RU2695783C1 - Способ определения полиморфных маркеров в генах SLCO1B1, APOE и ABCB1 для определения индивидуальной чувствительности к статинам - Google Patents
Способ определения полиморфных маркеров в генах SLCO1B1, APOE и ABCB1 для определения индивидуальной чувствительности к статинам Download PDFInfo
- Publication number
- RU2695783C1 RU2695783C1 RU2018147306A RU2018147306A RU2695783C1 RU 2695783 C1 RU2695783 C1 RU 2695783C1 RU 2018147306 A RU2018147306 A RU 2018147306A RU 2018147306 A RU2018147306 A RU 2018147306A RU 2695783 C1 RU2695783 C1 RU 2695783C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- slco1b1
- biochip
- apoe
- abcb1
- genes
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 101150037123 APOE gene Proteins 0.000 title claims abstract description 23
- 229940121710 HMGCoA reductase inhibitor Drugs 0.000 title claims abstract description 18
- 239000002471 hydroxymethylglutaryl coenzyme A reductase inhibitor Substances 0.000 title claims abstract description 12
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 title claims abstract description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title description 8
- 101100216294 Danio rerio apoeb gene Proteins 0.000 title 1
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 claims abstract description 37
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims abstract description 33
- 108091006731 SLCO1B1 Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 108010047230 Member 1 Subfamily B ATP Binding Cassette Transporter Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 102100029470 Apolipoprotein E Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 102100027233 Solute carrier organic anion transporter family member 1B1 Human genes 0.000 claims abstract description 19
- 102100033350 ATP-dependent translocase ABCB1 Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 8
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 25
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 claims description 21
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 claims description 21
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 4
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims 1
- 230000002974 pharmacogenomic effect Effects 0.000 abstract description 12
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 6
- 102200087157 rs4149056 Human genes 0.000 abstract description 4
- 102200017284 rs7412 Human genes 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 102200012755 rs2032582 Human genes 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 26
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 10
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- RYMZZMVNJRMUDD-UHFFFAOYSA-N SJ000286063 Natural products C12C(OC(=O)C(C)(C)CC)CC(C)C=C2C=CC(C)C1CCC1CC(O)CC(=O)O1 RYMZZMVNJRMUDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000037065 Subacute sclerosing leukoencephalitis Diseases 0.000 description 4
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 description 4
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 4
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 4
- 229960002855 simvastatin Drugs 0.000 description 4
- RYMZZMVNJRMUDD-HGQWONQESA-N simvastatin Chemical compound C([C@H]1[C@@H](C)C=CC2=C[C@H](C)C[C@@H]([C@H]12)OC(=O)C(C)(C)CC)C[C@@H]1C[C@@H](O)CC(=O)O1 RYMZZMVNJRMUDD-HGQWONQESA-N 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 3
- 208000021642 Muscular disease Diseases 0.000 description 3
- 201000009623 Myopathy Diseases 0.000 description 3
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 101150119038 ABCB1 gene Proteins 0.000 description 2
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XUKUURHRXDUEBC-KAYWLYCHSA-N Atorvastatin Chemical compound C=1C=CC=CC=1C1=C(C=2C=CC(F)=CC=2)N(CC[C@@H](O)C[C@@H](O)CC(O)=O)C(C(C)C)=C1C(=O)NC1=CC=CC=C1 XUKUURHRXDUEBC-KAYWLYCHSA-N 0.000 description 2
- XUKUURHRXDUEBC-UHFFFAOYSA-N Atorvastatin Natural products C=1C=CC=CC=1C1=C(C=2C=CC(F)=CC=2)N(CCC(O)CC(O)CC(O)=O)C(C(C)C)=C1C(=O)NC1=CC=CC=C1 XUKUURHRXDUEBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N Bilirubin Chemical compound N1C(=O)C(C)=C(C=C)\C1=C\C1=C(C)C(CCC(O)=O)=C(CC2=C(C(C)=C(\C=C/3C(=C(C=C)C(=O)N\3)C)N2)CCC(O)=O)N1 BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TUZYXOIXSAXUGO-UHFFFAOYSA-N Pravastatin Natural products C1=CC(C)C(CCC(O)CC(O)CC(O)=O)C2C(OC(=O)C(C)CC)CC(O)C=C21 TUZYXOIXSAXUGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Chemical class Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007844 allele-specific PCR Methods 0.000 description 2
- 229960005370 atorvastatin Drugs 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 2
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 2
- 229960002965 pravastatin Drugs 0.000 description 2
- TUZYXOIXSAXUGO-PZAWKZKUSA-N pravastatin Chemical compound C1=C[C@H](C)[C@H](CC[C@@H](O)C[C@@H](O)CC(O)=O)[C@H]2[C@@H](OC(=O)[C@@H](C)CC)C[C@H](O)C=C21 TUZYXOIXSAXUGO-PZAWKZKUSA-N 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 2
- 229960000672 rosuvastatin Drugs 0.000 description 2
- BPRHUIZQVSMCRT-VEUZHWNKSA-N rosuvastatin Chemical compound CC(C)C1=NC(N(C)S(C)(=O)=O)=NC(C=2C=CC(F)=CC=2)=C1\C=C\[C@@H](O)C[C@@H](O)CC(O)=O BPRHUIZQVSMCRT-VEUZHWNKSA-N 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KEWSCDNULKOKTG-UHFFFAOYSA-N 4-cyano-4-ethylsulfanylcarbothioylsulfanylpentanoic acid Chemical compound CCSC(=S)SC(C)(C#N)CCC(O)=O KEWSCDNULKOKTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005552 B01AC04 - Clopidogrel Substances 0.000 description 1
- 102100037637 Cholesteryl ester transfer protein Human genes 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010001237 Cytochrome P-450 CYP2D6 Proteins 0.000 description 1
- 102100021704 Cytochrome P450 2D6 Human genes 0.000 description 1
- 208000030453 Drug-Related Side Effects and Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 101150053603 HMGCR gene Proteins 0.000 description 1
- 101000880514 Homo sapiens Cholesteryl ester transfer protein Proteins 0.000 description 1
- 101001051093 Homo sapiens Low-density lipoprotein receptor Proteins 0.000 description 1
- 101000587058 Homo sapiens Methylenetetrahydrofolate reductase Proteins 0.000 description 1
- 208000000563 Hyperlipoproteinemia Type II Diseases 0.000 description 1
- 102100024640 Low-density lipoprotein receptor Human genes 0.000 description 1
- 101150066553 MDR1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100545180 Mus musculus Zc3h12d gene Proteins 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000006098 Neonatal Hyperbilirubinemia Diseases 0.000 description 1
- 201000006346 Neonatal Jaundice Diseases 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101150018278 SLCO1B1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010001244 Tli polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108010020713 Tth polymerase Proteins 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000000719 anti-leukaemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- GKTWGGQPFAXNFI-HNNXBMFYSA-N clopidogrel Chemical compound C1([C@H](N2CC=3C=CSC=3CC2)C(=O)OC)=CC=CC=C1Cl GKTWGGQPFAXNFI-HNNXBMFYSA-N 0.000 description 1
- 229960003009 clopidogrel Drugs 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000007334 copolymerization reaction Methods 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- -1 however Proteins 0.000 description 1
- 230000000260 hypercholesteremic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- RAPZEAPATHNIPO-UHFFFAOYSA-N risperidone Chemical compound FC1=CC=C2C(C3CCN(CC3)CCC=3C(=O)N4CCCCC4=NC=3C)=NOC2=C1 RAPZEAPATHNIPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001534 risperidone Drugs 0.000 description 1
- 102200017290 rs429358 Human genes 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 201000000980 schizophrenia Diseases 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
- C12Q1/6874—Methods for sequencing involving nucleic acid arrays, e.g. sequencing by hybridisation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области фармакогенетики и персонализированной медицины. Предложен способ анализа полиморфных маркеров в генах SLCO1B1, АРОЕ и АВСВ1 для определения индивидуальной чувствительности к статинам, предусматривающий следующие стадии: амплификацию с помощью мультиплексной одноэтапной ПЦР, обеспечение биочипа, гибридизацию флуоресцентно меченного ПЦР-продукта на биочипе и регистрацию и интерпретацию результатов гибридизации. Изобретение обеспечивает выявление следующих полиморфных маркеров: SLCO1B1 (rs4149056, rs4149015), АРОЕ (rs7412), АВСВ1 (rs2032582). 1 з.п. ф-лы, 2 ил., 2 табл., 4 пр.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области фармакогенетики и персонализированной медицины и касается способа определения генетических маркеров, которые обуславливают индивидуальную чувствительность к статинам (симвастатин, аторвастатин, правастатин, розувастатин), с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) и последующей гибридизацией с олигонуклеотидным биологическим микрочипом (биочипом).
Полиморфные варианты генов SLCO1B1, АРОЕ и АВСВ1 являются одной из причин межиндивидуальных различий в ответе на статины. Генетическое тестирование SLCO1B1 при назначении этих препаратов включено в Рекомендации экспертов Консорциума по внедрению клинической фармакогенетики (CPIC, США) (Wilke RA, Ramsey LB, Johnson SG et al; The clinical pharmacogenomics implementation consortium: CPIC guideline for SLCO1B1 and simvastatin-induced myopathy. Clin Pharmacol Ther. 2012 Jul; 92(1): 112-7), а также в Практические рекомендации экспертов Европейского научного фонда по применению фармакогенетического тестирования (Becquemont L, Alfirevic А, Amstutz U, Brauch Н et. al. Pharmacogenomics. Practical recommendations for pharmacogenomics-based prescription: 2010 ESF-UB Conference on Pharmacogenetics and Pharmacogenomics. 2010; 12(1):113-24).
Применение фармакогенетического тестирования с использованием настоящего изобретения позволит персонализировать терапию статинами, в том числе снизить риск нежелательных лекарственных реакций (в частности, статин-индуцированной миопатии).
Уровень техники
В настоящее время существует ряд методов анализа полиморфизма генома человека, в том числе и для анализа маркеров в генах SLCO1B1, АРОЕ и АВСВ1. Большинство современных методов основано на проведении ПЦР с различными вариациями, при этом дизайн реакций и способы детекции результата существенно варьируются, и зависят от конкретных задач.
Наиболее распространенными методами анализа полиморфизма генома являются:
1. Секвенирование по Сенгеру:
Метод является достаточно информативным. Он предоставляет полную информацию о последовательности ДНК в исследуемом локусе. Однако он характеризуется низкой производительностью, высокой стоимостью проведения анализа, время- и трудозатратен. Часто этот метод используется для подтверждения результатов, полученных с помощью других методов [Fesenko DO, Avdonina MA, Gukasyan LG, Surzhikov SA, Chudinov AV, Zasedatelev AS, Nasedkina TV. Multiplex Genotyping of Allelic Variants of Genes Involved in Metabolizing Antileukemic Drugs. Mol Biol (Mosk). 2018; 52(2):238-245.].
2. Аллель-специфичный рестрикционный анализ (ПДРФ, полиморфизм длин рестрикционных фрагментов):
Данный метод требует постановки ПЦР и реакции рестрикции, что делает его трудоемким и повышает вероятность ошибки, не подлежит автоматизации. Однако данный метод не требует высокой квалификации персонала и дорогостоящего оборудования [Su J, Yu Q, Zhu H, Li X, Cui H, Du W, Ji L, Tong M, Zheng Y, Xu H, Zhang J, Zhu Y, Xia Y, Liu T, Yao Q, Yang J, Chen X, Yu J. The risk of clopidogrel resistance is associated with ABCB1 polymorphisms but not promoter methylation in a Chinese Han population. PLoS One. 2017 Mar 30; 12(3):e0174511.; 
The role of CYP2D6 and ABCB1 pharmacogenetics in 
patients with first-episode schizophrenia treated with risperidone. Eur J Clin Pharmacol. 2010 Nov; 66(11):1109-17.].
3. Аллель-специфичная ПЦР (AS-PCR)
Метод распространен достаточно широко, однако требует постановки независимых параллельных ПЦР-реакций, соответствующих количеству анализируемых однонуклеотидных замен, что снижает его ценность для широкомасштабного генотипирования. Детекция осуществляется в режиме реального времени или по конечной точке реакции с последующим разделением продуктов с помощью электрофореза [Op den Buijsch RA, Wijnen PA, van Dieijen-Visser MP, de Vries JE, Bekers O. Rapid genotyping of the OATP1B1 polymorphisms A388G and T521C with real-time PCR FRET assays. Pharmacogenomics. 2005 Jun;6(4):393-7.; 
Barczak W, Gryczka R, 
Jagielski P, Czernikiewicz A, 
Wojewoda A, Perz K, 
Morze K, Kanduta Z, Lisiak N, Mrozikiewicz PM, Grodecka-Gazdecka S, 
Study of ABCB1 polymorphism frequency in breast cancer patients from Poland. Pharmacol Rep. 2012; 64(6): 1560-6.].
4. ПЦР в реальном времени с TaqMan-зондами:
Метод является достаточно быстрым и удобным. Требует оборудования для ПЦР в реальном времени. Возможен анализ нескольких локусов в одной пробирке. [Thompson J F, Man M, Johnson К J, Wood L S, Lira M E, Lloyd D B, Banerjee P, Milos P M, Myrand S P, Paulauskis J, Milad M A, Sasiela W J. An association study of 43 SNPs in 16 candidate genes with atorvastatin response. The pharmacogenomics journal. 2005.; Baldissera VD, de Mattos AA, Coral GP, de Araujo FB, Marroni CA, de Mello 
AB, Ott Fontes PR, Schmidt Cerski CT, Hartmann AA, Kretzmann Filho NA. Evaluation of the C3435T polymorphism in the MDR1 gene in patients with hepatocellular carcinoma. Ann Hepatol. 2012 Nov-Dec; 11(6):899-906.].
5. Анализ кривых плавления высокого разрешения:
Метод 5 является достаточно простым методом скрининга, однако для анализа некоторых последовательностей данный метод не подходит. HRM анализ может быть выполнен только на приборе с специальным каналом для HRM и специальным программным обеспечением. Кроме того, он также требует постановки нескольких параллельных реакций для каждого пациента по числу анализируемых локусов [Kaewboonlert N, Thitisopee W, Sirintronsopon W, Porntadavity S, Jeenduang N. Lack of association between SLCO1B1 polymorphisms and lipid-lowering response to simvastatin therapy in Thai hypercholesterolaemic patients. J Clin Pharm Ther. 2018 Oct; 43(5):647-655.; Yang H, Wang Q, Zheng L, Lin M, Zheng XB, Lin F, Yang LY. Multiple Genetic Modifiers of Bilirubin Metabolism Involvement in Significant Neonatal Hyperbilirubinemia in Patients of Chinese Descent. PLoS One. 2015 Jul 6; 10(7):e0132034.].
6. Высокопроизводительное секвенирование (next generation sequencing, NGS):
Метод является высокоинформативным. Однако из-за высокой стоимости оборудования, расходных материалов и необходимости высокой квалификации персонала его применение в рутинной лабораторной диагностике ограничено. Используется для поиска ассоциаций [Thompson John F, Hyde Craig L, Wood Linda S, Paciga Sara A, Hinds David A, Cox David R, Hovingh G Kees, Kastelein John J P. Comprehensive whole-genome and candidate gene analysis for response to statin therapy in the Treating to New Targets (TNT) cohort. Circulation. Cardiovascular genetics. 2009.; Calandra S, Tarugi P, Bertolini S. Impact of rare variants in autosomal dominant hypercholesterolemia causing genes. Curr Opin Lipidol. 2017 Jun; 28(3):267-272.].
Запатентовано большое количество методов анализа полиморфных генетических маркеров для определения индивидуальной чувствительности к статинам, в том числе те, которые позволяют анализировать генетические варианты генов SLCO1B1, АРОЕ и АВСВ1.
В китайском патенте CN 105803099 A от 2016-05-16 описан метод одновременного обнаружения мутаций SLCO1B1, АРОЕ и LDLR, однако полиморфизм гена АВСВ1 не включен в данный анализ. В китайском патенте CN 106434940 A от 2016-10-20 праймеры для обнаружения локуса rs17238540 гена HMGCR, rs7412 гена АРОЕ, rs429358 гена АРОЕ и rs4149056 гена SLCO1B1, однако метод не позволяет анализировать аллели гена АВСВ1. В китайском патенте CN 107099602 A от 2017-05-27 представлен анализ полиморфизма генов АРОЕ, SLCO1B1, СЕТР, АВСВ1 и MTHFR. Данная панель генетических маркеров широка и информативна, однако для проведения анализа требуется оборудование для ПЦР в реальном времени, которым располагают не все диагностические лаборатории.
Раскрытие сущности изобретения
Задача настоящего изобретения состоит в создании способа определения генетических маркеров, которые обуславливают индивидуальную чувствительность к статинам. Панель маркеров включает наиболее информативные генетические маркеры, определение которых позволяет персонализировать терапию статинами, снизить риск нежелательных лекарственных реакций (в частности, статин-индуцированной миопатии).
Сущность изобретения заключается в обеспечении способа анализа однонуклеотидного полиморфизма (SNP, Single nucleotide polymorphism) генов SLCO1B1, АРОЕ, АВСВ1, продукты которых обуславливают индивидуальную чувствительность к статинам (симвастатин, аторвастатин, правастатин, розувастатин). Данный способ позволяет выявлять следующие полиморфные маркеры в генах: SLCO1B1 (rs4149056, rs4149015), АРОЕ (rs7412), АВСВ1 (rs2032582).
Основными признаками данного изобретения являются мультиплексная одноэтапная ПЦР и последующая гибридизация продуктов на биочипе, содержащем набор иммобилизованных олигонуклеотидных зондов.
Первый важный признак изобретения - набор праймеров для амплификации анализируемых локусов, который используется для получения флуоресцентно меченных продуктов в необходимом количестве для гибридизации на биочипе. Один из пары праймеров для каждого локуса имеет часть, комплементарную участку гена (на 3'-конце) и часть с универсальной последовательностью (на 5'-конце), соответствующей универсальному праймеру. Последовательности праймеров для проведения ПЦР приведены в Перечне последовательностей 1 (последовательности SEQ ID NO: 1-9).
Второй важный признак изобретения - биочип, содержащий набор иммобилизованных олигонуклеотидных зондов, последовательности которых приведены в Перечне последовательностей 2 (последовательности SEQ ID NO: 10-17). Олигонуклеотидные зонды иммобилизуются в ячейках гидрогелевого микрочипа, как описано в патенте RU 2206575 (дата публикации 2003-06-20) в концентрации 2000 мкМ. Схема расположения зондов в ячейках биочипа приведена на Фигуре 1.
Набор праймеров для ПЦР используется при проведении одноэтапной ПЦР, результатом которой является флюоресцентно меченный продукт, полученный за два раунда, для последующей гибридизации на биочипе. Далее проводится гибридизация флуоресцентно меченных фрагментов ДНК с иммобилизованными в ячейках биочипа олигонуклеотидными зондами, расположенными на пластиковой подложке. После проведения гибридизации и отмывки биочипа проводится анализ полученной флуоресцентной картины, на основании которой делается отчет о генотипе исследуемого образца. Пример картины гибридизации приведен на Фигуре 2.
Краткое описание таблиц и фигур
Фигура 1. Схема расположения зондов в ячейках биочипа для анализа полиморфных маркеров в генах SLCO1B1, АРОЕ и АВСВ1 для определения индивидуальной чувствительности к статинам. (а) расположение ячеек на биочипе; (б) расшифровка условных обозначений. (М) - ячейки, содержащие флуоресцентный краситель Су5, светящийся перманентно, для ориентировки и контроля интенсивности свечения.
Фигура 2. Гибридизационная картина анализа полиморфных маркеров в генах SLCO1B1, АРОЕ и АВСВ1 для определения индивидуальной чувствительности к статинам (пациент №1), полученная на биочипе.
Осуществление изобретения
Для обеспечения оптимальных условий мультиплексной ПЦР необходимо использовать праймеры, обеспечивающие специфичный и эффективный отжиг на мишени при одинаковой температуре (для одного этапа), и они не должны образовывать при этой температуре вторичные структуры, в том числе и в условиях мультиплексной ПЦР. Для оптимальной (стабильной и специфичной) наработки необходимого для гибридизации на биочипе количества флюоресцентно меченного ПЦР-продукта должны быть подобраны такие параметры как концентрации реагентов в реакционной смеси и температурно-временной режим реакции. В результате проведенной работы были подобраны праймеры и условия для проведения ПЦР, которые позволяют осуществлять эффективную наработку исследуемых локусов ДНК в условиях мультиплексной ПЦР.
Для иммобилизации на биочипе подбираются олигонуклеотидные зонды, позволяющие идентифицировать все выбранные для анализа участки генов.
Олигонуклеотидные зонды должны быть подобраны в соответствии со следующими критериями:
1) Олигонуклеотидный зонд должен обладать высокой специфичностью к анализируемому локусу.
2) Предпочтительно расположение вариабельного нуклеотида в серединной области зонда, так как такая конструкция зонда позволяет добиться лучшей дискриминации между совершенными и несовершенными дуплексами.
3) Олигонуклеотидный зонд в условиях, при которых проводится гибридизация не должен образовывать стабильных вторичных структур, наличие которых может приводить к снижению эффективности гибридизации.
Для анализа полиморфных маркеров в генах SLCO1B1, АРОЕ и АВСВ1 для определения индивидуальной чувствительности к статинам на биочипе было иммобилизовано 10 высокоспецифичных дифференцирующих олигонуклеотидных зондов (Перечень последовательностей 2, последовательности SEQ ID NO: 10-17), структура которых обеспечивает высокоспецифичное связывание с полностью комплементарными ДНК-мишенями. Яркий флюоресцентный сигнал наблюдается только в ячейках, в которых при гибридизации образовался совершенный дуплекс между олигонуклеотидным зондом и флюоресцентно меченным ПЦР-продуктом.
Приведем последовательность анализа с использованием данного метода. Амплификация ПЦР-продуктов для последующей гибридизации на биочипе проводится посредством мультиплексной одноэтапной ПЦР, при этом в качестве матрицы для проведения реакции используют образец ДНК, выделенный из крови или соскоба буккального эпителия любым известным исследователю методом (фенол-хлороформная экстракция, выделение на колонках, выделение на сорбенте и т.д.).
ПЦР может быть проведена с использованием любого вида термостабильной полимеразы (Taq-полимераза, Taq-полимераза с горячим стартом, Tth-полимераза, Tfl-полимераза, Pfu-полимераза, Vent-полимераза, DeepVent-полимераза и другие коммерчески доступные ферменты, выделенные из термофилов), работающей в соответствующем буфере. Для построения новой цепи в буфер добавляется смесь дНТФ (дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ). Для проведения ПЦР могут быть использованы готовые коммерчески доступные наборы, содержащие все необходимые компоненты за исключением праймеров.
В ходе мультиплексной одноэтапной ПЦР осуществляется наработка преимущественно одноцепочечных продуктов (за счет добавления в реакцию избытка универсального праймера), и их флюоресцентное маркирование с использованием дУТФ-Су5, который способен включаться в растущую цепь ДНК. В качестве флуоресцентной метки также может быть использован любой флуорохром без ограничения (например, FITC, Texas red, Су-3 и т.д.), а также биотин.
Синтез праймеров и олигонуклеотидных зондов осуществляется с помощью таких химических подходов как фосфодиэфирный метод, гидрофосфорильный метод и т.д. Для синтеза праймеров используются автоматические ДНК/РНК синтезаторы, например, производства фирмы «Applied Biosystems» (США). Для иммобилизации в гидрогелевых ячейках биочипа, к 5'- или 3'-концу олигонуклеотидных зондов добавляется активная группа (например на 3'-конец может быть добавлена свободная аминогруппа с помощью 3'-Amino-Modifier С7 CPG 500, «Glen Research)), США).
Для проведения ПЦР используют праймеры SEQ ID NO: 1-8 в концентрации 1 пикомоль/мкл, и универсальный праймер SEQ ID NO: 9 в концентрации 50 пикомоль/мкл. Последовательности праймеров приведены в Перечне последовательностей 1.
Далее проводится гибридизация флуоресцентно - меченых фрагментов ДНК, полученных после проведения ПЦР, с иммобилизованными в ячейках геля олигонуклеотидными зондами, последовательности которых представляют собой участки, комплементарные последовательностям мажорного или минорного аллеля по исследуемым локусам.
Гибридизация ПЦР-продукта с олигонуклеотидными зондами на биочипе может быть проведена в любом гибридизационном буфере, например, в SSPE-буфере с формамидом или буфере с гуанидином. Перед постановкой гибридизации ПЦР-продукт прогревают при 95°C в течение 5 минут, затем охлаждают на льду в течение 2 минут, после чего наносят гибридизационную смесь на биочип. Гибридизация проводят 12-14 ч при 37°C. Отмывка биочипа после проведения гибридизации может быть проведена в любом известном в данной области техники буфере (SSC, SSPE и т.п.) или в дистиллированной воде.
Анализируемый фрагмент ДНК в условиях (состав реакции, температура и время гибридизации), при которых осуществляется гибридизация, образует совершенные дуплексы только с полностью комплементарными ему олигонуклеотидными зондами. Сигнал флюоресценции детектируется только в ячейках, в которых образовался совершенный дуплекс. В случае, если дуплекс несовершенный (присутствует хотя бы один не спаренный нуклеотид), то сигнал флюоресценции отсутствует.
Далее проводится визуализация результатов гибридизации с помощью любой детектирующей системы, способной возбуждать флюоресценцию и распознавать флуоресцентный сигнал (например, портативный анализатор биочипов, снабженный ПЗС-камерой и специальным программным обеспечением, производства ООО «БИОЧИП-ИМБ» (Москва, Россия)).
Изготовление биочипов может осуществляться посредством последовательного нанесения на поверхность подложки из стекла ячеек акриламидного геля, активации ячеек и иммобилизации в ячейках модифицированных олигонуклеотидов [Analysis of SNPs and other genomic variations usins sel-based chips / A. Kolchinsky, A. Mirzabekov // Hum Mutat. - 2002. - Vol. 19. - P. 343-360. Review]. В качестве подложки кроме стекла может быть использован любой материал, в том числе металл, гибкие мембраны и пластик (Патент RU 2309959, опубликован 2007-11-10). Биочипы также могут быть изготовлены и другими известными способами [Arrays of immobilized oligonucleotides-contributions to nucleic acids technology / H. Seliger, M. Hinz, E. Happ // Curr Pharm Biotechnol. - 2003. - Vol. 4. - P. 379-395].
Для изготовления биочипа в настоящем изобретении используется набор олигонуклеотидных зондов SEQ ID NO: 10-17, приведенный в Перечне последовательностей 2. Расположение конкретных олигонуклеотидных зондов на биочипе может варьироваться в зависимости от удобства интерпретации результатов.
Далее приведены примеры, иллюстрирующие возможности применения способа анализа полиморфных маркеров в генах SLCO1B1, АРОЕ и АВСВ1 для определения индивидуальной чувствительности к статинам. Варианты и модификации осуществления изобретения, которые могут быть воспроизведены, не отходя от общей концепции настоящего изобретения и без привлечения собственной изобретательской деятельности, также будут входить в объем притязаний настоящего изобретения.
Пример 1. Амплификация участков генов SLCO1B1, АРОЕ и ABCB1 с целью получения флуоресцентно меченного ПЦР-продукта в необходимом количестве.
Из крови пациента больного выделяли ДНК с помощью набора QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, США).
Наработку участков анализируемых генов проводили методом одноэтапной мультиплексной ПЦР. ПЦР проводилась в одной реакции для каждого образца. ПЦР-смесь общим объемом 25 мкл включала в себя: 0.5 ед. акт. Taq-полимеразы («СибЭнзим», Россия), ПЦР-буфер (70 мМ Трис-HCl (рН 8.3), 16.6 мМ (NH4)SO4, 2.5 мМ MgCl2, 200 мкМ каждого дНТФ («СибЭнзим», Россия), 10 нг ДНК, по 1 пмоль каждого праймера SEQ ID NO: 1-14, 50 пмоль универсального праймера SEQ ID NO: 9, 8 мкМ флуоресцентно меченного дУТФ-Су5. Амплификацию проводили по следующей схеме: 40 циклов (94°C 30 с, 65°C 30 с, 67°C 30 с, 69°C 30 с, 72°C 20 с), далее 40 циклов (94°C 30 с, 56°C 10 с, 72°C 30 с), на приборе Т100 («Bio-Rad», США).
Пример 2. Олигонуклеотидный биочип для анализа полиморфных маркеров в генах SLCO1B1, АРОЕ и АВСВ1.
Олигонуклеотидные зонды для иммобилизации на микрочипе синтезировали на автоматическом синтезаторе 394 DNA/RNA Synthesizer («Applied Biosystems», США) с использованием стандартной фосфоамидитной процедуры. В 3'-конец олигонуклеотидов вводят спейсер со свободной аминогруппой, используя метод 3'-Amino-Modifier С7 CPG 500 («Glen Research», США).
Биочип изготовляют методом сополимеризации олигонуклеотида в акриламидном геле (патент RU 2309959, опубликованный 2007-11-10 и RU 2175972, опубликованный 2001-11-20). Биочип содержит 8 иммобилизованных олигонуклеотидных зондов (SEQ ID NO: 10-29), список которых представлен также в Перечне последовательностей 2. Ячейки наносят согласно схеме на Фигуре 1.
Пример 3. Гибридизация меченного продукта на биочипе
Реакционную смесь, полученную после проведения второго этапа ПЦР, описанного в Примере 1, использовали для гибридизации на биочипе. 10 мкл формамида ("Serva", США), 10 мкл 20*SSPE ("Promega", США) и 20 мкл амплификата. Гибридизационную смесь денатурировали при 95°C 5 минут, охлаждали во льду 2 минуты, наносили на биочип и оставляли на 12 часов при 37°C. После проведения гибридизации биочип отмывали в 1x SSPE в течение 10 минут при комнатной температуре.
Пример 4. Регистрация и интерпретация результатов гибридизации
Регистрацию гибридизационной картины производили с помощью портативного анализатора биочипов, снабженного ПЗС-камерой, производимого ООО «Биочип-ИМБ». По полученной гибридизационной картине, представленной на Фигуре 2. определяли генотип образца
Генотип образца:
SLCO1B1 rs4149056_T/T
SLCO1B1 rs4149015_G/G
АРОЕ rs7412_C/G
ABCB1 rs2032582_C/A
Claims (6)
1. Способ анализа полиморфных маркеров в генах SLCO1B1, АРОЕ и АВСВ1 для определения индивидуальной чувствительности к статинам, предусматривающий следующие стадии:
(а) амплификацию фрагментов генов SLCO1B1, АРОЕ и АВСВ1 с помощью мультиплексной одноэтапной ПЦР, в которой в качестве матрицы для амплификации используется ДНК, выделенная из крови или другого биоматериала, полученного от пациента, и праймеры, представленные последовательностями SEQ ID NO: 1-9;
(б) обеспечение биочипа для анализа и идентификации полиморфных маркеров в генах SLCO1B1, АРОЕ и АВСВ1 для определения индивидуальной чувствительности к статинам, набором олигонуклеотидных зондов, представленных последовательностями SEQ ID NO: 10-17;
(в) гибридизацию флуоресцентно меченного ПЦР-продукта, полученного на стадии (а), на биочипе, полученном на стадии (б);
(г) регистрацию и интерпретацию результатов гибридизации на биочипе, проведенной на стадии (в).
2. Способ по п. 1, в котором для идентификации полиморфных маркеров в генах SLCO1B1, АРОЕ и АВСВ1, амплифицированных с помощью набора праймеров, охарактеризованных в п. 1, используется биочип, представляющий собой подложку с набором иммобилизованных на ней олигонуклеотидных зондов с последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 10-17.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018147306A RU2695783C1 (ru) | 2018-12-28 | 2018-12-28 | Способ определения полиморфных маркеров в генах SLCO1B1, APOE и ABCB1 для определения индивидуальной чувствительности к статинам |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018147306A RU2695783C1 (ru) | 2018-12-28 | 2018-12-28 | Способ определения полиморфных маркеров в генах SLCO1B1, APOE и ABCB1 для определения индивидуальной чувствительности к статинам |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2695783C1 true RU2695783C1 (ru) | 2019-07-26 |
Family
ID=67512397
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018147306A RU2695783C1 (ru) | 2018-12-28 | 2018-12-28 | Способ определения полиморфных маркеров в генах SLCO1B1, APOE и ABCB1 для определения индивидуальной чувствительности к статинам |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2695783C1 (ru) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105803099A (zh) * | 2016-05-16 | 2016-07-27 | 钟诗龙 | 一种同时检测slco1b1、apoe和ldlr基因多位点突变的试剂盒 |
| CN107099602A (zh) * | 2017-05-27 | 2017-08-29 | 宁波美晶医疗技术有限公司 | 一种同时检测他汀类药物代谢基因多位点突变的试剂盒 |
-
2018
- 2018-12-28 RU RU2018147306A patent/RU2695783C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105803099A (zh) * | 2016-05-16 | 2016-07-27 | 钟诗龙 | 一种同时检测slco1b1、apoe和ldlr基因多位点突变的试剂盒 |
| CN107099602A (zh) * | 2017-05-27 | 2017-08-29 | 宁波美晶医疗技术有限公司 | 一种同时检测他汀类药物代谢基因多位点突变的试剂盒 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| КАЗАКОВ Р.Е. и др. Значение генетических факторов в прогнозировании побочного действия статинов. Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. 2016; 8-5: 691-698 [Найдено 15.05.2019] [он-лайн], Найдено из Интернет: URL: https://applied-research.ru/ru/article/view?id=10151. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7892731B2 (en) | System and method for inhibiting the decryption of a nucleic acid probe sequence used for the detection of a specific nucleic acid | |
| WO2008059578A1 (fr) | Procédé d'amplification pcr multiplex | |
| EP2563939B1 (en) | Rapid genotyping analysis for human papillomavirus and the device thereof | |
| JP4989493B2 (ja) | 分子内プローブによる核酸配列の検出方法 | |
| CN1489632A (zh) | 固相支持物上的核酸等温扩增 | |
| CA2497740A1 (en) | Multiplexed analysis of polymorphic loci by probe elongation-mediated detection | |
| AU2016266065B2 (en) | Methods for pcr and hla typing using raw blood | |
| EP2180066B1 (en) | Single nucleotide polymorphism genotyping detection via the real-time invader assay microarray platform | |
| JP2019076100A (ja) | 多重メチル化特異的増幅システムおよび方法 | |
| KR20130077207A (ko) | 돼지의 다산 개체 선발을 위한 ｓｎｐ 마커와 이를 이용한 평가방법 | |
| US20090061440A1 (en) | Method for amplifying plural nucleic acid sequences for discrimination | |
| Blömeke et al. | Identification of N-acetyltransferase 2 genotypes by continuous monitoring of fluorogenic hybridization probes | |
| RU2695783C1 (ru) | Способ определения полиморфных маркеров в генах SLCO1B1, APOE и ABCB1 для определения индивидуальной чувствительности к статинам | |
| RU2609641C1 (ru) | Способ анализа соматических мутаций в химерном гене BCR/ABL с использованием ОТ-ПЦР и последующей гибридизацией с олигонуклеотидным биологическим микрочипом (биочипом) | |
| Shammas et al. | ThalassoChip, an array mutation and single nucleotide polymorphism detection tool for the diagnosis of β-thalassaemia | |
| RU2539733C2 (ru) | Набор дифференцирующих нуклеотидов и биочип для применения в способе генотипирования маркеров гаплогрупп y-хромосомы человека: m130 (c), м145 (de) | |
| RU2549682C1 (ru) | Способ анализа соматических мутаций в гене pi3k с использованием lna-блокирующей мультиплексной пцр и последующей гибридизацией с олигонуклеотидным биологическим микрочипом (биочипом) | |
| RU2674687C1 (ru) | Способ анализа соматических мутаций в генах GNAQ и GNA11 с использованием LNA-блокирующей мультиплексной ПЦР и последующей гибридизацией с олигонуклеотидным биологическим микрочипом (биочипом) | |
| Hue-Roye et al. | Principles of PCR-based assays | |
| JP2008125471A (ja) | マルチプレックスな核酸増幅方法 | |
| Zhussupova | PCR–diagnostics | |
| WO2008088236A1 (ru) | Способ генетической идентификации личности на основе анализа однонуклеотидного полиморфизма генома человека с использованием олигонуклеотидного биологического микрочипа (биочипа) | |
| US20060078881A1 (en) | Method and kit for detection of mutations in mitochondrial dna | |
| RU2716589C1 (ru) | Способ определения полиморфных маркеров в генах CYP2C19 и CYP2D6 для определения индивидуальной чувствительности к антидепрессантам | |
| Morlighem et al. | DNA amplification techniques in pharmacogenomics |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20200225 Effective date: 20200225 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20201229 |