CN107326085A

CN107326085A - 多路生化测定中信号的编码和解码

Info

Publication number: CN107326085A
Application number: CN201710674587.8A
Authority: CN
Inventors: 埃米尔·P·卡尔塔洛夫; 阿迪蒂亚·拉贾戈帕; 阿克塞尔·谢勒
Original assignee: California Institute of Technology CalTech
Current assignee: California Institute of Technology CalTech
Priority date: 2012-02-03
Filing date: 2013-02-01
Publication date: 2017-11-07
Anticipated expiration: 2033-02-01
Also published as: BR112014019168A8; US20210012860A1; KR20140127282A; US8838394B2; EP2809813A4; CN107326085B; EP2809813B1; US11827921B2; US20240018573A1; KR20180121656A; US11866768B2; BR112014019168A2; WO2013116780A1; EP4361609A2; US20240093273A1; EP4361606A2; JP6255353B2; US20210098076A1; US20230086246A1; US20130323716A1

Abstract

本公开提供了用于样品中的多个分析物的多路检测的方法、系统、组合物、和试剂盒。在一些实例中，本公开提供了方法、系统、组合物、和试剂盒，其中，可在单个样品体积中通过获得信号的至少一个可计量的分量的累积测量或多个累积测量来检测多个分析物。在一些情况下，信号的额外分量、或额外的信号(或其分量)也被定量。每个信号或信号的每个分量可被用于构建编码方案，然后所述编码方案可用于确定任何分析物的存在或不存在。

Description

多路生化测定中信号的编码和解码

本申请是申请日为2013年2月1日，申请号为201380018760.9，发明名称为“多路生化测定中信号的编码和解码”的申请的分案申请。

交叉引用

本申请要求2012年2月3日提交的美国临时申请61/594,480,及2012年9月19日提交的美国临时申请61/703,093的利益，其各自通过引用其全文并入本文。

序列表

本即时申请包含经由EFS-网页以ASCII格式提交的序列表，且通过引用将其全文并入本文。所述ASCII副本，建立于2013年2月14日，被命名为38075-716.601_SL.txt，且大小为9,240字节。

技术领域

本发明涉及多路生化测定中信号的编码和解码。

背景技术

相比传统的单路反应，多路反应提供了显著的优点，包括在相同样品上执行并行的多个反应，使用相同的室执行更多个反应，以及以快速且有效的方式从样品中提取丰富信息的能力。然而，为了实现这些优点，多路测定通常需要复杂的报告机制，即光谱上可分辨的荧光或化学发光(例如，PCR、ELISA)、空间上可分辨的信号(例如，微阵列、凝胶电泳)、时间上可分辨的信号(例如，毛细管电泳)或其组合(例如，Sanger测序)。

发明内容

对可以在单一的溶液中执行的多路反应是有需求的。

本公开提供了用于分析物的多路检测的方法、组合物、系统和试剂盒。在一些情况下，本公开提供测定，所述测定能够不执行固定化(immobilization)、分离、质谱法、或解链(melting)曲线分析而明确地检测单一样品体积中的、以存在或不存在的任意组合形式的至少7种分析物中的每种分析物的存在或不存在。在一些实例中，每种分析物被编码为信号的一个(或至少一个)分量的值。

在一些实例中，本公开提供的测定能够明确地检测以存在或不存在的任意组合形式的、M种分析物的存在或不存在，其中M＝log₂(F+1)，且F是当所有分析物存在时的信号的一个分量(例如，强度)的最大累积值。

在一些情况下，每种分析物被编码为信号的第一分量中的至少一个第一值(例如，至少一个强度或强度范围)和信号的第二分量中的至少一个第二值(例如，至少一个波长或波长范围)。在一些实例中，每种分析物被编码为在信号的第二分量中的多个第二值中的每个第二值的信号的第一分量中的第一值(例如，在多个波长或多个波长范围中的每个波长或每个波长范围的信号强度或信号强度范围)。

在一些实例中，本文提供的测定能够明确地检测以存在或不存在的任意组合形式的、M种分析物的存在或不存在，其中M＝C*log₂(F+1)，其中C是用于编码分析物的第二值的数目，且F是在所有分析物存在时的、关于任意第二值的信号的第一分量的最大累积值。

在一些情况下，本公开提供的测定能够明确地检测以存在或不存在的任意组合形式的、M种分析物的存在或不存在，其中M＝(P*T)+1，其中P是编码方案中每层代码的数目，且T是层的数目。在一些情况下，层的数目T＝log₄(F+1)，且F是在所有分析物存在时的、关于任意第二值的信号的第一分量的最大累积值。

在一些实例中，第一值是强度或强度范围。在一些情况下，编码方案包括至少三个强度或强度范围。

在一些情况下，第二值是波长或波长范围。在一些实例中，编码方案包括至少五个波长或波长范围。

在一些实施例中，信号是电磁信号。在一些情况下，电磁信号是荧光发射信号。在一些实施例中，测量了在至少四个波长或波长范围处的荧光发射信号的强度。

在一些情况下，本文提供的测定利用在使用之前被冻干的试剂执行。

在一些情况下，利用包括杂交探针的试剂执行检测步骤。在一些实例中，杂交探针的数目大于分析物的数目。在一些情况下，杂交探针组包括专门用于不同分析物的一个或更多个杂交探针，且包括相同的荧光团或荧光团的组合。在一些实例中，样品与至少18个所述杂交探针接触。在一些实例中，利用包括至少一对引物的试剂执行检测步骤。在一些情况下，至少一对引物能够扩增与至少三个所述杂交探针互补的区域。

在一些实例中，在聚合酶链式反应期间产生被测量的信号。在一些情况下，聚合酶链式反应选自以下所构成的组：终点(end-point)聚合酶链式反应、实时聚合酶链式反应、数字聚合酶链式反应、及其组合。

在一些实例中，针对溶液执行至少一个累积测量。

在一些实例中，至少一种分析物是通过至少一个额外的值(即，至少两个值一起)编码的，其中，至少一个额外的值选自以下所构成的组：来自信号的至少一个额外的分量的值，来自不同的信号的至少一个分量的值，及其组合。例如，至少一个额外的值可选自以下所构成的组：荧光发射强度、荧光发射波长、共振能量转移(FRET)发射强度、FRET发射波长、电化学信号、化学发光波长、化学发光强度、荧光漂白率、化学发光漂白率、及其组合。

在一些情况下，色谱被构建。通过绘制每个分析物的阳性对照(positivecontrol)样品的第一值和第二值的所有可能的组合可构建色谱。

在一些实例中，至少一个分析物包括多核苷酸。在一些情况下，多核苷酸来自选自以下所构成的组的来源：动物、植物、细菌、真菌、寄生物和病毒。在一些实例中，多核苷酸来自选自以下所构成的组的来源：人类免疫缺陷病毒、单纯性疱疹病毒、人类乳头瘤病毒、疟原虫、分枝杆菌、登革热病毒、肝炎病毒和流感病毒。在一些情况下，多核苷酸选自以下所构成的组；人类免疫缺陷病毒多蛋白酶(polyprotease)、人类免疫缺陷病毒p17、人类乳头瘤病毒E6、及人类乳头瘤病毒E7。

在一些情况下，样品选自以下所构成的组：临床样品、食品样品、环境样品、药物样品、及来自消费产品的样品。

在一些实例中，关于分析物存在或不存在的信息通过计算机网络传输。

在一些情况下，向医生提供关于分析物存在或不存在的信息。在一些实例中，临床决定是基于此类信息做出的。

在一些实例中，本文提供的方法的至少一个步骤是使用计算机可读介质上的指令执行的。在一些情况下，指令位于远程服务器上。在一些实例中，指令位于热循环仪上。在一些情况下，指令位于与热循环仪通信的计算机上。

在一些情况下，至少一个分析物是阳性对照分析物。

在一些实例中，编码方案是非简并的。在一些情况下，编码方案被设计为非简并的。在一些实例中，通过枚举可以从编码方案获得的每个合理的结果、鉴定是简并的每个合理的结果、并消除来自编码方案的至少一个潜在的分析物代码以消除简并性，编码方案被做成非简并的。

在一些情况下，本文提供的测定是终点测定。在一些实例中，本公开提供的测定在通过仪器的检测极限设定的循环的阈值数结束。

在一些实例中，本文提供的测定是液相测定。

在一些情况下，本文提供的测定是定量的。

在一些情况下，本公开提供了检测多个分析物中的每个分析物存在或不存在的方法，所述方法包括：(a)将每个所述分析物编码为信号的第一值，由此产生编码方案，其中每个所述分析物在所述编码方案中由所述第一值表示，其中所述编码是以消除简并性的方式执行的；(b)提供包括或可能包括至少一个所述分析物的样品；(c)将所述样品与如所述编码方案中表示的在每个所述分析物存在时产生所述第一值的分析物特异性试剂接触；(d)累积地测量所述样品中所述信号的所述第一值，从而提供累积测量结果；及(e)基于所述累积测量结果和所述编码方案，确定每个所述分析物是存在还是不存在。

在一些实例中，在先前段落描述的方法能够明确地检测以存在或不存在的任意组合的M种分析物的存在或不存在，其中M＝log₂(F+1)，且F是当所有分析物存在时的第一值的最大累积值。在一些情况下，第一值是强度或强度范围。在一些实例中，第一值具有在编码方案中的最小值，所述最小值选自以下所构成的组：至少1、至少2、至少4、至少8、至少16、至少32和至少64。在一些情况下，第一值通过等于所述先前第一值的累积最大值的加一的量在编码方案中增加。在其它情况下，第一值通过大于先前第一值的累积最大值加一的量在编码方案中增加。

在一些情况下，本公开提供了检测多个分析物中的每个分析物存在或不存在的方法，所述方法包括：(a)以至少一个第一值和至少一个第二值编码每个所述分析物，其中所述第一值是来自信号的第一分量的值且所述第二值是来自所述信号的第二分量的值，从而产生编码方案，其中每个所述分析物在所述编码方案中通过所述至少一个第一值和所述至少一个第二值表示，其中所述编码以减少或消除简并性的方式执行；(b)提供包括或可能包括至少一种所述分析物的样品；(c)将所述样品与所述编码方案中表示的在每个所述分析物存在时产生所述至少一个第一值和至少一个所述第二值的分析物特异性试剂接触；(d)累积地测量所述样品中的所述第一值和所述第二值，从而提供累积测量结果；及(e)基于所述累积测量结果和所述编码方案，确定每个所述分析物是存在还是不存在，其中，当简并性被消除时，在每个所述试剂仅产生一个第二值时，所述方法能够明确地检测单一体积中的、以存在或不存在的任意组合形式的、至少6个分析物的每个分析物的存在或不存在。

在一些情况下，在先前段落描述的方法中的每个分析物被编码为在信号的第二分量中的多个第二值中的每个第二值的信号的第一分量中的第一值。在一些情况下，当简并性被消除时，该方法使用4个第二值能够明确地检测单一体积中的至少7个分析物中的每个分析物的存在或不存在。在一些实例中，当简并性被消除时，编码方案包括T个非简并层，其中T＝log₄(F+1)，且F是当所有分析物存在时，关于任意第二值的信号的第一分量的最大累积值。在一些情况下，当简并性被消除时，方法能够明确地检测以存在或不存在的任意组合形式的、M种分析物的存在或不存在，其中M＝(P*T)+1，且P是每层代码的数目。在一些实例中，当简并性被消除时，方法能够明确地检测以存在或不存在的任意组合形式的、M种分析物的存在或不存在，其中M＝C*log₂(F+1)，C是编码方案中第二值的数目，且F是当所有分析物存在时，关于任意第二值的信号的第一分量的最大累积值。

本公开还提供了非简并编码方案，所述非简并编码方案能够不执行固定化、分离、质谱法、或解链曲线分析而明确地编码单一样品体积中的、以存在或不存在的任意组合的至少7个分析物中的每个分析物的存在或不存在。

在一些实例中，本公开的非简并编码方案是通过包括以下步骤的方法产生的：(a)产生用于每个潜在分析物的代码，其中每个潜在的分析物通过信号的至少一个分量的至少一个值编码；(b)枚举对存在或不存在的每个分析物的所有可能组合的每个合理的累积结果；(c)鉴定每个合理的简并的结果；及(d)消除至少一个代码，以消除简并性。在一些情况下，编码方案可通过增加额外的代码扩大，所述额外的编码比所述信号的至少一种分量中的所有先前的代码的总和大至少一个单位。在一些情况下，编码方案通过由结构保证非简并性的数学迭代的方法产生。

在一些情况下，本公开提供了用于检测多个分析物中的每个分析物存在或不存在的系统，所述系统包括：(a)编码每个所述分析物为信号的第一值，由此产生编码方案，其中每个所述分析物在所述的编码方案中由所述第一值表示，其中所述编码是以消除简并性的方式执行的；(b)提供包括或可能包括至少一个所述分析物的样品；(c)将所述样品与如在所述编码方案中表示的、当每个所述分析物存在时产生所述第一值的分析物特异性试剂接触；(d)累积地在所述样品中测量所述信号的所述第一值，从而提供累积测量结果；及(e)基于所述累积测量结果和所述编码方案，确定每个所述分析物是存在还是不存在。

在一些情况下，本公开提供了用于检测多个分析物中的每个分析物存在或不存在的系统，所述系统包括：(a)以至少一个第一值和至少一个第二值编码每个所述分析物，其中所述第一值是来自信号的第一分量的值且所述第二值是来自所述信号的第二分量的值，从而产生编码方案，其中每个所述分析物在所述编码方案中通过所述至少一个第一值和所述至少一个第二值表示，其中所述编码以减少或消除简并性的方式执行；(b)提供包括或可能包括至少一种所述分析物的样品；(c)将所述样品与在所述编码方案中表示的、当每个所述分析物存在时产生所述至少一个第一值和所述至少一个第二值的分析物特异性试剂接触；(d)累积地测量所述样品中的所述第一值和所述第二值，从而提供累积测量结果；及(e)基于所述累积测量结果和所述编码方案，确定每个所述分析物是存在还是不存在，其中，当简并性被消除时，在每个所述试剂仅产生一个第二值时，所述方法能够明确地检测在单一体积中的、以存在或不存在的任意组合形式的、至少6个分析物的每个分析物的存在或不存在。

在一些情况下，本公开提供了用于第三团体的检测多个分析物中的每个分析物存在或不存在的方法，所述方法包括：(a)从团体获得每个所述分析物的标识；(b)将每个所述分析物编码为信号的第一值，由此产生编码方案，其中每个所述分析物在所述的编码方案中由所述第一值表示，其中所述编码以消除简并性的方式执行；(c)向所述团体提供如在所述编码方案中表示的、当每个所述分析物存在时产生所述第一值的分析物特异性试剂，所述团体：(i)将包括或可能包括至少一个所述分析物的样品与所述试剂接触；及(ii)累积地测量所述样品中的所述第一值，从而提供累积测量结果；及(d)从所述团体获得所述累积测量结果；(e)基于所述累积测量结果和所述编码方案，确定每个所述分析物是存在还是不存在；及(f)将关于每个所述分析物存在或不存在的信息提供给所述团体。

在一些情况下，本公开提供了用于第三团体的检测多个分析物中的每个分析物存在或不存在的方法，所述方法包括：(a)从团体获得每个所述分析物的标识；(b)将每个所述分析物编码为至少一个第一值和至少一个第二值，其中，所述第一值是来自信号的第一分量的值，且所述第二值是来自所述信号的第二分量的值，由此产生编码方案，其中每个所述分析物在所述的编码方案中由所述至少一个第一值和所述至少一个第二值表示，其中所述编码以减少或者消除简并性的方式执行；(c)向所述团体提供如所述编码方案中表示的在每个所述分析物存在时产生所述至少一个第一值和所述至少一个第二值的分析物特异性试剂，所述团体：(i)将包括或可能包括至少一个所述分析物的样品与所述试剂接触；及(ii)累积地测量所述样品中所述第一值及所述第二值，从而提供累积测量结果；及(d)从所述团体获得所述累积测量结果；(e)基于所述累积测量结果和所述编码方案，确定每个所述分析物是存在还是不存在；及(f)将关于每个所述分析物存在或不存在的信息提供给所述团体。

在一些情况下,本公开提供了用于检测多个分析物中的每个分析物的存在或不存在的组合物，所述组合物包括分析物特异性试剂，每个试剂产生包括第一值的信号，其中所述试剂能够在不执行固定化、分离、质谱法、或解链曲线分析的情况下，明确地检测单一样品体积中的、以存在或不存在的任意组合形式的、至少7个分析物的每个分析物的存在或不存在。

在一些情况下，本公开提供了用于检测多个分析物中的每个分析物的存在或不存在的组合物，所述组合物包括分析物特异性试剂，每个试剂产生包括至少一个第一值和至少一个第二值的信号，所述至少一个第一值是来自所述信号的第一分量的值且所述至少一个第二值是来自所述信号的第二分量的值，其中，当每个所述试剂仅产生一个第二值时，所述试剂能够检测在单一体积中的、以存在或不存在的任意组合形式的、至少6个分析物的每个分析物的存在或不存在。

在一些情况下，本公开提供了用于检测多个分析物中的每个分析物的存在或不存在的试剂盒，所述试剂盒包括分析物特异性试剂、包装、及说明书，每个试剂产生包括第一值的信号，其中所述试剂盒能够在不执行固定化、分离、质谱法、或解链曲线分析的情况下，明确地检测单一样品体积中的、以存在或不存在的任意组合形式的、至少7个分析物的每个分析物的存在或不存在。

在一些实例中，本公开提供了用于检测多个分析物中的每个分析物的存在或不存在的试剂盒，所述试剂盒包括分析物特异性试剂、包装、及说明书，每个试剂产生包括至少一个第一值和至少一个第二值的信号，所述至少一个第一值是来自所述信号的第一分量的值且所述至少一个第二值是来自所述信号的第二分量的值，其中，当每个所述试剂仅产生一个第二值时，所述试剂盒能够检测在单一体积中的、以存在或不存在的任意组合形式的、至少6个分析物中的每个分析物的存在或不存在。

在一些情况下，本公开提供了用于检测多个分析物中的每个分析物存在或不存在的试剂盒，所述试剂盒包括盒体601、布置在盒体中用于放置瓶的卡接槽口、包括用于分析物的检测的探针的瓶602、包括用于扩增的引物的瓶603、及包括用于扩增的试剂的瓶604、其中，所述试剂盒能够在不执行固定化、分离、质谱法、或解链曲线分析的情况下，明确地检测单一样品体积中的、以存在或不存在的任意组合形式的至少7个分析物中的每个分析物的存在或不存在。

在一些实例中，本公开提供了用于检测多个分析物中的每个分析物存在或不存在的试剂盒，包括：盒体601、布置在盒体中用于放置瓶的卡接槽口、包括用于分析物的检测的探针的瓶602、包括用于扩增的引物的瓶603、及包括用于扩增的试剂的瓶604，每个探针产生包括至少一个第一值和至少一个第二值的信号，所述至少一个第一值是来自所述信号的第一分量的值且所述至少一个第二值是来自所述信号的第二分量的值，其中，当每个所述探针仅产生一个第二值时，所述试剂盒能够检测在单一体积中的、以存在或不存在的任意组合形式的至少6个分析物中的每个分析物的存在或不存在。

引用并入

在本说明书中提到的所有的出版物和专利申请在此通过引用以相同程度并入，如同每个单独的出版物或专利申请被具体地和单独地表明通过引用并入。

附图说明

本发明的新颖特征在所附权利要求书中特别陈述。将通过参考以下的详细描述的说明性实施方案的陈述获得对本发明的特征和优点更好地理解，其中本发明的原理被利用，且其中的附图是：

图1显示了以四个颜色检测四个分析物的传统的编码方法，及以四个颜色能够检测16个或更多个序列的本发明的编码方法之间的比较。颜色由B、G、Y和R指示，其分别指示蓝色、绿色、黄色和红色。

图2显示了表示以四个颜色对6个分析物(包括对照)检测的示意图。使用连接到荧光团(B、G、Y、R；分别为蓝色、绿色、黄色和红色)和猝灭剂(标有“X”的椭圆形)的杂交探针检测分析物。对照序列和五个其它序列(登革热＝登革热病毒；结核病＝结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)；P17＝HIV p17；疟疾＝恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)；和疱疹＝单纯性疱疹病毒2)均使用标有蓝色荧光团的探针检测。每个非对照分析物分别使用1-3个额外的探针检测。例如，登革热病毒的分析物使用三个具有绿色、黄色和红色荧光团的额外的探针检测；单纯性疱疹病毒2的分析物使用具有红色荧光团的额外的探针检测；等等。

图3显示了如实施例2中描述得到的实验结果的色谱。

图4显示了本发明的示例性的实施方案，其中使用计算机执行本文提供的方法的一个或更多个步骤。

图5显示了检测光信号，例如荧光发射信号的波长和强度的两个不同的方法的示意图。

图6显示了示例性的试剂盒的示意图。

图7显示了如实施例3中描述得到的实验结果的色谱。

图8显示了合理的结果(上图)和不合理的结果(下图)的示意图。

具体实施方式

由于几个理想的特性，包括与生化测定的相容性、荧光标记相对小的尺寸、缀合感兴趣的分子的简单的手段、可负担性、低毒性、稳定性、鲁棒性、利用廉价光学系统的可检测性、及与空间阵列相结合的能力，荧光检测已经是多路测定优选的技术。然而，标准的荧光具有广泛的发射光谱。因此，为了避免光谱重叠(即，为了保持光谱分辨率)仅相对少量数目的颜色(例如，4至6种)通常在多路荧光测定中同时使用。

多路荧光测定的传统编码方法一直以单一的颜色编码每个分析物；即，M＝N，其中M是可检测的分析物的数目，且N是光谱可分辨的荧光探针的数目。每当需要更高的多路因子时(即，M>N)，荧光通常结合其它技术技术，如等分、空间阵列、或顺序处理。这些额外的处理步骤是劳动密集的，并经常需要相对昂贵和复杂的光学和机械系统(例如，光谱仪、机械化显微镜镜台、微流体、液滴生成器、扫描仪、及类似系统)。这种系统在某些环境中配置往往是不切实际的，特别是定点护理(point-of care)和低资源设置。因此，对可提供廉价的多路的手段，同时避免使用昂贵的额外的处理步骤的多路编码和解码方法有显著需求。

本公开提供了用于样品中的多个分析物的检测的方法、系统、组合物和试剂盒。本文呈现了基于编码、分析和解码方法对分析物进行检测。在一些实例中，待检测的每个分析物被编码为信号(例如，强度)的值，其中值被分配，使得测定的结果明确地指示被测定的分析物存在或不存在。在其它实例中，待检测的每个分析物被编码为在信号的至少两个分量(例如，强度和波长)的每个中的值。信号的至少两个分量可以是正交的。类似地，如本公开中在其他地方更全面地描述的，可以使用多个正交信号，例如荧光信号和电化学信号的组合。分析物可以是任何合适的分析物，例如多核苷酸、蛋白质、小分子、脂质、碳水化合物、或其混合物。信号可以是任何合适的信号，例如电磁信号、光信号、荧光发射信号、电化学信号、化学发光信号、及其组合。信号的至少两个分量可以是任何合适的两个分量，例如振幅和频率，或强度和波长。

编码分析物之后，样品被提供，其中样品包括或可包括编码的分析物中的至少一个。样品与在编码方案中对每个分析物指定的在分析物存在时、产生特定的信号的、一个或多个分析物特异性试剂接触。试剂可以是任何合适的试剂，其能够在其相应的分析物存在时产生这样的信号，例如，连接到荧光团和猝灭剂的寡核苷酸探针(例如，TAQMAN探针)。如果试剂是连接到荧光团和猝灭剂的寡核苷酸探针，可执行产生信号的核酸扩增。

添加试剂后，信号被定量。在一些情况下，通过测量信号的一个分量(例如，荧光强度)，及基于用于编码每种分析物的存在的值、及信号的累积值，确定某些分析物存在和不存在，执行这种定量。

在一些情况下，对样品累积地测量信号的至少两个分量(例如，强度和波长)。例如，这种测量可以通过测量在特定波长的强度，或特定波长范围内的强度执行。然后可以基于信号的至少两个分量中的每个分量的值与用于编码分析物的存在的值(即，在编码方案中的那些值)确定分析物的存在或不存在。

编码可以以减少或消除通过该方法获得的可能的简并(例如，不明确的)结果的数目的方式执行。如本说明书中其他地方所描述的，特定编码方案的完整编码能力可被枚举，且某些潜在的分析物代码可从编码方案消除，以减少或消除简并性。同样地，编码方案可被设计成非简并的，使得简并性的减少或消除是没有必要的。可以构建解码矩阵以对应于累积信号测量结果的构成信号，将累积信号测量结果(例如，强度或在特定波长的强度)解释为某些分析物存在或不存在。

I.定义

本文所用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不旨在限制。

如本文所用，单数形式的“一(a)”、“一(an)”、和“该(the)”除非上下文另有明确地指示，也旨在包括复数形式。此外，针对术语“包括(including)”、“包括(includes)”、“具有(having)”、“具有(has)”、“有(with)”、“例如(such as)”、或其变体的范围，在说明书和/或权利要求书中使用时，这些术语不是限制的，且旨在以类似术语“包括(comprising)”的方式被包括。

如本文所用的术语“约”，一般是指比特定用法的上下文中规定的数值增加15％或减少15％的范围。例如，“约10”将包括从8.5到11.5的范围。

如本文所用的术语“维”和“分量”，当涉及信号时，一般是指可被定量的信号的方面。例如，如果是由荧光分子产生的信号，其可以依据其波长(例如，第一维或第一分量)及其强度(例如，第二维或第二分量)被量化。

如本文所用的术语“解码”，一般是指确定哪个分析物存在的方法，其基于累积信号和能够将累积信号转换为关于一个或更多个分析物存在或不存在的信息的编码方案或解码矩阵。

如本文所用的术语“编码”，一般是指表示分析物的处理，使用包括信号的值(例如强度)、或在一个信号或多个信号的至少两个分量中的每个分量的值(如波长和强度)的代码。

术语“连接到荧光团和猝灭剂的寡核苷酸探针”和“TAQMAN探针”通常是指在多核苷酸扩增测定中用于检测分析物存在的水解探针。这些探针包括连接到荧光团和猝灭剂的寡核苷酸探针。只要猝灭剂和荧光团接近，猝灭剂就会猝灭由光源激发荧光团所发射的荧光。寡核苷酸探针的序列被设计为互补于分析物中存在的多核苷酸序列，并因此，能够与分析物中存在的多核苷酸序列杂交。寡核苷酸探针的杂交在包括引物的核酸扩增反应(例如，聚合酶链式反应)中执行。通过DNA聚合酶延伸引物后，聚合酶的5'至3'外切酶活性降解探针，释放荧光团和猝灭剂至介质中。荧光团和猝灭剂之间的接近被破坏，且来自荧光团的信号不再猝灭。因此，检测到的荧光的量是分析物存在的量的函数。如果没有分析物存在，探针将不与分析物杂交，且荧光团和猝灭剂将保持极为接近。很少信号或没有信号会产生。

如本文所用的术语“正交”，一般是指可以独立地或近似独立地改变的信号的至少两个分量(如，波长和强度)，或至少两个不同的信号(如，荧光发射信号和电化学信号)。例如，当使用荧光分子时，波长和强度被认为是正交的或近似正交的。除其它因素外，荧光发射的波长将取决于荧光分子的组合物，并且荧光的强度将取决于存在的分子的量。虽然波长和强度是可以近似独立地被改变的信号的两个分量的实例，但是本文描述的方法不限于可以独立地或近似独立地被改变的分量。也可以使用非独立地改变的信号的分量、或多个信号，只要足够良好地确定分量或信号的特征，以能够编码、测量和解码。例如，如果一个分量或信号中的变化影响另一个分量或信号中的变化，只要理解变化之间的关系，仍可以使用这两个分量或信号。

如本文所用的术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、或“核酸”，在本文中用于指包括多个核苷酸的生物分子。示例性的多核苷酸包括脱氧核糖核酸、核糖核酸、及其合成的类似物，包括肽核酸。

如本文所用的术语“探针”一般是指在特定的分析物存在下能够产生信号的试剂。探针通常具有至少两个部分：能够特异性识别分析物，或其一部分的部分；及能够在分析物，或其一部分存在下，产生信号的部分。如上文和本公开中其他地方描述的，探针可以是连接到荧光团和猝灭剂的寡核苷酸探针。探针还可以是在分析物存在下，产生信号的任何试剂，如检测分析物的抗体，具有因抗体结合至分析物而发射或被猝灭的荧光标记。任何合适的探针可以以本公开中提出的方法使用，只要探针在分析物存在下产生可定量的信号。例如，探针的分析物特异性部分可以与酶耦合，在分析物存在下，所述酶转化不带电荷的底物为带电荷的产物，从而随着时间的推移提高了介质中的导电率。在此情况下，不同的分析物可以以不同比例通过耦合探针(如杂交探针或抗体)的分析物特异性部分至酶被编码。介质中增加的导电率的产生速率将对介质中存在的所有分析物累积。根据本文提供的方法，编码分析物能够将导电率测量结果转换为明确的(即，非简并的)的结果，提供了关于特定分析物存在或不存在的信息。类似地，探针可包括从底物产生化学发光产物的酶。化学发光的量可随后被用于编码特定分析物的存在。

II.编码和解码方法

A.传统荧光编码和解码方法

确定分析物存在的常用的方法是使用4个光谱可分辨的荧光分子指示四个分析物的存在或不存在。图1的左手侧表示了这种方法的实例。图1的左手侧显示了编码方法，其中四个分析物(序列1、序列2、序列3和序列4)每个分别由单一颜色(分别为蓝色、绿色、黄色和红色)编码。颜色表示连接到还包括猝灭剂的寡核苷酸探针的荧光团。在图1的左手侧所示的系统中，有四种不同的寡核苷酸探针，每种包括单一的荧光团(蓝色、绿色、黄色、或红色)和猝灭剂。分析物的存在或不存在是基于在特定的颜色中信号的存在或不存在确定的。

图1的左手侧的图表显示了包含两个分析物：序列1和序列3，的假定样品的强度对颜色。这些分析物的存在是基于蓝色信号(对应于序列1)和黄色信号(对应于序列3)的测量结果确定的。不存在序列2和序列4是通过不存在绿色和红色信号指示的。

表1显示了这种编码方案的二进制格式的解释。每个分析物被编码为在荧光信号的两个分量中的每个分量的值：(1)颜色(也称为波长；或波长范围)和(2)的强度(由表中的数字指示)。例如，A(例如，序列1)具有蓝色的颜色和1的强度；B(例如，序列2)具有绿色的颜色和1的强度；等等。如本文所述的定量每个颜色范围内的信号的强度，例如，通过测量由带通滤波器确定的特定波长范围内的信号的强度。1000的结果指示仅分析物A存在；1100结果指示分析物A和B存在；等等。

表1.具有四个探针的四个分析物的传统编码，每个探针具有单一颜色，且每个分析物一个探针。

	蓝色	绿色	黄色	红色
					A	1	0	0	0
B	0	1	0	0
					C	0	0	1	0
D	0	0	0	1

B.每种分析物使用一种以上的颜色的编码方法

上文描述的传统方法经受其由光谱可分辨的荧光团的数目限制的事实。更具体地，可检测的分析物的数目等于光谱可分辨的荧光团的数目。因此，分析物的数目仅可通过增加光谱可分辨的荧光团的数目增加。

本公开提供了克服这种限制的方法。更具体地，在一些情况下，通过在编码过程中，利用信号的至少两个分量，本文描述的方法可用于检测每个荧光团一个以上的分析物。例如，使用本文提供的方法，每个荧光团可检测1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50个分析物。在一些情况下，本文提供的方法可用于检测，每个荧光团可检测至少1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50个分析物。在一些情况下，本文提供的方法可用于检测每个荧光团1.5-2、2-4、1.5-4、4-6、2-6、6-10个分析物。

在一些情况下，本公开提供的方法可包括使用对照颜色。对照颜色可连接到一个或更多个探针，在样品中，所述探针结合阳性对照分析物，及待检测的每个分析物。如果在阳性对照分析物和待检测的每个分析物中出现相同的序列，也可以使用单一的对照探针。如果阳性对照分析物和待检测的每个分析物中不出现相同的序列，可以使用不同的探针，但每个探针仍可连接到对照颜色。

例如，建立在上文描述的传统方法上，一种颜色(例如蓝色)可用于编码始终存在于样品中的对照分析物的存在。对照分析物可被加入到样品中，或者可以是固有地存在于样品中。剩余的颜色(例如，绿色、黄色、红色)可用于编码额外的分析物的存在。表2显示了一个这样的方法的实例。

表2.以四个颜色且每个分析物最多两个颜色编码四个分析物(包括对照)。

	蓝色	绿色	黄色	红色
					对照(p)	1	0	0	0
A	1	0	0	1
					B	1	0	1	0
C	1	1	0	0

在表2中，对照组(p)的存在由1000的结果指示。对照和分析物A的存在由2001的结果指示。对照和所有其它三个分析物的存在由4111的结果指示。对照颜色(蓝色)提供了测定正常运行的指示。蓝色颜色的强度报告了测试样品中存在的分析物的数目。当然，任何颜色都可以被用于对照颜色。本领域技术的一名人员将认识到，某些实际考虑可能使其优选使用一种颜色而不使用另一种颜色作为对照颜色。例如，如果一种颜色在特定的光学系统(或荧光团系统)中被更好地检测，那么可能实际上优选使用该颜色作为对照颜色。

表2中所示的编码方案使用一个对照颜色和一个额外的颜色(每个分析物最多2个探针)编码每个分析物。然而，如下所示，当每个分析物使用多达4个颜色时，可被编码的分析物的数目增加。表3显示了示例性的编码方案，其中每个分析物由最多4个颜色编码。表3所示的方案中，对照颜色(蓝色)在对照序列和其它七个分析物(A-G)的每个分析物的存在下产生。其它七个分析物的每个由一至三个额外的颜色的存在编码。颜色可能被不同的探针(例如，连接到荧光团和猝灭剂的寡核苷酸探针)或相同的探针(其可以具有多个荧光团和多个猝灭剂)所包含。

表3.以四个颜色且每个分析物最多四个颜色编码八个分析物(包括对照)。

	蓝色	绿色	黄色	红色
					对照(p)	1	0	0	0
A	1	0	0	1
					B	1	0	1	0
C	1	1	0	0
					D	1	0	1	1
E	1	1	0	1
					F	1	1	1	0
G	1	1	1	1

在表3中，对照和所有其它七个分析物的存在由8444的结果指示。三个分析物(A、B和C)由两个颜色编码。三个分析物(D、E和F)由三个颜色编码，且一个分析物(G)由四个颜色编码。对照(p)的存在由1000的结果指示。对照和分析物A的存在由2001的结果指示。对照和分析物G的存在由2111的结果指示。这些结果表达每个颜色中信号的累积强度。例如，结果2111在蓝色通道中具有2X的信号强度，而结果1000在蓝色通道中仅具有1X的信号强度。

使用表3，依据颜色(蓝色、绿色、黄色、红色)和强度(0-8)，每个可能的累积测定结果可被枚举。表4显示了通过基于在表3中所示的编码方法，对每个可能的累积测定结果进行枚举，并且根据在样品中存在的分析物提供每个测定的相应的解码结果，产生“解码矩阵”。通过基于编码方案枚举每个可能的累积测定结果，及根据在样品中存在的(或不存在的)分析物提供每个测定的相应的解码结果，可以产生用于本文描述的任何编码方案的类似的解码矩阵。在一些情况下，如以下所述，一个或更多个分析物可从编码方案除去，以减少或消除简并性。

表4.表3所示的编码方法的解码矩阵。

使用两个假定构建的表4中提供了解码矩阵。首先，解码矩阵假定阳性对照(P)总是产生阳性的结果。第二，解码矩阵假定，每个颜色中，无论信号可来自哪个探针，强度都以与改变探针浓度相同的方式添加和衡量。这本质上意味着信号是加性的和数字的。这些假定所依据的条件可以通过适当准备测定得到满足。如在本文所提供的实施例中证明的，如果使用荧光信号，强度仅需近似是的加性的和数字的。

表4允许荧光波长的四个范围中强度(即，每个颜色范围中的信号强度)的累积测量转换为样品中存在的相应的分析物。例如，4321的结果指示存在p、C、F和G，且其它分析物不存在。此结果被称为“合理”的结果，因为其在解码矩阵中出现。相比之下，4000的结果，虽然可能测量到，但未在解码矩阵出现。更具体地，4000的结果不能通过添加来自表3的对照代码和分析物代码的任意组合被实现。该结果被称为“不合理”的结果。不合理的结果可能指示测定故障。因此，对照(p)和解码矩阵提供了验证测定是否正常运行的手段。

表4穷举了产生4个可分辨发射光谱(例如，颜色)的荧光团的任意组合。术语“秩(rank)”用于描述检测的包括对照的分析物的数目。在上文提供的实例中，如果测定正常运行，那么秩等于蓝色信号的值。例如，秩8指示对照及所有其它七个分析物(A-G)存在。秩2指示存在对照及仅有的一个分析物。最低的秩是秩1，这指示仅存在对照。在每个秩的可能性的数目可被枚举。例如，继续参考在表3-4中描述的编码和解码方法，对于秩2有7个可能性。在秩3的可能性的数目可以以7取2的组合计算或者说有7！/(5！*2！)＝21个可能性。更普遍地，可能性的数目是N取K的组合，即为N！/((N-K)！*K！)。类似地，在秩4、5、6、7和8，可能性的数目分别是35、35、21、7和1。参照表4显示了表与理论预测一致。因此，表4是对表3中提供的编码方法的穷举的解码矩阵。

C.减少或消除简并性

如本文使用的术语“简并”和“简并性”，通常描述合理的结果是不明确的情况，因为依据分析物存在或不存在，其可以指示一个以上的可能性。例如，参照表4，结果5233是简并的，因为它可以被解码为pADFG或pBDEG。类似地，结果4222是简并的，因为它可以被解码为以下任一个：pCDG、pAFG、pBEG、pDEF。相比之下，结果3110只能指示pBC，且因此是非简并的。

本公开提供了减少或消除简并性的方法，从而提高了通过其检测到分析物的置信度。在一个实施方案中，消除简并度的方法包括：(i)将待检测的每个潜在分析物编码为信号的值，并且可选地，编码为信号的至少两个分量的每个分量中的值；(ii)枚举可以从编码方案获得的每个合理的结果；(iii)鉴定是简并的每个合理的结果；及(iv)从编码方案消除至少一个潜在分析物(或潜在的分析物代码)，其中消除该至少一个潜在的分析物减少或消除简并性。例如，参照表3中描述的编码方案，及在表4中描述的解码矩阵(枚举每个合理的结果)，消除分析物D、E和F的任意两个，消除了简并性。消除分析物D、E和F中的任意一个不会消除简并性，但会减少它。

继续参照表3中描述的编码方案，从编码方案消除分析物D、E和F的任意两个，产生仅使用4个颜色，以无简并性可以分析6个分析物(包括对照)的方案。相比之下，多路常规方法使用4种颜色将仅允许报告3个分析物和1个对照。因此，通过使用本文提供的方法可被分析的分析物的数目接近加倍。

图2显示了本发明的示例性实施方案，其中使用4个颜色检测五个分析物和一个对照。分析物是来自登革热病毒(“登革热”)、结核分枝杆菌(“结核病”)、人类免疫缺陷病毒(HIV)p17(P17)、疟原虫(“疟疾”)、和单纯性疱疹(“疱疹”)的核酸。在此实例中“颜色”是连接到还包括猝灭剂的寡核苷酸探针的荧光团。寡核苷酸探针通常将对不同的分析物不同，而颜色是相同的。例如，指定为探针1的所有探针具有蓝色颜色，但通常会具有不同的寡核苷酸序列。当然，如果互补序列在每个分析物中存在，指定为探针1的探针也可以具有相同的寡核苷酸序列。本公开中其他地方描述了用这些探针检测的机制。探针1(蓝色)杂交包括对照的所有6个分析物。探针2(绿色)杂交来自登革热病毒、分歧杆菌和HIV p17的分析物。探针3(黄色)杂交来自登革热病毒和疟原虫的分析物。探针4杂交来自登革热病毒、分歧杆菌和单纯性疱疹的分析物。通过这些探针定义的编码方案被示于表5。参照表3，潜在的分析物D(1011)和F(1110)已经从编码方案消除。因此，表5中所示的编码方案是非简并的，且来自测定的每个合理的结果对应于样品中分析物的唯一的组合的存在或不存在。

表5.如图2所示例的，用于检测登革热病毒、分枝杆菌、HIV、疟原虫和单纯性疱疹的编码方案。

上文所示的用于编码和解码的方法，包括用于消除简并性的方法，都同样地适用于使用额外的颜色的编码方法。例如，表3可以通过包括额外的颜色和额外的强度扩大(下面进一步描述)。然后如上所述，枚举可以从编码方案获得的每个合理的结果产生解码矩阵。可以为本公开中描述的任何编码方案构建类似于表4中提供的解码矩阵的解码矩阵。然后鉴定简并的合理的结果，且至少一个潜在的分析物代码从编码方案消除，以减少或消除简并性。消除简并性的方法可以使用在计算机可读介质上的软件、或使用执行该方法的硬件配置(例如，微芯片)执行。

虽然简并性可由以上、及在本公开中其他地方描述的方法减少或消除，本公开还提供了通过设计的非简并的编码方案。例如，消除表3中描述的编码方案的简并性后，编码方案可无限地以非简并的方式扩大，其中非简并性是通过设计(参见例如，表6中示例的编码方案，下文更充分地描述)。类似地，本公开提供通过设计的完全非简并的编码方案，且因此不需要任何简并性减少或消除(参见例如，表8中示例的编码方案，下文更充分地描述)。因此，本公开提供的编码方案可能已经通过设计减少或消除了简并性，或通过设计是非简并的。

D.使用一个以上的颜色和一个以上的强度的编码方法

上文描述的编码方法(例如，表3-5)可以通过允许由大于1的强度编码分析物被进一步扩大。例如，表5中提供的编码方案中的编码的每个分析物是由1或0的荧光强度编码的。在至少一个颜色中允许较高的信号强度值进一步增加了可以通过本公开中提供的任何方法编码的分析物的数目。在一些实例中，为了保持对照颜色的分析物计数能力，这些较高的强度值可被分配除了对照颜色的任何颜色。

表6显示了利用四个颜色和多强度的示例性编码方案的最前面的三层。表6的第1层是表3的复制，显示了使用四个颜色的七个分析物和一个对照的编码。如上文描述的，潜在的分析物D、E和F的任何两个可从编码方案消除，以便产生非简并的编码方案。表6的第1层指示潜在的分析物D(1011)和F(1110)已经从编码方案消除，以消除简并性。因此，如上文描述的，表6的第1层所示的编码方案能够使用四个颜色确定五个分析物及一个对照的存在。

表6的第1层的编码方案可通过允许任何颜色的强度增加，被扩大到第二层(层2)。如上文描述的，为了保持对照的序列计数能力，对照颜色的强度可保持为1。增加任何剩余三个颜色的强度将产生代码100Y、10Y0、1Y00、10YY、1Y0Y、1YY0和1YYY，其中Y>1。用于编码新的层的Y的最小值等于来自现有层的累积最大值加1。如下文描述的，也可以使用大于1的值，以最大化强度之间的差异。

因此，在此上下文中，术语“层”通常用于描述充分利用通过特定数目的没有简并性的第一值(例如，强度)和第二值(例如，颜色)，提供编码能力的代码组。例如，表6的第1层充分利用通过没有简并性的四个颜色与每个颜色最多1个强度提供的编码能力。如表6所示，第1层，这将导致包括对照的六个编码的分析物。引入第二层，如上所述，Y的最小值可被增加至等于根据现有层的累积最大结果加1(或多于一)。在表6提供的实例中，蓝色(对照)颜色的强度被保持为1，以保持这种颜色的序列计数能力。因此，第2层包括五个非简并的编码的可能性，其通过将绿色、黄色和红色通道中的强度增加至等于根据第1层的这些通道的每个通道中的累积最大结果加一获得。然后可以枚举层2的这些代码的所有可能性，且导致简并性的代码可被消除，或第2层可以通过设计，使用用于消除来自第1层的对应的代码的信息，制成非简并的。然后可通过添加根据类似的方法构建的第三层、或更多的层实现更大的编码容量。编码方案可具有无限数目的层，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90、100或更多层。

更具体地，参照表6，第2层中的分析物H由1004编码。对照颜色的值保持为1。红色颜色的值等于根据先前层的累积最大结果(3)加1，或4。同样地，分析物I和J由1030和1400分别编码。这些代码的组合用于编码其余四个分析物(K-N)，如在第1层对分析物D-G完成的。这样完成了第2层。在第2层，潜在的分析物K(1034)和M(1430)的内容导致简并性。因此，这些分析物已从编码方案消除，以消除简并性。

继续参照表6，第三层(层3)使用上文描述的相同的原理构建。分析物O用1-0-0-16编码。对照颜色的值仍然保持为1。红色颜色的值等于根据先前层的累积最大结果(15)加1、或16。同样地，分析物P和Q分别由1-0-9-0和1-16-0-0编码。这些代码的组合用于编码其余四个分析物(R-U)，如在第1层对分析物D-G及在第2层对分析物K-N完成的。在第3层，潜在的分析物R(1-0-9-16)和T(1-16-9-0)的内容导致简并性。因此，这些分析物已从编码方案消除，以消除简并性。

表6中显示的三层的编码方案显示了使用四个颜色的15个分析物和一个对照的编码。通过增加更多的强度以产生额外的层和/或增加更多的颜色以在层内产生额外的编码能力，此编码方案可无限地扩大。如在本公开中描述的，减少或消除简并性的方法可以在添加每个强度和/或颜色时使用，以减少或消除简并的结果。

更普遍地，表6中描绘的编码方案是表3-5中描绘的编码方案的非简并的、无限扩大。在第一层的累积测量的最大强度是6。在第二层的累积测量的最大强度是15。在第三层的累积测量的最大强度是63，且以此类推。给出最大累积强度值(F)，本编码方案中可用的层(T)的最大数目为T＝log₄(F+1)。表6中描绘的编码方案提供了每层五个(P个)非简并的代码。因此，代码的最大数目M＝5*Log₄(F+1)，或M＝P*T，其中，P为每层的非简并的代码的数目，且T是层数。例如，给出F＝63，对每层5个非简并的化码，代码(即，分析物)的最大数目为15。此式不包括代码1000，其在表6中保留为阳性对照。为了在分析物的总数中包括对照，任何人可简单地增加一，提供公式M＝(P*T)+1。

本公开中提供的方法可用于无限扩大此编码方案。例如，通过利用不同的强度(即，第一值)和颜色(即，第二值)的组合，任何人可以通过改变每层的非简并的代码数目(P)和层的数目(T)，编码任何数目(M)的分析物。例如，每层的非简并的代码的数目是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90、100或更多。类似地，层的数目可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90、100或更多。

表6.使用四个颜色和多个强度编码15种分析物和1个对照。

图1的右手侧显示了上文描述的方法的一个示例性的实例。更具体地，图1的右手侧显示了编码方法，其中9个或多于9个分析物(序列1-序列9，等)中的每种个由至少两个颜色，且在每个颜色的强度变化进行编码。颜色表示连接到还包括猝灭剂的寡核苷酸探针的荧光团。系统可设计成使得每个探针以单一荧光团标记，或每个探针以一个以上的荧光团标记。例如，对于分析物H的代码，在表6中是1004。在红色通道中4的强度可通过使用包括4个红色荧光团的H特异性探针，或者通过使用每个包括单一的红色荧光团的4个H特异性探针实现。当然，产生在红色通道中4的结果的探针和荧光团的任意组合也同样合适，如每个含有2个红色荧光团的2个探针，及含有1个红色荧光团的1个探针和含有3个红色荧光团的1个探针，或仅仅是含有一个红色荧光团的一个探针，但以4x数量在反应混合物中存在。

图1的右手侧描绘的编码方案可以如表7中所示。图1的右手侧所示的分析结果是4112，或蓝色通道中强度为4、绿色通道中为1、黄色通道中为1、且红色通道中为2。使用如本文所述构建的解码矩阵，此结果被解码为指示序序列1、序列3、序列4和序列5存在。

表7.图1的右手侧说明的编码方案。

E.每个分析物使用一个颜色和一个强度，但在分析物中使用不同强度的编码方法

在本文提供的一些方法中，每个分析物是由单一的颜色和强度的组合编码的。例如，在四色系统中，最前面的四个分析物可通过1000、2000、4000和8000编码。其后的四个分析物可通过0100、0200、0400和0800编码。分析物9-12和13-16将类似地分配，如表8所示。

像表6中描述的编码方法，该编码方案通过构建在理论上是无限的、非简并的，且仅由测量信号使用的仪器的带宽限制。然而，此编码方案比表6中描述的编码方法能够在每单位带宽上定量更多的分析物。其原因在于，以最大的效率使用信号的可用的多路性，因为编码中利用了每个强度等级(即色谱中没有空缺；参见下文色谱的描述)。表8显示了该方法的一个实施方案，说明了基于四个颜色和强度1、2、4和8的四层编码。编码方案是非简并的，且如果所有16个分析物存在，结果是15-15-15-15。在带宽利用率方面，这种编码方法比上面给出的编码方法更有效。然而，这种方法不具有第一个方案的校对能力，这是因为第一个方案中所有解码为合理的输出结果的结果都存在色谱中的空缺。

表8.每个分析物使用一个颜色和一个强度，但在分析物中使用不同强度的编码方法的实例。

上文所示的，及表8中示例的方法，可通过引入额外的颜色和/或强度扩大。例如，可以使用5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90、100、或更多个颜色。也可以使用额外的强度等级，例如16、32、64、128、256、512、1024、2048、4096、8192、16384、32768、65536、等等。该方法是可归纳的且可用于编码无限数目的分析物。每个分析物由单一颜色中的代码表示，其中，在该单一颜色中的代码的值等于所有先前值的总和加1。例如，如果在特定的颜色中的第一代码包含1，其后的代码是2、4、8、16、32、64、128等等。其它级数(progression)是可能的，但依据带宽的使用不会被认为有效的。然而，本领域的一个普通技术人员将认识到，当任何人希望最大化值之间的间隔时，可能希望较不有效的带宽使用。类似地，值1可从编码方案排除，例如，以最大化第一编码值和仪器的噪声之间的强度中的差异。例如，在一些情况下，编码方案可以以值2开始，其将为分析物代码提供为2、4、8、16、32、64、128、等等的级数，而累积结果的级数将是2、4、6、8、10、12、14、16、等等。这种方法在可能的累积结果中产生均匀的空缺(gap)，相比1、2、4、8、16、32、等等的分析物代码级数，允许对噪声更高的耐受，且其对应于1、2、3、4、5、6、7、8、等等的累积结果级数。在这个实例中，测量中增加的鲁棒性以多路性的固定带宽中可用的代码的数目减少为代价。例如，如果仅有63个多路性状态能够被可靠地测量，那么从1开始的编码方案每个颜色提供7个代码，而从2开始的编码方案每个颜色提供6个代码。如果4个颜色可用，前者将提供28个代码，而后者将提供24个代码。总之，开始信号强度和级数(即，强度值之间的差异)两者均可以被衡量，以最大化对仪器的噪声的分辨能力，并最大化强度值之间的差异，由此增强区分不同实验结果之间的能力。

如表8说明的编码方案通过设计为非简并的。虽然表8中说明的编码方案使用强度和颜色两者编码16个分析物的每个分析物，还可以通过简单地利用强度编码每个分析物。例如，给出表8中提供的16个分析物(A-P)，单一颜色的编码方案编码全部16个分析物，可分别地分配值1、2、4、8、16、32、64、128、256、512、1024、2048、4096、8192和16384至分析物A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、N、O和P。这种编码方案通过设计为非简并的，且累积强度结果可以被明确地解码以指示分析物A-P的存在或不存在。这种编码方案能够检测M种分析物的存在或不存在，其中M＝Log₂(F+1)，且F是信号(例如，信号强度)的最大累积值。通过向这个信号添加第二分量(如颜色，如表8中描绘的)，这个编码方案的容量可以增大到M＝C*Log₂(F+1)，其中C是在所述编码方案中使用的颜色数目。

如贯穿此说明书中描述的，任何合适的值可以用于C或F。例如，C可以是至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90、100、或更多。F+1可以是至少约2、4、8、16、32、64、128、256、512、1024、2048、4096、8192、16384、32768、65536、131072、262144、524288、1048576、等等。如在本公开中其他地方描述的，F的最初开始值和在其级数中的步长(step)也可以改变。

III.分析物

分析物可以是使用本发明的方法和组合物分析的任何合适的分析物，其中分析物能够与试剂相互作用，以便产生可被测量的具有至少两个分量的信号。分析物可以是天然存在的或合成的。分析物可以存在于使用本领域中已知的任何方法获得的样品中。在一些情况下，样品可以在其用于分析物的分析前被处理。本公开中提出的方法和组合物可在溶液相测定中使用，而不需要颗粒(如珠)或固体支持体。

在一些情况下，分析物可以是多核苷酸，例如DNA、RNA、肽核酸、及其任何杂合体(hybrid)，其中多核苷酸包含脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的任意组合。多核苷酸可以是单链或双链的，或同时含有双链或单链序列部分。多核苷酸可包含核苷酸或碱基的任意组合，包括，例如，尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶、异鸟嘌呤及其任意核苷酸衍生物。如本文所用，术语“核苷酸”可包括核苷酸和核苷，以及核苷和核苷酸类似物，及修饰(modified)的核苷酸，包括合成的种类和天然存在的种类两者。多核苷酸可以是针对其可产生如本文描述的一种或更多种试剂(或探针)的任何合适的多核苷酸，包括但不限于cDNA、线粒体DNA(mtDNA)、信使RNA(mRNA)、核糖体RNA(rRNA)、转移RNA(tRNA)、核RNA(nRNA)、小干扰RNA(siRNA)、小核RNA(snRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、小卡哈尔体特异性RNA(small Cajal body-specific RNA，scaRNA)、微小RNA(miRNA)、双链(dsRNA)、核酶、核糖开关(riboswitch)或病毒RNA。多核苷酸可被包含在任何合适的载体中，例如质粒、粘粒、片段、染色体、或基因组。

基因组DNA可从天然存在的或遗传修饰的生物体，或从人工地或合成地产生的基因组获得。包括基因组DNA单独分析物可从任何来源，且使用本领域中已知的任何方法获得。例如，基因组DNA可以利用或不利用扩增被分离。扩增可包括PCR扩增、多重置换扩增(MDA)、滚环扩增和其它扩增方法。基因组DNA也可以通过克隆或重组的方法获得，例如那些涉及质粒和人工染色体的方法或其它的常规方法(参见Sambrook和Russell，MolecularCloning:A Laboratory Manual.，出处同上)。多核苷酸可使用本领域已知的其它方法分离，例如如在Genome Analysis:A Laboratory Manual Series(卷I-IV)或MolecularCloning:A Laboratory Manual中公开的。如果分离的多核苷酸是mRNA，其可以使用常规技术被逆转录(reverse transcribe)为cDNA，如Sambrook和Russell,Molecular Cloning:ALaboratory Manual，出处同上，中描述的。

分析物可以是蛋白质、多肽、脂质、碳水化合物、糖、小分子、或可以以本文提供的方法和组合物检测的任何其它合适的分子。分析物可以是酶或其它蛋白质。分析物可以是药物或代谢物(例如，抗癌药物、化学治疗药物、抗病毒药物、抗生素药物、或生物制剂(biologic))。分析物可以是任何分子，如辅因子、受体、受体配体、激素、细胞因子、血液因子、抗原、类固醇、或抗体。

分析物可以是来自任何病原体的任何分子，病原体例如病毒、细菌、寄生虫、真菌、或朊病毒(例如，PrP^Sc)。病毒的实例包括来自以下科的那些，腺病毒科、黄病毒科、嗜肝病毒科、疱疹病毒科、正粘病毒科、乳多空病毒科、副粘病毒科、小核糖核酸病毒科、多瘤病毒科、逆转录病毒科、弹状病毒科、及披膜病毒科。病毒的具体实例包括腺病毒、星状病毒、博卡病毒、BK病毒、柯萨奇病毒、巨细胞病毒、登革热病毒、埃博拉病毒、肠病毒、EB病毒、猫白血病病毒、肝炎病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、单纯性疱疹病毒(HSV)、HSV 1型、HSV 2型、人免疫缺陷病毒(HIV)、HIV 1型、HIV 2型、人类乳头瘤病毒(HPV)、HPV 1型、HPV 2型、HPV 3型、HPV 4型、HPV 6型、HPV 10型、HPV 11型、HPV16型、HPV18型、HPV 26型、HPV 27型、HPV 28型、HPV 29型、HPV 30型、HPV 31型、HPV 33型、HPV 34型、HPV 35型、HPV 39型、HPV 40型、HPV 41型、HPV 42型、HPV 43型、HPV 44型、HPV 45型、HPV 49型、HPV 51型、HPV 52型、HPV 54型、HPV 55型、HPV 56型、HPV 57型、HPV58型、HPV 59型、HPV 68型、HPV 69型、流感病毒、JC病毒、马尔堡病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、诺沃克病毒、细小病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒、逆转录病毒、鼻病毒、轮状病毒、风疹病毒、天花病毒、牛痘病毒、西尼罗河病毒和黄热病病毒。

细菌的实例包括来自以下属的那些，博德特氏菌属(Bordetella)、疏螺旋体属(Borrelia)、布鲁氏菌属(Brucella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、衣原体属(Chlamydia)、梭菌属(Clostridium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、肠球菌属(Enterococcus)、埃希氏菌属(Escherichia)、弗朗西斯氏菌属(Francisella)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、螺杆菌属(Helicobacter)、军团菌属(Legionella)、钩端螺旋体属(Leptospira)、李斯特菌属(Listeria)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、支原体属(Mycoplasma)、奈瑟菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、立克次氏体属(Rickettsia)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、密螺旋体属(Treponema)、弧菌属(Vibrio)和耶尔森氏菌属(Yersinia)。细菌的具体实例包括副百日咳博德特氏菌(Bordetella parapertussis)、百日咳博得特氏菌(Bordetella pertussis)、伯氏疏螺旋体(Borreliaburgdorferi)、流产布鲁氏菌(Brucella abortus)、犬布鲁氏菌(Brucella canis)、羊布鲁氏菌(Brucella melitensis)、猪布鲁氏菌(Brucella suis)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatix)、肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、白喉棒状杆菌(Corynebacteriumdiphtheriae)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、大肠杆菌(Escherichia coli)、土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)、单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、溃疡分枝杆菌(Mycobacterium ulcerans)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、淋球奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、立克次氏体(Rickettsia rickettsii)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis)、都柏林沙门氏菌(Salmonella dublin)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、宋内氏志贺菌(Shigella sonnei)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、苍白密螺旋体(Treponema pallidum)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)和小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)。

寄生虫的实例包括来自以下属的那些，棘阿米巴属(Acanthamoeba)、巴贝虫属(Babesia)、巴拉姆西属(Balamuthia)、肠袋属虫(Balantidium)、芽囊原虫属(Blastocystis)、隐孢子虫属(Cryptosporidium)、双核阿米巴属(Dientamoeba)、内阿米巴属(Entamoeba)、贾第虫属(Giardia)、等孢球虫属(Isospora)、利什曼原虫属(Leishmania)、耐格里虫属(Naegleria)、虱属(Pediculus)、疟原虫属(Plasmodium,)、鼻孢子虫属(Rhinosporidium,)、肉孢子虫属(Sarcocystis)、血吸虫属(Schistosoma)、弓形虫属(Toxoplasma)、滴虫属(Trichomonas)和锥虫属(Trypanosoma)。寄生虫的具体实例包括分歧巴贝虫(Babesia divergens)、双芽巴贝虫(Babesia bigemina)、马巴贝虫(Babesiaequi)、田鼠巴贝虫(Babesia microti)、邓肯巴贝虫(Babesia duncani)、狒狒巴拉姆西阿米巴(Balamuthia mandrillaris)、结肠小袋纤毛虫(Balantidium coli)、脆弱双核阿米巴(Dientamoeba fragilis)、痢疾阿米巴(Entamoeba histolytica)、贾第鞭毛虫(Giardialamblia)、贝利等孢球虫(Isospora belli)、福氏耐格里阿米巴(Naegleria fowleri)、人虱(Pediculus humanus)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、诺氏疟原虫(Plasmodiumknowlesi)、三日疟原虫(Plasmodium malariae)、卵形疟原虫(Plasmodium ovale)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、鼻孢子虫(Rhinosporidium seeberi)、牛人肉孢子虫(Sarcocystis bovihominis)、猪人肉孢子虫(Sarcocystis suihominis)、曼氏血吸虫(Schistosoma mansoni)、弓形虫(Toxoplasma gondii)、阴道毛滴虫(Trichomonasvaginalis)、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、和克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)。

真菌的实例包括来自以下属的那些，鳞质霉属(Apophysomyces)、曲霉属(Aspergillus)、芽生菌属(Blastomyces)、念珠菌属(Candida)、枝孢霉属(Cladosporium)、球孢子菌属(Coccidioides)、隐球菌属(Cryptococcus)、突脐孢属(Exserohilum)、镰刀菌属(Fusarium)、组织胞浆菌属(Histoplasma)、毕赤酵母属(Pichia)、肺囊虫属(Pneumocystis)、酵母属(Saccharomyces)、孢子丝菌属(Sporothrix)、葡萄穗霉属(Stachybotrys)和毛癣菌属(Trichophyton)。真菌的具体实例包括烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、棒曲霉(Aspergillus clavatus)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、白色念珠菌(Candida albicans)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、尖角突脐孢(Exserohilum rostratum)、轮状镰刀菌(Fusarium verticillioides)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、杰氏肺囊虫(Pneumocystis jirovecii)、申克孢子丝菌(Sporothrix schenckii)、黑葡萄穗霉(Stachybotrys chartarum)和须癣毛癣菌(Trichophyton mentagrophytes)。

在一些情况下，本公开中所提供的方法可以用于检测在上文、或者在说明书的其它地方描述的分析物中的任何一个。在一些情况下，本公开中提供的方法可以用于检测在上文、或在说明书的其它地方描述的分析物的组合(panel)。例如，组合可包括选自由任意2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90、100或更多个在上文或在说明书中的其它地方描述的分析物所组成的组的分析物。

分析物可从任何合适的位置获得，包括从生物体、完整细胞、细胞制剂和来自任何生物体、组织、细胞、或环境的无细胞组合物。分析物可从环境样品、活检、抽吸物、福尔马林固定的包埋组织、空气、农业样品、土壤样品、石油样品、水样、或灰尘样品中获得。在一些情况下，分析物可以从体液获得，其可能包括血液、尿液、粪便、血清、淋巴液、唾液、粘膜分泌物、汗液、中枢神经系统流体、阴道液、或精液。分析物也可以由制造的产品获得，如化妆品、食品、个人护理产品、等等。分析物可以是实验操作的产物，包括重组克隆、多核苷酸扩增、聚合酶链式反应(PCR)扩增、纯化方法(如基因组DNA或RNA的纯化)和合成反应。

在每个多路测定中，可以检测多于一种类型的分析物。例如，多核苷酸、蛋白质、多肽、脂质、碳水化合物、糖、小分子、或任何其它合适的分子可以同时在相同的多路测定中以合适的试剂检测。可在相同的时间检测分析物的任意组合。

分析物的检测可对任何合适的应用有用，应用包括科研、临床、诊断、预后、法医和监测应用。典型应用包括遗传性疾病的检测、遗传指纹的鉴定、感染性疾病的诊断、基因的克隆、亲子测试、刑事鉴定、系统发育、生物反恐、环境监测、及DNA计算。例如，分析物可以指示疾病或状况。分析物可以用来做出治疗决定，或以评估疾病的状态。分析物的存在可以指示具有特定病原体感染或任何其它疾病如癌症、自身免疫性疾病、心肺病、肝病、消化道疾病、等等。因此本文提供的方法可以用于做出诊断并基于该诊断做出临床决定。例如，指示从受试者采集的样品中细菌多核苷酸的存在的结果可能导致以抗生素治疗受试者。

在一些情况下，本发明的方法和组合物可用于检测至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、或1000个分析物。在一些情况下，本发明的方法和组合物可用于检测7-50、8-40、9-30、10-20、10-15、8-12、或7-12个分析物。

在一些情况下，本公开提供在单一样品体积中能够明确地检测处于存在或不存在的任意组合的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、或1000个分析物中的每个分析物的存在或不存在的测定而无需固定化、分离、质谱法、或解链曲线分析。在一些情况下，本公开提供在单一样品体积中能够明确地检测处于存在或不存在的任意组合的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、或1000个分析物中的每个分析物的存在或不存在的测定而无需固定化、分离、质谱法、或解链曲线分析。在一些情况下，本公开提供在单一样品体积中能够明确地检测处于存在或不存在的任意组合的少于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、或1000个分析物的存在或不存在的测定而无需固定化、分离、质谱法、或解链曲线分析。

IV.信号

本公开中提出的方法可以任何可定量的信号进行使用。在一些情况下，本公开提供了使用信号的单一分量(例如，强度)，以非简并性编码无限数目的目标的编码方案和方法。例如，如在上文和在实施例3中描述的，编码方案可依赖于信号强度的多路性不考虑颜色。虽然荧光探针已被用于说明此原理，但是如在本公开中其他地方描述的，所述编码方案同样适合任何其它方法，所述其它方法提供了可定量的信号，包括电化学信号和化学发光信号。

本公开提出的方法还可以利用在至少二个维度中的信号测量结果，也被称为信号的至少两个分量的测量结果。例如，相比于上文段落中描述的、依赖于信号强度以区分分析物的编码方案，利用信号的至少两个分量(例如，颜色和强度)允许每个信号强度带宽的单位产生更多不同的代码。当利用信号的至少两个分量时，可获得单一样品体积的至少两个分量的累积测量结果。例如，在表5描述的编码方案中，每个分析物的存在导致在4个颜色(信号的第二分量)的每个颜色上的特定的强度(信号的一个分量)。这些构成信号的组合导致了可以通过测量在每个波长或波长范围内的强度来测量累积信号。然后可使用相应的编码方案或解码矩阵，将累积测量结果转换为确定分析物存在或不存在。

在一些情况下，可定量的信号包括具有频率(波长)和振幅(强度)两者的波形。信号可以是电磁信号。电磁信号可以是声音、无线电信号、微波信号、红外信号、可见光信号、紫外光信号、x射线信号、或γ射线信号。在一些情况下，电磁信号可以是荧光信号，例如可以依据波长和强度表征的荧光发射光谱。

在本公开的某些部分，信号依据荧光信号被描述和示例。这不意味着是限制性的，且本领域的一个普通技术人员将容易地认识到适用于荧光信号的测量的原理也适用于其它信号。例如，类似荧光信号，上文描述的任何电磁信号都可以依据波长和强度表征。荧光信号的波长也可以依据颜色描述。颜色可以通过基于在特定波长或波长范围测量强度确定，例如，通过确定在不同波长荧光的强度分布，和/或通过利用带通滤波器以确定特定波长范围内的荧光强度来进行确定。这样的带通滤波器通常用于各种实验室仪器，包括定量PCR器。强度可以以光电检测器测量。许多波长可被称为“信道”。

在一些情况下，本公开中提供的方法可以用于任何信号，其中累积信号以相同的颜色、频率、吸收带、等等的构成信号衡量。然而，累积信号不需要是数字信号或随构成信号的数目和强度线性调节(scale)。例如，如果测量的物理原理是吸收，那么由于Beer-Lambert定律的指数性质，累积衰减是构成衰减的乘积而构成浓度是加性的。然后累积衰减的对数将随在每个吸收带(如果使用荧光检测，相当于颜色)上的构成浓度线性调节。因此，本发明的方法是可以应用的。本发明的方法也可用于化学发光信号和电化学信号。

信号的数目，及测量的维数或分量的数目，也可以扩大到超出本发明的示例性的实施方案中所示的数目，导致多路能力的扩大。本公开中提供的示例性实施方案利用了利用具有测量的一个或两个分量：波长和/或强度的荧光信号所构造的编码方案。可被编码的分析物的数目可以通过增加波长和/或强度的数目而增加。可被编码的分析物的数量，也可以通过增加信号的数目而增加，例如通过组合荧光信号与电化学信号或FRET信号(荧光共振能量转移)而增加。

在一些情况下，信号的两个以上的分量可被测量。例如，信号的3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、18、20个或更多个分量可被测量。信号的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、18、或20个分量可被测量。信号的至少2个，但少于3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、18、或20个分量可被测量。在一些情况下，信号的2-3、2-4、2-5、2-6、3-5、3-6、3-8、或5-10个分量可被测量。这些额外的分量可包括动力分量，例如信号衰减的速率和光漂白速率。

如果采用荧光信号，可被编码的分析物的数目，可以进一步通过利用额外的荧光团扩大。例如，可以使用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、或更多个荧光团。在一些情况下，可以使用至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50个荧光团。在一些情况下，可以使用少于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50个荧光团。在一些情况下，可以使用4-6、4-7、4-8、4-9、4-10、5-6、5-7、5-8、5-9、5-10、10-15、或10-20的荧光团。

通常，可被编码的分析物的数目，可以进一步通过利用来自信号的第一分量的值或值的范围的额外的第一值(例如，强度)扩大。例如，可以使用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、或更多个来自信号的第一分量的值或值的范围的第一值。在一些情况下，可以使用至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、或更多个来自信号的第一分量的值或值的范围的第一值。在一些情况下，可以使用少于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50个来自信号的第一分量的值或值的范围的第一值。在一些情况下，可以使用4-20、4-6、4-7、4-8、4-9、4-10、5-6、5-7、5-8、5-9、5-10、10-15、或10-20的来自信号的第一分量的值或值的范围的第一值。

在实例中，其中强度是被定量的信号的分量，例如当利用荧光信号时，分析物的存在可以使用多个强度或强度范围编码。例如，编码方案可以利用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、或更多个强度或强度范围。编码方案可以利用至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、或更多个强度或强度范围。编码方案可以利用少于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50个强度或强度范围。在一些情况下，编码方案可利用2-20、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10、4-5、4-6、4-7、4-8、4-9、4-10、5-6、5-7、5-8、5-9或5-10个强度或强度范围。

可被编码的分析物的数目，可以进一步通过利用来自信号的第二分量的值或值的范围的额外的第二值(例如，波长)扩大。例如，可以使用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、或更多个来自信号的第二分量的值或值的范围的第二值。在一些情况下，可以使用至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、或更多个来自信号的第二分量的值或值的范围的第二值。在一些情况下，可以使用少于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、或更多个来自信号的第二分量的值或值的范围的第二值。在一些情况下，可以使用4-20、4-6、4-7、4-8、4-9、4-10、5-6、5-7、5-8、5-9、5-10、10-15、或10-20个来自信号的第二分量的值或值的范围的第二值。

在其中波长是被定量的信号的分量的实例中，例如当利用荧光信号时，分析物的存在可以使用多种波长或波长范围编码。例如，可以使用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、或更多个波长或波长范围。在一些情况下，可以使用至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、或更多个波长或波长范围。在一些情况下，可以使用少于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50个波长或波长范围。在一些情况下，可以使用4-20、4-6、4-7、4-8、4-9、4-10、5-6、5-7、5-8、5-9、5-10、10-15、或10-20的波长或波长范围。

在一些情况下，当简并性被消除，本发明的方法能够检测在单一体积中的至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、或更多个分析物的存在或不存在，当用于在体积中产生信号的每个试剂仅产生一个第二值(例如，每个试剂，仅发射一个波长的光)时。

在其它情况下，当简并性被消除，本发明的方法能够检测在单一体积中的至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、或更多个分析物的存在或不存在，总共在该体积中使用了四个第二值(例如，共四个波长或波长的范围，其可能通过使用四个光谱可分辨的荧光团实施)。

如在整个说明书中描述的，本文提供的测定利用对样品的累积测量结果。累积测量结果可以是，例如，强度值的单一测量结果，或在一个或更多个波长或波长的范围的强度值的测量结果。可以获得多个累积测量结果。例如，强度可以在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、或更多个波长或波长范围测量。强度可以在至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、或更多个波长或波长范围测量。强度可以在少于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50个波长或波长范围测量。

更普遍地，可获得关于信号的任何可定量的分量，以及关于在信号的另一个可定量的分量的信号的任何可定量的分量的累积测量结果。例如，信号的至少一个第一分量可以在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、或更多个信号的第二分量测量。信号的至少一个第一分量可以在至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、或更多个信号的第二分量测量。信号的至少一个第一分量可以在少于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50个信号的第二分量测量。

如本公开明显显示的，待检测的每个分析物可被编码为利用任意数目的信号的合适的分量，或任意数目的信号的代码。例如，待检测的每个分析物可以被编码在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、或更多个信号的分量或信号中。在一些情况下，待检测的每个分析物可以被编码在至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、或更多个信号的分量或信号中。在一些情况下，待检测的每个分析物可以被编码在少于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50个信号的分量或信号中。在一些情况下，可以使用1-4、4-20、4-6、4-7、4-8、4-9、4-10、5-6、5-7、5-8、5-9、5-10、10-15、或10-20的信号的分量或信号编码每个分析物。在编码方案中每个分析物可以由相同数目的信号的分量，或信号，或不同数目的信号的分量，或信号编码。

A.探针、引物、荧光团、和猝灭剂

本公开中提供的一些方法利用在分析物存在时产生信号的试剂。任何合适的试剂可用于本发明。通常，试剂将具有分析物特异性成分，及在分析物存在时产生信号的分量。在一些情况下，这些试剂被称为探针。探针可以是杂交探针。杂交探针可以是连接到荧光团和猝灭剂(例如，TAQMAN探针)的寡核苷酸探针。

本发明的方法可使用一种或更多种试剂或探针以检测每个分析物的存在或不存在。例如，可以使用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、或更多个探针以检测每个分析物的存在或不存在。在一些情况下，可以使用至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50个探针，以检测每个分析物的存在或不存在。在一些情况下，可以使用少于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50个探针以检测每个分析物的存在或不存在。在一些情况下,用于检测每个分析物的存在或不存在的探针的数目是1-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4、1-3、或1-4。

在一些情况下，样品与4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、或更多个探针接触，以检测所有分析物的存在或不存在。在一些情况下，样品与至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或更多个探针接触，以检测所有分析物的存在或不存在。在一些情况下，样品与少于4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50个探针接触，以检测所有分析物的存在或不存在。在一些情况下,样品所接触的用以检测所有分析物的存在或不存在的探针的数目是4-50、4-40、4-30、4-20、5-15、5-10、或3-10。

如上文描述的，连接到荧光团和猝灭剂的寡核苷酸探针可用于检测多核苷酸扩增测定中分析物的存在。只要猝灭剂和荧光团接近，猝灭剂就猝灭由光源激发荧光团所发射的荧光。寡核苷酸探针的序列被设计为互补于分析物中存在的多核苷酸序列，并因此，能够与分析物中存在的多核苷酸序列杂交。在包括引物的核酸扩增反应(例如，聚合酶链式反应)中可执行寡核苷酸探针的杂交。通过DNA聚合酶延伸引物后，聚合酶的5'至3'外切酶活性降解探针，释放荧光团和猝灭剂至介质中。荧光团和猝灭剂之间的接近被破坏，且来自荧光团的信号不再猝灭。因此，检测到的荧光的量是分析物存在的量的函数。如果没有分析物存在，探针将不与分析物杂交，且荧光团和猝灭剂将保持极为接近。很少信号或没有信号会产生。

寡核苷酸探针的每个探针可具有一个或多个荧光团和猝灭剂。例如，在一些实施方案中，寡核苷酸探针可包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、或更多个荧光团。寡核苷酸探针可包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50个荧光团。寡核苷酸探针可包括少于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50个荧光团。

寡核苷酸探针可包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、或更多个猝灭剂。寡核苷酸探针可包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50个猝灭剂。寡核苷酸探针可包括少于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50个猝灭剂。

探针和猝灭剂至探针的连接可以在相同的反应，或在系列的反应中执行。可以执行一系列的反应以使用至少一种荧光团标记探针，且反应产物可被混合以产生具有不同荧光团的探针的混合物。

如果寡核苷酸探针包括两个或更多个荧光团，这些荧光团可以被布置为允许(荧光)共振能量转移(FRET)在荧光团之间发生。简单地说，FRET是在荧光团之间的能量转移的机制。使用基于FRET的探针允许一个激发源通过单一的荧光团的激发，产生两个不同的荧光发射信号。例如，本文描述的方法可使用配对的探针，其中在配对中的一个探针连接到荧光团和猝灭剂，且第二探针连接到两个荧光团(足够接近用于FRET发生)和猝灭剂。可以使用提供用于FRET的荧光团和猝灭剂任意组合。这种方法使得可以与激发源使用的荧光探针的数目加倍，这是因为单一的激发源可用于产生两个信号：一个来自具有一个荧光团的探针，且一个来自具有足够接近用于FRET发生的两个荧光团的探针。例如，使用表8中描述的编码方法，通过将表8中的每个探针与对应的FRET探针配对，明确地可检测的分析物的数目可从16增加到32。

引物可以是对特定分析物特异性的，且能够扩增与探针互补的区域。在一些情况下，使用的引物的配对的数目等于探针的数目。在其它情况下，使用的探针的数目可超过使用的引物配对的数目。在又另一些情况下，使用的引物配对的数目可超过使用的探针的数目。在一些情况下，待分析的样品可与1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、或更多个引物的配对接触。在一些情况下，待分析的样品可与至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、或更多个引物的配对接触。在一些情况下，待分析的样品可与少于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50个引物的配对接触。在一些情况下,引物的配对的数目是2-10、3-15、4-20、3-10、4-10、5-10、6-8、或6-10。

引物可扩增不同数目的杂交探针在其中杂交的多核苷酸的区域。例如，引物的至少一个配对可以扩增与至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50个杂交探针互补的区域。在一些情况下，引物的所有所述配对可以扩增与至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50个杂交探针互补的区域。

在一个实例中，第一探针可以以荧光团5'-荧光素酰胺(5'-FAM)和猝灭剂黑洞猝灭剂1(BHQ-1)标记。第二探针可以以极为接近(例如，连接到)青色素5.5(Cy5.5)和猝灭剂黑洞猝灭剂3(BHQ-3)的5'-FAM标记。根据经由聚合酶的核酸酶活性探针的消化，从单一激发波长(例如，470nm)产生两个荧光信号。来自第一探针的荧光团在大约520nm发出荧光。在第二探针上的荧光团经受FRET。供体荧光团FAM通过激发光源(例如，470nm)激发，且转移其能量到受体荧光团Cy5.5。受体荧光团在约705nm发射。这些荧光团和猝灭剂仅是示范性的。能够经受FRET的任何荧光团，及可以猝灭荧光的任何猝灭剂适合于本发明使用。生产基于FRET探针的方法，在2009年出版的Jothikumar等人的BioTechniques,第46(7):519-524页中进行了描述。

在一些实施例中，单一的杂交探针可用于每个分析物。为了利用多颜色编码(例如，如表3中所示)，每个探针可以以多个荧光团在预确定的比例标记。比例可被确定，在相同的颜色中，使得阳性对照信号与相同的强度的其它阳性对照信号提供相同的强度。这种方法减少了必须被合成的探针的数目，且可能比利用多个探针的方法更便宜地配置。此外，在杂交探针的情况下，相比多个探针，一个杂交探针配合分析物的序列更容易。

虽然本发明的许多方面使用基于核酸的探针被例举，但是本领域的一个普通技术人员将容易地认识到，其它形式的探针将与在本公开中描述的本发明同样一起工作得很好。例如，对分析物特异的结合分子可用作探针。非限制性的示例性的结合分子包括识别的分析物，并在分析物存在时产生信号的抗体。

在利用荧光标记的本发明的实施方案中，可以使用任何合适的荧光标记。适用于本发明使用的示例性的荧光标记包括罗丹明、对甲氨基酚、荧光素、硫代荧光素(thiofluorescein)、氨基荧光素、羧基荧光素、氯代荧光素、甲基荧光素、磺基荧光素、氨基对甲氨基酚(aminorhodol)、羧基对甲氨基酚(carboxyrhodol)、氯代对甲氨基酚(chlororhodol)、甲基对甲氨基酚(methylrhodol)、磺基对甲氨基酚(sulforhodol)、氨基罗丹明(aminorhodamine)、羧基罗丹明、氯代罗丹明(chlororhodamine)、甲基罗丹明(methylrhodamine)、磺基罗丹明(sulforhodamine)、及硫代罗丹明(thiorhodamine)、青色素(cyanine)、吲哚碳青色素、氧碳青色素(oxacarbocyanine)、噻碳青色素(thiacarbocyanine)、部青色素(merocyanine)、青色素2、青色素3、青色素3.5、青色素5、青色素5.5、青色素7、恶二唑衍生物(oxadiazole derivatives)、吡啶恶唑(pyridyloxazole)、硝基苯并恶二唑(nitrobenzoxadiazole)、苯并恶二唑(benzoxadiazole)、芘衍生物(pyrene derivatives)、级联蓝、恶嗪衍生物、尼罗红、尼罗蓝、甲酚紫、恶嗪170、吖啶衍生物、二氨基吖啶(proflavin)、吖啶橙、吖啶黄、金胺(arylmethine)衍生物、金胺、结晶紫、孔雀石绿、四吡咯衍生物、卟吩、酞青色素和胆红素。示例性的猝灭剂包括黑洞猝灭剂，如BHQ-0、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3；ATTO猝灭剂，如ATTO540Q、ATTO 580Q和ATTO 612Q；等等。

可以与本发明使用的荧光团不限于本文描述的任何荧光团。例如，具有改进性能的荧光团不断发展，且这些荧光团可以很容易地与本公开提供的方法使用。这种改进的荧光团包括量子点，在单一波长被激发后，其可以以不同的波长发射能量。使用这样的荧光团的优点在于，仅需要一个单一的激发源，但是许多不同的信号可以被定量，例如，根据颜色和强度被定量。此外，具有窄的发射光谱的荧光团将对本文描述的方法特别有用，因为这样的荧光团可被包括在其发光光谱之间很少重叠或没有重叠的多路测定中，从而提供更多的“颜色”并显著地提高编码的分析物的总体数目。

在一些情况下，一种或更多种试剂被冻干。任何合适的试剂可以被冻干。例如，探针、引物、酶、抗体或用于检测的任何其它试剂可被冻干。在一些情况下，包括分析物的样品也可被冻干。冻干可能是有用的，例如，当在发展中地区分配试剂和/或样品时，在这些地区获得冷库是昂贵的、不易利用的、或不能可靠地利用的。在一个实例中，冻干的试剂包括在本公开中描述的或以其它方式适合于本发明使用的任何探针或分析物特异性试剂。在另一个实例中，冻干的试剂包括PCR引物。在又另一实例中，冻干的试剂包括适合用于执行PCR反应的试剂。

V.分析技术与仪器

本文提供的方法适合与各种检测方法使用。例如，可应用的方法使用测量荧光信号的波长和强度的分析技术。这可以通过测量整个光谱波长的信号的强度实现，或通过使用限制某些波长的光的带通滤波器，从而仅允许某些波长的光到达光电检测器实现。许多实时PCR和定量PCR仪器包括激发光源和带通滤波器，其能够检测在四种颜色(例如，蓝色、绿色、黄色和红色)上的荧光信号。因此，本发明的方法可以使用本领域广泛使用的仪器容易地应用。重要的是，本文提供的方法和组合物可用于通过获得单一溶液的累积测量结果来检测多种分析物。没有分离的必要。本发明不需要使用珠或固相。当然，本领域的一个普通技术人员应当理解，如果需要的话，本发明可以结合分离、珠、或固相使用。

图5显示了可用于获得对本发明的方法有用的累积测量结果的仪器的配置的两个实例。参考图5，带有配置为检测波长和强度两者的检测器(例如，荧光计)的仪器示于501。参考501，至少一个激发光源502被引导到含有分析物和在分析物504存在时产生信号的试剂的室503中。如在其他地方描述的，分析物可以是核酸，且产生信号的试剂可以是包括荧光团和猝灭剂的杂交探针。如果分析物存在，则产生发射信号505。在501中所示的配置中，该发射信号的波长和强度通过能够产生荧光发射光谱506的检测器在整个光谱上测量。

波长和强度也可以使用光电检测器和带通滤波器的组合确定。该配置在本领域中已知的几种热循环仪中使用。参考图5，具有带通滤波器和光点检测器的仪器在507中描绘。参考507，至少一个激发光源508被引导到含有分析物和在分析物510存在时产生信号的试剂的室509中。如在其他地方描述的，分析物可以是核酸，且产生信号的试剂可以是包括荧光团和猝灭剂的杂交探针。如果分析物存在，则产生发射信号511。在507所示的配置中，带通滤波器512、513和514被用于限制光的通过，以在特定的波长范围内发光。例如带通滤波器512可以限制光的通过，以在波长范围1内发光。带通滤波器513可以限制光的通过，以在波长范围2内发光。带通滤波器514可以限制光的通过，以在波长范围3内发光。任何数目的带通滤波器(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、或更多)可用于本发明。此外，在507中带通滤波器的位置不意味着是限制性的。在一些情况下，发射的光可在任何时间通过多于一个的带通滤波器。在其它情况下，带通滤波器可以被配置为使得所有发射的光在一个时间仅通过一个带通滤波器。通过带通滤波器后，过滤的光515、516和517通过光电检测器检测。例如，过滤的光515可能是在波长范围1内的光，过滤的光516可能是在波长范围2内的光，且过滤的光517可能是在波长范围3内的光。然后每个过滤的光515、516、及517的强度可以通过光电检测器518定量。

本公开中描述的方法可与各种扩增方法兼容，包括定量PCR(qPCR)法、终点PCR法、逆转录酶PCR、及数字PCR法。数字PCR法(例如，微滴数字(BIORAD)和动态阵列(FLUIDIGM))产生高度敏感的多核苷酸拷贝数目的定量。本文提供的方法可以容易地集成到这些系统中，通过允许在微滴或动态阵列中的多路显著地扩大其工作能力。

类似地，本公开中描述的方法可在实时PCR测定中应用。例如，随着PCR运行完成，实时数据可以被完全记录。然后端点值可被解码以指示分析物的存在或不存在。通过检测该颜色的实时曲线的二阶导数的最大值，可对每个颜色分析各个循环阈值(Ct)的值。因为特定的分析物被扩增，荧光团以与该序列编码的颜色多样性相同的比例从其相应的探针释放。因此，如1100代码在蓝色和绿色中将具有相同的Ct，而1400代码将具有领先其蓝色Ct2个循环的绿色Ct。这种额外的数据能够测定每个分析物的标识和起始量。

本文描述的方法也可以直接在组织样品上使用。例如，可以获得组织样品，且使用光刻法在组织样品上直接建造孔(well)。组织样品可以被事先固定以建造孔。然后可通过分配适当的试剂进入组织样品中的孔中以分析组织样品。本公开中描述的编码和解码方法可用于蚀刻到组织中的孔中的分析物的多路检测。每个孔可以对应于单一细胞或若干细胞，当对组织的不同部分执行分析物分析时，提供优异的空间分辨率。这个方法可以被用于检测相同组织的不同区域的分析物。

在一些情况下，仪器可被修改或构建，例如，以提供在多波长的额外的激发光源，和/或提供额外的带通滤波器或确定完整的光谱的能力。包括额外的激发源将允许更大数量的各种荧光团的激发。包括额外的带通滤波器，或者修改或构建仪器能够确定整个光谱，允许检测来自荧光团的更多种发射。这些技术可用于增加可以用于本公开中描述的方法的荧光团的数目，且因此可以增加被同时检测的分析物的数目。

在一些情况下，本公开中描述的方法利用终点PCR法。然而，在一些情况下，结果可在终点前获得。例如，当尽快需要结果时，这可能是有利的。例如，在一种执行校准实验的情况下，其中分析分析物的不同的起始浓度，以确定信号达到饱和其循环数，其为分析物的起始量的函数。使用这种数据，实时监控PCR反应的计算机，可被编程以根据特定系统的检测极限(LOD)的限制搜索达到最大的循环数的饱和。如果到最大循环数时，分析物没有扩增(例如，除了可能存在的阳性对照)，那么对于该分析物的结果是阴性。如果到最大循环数时，分析物有扩增，那么对于该分析物的结果是阳性，且在每个颜色中的饱和强度可以被用于使用编码方案解码结果。在这两种情况下，没有必要运行PCR反应超过由LOD为仪器设定的循环的数目。尽管PCR方法已被用于说明这种定量方法，本领域的一个普通技术人员将容易认识到，类似的原理可以在任何催化体系中应用，其中分析物的起始量限制了反应速率，且反应速率可以通过在一段时间内信号强度的演变被测量和报告。

VI.组合物和试剂盒

本公开还提供了与本文描述的方法使用的组合物和试剂盒。组合物可以包括本文描述的任何成分、反应混合物和/或中间体，以及任意组合。例如，本公开提供了与本文提供的方法一起使用的检测试剂。可提供任何合适的检测试剂，包括如在本说明书中其他地方描述的，以荧光团和猝灭剂和引物标记的杂交探针。

在一些情况下，组合物包括使用四个荧光团检测至少七个分析物的试剂。在一些情况下，组合物包括使用四个荧光团检测至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50个分析物的试剂。在一些情况下，组合物包括使用五个荧光团检测至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50个分析物的试剂。在一些情况下，组合物包括使用六个荧光团检测至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50个分析物的试剂。在一些情况下，组合物包括使用七个荧光团检测至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50个分析物的试剂。

在一些情况下，组合物包括引物。组合物可包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50个引物配对。

本发明还提供了用于实施本发明的方法的试剂盒。因此，各种试剂盒在合适的包装中提供。试剂盒可用于本文描述的任何一个或更多个用途，且，相应地，可含有用于检测多个分析物中的每个分析物的存在或不存在的指令。试剂盒可包括编码方案、或解码矩阵，以帮助用户转换累积测量结果为表明多个分析物中的每个分析物的存在或不存在的结果。试剂盒可以是诊断试剂盒，例如，适合用于包括本文列举的分析物的任何分析物的检测的诊断试剂盒。试剂盒可以包含任何本公开中提供的组合物，包括上文列举的那些。

图6显示了本发明的示例性试剂盒的示意图。参考图6，显示了包括盒体601的试剂盒，盒体601含有用于分析物(例如，包括荧光团和猝灭剂的多核苷酸探针)的检测的试剂602，及用于核酸的扩增的引物603。试剂盒也可以包含任何其他试剂，例如适合于执行扩增反应的试剂604。在601中描绘的实施方案中，用于分析物的检测的试剂及引物各自包含在单一体积(如管或瓶)中。然而，这些试剂也可以以单独的体积提供，如605中所示的盒体所描绘的。盒体605包含七个单独的体积。三个体积606、607和608含有用于分析物的检测的试剂(或这类试剂的混合物)，且三个体积609、610和611含有引物(或引物的混合物)。试剂盒还可以含有适合于执行扩增反应的试剂604。

提供图6仅用于说明的目的。用于分析物(例如，探针)的检测的任何数目的试剂，及任何数目的引物可以被包括在单一的管或瓶中，使其适合应用。例如，在一些实施方案中，在单一的瓶中可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、或更多个试剂，用于分析物的检测。在其它情况下，在单一的瓶或管中可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、或更多个引物，用于扩增。在一些情况下，引物和探针可在相同的瓶或管中提供。例如，每对引物配对可以提供1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、或更多个探针。在其它情况下，每对探针配对可以提供1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、或更多个引物。试剂盒可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、或更多个瓶或管。对照分析物，及其相关的检测试剂和引物，也可以包括在试剂盒中。这些可以包括在单独的瓶或管中，或者例如，包括在提供用于扩增反应的试剂的瓶或管604中。如在本说明书中其他地方描述的，可以冻干试剂盒中的任何试剂。

VII.系统和软件

本公开的方法还可以作为系统的一部分执行。例如，可以通过包含在计算机可读介质中的软件执行本文描述的方法的一个或更多个步骤。软件可用于编码分析物、检查简并性、减少或消除简并性、和/或产生解码矩阵。软件也可以用于将仪器(例如，PCR器)上作出的累积测量结果转换为关于分析物的存在或不存在的信息。例如，参考图4，计算机401可以连接到输入装置403、显示器402和打印机404。计算机可以执行本公开中描述的方法的任意一个方法的一个或更多个步骤，例如包括，编码方法410、分析方法420和解码方法430。计算机可减少或消除简并性，例如，作为编码方法410的一部分。类似地，计算机可以产生通过设计是非简并的编码方案，例如使用数学迭代设计的编码方案。计算机也可以连接到网络405。网络可以是局域网和/或因特网。网络可以用于在不同位置的多个计算机上执行本发明的方法。例如，一台计算机可以执行编码，另一台计算机可执行测量，且又一台计算机可执行解码。一台计算机可执行这些方法的任何方法或全部。网络可用于在全世界传输使用本公开中描述的方法所获得的信息，例如跨越国界。

在一个实例中，软件被嵌入在执行测量的仪器中，例如热循环仪。在另一个实例中，软件被安装在连接到执行测量的仪器的计算机上，例如连接到热循环仪的计算机。在另一个实例中，软件是“云”，即在另一台计算机可通过网络与其通信的计算机上。

上文描述的每个元件可被连接到控制器，所述控制器与每个元件通信，并协调它们的操作。例如，控制器可启动将一系列的分析物编码为颜色和强度的值。如本公开全文所描述的，控制器可以执行软件，以通过从编码矩阵中除去一个或更多个潜在的分析物代码来减少或消除简并性。然后，控制器可以自动地从探针的制造商订购对应该代码的探针。可替代地，控制器可以操作可以合成相应的探针的寡核苷酸合成仪。分析了在仪器上的样品(其也可以是自动的)之后，控制器可以使用解码矩阵处理分析的结果。然后，控制器可将这些结果提供给用户。

VIII.服务

本文提供的方法也可以作为服务执行。例如，服务提供者可以获得客户希望分析的多个分析物的标识。然后服务提供者可以通过本文所述的任何方法编码每个待检测的分析物，并向客户提供适当的试剂用于测定。客户也可以执行测定，并向服务提供者提供结果以解码。然后服务提供者可以向客户提供解码的结果。客户还可以通过与安装在本地(在客户所在地)或远程(例如，在通过网络可达的一台服务器上)的软件交互，；来编码分析物、产生探针、和/或解码结果。示例性的客户包括临床实验室、医生、食品和消费品制造商、工业制造商(例如，石油公司)等等。客户或团体可以是有需要或希望使用本发明的方法、系统、组合物和试剂盒的任何合适的客户或团体。

实施例

实施例1：一般材料和方法

1.一般试剂

TE缓冲液，pH7(LIFE TECHNOLOGIES,Carlsbad,CA)；无RNA酶超纯水(LIFETECHNOLOGIES,Carlsbad,CA)；Taq 5x预混液(FISHER SCIENTIFIC COMPANY,Tustin,CA)。

2.DNA序列、引物和探针

选择了来自临床相关的生物体的五种核酸用于示例性的研究：(1)人类免疫缺陷病毒1(HIV-1)；(2)恶性疟原虫(疟疾)；(3)单纯性疱疹病毒2(HSV-2)；(4)结核分枝杆菌(TB)；和(5)登革热病毒3型(登革热)。

来自HIV-1的基因组的诊断相关的两个区域，p17和聚蛋白酶，分别选自LosAlamos国家实验室的HIV-1参考序列。来自恶性疟原虫ChR 7基因的诊断序列从UCSC恶性疟原虫基因组浏览器获得。单纯性疱疹病毒2序列从欧洲分子生物学库(European MolecularBiology Library)中获得的序列合成。相似地，结核分歧杆菌中的rpoB基因的诊断序列合成自从欧洲分子生物学库获得的序列。登革热病毒3型的PCR诊断序列获得自美国国家卫生研究院(National Institute of Health)的健康基因序列数据库。

由INTEGRATED DNA TECHNOLOGIES(IDT)合成寡核苷酸。使用来自IDT的OLIGO分析仪选择用于每个分析物的探针和引物配对。对所有分析物合成包含在5'端的荧光团和在3'端的猝灭剂的感测探针。冻干所有的寡核苷酸，并在使用前在TE缓冲液中重建。表9-14显示了六个分析物的每个分析物的序列信息、目标序列、引物、和探针。

表9.HIV-1聚蛋白酶的序列信息。

表10.HIV p17的序列信息。

表11.疟原虫ChR 7的序列信息。

表12.单纯性疱疹病毒2的序列信息。

表13.结核分枝杆菌rpoB的序列信息。

表14.登革热病毒3型的序列信息。

3.聚合酶链式反应

所有的PCR反应在ROCHE 480LIGHTCYCLER仪器上执行。以在95℃，60秒的热启动，执行45个循环。变性、退火(annealing)和延伸的循环条件为分别在95℃、65℃和70℃分别为45秒、50秒和60秒。每个实验以15μL的反应体积一式五份运行。每个退火步骤后，在以下通道中获得荧光测量结果：483nm至533nm(FAM)、523nm至568nm(Cy3)、558nm至610nm(ROX)、及615nm至670nm(Cy5)。在热启动和45个热循环结束后也可以获得荧光测量结果。这两个测量结果之间的荧光强度的变化(热启动后，及在45个循环结束时)确定终点荧光信号。

实施例2：基于每个分析物使用多于一个颜色的编码方法同时检测来自病原体的多核苷酸标记

本实施例描述了选自HIV(2个多核苷酸)、HSV-2、分枝杆菌、疟原虫、和登革病毒的最多四种多核苷酸的同时检测。使用表15中描述的试剂，装配(assemble)了14个PCR反应。

表15. 14个PCR反应的试剂。

参照表15，在其它分析物不存在时，反应1、3、5、7和9(分别包含HIV聚蛋白酶、疟原虫、HSV、分枝杆菌和登革热的分析物)是为每个多核苷酸分析物单独提供基线荧光强度的阳性对照。如下文更充分地描述的，在每个颜色中荧光强度的变化被用于提供色谱(图3)中每个颜色的预期累积的强度水平。反应2、4、6、8和10是阴性对照，分别用于确定非特异性扩增的程度。在这些反应中，提供的引物对提供的分析物特不是异性的。

实验11、12、13和14是多路检测实验。如表16中表示的执行编码。在每个颜色中，对每个测定测量的荧光强度被描绘为图3的色谱中的黑色圆圈。

表16.病原体检测的编码方案。

	FAM	Cy3	ROX	Cy5
					HIV聚蛋白酶	1	0	0	0
HIV p17	1	1	0	0
					疟原虫	1	0	1	0
HSV	1	0	0	1
					分歧杆菌	1	1	0	1
登革热病毒	1	1	1	1

为了构建色谱，在每个颜色中，阳性对照的信号(反应1、3、5、7和9)被用于装配存在的序列的每个可能的组合。累积信号被绘制在称为“色谱”(图3)的图中。对应于相同颜色中相同秩的所有可能组合的累积信号被组织到其自己的“带”内。对所有四个颜色这样做产生水平(level)和带结构，针对其可以评估每个组合的实验结果(反应11、12、13和14)。图3显示了色谱的三个重复，所述色谱使用阳性对照样品构建，并以实验结果4112、3121和3102叠加在色谱上。实验结果由黑点指示。

在反应11-14中每个颜色的强度值以任意荧光单位(AFU)测量，绘制在色谱中，且然后基于两个标准分配至带。首先，如果实验结果在带内，那么结果被分配到多路性的带(例如，在图3的最左边的色谱中为1的Cy3值)。第二，如果实验结果在两个带之间，则使用两步分析。如果实验结果在两个合理的结果之间，那么实验结果被分配到最接近的带(例如，在图3的最右边的色谱中Cy5的值2)。如果实验结果在合理的结果和不合理的结果之间，结果被分配至带的合理的结果(例如，图3的中间的色谱中FAM的值3)。图8示意性地显示了4112的合理的结果(上图)，其指示了HIV聚蛋白酶、疟原虫、单纯性疱疹、及分枝杆菌的存在；以及4110的不合理的结果(下图)，其不能被解码并指示了测定中的故障。

使用这些标准，实验12的输出被指定为4112，这是正确的答案。实验14的输出可以被指定为2121或3121，但2121是不合理的，因此其结果必然是3121，这是正确的答案。实验13的输出可以被指定为3102或3101，这两者都是合理的，但在Cy5通道中相比1，结果明确地更接近2，所以正确答案3102，被指定为的结果。这些结果提供了本文提供的方法的实验性验证。

研究结果表明组合信号比可以预期的来自阳性对照信号的简单总和略低的趋势。这可能是因为信号的组合不是完美的线性。这可能是目前不能解释的色谱构建的额外效应的结果。这些效应可能与猝灭剂的绝对浓度相关。猝灭剂的绝对浓度越高，其猝灭的反应体积的百分比越大，使得释放的相同的百分比的荧光团对累积信号的贡献没有预期的那么多。这个问题一个解决方法是使用低浓度的探针，使得信号中的百分损失是可以忽略的，而不管有多少猝灭剂被释放。

图3显示了包含多个组合的每个秩具有相对宽的带。带的宽度最终是阳性对照样品的最高和最低累积信号之间的差异。如果在特定颜色中所有阳性对照产生完全相同的荧光信号，则每个带的宽度将是零。因为代替的那些信号有所不同，得到的带是相对宽的。然而，有一种简单的手段以收紧带。如在上述实验完成的，与加载相同浓度的所有探针不同，作为代替，每个探针的浓度可被调整，使得每个得到的阳性对照信号与相同的颜色中的其它的是相同的。这种方法会显著收紧带，使其更容易确定含有分析物的样品的信号的多路性。

实施例3：基于每个分析物使用一个颜色和不同强度的编码方法同时检测来自病原体的多核苷酸标记

本实施例描述了选自登革病毒、HIV p17和HIV聚蛋白酶的最多三种多核苷酸的同时检测。编码方案如表11中描绘的。如表11所示，每个分析物被编码为单一颜色中荧光强度的单一值。在这种情况下，如本公开其他地方描述的，编码方案通过设计是非简并的。这通过向每个分析物分配强度值实现，所分配的强度值等于之前的分析物的累积强度值加一。当然，如在本说明书中其他地方描述的，初始分配值可以大于1，例如，以更好地区别噪声。类似地，分配给每个分析物的值可以大于之前的分析物的累积强度值加一，例如，为了增加强度之间的间隔，并使得强度分配更简单。

表17.检测登革热病毒、HIV聚蛋白酶和HIV p17的编码方案。

	FAM
		登革热病毒	1
HIV p17	2
		HIV聚蛋白酶	4

实施例2中使用的相同的试剂(例如，模板、引物和探针)用于此处。测量了由阳性对照终点PCR反应中的各个探针产生的荧光信号，并将其用于计算将产生1x、2x、和4x的信号强度的探针的浓度。然后设置实验用于检测分析物出现的七个非空的组合。表18-24提供了这些混合物的每个的分析物PCR反应成分。

表18.二进制FAM实验1混合液(Cocktail)：HIV聚蛋白酶、HIV p17、及登革热病毒。

表19.二进制FAM实验2混合液：登革热病毒和HIV p17。

表20.二进制FAM实验3混合液：登革热病毒和HIV聚蛋白酶。

表21.二进制FAM实验4混合液：HIV聚蛋白酶和HIV p17。

表22.二进制FAM实验5混合液：登革热病毒。

表23.二进制FAM实验6混合液：HIV p17。

表24.二进制FAM实验7混合液：HIV聚蛋白酶。

每个实验的总荧光信号在如上文描述构建的色谱上绘制(图7)。围绕每个阳性对照测量结果的带的宽度是1x测量结果传播的不确定性。该不确定性等于饱和的最后五个PCR循环的荧光信号的标准差。

图7显示了该实验的结果。最右边的三个结果显示了单独的登革病毒(DEN)、单独的HIV p17(P17)和HIV聚蛋白酶(TPP)的测量强度。对这些分析物的每个分配的强度如表11所示，且图7确认了三个分析物单独存在时，产生了预期的强度结果(见DEN、P17和TPP)。在测定结束时，基本上所有的探针已被水解，释放了发射信号的基本上所有的荧光团。固定数量的荧光团产生固定的且可预测的信号量。因此，由通过加入到反应体积的探针的数量确定的，存在的目标通常应产生固定量的信号。

如预期的，分析物的组合的强度值等于分配的强度之和。因为这种编码方案被设计成非简并的，每个结果可以明确地解码成特定分析物的存在或不存在。例如，从图7的左侧开始，7的结果表明所有三个分析物存在。3的结果表明登革热病毒和HIV p17分析物存在，而HIV聚蛋白酶不存在。5的结果表明登革热病毒和HIV聚蛋白酶存在，而HIV p17不存在。最后，6的结果表明HIV p17和HIV聚蛋白酶存在，而登革热病毒不存在。如在本公开中其他地方描述的，这种编码方案可被扩大以编码额外的分析物。

序列表

<110> 加州理工学院

<120> 多路生化测定中信号的编码和解码

<130> 38075-716.601

<140> PCT/US2013/024509

<141> 2013-02-01

<150> 61/703,093

<151> 2012-09-19

<150> 61/594,480

<151> 2012-02-03

<160> 32

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 198

<212> DNA

<213> 人类免疫缺陷病毒1

<400> 1

ggaagctcta ttagatacag gagcagatga tacagtatta gaagaaatga gtttgccagg 60

aagatggaaa ccaaaaatga tagggggaat tggaggtttt atcaaagtaa gacagtatga 120

tcagatactc atagaaatct gtggacataa agctataggt acagtattag taggacctac 180

acctgtcaac ataattgg 198

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成引物

<400> 2

ggaagctcta ttagatacag gagcag 26

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成引物

<400> 3

ccaattatgt tgacaggtgt aggtcc 26

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成探针

<220>

<223> 5'6-FAM

<220>

<223> 3'BHQ_1

<400> 4

tgagtttgcc aggaagatgg aaacca 26

<210> 5

<211> 199

<212> DNA

<213> 人类免疫缺陷病毒1

<400> 5

cagctacaac catcccttca gacaggatca gaagaactta gatcattata taatacagta 60

gcaaccctct attgtgtgca tcaaaggata gagataaaag acaccaagga agctttagac 120

aagatagagg aagagcaaaa caaaagtaag aaaaaagcac agcaagcagc agctgacaca 180

ggacacagca atcaggtca 199

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成引物

<400> 6

cagctacaac catcccttca gaca 24

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成引物

<400> 7

tgacctgatt gctgtgtcct gtgt 24

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成探针

<220>

<223> 5'6-FAM

<220>

<223> 3'BHQ_1

<400> 8

agcaaccctc tattgtgtgc atcaaagg 28

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成探针

<220>

<223> 5'Cy3

<220>

<223> 3'BHQ_2

<400> 9

aaagcacagc aagcagcagc tga 23

<210> 10

<211> 199

<212> DNA

<213> 恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）

<400> 10

gcctaacatg gctatgacgg gtaacgggga attagagttc gattccggag agggagcctg 60

agaaatagct accacatcta aggaaggcag caggcgcgta aattacccaa ttctaaagaa 120

gagaggtagt gacaagaaat aacaatgcaa ggccaattta aaaccttccc agagtaacaa 180

ttggagggca agtctggtg 199

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成引物

<400> 11

gcctaacatg gctatgacgg gtaa 24

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成引物

<400> 12

caccagactt gccctccaat tgtt 24

<210> 13

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成探针

<220>

<223> 5'6-FAM

<220>

<223> 3'BHQ_1

<400> 13

attccggaga gggagcctga gaaata 26

<210> 14

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成探针

<220>

<223> 5'6-ROXN

<220>

<223> 3'BHQ_2

<400> 14

aaggaaggca gcaggcgcgt aaatta 26

<210> 15

<211> 192

<212> DNA

<213> 单纯性疱疹病毒2

<400> 15

tcagcccatc ctccttcggc agtatggagg gtgtcgcggc ggcgagccgc cgtccccaaa 60

gacgtgcggg tcgtacacgt acacgtacca gggcggcggg cctccgaccc ggtacgctct 120

cgtaaatgct tccctgctgg tgccgatctg ggaccgcgcc gcggagacat tcgagtacca 180

gatcgaactc gg 192

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成引物

<400> 16

tcagcccatc ctccttcggc agtat 25

<210> 17

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成引物

<400> 17

ccgagttcga tctggtactc gaatgt 26

<210> 18

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成探针

<220>

<223> 5'6-FAM

<220>

<223> 3'BHQ_1

<400> 18

aaagacgtgc gggtcgtaca cgtaca 26

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成探针

<220>

<223> 5'Cy5

<220>

<223> 3'3IAbRQSp

<400> 19

taaatgcttc cctgctggtg ccgat 25

<210> 20

<211> 200

<212> DNA

<213> 结核分歧杆菌（Mycobacterium tuberculosis）

<400> 20

gagtgcaaag acaaggacat gacgtacgcg gccccgctgt tcgtcacggc cgagttcatc 60

aacaacaaca ccggcgagat caagagccag acggtgttca tgggtgactt cccgatgatg 120

accgagaagg gcaccttcat catcaacggc accgagcgcg tcgtggtcag ccagctggtc 180

cgctcgcccg gtgtgtactt 200

<210> 21

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成引物

<400> 21

gagtgcaaag acaaggacat gacg 24

<210> 22

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成引物

<400> 22

aagtacacac cgggcgagc 19

<210> 23

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成探针

<220>

<223> 5'6-FAM

<220>

<223> 3'BHQ_1

<400> 23

cgctgttcgt cacggccgag ttcat 25

<210> 24

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成探针

<220>

<223> 5'Cy3

<220>

<223> 3'BHQ_2

<400> 24

agatcaagag ccagacggtg ttcatg 26

<210> 25

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成探针

<220>

<223> 5'Cy5

<220>

<223> 3'IAbRQSp

<400> 25

aagggcacct tcatcatcaa cggca 25

<210> 26

<211> 200

<212> DNA

<213> 登革热病毒3

<400> 26

atgccaactg tgattgagca cttagaaaga ctacaaagga aacatggagg aatgcttgtg 60

agaaatccac tctcacgaaa ctccacgcac gaaatgtatt ggatatccaa tggtacaggc 120

aacatcgtct cattcacaat gacacacagg agacccacca tagagaaaga tgtggattta 180

ggagcaggaa cccgacatgt 200

<210> 27

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成引物

<400> 27

atgccaactg tgattgagca ct 22

<210> 28

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成引物

<400> 28

acatgtcggg ttcctgctcc taaa 24

<210> 29

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成探针

<220>

<223> 5'6-FAM

<220>

<223> 3'BHQ_1

<400> 29

acaaaggaaa catggaggaa tgcttgtga 29

<210> 30

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成探针

<220>

<223> 5'Cy3

<220>

<223> 3'BHQ_2

<400> 30

actctcacga aactccacgc acgaaa 26

<210> 31

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成探针

<220>

<223> 5'6-ROXN

<220>

<223> 3'BHQ_2

<400> 31

acaatgacac acaggagacc caccat 26

<210> 32

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成探针

<220>

<223> 5'Cy5

<220>

<223> 3'IAbRQSp

<400> 32

ggatatccaa tggtacaggc aacatcgt 28

Claims

1.一种方法，所述方法能够不进行固定化、分离、质谱法、或解链曲线分析而非简并地检测单一样品体积中的、以存在或不存在的任意组合形式的至少7个分析物中的每个分析物的存在或不存在，其中所述方法包括：

(i)将待检测的每个分析物编码为信号的第一分量中的至少一个第一值和所述信号的第二分量中的至少一个第二值；

(ii)枚举可以从所述编码方案获得的至少一个结果；

(iii)鉴定是简并的至少一个结果；和

(iv)从所述编码方案消除至少一个潜在的分析物代码，其中所述消除至少一个潜在的分析物代码减少或消除所述编码方案的结果的简并性。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法能够明确地检测以存在或不存在的任意组合形式的M个分析物的存在或不存在，其中M＝log₂(F+1)，且F是当所有所述分析物存在时的所述信号的所述一个分量的最大累积值。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法能够明确地检测以存在或不存在的任意组合形式的M个分析物的存在或不存在，其中M＝C*log₂(F+1)，其中C是用于编码所述分析物的所述第二值的数目，且F是当所有所述分析物存在时，关于任意第二值的所述信号的所述第一分量的最大累积值。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法能够明确地检测以存在或不存在的任意组合形式的M个分析物的存在或不存在，其中M＝(P*T)+1，其中P是编码方案中每层代码的数目，且T是层的数目。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述层的数目T＝log4(F+1)，且F是当所有所述分析物存在时，关于任意第二值的所述信号的所述第一分量的最大累积值。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一值是强度或强度的范围。

7.根据权利要求4所述的方法，其中，所述编码方案包括至少三个强度或强度的范围。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第二值是波长或波长的范围。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述编码方案包括至少五个波长或波长的范围。

10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述信号是电磁信号。