KR20140127282A - 다중화된 생화학적 분석에서의 시그널 인코딩 및 디코딩 - Google Patents

다중화된 생화학적 분석에서의 시그널 인코딩 및 디코딩 Download PDF

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아디트야 라자고팔
악셀 셰러
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캘리포니아 인스티튜트 오브 테크놀로지
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Abstract

본 개시는 표본 중 복수의 분석물질의 다중화된 검출을 위한 방법, 시스템, 조성물, 및 키트를 제공한다. 일부 예에서, 상기 개시는 적어도 하나의 정량 가능한 시그널 성분의 누적 측정 또는 측정들을 확보함으로써 단일 표본 부피에서 여러 분석물질이 검출될 수 있는 방법, 시스템, 조성물, 및 키트를 제공한다. 일부 사례에서, 추가적인 시그널 성분, 또는 추가적인 시그널(또는 이들의 성분)이 또한 정량된다. 각각의 시그널 또는 시그널 성분은 코딩 방식을 구축하기 위해 이용될 수 있고, 이는 다시 임의의 분석물질의 존재 또는 부재를 결정하기 위해 이용될 수 있다.

Description

다중화된 생화학적 분석에서의 시그널 인코딩 및 디코딩{SIGNAL ENCODING AND DECODING IN MULTIPLEXED BIOCHEMICAL ASSAYS}
교차 참조
본 출원은 2012. 2. 3.에 출원된 U.S. 가출원 61/594,480, 및 2012. 9. 19.에 출원된 61/703,093의 이익을 청구하며, 각각은 그 전문이 본원에 참고문헌으로 도입된다.
다중화된 반응은 동일한 표본에서의 병렬 반응 수행, 동일한 챔버를 이용한 여러 반응의 수행, 및 빠르고 효율적인 방식으로 표본으로부터 풍부한 정보를 추출하는 능력을 포함하여, 전통적인 단일화 반응에 비해 상당한 장점을 제공한다. 그러나 이들 이점을 달성하기 위해, 다중화된 분석은 일반적으로 복잡한 보고 기전, 즉 분광학적으로 분리된 형광 또는 화학발광(예로, PCR, ELISA), 공간적으로 분리된 시그널(예로, 마이크로어레이, 겔 전기영동), 시간적으로 분리된 시그널(예로, 모세관 전기영동), 또는 이들의 조합(예로, 생거(Sanger) 서열분석)을 필요로 한다. 단일 용액 중에 수행될 수 있는 다중화된 반응이 필요하다.
발명의 요약
본 개시는 분석물질의 다중화된 검출을 위한 방법, 조성물, 시스템, 및 키트를 제공한다. 일부 사례에서, 본 개시는 고정화, 분리, 질량 분광측정, 또는 용융 곡선 분석 없이 단일 표본 부피에서 임의 조합의 존재 또는 부재 하에 적어도 7개 분석물질 각각의 존재 또는 부재를 모호하지 않게 검출할 수 있는 분석을 제공한다. 일부 예에서, 각각의 분석물질은 시그널의 하나의(또는 적어도 하나의) 성분값으로 인코딩된다.
일부 예에서, 본 개시에서 제공되는 분석은 임의 조합의 존재 또는 부재 하에 M개의 분석물질의 존재 또는 부재를 모호하지 않게 검출할 수 있고, 여기서 M = log2(F + 1)이고, F는 분석물질이 모두 존재할 때 시그널의 하나의 성분(예로, 강도)의 최대 누적값이다.
일부 사례에서, 각각의 분석물질은 시그널의 제1 성분(예로, 적어도 하나의 강도 또는 강도들의 범위)에서의 적어도 하나의 제1값 및 시그널의 제2 성분(예로, 적어도 하나의 파장 또는 파장들의 범위)에서의 적어도 하나의 제2값으로 인코딩된다. 일부 예에서, 각각의 분석물질은 시그널의 제2 성분에서의 복수의 제2값 각각에서 시그널의 제1 성분에서의 제1값으로(예로, 복수의 파장들 또는 파장들의 범위 각각에서의 시그널 강도 또는 시그널 강도들의 범위로) 인코딩된다.
일부 예에서, 본원에 제공되는 분석은 임의 조합의 존재 또는 부재 하에 M개의 분석물질의 존재 또는 부재를 모호하지 않게 검출할 수 있고, 여기서 M = C * log2(F + 1)이며, C는 분석물질을 인코딩하는데 이용되는 제2값들의 수이고, F는 분석물질이 모두 존재할 때 임의의 제2값에 대한 시그널의 제1 성분의 최대 누적값이다.
일부 사례에서, 본 개시에 제공되는 분석은 임의 조합의 존재 또는 부재 하에 M개의 분석물질의 존재 또는 부재를 모호하지 않게 검출할 수 있고, 여기서 M = (P * T) + 1이고, P는 코딩 방식에서 티어별 코드의 수이고, T는 티어의 수이다. 일부 사례에서, 티어의 수 T = log4(F + 1)이고, F는 분석물질이 모두 존재할 때 임의의 제2값에 대한 시그널의 제1 성분의 최대 누적값이다.
일부 예에서, 제1값은 강도 또는 강도들의 범위이다. 일부 사례에서, 코딩 방식은 적어도 3개의 강도 또는 강도들의 범위를 포함한다.
일부 사례에서, 제2값은 파장 또는 파장들의 범위이다. 일부 사례에서, 코딩 방식은 적어도 5개의 파장 또는 파장들의 범위를 포함한다.
일부 예에서, 시그널은 전자기적 시그널이다. 일부 사례에서, 전자기적 시그널은 형광 방출 시그널이다. 일부 예에서, 형광 방출 시그널의 강도는 적어도 4개의 파장 또는 파장들의 범위에서 측정된다.
일부 사례에서, 본원에 제공된 분석은 사용 전에 동결건조된 시약과 함께 수행된다.
일부 사례에서, 검출 단계는 혼성화 탐침을 포함하는 시약과 함께 수행된다. 일부 예에서, 혼성화 탐침의 수는 분석물질의 수보다 많다. 일부 사례에서, 혼성화 탐침 세트는 상이한 분석물질에 특이적이고 동일한 형광단 또는 형광단들의 조합을 포함하는 하나 이상의 혼성화 탐침을 포함한다. 일부 예에서, 표본은 적어도 18개의 상기 혼성화 탐침과 접촉된다. 일부 예에서, 검출 단계는 적어도 한 페어의 프라이머를 포함하는 시약과 함께 수행된다. 일부 사례에서, 적어도 한 페어의 프라이머는 적어도 3개의 상기 혼성화 탐침에 상보적인 영역을 증폭할 수 있다.
일부 예에서, 측정되는 시그널은 폴리머라아제 연쇄 반응 동안 생성된다. 일부 사례에서, 폴리머라아제 연쇄 반응은 종점 폴리머라아제 연쇄 반응, 실시간 폴리머라아제 연쇄 반응, 디지털 폴리머라아제 연쇄 반응, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 예에서, 적어도 하나의 누적 측정은 용액 상에서 수행된다.
일부 예에서, 적어도 하나의 분석물질은 적어도 하나의 추가적인 값에 의해(즉, 적어도 2개의 값으로 함께) 인코딩되며, 여기서 적어도 하나의 추가적인 값은 시그널의 적어도 하나의 추가적인 성분값, 상이한 시그널의 적어도 하나의 성분값, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 예를 들어, 적어도 하나의 추가적인 값은 형광 방출 강도, 형광 방출 파장, 포스터 공명 에너지 전달(FRET) 방출 강도, FRET 방출 파장, 전기화학적 시그널, 화학발광 파장, 화학발광 강도, 형광 표백 속도, 화학발광 표백 속도, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 사례에서, 크로마토그램이 구축된다. 크로마토그램은 각각의 분석물질에 대한 양성 대조군 표본에 대한 제1값 및 제2값의 가능한 모든 조합을 도식화하여 구축될 수 있다.
일부 예에서, 적어도 하나의 분석물질은 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 사례에서, 폴리뉴클레오티드는 동물, 식물, 박테리아, 진균, 기생충, 및 바이러스로 구성된 군으로부터 선택되는 원천에서 유래된다. 일부 예에서, 폴리뉴클레오티드는 인간 면역결핍 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 인간 유두종 바이러스, 말라리아원충, 결핵균, 뎅기 바이러스, 간염 바이러스, 및 인플루엔자 바이러스로 구성된 군으로부터 선택되는 원천에서 유래된다. 일부 사례에서, 폴리뉴클레오티드는 인간 면역결핍 바이러스 폴리프로테아제, 인간 면역결핍 바이러스 p17, 인간 유두종 바이러스 E6, 및 인간 유두종 바이러스 E7로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 사례에서, 표본은 임상 표본, 식품 표본, 환경 표본, 약학 표본, 및 소비재 표본으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 예에서, 분석물질의 존재 또는 부재에 대한 정보는 컴퓨터 네트워크를 통해 전송된다.
일부 사례에서, 분석물질의 존재 또는 부재에 대한 정보는 의사에게 제공된다. 일부 예에서, 이러한 정보에 근거하여 임상적 결정이 수행된다.
일부 예에서, 본원에 제공되는 방법의 적어도 하나의 단계는 컴퓨터로 읽을 수 있는 매체에서 지침을 이용하여 수행된다. 일부 사례에서, 지침은 원격 서버 상에 위치한다. 일부 예에서, 지침은 열 싸이클러 상에 위치한다. 일부 사례에서, 지침은 열 싸이클러와 통신하는 컴퓨터 상에 위치한다.
일부 사례에서, 적어도 하나의 분석물질은 양성 대조군 분석물질이다.
일부 예에서, 코딩 방식은 비-축퇴성이다. 일부 사례에서, 코딩 방식은 비-축퇴성으로 설계된다. 일부 예에서, 코딩 방식은 코딩 방식에서 수득될 수 있는 모든 유효 결과를 열거하고, 축퇴성이 있는 각각의 유효 결과를 확인하고, 코딩 방식에서 적어도 하나의 잠재적 분석물질 코드를 제거하여 축퇴성을 제거함으로써 비-축퇴성이 된다.
일부 사례에서, 본원에서 제공되는 분석은 종점 분석이다. 일부 예에서, 본 개시에서 제공되는 분석은 기기의 검출 한계에 의해 설정되는 역치 사이클수에서 종결된다.
특정한 예에서, 본원에서 제공되는 분석은 액상 분석이다.
일부 사례에서, 본원에서 제공되는 분석은 정량적이다.
일부 사례에서, 본 개시는 하기를 포함하는, 복수의 분석물질의 각각의 분석물질의 존재 또는 부재의 검출 방법을 제공한다: (a) 각각의 상기 분석물질을 시그널의 제1값으로 인코딩하여 코딩 방식을 생성하고, 여기서 각각의 상기 분석물질은 상기 코딩 방식에서 상기 제1값에 의해 나타내며, 상기 인코딩은 축퇴성을 제거하는 방식으로 수행되고; (b) 적어도 하나의 상기 분석물질을 포함하거나 또는 잠재적으로 포함하는 표본을 제공하고; (c) 각각의 상기 분석물질이 존재할 때, 상기 코딩 방식에서 나타낸 바와 같이 상기 제1값을 생성하는 분석물질-특이적 시약과 상기 표본을 접촉시키고; (d) 상기 표본 내에서 상기 시그널의 상기 제1값을 누적 측정하여 누적 측정을 제공하고; (e) 상기 누적 측정 및 상기 코딩 방식에 근거하여 각각의 상기 분석물질이 존재하는지 또는 부재하는지를 결정함.
일부 예에서, 선행 단락에 기재된 방법은 임의 조합의 존재 또는 부재 하에 M개의 분석물질의 존재 또는 부재를 모호하지 않게 검출할 수 있고, 여기서 M = log2(F + 1)이고 F는 분석물질이 모두 존재할 때 제1값의 최대 누적값이다. 일부 사례에서, 제1값은 강도 또는 강도들의 범위이다. 일부 예에서, 제1값은 적어도 1, 적어도 2, 적어도 4, 적어도 8, 적어도 16, 적어도 32, 및 적어도 64로 구성된 군으로부터 선택되는 코딩 방식에서의 최소값을 갖는다. 일부 사례에서, 제1값은 상기 선행 제1값의 누적 최대 + 1까지의 양만큼 코딩 방식에서 증분된다. 다른 사례에서, 제1값은 상기 선행 제1값의 누적 최대 + 1을 초과하는 양만큼 코딩 방식에서 증분된다.
일부 사례에서, 본 개시는 하기를 포함하는, 복수의 분석물질의 각각의 분석물질의 존재 또는 부재의 검출 방법을 제공한다: (a) 각각의 상기 분석물질을 적어도 하나의 제1값 및 적어도 하나의 제2값으로 인코딩하여 코딩 방식을 생성하고, 여기서 상기 제1값은 시그널의 제1 성분값이고 상기 제2값은 상기 시그널의 제2 성분값이며, 각각의 상기 분석물질은 상기 코딩 방식에서 상기 적어도 하나의 제1값 및 상기 적어도 하나의 제2값에 의해 나타내며, 상기 인코딩은 축퇴성을 감소시키거나 제거하는 방식으로 수행되고; (b) 적어도 하나의 상기 분석물질을 포함하거나 또는 잠재적으로 포함하는 표본을 제공하고; (c) 각각의 상기 분석물질이 존재할 때, 상기 코딩 방식에서 나타낸 바와 같이 상기 적어도 하나의 제1값 및 적어도 하나의 상기 제2값을 생성하는 분석물질-특이적 시약과 상기 표본을 접촉시키고; (d) 상기 표본 내에서 상기 제1값 및 상기 제2값을 누적 측정하여 누적 측정을 제공하고; (e) 상기 누적 측정 및 상기 코딩 방식에 근거하여 각각의 상기 분석물질이 존재하는지 또는 부재하는지를 결정하며, 각각의 상기 시약이 하나의 제2값만을 생성할 때, 축퇴성이 제거되는 경우 상기 방법은 임의 조합의 존재 또는 부재 하에 단일 부피에서 적어도 6개 분석물질 각각의 존재 또는 부재를 모호하지 않게 검출할 수 있다.
일부 사례에서, 선행 단락에 기재된 방법의 각각의 분석물질은 시그널의 제2 성분에서의 복수의 제2값 각각에서 시그널의 제1 성분에서의 제1값으로 인코딩된다. 일부 사례에서, 축퇴성이 제거되는 경우, 상기 방법은 4개의 제2값을 이용하여 단일 부피에서 적어도 7개 분석물질 각각의 존재 또는 부재를 모호하지 않게 검출할 수 있다. 일부 예에서, 축퇴성이 제거되는 경우, 코딩 방식은 T개의 비-축퇴성 티어를 포함하며, 여기서 T = log4(F + 1)이고, F는 분석물질이 모두 존재할 때 임의의 제2값에 대한 시그널의 제1 성분의 최대 누적값이다. 일부 사례에서, 축퇴성이 제거되는 경우, 방법은 임의 조합의 존재 또는 부재 하에 M개의 분석물질의 존재 또는 부재를 모호하지 않게 검출할 수 있고, 여기서 M = (P * T) + 1이고, P는 티어별 코드의 수이다. 일부 예에서, 축퇴성이 제거되는 경우, 방법은 임의 조합의 존재 또는 부재 하에 M개의 분석물질의 존재 또는 부재를 모호하지 않게 검출할 수 있고, 여기서 M = C * log2(F + 1)이고, C는 코딩 방식에서 제2값의 수이고, F는 분석물질이 모두 존재할 때 임의의 제2값에 대한 시그널의 제1 성분의 최대 누적값이다.
본 개시는 또한 고정화, 분리, 질량 분광측정, 또는 용융 곡선 분석 없이 단일 표본 부피에서, 임의 조합의 존재 또는 부재 하에 적어도 7개 분석물질 각각의 존재 또는 부재를 모호하지 않게 인코딩 할 수 있는 비-축퇴성 코딩 방식을 제공한다.
일부 예에서, 본 개시의 비-축퇴성 코딩 방식은 하기를 포함하는 방법에 의해 생성된다: (a) 각각의 잠재적 분석물질에 대한 코드를 생성하고, 여기서 각각의 잠재적 분석물질은 시그널의 적어도 하나의 성분의 적어도 하나의 값으로 인코딩되며; (b) 각각의 분석물질의 존재 또는 부재의 가능한 모든 조합에 대해 모든 유효 누적 결과를 열거하고; (c) 축퇴성이 있는 각각의 유효 결과를 확인하고; (d) 적어도 하나의 코드를 제거하여 축퇴성을 제거함. 일부 사례에서, 코딩 방식은 상기 시그널의 적어도 하나의 성분에서 모든 이전 코드의 합보다 적어도 하나의 단위가 큰 추가적인 코드를 추가하여 확장될 수 있다. 일부 사례에서, 코딩 방식은 구성상 비-축퇴성을 보장하는 수학적 반복 방법에 의해 생성된다.
일부 사례에서, 본 개시는 하기를 포함하여, 복수의 분석물질의 각각의 분석물질의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 시스템을 제공한다: (a) 각각의 상기 분석물질을 시그널의 제1값으로 인코딩하여 코딩 방식을 생성하고, 여기서 각각의 상기 분석물질은 상기 코딩 방식에서 상기 제1값으로 나타내며, 상기 인코딩은 축퇴성을 제거하는 방식으로 수행되고; (b) 적어도 하나의 상기 분석물질을 포함하거나 또는 잠재적으로 포함하는 표본을 제공하고; (c) 각각의 상기 분석물질이 존재할 때 상기 코딩 방식에서 나타낸 바와 같이 상기 제1값을 생성하는 분석물질-특이적 시약과 상기 표본을 접촉시키고; (d) 상기 표본 내에서 상기 시그널의 상기 제1값을 누적 측정하여 누적 측정을 제공하고; (e) 상기 누적 측정 및 상기 코딩 방식에 근거하여 각각의 상기 분석물질이 존재하는지 또는 부재하는지를 결정함.
일부 사례에서, 본 개시는 하기를 포함하여, 복수의 분석물질의 각각의 분석물질의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 시스템을 제공한다: (a) 각각의 상기 분석물질을 적어도 하나의 제1값 및 적어도 하나의 제2값으로 인코딩하여 코딩 방식을 생성하고, 여기서 상기 제1값은 시그널의 제1 성분값이고 상기 제2값은 상기 시그널의 제2 성분값이며, 각각의 상기 분석물질은 상기 코딩 방식에서 상기 적어도 하나의 제1값 및 상기 적어도 하나의 제2값으로 나타내고, 상기 인코딩은 축퇴성을 감소시키거나 제거하는 방식으로 수행되고; (b) 적어도 하나의 상기 분석물질을 포함하거나 또는 잠재적으로 포함하는 표본을 제공하고; (c) 각각의 상기 분석물질이 존재할 때 상기 코딩 방식에서 나타낸 바와 같이 상기 적어도 하나의 제1값 및 상기 적어도 하나의 제2값을 생성하는 분석물질-특이적 시약과 상기 표본을 접촉시키고; (d) 상기 표본 내에서 상기 제1값 및 상기 제2값을 누적 측정하여 누적 측정을 제공하고; (e) 상기 누적 측정 및 상기 코딩 방식에 근거하여 각각의 상기 분석물질이 존재하는지 또는 부재하는지를 결정하고, 축퇴성이 제거되는 경우, 상기 시스템은 각각의 상기 시약이 하나의 제2값만을 생성할 때 임의 조합의 존재 또는 부재 하에 단일 부피에서 적어도 6개 분석물질 각각의 존재 또는 부재를 모호하지 않게 검출할 수 있다.
일부 사례에서, 본 개시는 하기를 포함하여, 제3 당사자를 위한 복수의 분석물질의 각각의 분석물질의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 방법을 제공한다: (a) 당사자로부터 각각의 상기 분석물질의 정체를 수득하고; (b) 각각의 상기 분석물질을 시그널의 제1값으로 인코딩하여 코딩 방식을 생성하고, 여기서 각각의 상기 분석물질은 상기 코딩 방식에서 상기 제1값으로 나타내며, 상기 인코딩은 축퇴성을 제거하는 방식으로 수행되고; (c) 각각의 상기 분석물질이 존재할 때 상기 코딩 방식에서 나타낸 바와 같이 상기 제1값을 생성하는 분석물질-특이적 시약을 상기 당사자에 제공하고, 상기 당사자는: (i) 적어도 하나의 상기 분석물질을 포함하거나 또는 잠재적으로 포함하는 표본과 상기 시약을 접촉시키고; (ii) 상기 표본 내에서 상기 제1값을 누적 측정하여 누적 측정을 제공하고; (d) 상기 당사자로부터 상기 누적 측정을 수득하고; (e) 상기 누적 측정 및 상기 코딩 방식에 근거하여 각각의 상기 분석물질이 존재하는지 또는 부재하는지를 결정하고; (f) 각각의 상기 분석물질의 존재 또는 부재에 대한 정보를 상기 당사자에게 제공함.
일부 사례에서, 본 개시는 하기를 포함하여, 제3 당사자를 위한 복수의 분석물질의 각각의 분석물질의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 방법을 제공한다: (a) 당사자로부터 각각의 상기 분석물질의 정체를 수득하고; (b) 각각의 상기 분석물질을 적어도 하나의 제1값 및 적어도 하나의 제2값으로 인코딩하여 코딩 방식을 생성하고, 여기서 상기 제1값은 시그널의 제1 성분값이고 상기 제2값은 상기 시그널의 제2 성분값이며, 각각의 상기 분석물질은 상기 코딩 방식에서 상기 적어도 하나의 제1값 및 상기 적어도 하나의 제2값으로 나타내고, 상기 인코딩은 축퇴성을 감소시키거나 제거하는 방식으로 수행되며; (c) 각각의 상기 분석물질이 존재할 때 상기 코딩 방식에서 나타낸 바와 같이 상기 적어도 하나의 제1값 및 상기 적어도 하나의 제2값을 생성하는 분석물질-특이적 시약을 상기 당사자에 제공하고, 상기 당사자는: (i) 적어도 하나의 상기 분석물질을 포함하거나 또는 잠재적으로 포함하는 표본과 상기 시약을 접촉시키고; (ii) 상기 표본 내에서 상기 제1값 및 상기 제2값을 누적 측정하여 누적 측정을 제공하고; (d) 상기 당사자로부터 상기 누적 측정을 수득하고; (e) 상기 누적 측정 및 상기 코딩 방식에 근거하여 각각의 상기 분석물질이 존재하는지 또는 부재하는지를 결정하고; (f) 각각의 상기 분석물질의 존재 또는 부재에 대한 정보를 상기 당사자에게 제공함.
일부 사례에서, 본 개시는 분석물질-특이적 시약을 포함하고 각각의 시약이 제1값을 포함하는 시그널을 생성하는 복수의 분석물질의 각각의 분석물질의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 조성물을 제공하며, 여기서 상기 시약은 고정화, 분리, 질량 분광측정, 또는 용융 곡선 분석 없이 임의 조합의 존재 또는 부재 하에 단일 표본 부피에서 적어도 7개 분석물질 각각의 존재 또는 부재를 모호하지 않게 검출할 수 있다.
일부 사례에서, 본 개시는 분석물질-특이적 시약을 포함하고 각각의 시약이 상기 시그널의 제1 성분값인 적어도 하나의 제1값 및 상기 시그널의 제2 성분값인 적어도 하나의 제2값을 포함하는 시그널을 생성하는 복수의 분석물질의 각각의 분석물질의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 조성물을 제공하며, 여기서 상기 시약은 각각의 상기 시약이 하나의 제2값만을 생성할 때 임의 조합의 존재 또는 부재 하에 단일 부피에서 적어도 6개 분석물질 각각의 존재 또는 부재를 검출할 수 있다.
일부 사례에서, 본 개시는 분석물질-특이적 시약, 패키징 및 지침을 포함하고 각각의 시약이 제1값을 포함하는 시그널을 생성하는 복수의 분석물질의 각각의 분석물질의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 키트를 제공하며, 여기서 상기 키트는 고정화, 분리, 질량 분광측정, 또는 용융 곡선 분석 없이 임의 조합의 존재 또는 부재 하에 단일 표본 부피에서 적어도 7개 분석물질 각각의 존재 또는 부재를 모호하지 않게 검출할 수 있다.
일부 예에서, 본 개시는 분석물질-특이적 시약, 패키징 및 지침을 포함하고 각각의 시약이 상기 시그널의 제1 성분값인 적어도 하나의 제1값 및 상기 시그널의 제2 성분값인 적어도 하나의 제2값을 포함하는 시그널을 생성하는 복수의 분석물질의 각각의 분석물질의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 키트를 제공하며, 여기서 상기 키트는 각각의 상기 시약이 하나의 제2값만을 생성할 때 임의 조합의 존재 또는 부재 하에 단일 부피에서 적어도 6개 분석물질 각각의 존재 또는 부재를 검출할 수 있다.
일부 사례에서, 본 개시는 키트 본체(601), 병을 배치하기 위해 키트 본체에 배열된 클램핑 슬롯, 분석물질 검출용 탐침을 포함하는 병(602), 증폭용 프라이머를 포함하는 병(603), 및 증폭용 시약을 포함하는 병(604)을 포함하는 복수의 분석물질의 각각의 분석물질의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 키트를 제공하며, 여기서 상기 키트는 고정화, 분리, 질량 분광측정, 또는 용융 곡선 분석 없이 임의 조합의 존재 또는 부재 하에 단일 표본 부피에서 적어도 7개 분석물질 각각의 존재 또는 부재를 모호하지 않게 검출할 수 있다.
일부 예에서, 본 개시는 키트 본체(601), 병을 배치하기 위해 키트 본체에 배열된 클램핑 슬롯, 분석물질 검출용 탐침을 포함하는 병(602), 증폭용 프라이머를 포함하는 병(603), 및 증폭용 시약을 포함하는 병(604)을 포함하고 각각의 탐침이 상기 시그널의 제1 성분값인 적어도 하나의 제1값 및 상기 시그널의 제2 성분값인 적어도 하나의 제2값을 포함하는 시그널을 생성하는 복수의 분석물질의 각각의 분석물질의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 키트를 제공하며, 여기서 상기 키트는 각각의 상기 탐침이 하나의 제2값만을 생성할 때 임의 조합의 존재 또는 부재 하에 단일 표본 부피에서 적어도 6개 분석물질 각각의 존재 또는 부재를 검출할 수 있다.
참고문헌으로 도입
본 명세서에서 언급되는 모든 공보 및 특허 출원은 각각의 개별 공보 또는 특허 출원이 참고문헌으로 도입되었음을 구체적이고 개별적으로 나타낸 것과 동일한 정도로 본원에 참고문헌으로 도입된다.
도면의 간단한 설명
본 발명의 신규한 특징을 첨부되는 특허청구범위에서 구체적으로 나타낸다. 본 발명의 특징 및 장점에 대한 더욱 우수한 이해는 본 발명의 원리가 이용되는 예시적 구현예를 나타낸 하기 상세한 설명 및 하기 첨부 도면을 참조하여 얻어질 것이다:
도 1은 4개 색상으로 4개 분석물질을 검출하는 전통적인 인코딩 방법 및 4개 색상으로 16개 이상의 서열을 검출할 수 있는 본 발명의 인코딩 방법 간 비교를 나타낸다. 색상은 B, G, Y, 및 R로 나타내며, 이는 각각 청색, 녹색, 황색, 및 적색을 나타낸다.
도 2는 4개 색상을 이용한 6개 분석물질(대조군 포함) 검출의 도식적 표시를 나타낸다. 분석물질은 형광단(B, G, Y, R; 각각 청색, 녹색, 황색, 및 적색) 및 켄처("X", 타원형)에 부착된 혼성화 탐침을 이용하여 검출된다. 대조군 서열 및 5개의 다른 서열(뎅기열 = 뎅기 바이러스; 결핵 = 결핵균(Mycobacterium tuberculosis); P17 = HIV p17; 말라리아 = 말라리아원충(Plasmodium falciparum); 및 헤르페스 = 단순 헤르페스 바이러스 2)은 모두 청색 형광단이 표지된 탐침을 이용하여 검출된다. 비-대조군 분석물질은 각각 1-3개의 추가적인 탐침을 이용하여 검출된다. 예를 들어, 뎅기 바이러스 분석물질은 녹색, 황색, 및 적색 형광단을 갖는 3개의 추가적인 탐침을 이용하여 검출되고; 단순 헤르페스 바이러스 2 분석물질은 적색 형광단을 갖는 1개의 추가적인 탐침을 이용하여 검출되는 등이다.
도 3은 실시예 2에 기재된 바와 같이 수득된 실험 결과의 크로마토그램을 나타낸다.
도 4는 컴퓨터가 본원에서 제공되는 방법의 하나 이상의 단계를 수행하기 위해 사용되는 본 발명의 예시적 구현예를 나타낸다.
도 5는 광 시그널, 예컨대 형광 방출 시그널의 검출 파장 및 강도가 상이한 두 방법의 모식도를 나타낸다.
도 6은 예시적 키트의 모식도를 나타낸다.
도 7은 실시예 3에 기재된 바와 같이 수득된 실험 결과의 크로마토그램을 나타낸다.
도 8은 유효 결과(상부) 및 무효 결과(하부)의 모식도를 나타낸다.
발명의 상세한 설명
형광 검출은 생화학적 분석과의 상용성, 형광 표지의 상대적으로 작은 크기, 관심 분자에 대해 단순한 콘쥬게이션 수단, 경제적 적절성, 낮은 독성, 안정성, 강건성, 저렴한 광학을 이용한 검출 가능성 및 공간적 어레이와 조합되는 능력을 포함하는 몇몇 바람직한 특징으로 인해 다중화된 분석을 위해 바람직한 기법이 되어왔다. 그러나 표준 형광단은 넓은 방출 스펙트럼을 갖는다. 따라서 스펙트럼 중첩을 배제하기 위해서(즉 스펙트럼 분리를 보존하기 위해서) 전형적으로는 상대적으로 적은 수의 색상(예로 4 내지 6개)만이 다중화된 형광 분석에서 동시에 사용된다.
다중화된 형광 분석을 위한 전통적인 인코딩 방법은 단일 색상으로 각각의 분석물질을 인코딩하는 것이었다: 즉, M=N으로, 여기서 M은 검출될 수 있는 분석물질의 수이고, N은 분광학적으로 분리된 형광 탐침의 수이다. 더 높은 다중화 비율이 필요한 경우(즉, M>N), 형광은 일반적으로 다른 기법, 예컨대 분취, 공간적 어레이화 또는 순차적 처리와 조합된다. 이러한 추가적인 처리 단계는 노동 집약적이며, 종종 상대적으로 고가이고 복잡한 광학적 및 기계적 시스템(예로, 분광측정기, 기계화된 현미경 스테이지, 미소역학 장치, 액적 생성기, 스캐너 등)을 필요로 한다. 이러한 시스템은 종종 특정 환경에서, 특히 케어 지점에서 그리고 저자원 환경에서 전개하기에는 비실용적이다. 따라서 고가의 추가적인 처리 단계의 사용을 배제하면서 저렴한 다중화 수단을 제공할 수 있는 다중화된 인코딩 및 디코딩 방법이 매우 필요하다.
본 개시는 표본 중 여러 분석물질의 검출을 위한 방법, 시스템, 조성물, 및 키트를 제공한다. 분석물질은 본원에서 제시되는 인코딩, 분석, 및 디코딩 방법에 근거하여 검출된다. 일부 예에서, 검출될 각각의 분석물질은 시그널값(예로, 강도)으로 인코딩되며, 여기서 값은 분석 결과가 분석되는 분석물질의 존재 또는 부재를 모호하지 않게 나타내도록 할당된다. 다른 예에서, 검출될 각각의 분석물질은 적어도 2개의 시그널 성분(예로, 강도 및 파장) 각각에서의 값으로 인코딩된다. 적어도 2개의 시그널 성분은 직교할 수 있다. 유사하게, 본 개시의 다른 곳에서 보다 자세히 기재된 바와 같이, 여러 직교 시그널, 예컨대 형광 시그널과 전기화학적 시그널의 조합이 이용될 수 있다. 분석물질은 임의의 적합한 분석물질, 예컨대 폴리뉴클레오티드, 단백질, 소분자, 지질, 탄수화물 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 시그널은 임의의 적합한 시그널, 예컨대 전자기적 시그널, 광 시그널, 형광 방출 시그널, 전기화학적 시그널, 화학발광 시그널, 및 이들의 조합일 수 있다. 적어도 2개의 시그널 성분은 임의의 적합한 두 성분, 예컨대 진폭 및 주파수 또는 강도 및 파장일 수 있다.
분석물질의 인코딩 후, 표본이 제공되며, 표본은 적어도 하나의 인코딩된 분석물질을 포함하거나 포함할 수 있다. 표본은 분석물질의 존재 시 코딩 방식에서 각각의 분석물질에 대해 특정된 바와 같은 특정 시그널을 생성하는 분석물질-특이적 시약 또는 시약들과 접촉된다. 시약은 그 대응 분석물질의 존재 시 이러한 시그널을 생성할 수 있는 임의의 적합한 시약, 예를 들어, 켄처 및 형광단에 부착된 올리고뉴클레오티드 탐침(예로, TAQMAN 탐침)일 수 있다. 시약이 켄처 및 형광단에 부착된 올리고뉴클레오티드 탐침인 경우, 시그널을 생성하기 위해 핵산 증폭이 수행될 수 있다.
시약(들)의 첨가 후, 시그널이 정량된다. 일부 사례에서, 상기 정량은 한 개의 시그널 성분(예로, 형광 강도)을 측정하고 각각의 분석물질의 존재를 인코딩하는데 사용되는 값 및 시그널의 누적값에 근거하여 특정 분석물질의 존재 및 부재를 결정함으로써 수행된다.
일부 사례에서, 적어도 2개의 시그널 성분(예로, 강도 및 파장)이 표본에 대해 누적 측정된다. 상기 측정은, 예를 들어 특정 파장에서의 강도 또는 특정 파장들의 범위 내에서의 강도를 측정하여 수행될 수 있다. 이어서 분석물질의 존재 또는 부재는 적어도 2개의 시그널 성분 각각의 값 및 분석물질의 존재를 인코딩하는데 사용되는 값(즉, 코딩 방식에서의 값)에 근거하여 결정될 수 있다.
인코딩은 방법에 의해 수득될 수 있는 가능한 축퇴성(예로 모호한) 결과의 수를 감소시키거나 제거하는 방식으로 수행될 수 있다. 본 명세서에서 다른 곳에 기재된 바와 같이, 특정 코딩 방식의 전체 코딩 능력이 열거될 수 있고, 특정한 잠재적 분석물질 코드가 코딩 방식에서 제거되어 축퇴성을 감소시키거나 제거할 수 있다. 유사하게, 축퇴성의 감소 또는 제거가 필요하지 않도록 코딩 방식이 비-축퇴성으로 설계될 수 있다. 디코딩 매트릭스는 누적 시그널 측정(예로, 강도들 또는 특정 파장에서의 강도들)을 누적 시그널 측정의 구성 시그널에 대응하여 특정 분석물질의 존재 또는 부재로 변환하도록 구축될 수 있다.
I. 정의
본원에서 사용되는 용어는 단지 특정 구현예를 설명하기 위한 목적이지 제한하기 위한 것이 아니다.
본원에서 사용되는 단수 형태는 문맥 상 명백히 달리 나타내지 않는 한, 복수 형태를 또한 포함하는 것이다. 또한 용어들 "포함되는", "포함되며", "갖는", "갖고", "과 함께", "예컨대" 또는 이들의 변형들이 명세서 및/또는 특허청구범위에서 사용되는 범위에서, 이러한 용어들은 제한하는 것이 아니며 용어 "포함하는"과 유사한 방식으로 포괄적인 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "약"은 일반적으로 특정 사용 문맥 내에서 언급되는 수치값의 15% 초과 또는 미만의 범위를 나타낸다. 예를 들어, "약 10"에는 8.5 내지 11.5의 범위가 포함될 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "치수" 및 "성분"은 시그널을 나타내는 경우, 일반적으로 정량될 수 있는 시그널 측면을 나타낸다. 예를 들어, 시그널이 형광 분자에 의해 생성되는 경우, 이것은 그 파장(예로, 제1 치수 또는 성분) 및 그 강도(예로, 제2 치수 또는 성분)의 관점에서 정량될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "디코딩"은 일반적으로 누적 시그널을 하나 이상의 분석물질의 존재 또는 부재에 관한 정보로 전환할 수 있게 하는 디코딩 매트릭스 또는 코딩 방식 및 누적 시그널에 근거하여 어느 분석물질이 존재하는지를 결정하는 방법을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "인코딩"은 일반적으로 시그널값, 예컨대 강도 또는 시그널 또는 시그널들의 적어도 2개 성분, 예컨대 파장 및 강도 각각에서의 값을 포함하는 코드를 이용하여 분석물질을 나타내는 방법을 나타낸다.
용어 "형광단 및 켄처에 부착된 올리고뉴클레오티드 탐침" 및 "TAQMAN 탐침"은 일반적으로 폴리뉴클레오티드 증폭 분석에서 분석물질의 존재를 검출하는데 사용되는 가수분해 탐침을 나타낸다. 이들 탐침은 형광단 및 켄처에 부착된 올리고뉴클레오티드 탐침을 포함한다. 켄처 및 형광단이 인접해 있는 한, 켄처는 광원에 의한 여기 시 형광단에 의해 방출되는 형광을 켄칭한다. 올리고뉴클레오티드 탐침 서열은 분석물질에 존재하는 폴리뉴클레오티드 서열에 상보적으로 설계되어, 분석물질에 존재하는 폴리뉴클레오티드 서열에 혼성화할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 탐침의 혼성화는 프라이머를 포함하는 핵산 증폭 반응(예로, 폴리머라아제 연쇄 반응)에서 수행된다. DNA 폴리머라아제에 의한 프라이머의 연장 시, 폴리머라아제의 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성이 탐침을 분해하여 형광단 및 켄처를 매질 내로 방출한다. 형광단 및 켄처 간 인접성이 해제되고 형광단으로부터의 시그널이 더 이상 켄칭되지 않는다. 따라서 검출되는 형광의 양은 존재하는 분석물질의 양의 함수이다. 분석물질이 존재하지 않는 경우, 탐침은 분석물질에 혼성화하지 않을 것이고, 형광단 및 켄처는 가까이 인접해 유지될 것이다. 시그널이 생성되지 않거나 거의 생성되지 않을 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "직교"는 일반적으로 독립적으로 또는 대략 독립적으로 변할 수 있는 시그널의 적어도 2개 성분(예로, 파장 및 강도), 또는 적어도 2개의 상이한 시그널(예로, 형광 방출 및 전기화학적 시그널)을 나타낸다. 예를 들어, 형광 분자가 사용되는 경우 파장 및 강도는 직교 또는 대략 직교인 것으로 간주된다. 다른 인자들 가운데 형광 방출 파장은 형광 분자의 조성에 의존할 것이고, 형광 강도는 존재하는 분자의 양에 의존할 것이다. 파장 및 강도는 대략 독립적으로 변할 수 있는 시그널의 2개 성분의 예이지만, 본원에 기재된 방법은 독립적으로 또는 대략 독립적으로 변할 수 있는 성분으로 제한되지 않는다. 비-독립적으로 변하는 시그널, 또는 시그널들의 성분도 그 성분 또는 시그널이 인코딩, 측정, 및 디코딩이 가능하도록 충분히 잘 분석되는 한 사용될 수 있다. 예를 들어 하나의 성분 또는 시그널에서의 변동이 또 다른 성분 또는 시그널에서의 변동에 영향을 미치는 경우, 변동 간 상관관계가 이해되는 한 2개의 성분 또는 시그널이 여전히 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드", "올리고뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 복수의 뉴클레오티드를 포함하는 생물학적 분자를 나타내기 위해 본원에서 사용된다. 예시적인 폴리뉴클레오티드에는 데옥시리보핵산, 리보핵산, 및 펩티드 핵산을 포함하는 이들의 합성 유사체가 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 "탐침"은 일반적으로 특정 분석물질의 존재 시 시그널을 생성할 수 있는 시약을 나타낸다. 탐침은 일반적으로 적어도 2개 부분을 갖는다: 분석물질, 또는 이들의 일부를 특이적으로 인지할 수 있는 부분, 및 분석물질, 또는 이들의 일부의 존재 시 시그널을 생성할 수 있는 부분. 탐침은 상기 및 본 개시의 다른 곳에 기재된 바와 같이, 형광단 및 켄처에 부착된 올리고뉴클레오티드 탐침일 수 있다. 탐침은 또한 분석물질의 존재 시 시그널을 생성하는 임의의 시약, 예컨대 분석물질에 대한 항체 결합 시 방출하거나 켄칭되는 형광 표지를 포함하는, 분석물질을 검출하는 항체일 수 있다. 탐침이 분석물질의 존재 시 정량 가능한 시그널을 생성하는 한, 임의의 적합한 탐침이 본 개시에 제시되는 방법과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 탐침의 분석물질-특이적 부분은 분석물질의 존재 시 비하전 기질을 하전 산물로 전환하는 효소에 커플링되어 경시적으로 매질 내 전기 전도성을 증가시킬 수 있다. 이러한 경우, 상이한 분석물질은 탐침(예로, 혼성화 탐침 또는 항체)의 분석물질-특이적 부분을 효소에 대해 상이한 비로 커플링하여 인코딩될 수 있다. 매질 중에서 생성되는 전도성 증가 속도는 매질에 존재하는 모든 분석물질에 대한 누적일 것이다. 본원에서 제공되는 방법에 따른 분석물질의 인코딩은 전도성 측정을 특정 분석물질의 존재 또는 부재에 대한 정보를 제공하는 모호하지 않은(즉, 비-축퇴성) 결과로 전환할 수 있게 한다. 유사하게, 탐침은 기재로부터 화학발광 산물을 생성하는 효소를 포함할 수 있다. 이어서 화학발광의 양을 이용하여 특정 분석물질의 존재를 인코딩할 수 있다.
II. 인코딩 및 디코딩 방법
A. 전통적인 형광 인코딩 및 디코딩 방법
일반적으로 사용되는 분석물질의 존재 결정 방법은 4개 분석물질의 존재 또는 부재를 나타내기 위해 4개의 분광학적으로 분리된 형광 분자를 사용한다. 상기 방법의 예를 도 1의 왼쪽에 나타낸다. 도 1의 왼쪽은 4개 분석물질(Seq 1, Seq 2, Seq 3, 및 Seq 4)이 각각 단일 색상(각각 청색, 녹색, 황색, 및 적색)으로 인코딩되는 인코딩 방법을 나타낸다. 색상은 켄처를 또한 포함하는 올리고뉴클레오티드 탐침에 부착된 형광단을 나타낸다. 도 1의 왼쪽에 나타낸 시스템에는 각각 단일 형광단(청색, 녹색, 황색, 또는 적색) 및 켄처를 포함하는 4개의 상이한 올리고뉴클레오티드 탐침이 있다. 분석물질의 존재 또는 부재는 특정 색상 시그널의 존재 또는 부재에 근거하여 결정된다.
도 1의 왼쪽 차트는 2개의 분석물질: Seq 1 및 Seq 3을 함유하는 가상 표본에 대한 강도 대 색상을 나타낸다. 이들 분석물질의 존재는 청색 시그널(Seq 1에 해당) 및 황색 시그널(Seq 3에 해당)의 측정에 근거하여 결정된다. Seq 2 및 Seq 4의 부재는 청색 및 적색 시그널의 부재로 나타난다.
표 1은 상기 코딩 방식의 이원성 포맷으로의 변환을 나타낸다. 각각의 분석물질은 형광 시그널의 2개 성분: (1) 색상(또한 파장; 또는 파장들의 범위로 알려져 있음) 및 (2) 강도(표 내에서 숫자로 나타냄) 각각의 값으로 인코딩된다. 예를 들어, A(예로, Seq 1)는 청색 색상 및 1의 강도를 가지며; B(예로, Seq 2)는 녹색 색상 및 1의 강도를 가지는 등이다. 각각의 색상 범위 내에서 시그널의 강도는 본원에 기재된 바와 같이, 예를 들어 밴드 통과 필터에 의해 결정되는 특정 파장 범위 내의 시그널 강도를 측정하여 정량될 수 있다. 결과 1000은 분석물질 A만이 존재함을 시사하며; 결과 1100은 분석물질 A 및 B가 존재함을 시사하는 등이다.
표 1. 1개 분석물질 당 1개 탐침으로, 각각의 탐침이 단일 색상을 가지는 4개 탐침을 이용한 4개 분석물질의 전통적인 인코딩.
Figure pct00001
B. 분석물질 별로 둘 이상의 색상을 이용하는 인코딩 방법
상기 기재된 전통적인 방법은 분광학적으로 분리 가능한 형광단의 수에 의해 제한된다는 점에서 어려움을 겪는다. 보다 구체적으로, 검출 가능한 분석물질의 수는 분광학적으로 분리 가능한 형광단의 수와 같다. 따라서 분석물질의 수는 분광학적으로 분리 가능한 형광단의 수를 증가시킴으로써만 증가될 수 있다.
본 개시는 상기 한계를 극복하는 방법을 제공한다. 보다 구체적으로 일부 사례에서, 인코딩 동안 시그널의 적어도 2개 성분을 이용함으로써 본원에 기재된 방법을 이용하여 형광단 별로 둘 이상의 분석물질을 검출할 수 있다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 방법을 이용함으로써, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개의 분석물질이 형광단 별로 검출될 수 있다. 일부 사례에서, 본원에서 제공되는 방법을 이용하여 적어도 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개의 분석물질이 형광단 별로 검출될 수 있다. 일부 사례에서, 본원에서 제공되는 방법을 이용하여 1.5-2, 2-4, 1.5-4, 4-6, 2-6, 6-10개의 분석물질이 형광단 별로 검출될 수 있다.
일부 사례에서, 본 개시에서 제공되는 방법에는 대조군 색상의 이용이 포함될 수 있다. 대조군 색상은 표본 중 검출될 각각의 분석물질 및 양성 대조군 분석물질에 결합하는 하나 이상의 탐침에 부착될 수 있다. 양성 대조군 분석물질 및 검출될 각각의 분석물질에 동일한 서열이 있으면, 단일 대조군 탐침이 사용될 수 있다. 양성 대조군 분석물질 및 검출될 각각의 분석물질에 동일한 서열이 없으면, 상이한 탐침들이 사용될 수 있지만 각각의 탐침은 여전히 대조군 색상에 부착될 수 있다.
예를 들어, 상술된 전통적인 방법을 구축하여, 하나의 색상(예로, 청색)이 표본에 항상 존재하는 대조군 분석물질의 존재를 인코딩하는데 이용될 수 있다. 대조군 분석물질은 표본에 첨가될 수도 있고, 또는 표본에 내재적으로 존재할 수도 있다. 나머지 색상(예로, 녹색, 황색, 적색)은 추가적인 분석물질의 존재를 인코딩하는데 사용될 수 있다. 표 2는 이러한 한 방법의 예를 나타낸다.
표 2. 분석물질별로 2개까지의 색상으로 4개 색상을 이용한 대조군 포함 4개 분석물질의 인코딩.
Figure pct00002
표 2에서, 대조군(p)의 존재는 결과 1000으로 나타난다. 대조군 및 분석물질 A의 존재는 결과 2001로 나타난다. 대조군 및 3개의 다른 모든 분석물질의 존재는 결과 4111로 나타난다. 대조군 색상(청색)은 분석이 제대로 기능하고 있다는 지표를 제공한다. 청색 색상의 강도는 평가 표본에 존재하는 분석물질의 수를 보고한다. 물론 임의의 색상이 대조군 색상으로 사용될 수 있다. 당분야 숙련자는 특정한 실제적 고려로부터 다른 것에 비해 어느 하나의 색상을 대조군 색상으로 사용하는 것이 바람직해질 수 있음을 인지할 것이다. 예를 들어, 하나의 색상이 특정 광학 시스템(또는 형광단 시스템)에서 더 잘 검출되는 경우, 그 색상을 대조군 색상으로 사용하는 것이 실제적으로 바람직할 수 있다.
표 2에 나타낸 코딩 방식은 하나의 대조군 색상 및 하나의 추가적인 색상(분석물질별로 2개까지의 탐침)을 이용하여 각각의 분석물질을 인코딩한다. 그러나 아래 나타낸 바와 같이, 분석물질별로 4개까지의 색상이 사용될 때 인코딩될 수 있는 분석물질의 수가 증가된다. 표 3은 각각의 분석물질이 4개까지의 색상에 의해 인코딩되는 경우의 예시적인 코딩 방식을 나타낸다. 표 3에 나타낸 방식에서, 대조군 색상(청색)은 대조군 서열 및 각각의 다른 7개의 분석물질(A-G)의 존재 시에 생성된다. 다른 7개의 분석물질은 각각 1 내지 3개의 추가적인 색상의 존재에 의해 인코딩된다. 색상은 상이한 탐침(예로, 형광단 및 켄처에 부착된 올리고뉴클레오티드 탐침) 상에 또는 동일한 탐침(여러 형광단 및 여러 켄처를 가질 수 있음) 상에 포함될 수 있다.
표 3. 분석물질별로 4개까지의 색상으로 4개 색상을 이용한 8개 분석물질(대조군 포함)의 인코딩.
Figure pct00003
표 3에서, 대조군 및 전체 7개의 다른 분석물질의 존재는 결과 8444로 나타난다. 3개의 분석물질(A, B, 및 C)은 2개의 색상에 의해 인코딩된다. 3개의 분석물질(D, E, 및 F)은 3개의 색상에 의해 인코딩되며, 하나의 분석물질(G)은 4개 색상에 의해 인코딩된다. 대조군(p)의 존재는 결과 1000으로 나타난다. 대조군 및 분석물질 A의 존재는 결과 2001로 나타난다. 대조군 및 분석물질 G의 존재는 결과 2111로 나타난다. 이들 결과는 각각의 색상에서 시그널의 누적 강도를 표시한다. 예를 들어, 결과 2111은 청색 채널에서 2X 시그널 강도를 갖는 반면, 결과 1000은 청색 채널에서 1X 시그널 강도만을 갖는다.
표 3을 이용하여, 각각의 가능한 누적 분석 결과가 색상(청색, 녹색, 황색, 적색) 및 강도(0-8)의 관점에서 열거될 수 있다. 표 4는 표 3에 제공된 인코딩 방법에 근거한 각각의 가능한 누적 분석 결과를 열거하고, 각 분석의 대응하는 디코딩 결과를 표본에 존재하는 분석물질(들)의 관점에서 제공함으로써 생성되는 "디코딩 매트릭스"를 나타낸다. 본원에 기재된 임의의 코딩 방식에 대해, 코딩 방법에 근거한 각각의 가능한 누적 분석 결과를 열거하고, 각 분석의 대응하는 디코딩 결과를 표본에 존재하는(또는 부재하는) 분석물질(들)의 관점에서 제공함으로써 유사한 디코딩 매트릭스가 생성될 수 있다. 일부 사례에서, 축퇴성을 감소시키거나 제거하기 위해 후술되는 바와 같이 하나 이상의 분석물질이 코딩 방식에서 제거될 수 있다.
표 4. 표 3에 제시된 인코딩 방법에 대한 디코딩 매트릭스.
Figure pct00004
Figure pct00005
표 4에 제공된 디코딩 매트릭스는 2가지 가정을 이용하여 구축된다. 첫 번째로, 디코딩 매트릭스는 양성 대조군(p)이 항상 양의 결과를 생성한다고 가정한다. 두 번째로, 디코딩 매트릭스는 각각의 색상 내에서 강도가 추가적이며 시그널이 어느 탐침에서 나올 수 있는지와 무관하게 탐침의 농도 변화와 동일한 방식으로 스케일이 변한다고 가정한다. 이는 본질적으로 시그널이 추가적이며 디지털이라는 것을 의미한다. 이들 가정에 내재된 조건은 분석을 적절히 준비하여 충족될 수 있다. 형광 시그널이 사용되는 경우, 본원에서 제공되는 실시예에 나타낸 바와 같이 강도는 대략적으로만 추가적이고 디지털이면 된다.
표 4는 4개의 형광 파장들의 범위에서의 강도(즉 각각의 색상 범위 내에서의 시그널 강도)의 누적 측정을 표본에 존재하는 대응 분석물질로 전환할 수 있도록 한다. 예를 들어, 결과 4321은 p, C, F, 및 G가 존재하며 다른 분석물질은 존재하지 않음을 시사한다. 상기 결과는 디코딩 매트릭스에 존재하므로 "유효" 결과로 불린다. 대조적으로, 결과 4000은 측정이 가능하지만 디코딩 매트릭스에 나타나지 않는다. 보다 구체적으로, 결과 4000은 표 3으로부터 대조군 및 분석물질 코드의 임의 조합을 추가하여 달성될 수 없다. 상기 결과는 "무효" 결과로 불린다. "무효" 결과는 분석이 오작동했음을 시사할 수 있다. 따라서 대조군(p) 및 디코딩 매트릭스는 분석이 제대로 기능하고 있다는 확인 수단을 제공한다.
표 4는 4개의 분리 가능한 방출 스펙트럼(예로, 색상)을 생성하는 형광단의 임의의 조합에 대해 포괄적인 것이다. 용어 "순위"는 대조군을 포함하여 검출된 분석물질의 수를 나타내기 위해 사용된다. 상기 제공된 예에서, 분석이 제대로 기능하는 경우, 순위는 청색 시그널값과 같다. 예를 들어, 순위 8은 대조군 및 전체 7개의 다른 분석물질(A-G)이 존재함을 시사한다. 순위 2는 대조군과 하나의 분석물질만이 존재함을 시사한다. 가장 낮은 순위는 순위 1이고, 이는 대조군만 존재함을 시사한다. 각각의 순위에서 가능한 수가 열거될 수 있다. 예를 들어, 표 3-4에 기재된 인코딩 및 디코딩 방법을 계속 참조하면, 순위 2에 대해 7가지 가능성이 존재한다. 순위 3에서 가능한 수는 7에서 2를 취하는 조합으로, 또는 7!/(5! * 2!) = 21개 가능성으로 계산될 수 있다. 보다 일반적으로, N에서 K를 취하는 조합의 가능한 수는 N!/((N-K)! * K!)이다. 유사하게, 순위 4, 5, 6, 7, 및 8에서, 가능한 수는 각각 35, 35, 21, 7, 및 1이다. 표 4를 참조하면, 이 표는 이론적 예측과 일치함을 나타낸다. 따라서 표 4는 표 3에 제공되는 인코딩 방법에 대한 포괄적인 디코딩 매트릭스이다.
C. 축퇴성 감소 또는 제거
본원에서 사용되는 용어 "축퇴성이 있는" 및 "축퇴성"은 일반적으로 분석물질의 존재 또는 부재의 관점에서 2개 이상의 가능성을 시사할 수 있기 때문에 유효 결과가 확정적이 아닌 상황을 나타낸다. 예를 들어 표 4를 참조하면, 결과 5233은 pADFG 또는 pBDEG로 디코딩될 수 있으므로 축퇴성이 있다. 유사하게, 결과 4222는 하기 pCDG, pAFG, pBEG, pDEF 중 임의의 것으로 디코딩될 수 있으므로 축퇴성이 있다. 대조적으로 결과 3110은 pBC만을 시사할 수 있으므로 축퇴성이 없다.
본 개시는 축퇴성을 제거하거나 감소시키는 방법을 제공함으로써 분석물질이 검출되는 신뢰도를 증가시킨다. 하나의 구현예에서, 축퇴성은 (i) 검출될 각각의 잠재적 분석물질을 시그널값으로, 그리고 선택적으로 적어도 2개의 시그널 성분의 각각의 값으로 인코딩하고; (ii) 코딩 방식에서 수득될 수 있는 모든 유효 결과를 열거하고; (iii) 축퇴성이 있는 각각의 유효 결과를 확인하고; (iv) 적어도 하나의 잠재적 분석물질(또는 잠재적 분석물질 코드)을 코딩 방식에서 제거하는 것을 포함하는 방법으로 제거되며, 여기서 적어도 하나의 잠재적 분석물질의 제거는 축퇴성을 감소시키거나 제거한다. 예를 들어, 표 3에 기재된 코딩 방식 및 표 4에 기재된 디코딩 매트릭스를 참조하면(모든 유효 결과를 열거하여), 분석물질 D, E, 및 F의 임의의 2개의 제거는 축퇴성을 제거한다. 분석물질 D, E, 및 F의 임의의 1개의 제거는 축퇴성을 제거하지는 못하지만, 이를 감소시킬 것이다.
표 3에 기재된 코딩 방식을 계속 참조하여, 코딩 방식으로부터 분석물질 D, E, 및 F의 임의의 2개의 제거는 단 4개 색상을 이용하여 축퇴성 없이 6개 분석물질(대조군 포함)이 분석될 수 있는 방식을 야기한다. 대조적으로 통상적인 다중화 방법은 4개 색상을 이용하여 3개 분석물질 및 1개 대조군의 보고만을 허용할 것이다. 따라서 분석될 수 있는 분석물질의 수는 본원에서 제공되는 방법을 이용하여 거의 2배가 된다.
도 2는 5개의 분석물질 및 대조군을 검출하기 위해 4개 색상이 사용되는 본 발명의 예시적인 구현예를 나타낸다. 분석물질은 뎅기 바이러스("뎅기열"), 결핵균("결핵"), 인간 면역결핍 바이러스(HIV) p17(P17), 말라리아원충("말라리아"), 및 단순 헤르페스("헤르페스")의 핵산이다. 상기 예에서 "색상"은 켄처를 또한 포함하는 올리고뉴클레오티드 탐침에 부착된 형광단이다. 올리고뉴클레오티드 탐침은 일반적으로 상이한 분석물질에 대해 상이할 것이지만, 색상은 동일하다. 예를 들어, 탐침 1로 명명된 모든 탐침은 청색 색상을 갖지만 일반적으로 상이한 올리고뉴클레오티드 서열을 가질 것이다. 물론 각각의 분석물질에 상보적인 서열이 존재하는 경우, 탐침 1로 명명된 탐침들이 동일한 올리고뉴클레오티드 서열을 가질 수도 있다. 이들 탐침을 이용한 검출 기전은 본 개시의 다른 곳에 기재된다. 탐침 1(청색)은 대조군을 포함하는 모든 6개 분석물질에 혼성화한다. 탐침 2(녹색)는 뎅기 바이러스, 결핵균, 및 HIV p17로부터의 분석물질에 혼성화한다. 탐침 3(황색)은 뎅기열 및 말라리아원충으로부터의 분석물질에 혼성화한다. 탐침 4는 뎅기 바이러스, 결핵균, 및 단순 헤르페스로부터의 분석물질에 혼성화한다. 이들 탐침에 의해 정의되는 코딩 방식을 표 5에 나타낸다. 표 3을 참조하여, 잠재적 분석물질 D(1011) 및 F(1110)가 코딩 방식에서 제거되었다. 따라서 표 5에 제공된 코딩 방식은 비-축퇴성이며 분석에서 얻어지는 각각의 유효 결과는 표본 중 고유한 조합의 분석물질의 존재 또는 부재에 해당한다.
표 5. 도 2에 예시된 뎅기 바이러스, 결핵균, HIV, 말라리아원충, 및 단순 헤르페스의 검출을 위한 코딩 방식
Figure pct00006
축퇴성 제거 방법을 포함하는 상기 제공된 인코딩 및 디코딩 방법은 모두 동일하게 추가적인 색상을 이용하는 인코딩 방법에 적용할 수 있다. 예를 들어, 표 3은 추가적인 색상 및 추가적인 강도들을 포함시켜 확장될 수 있다(아래에 추가 기재됨). 이어서 디코딩 매트릭스가 상술된 바와 같이 생성되어 코딩 방식에서 수득될 수 있는 모든 유효 결과를 열거한다. 표 4에 제공된 디코딩 매트릭스와 유사한 디코딩 매트릭스가 본 개시에 기재된 임의의 코딩 방식에 대해 구축될 수 있다. 이어서 축퇴성이 있는 유효 결과가 확인되고 적어도 하나의 잠재적 분석물질 코드가 코딩 방식에서 제거되어 축퇴성을 감소시키거나 제거한다. 축퇴성 제거 방법은 컴퓨터로 읽을 수 있는 매체 또는 방법을 수행하도록 구성된 하드웨어(예로 마이크로칩) 상에서 소프트웨어를 이용하여 수행될 수 있다.
축퇴성은 상기 및 본 개시에서 다른 곳에 기재된 방법에 의해 감소되거나 제거될 수 있지만, 본 개시는 설계상 비-축퇴성인 코딩 방식도 제공한다. 예를 들어, 표 3에 기재된 코딩 방식에서의 축퇴성 제거 후, 코딩 방식은 설계상 비-축퇴성이 되는 비-축퇴성 방식으로 무한히 확장될 수 있다(예로, 아래에 보다 자세히 기재되는 표 6에 예시된 코딩 방식을 참고). 유사하게, 본 개시는 설계상 완전히 비-축퇴성이어서 임의의 축퇴성 감소 또는 제거를 필요로 하지 않는 코딩 방식을 제공한다(예로, 아래에 보다 자세히 기재되는 표 8에 예시된 코딩 방식을 참고). 따라서 본 개시에서 제공되는 코딩 방식은 축퇴성이 감소되거나 제거될 수 있고, 또는 설계상 비-축퇴성일 수 있다.
D. 둘 이상의 색상 및 둘 이상의 강도를 이용하는 인코딩 방법
상술된 인코딩 방법(예로, 표 3-5)은 분석물질이 1을 초과하는 강도로 인코딩될 수 있도록 하여 추가 확장될 수 있다. 예를 들어, 표 5에 제공되는 코딩 방식에서 인코딩되는 각각의 분석물질은 1 또는 0의 형광 강도로 인코딩된다. 적어도 하나의 색상에서 시그널 강도에 대해 더 높은 값을 허용하면 본 개시에서 제공되는 임의의 방법으로 인코딩될 수 있는 분석물질의 수가 추가로 증가한다. 일부 예에서, 대조군 색상의 분석물질 계측 능력을 유지하기 위해 이러한 더 높은 강도값이 대조군 색상을 제외하고 임의의 색상에 할당될 수 있다.
표 6은 4개 색상 및 여러 강도를 이용하는 예시적인 코딩 방식의 첫 번째 3개 티어를 나타낸다. 표 6의 티어 1은 표 3의 재현으로, 4개 색상을 이용한 7개의 분석물질 및 대조군의 인코딩을 나타낸다. 상술된 바와 같이, 잠재적 분석물질 D, E, 및 F 중 임의의 2개가 비-축퇴성 코딩 방식을 생성하기 위해 코딩 방식에서 제거될 수 있다. 표 6의 티어 1은 축퇴성을 제거하기 위해 잠재적 분석물질 D(1011) 및 F(1110)가 코딩 방식에서 제거되었음을 시사한다. 따라서 표 6의 티어 1에 제시된 코딩 방식은 상술된 바와 같이 4개 색상을 이용하여 5개 분석물질 및 1개 대조군의 존재를 결정할 수 있다.
표 6의 티어 1의 코딩 방식은 임의 색상의 강도가 증가할 수 있도록 허용하여 두 번째 티어(티어 2)로 확장될 수 있다. 상술된 바와 같이, 대조군 색상의 강도는 대조군의 서열 계측 능력을 보존하기 위해 1로 유지될 수 있다. 나머지 3개 색상 중 임의의 강도를 증가시키면 코드 100Y, 10Y0, 1Y00, 10YY, 1Y0Y, 1YY0, 및 1YYY가 생성될 것이다(여기서 Y > 1). 인코딩의 새로운 티어에 대한 Y의 최소값은 이전 티어(들)로부터의 누적 최대값 + 1과 같다. 후술되는 바와 같이, 강도들 간 차이를 최대화하기 위해 1을 초과하는 값이 또한 사용될 수 있다.
따라서 본 맥락에서, 용어 "티어"는 일반적으로 축퇴성 없이 특정한 수의 제1값(예로, 강도) 및 제2값(예로, 색상)에 의해 제공되는 코딩 능력을 모두 이용하는 한 세트의 코드를 나타내기 위해 사용된다. 예를 들어, 표 6의 티어 1은 축퇴성 없이 각각의 색상에서 1까지의 강도로 4개 색상에 의해 제공되는 코딩 능력을 모두 이용한다. 표 6, 티어 1에 나타낸 바와 같이, 이는 대조군을 포함하여 6개의 인코딩된 분석물질을 야기한다. 두 번째 티어를 도입하기 위해, Y(상술된)의 최소값은 이전 티어(들)로부터의 누적 최대 결과 + 1과 같도록 증분될 수 있다. 표 6에 제공되는 예에서, 청색(대조군) 색상의 강도는 상기 색상에서의 서열 계측 능력을 보존하기 위해 1로 유지된다. 따라서 티어 2는 녹색, 황색, 및 적색 채널에서의 강도들을 티어 1에서의 이들 채널 각각의 누적 최대 결과 + 1과 같도록 증분시켜 수득되는 5개의 비-축퇴성 인코딩 가능성으로 구성된다. 이어서 이들 코드의 모든 가능성이 티어 2에 대해 열거될 수 있고 축퇴성을 야기하는 코드가 제거될 수 있거나, 또는 티어 2가 티어 1로부터 대응 코드를 제거하는데 사용된 정보를 이용하여 설계상 비축퇴성으로 제조될 수 있다. 이어서 유사한 방법에 따라 구축되는 세 번째 티어 또는 추가 티어들을 추가하여 추가적인 코딩 능력이 확보될 수 있다. 코딩 방식은 무한한 수의 티어, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100개 이상의 티어를 가질 수 있다.
보다 구체적으로 표 6, 티어 2를 참조하면, 분석물질 H는 1004로 인코딩된다. 대조군 색상값은 1로 유지된다. 적색 색상값은 이전 티어로부터의 누적 최대 결과(3) + 1 또는 4와 같다. 유사하게 분석물질 I 및 J는 각각 1030 및 1400으로 인코딩된다. 이들 코드의 조합을 이용하여 티어 1에서 분석물질 D-G에 대해 수행된 것과 같이 나머지 4개 분석물질(K-N)을 인코딩한다. 이는 티어 2를 완성한다. 티어 2에서, 잠재적 분석물질 K(1034) 및 M(1430)의 도입으로 축퇴성이 야기된다. 따라서 축퇴성을 제거하기 위해 이들 분석물질은 코딩 방식에서 제거되었다.
표 6을 계속 참조하여, 세 번째 티어(티어 3)가 상술된 것과 동일한 원리를 이용하여 구축된다. 분석물질 O는 1-0-0-16으로 인코딩된다. 대조군 색상값은 여전히 1로 유지된다. 적색 색상값은 이전 티어의 누적 최대 결과(15) + 1, 또는 16과 같다. 유사하게, 분석물질 P 및 Q는 각각 1-0-9-0 및 1-16-0-0으로 인코딩된다. 이들 코드의 조합을 이용하여 티어 1에서 분석물질 D-G 및 티어 2에서 분석물질 K-N에 대해 수행된 것과 같이 나머지 4개 분석물질(R-U)을 인코딩한다. 티어 3에서, 잠재적 분석물질 R(1-0-9-16) 및 T(1-16-9-0)의 도입으로 축퇴성이 야기된다. 따라서 축퇴성을 제거하기 위해 이들 분석물질은 코딩 방식에서 제거되었다.
표 6에 나타낸 3-티어 코딩 방식은 4개 색상을 이용한 15개의 분석물질 및 하나의 대조군의 인코딩을 나타낸다. 상기 코딩 방식은 추가적인 티어를 생성하기 위해 더 많은 강도들을 추가하고/하거나 티어 내에서 추가적인 코딩 능력을 생성하기 위해 더 많은 색상을 추가함으로써 무한대로 확장될 수 있다. 본 개시에 기재된 바와 같은 축퇴성의 감소 또는 제거 방법이 축퇴성 결과를 감소시키거나 제거하기 위해 각각의 강도 및/또는 색상 추가와 함께 이용될 수 있다.
보다 일반적으로, 표 6에 나타낸 코딩 방식은 표 3-5에 나타낸 코딩 방식의 비-축퇴성, 무한 확장이다. 첫 번째 티어에서 누적 측정의 최대 강도는 6이며, 두 번째 티어에서 누적 측정의 최대 강도는 15이고, 세 번째 티어에서 누적 측정의 최대 강도는 63인 등이다. 주어진 최대 누적 강도값(F)에서, 상기 코딩 방식에서 이용 가능한 티어의 최대수(T)는 T = log4(F + 1)이다. 표 6에 나타낸 코딩 방식은 티어별로 5개의 비-축퇴성 코드(P)를 제공한다. 따라서 코드의 최대수 M = 5 * log4(F + 1), 또는 M = P * T이며, 여기서 P는 티어별 비-축퇴성 코드의 수이고 T는 티어의 수이다. 예를 들어, 주어진 F = 63에서, 코드(즉, 분석물질)의 최대수는 티어별 5개의 비-축퇴성 코드에 대해 15이다. 상기 식에는 표 6에서 양성 대조군에 대해 정해둔 1000 코드는 포함되지 않는다. 분석물질의 총 수에 대조군을 포함시키려면 단지 1을 추가하여 식 M = (P * T) + 1을 제공하게 된다.
본 개시에서 제공되는 방법은 상기 코딩 방식을 무한대로 확장하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 상이한 강도(즉, 제1값) 및 색상(즉, 제2값)의 조합을 이용함으로써, 티어별 비-축퇴성 코드의 수(P) 및 티어의 수(T)를 변화시켜서 임의 수의 분석물질(M)을 인코딩할 수 있다. 예를 들어, 티어별 비-축퇴성 코드의 수는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100개 이상이다. 유사하게, 티어의 수는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100개 이상일 수 있다.
표 6. 4개 색상 및 여러 강도를 이용한 15개 분석물질 및 1개 대조군의 인코딩.
Figure pct00007
도 1의 오른쪽은 상술된 방법의 하나의 예시적인 구현예를 나타낸다. 보다 구체적으로, 도 1의 오른쪽은 9개 이상의 분석물질(Seq 1 - Seq 9 등)이 각각의 색상 내 강도들을 변화시키면서 적어도 2개 색상에 의해 각각 인코딩되는 인코딩 방법을 나타낸다. 색상은 켄처를 또한 포함하는 올리고뉴클레오티드 탐침에 부착된 형광단을 나타낸다. 시스템은 각각의 탐침이 단일 형광단으로 표지되거나, 또는 각각의 탐침이 둘 이상의 형광단으로 표지되도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 표 6에서 분석물질 H에 대한 코드는 1004이다. 적색 채널에서의 강도 4는 4개의 적색 형광단을 포함하는 H-특이적 탐침을 이용하여 또는 각각 단일 적색 형광단을 포함하는 4개의 H-특이적 탐침들을 이용하여 달성될 수 있다. 물론, 적색 채널에서 결과 4를 생성하는 탐침 및 형광단의 임의 조합, 예컨대 각각 2개의 적색 형광단을 갖는 2개의 탐침, 및 1개의 적색 형광단을 갖는 1개의 탐침과 3개의 적색 형광단을 갖는 1개의 탐침, 또는 단지 1개의 적색 형광단을 갖지만 반응 혼합물에 4배의 양으로 존재하는 1개의 탐침이 모두 적절할 것이다.
도 1의 오른쪽에 도시된 코딩 방법은 표 7에서와 같이 나타낼 수 있다. 도 1의 오른쪽에 나타낸 분석 결과는 4112이거나, 또는 청색 채널에서 4, 녹색 채널에서 1, 황색 채널에서 1 및 적색 채널에서 2의 강도이다. 본원에 기재된 바와 같이 구축된 디코딩 매트릭스를 이용하면 상기 결과는 Seq 1, Seq 3, Seq 4, 및 Seq 5의 존재를 시사하는 것으로 디코딩된다.
표 7. 도 1의 오른쪽에 나타낸 코딩 방식
Figure pct00008
E. 분석물질별 1개의 색상 및 1개의 강도, 그러나 분석물질 간에 상이한 강도들을 이용하는 인코딩 방법
본원에서 제공되는 일부 방법에서, 각각의 분석물질은 단일 색상 및 강도 조합으로 인코딩된다. 예를 들어, 4개 색상 시스템에서, 첫 번째 4개 분석물질은 1000, 2000, 4000, 및 8000으로 인코딩될 수 있다. 다음의 4개 분석물질은 0100, 0200, 0400, 및 0800으로 인코딩될 수 있다. 분석물질 9-12 및 13-16은 표 8에 나타낸 바와 같이 유사하게 할당될 것이다.
표 6에 기재된 인코딩 방법과 마찬가지로, 상기 코딩 방식은 이론상 무한한 비-축퇴성 구성이며, 시그널을 측정하는데 사용되는 기기의 대역폭에 의해서만 제한된다. 그러나 상기 코딩 방식은 표 6에 기재된 인코딩 방법에 비해 대역폭 단위별로 더 많은 분석물질이 정량될 수 있도록 한다. 그 이유는 각각의 강도 수준이 코딩에서 이용되므로(즉 크로마토그램에 갭이 없음; 크로마토그램에 대한 설명은 하기를 참고), 시그널의 이용 가능한 다중성이 최대 효율로 사용되기 때문이다. 표 8은 4개 색상 및 강도들 1, 2, 4, 및 8에 근거한 4개 티어의 인코딩을 나타내는 본 방법의 하나의 구현예를 나타낸다. 코딩 방식은 비-축퇴성이고, 모든 16개 분석물질이 존재하는 경우 결과는 15-15-15-15이다. 이 인코딩 방법은 상기 제시된 인코딩 방법에 비해 대역폭 이용의 관점에서 더 효율적이다. 그러나 이 방법은 크로마토그램에서 갭의 부재시 모든 결과가 유효 결과로 디코딩되므로, 첫 번째 방식의 교정 능력을 갖지 못한다.
표 8. 분석물질별 1개의 색상 및 1개의 강도, 그러나 분석물질 간에 상이한 강도들을 이용하는 인코딩 방법의 예.
Figure pct00009
상기에서 제시되고 표 8에 예시된 방법은 추가적인 색상 및/또는 강도의 도입에 의해 확장될 수 있다. 예를 들어, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100개 이상의 색상이 사용될 수 있다. 추가적인 강도 수준, 예컨대 16, 32, 64, 128, 255, 512, 1024, 2048, 4096, 8192, 16384, 32768, 65536 등도 사용될 수 있다. 방법은 일반화될 수 있으며, 무한한 수의 분석물질을 인코딩하는데 이용될 수 있다. 각각의 분석물질은 단일 색상으로 코드에 의해 나타내며, 여기서 그 단일 색상에서의 코드값은 모든 이전 값의 합 + 1과 같다. 예를 들어, 제1 코드가 특정 색상에 1을 포함하는 경우, 다음 코드는 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128 등이다. 다른 진행도 가능하지만 대역폭 사용의 관점에서 효율적이지 않을 것이다. 그러나 당업자는 값들 간에 분리를 최대화하기를 원하는 경우, 덜 효율적인 대역폭의 사용이 바람직할 수 있음을 인지할 것이다. 유사하게, 값 1은, 예를 들어 제1 인코딩값 및 기기 노이즈 간 강도 차이를 최대화하기 위해 코딩 방식에서 제외될 수 있다. 예를 들어 일부 사례에서, 코딩 방식은 값 2로 시작할 수 있고, 이는 분석물질 코드에 대해 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128 등의 진행을 제공할 것이며, 누적 결과의 진행은 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 등이 될 것이다. 상기 접근은 가능한 누적 결과에 균일한 갭을 생성하여 분석물질 코드 진행 1, 2, 4, 8, 16, 32 등과 그 대응하는 누적 결과 진행 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 등과는 대조적으로 노이즈에 대해 더 높은 관용치를 허용한다. 상기 예에서, 측정에서의 증가된 강성도는 다중성의 고정된 대역폭 내에서 이용 가능한 코드수 감소의 대가로 얻어진다. 예를 들어 63개의 다중성 상태만이 신뢰성있게 측정될 수 있는 경우, 1로 시작하는 코딩 방식은 색상별로 7개의 코드를 제공하는 반면, 2로 시작하는 코딩 방식은 색상별로 6개의 코드를 제공한다. 4개 색상이 이용 가능한 경우, 전자는 28개 코드를 제공할 것인 반면, 후자는 24개 코드를 제공할 것이다. 요약하면, 시그널 강도 및 진행(즉 강도값들 간 차이)은 모두 기기 노이즈와의 구분 능력을 최대화하고 강도값들 간 차이를 최대화하여 개별 실험 결과 간 구분 능력을 증강시키기 위해 스케일이 조정될 수 있다.
표 8에 나타낸 코딩 방식은 설계상 비-축퇴성이다. 표 8에 나타낸 코딩 방식은 16개의 분석물질 각각을 인코딩하기 위해 강도 및 색상을 모두 이용하지만, 각각의 분석물질은 또한 단순히 강도를 이용하여 인코딩될 수 있다. 예를 들어, 표 8에 제공된 16개의 분석물질(A-P)에 있어서, 전체 16개 분석물질을 인코딩하는 단일 색상 코딩 방식은 값 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512, 1024, 2048, 4096, 8192, 및 16384를 분석물질 A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, L, M, N, O, 및 P에 각각 할당할 수 있다. 이러한 코딩 방식은 설계상 비-축퇴성이며, 누적 강도 결과는 모호하지 않게 디코딩되어 분석물질 A-P의 존재 또는 부재를 시사할 수 있다. 상기 코딩 방식은 M개의 분석물질의 존재 또는 부재를 검출할 수 있고, 여기서 M = log2(F + 1)이며 F는 시그널의 최대 누적값(예로, 시그널 강도)이다. 제2 성분을 상기 시그널에 추가함으로써(예로, 표 8에 나타낸 바와 같은 색상), 상기 코딩 방식의 능력은 M = C * log2(F + 1)로 증가될 수 있고, 여기서 C는 상기 코딩 방식에서 사용되는 색상의 수이다.
본 명세서를 통해 기재된 바와 같이, 임의의 적합한 값이 C 또는 F에 대해 사용될 수 있다. 예를 들어, C는 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100개 이상일 수 있다. F는 적어도 약 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 255, 512, 1024, 2048, 4096, 8192, 16384, 32768, 65536, 131072, 262144, 524288, 1048576개 등일 수 있다. 본 개시의 다른 곳에 기재된 바와 같이, F의 초기 시작값 및 그 진행 단계도 모두 변할 수 있다.
III. 분석물질
분석물질은 본 발명의 방법 및 조성물을 이용하여 분석될 수 있는 임의의 적합한 분석물질일 수 있고, 여기서 분석물질은 측정될 수 있는 적어도 2개 성분을 갖는 시그널을 생성하기 위해 시약과 상호작용할 수 있다. 분석물질은 천연 생성 또는 합성 물질일 수 있다. 분석물질은 당분야에 공지된 임의의 방법을 이용하여 수득되는 표본 중에 존재할 수 있다. 일부 사례에서, 표본은 이것을 분석물질에 대해 분석하기 전에 처리될 수 있다. 본 개시에 제시된 방법 및 조성물은 입자(예컨대 비드) 또는 고체 지지체가 필요 없이 용액상 분석에서 사용될 수 있다.
일부 사례에서, 분석물질은 폴리뉴클레오티드, 예컨대 DNA, RNA, 펩티드 핵산, 및 이들의 임의의 하이브리드일 수 있고, 여기서 폴리뉴클레오티드는 임의 조합의 데옥시리보- 및/또는 리보-뉴클레오티드를 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 단일쇄 또는 이중쇄이거나 또는 이중쇄 또는 단일쇄 서열의 부분을 모두 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 우라실, 아데닌, 티민, 시토신, 구아닌, 이노신, 잔틴, 하이포잔틴, 이소시토신, 이소구아닌 및 이들의 임의의 뉴클레오티드 유도체를 포함하는 임의 조합의 뉴클레오티드 또는 염기를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "뉴클레오티드"에는 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드뿐만 아니라 합성 및 천연 생성종 모두를 포함하는 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드 유사체, 및 개질된 뉴클레오티드가 포함될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 cDNA, 미토콘드리아 DNA(mtDNA), 메신저 RNA(mRNA), 리보솜 RNA(rRNA), 전달 RNA(tRNA), 핵 RNA(nRNA), 소형 간섭 RNA(siRNA), 소형 핵 RNA(snRNA), 소형 인 RNA(snoRNA), 소형 카잘체-특이적 RNA(scaRNA), 마이크로RNA(miRNA), 이중쇄(dsRNA), 리보자임, 리보스위치 또는 바이러스 RNA를 비제한적으로 포함하여 본원에 기재된 바와 같이 그에 대해 하나 이상의 시약(또는 탐침)이 생성될 수 있는 임의의 적합한 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 적합한 벡터, 예컨대 플라스미드, 코스미드, 단편, 염색체, 또는 게놈 내에 포함될 수 있다.
게놈 DNA는 천연 생성 또는 유전적으로 개질된 개체로부터 또는 인공적으로 또는 합성적으로 생성된 게놈으로부터 수득될 수 있다. 게놈 DNA를 포함하는 분석물질은 임의의 원천으로부터 당분야에 공지된 임의의 방법을 이용하여 수득될 수 있다. 예를 들어, 게놈 DNA는 증폭과 함께 또는 증폭 없이 단리될 수 있다. 증폭에는 PCR 증폭, 다중 변위 증폭(MDA), 회전형 증폭 및 다른 증폭 방법이 포함될 수 있다. 게놈 DNA는 또한 클로닝 또는 재조합 방법, 예컨대 플라스미드 및 인공 염색체 또는 다른 통상적 방법이 관여되는 것들에 의해 수득될 수 있다(Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 참고, 위에서 언급됨). 폴리뉴클레오티드는 당분야에 공지된 다른 방법, 예를 들어 [Genome Analysis: A Laboratory Manual Series (Vols. I-IV) 또는 Molecular Cloning: A Laboratory Manual]에 개시된 방법을 이용하여 단리될 수 있다. 단리된 폴리뉴클레오티드가 mRNA인 경우, 통상적 기법, 예컨대 [Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual., 위에서 언급됨]에 기재된 것을 이용하여 cDNA로 역전사될 수 있다.
분석물질은 본원에서 제공되는 방법 및 조성물로 검출될 수 있는 단백질, 폴리펩티드, 지질, 탄수화물, 당, 소분자, 또는 임의의 다른 적합한 분자일 수 있다. 분석물질은 효소 또는 다른 단백질일 수 있다. 분석물질은 약물 또는 대사물질일 수 있다(예로, 항암 약물, 화학치료 약물, 항-바이러스 약물, 항생제 약물, 또는 생물학적 제제). 분석물질은 임의의 분자, 예컨대 보조 인자, 수용체, 수용체 리간드, 호르몬, 시토카인, 혈액 인자, 항원, 스테로이드, 또는 항체일 수 있다.
분석물질은 임의의 병원체, 예컨대 바이러스, 박테리아, 기생충, 진균, 또는 프리온(예로, PrPSc)으로부터의 임의의 분자일 수 있다. 바이러스의 예에는 아데노비리대(Adenoviridae), 플라비비리대(Flaviviridae), 헤파드나비리대(Hepadnaviridae), 헤르페스비리대(Herpesviridae), 오르소믹소비리대(Orthomyxoviridae), 파포바비리대(Papovaviridae), 파라믹소비리대(Paramyxoviridae), 피코나비리대(Picornaviridae), 폴리오마바이러스(Polyomavirus), 레트로비리대(Retroviridae), 랩도비리대(Rhabdoviridae), 및 토가비리대(Togaviridae) 군의 것들이 포함된다. 바이러스의 구체적 예에는 아데노바이러스, 아스트로바이러스, 보카바이러스, BK 바이러스, 콕사키바이러스, 사이토메갈로바이러스, 뎅기 바이러스, 에볼라 바이러스, 엔테로바이러스, 엡스타인 바(Epstein Barr) 바이러스, 고양이 백혈병 바이러스, 간염 바이러스, A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, D형 간염 바이러스, E형 간염 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스(HSV), HSV 1형, HSV 2형, 인간 면역결핍 바이러스(HIV), HIV 1형, HIV 2형, 인간 유두종 바이러스(HPV), HPV 1형, HPV 2형, HPV 3형, HPV 4형, HPV 6형, HPV 10형, HPV 11형, HPV 16형, HPV 18형, HPV 26형, HPV 27형, HPV 28형, HPV 29형, HPV 30형, HPV 31형, HPV 33형, HPV 34형, HPV 35형, HPV 39형, HPV 40형, HPV 41형, HPV 42형, HPV 43형, HPV 44형, HPV 45형, HPV 49형, HPV 51형, HPV 52형, HPV 54형, HPV 55형, HPV 56형, HPV 57형, HPV 58형, HPV 59형, HPV 68형, HPV 69, 인플루엔자 바이러스, JC 바이러스, 마르부르크(Marburg) 바이러스, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스, 노르워크(Norwalk) 바이러스, 파로바이러스, 폴리오 바이러스, 광견병 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 레트로바이러스, 리노바이러스, 로타바이러스, 루벨라(Rubella) 바이러스, 천연두 바이러스, 우두 바이러스, 웨스트 나일(West Nile) 바이러스, 및 황열병 바이러스가 포함된다.
박테리아의 예에는 보르데텔라(Bordetella), 보렐리아(Borrelia), 브루셀라(Brucella), 캄필로박터(Campylobacter), 클라미디아(Chlamydia), 클로스트리듐(Clostridium), 코리네박테리움(Corynebacterium), 엔테로코커스(Enterococcus), 에스체리키아(Escherichia), 프란시셀라(Francisella), 해모필러스(Haemophilus), 헬리코박터(Helicobacter), 레지오넬라(Legionella), 렙토스피라(Leptospira), 리스테리아(Listeria), 미코박테리움(Mycobacterium), 미코플라즈마(Mycoplasma), 나이세리아(Neisseria), 슈도모나스(Pseudomonas), 리케차(Rickettsia), 살모넬라(Salmonella), 시겔라(Shigella), 스타필로코커스(Staphylococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 트레포네마(Treponema), 비브리오(Vibrio), 및 에르시니아(Yersinia) 속의 것들이 포함된다. 박테리아의 구체예에는 보르데텔라 파 아퍼투시스(Bordetella par apertussis), 보르데텔라 퍼투시스(Bordetella pertussis), 보렐리아 벌그도르페리(Borrelia burgdorferi), 브루셀라 아보르투스(Brucella abortus), 브루셀라 캐니스(Brucella canis), 브루셀라 멜리텐시스(Brucella melitensis), 브루셀라 수이스(Brucella suis), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 클라미디아 뉴모니애(Chlamydia pneumoniae), 클라미디아 시타치(Chlamydia psittaci), 클라미디아 트라코매틱스(Chlamydia trachomatix), 클로스트리듐 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리듐 디피실(Clostridium difficile), 클로스트리듐 페르프링겐스(Clostridium perfringens), 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani), 코리네박테리움 디프테리애(Corynebacterium diphtheriae), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium), 에스체리키아 콜리(Escherichia coli), 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis), 해모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori), 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 렙토스피라 인테로간스(Leptospira interrogans), 리스테리아 모노사이토겐스(Listeria monocytogenes), 미코박테리움 레프래(Mycobacterium leprae), 결핵균(Mycobacterium tuberculosis), 미코박테리움 울세란스(Mycobacterium ulcerans), 미코플라즈마 뉴모니애(Mycoplasma pneumoniae), 나이세리아 고노리애(Neisseria gonorrhoeae), 나이세리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis), 수도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 리케차 리케치(Rickettsia rickettsii), 살모넬라 콜레래수이스(Salmonella choleraesuis), 살모넬라 두블린(Salmonella dublin), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 타이피(Salmonella typhi), 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium), 시겔라 손네이(Shigella sonnei), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis), 스타필로코커스 사프로피티쿠스(Staphylococcus saprophyticus), 스트렙토코커스 아갈락티애(Streptococcus agalactiae), 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum), 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis), 및 예르시니아 엔테콜리티카(Yersinia enterocolitica)가 포함된다.
기생충의 예에는 아칸트아메바(Acanthamoeba), 바베시아(Babesia), 발라무치아(Balamuthia), 발란티디움(Balantidium), 블라소시스티스(Blasocystis), 크립토스포리디움(Cryptosporidium), 디엔트아메바(Dientamoeba), 엔트아메바(Entamoeba), 기아르디아(Giardia), 이소스포라(Isospora), 레이시마니아(Leishmania), 내글레리아(Naegleria), 페디쿨루스(Pediculus), 말라리아원충(Plasmodium), 리노스포리디움(Rhinosporidium), 사르코시스티스(Sarcocystis), 스키스토소마(Schistosoma), 톡소플라즈마(Toxoplasma), 트리코모나스(Trichomonas) 및 트립파노소마(Trypanosoma) 속의 것들이 포함된다. 기생충의 구체예에는 바베시아 다이버전스(Babesia divergens), 바베시아 비게미나(Babesia bigemina), 바베시아 에퀴(Babesia equi), 바베시아 마이크로프티(Babesia microfti), 바베시아 던카니(Babesia duncani), 발라무치아 만드릴라리스(Balamuthia mandrillaris), 발란티디움 콜리(Balantidium coli), 디엔트아메바 프라길리스(Dientamoeba fragilis), 엔트아메바 히스톨리티카(Entamoeba histolytica), 기아르디아 람블리아(Giardia lamblia), 이소스포라 벨리(Isospora belli), 내글레리아 파울레리(Naegleria fowleri), 페디쿨루스 휴마누스(Pediculus Humanus), 말라리아원충(Plasmodium falciparum), 플라스모디움 놀레시(Plasmodium knowlesi), 플라스모디움 말라리애(Plasmodium malariae), 플라스모디움 오발레(Plasmodium ovale), 플라스모디움 비백스(Plasmodium vivax), 리노스포리디움 시베리(Rhinosporidium seeberi), 사르코시스티스 보비호미니스(Sarcocystis bovihominis), 사르코시스티스 수이호미니스(Sarcocystis suihominis), 스키스토소마 만소니(Schistosoma mansoni), 톡소플라즈마 곤디(Toxoplasma gondii), 트리코모나스 바기날리스(Trichomonas vaginalis), 트립파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei), 및 트립파노소마 크루지(Trypansoma cruzi)가 포함된다.
진균의 예에는 아포피소마이세스(Apophysomyces), 아스페르길러스(Aspergillus), 블라스토마이세스(Blastomyces), 칸디다(Candida), 클라도스포리움(Cladosporium), 코디디오이데스(Coddidioides), 크립토코커스(Cryptococcos), 엑세로힐룸(Exserohilum), 푸사리움(Fusarium), 히스토플라즈마(Histoplasma), 피치아(Pichia), 뉴모시스티스(Pneumocystis), 사카로마이세스(Saccharomyces), 스포로트릭스(Sporothrix), 스타키보트리스(Stachybotrys), 및 트리코피톤(Trichophyton) 속의 것들이 포함된다. 진균의 구체예에는 아스페르길러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 아스페르길러스 플라부스(Aspergillus flavus), 아스페르길러스 클라바투스(Aspergillus clavatus), 블라스토마이세스 더마티티디스(Blastomyces dermatitidis), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 코키디오이데스 이미티스(Coccidioides immitis), 크립토코커스 네오포르만스(Crytptococcus neoformans), 엑세로힐룸 로스트라툼(Exserohilum rostratum), 푸사리움 베르티실리오이데스(Fusarium verticillioides), 히스토플라즈마 캡술라툼(Histoplasma capsulatum), 뉴모시스티스 지로베시(Pneumocystis jirovecii), 스포로트릭스 스켄키(Sporothrix schenckii), 스타키보트리스 차르타룸(Stachybotrys chartarum), 및 트리코피톤 멘타그로피테스(Trichophyton mentagrophytes)가 포함된다.
일부 사례에서, 본 개시에 제공되는 방법은 상기 또는 명세서에서 다른 곳에 기재된 분석물질 중 임의 하나를 검출하는데 이용될 수 있다. 일부 사례에서, 본 개시에 제공된 방법은 상기 또는 명세서에서 다른 곳에 기재된 분석물질들의 패널을 검출하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 패널은 상기 또는 명세서에서 다른 곳에 기재된 분석물질 중 임의의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100개 이상으로 구성된 군으로부터 선택되는 분석물질을 포함할 수 있다.
분석물질은 개체, 임의의 개체, 조직, 세포 또는 환경으로부터의 전체 세포, 세포 제조물 및 무세포 조성물을 포함하는 임의의 적합한 위치에서 수득될 수 있다. 분석물질은 환경 표본, 생검, 흡입물, 포르말린 고정된 임베딩 조직, 공기, 농업 표본, 토양 표본, 석유 표본, 물 표본, 또는 먼지 표본에서 수득될 수 있다. 일부 경우에서, 분석물질은 혈액, 소변, 변, 혈청, 림프액, 타액, 점액 분비물, 발한, 중추 신경계 유체, 질액 또는 정액을 포함할 수 있는 체액에서 수득될 수 있다. 분석물질은 또한 제조 산물, 예컨대 화장품, 식품, 개인 관리 제품 등에서 수득될 수 있다. 분석물질은 재조합 클로닝, 폴리뉴클레오티드 증폭, 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR) 증폭, 정제 방법(예컨대 게놈 DNA 또는 RNA의 정제), 및 합성 반응을 포함하는 실험적 조작의 산물일 수 있다.
2개 이상 유형의 분석물질이 각각의 다중화된 분석에서 검출될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드, 단백질, 폴리펩티드, 지질, 탄수화물, 당, 소분자, 또는 임의의 다른 적합한 분자가 적합한 시약을 사용하여 동일한 다중화 분석에서 동시에 검출될 수 있다. 임의 조합의 분석물질이 동시에 검출될 수 있다.
분석물질의 검출은 연구, 임상, 진단, 예측, 법의학 및 모니터링 용도를 포함하는 임의의 적합한 용도에 유용할 수 있다. 예시적인 용도에는 유전 질환의 검출, 유전자 지문의 확인, 감염성 질환의 진단, 유전자 클로닝, 친권 평가, 범죄자 확인, 계통유전학, 생물학 테러 방지, 환경 감시 및 DNA 컴퓨터 계산이 포함된다. 예를 들어, 분석물질은 질환 또는 상태를 시사할 수 있다. 분석물질은 치료 결정의 수행 또는 질환 상태 평가에 이용될 수 있다. 분석물질의 존재는 특정 병원체의 감염 또는 임의의 다른 질환, 예컨대 암, 자가면역 질환, 심혈관 질환, 간 질환, 소화기 질환 등을 시사할 수 있다. 따라서 본원에서 제공되는 방법은 진단을 수행하고 이 진단에 근거하여 임상적 결정을 수행하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 대상체에서 채취한 표본 중 박테리아 폴리뉴클레오티드의 존재를 시사하는 결과는 항생제를 이용한 대상체의 치료로 이어질 수 있다.
일부 사례에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000개의 분석물질을 검출하는데 사용될 수 있다. 일부 사례에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 7-50, 8-40, 9-30, 10-20, 10-15, 8-12, 또는 7-12개의 분석물질을 검출하는데 사용될 수 있다.
일부 사례에서, 본 개시는 고정화, 분리, 질량 분광측정, 또는 용융 곡선 분석 없이 단일 표본 부피에서 임의 조합의 존재 또는 부재 하에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000개 분석물질 각각의 존재 또는 부재를 모호하지 않게 검출할 수 있는 분석을 제공한다. 일부 사례에서, 본 개시는 고정화, 분리, 질량 분광측정, 또는 용융 곡선 분석 없이 단일 표본 부피에서 임의 조합의 존재 또는 부재 하에 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000개 분석물질 각각의 존재 또는 부재를 모호하지 않게 검출할 수 있는 분석을 제공한다. 일부 사례에서, 본 개시는 고정화, 분리, 질량 분광측정, 또는 용융 곡선 분석 없이 단일 표본 부피에서 임의 조합의 존재 또는 부재 하에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000개 미만의 분석물질의 존재 또는 부재를 모호하지 않게 검출할 수 있는 분석을 제공한다.
IV. 시그널
본 개시에 제시되는 방법은 임의의 정량 가능한 시그널과 함께 사용될 수 있다. 일부 사례에서, 본 개시는 단일 시그널 성분(예로 강도)을 이용하여 축퇴성 없이 무한한 수의 표적을 인코딩하기 위한 코딩 방식 및 방법을 제공한다. 예를 들어, 상기 및 실시예 3에 기재된 바와 같이, 코딩 방식은 색상의 고려 없이 시그널 강도의 다중성에 의존할 수 있다. 상기 원리를 예시하기 위해 형광 탐침이 사용되었지만, 코딩 방식은 본 개시에서 다른 곳에 기재된 전기화학적 시그널 및 화학발광 시그널을 포함하는 정량 가능한 시그널을 제공하는 임의의 다른 방법에 동일하게 적용 가능하다.
본 개시에 제시된 방법은 또한 적어도 2개의 시그널 성분의 측정으로도 언급되는, 적어도 2개 치수의 시그널 측정을 이용할 수 있다. 예를 들어 분석물질 간 구분을 위해 시그널 강도에 의존하는 상기 단락에 기재된 코딩 방식과는 대조적으로, 적어도 2개의 시그널 성분(예로, 색상 및 강도)의 이용은 시그널 강도 대역폭의 단위별로 더 많은 고유한 코드 생성을 허용한다. 적어도 2개의 시그널 성분이 이용되는 경우, 적어도 2개 성분의 누적 측정이 단일 표본 부피에 대해 수득될 수 있다. 예를 들어 표 5에 기재된 코딩 방식에서, 각각의 분석물질의 존재는 4개 색상 각각에서(시그널의 제2 성분) 특정 강도(시그널의 하나의 성분)를 야기한다. 이들 구성성분 시그널의 조합은 각각의 파장 또는 파장들의 범위에서 강도를 측정함으로써 측정될 수 있는 누적 시그널로 이어진다. 이어서 해당 코딩 방식 또는 디코딩 매트릭스가 누적 측정을 분석물질의 존재 또는 부재 결정으로 전환하는데 이용될 수 있다.
일부 사례에서, 정량 가능한 시그널은 주파수(파장) 및 진폭(강도)을 모두 갖는 파형을 포함한다. 시그널은 전자기적 시그널일 수 있다. 전자기적 시그널은 소리, 무선 시그널, 마이크로파 시그널, 적외선 시그널, 가시광선 시그널, 자외선 시그널, x-선 시그널, 또는 감마선 시그널일 수 있다. 일부 사례에서, 전자기적 시그널은 형광 시그널, 예를 들어 파장 및 강도의 관점에서 특징지울 수 있는 형광 방출 스펙트럼일 수 있다.
본 개시의 특정 부분에서, 시그널은 형광 시그널의 관점에서 기재되고 예시된다. 이는 제한하기 위한 것이 아니며, 당업자는 형광 시그널의 측정에 적용 가능한 원리가 다른 시그널에도 적용 가능함을 쉽게 인지할 것이다. 예를 들어 형광 시그널과 마찬가지로, 상술된 임의의 전자기적 시그널도 파장 및 강도의 관점에서 특징지울 수 있다. 형광 시그널의 파장은 색상의 관점에서도 기재될 수 있다. 색상은 특정 파장 또는 파장들의 범위에서의 강도 측정에 근거하여, 예를 들어 상이한 파장에서 형광 강도의 분포 결정에 의해 및/또는 특정 파장 범위 내에서 형광 강도를 결정하기 위해 밴드 통과 필터를 이용하여 결정될 수 있다. 이러한 밴드 통과 필터는 정량적 PCR 기계를 포함하여 다양한 실험실 기기에서 일반적으로 채용된다. 강도는 광검출기로 측정될 수 있다. 파장 범위는 "채널"로 불릴 수 있다.
일부 사례에서, 본 개시에 제공된 방법은 누적 시그널이 동일한 색상, 주파수, 흡광 밴드 등의 구성성분 시그널과 스케일이 조정되는 임의의 시그널과 함께 사용될 수 있다. 그러나 누적 시그널이 디지털이거나 구성성분 시그널의 수 및 강도와 선형으로 스케일이 조정될 필요는 없다. 예를 들어, 물리적 측정 원리가 흡광이면, 비어-램버트 법칙의 지수적 성질로 인해 구성성분 농도는 추가적이지만 누적 감쇠가 구성성분 감쇠의 산물이 된다. 이어서 누적 감쇠의 로그값이 각각의 흡광 밴드에서의 구성성분 농도(형광 검출이 이용되는 경우, 색상의 균등분)와 선형으로 스케일 조정될 것이다. 따라서 본 발명의 방법이 적용 가능하다. 본 발명의 방법은 또한 화학발광 시그널 및 전기화학적 시그널과 함께 이용될 수 있다.
측정되는 시그널의 수, 및 치수 또는 성분의 수는 또한 본 발명의 예시적인 구현예에 나타낸 수를 넘어 확장되어 다중화 능력의 확장으로 이어질 수 있다. 본 개시에 제공되는 예시적인 구현예는 측정되는 1개 또는 2개 성분: 파장 및/또는 강도를 갖는 형광 시그널을 이용하여 구축된 코딩 방식을 이용한다. 인코딩될 수 있는 분석물질의 수는 파장 및/또는 강도의 수를 증가시켜 증가될 수 있다. 인코딩될 수 있는 분석물질의 수는 또한 시그널의 수를 증가시켜, 예를 들어 형광 시그널과 전기화학적 시그널 또는 FRET 시그널(형광 공명 에너지 전달)을 조합하여 증가될 수 있다.
일부 사례에서, 2개 이상의 시그널 성분이 측정될 수 있다. 예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 18, 또는 20개 이상의 시그널 성분이 측정될 수 있다. 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 18, 또는 20개의 시그널 성분이 측정될 수 있다. 적어도 2개, 그러나 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 18, 또는 20개 미만의 시그널 성분이 측정될 수 있다. 일부 사례에서, 2-3, 2-4, 2-5, 2-6, 3-5, 3-6, 3-8, 또는 5-10개의 시그널 성분이 측정될 수 있다. 이들 추가적인 성분에는 역학 성분, 예컨대 시그널 감소 속도 및 광표백 속도가 포함될 수 있다.
형광 시그널이 채용되는 경우, 인코딩될 수 있는 분석물질의 수는 추가적인 형광단을 이용하여 추가 확장될 수 있다. 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 이상의 형광단이 사용될 수 있다. 일부 사례에서, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개의 형광단이 사용될 수 있다. 일부 사례에서, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 미만의 형광단이 사용될 수 있다. 일부 사례에서, 4-6, 4-7, 4-8, 4-9, 4-10, 5-6, 5-7, 5-8, 5-9, 5-10, 10-15, 또는 10-20개의 형광단이 사용될 수 있다.
일반적으로, 인코딩될 수 있는 분석물질의 수는 시그널의 제1 성분의 값이거나 값들의 범위인 추가적인 제1값(예로, 강도)을 이용하여 추가 확장될 수 있다. 예를 들어, 시그널의 제1 성분의 값이거나 값들의 범위인 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 이상의 제1값이 사용될 수 있다. 일부 사례에서, 시그널의 제1 성분의 값이거나 값들의 범위인 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개 이상의 제1값이 사용될 수 있다. 일부 사례에서, 시그널의 제1 성분의 값이거나 값들의 범위인 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 미만의 제1값이 사용될 수 있다. 일부 사례에서, 시그널의 제1 성분의 값이거나 값들의 범위인 4-20, 4-6, 4-7, 4-8, 4-9, 4-10, 5-6, 5-7, 5-8, 5-9, 5-10, 10-15, 또는 10-20개의 제1값이 사용될 수 있다.
강도가 정량되는 시그널 성분인 경우, 예컨대 형광 시그널이 사용되는 경우, 분석물질의 존재는 다양한 강도 또는 강도들의 범위를 이용하여 인코딩될 수 있다. 예를 들어, 코딩 방식은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 이상의 강도 또는 강도들의 범위를 이용할 수 있다. 코딩 방식은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 이상의 강도 또는 강도들의 범위를 이용할 수 있다. 코딩 방식은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 미만의 강도 또는 강도들의 범위를 이용할 수 있다. 일부 사례에서, 코딩 방식은 2-20, 2-3, 2-4, 2-5, 2-6, 2-7, 2-8, 2-9, 2-10, 3-4, 3-5, 3-6, 3-7, 3-8, 3-9, 3-10, 4-5, 4-6, 4-7, 4-8, 4-9, 4-10, 5-6, 5-7, 5-8, 5-9, 또는 5-10개 강도 또는 강도들의 범위를 이용할 수 있다.
인코딩될 수 있는 분석물질의 수는 시그널의 제2 성분의 값이거나 값들의 범위인 추가적인 제2값(예로, 파장)을 이용하여 추가 확장될 수 있다. 예를 들어, 시그널의 제2 성분의 값이거나 값들의 범위인 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 이상의 제2값이 사용될 수 있다. 일부 사례에서, 시그널의 제2 성분의 값이거나 값들의 범위인 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 이상의 제2값이 사용될 수 있다. 일부 사례에서, 시그널의 제2 성분의 값이거나 값들의 범위인 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 미만의 제2값이 사용될 수 있다. 일부 사례에서, 시그널의 제2 성분의 값이거나 값들의 범위인 4-20, 4-6, 4-7, 4-8, 4-9, 4-10, 5-6, 5-7, 5-8, 5-9, 5-10, 10-15, 또는 10-20개의 제2값이 사용될 수 있다.
파장이 정량될 수 있는 시그널 성분인 경우, 예컨대 형광 시그널이 이용되는 경우, 분석물질의 존재는 다양한 파장 또는 파장들의 범위를 이용하여 인코딩될 수 있다. 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 이상의 파장 또는 파장들의 범위가 사용될 수 있다. 일부 사례에서, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 이상의 파장 또는 파장들의 범위가 사용될 수 있다. 일부 사례에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 미만의 파장 또는 파장들의 범위가 사용될 수 있다. 일부 사례에서, 4-20, 4-6, 4-7, 4-8, 4-9, 4-10, 5-6, 5-7, 5-8, 5-9, 5-10, 10-15, 또는 10-20개의 파장 또는 파장들의 범위가 사용될 수 있다.
일부 사례에서 축퇴성이 제거되는 경우, 본 발명의 방법은 단일 부피에서 시그널을 생성하는데 사용되는 각각의 시약이 하나의 제2값만을 생성하는(예로, 각각의 시약이 하나의 파장에서만 광을 방출하는) 경우, 그 부피에서 적어도 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 이상의 분석물질의 존재 또는 부재를 검출할 수 있다.
다른 사례에서 축퇴성이 제거되는 경우, 본 발명의 방법은 단일 부피에서 총 4개의 제2값(예로, 4개의 분광학적으로 분리 가능한 형광단을 이용하여 시행될 수 있는 총 4개 파장 또는 파장들의 범위)을 이용하여 그 부피에서 적어도 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 이상의 분석물질의 존재 또는 부재를 검출할 수 있다.
명세서에 걸쳐 기재된 바와 같이, 본원에서 제공되는 분석은 표본 상에서 누적 측정을 이용한다. 누적 측정은, 예를 들어 강도값의 단일 측정 또는 하나 이상의 파장 또는 파장들의 범위에서의 강도값의 측정일 수 있다. 복수의 누적 측정이 수득될 수 있다. 예를 들어, 강도는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 이상의 파장 또는 파장들의 범위에서 측정될 수 있다. 강도는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 이상의 파장 또는 파장들의 범위에서 측정될 수 있다. 강도는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 미만의 파장 또는 파장들의 범위에서 측정될 수 있다.
보다 일반적으로 누적 측정은 임의의 정량 가능한 시그널 성분에 대해, 그리고 또 다른 정량 가능한 시그널 성분에서 임의의 정량 가능한 시그널 성분에 대해 수득될 수 있다. 예를 들어, 적어도 하나의 시그널의 제1 성분은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 이상의 시그널의 제2 성분에서 측정될 수 있다. 적어도 하나의 시그널의 제1 성분은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 이상의 시그널의 제2 성분에서 측정될 수 있다. 적어도 하나의 시그널의 제1 성분은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 미만의 시그널의 제2 성분에서 측정될 수 있다.
본 개시로부터 자명한 바와 같이, 검출될 각각의 분석물질은 임의의 수의 적합한 시그널 성분 또는 임의의 수의 시그널을 이용하는 코드로 인코딩될 수 있다. 예를 들어, 검출될 각각의 분석물질은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 이상의 시그널 성분 또는 시그널로 인코딩될 수 있다. 일부 사례에서, 검출될 각각의 분석물질은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 이상의 시그널 성분 또는 시그널로 인코딩될 수 있다. 일부 사례에서, 검출될 각각의 분석물질은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 미만의 시그널 성분 또는 시그널로 인코딩될 수 있다. 일부 사례에서, 1-4, 4-20, 4-6, 4-7, 4-8, 4-9, 4-10, 5-6, 5-7, 5-8, 5-9, 5-10, 10-15, 또는 10-20개의 시그널 성분 또는 시그널이 각각의 분석물질을 인코딩하기 위해 사용될 수 있다. 코딩 방식에서 각각의 분석물질은 동일한 수의 시그널 성분 또는 시그널 또는 상이한 수의 시그널 성분 또는 시그널에 의해 인코딩될 수 있다.
A. 탐침, 프라이머, 형광단, 및 켄처
본 개시에 제공된 일부 방법은 분석물질의 존재 시 시그널을 생성하는 시약을 이용한다. 임의의 적합한 시약이 본 발명과 함께 사용될 수 있다. 일반적으로 시약은 분석물질-특이적 성분 및 분석물질의 존재 시 시그널을 생성하는 성분을 가질 것이다. 일부 사례에서, 이들 시약은 탐침으로 불린다. 탐침은 혼성화 탐침일 수 있다. 혼성화 탐침은 형광단 및 켄처에 부착된 올리고뉴클레오티드 탐침(예로, TAQMAN 탐침)일 수 있다.
본 발명의 방법은 각각의 분석물질의 존재 또는 부재를 검출하기 위해 하나 이상의 시약 또는 탐침을 이용할 수 있다. 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 이상의 탐침이 각각의 분석물질의 존재 또는 부재를 검출하는데 사용될 수 있다. 일부 사례에서, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개의 탐침이 각각의 분석물질의 존재 또는 부재를 검출하는데 사용될 수 있다. 일부 사례에서, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개 미만의 탐침이 각각의 분석물질의 존재 또는 부재를 검출하는데 사용될 수 있다. 일부 사례에서, 각각의 분석물질의 존재 또는 부재를 검출하는데 사용되는 탐침의 수는 1-10, 2-9, 2-8, 2-7, 2-6, 2-5, 2-4, 1-3, 또는 1-4개이다.
일부 사례에서, 표본은 모든 분석물질의 존재 또는 부재를 검출하기 위해 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 이상의 탐침과 접촉된다. 일부 사례에서, 표본은 모든 분석물질의 존재 또는 부재를 검출하기 위해 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 이상의 탐침과 접촉된다. 일부 사례에서, 표본은 모든 분석물질의 존재 또는 부재를 검출하기 위해 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 미만의 탐침과 접촉된다. 일부 사례에서, 모든 분석물질의 존재 또는 부재를 검출하기 위해 표본이 접촉되는 탐침의 수는 4-50, 4-40, 4-30, 4-20, 5-15, 5-10, 또는 3-10개이다.
상술된 바와 같이, 형광단 및 켄처에 부착된 올리고뉴클레오티드 탐침이 폴리뉴클레오티드 증폭 분석에서 분석물질의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다. 켄처 및 형광단이 인접해있는 한, 켄처는 광원에 의한 여기 시 형광단에 의해 방출되는 형광을 켄칭한다. 올리고뉴클레오티드 탐침의 서열은 분석물질에 존재하는 폴리뉴클레오티드 서열에 상보적으로 설계되므로, 분석물질에 존재하는 폴리뉴클레오티드 서열과 혼성화할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 탐침의 혼성화는 프라이머를 포함하는 핵산 증폭 반응(예로, 폴리머라아제 연쇄 반응)에서 수행될 수 있다. DNA 폴리머라아제에 의한 프라이머 연장 시, 폴리머라아제의 5' → 3' 엑소뉴클레아제 활성이 탐침을 분해하여 형광단 및 켄처를 매질 내로 방출한다. 형광단 및 켄처 간의 인접성이 해제되고 형광단으로부터의 시그널이 더 이상 켄칭되지 않는다. 따라서 검출되는 형광의 양은 존재하는 분석물질의 양의 함수이다. 분석물질이 존재하지 않는 경우, 탐침은 분석물질과 혼성화하지 않을 것이고 형광단 및 켄처는 가까이 인접하여 유지될 것이다. 시그널은 생성되지 않거나 거의 생성되지 않을 것이다.
올리고뉴클레오티드 탐침은 탐침별로 하나 또는 복수의 형광단 및 켄처를 가질 수 있다. 예를 들어 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드 탐침은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 이상의 형광단을 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 탐침은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개의 형광단을 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 탐침은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 미만의 형광단을 포함할 수 있다.
올리고뉴클레오티드 탐침은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 이상의 켄처를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 탐침은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개의 켄처를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 탐침은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 미만의 켄처를 포함할 수 있다.
탐침 및 탐침에 대한 켄처의 부착은 동일한 반응에서 또는 일련의 반응에서 수행될 수 있다. 적어도 하나의 형광단으로 탐침을 표지하기 위해 일련의 반응이 수행될 수 있고, 상이한 형광단을 갖는 탐침 혼합물을 생성하기 위해 반응 산물이 혼합될 수 있다.
올리고뉴클레오티드 탐침이 2개 이상의 형광단을 포함하는 경우, 이들 형광단은 형광단 간에 포스터(형광) 공명 에너지 전달(FRET)이 일어날 수 있도록 배열될 수 있다. 간략하게, FRET는 형광단 간의 에너지 전달 기전이다. FRET-기반 탐침의 이용은 하나의 여기원이 단일 형광단의 여기에 의해 2개의 상이한 형광 방출 시그널을 생성할 수 있도록 한다. 예를 들어, 본원에 기재된 방법은 페어를 형성한 탐침을 이용할 수 있고, 여기서 페어에서의 하나의 탐침은 형광단 및 켄처에 부착되고 두 번째 탐침은 2개의 형광단(FRET이 일어나기 충분히 가까이 인접해 있음) 및 켄처에 부착된다. FRET를 제공하는 임의 조합의 형광단 및 켄처가 사용될 수 있다. 이러한 접근은 단일 여기원이 2개 시그널(하나는 1개의 형광단을 갖는 탐침으로부터, 그리고 하나는 FRET를 제공하기 충분히 가까이 인접한 2개 형광단을 갖는 탐침으로부터)을 생성하는데 사용될 수 있으므로 여기원과 함께 사용될 수 있는 형광 탐침의 수를 2배로 만든다. 예를 들어 표 8에 기재된 인코딩 방법을 이용하면, 모호하지 않게 검출 가능한 분석물질의 수가 대응 FRET 탐침을 갖는 표 8에서의 각각의 탐침의 페어링에 의해 16개에서 32개로 증가될 수 있다.
프라이머는 특정 분석물질에 대해 특이적일 수 있고, 탐침에 상보적인 영역을 증폭할 수 있다. 일부 사례에서, 사용되는 프라이머 페어의 수는 탐침의 수와 같다. 다른 사례에서, 사용되는 탐침의 수는 사용되는 프라이머 페어의 수를 초과할 수 있다. 또 다른 사례에서, 사용되는 프라이머 페어의 수는 사용되는 탐침의 수를 초과할 수 있다. 일부 사례에서, 분석될 표본은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 이상의 프라이머 페어와 접촉된다. 일부 사례에서, 분석될 표본은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 이상의 프라이머 페어와 접촉된다. 일부 사례에서, 분석될 표본은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 미만의 프라이머 페어와 접촉된다. 일부 사례에서, 프라이머 페어의 수는 2-10, 3-15, 4-20, 3-10, 4-10, 5-10, 6-8, 또는 6-10개이다.
프라이머는 상이한 수의 혼성화 탐침이 혼성화하는 폴리뉴클레오티드 영역을 증폭시킬 수 있다. 예를 들어, 적어도 한 페어의 프라이머는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 혼성화 탐침에 상보적인 영역을 증폭시킬 수 있다. 일부 사례에서, 상기 모든 프라이머 페어는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개의 혼성화 탐침에 상보적인 영역을 증폭시킬 수 있다.
하나의 예에서, 제1 탐침은 형광단 5'-플루오레신 아미다이트(5'-FAM) 및 켄처인 블랙 홀 켄처 1(BHQ-1)로 표지될 수 있다. 제2 탐침은 시아닌 5.5(Cy5.5) 및 켄처인 블랙 홀 켄처 3(BHQ-3)에 가까이 인접한(예로 부착된) 5'-FAM으로 표지될 수 있다. 폴리머라아제의 뉴클레아제 활성을 통한 탐침의 소화 시, 단일 여기 파장(예로, 470nm)으로부터 2개의 형광 시그널이 생성된다. 제1 탐침의 형광단은 약 520nm에서 형광을 낼 것이다. 제2 탐침의 형광단은 FRET를 거친다. 공여체 형광단 FAM은 여기 광원(예로, 470nm)에 의해 여기되고 그 에너지를 수신체 형광단 Cy5.5로 전달한다. 수신체 형광단은 약 705nm에서 발광한다. 이들 형광단 및 켄처는 단순히 예시적인 것이다. FRET를 거칠 수 있는 임의의 형광단 및 형광을 켄칭할 수 있는 임의의 켄처가 본 발명과 함께 사용하기 적합하다. FRET-기반 탐침의 제조 방법은 [Jothikumar 등, BioTechniques, 2009, 46(7):519-524]에 기재된다.
일부 예에서, 단일 혼성화 탐침이 각각의 분석물질에 대해 사용될 수 있다. 다색상 인코딩(예로, 표 3에 나타낸 것)을 이용하기 위해, 각각의 탐침은 소정 비의 복수의 형광단으로 표지될 수 있다. 이 비는 양성 대조군 시그널이 동일한 색상에서 동일한 강도의 다른 양성 대조군 시그널과 동일한 강도를 제공하도록 결정될 수 있다. 상기 접근은 합성되어야 하는 탐침의 수를 감소시키고, 여러 탐침을 이용하는 방법에 비해 전개하는 비용이 더 적을 수 있다. 또한 혼성화 탐침의 경우, 여러 탐침보다 하나의 혼성화 탐침을 분석물질 서열에 맞추는 것이 더 쉽다.
본 발명의 여러 측면이 핵산 기반 탐침을 이용하여 예시되지만, 당업자는 다른 형태의 탐침이 본 개시에 기재된 본 발명과 함께 똑같이 잘 작용할 것임을 쉽게 인지할 것이다. 예를 들어, 분석물질에 특이적인 결합 분자가 탐침으로 사용될 수 있다. 비제한적인 예시적 결합 분자에는 분석물질을 인지하고 분석물질의 존재 시 시그널을 생성하는 항체가 포함된다.
형광 표지를 이용하는 본 발명의 구현예에서, 임의의 적합한 형광 표지 사용될 수 있다. 본 발명에 사용하기 적합한 예시적인 형광 표지에는 로다민, 로돌, 플루오레신, 티오플루오레신, 아미노플루오레신, 카르복시플루오레신, 클로로플루오레신, 메틸플루오레신, 설포플루오레신, 아미노로돌, 카르복시로돌, 클로로로돌, 메틸로돌, 설포로돌; 아미노로다민, 카르복시로다민, 클로로로다민, 메틸로다민, 설포로다민, 및 티오로다민, 시아닌, 인도카르보시아닌, 옥사카르보시아닌, 티아카르보시아닌, 메로시아닌, 시아닌 2, 시아닌 3, 시아닌 3.5, 시아닌 5, 시아닌 5.5, 시아닌 7, 옥사디아졸 유도체, 피리딜옥사졸, 니트로벤족사디아졸, 벤족사디아졸, 피렌 유도체, 케이케이드 블루, 옥사진 유도체, 나일 레드, 나일 블루, 크레실 바이올렛, 옥사진 170, 아크리딘 유도체, 프로플라빈, 아크리딘 오렌지, 아크리딘 옐로, 아릴메틴 유도체, 오라민, 크리스탈 바이올렛, 말라카이트 그린, 테트라피롤 유도체, 포르핀, 프탈로시아닌 및 빌리루빈이 포함된다. 예시적인 켄처에는 블랙 홀 켄처, 예컨대 BHQ-0, BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3; ATTO 켄처, 예컨대 ATTO 540Q, ATTO580Q, 및 ATTO612Q 등이 포함된다.
본 발명에 사용될 수 있는 형광단은 본원에 기재된 임의의 형광단에 제한되지 않는다. 예를 들어, 개선된 특성을 갖는 형광단이 계속적으로 개발되며, 이들 형광단이 본 개시에 제공되는 방법과 함께 쉽게 사용될 수 있다. 이러한 개선된 형광단에는 단일 파장에서 여기된 후 상이한 파장에서 에너지를 방출할 수 있는 퀀텀 도트가 포함된다. 이러한 형광단을 사용하는 장점은 단일 여기원만이 필요하지만 여러 상이한 시그널이, 예를 들어 색상 및 강도의 관점에서 정량될 수 있다는 것이다. 또한, 좁은 방출 스펙트럼을 갖는 형광단은 이들의 방출 스펙트럼 간 중첩이 최소이거나 없이 다중화 분석에 포함되어 더 많은 "색상"을 제공하고 코딩된 분석물질의 전체 수를 크게 증강시킬 수 있으므로, 본원에 기재된 방법에서 특히 유용할 것이다.
일부 사례에서, 하나 이상의 시약이 동결건조된다. 임의의 적합한 시약이 동결건조될 수 있다. 예를 들어, 탐침, 프라이머, 효소, 항체, 또는 검출을 위해 사용되는 임의의 다른 시약이 동결건조될 수 있다. 일부 사례에서, 분석물질을 포함하는 표본도 동결건조될 수 있다. 동결건조는, 예를 들어 저온 보관에 대한 접근이 고가이거나, 쉽게 이용 가능하지 않거나, 신뢰하며 이용 가능하지 않은 개발 도상국에서 시약 및/또는 표본을 유통할 때 유용할 수 있다. 하나의 예에서, 동결건조된 시약은 본 개시에 기재되거나 다른 방식으로 본 발명에 사용하기 적합한 임의의 탐침 또는 분석물질-특이적 시약을 포함한다. 또 다른 예에서, 동결건조된 시약은 PCR 프라이머를 포함한다. 또 다른 예에서, 동결건조된 시약은 PCR 반응을 수행하기 적합한 시약을 포함한다.
V. 분석 기법 및 기기
본원에서 제공되는 방법은 다양한 검출 방법과 함께 사용하기 적합하다. 예를 들어, 방법은 형광 시그널의 파장 및 강도를 측정하는 분석 기법을 이용하여 적용될 수 있다. 이는 파장 스펙트럼에 걸쳐 시그널 강도를 측정하여 또는 특정 광 파장의 통과를 제한하는 밴드 통과 필터를 이용함으로써 특정 파장의 광만 광 검출기에 도달하도록 함으로써 달성될 수 있다. 여러 실시간 PCR 및 정량적 PCR 기기는 4개 색상(예로, 청색, 녹색, 황색, 및 적색)의 형광 시그널 검출을 가능케 하는 밴드 통과 필터 및 여기 광원을 포함한다. 따라서 본 발명의 방법은 당분야에 널리 이용되는 기기를 이용하여 쉽게 적용될 수 있다. 중요하게는, 본원에서 제공되는 방법 및 조성물은 단일 용액에서 누적 측정을 수득하여 여러 분석물질을 검출하는데 사용될 수 있다. 분리가 필요없다. 본 발명은 비드 또는 고상의 이용을 필요로 하지 않는다. 물론, 당업자는 필요한 경우, 본 발명이 분리, 비드 또는 고상과 함께 이용될 수 있음을 이해할 것이다.
도 5는 본 발명의 방법을 위해 유용한 누적 측정을 수득하기 위해 사용될 수 있는 기기 구성의 두 예를 나타낸다. 도 5를 참조하면, 파장 및 강도를 모두 검출하도록 구성된 검출기를 갖는 기기(예로, 형광 측정계)를 501에 나타낸다. 501을 참조하면, 적어도 하나의 여기 광원 502는 분석물질 504의 존재시 시그널을 생성하는 시약 및 분석물질을 함유하는 챔버 503 내로 보내진다. 다른 곳에 기재된 바와 같이, 분석물질은 핵산일 수 있고, 시그널을 생성하는 시약은 형광단 및 켄처를 포함하는 혼성화 탐침일 수 있다. 분석물질이 존재하는 경우, 방출 시그널 505가 생성된다. 501에 나타낸 구성에서, 상기 방출 시그널의 파장 및 강도는 형광 방출 스펙트럼 506을 생성할 수 있는 검출기에 의해 스펙트럼에 걸쳐 측정된다.
파장 및 강도는 또한 광 검출기 및 밴드 통과 필터의 조합을 이용하여 결정될 수 있다. 상기 구성은 당분야에 공지된 몇몇 열 싸이클러에서 이용된다. 도 5를 참조하면, 밴드 통과 필터 및 광 검출기를 갖는 기기가 507에 도시된다. 507을 참조하면, 적어도 하나의 여기 광원 508은 분석물질 510의 존재시 시그널을 생성하는 시약 및 분석물질을 함유하는 챔버 509 내로 보내진다. 다른 곳에 기재된 바와 같이, 분석물질은 핵산일 수 있고, 시그널을 생성하는 시약은 형광단 및 켄처를 포함하는 혼성화 탐침일 수 있다. 분석물질이 존재하는 경우, 방출 시그널 511이 생성된다. 507에 나타낸 구성에서, 밴드 통과 필터 512, 513, 및 514가 광 통과를 특정 파장 범위 내의 광으로 제한하는데 이용된다. 예를 들어, 밴드 통과 필터 512는 광 통과를 특정 파장 범위 1 내의 광으로 제한할 수 있다. 밴드 통과 필터 513은 광 통과를 특정 파장 범위 2 내의 광으로 제한할 수 있다. 밴드 통과 필터 514는 광 통과를 특정 파장 범위 3 내의 광으로 제한할 수 있다. 임의의 수의 밴드 통과 필터가(예로, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개 이상이) 본 발명과 함께 사용될 수 있다. 또한, 507에서 밴드 통과 필터의 위치는 제한하는 것이 아니다. 일부 사례에서, 방출된 광은 임의의 시간에 둘 이상의 밴드 통과 필터를 통해 통과될 수 있다. 다른 사례에서, 밴드 통과 필터는 모든 방출된 광이 한 번에 하나의 밴드 통과 필터만을 통해 통과하도록 구성될 수 있다. 밴드 통과 필터를 통한 통과 후, 여과된 광 515, 516, 및 517은 광 검출기에 의해 검출된다. 예를 들어, 여과된 광 515는 파장 범위 1 내의 광일 수 있고, 여과된 광 516은 파장 범위 2 내의 광일 수 있고, 여과된 광 517은 파장 범위 3 내의 광일 수 있다. 이어서 각각의 여과된 광의 강도는 515, 516, 및 517은 광 검출기 518에 의해 정량될 수 있다.
본 개시에 기재된 방법은 정량적 PCR(qPCR) 방법, 종점 PCR 방법, 역전사효소 PCR, 및 디지털 PCR 방법을 포함하는 다양한 증폭 방법과 상용 가능하다. 디지털 PCR 방법(예로, DROPLET DIGITAL(BIORAD) 및 DYNAMIC ARRAY(FLUIDIGM))은 폴리뉴클레오티드 복제수의 고감도 정량을 제공한다. 본원에서 제공되는 방법은 점적 또는 다이내믹 어레이에서 다중화를 허용함으로써 이들의 처리량을 크게 확장시키기 위해 이들 시스템 내로 쉽게 통합될 수 있다.
유사하게, 본 개시에 기재된 방법은 실시간 PCR 분석에서 적용될 수 있다. 예를 들어, 실시간 데이터는 PCR 수행이 종결될 때까지 모두 기록될 수 있다. 이어서 종점 값이 디코딩되어 분석물질의 존재 또는 부재를 시사할 수 있다. 개별 사이클 역치(Ct) 값은 해당 색상에서 실시간 곡선의 제2 유도체의 최대값 검출에 의해 각각의 색상에 대해 분석될 수 있다. 특정 분석물질이 증폭됨에 따라 형광단은 해당 서열의 코딩에서 색상이 증가되는 것과 동일한 비로 그 해당 탐침으로부터 방출된다. 따라서, 예로 코드 1100은 청색 및 녹색에서 동일한 Ct를 가질 것인 반면, 코드 1400은 그 녹색 Ct가 그 청색 Ct를 2 사이클 선행할 것이다. 이러한 추가적인 데이터는 각각의 분석물질의 정체 및 출발 양의 결정을 가능케 한다.
본원에 기재된 방법은 또한 조직 표본 상에서 직접 이용될 수 있다. 예를 들어, 조직 표본이 수득되고 조직 표본 상에 직접 웰을 구축하기 위해 사진석판 방법이 사용될 수 있다. 조직 표본은 웰의 구축 전에 고정될 수 있다. 이어서 조직 표본의 웰 내로 적절한 시약을 분배하여 조직 표본이 분석될 수 있다. 본 개시에 기재된 인코딩 및 디코딩 방법은 조직 내로 에칭된 웰 내에서 분석물질의 다중화된 검출을 위해 사용될 수 있다. 각각의 웰은 단일 세포 또는 소수의 세포들에 대응하여, 분석물질에 대해 조직의 상이한 부분을 분석할 때 뛰어난 공간적 분리를 제공할 수 있다. 상기 방법은 동일한 조직의 상이한 영역에서 분석물질을 검출하는데 사용될 수 있다.
일부 사례에서, 기기는, 예를 들어 여러 파장에서 추가적인 여기 광원을 제공하기 위해 및/또는 추가적인 밴드 통과 필터 또는 전체 스펙트럼을 결정하는 능력을 제공하기 위해 개질되거나 구성될 수 있다. 추가적인 여기원의 도입은 더욱 다양한 형광단의 여기를 허용할 것이다. 추가적인 밴드 통과 필터의 도입, 또는 전체 스펙트럼을 결정할 수 있도록 하는 기기의 개질 또는 구성은 형광단으로부터 더욱 다양한 방출을 검출할 수 있게 한다. 이러한 기법은 본 개시에 기재된 방법과 함께 사용될 수 있는 형광단의 수를 증가시키고, 이에 따라 동시에 검출되는 분석물질의 수를 증가시키기 위해 이용될 수 있다.
일부 사례에서, 본 개시에 기재된 방법은 종점 PCR 방법을 이용한다. 그러나 일부 사례에서, 결과는 종점 전에 수득될 수 있다. 이는, 예를 들어 최대한 빨리 결과가 필요한 경우 장점이 될 수 있다. 예를 들어 하나의 사례에서, 분석물질의 출발 양의 함수로서 시그널이 포화되기 시작하는 사이클 수를 결정하기 위해 상이한 출발 농도의 분석물질이 분석되는 검정 실험이 수행된다. 상기 데이터를 이용하여, 실시간으로 PCR 반응을 모니터링하는 컴퓨터는 특정 시스템의 검출 한계(LOD)에 따라 최대 사이클 수까지 포화에 대해 검색하도록 프로그래밍될 수 있다. 최대 사이클 수까지 분석물질(예로, 존재하는 경우 양성 대조군 이외의 것)이 증폭되지 않는 경우, 그 분석물질에 대한 결과는 음성이다. 최대 사이클 수까지 분석물질이 증폭되는 경우, 그 분석물질에 대한 결과는 양성이며, 각 색상의 포화 강도가 코딩 방식을 이용하여 결과를 디코딩하는데 사용될 수 있다. 두 사례 모두에서, 해당 기기에 대해 LOD에 의해 설정된 사이클 수를 초과하여 PCR 반응을 수행할 필요는 없을 것이다. PCR을 이용하여 상기 정량적 방법을 예시하였지만, 당분야 숙련자는 분석물질의 출발 양이 반응 속도를 제한하는 임의의 촉매 시스템에서 유사한 원리가 적용될 수 있고, 반응 속도는 경시적으로 시그널 강도의 진행에 따라 측정되고 보고될 수 있음을 쉽게 인지할 것이다.
VI. 조성물 및 키트
본 개시는 또한 본원에 기재된 방법에 사용하기 위한 조성물 및 키트를 제공한다. 조성물은 본원에 기재된 임의의 성분, 반응 혼합물 및/또는 중간체뿐만 아니라 임의의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 개시는 본원에서 제공되는 방법과 함께 사용하기 위한 검출 시약을 제공한다. 명세서에서 다른 곳에 기재된 바와 같이 프라이머 및 형광단과 켄처가 표지된 혼성화 탐침을 포함하는 임의의 적합한 검출 시약이 제공될 수 있다.
일부 사례에서, 조성물은 4개 형광단을 이용하여 적어도 7개의 분석물질을 검출하기 위한 시약을 포함한다. 일부 사례에서, 조성물은 4개 형광단을 이용하여 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 분석물질을 검출하기 위한 시약을 포함한다. 일부 사례에서, 조성물은 5개 형광단을 이용하여 적어도 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 분석물질을 검출하기 위한 시약을 포함한다. 일부 사례에서, 조성물은 6개 형광단을 이용하여 적어도 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 분석물질을 검출하기 위한 시약을 포함한다. 일부 사례에서, 조성물은 7개의 형광단을 이용하여 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 분석물질을 검출하기 위한 시약을 포함한다.
일부 사례에서, 조성물은 프라이머를 포함한다. 조성물은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개의 프라이머 페어를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 방법을 수행하기 위한 키트를 제공한다. 따라서 다양한 키트가 적합한 패키지에 제공된다. 키트는 본원에 기재된 임의의 하나 이상의 용도를 위해 사용될 수 있고, 이에 따라 복수의 분석물질의 각각의 분석물질의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 지침을 포함할 수 있다. 키트는 누적 측정을 복수의 분석물질의 각각의 존재 또는 부재를 시사하는 결과로 전환하는데 있어서 사용자를 보조하는 코딩 방식, 또는 디코딩 매트릭스를 포함할 수 있다. 키트는 진단 키트, 예를 들어 본원에 언급된 분석물질을 포함하여, 임의의 분석물질의 검출에 적합한 진단 키트일 수 있다. 키트는 상기 언급된 것들을 포함하여, 본 개시에 제공되는 임의의 조성물을 함유할 수 있다.
도 6은 본 발명의 예시적인 키트의 모식도를 나타낸다. 도 6을 참조하면, 분석물질(예로, 형광단 및 켄처를 포함하는 폴리뉴클레오티드 탐침)의 검출을 위한 시약 602 및 핵산의 증폭을 위한 프라이머 603을 포함하는 키트 본체 601를 포함하는 키트를 나타낸다. 키트는 또한 임의의 다른 시약, 예컨대 증폭 반응을 수행하기 적합한 시약 604를 포함할 수 있다. 601에 도시된 구현예에서, 분석물질의 검출을 위한 시약 및 프라이머가 각각 단일 부피(예로 튜브 또는 병)에 포함된다. 그러나 이들 시약은 또한 605에 나타낸 키트 본체에 도시된 바와 같은 별도 부피에 제공될 수 있다. 키트 본체 605는 7개의 별도 부피를 포함한다. 3개 부피(606, 607, 및 608)가 분석물질의 검출을 위한 시약(또는 상기 시약의 혼합물)을 포함하며, 3개 부피(609, 610, 및 611)가 프라이머(또는 프라이머들의 혼합물)를 포함한다. 키트는 또한 증폭 반응을 수행하기 적합한 시약 604를 포함할 수 있다.
도 6은 단지 예시적 목적으로 제공된다. 분석물질의 검출을 위한 임의의 수의 시약(예로, 탐침) 및 임의의 수의 프라이머가 용도에 적절한 바에 따라 단일 튜브 또는 병에 포함될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 분석물질의 검출을 위한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 이상의 시약이 단일 병에 포함될 수 있다. 다른 사례에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 이상의 증폭용 프라이머가 단일 병 또는 튜브에 포함될 수 있다. 일부 사례에서, 프라이머 및 탐침은 동일한 병 또는 튜브에 제공될 수 있다. 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 이상의 탐침이 프라이머 페어별로 제공될 수 있다. 다른 사례에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 이상의 프라이머가 탐침 페어별로 제공될 수 있다. 키트는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 이상의 병 또는 튜브를 함유할 수 있다. 대조군 분석물질, 및 이들의 연관 검출 시약 및 프라이머가 또한 키트에 포함될 수 있다. 이들은, 예를 들어 증폭 반응 604를 위해 시약을 제공하는 병 또는 튜브 내에 포함된 별도의 병 또는 튜브에 포함될 수 있다. 명세서에서 다른 곳에 기재된 바와 같이, 키트의 임의의 시약은 동결건조될 수 있다.
VII. 시스템 및 소프트웨어
본 개시의 방법은 또한 시스템의 일환으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 방법의 하나 이상의 단계는 컴퓨터로 읽을 수 있는 매체 상에 포함된 소프트웨어에 의해 수행될 수 있다. 소프트웨어는 분석물질을 인코딩하고, 축퇴성을 확인하고, 축퇴성을 제거 또는 감소시키고, 및/또는 디코딩 매트릭스를 생성하는데 사용될 수 있다. 소프트웨어는 또한 기기(예로 PCR 기계) 상에서 제조된 누적 측정을 분석물질의 존재 또는 부재에 관한 정보로 전환하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 도 4를 참조하면, 컴퓨터 401은 입력 장치 403, 디스플레이 402, 및 프린터 404에 연결될 수 있다. 컴퓨터는, 예를 들어 인코딩 방법 410, 분석 방법 420, 및 디코딩 방법 430을 포함하여 본 개시에 기재된 임의 방법의 하나 이상의 단계를 실행할 수 있다. 컴퓨터는, 예를 들어 인코딩 방법 410의 일환으로 축퇴성을 감소시키거나 제거할 수 있다. 유사하게, 컴퓨터는, 예를 들어 수학적 반복을 이용하여 설계상 비-축퇴성인 코딩 방식을 생성할 수 있다. 컴퓨터는 또한 네트워크 405에 연결될 수 있다. 네트워크는 로컬 네트워크 및/또는 인터넷일 수 있다. 네트워크는 상이한 위치의 여러 컴퓨터에서 본 발명의 방법을 수행하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 하나의 컴퓨터가 인코딩을 수행할 수 있고, 다른 컴퓨터가 측정을 수행할 수 있으며, 또 다른 컴퓨터가 디코딩을 수행할 수 있다. 컴퓨터는 임의의 또는 전체의 이들 방법을 수행할 수 있다. 네트워크는 전세계에 걸쳐, 예를 들어 국경을 넘어 본 개시에 기재된 방법을 이용하여 수득된 정보를 전송하는데 사용될 수 있다.
하나의 예에서, 소프트웨어는 측정을 수행하는 기기, 예컨대 열 싸이클러에 임베딩된다. 또 다른 예에서, 소프트웨어는 측정을 수행하는 기기에 부착된 컴퓨터, 예컨대 열 싸이클러에 부착된 컴퓨터 상에 설치된다. 또 다른 예에서, 소프트웨어는 "클라우드"에 - 즉, 또 다른 컴퓨터가 네트워크를 통해 통신할 수 있는 컴퓨터 상에 있다.
상술된 각각의 요소는 각각의 요소와 통신하고 이들의 작용을 조정하는 컨트롤러에 연결될 수 있다. 예를 들어, 컨트롤러는 일련의 분석물질의 색상 및 강도값들로의 인코딩을 개시할 수 있다. 본 개시를 통해 기재된 바와 같이, 컨트롤러는 인코딩 매트릭스에서 하나 이상의 잠재적 분석물질 코드를 제거함으로써 축퇴성을 감소시키거나 제거하는 소프트웨어를 실행할 수 있다. 이어서 컨트롤러는 탐침 제조업체로부터 상기 코드에 대응하는 탐침을 자동 주문할 수 있다. 대안적으로, 컨트롤러는 적절한 탐침을 합성할 수 있는 올리고뉴클레오티드 합성 기기를 작동시킬 수 있다. 기기 상에서의 표본 분석(역시 자동화될 수 있음) 후, 컨트롤러는 디코딩 매트릭스를 이용하여 분석 결과를 처리할 수 있다. 이어서 컨트롤러가 이러한 결과를 사용자에게 제공할 수 있다.
VIII. 서비스
본원에서 제공되는 방법은 또한 서비스로서 수행될 수 있다. 예를 들어, 서비스 제공업체는 고객이 분석하기를 원하는 복수의 분석물질의 정체를 수득할 수 있다. 이어서 서비스 제공업체는 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 검출될 각각의 분석물질을 인코딩하고, 고객에게 분석을 위해 적절한 시약을 제공할 수 있다. 고객은 분석을 수행하고, 그 결과를 디코딩을 위해 서비스 제공업체에 제공할 수 있다. 이어서 서비스 제공업체는 디코딩된 결과를 고객에게 제공할 수 있다. 고객은 또한 로컬로(고객의 위치에서) 또는 원격으로(예로, 네트워크를 통해 접근할 수 있는 서버 상에) 설치된 소프트웨어와 상호작용하여 분석물질을 인코딩하고, 탐침을 생성하고, 및/또는 결과를 디코딩할 수 있다. 예시적인 고객에는 임상 실험실, 의사, 음식품 및 소비재의 제조업체, 산업 제조업체(예로 석유 회사) 등이 포함된다. 고객 또는 당사자는 본 발명의 방법, 시스템, 조성물 및 키트의 사용이 필요하거나 이를 원하는 임의의 적합한 고객 또는 당사자일 수 있다.
실시예
실시예 1: 일반 재료 & 방법
1. 일반 시약
TE 완충액, pH 7(LIFE TECHNOLOGIES, Carlsbad, CA); UltraPure RNAse-비함유수(LIFE TECHNOLOGIES, Carlsbad, CA); Taq 5x 마스터 혼합물(FISHER SCIENTIFIC COMPANY, Tustin, CA).
2. DNA 서열, 프라이머, 및 탐침
임상적으로 중요한 개체의 5개 핵산을 예시적 연구를 위해 선택하였다: (1) 인간 면역결핍 바이러스 1(HIV-1); (2) 말라리아원충(말라리아); (3) 단순 헤르페스 바이러스-2(HSV-2); (4) 결핵균(TB); 및 (5) 뎅기 바이러스 3형(뎅기열).
HIV-1 게놈에서 진단적으로 중요한 2개 영역 p17 및 폴리프로테아제를 로스 알라모스 국립 연구소(Los Alamos National Laboratory) HIV-1 참조 서열로부터 선택하였다. 말라리아원충 ChR7 유전자로부터의 진단 서열은 UCSC 말라리아원충 게놈 브라우저로부터 수득하였다. 단순 헤르페스 바이러스-2에 대한 서열은 유럽 분자생물학 라이브러리(European Molecular Biology Library)에서 수득한 서열로부터 합성하였다. 유사하게 결핵균에서의 rpoB 유전자에 대한 진단 서열을 유럽 분자생물학 라이브러리로부터 수득한 서열로부터 합성하였다. 뎅기 바이러스 3형에 대한 PCR 진단 서열은 국립 의료원(National Institute of Health) 유전 서열 데이터베이스에서 수득하였다.
INTEGRATED DNA TECHNOLOGIES(IDT)에서 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. IDT의 올리고분석기(OLIGOANALYZER)를 이용하여 각각의 분석물질에 대해 탐침 및 프라이머 페어를 선택하였다. 5'에 형광단을 그리고 3' 말단에 켄처를 함유하는 센스 탐침을 모든 분석물질에 대해 합성하였다. 모든 올리고뉴클레오티드를 동결건조하고, 사용 전에 TE 완충액 중에 재구성하였다. 표 9 - 14는 6개 분석물질 각각에 대한 서열 정보, 표적 서열, 프라이머, 및 탐침을 나타낸다.
표 9. HIV-1 폴리프로테아제 서열 정보.
Figure pct00010
표 10. HIV p17 서열 정보.
Figure pct00011
표 11. 말라리아원충 ChR7 서열 정보.
Figure pct00012
표 12. 단순 헤르페스 바이러스 2 서열 정보.
Figure pct00013
표 13. 결핵균 rpoB 서열 정보
Figure pct00014
표 14. 뎅기 바이러스 3형 서열 정보.
Figure pct00015
3. 폴리머라아제 연쇄 반응
ROCHE 480 LIGHTCYCLER 기기에서 전체 PCR 반응을 수행하였다. 95℃에서 60초의 고온 시작과 함께 45회 열 사이클링을 수행하였다. 변성, 어닐링 및 연장을 위한 사이클링 조건은 각각 95℃, 65℃ 및 70℃에서 45초, 50초, 및 60초였다. 각각의 실험을 반응 부피 15㎕로 5개씩 수행하였다. 매 어닐링 단계 후, 하기 채널에서 형광 측정을 수득하였다: 483nm 내지 533nm(FAM), 523nm 내지 568nm(Cy3), 558nm 내지 610nm(ROX), 및 615nm 내지 670nm(Cy5). 또한 고온-시작 및 45회의 열 사이클링 종료 후에도 형광 측정을 수득하였다. 이들 두 측정(고온-시작 후 및 45회의 열 사이클링 종료 시) 간 형광 강도 변화로 종점 형광 시그널을 결정하였다.
실시예 2: 분석물질별로 둘 이상의 색상을 이용하는 인코딩 방법에 근거한 병원체로부터의 폴리뉴클레오티드 마커의 동시적 검출
본 실시예는 HIV(2개의 폴리뉴클레오티드), HSV-2, 결핵균, 말라리아원충, 및 뎅기 바이러스로부터 선택되는 4개까지의 폴리뉴클레오티드의 동시적 검출을 기재한다. 표 15에 기재된 시약을 이용하여 14개 PCR 반응을 조합하였다.
표 15. 14개 PCR 반응을 위한 시약
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
표 15를 참조하면, 반응 1, 3, 5, 7, 및 9(각각 HIV 폴리프로테아제, 말라리아원충, HSV, 결핵균, 및 뎅기 분석물질을 함유)는 다른 분석물질의 부재 시, 각각의 폴리뉴클레오티드 분석물질 단독에 대한 기준선 형광 강도를 제공하는 양성 대조군이었다. 아래에 보다 상세히 기재된 바와 같이, 각각의 색상에서의 형광 강도 변화는 크로마토그램(도 3)에서 각각의 색상에 대한 예측 누적 강도 수준을 제공하는데 이용되었다. 반응 2, 4, 6, 8, 및 10은 비-특이적 증폭 정도를 결정하기 위해 이용된 음성 대조군이었다. 이들 반응에서, 제공된 프라이머는 제공된 분석물질에 대해 특이적이지 않은 것이었다.
실험 11, 12, 13, 및 14는 다중화 검출 실험이었다. 인코딩을 표 16에 나타낸 바와 같이 수행하였다. 각각의 색상에서 각각의 분석에 대해 측정된 형광 강도를 도 3의 크로마토그램에서 검은색 점으로 도시하였다.
표 16. 병원체 검출을 위한 코딩 방식
Figure pct00020
크로마토그램을 구축하기 위해, 양성 대조군(반응 1, 3, 5, 7, 및 9)의 시그널을 이용하여 각각의 색상에서 존재 서열의 가능한 모든 조합을 조합하였다. 누적 시그널을 "크로마토그램"으로 불리는 다이어그램에 도시하였다(도 3). 동일한 색상에서 동일한 순위의 가능한 모든 조합에 해당하는 누적 시그널을 이들의 고유한 "밴드"로 조직하였다. 전체 4개 색상에 대해 이를 수행하여 각 조합의 실험 결과(반응 11, 12, 13, 및 14)를 평가할 수 있는 밴드 구조 및 수준을 생성하였다. 도 3은 양성 대조군 표본을 이용하여 구축된 크로마토그램의 세 복제물을 나타내며, 실험 결과 4112, 3121, 및 3102가 크로마토그램 상에 중첩된다. 실험 결과를 검은색 점으로 나타낸다.
반응 11-14에서 각각의 색상에 대한 강도값을 임의 형광 단위(AFU)로 측정하고, 크로마토그램 상에 도시한 뒤 2개 기준에 근거하여 밴드에 할당하였다. 먼저, 실험 결과가 밴드 내에 있는 경우, 결과를 그 밴드의 다중성에 할당하였다(예로 도 3의 가장 왼쪽 크로마토그램에서의 Cy3값 1). 다음으로, 실험 결과가 두 밴드 사이에 있는 경우, 두 단계 분석을 채용하였다. 실험 결과가 두 유효 결과 사이에 있는 경우, 실험 결과를 가장 가까운 밴드에 할당하였다(예로, 도 3의 가장 오른쪽 크로마토그램에서의 Cy5값 2). 실험 결과가 유효 결과 및 무효 결과 사이에 있는 경우, 결과를 유효 결과를 갖는 밴드에 할당하였다(예로, 도 3의 중앙 크로마토그램에서의 FAM값 3). 도 8은 HIV 폴리프로테아제, 말라리아원충, 단순 헤르페스, 및 결핵균의 존재를 나타내는 유효 결과 4112(상부); 및 디코딩될 수 없고 분석 오류를 나타내는 무효 결과 4110(하부)를 도식적으로 나타낸다.
상기 기준을 이용하여, 실험 12의 결과물을 적절한 답인 4112로 지정하였다. 실험 14의 결과물은 2121 또는 3121로 지정할 수 있었으나 2121이 무효하므로, 결과는 적절한 답인 3121이 되어야 한다. 실험 13의 결과물은 3102 또는 3101로 지정될 수 있고 둘 다 유효하지만, Cy5 채널에서 결과가 1보다 2에 확실히 더 가까우므로 적절한 답인 3102가 결과로 지정되었다. 이들 결과는 본원에서 제공되는 방법의 실험적 검증을 제공한다.
결과는 양성-대조군 시그널의 단순 합계로부터 예측되는 것보다 약간 더 낮은 조합 시그널의 경향을 나타낸다. 이는 시그널 조합이 완벽하게 선형이 아니기 때문일 수 있다. 이는 크로마토그램 구축이 현재 설명하지 않는 추가적인 효과의 결과일 수 있다. 이러한 효과는 켄처의 절대 농도에 관련될 수 있다. 켄처의 절대 농도가 높을수록, 이들이 켄칭하는 반응 부피의 백분율이 더 커지므로, 동일한 백분율의 방출 형광단은 누적 시그널에 대해 예측되는 만큼 기여하지 못하게 된다. 이러한 문제에 대한 하나의 해결책은 저농도의 탐침을 이용하여 켄처가 방출되는 양과 무관하게 시그널에서의 백분율 손실을 무시할 수 있도록 하는 것이다.
도 3은 여러 조합을 함유하는 각각의 순위가 상대적으로 넓은 밴드를 갖는다는 것을 나타낸다. 밴드의 폭은 궁극적으로 양성 대조군 표본에 대한 최고 및 최저 누적 시그널 간의 차이이다. 특정 색상에서 양성 대조군이 모두 정확히 동일한 형광 시그널을 생성하는 경우, 각 밴드의 폭은 0이 될 것이다. 그러나 이들 시그널이 다소 상이하므로, 생성 밴드가 상대적으로 넓다. 그러나 밴드를 좁힐 단순한 방법이 있다. 상기 실험에 대해 수행한 바와 같이 모든 탐침을 동일한 농도로 로딩하는 대신, 각각의 탐침의 농도를 각각의 생성 양성-대조군 시그널이 동일한 색상에서 다른 것과 동일하도록 조정할 수 있다. 이러한 접근은 밴드를 상당히 좁힘으로써 분석물질을 함유하는 표본에 대한 시그널의 다중성 결정을 더 쉽게 만든다.
실시예 3: 분석물질별로 하나의 색상 및 상이한 강도를 이용하는 인코딩 방법에 근거한 병원체로부터의 폴리뉴클레오티드 마커의 동시적 검출
본 실시예는 뎅기 바이러스, HIV p17, 및 HIV 폴리프로테아제로부터 선택된 3개까지의 폴리뉴클레오티드의 동시적 검출을 기재한다. 코딩 방식을 표 11에 도시한다. 표 17에 나타낸 바와 같이, 각각의 분석물질은 단일 색상에서 형광 강도의 단일 값으로 인코딩되었다. 본 사례에서, 본 개시의 다른 곳에 기재된 바와 같이 코딩 방식은 설계상 비-축퇴성이다. 이는 이전 분석물질에 대한 누적 강도값 + 1과 같은 강도값을 각각의 분석물질에 할당하여 달성된다. 물론 명세서에서 다른 곳에 기재된 바와 같이, 초기 할당된 값은 예를 들어 노이즈에 비해 더 잘 구분하기 위해 1보다 클 수 있다. 유사하게 각각의 분석물질에 할당된 값은, 예를 들어 강도들 간 분리를 증가시키고 더 단순한 강도 할당을 구현하기 위해, 이전 분석물질에 대한 누적 강도값 + 1보다 클 수 있다.
표 17. 뎅기 바이러스, HIV 폴리프로테아제, 및 HIV p17의 검출을 위한 코딩 방식.
Figure pct00021
실시예 2에서 사용된 것과 동일한 시약(예로, 주형, 프라이머, 및 탐침)을 여기에서 사용하였다. 양성-대조군 종점 PCR 반응에서 각각의 탐침에 의해 생성된 형광 시그널을 측정하고, 1x, 2x, 및 4x 시그널 강도를 생성할 탐침 농도를 계산하는데 이용하였다. 이어서 분석물질 출현의 7가지 비-무(null) 조합을 검출하기 위한 실험을 설정하였다. 표 18-24는 이들 혼합물 각각에 대한 PCR 반응 성분을 제공한다.
표 18. 이원성 FAM 실험 1 칵테일: HIV 폴리프로테아제, HIV p17, 및 뎅기 바이러스
Figure pct00022
표 19. 이원성 FAM 실험 2 칵테일: 뎅기 바이러스 및 HIV p17
Figure pct00023
표 20. 이원성 FAM 실험 3 칵테일: 뎅기 바이러스 및 HIV 폴리프로테아제
Figure pct00024
표 21. 이원성 FAM 실험 4 칵테일: HIV 폴리프로테아제 및 HIV p17
Figure pct00025
표 22. 이원성 FAM 실험 5 칵테일: 뎅기 바이러스
Figure pct00026
표 23. 이원성 FAM 실험 6 칵테일: HIV p17
Figure pct00027
표 24. 이원성 FAM 실험 7 칵테일: HIV 폴리프로테아제
Figure pct00028
각각의 실험의 전체 형광 시그널을 상술된 바와 같이 구축된 크로마토그램(도 7) 상에 도시하였다. 각각의 양성 대조군 측정 주위의 밴드 폭은 1X 측정에서 파급되는 불확실성이다. 이 불확실성은 포화 시 최종 5개 PCR 사이클의 형광 시그널의 표준 편차와 일치하였다.
도 7은 상기 실험 결과를 나타낸다. 가장 오른쪽의 3개 결과는 뎅기 바이러스 단독(DEN), HIV p17 단독(P17), 및 HIV 폴리프로테아제(TPP)에 대해 측정된 강도를 나타낸다. 이들 분석물질 각각에 대해 할당된 강도는 표 11에 나타낸 바와 같고, 도 7에서는 3개의 분석물질이 단독인 경우 예측된 강도 결과를 생성하였음이 확인된다(DEN, P17, 및 TPP 참고). 분석 종료 시, 본질적으로 모든 탐침이 가수분해되어 본질적으로 모든 형광단을 방출하며, 이것이 시그널을 방출한다. 고정된 양의 형광단은 고정되고 예측 가능한 양의 시그널을 생성한다. 따라서 존재하는 표적은 일반적으로 반응 부피에 첨가된 탐침의 양에 의해 결정되는 고정된 양의 시그널을 생성한다.
예측되는 바와 같이, 분석물질의 조합에 대한 강도값은 할당된 강도의 합계와 같다. 상기 코딩 방식은 비-축퇴성으로 설계되므로, 각각의 결과는 특정 분석물질의 존재 또는 부재로 모호하지 않게 디코딩될 수 있다. 예를 들어, 도 7의 왼쪽에서 시작하여, 결과 7은 3개의 분석물질 모두의 존재를 나타낸다. 결과 3은 뎅기 바이러스 및 HIV p17 분석물질의 존재, 및 HIV 폴리프로테아제의 부재를 나타낸다. 결과 5는 뎅기 바이러스 및 HIV 폴리프로테아제의 존재, 및 HIV p17의 부재를 나타낸다. 마지막으로 결과 6은 HIV p17 및 HIV 폴리프로테아제의 존재, 및 뎅기 바이러스의 부재를 나타낸다. 상기 코딩 방식은 본 개시에서 다른 곳에 기재된 바와 같이, 추가적인 분석물질을 인코딩하기 위해 확장될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> CALIFORNIA INSTITUTE OF TECHNOLOGY <120> SIGNAL ENCODING AND DECODING IN MULTIPLEXED BIOCHEMICAL ASSAYS <130> 38075-716.601 <140> PCT/US2013/024509 <141> 2013-02-01 <150> 61/703,093 <151> 2012-09-19 <150> 61/594,480 <151> 2012-02-03 <160> 32 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 198 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus 1 <400> 1 ggaagctcta ttagatacag gagcagatga tacagtatta gaagaaatga gtttgccagg 60 aagatggaaa ccaaaaatga tagggggaat tggaggtttt atcaaagtaa gacagtatga 120 tcagatactc atagaaatct gtggacataa agctataggt acagtattag taggacctac 180 acctgtcaac ataattgg 198 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 2 ggaagctcta ttagatacag gagcag 26 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 3 ccaattatgt tgacaggtgt aggtcc 26 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of 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Claims (74)

  1. 고정화, 분리, 질량 분광측정, 또는 용융 곡선 분석 없이 단일 표본 부피에서 임의 조합의 존재 또는 부재 하에 적어도 7개 분석물질 각각의 존재 또는 부재를 모호하지 않게 검출할 수 있는 분석.
  2. 제1항에 있어서, 각각의 상기 분석물질이 시그널의 하나의 성분값으로 인코딩되는 분석.
  3. 제2항에 있어서, 상기 방법이 임의 조합의 존재 또는 부재 하에 M개의 분석물질의 존재 또는 부재를 모호하지 않게 검출할 수 있고, 여기서 M = log2(F + 1)이고, F는 상기 분석물질이 모두 존재할 때 상기 시그널의 하나의 성분의 최대 누적값인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 각각의 상기 분석물질이 상기 시그널의 제1 성분의 적어도 하나의 제1값 및 상기 시그널의 제2 성분의 적어도 하나의 제2값으로 인코딩되는 분석.
  5. 제4항에 있어서, 각각의 상기 분석물질이 상기 시그널의 제2 성분의 복수의 제2값의 각각에서 상기 시그널의 제1 성분의 제1값으로 인코딩되는 분석.
  6. 제4항에 있어서, 상기 방법이 임의 조합의 존재 또는 부재 하에 M개의 분석물질의 존재 또는 부재를 모호하지 않게 검출할 수 있고, 여기서 M = C * log2(F + 1)이고, C는 상기 분석물질을 인코딩하는데 사용되는 상기 제2값의 수이고, F는 상기 분석물질이 모두 존재할 때 임의의 제2값에 대해 상기 시그널의 상기 제1 성분의 최대 누적값인 방법.
  7. 제4항에 있어서, 상기 방법이 임의 조합의 존재 또는 부재 하에 M개의 분석물질의 존재 또는 부재를 모호하지 않게 검출할 수 있고, 여기서 M = (P * T) + 1이고, P는 코딩 방식에서 티어별 코드의 수이고, T는 티어의 수인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 티어의 수 T = log4(F + 1)이고, F는 상기 분석물질이 모두 존재할 때 임의의 제2값에 대해 상기 시그널의 상기 제1 성분의 최대 누적값인 방법.
  9. 제4항에 있어서, 상기 제1값이 강도 또는 강도들의 범위인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 코딩 방식이 적어도 3개의 강도들 또는 강도들의 범위를 포함하는 방법.
  11. 제4항에 있어서, 상기 제2값이 파장 또는 파장들의 범위인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 코딩 방식이 적어도 5개의 파장 또는 파장들의 범위를 포함하는 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 시그널이 전자기적 시그널인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 전자기적 시그널이 형광 방출 시그널인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 형광 방출 시그널의 강도가 적어도 4개의 파장 또는 파장들의 범위에서 측정되는 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 검출이 사용 전 동결건조된 시약과 함께 수행되는 방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 검출이 혼성화 탐침을 포함하는 시약과 함께 수행되는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 혼성화 탐침의 수가 상기 분석물질의 수보다 많은 방법.
  19. 제17항에 있어서, 상기 혼성화 탐침이 상이한 분석물질에 특이적이고 동일한 형광단 또는 형광단들의 조합을 포함하는 하나 이상의 혼성화 탐침을 포함하는 방법.
  20. 제17항에 있어서, 상기 표본이 적어도 18개의 상기 혼성화 탐침과 접촉되는 방법.
  21. 제17항에 있어서, 상기 시약이 적어도 3개의 상기 혼성화 탐침에 상보적인 영역을 증폭할 수 있는 적어도 한 페어의 프라이머를 추가로 포함하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 시그널이 폴리머라아제 연쇄 반응 동안 생성되는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 폴리머라아제 연쇄 반응이 종점 폴리머라아제 연쇄 반응, 실시간 폴리머라아제 연쇄 반응, 및 디지털 폴리머라아제 연쇄 반응으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  24. 제1항에 있어서, 상기 누적 측정이 용액 상에서 수행되는 방법.
  25. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 상기 분석물질이 적어도 하나의 추가적인 값에 의해 인코딩되며, 여기서 상기 적어도 하나의 추가적인 값은 상기 시그널의 적어도 하나의 추가적인 성분값, 추가적인 시그널의 적어도 하나의 성분값, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 적어도 하나의 추가적인 값이 형광 방출 강도, 형광 방출 파장, 포스터 공명 에너지 전달(FRET) 방출 강도, FRET 방출 파장, 전기화학적 시그널, 화학발광 파장, 화학발광 강도, 형광 표백 속도, 화학발광 표백 속도, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  27. 제1항에 있어서, 크로마토그램의 구축을 추가로 포함하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 크로마토그램이 양성 대조군 표본에 대한 상기 제1값 및 상기 제2값의 가능한 모든 조합을 도식화하여 구축되는 방법.
  29. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 상기 분석물질이 폴리뉴클레오티드를 포함하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 동물, 식물, 박테리아, 진균, 기생충, 및 바이러스로 구성된 군으로부터 선택되는 원천에서 유래되는 방법.
  31. 제23항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 인간 면역결핍 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 인간 유두종 바이러스, 말라리아원충, 결핵균, 뎅기 바이러스, 간염 바이러스, 및 인플루엔자 바이러스로 구성된 군으로부터 선택되는 원천에서 유래되는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 인간 면역결핍 바이러스 폴리프로테아제, 인간 면역결핍 바이러스 p17, 인간 유두종 바이러스 E6, 및 인간 유두종 바이러스 E7로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  33. 제1항에 있어서, 상기 표본이 임상 표본, 음식 표본, 환경 표본, 약학 표본 및 소비재 표본으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  34. 제1항에 있어서, 컴퓨터 네트워크를 통한 상기 분석물질의 존재 또는 부재에 관한 정보의 전송을 추가로 포함하는 방법.
  35. 제1항에 있어서, 의사에게 상기 분석물질의 존재 또는 부재에 관한 정보의 제공을 추가로 포함하는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 정보에 근거한 임상적 결정의 수행을 추가로 포함하는 방법.
  37. 제1항에 있어서, 상기 방법의 적어도 하나의 단계가 컴퓨터로 읽을 수 있는 매체 상에서 지침을 이용하여 수행되는 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 지침이 원격 서버 상에 위치하는 방법.
  39. 제37항에 있어서, 상기 지침이 열 싸이클러 상에 위치하는 방법.
  40. 제37항에 있어서, 상기 지침이 열 싸이클러와 통신하는 컴퓨터 상에 위치하는 방법.
  41. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 상기 분석물질이 양성 대조군 분석물질인 방법.
  42. 제1항에 있어서, 상기 코딩 방식이 비-축퇴성인 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 코딩 방식이 비-축퇴성으로 설계된 방법.
  44. 제42항에 있어서, 상기 코딩 방식이 상기 코딩 방식에서 수득될 수 있는 모든 유효 결과의 열거, 축퇴성이 있는 각각의 유효 결과의 확인 및 상기 코딩 방식으로부터 적어도 하나의 잠재적 분석물질 코드를 제거하여 축퇴성을 제거함으로써 비-축퇴성이 되는 방법.
  45. 제1항에 있어서, 상기 분석이 종점 분석인 방법.
  46. 제1항에 있어서, 상기 분석이 기기의 검출 한계에 의해 설정된 사이클의 역치수에서 종료되는 방법.
  47. 제1항에 있어서, 상기 분석이 액상 분석인 방법.
  48. 제1항에 있어서, 상기 분석이 정량적인 방법.
  49. 하기를 포함하는 복수의 분석물질의 각각의 분석물질의 존재 또는 부재의 검출 방법:
    a. 각각의 상기 분석물질을 시그널의 제1값으로 인코딩하여 코딩 방식을 생성하고, 여기서 각각의 상기 분석물질은 상기 코딩 방식에서 상기 제1값에 의해 나타내며, 상기 인코딩은 축퇴성을 제거하는 방식으로 수행되고;
    b. 적어도 하나의 상기 분석물질을 포함하거나 또는 잠재적으로 포함하는 표본을 제공하고;
    c. 각각의 상기 분석물질이 존재할 때, 상기 코딩 방식에서 나타낸 바와 같이 상기 제1값을 생성하는 분석물질-특이적 시약과 상기 표본을 접촉시키고;
    d. 상기 표본 내에서 상기 시그널의 상기 제1값을 누적 측정하여 누적 측정을 제공하고;
    e. 상기 누적 측정 및 상기 코딩 방식에 근거하여 각각의 상기 분석물질이 존재하는지 또는 부재하는지를 결정함.
  50. 제49항에 있어서, 상기 방법이 임의 조합의 존재 또는 부재 하에 M개의 분석물질의 존재 또는 부재를 모호하지 않게 검출할 수 있고, 여기서 M = log2(F + 1)이며 F는 상기 분석물질이 모두 존재할 때 상기 제1값의 최대 누적값인 방법.
  51. 제49항에 있어서, 상기 제1값이 강도 또는 강도들의 범위인 방법.
  52. 제49항에 있어서, 상기 제1값이 적어도 1, 적어도 2, 적어도 4, 적어도 8, 적어도 16, 적어도 32, 및 적어도 64로 구성된 군으로부터 선택되는 상기 코딩 방식에서의 최소값을 갖는 방법.
  53. 제49항에 있어서, 상기 제1값이 상기 선행 제1값의 누적 최대 + 1과 같아지는 양까지 상기 코딩 방식에서 증분되는 방법.
  54. 제49항에 있어서, 상기 제1값이 상기 선행 제1값의 누적 최대 + 1보다 큰 양까지 상기 코딩 방식에서 증분되는 방법.
  55. 하기를 포함하는 복수의 분석물질의 각각의 분석물질의 존재 또는 부재의 검출 방법에 있어서, 각각의 상기 시약이 하나의 제2값만을 생성할 때, 축퇴성이 제거되는 경우 상기 방법은 임의 조합의 존재 또는 부재 하에 단일 부피에서 적어도 6개 분석물질 각각의 존재 또는 부재를 모호하지 않게 검출할 수 있는 방법:
    a. 각각의 상기 분석물질을 적어도 하나의 제1값 및 적어도 하나의 제2값으로 인코딩하여 코딩 방식을 생성하고, 여기서 상기 제1값은 시그널의 제1 성분값이고 상기 제2값은 상기 시그널의 제2 성분값이며, 각각의 상기 분석물질은 상기 코딩 방식에서 상기 적어도 하나의 제1값 및 상기 적어도 하나의 제2값으로 나타내며, 상기 인코딩은 축퇴성을 감소시키거나 제거하는 방식으로 수행되고;
    b. 적어도 하나의 상기 분석물질을 포함하거나 또는 잠재적으로 포함하는 표본을 제공하고;
    c. 각각의 상기 분석물질이 존재할 때, 상기 코딩 방식에서 나타낸 바와 같이 상기 적어도 하나의 제1값 및 적어도 하나의 상기 제2값을 생성하는 분석물질-특이적 시약과 상기 표본을 접촉시키고;
    d. 상기 표본 내에서 상기 제1값 및 상기 제2값을 누적 측정하여 누적 측정을 제공하고;
    e. 상기 누적 측정 및 상기 코딩 방식에 근거하여 각각의 상기 분석물질이 존재하는지 또는 부재하는지를 결정함.
  56. 제55항에 있어서, 각각의 상기 분석물질이 상기 시그널의 제2 성분에서의 복수의 제2값 각각에서 상기 시그널의 제1 성분에서의 제1값으로 인코딩되는 방법.
  57. 제55항에 있어서, 축퇴성이 제거되는 경우, 상기 방법이 4개의 제2값을 이용하여 단일 부피에서 적어도 7개 분석물질 각각의 존재 또는 부재를 모호하지 않게 검출할 수 있는 방법.
  58. 제55항에 있어서, 축퇴성이 제거되는 경우, 상기 코딩 방식이 T개의 비-축퇴성 티어를 포함하며, 여기서 T = log4(F + 1)이고, F는 상기 분석물질이 모두 존재할 때 임의의 제2값에 대한 상기 시그널의 상기 제1 성분의 최대 누적값인 방법.
  59. 제56항에 있어서, 축퇴성이 제거되는 경우, 상기 방법이 임의 조합의 존재 또는 부재 하에 M개의 분석물질의 존재 또는 부재를 모호하지 않게 검출할 수 있고, 여기서 M = (P * T) + 1이고, P는 티어별 코드의 수인 방법.
  60. 제55항에 있어서, 축퇴성이 제거되는 경우, 상기 방법이 임의 조합의 존재 또는 부재 하에 M개의 분석물질의 존재 또는 부재를 모호하지 않게 검출할 수 있고, 여기서 M = C * log2(F + 1)이고, C는 상기 코딩 방식에서 제2값의 수이고, F는 상기 분석물질이 모두 존재할 때 임의의 제2값에 대한 상기 시그널의 상기 제1 성분의 최대 누적값인 방법.
  61. 고정화, 분리, 또는 용융 곡선 분석 없이 단일 표본 부피에서 임의 조합의 존재 또는 부재 하에 적어도 7개 분석물질 각각의 존재 또는 부재를 모호하지 않게 인코딩할 수 있는 비-축퇴성 코딩 방식.
  62. 제61항에 있어서, 상기 코딩 방식이 하기를 포함하는 방법에 의해 생성되는 비-축퇴성 코딩 방식:
    a. 각각의 잠재적 분석물질에 대한 코드를 생성하고, 여기서 각각의 잠재적 분석물질은 적어도 하나의 시그널 성분의 적어도 하나의 값으로 인코딩되며;
    b. 각각의 분석물질의 존재 또는 부재의 가능한 모든 조합에 대해 모든 유효 누적 결과를 열거하고;
    c. 축퇴성이 있는 각각의 유효 결과를 확인하고;
    d. 적어도 하나의 코드를 제거하여 축퇴성을 제거함.
  63. 제62항에 있어서, 상기 시그널의 상기 적어도 하나의 성분에서 모든 이전 코드의 합보다 적어도 하나의 단위가 더 큰 추가적인 코드를 추가하여 상기 코딩 방식을 확장시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  64. 제61항에 있어서, 상기 코딩 방식이 구성상 비-축퇴성을 보장하는 수학적 반복 방법에 의해 생성되는 방법.
  65. 하기를 포함하여, 복수의 분석물질의 각각의 분석물질의 존재 또는 부재의 검출 시스템:
    a. 각각의 상기 분석물질을 시그널의 제1값으로 인코딩하여 코딩 방식을 생성하고, 여기서 각각의 상기 분석물질은 상기 코딩 방식에서 상기 제1값으로 나타내며, 상기 인코딩은 축퇴성을 제거하는 방식으로 수행되고;
    b. 적어도 하나의 상기 분석물질을 포함하거나 또는 잠재적으로 포함하는 표본을 제공하고;
    c. 각각의 상기 분석물질이 존재할 때, 상기 코딩 방식에서 나타낸 바와 같이 상기 제1값을 생성하는 분석물질-특이적 시약과 상기 표본을 접촉시키고;
    d. 상기 표본 내에서 상기 시그널의 상기 제1값을 누적 측정하여 누적 측정을 제공하고;
    e. 상기 누적 측정 및 상기 코딩 방식에 근거하여 각각의 상기 분석물질이 존재하는지 또는 부재하는지를 결정함.
  66. 하기를 포함하여, 복수의 분석물질의 각각의 분석물질의 존재 또는 부재의 검출 시스템에 있어서, 축퇴성이 제거되는 경우 상기 시스템은 각각의 상기 시약이 하나의 제2값만을 생성할 때 임의 조합의 존재 또는 부재 하에 단일 부피에서 적어도 6개 분석물질 각각의 존재 또는 부재를 모호하지 않게 검출할 수 있는 시스템:
    a. 각각의 상기 분석물질을 적어도 하나의 제1값 및 적어도 하나의 제2값으로 인코딩하여 코딩 방식을 생성하고, 여기서 상기 제1값은 시그널의 제1 성분값이고 상기 제2값은 상기 시그널의 제2 성분값이며, 각각의 상기 분석물질은 상기 코딩 방식에서 상기 적어도 하나의 제1값 및 상기 적어도 하나의 제2값으로 나타내며, 상기 인코딩은 축퇴성을 감소시키거나 제거하는 방식으로 수행되고;
    b. 적어도 하나의 상기 분석물질을 포함하거나 또는 잠재적으로 포함하는 표본을 제공하고;
    c. 각각의 상기 분석물질이 존재할 때, 상기 코딩 방식에서 나타낸 바와 같이 상기 적어도 하나의 제1값 및 상기 적어도 하나의 제2값을 생성하는 분석물질-특이적 시약과 상기 표본을 접촉시키고;
    d. 상기 표본 내에서 상기 제1값 및 상기 제2값을 누적 측정하여 누적 측정을 제공하고;
    e. 상기 누적 측정 및 상기 코딩 방식에 근거하여 각각의 상기 분석물질이 존재하는지 또는 부재하는지를 결정함.
  67. 하기를 포함하는, 복수의 분석물질의 각각의 분석물질의 존재 또는 부재의 검출 방법:
    a. 당사자로부터 각각의 상기 분석물질의 정체를 수득하고;
    b. 각각의 상기 분석물질을 시그널의 제1값으로 인코딩하여 코딩 방식을 생성하고, 여기서 각각의 상기 분석물질은 상기 코딩 방식에서 상기 제1값으로 나타내며, 상기 인코딩은 축퇴성을 제거하는 방식으로 수행되고;
    c. 각각의 상기 분석물질이 존재할 때, 상기 코딩 방식에서 나타낸 바와 같이 상기 제1값을 생성하는 분석물질-특이적 시약을 상기 당사자에 제공하고, 상기 당사자는:
    i. 적어도 하나의 상기 분석물질을 포함하거나 또는 잠재적으로 포함하는 표본과 상기 시약을 접촉시키고;
    ii. 상기 표본 내에서 상기 제1값을 누적 측정하여 누적 측정을 제공하고;
    d. 상기 당사자로부터 상기 누적 측정을 수득하고;
    e. 상기 누적 측정 및 상기 코딩 방식에 근거하여 각각의 상기 분석물질이 존재하는지 또는 부재하는지를 결정하고;
    f. 각각의 상기 분석물질의 존재 또는 부재에 대한 정보를 상기 당사자에게 제공함.
  68. 하기를 포함하는, 복수의 분석물질의 각각의 분석물질의 존재 또는 부재의 검출 방법:
    g. 당사자로부터 각각의 상기 분석물질의 정체를 수득하고;
    h. 각각의 상기 분석물질을 적어도 하나의 제1값 및 적어도 하나의 제2값으로 인코딩하여 코딩 방식을 생성하고, 여기서 상기 제1값은 시그널의 제1 성분값이고 상기 제2값은 상기 시그널의 제2 성분값이며, 각각의 상기 분석물질은 상기 코딩 방식에서 상기 적어도 하나의 제1값 및 상기 적어도 하나의 제2값으로 나타내고, 상기 인코딩은 축퇴성을 감소시키거나 제거하는 방식으로 수행되며;
    i. 각각의 상기 분석물질이 존재할 때, 상기 코딩 방식에서 나타낸 바와 같이 상기 적어도 하나의 제1값 및 상기 적어도 하나의 제2값을 생성하는 분석물질-특이적 시약을 상기 당사자에 제공하고, 상기 당사자는:
    i. 적어도 하나의 상기 분석물질을 포함하거나 또는 잠재적으로 포함하는 표본과 상기 시약을 접촉시키고; 및
    ii. 상기 표본 내에서 상기 제1값 및 상기 제2값을 누적 측정하여 누적 측정을 제공하고;
    j. 상기 당사자로부터 상기 누적 측정을 수득하고;
    k. 상기 누적 측정 및 상기 코딩 방식에 근거하여 각각의 상기 분석물질이 존재하는지 또는 부재하는지를 결정하고;
    l. 각각의 상기 분석물질의 존재 또는 부재에 대한 정보를 상기 당사자에게 제공함.
  69. 분석물질-특이적 시약을 포함하고 각각의 시약이 제1값을 포함하는 시그널을 생성하는, 복수의 분석물질의 각각의 분석물질의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 조성물에 있어서, 상기 시약은 고정화, 분리, 또는 용융 곡선 분석 없이 임의 조합의 존재 또는 부재 하에 단일 표본 부피에서 적어도 7개 분석물질 각각의 존재 또는 부재를 모호하지 않게 검출할 수 있는 조성물.
  70. 분석물질-특이적 시약을 포함하고 각각의 시약이 상기 시그널의 제1 성분값인 적어도 하나의 제1값 및 상기 시그널의 제2 성분값인 적어도 하나의 제2값을 포함하는 시그널을 생성하는, 복수의 분석물질의 각각의 분석물질의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 조성물에 있어서, 상기 시약은 각각의 상기 시약이 하나의 제2값만을 생성할 때 임의 조합의 존재 또는 부재 하에 단일 부피에서 적어도 6개 분석물질 각각의 존재 또는 부재를 검출할 수 있는 조성물.
  71. 분석물질-특이적 시약, 패키징 및 지침을 포함하고 각각의 시약이 제1값을 포함하는 시그널을 생성하는, 복수의 분석물질의 각각의 분석물질의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 키트에 있어서, 상기 키트는 고정화, 분리, 또는 용융 곡선 분석 없이 임의 조합의 존재 또는 부재 하에 단일 표본 부피에서 적어도 7개 분석물질 각각의 존재 또는 부재를 모호하지 않게 검출할 수 있는 키트.
  72. 분석물질-특이적 시약, 패키징 및 지침을 포함하고 각각의 시약이 상기 시그널의 제1 성분값인 적어도 하나의 제1값 및 상기 시그널의 제2 성분값인 적어도 하나의 제2값을 포함하는 시그널을 생성하는, 복수의 분석물질의 각각의 분석물질의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 키트에 있어서, 상기 키트는 각각의 상기 시약이 하나의 제2값만을 생성할 때 임의 조합의 존재 또는 부재 하에 단일 부피에서 적어도 6개 분석물질 각각의 존재 또는 부재를 검출할 수 있는 키트.
  73. 키트 본체(601), 병을 배치하기 위해 키트 본체에 배열된 클램핑 슬롯, 분석물질 검출용 탐침을 포함하는 병(602), 증폭용 프라이머를 포함하는 병(603), 및 증폭용 시약을 포함하는 병(604)을 포함하는 복수의 분석물질의 각각의 분석물질의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 키트에 있어서, 상기 키트는 고정화, 분리, 또는 용융 곡선 분석 없이 임의 조합의 존재 또는 부재 하에 단일 표본 부피에서 적어도 7개 분석물질 각각의 존재 또는 부재를 모호하지 않게 검출할 수 있는 키트.
  74. 키트 본체(601), 병을 배치하기 위해 키트 본체에 배열된 클램핑 슬롯, 분석물질 검출용 탐침을 포함하는 병(602), 증폭용 프라이머를 포함하는 병(603), 및 증폭용 시약을 포함하는 병(604)을 포함하고 각각의 탐침이 상기 시그널의 제1 성분값인 적어도 하나의 제1값 및 상기 시그널의 제2 성분값인 적어도 하나의 제2값을 포함하는 시그널을 생성하는, 복수의 분석물질의 각각의 분석물질의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 키트에 있어서, 상기 키트는 각각의 상기 탐침이 하나의 제2값만을 생성할 때 임의 조합의 존재 또는 부재 하에 단일 부피에서 적어도 6개 분석물질 각각의 존재 또는 부재를 검출할 수 있는 키트.
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