产物的荧光信号的变化来鉴定所述分析物中的所述多核苷酸靶序列。

29.根据权利要求1至28所述的方法，其特征还在于，将所述一种或更多种核酸分析物拆分为多于一个反应体积，每个体积具有被引入以检测不同的靶序列的一种或更多种探针寡核苷酸A₀。

30.根据权利要求1至29所述的方法，其特征还在于，不同的探针A₀包含共同的引发位点，允许使用单个引物或单组引物进行扩增。