RU2021136364A

RU2021136364A - Способы детектирования вариантов нуклеиновых кислот

Info

Publication number: RU2021136364A
Application number: RU2021136364A
Authority: RU
Inventors: Камилла Колдинг БЕНДИКСЕН; Сара Кронборг ЭРИКСЕН; Эмели Элизабет ХАНСЕН; Ульф Бек КРИСТЕНСЕН; Расмус Кефед ПЕТЕРСЕН; Сесили Линд МАДСЕН
Original assignee: Пентабейс Апс
Priority date: 2019-05-13
Filing date: 2020-05-13
Publication date: 2023-06-13

Claims

1. Способ детектирования присутствия варианта последовательности в последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, состоящей из двух цепей и включающей представляющий интерес нуклеотид (нуклеотиды) (NOI), предпочтительно включающей повторы, при этом указанная последовательность-мишень нуклеиновой кислоты состоит из варианта последовательности или контрольной последовательности, при этом указанный способ включает следующие этапы:

a) Получение первого образца, включающего нуклеиновые кислоты, в отношении которых предполагается, что они включают указанный вариант последовательности;

b) Получение второго образца, включающего нуклеиновые кислоты, включающие указанную контрольную последовательность, при этом второй образец представляет собой контрольный образец;

c) Получение репортерного олигонуклеотида;

d) Получение набора праймеров, состоящего из первого праймера и второго праймера, при этом праймеры набора совместно способны амплифицировать последовательность-мишень нуклеиновой кислоты, включающую NOI;

e) Амплификацию последовательности-мишени нуклеиновой кислоты в присутствии указанного первого образца, указанного первого праймера и указанного второго праймера, тем самым обеспечивая получение первого ампликона, включающего нуклеиновые кислоты, в отношении которых предполагается, что они включают вариант последовательности; и амплификацию последовательности-мишени нуклеиновой кислоты в присутствии указанного второго образца, указанного первого праймера и указанного второго праймера, тем самым обеспечивая получение второго ампликона, включающего контрольную последовательность, при этом второй ампликон представляет собой контрольный ампликон;

f) Осуществление анализа плавления, такого как высокочувствительный анализ кривых плавления (HRM), первого ампликона, тем самым обеспечивая получение первого профиля, характеризуемого первой кривой плавления, и осуществление анализа плавления, такого как HRM анализ, второго ампликона, тем самым обеспечивая получение второго профиля, характеризуемого второй кривой плавления, при этом второй профиль представляет собой контрольный профиль, характеризуемый контрольной кривой плавления; при этом каждый ампликон включает первую цепь и вторую цепь, при этом анализ плавления включает гибридизирование репортерного олигонуклеотида с одной цепью каждого ампликона, детектирование сигнала, испускаемого флуорофором, и получение первой и второй кривой плавления;

при этом репортерный олигонуклеотид представляет собой последовательность длиной от 10 до 50, предпочтительно от 15 до 50 нуклеотидов, в которую были вставлены от 2 до 10 гидрофобных нуклеотидов,

при этом репортерный олигонуклеотид включает первый флуорофор, предпочтительно на его 5'-конце или на расстоянии не более 4 нуклеотидов от 5'-конца, и первый гаситель, предпочтительно на его 3'-конце или на расстоянии не более 4 нуклеотидов от 3'-конца, и

при этом репортерный олигонуклеотид включает последовательность гибридизации Н,

при этом последовательность гибридизации идентична последовательному фрагменту последовательности первой цепи последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, и при этом последовательность гибридизации комплементарна последовательному фрагменту последовательности второй цепи последовательности-мишени нуклеиновой кислоты,

и при этом последовательность гибридизации репортерного олигонуклеотида включает или состоит из повторяющейся последовательности и, по меньшей мере, одной хелперной последовательности на его 5'-конце и/или на его 3'-конце, при этом указанная хелперная последовательность не включает повторы и может гибридизироваться с первым и вторым ампликоном, когда последовательность гибридизации гибридизируется с ними; и

g) Сравнение первого профиля с контрольным профилем, при этом различие между первым профилем и контрольным профилем указывает на то, что первый образец содержит вариант последовательности.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что этап g) включает или состоит из следующих этапов:

i) выравнивания первой и второй кривой плавления при определенной интенсивности флуоресценции вдоль оси температуры, тем самым обеспечивая устранение различий в плане температуры плавления между первой и второй кривой плавлений;

ii) определения различия сигнала, испускаемого флуорофором, между первой и второй кривой плавления, предпочтительно при этом различие представляет собой количественную разность; и

iii) сравнения разности, определенной на этапе ii), с пороговым значением, при этом превышающая пороговое значение разность указывает на то, что первый образец включает вариант последовательности, а не превышающая пороговое значение разность указывает на то, что первый образец включает контрольную последовательность.

3. Способ по любому одному из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что контрольная последовательность имеет длину 15 нуклеотидов или более, например 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов или более.

4. Способ по любому одному из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что репортерный олигонуклеотид состоит из повторяющейся последовательности и только одной хелперной последовательности на его 5'-конце или на его 3'-конце, или отличающийся тем, что репортерный олигонуклеотид состоит из повторяющейся последовательности и двух хелперных последовательностей, например одной хелперной последовательности как на 5'-конце, так и на 3'-конце репортерного олигонуклеотида.

5. Способ по любому одному из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что

по меньшей мере, один гидрофобный нуклеотид расположен на 5'-конце или на расстоянии не более 10 нуклеотидов от 5'-конца репортерного олигонуклеотида; и/или

по меньшей мере, один гидрофобный нуклеотид расположен на 3'-конце или на расстоянии не более 10 нуклеотидов от 3'-конца репортерного олигонуклеотида; и

при этом гидрофобный нуклеотид имеет структуру

X-Y-Q

при этом

X представляет собой нуклеотид или аналог нуклеотида или единицу мономера каркаса, способную быть встроенной в каркас нуклеиновой кислоты или аналога нуклеиновой кислоты,

Q представляет собой интеркалятор, который не принимает участия в водородной связи Уотсона-Крика; и

Y представляет собой фрагмент в виде линкера, связывающий указанный нуклеотид или аналог нуклеотида или единицу мономера каркаса и указанный интеркалятор.

6. Способ по любому одному из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что хелперная последовательность включает или состоит из от 1 до 20 нуклеотидов, например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 нуклеотидов.

7. Способ по любому одному из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что хелперная последовательность включает, по меньшей мере, один гидрофобный нуклеотид, как указано в п. 3.

8. Способ по любому одному из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что, по меньшей мере, один гидрофобный нуклеотид, как указано в пункте 3, например 1, 2 или 3 гидрофобных нуклеотида вставлены в от 1 до 10 нуклеотидов на 3'-конце репортерного олигонуклеотида, например в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов на 3'-конце.

9. Способ по любому одному из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что, по меньшей мере, один гидрофобный нуклеотид, как указано в пункте 3, например 1, 2 или 3 гидрофобных нуклеотида вставлены в от 1 до 10 нуклеотидов на 5'-конце репортерного олигонуклеотида, например в 1, 2, 5, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов на 5'-конце.

10. Способ по любому одному из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что амплификация на этапе е) осуществляется с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), предпочтительно с помощью асимметричной ПЦР, при которой первый и второй праймер присутствуют при различных количествах, тем самым направляя ПЦР к амплификации в большем количестве одной цепи каждого ампликона, чем другой цепи каждого ампликона.

11. Способ по любому одному из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что первый образец был получен от субъекта, страдающего или предположительно страдающего заболеванием, например раком, при этом рак предпочтительно представляет собой наследственный неполипозный рак толстой кишки, или расстройством, предпочтительно расстройством, ассоциированным с микросателлитной нестабильностью.

12. Способ по любому одному из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что NOI представляет собой микросателлит, например микросателлитную последовательность из М тандемных повторов, имеющих полную длину n нуклеотидов, и при этом вариант последовательности имеет М' тандемных повторов, имеющих полную длину n' нуклеотидов, при этом М и М' представляют собой различающиеся целые числа.

13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что n представляет собой 15 или более, например 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или более.

14. Способ по любому одному из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что длина последовательности гибридизации Н репортерного олигонуклеотида представляет собой n'', при этом n''≥n+1, предпочтительно n''≥n+1 или n''≥n+2.

15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что n'' представляют собой 16 или более, например 17, 18, 19, 20 нуклеотидов или более, например 25, 30, 35, 40, 45, 50 или более.

16. Способ по любому одному из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что первый образец представляет собой образец ткани, включающей или предположительно включающей клетки с мутациями, характерными для указанного заболевания или расстройства.

17. Набор для детектирования присутствия варианта последовательности в последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, состоящей из двух цепей и включающей представляющий интерес нуклеотид (нуклеотиды) (NOI), предпочтительно включающей повторы, при этом указанная последовательность-мишень нуклеиновой кислоты состоит из варианта последовательности или контрольной последовательности, при этом указанный набор включает:

а) репортерный олигонуклеотид, включающий первый флуорофор, предпочтительно на его 5'-конце или на расстоянии не более 4 нуклеотидов от 5'-конца, и первый гаситель, предпочтительно на его 3'-конце или на расстоянии не более 4 нуклеотидов от 3'-конца,

при этом репортерный олигонуклеотид представляет собой последовательность длиной от 10 до 50 нуклеотидов, предпочтительно от 15 до 50 нуклеотидов, в которую были вставлены от 2 до 10 гидрофобных нуклеотидов, и при этом репортерный олигонуклеотид включает последовательность гибридизации Н,

и

при этом последовательность гибридизации идентична последовательному фрагменту последовательности первой цепи последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, и при этом последовательность гибридизации комплементарна последовательному фрагменту последовательности второй цепи последовательности-мишени нуклеиновой кислоты;

b) набор праймеров, состоящий из первого праймера и второго праймера, при этом праймеры набора совместно способны амплифицировать последовательность-мишень нуклеиновой кислоты.

18. Набор по п. 17, предпочтительно отличающийся тем, что репортерный олигонуклеотид и первый праймер и второй праймер соответствуют определению в любом одном из пп. 1-16.

19. Набор по любому одному из пп. 17, 18, отличающийся тем, что репортерный олигонуклеотид состоит из повторяющейся последовательности и только одной хелперной последовательности на его 5'-конце или на его 3'-конце, или отличающийся тем, что репортерный олигонуклеотид состоит из повторяющейся последовательности и двух хелперных последовательностей, например одной хелперной последовательности как на 5'-конце, так и на 3'-конце репортерного олигонуклеотида.

20. Набор по любому одному из пп. 17-19, отличающийся тем, что

X-Y-Q

при этом

21. Репортерный олигонуклеотид, который может гибридизироваться с одной цепью нуклеиновой кислоты-мишени, состоящей из двух цепей и включающей представляющий интерес нуклеотид (нуклеотиды) (NOI), предпочтительно включающей повторы, при этом указанный репортерный олигонуклеотид включает первый флуорофор, предпочтительно на его 5'-конце или на расстоянии не более 4 нуклеотидов от 5'-конца, и первый гаситель, предпочтительно на его 3'-конце или на расстоянии не более 4 нуклеотидов от 3'-конца, при этом репортерный олигонуклеотид представляет собой последовательность длиной от 10 до 50, предпочтительно от 15 до 50 нуклеотидов, в которую были вставлены от 2 до 10 гидрофобных нуклеотидов, и при этом репортерный олигонуклеотид включает последовательность гибридизации Н,

при этом последовательность гибридизации идентична последовательному фрагменту последовательности первой цепи нуклеиновой кислоты-мишени, и при этом последовательность гибридизации комплементарна последовательному фрагменту последовательности второй цепи нуклеиновой кислоты-мишени,

и при этом последовательность гибридизации репортерного олигонуклеотида включает или состоит из повторяющейся последовательности и, по меньшей мере, одной хелперной последовательности на его 5'-конце и/или на его 3'-конце, при этом указанная хелперная последовательность не включает повторы и может гибридизироваться со второй цепью первого и второго ампликона, когда последовательность гибридизации гибридизируется с ними.

22. Репортерный олигонуклеотид по п. 21, отличающийся тем, что репортерный олигонуклеотид состоит из повторяющейся последовательности и только одной хелперной последовательности на его 5'-конце или на его 3'-конце, или отличающийся тем, что репортерный олигонуклеотид состоит из повторяющейся последовательности и двух хелперных последовательностей, например одной хелперной последовательности как на 5'-конце, так и на 3'-конце репортерного олигонуклеотида.

23. Репортерный олигонуклеотид по любому одному из пп. 21, 22, отличающийся тем, что

X-Y-Q

при этом

24. Репортерный олигонуклеотид по любому одному из пп. 21-23, отличающийся тем, что хелперная последовательность включает или состоит из от 1 до 20 нуклеотидов, например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 нуклеотидов, предпочтительно при этом хелперная последовательность включает, по меньшей мере, один гидрофобный олигонуклеотид, как указано в п. 3.

25. Способ предсказания эффективности лечения клинического состояния у нуждающегося в этом субъекта предварительно определенным лекарством, при этом эффективность лечения указанного клинического состояния указанным лекарством ассоциирована с присутствием варианта последовательности, при этом указанный способ включает следующие этапы:

а. получение образца от указанного субъекта

b. реализацию способа по любому одному из пп. 1-16 для определения присутствия указанного варианта последовательности;

при этом присутствие указанного варианта последовательности свидетельствует о том, является ли указанное лекарство эффективным в плане лечения указанного клинического состояния у указанного субъекта.

26. Способ предсказания присутствия клинического состояния у нуждающегося в этом субъекта, при этом указанное клиническое состояние ассоциировано с присутствием последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, включающей вариант последовательности, при этом указанный способ включает следующие этапы:

a. получение образца от указанного субъекта

b. реализацию способа по любому одному из пп. 1-16 для определения присутствия варианта последовательности;

при этом присутствие варианта последовательности свидетельствует о том, что указанный субъект имеет указанное клиническое состояние.